CN113227785A - 识别和定量抗体片段化的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

提供了用于识别和定量样品中的抗体片段以及识别抗体上的片段化位点的方法，所述方法包括以下步骤：将包含所述抗体的片段的样品加载到具有混合模式尺寸排阻固定相(110)的色谱系统，使用流动相洗涤所述混合模式尺寸排阻固定相以提供包含所述片段的洗脱液，使用质谱仪(120)确定所述片段的分子量，以及使所述分子量与已知蛋白质标准物相关联。

Description

识别和定量抗体片段化的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请根据35USC§119(e)要求2019年1月16日提交的美国临时申请号62/793,004的权益，所述临时申请特别地以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及一种用于识别并定量抗体片段以及识别抗体上的片段化位点的方法和系统。
背景技术
基于蛋白质的生物制剂产品已作为用于治疗癌症、自身免疫性疾病、感染和心脏代谢病症的重要药物出现，并且它们代表医药工业中增长最快的产品类中的一种。
酶促或非酶促蛋白质消化为蛋白质识别、表征和定量的重要工具。片段化位点可取决于蛋白质复杂性和/或消化方法。为了检测片段化位点，需要识别剪切片段。
此外，基于蛋白质的生物制剂必须满足非常高的纯度标准。蛋白质易于将肽主链裂解成片段，这可以通过在加工、处理或储存期间使用的酸性条件来催化。与产品相比，这些剪切片段可表现出不同的作用模式和潜在的毒性或免疫原性。另外，它们可具有比产品更低的稳定性，这带来了更高的聚集和免疫原性风险。尽管最近取得进展，但开发用于定量评估此类剪切片段的纯度测定方法仍然是挑战。因此，重要的是在药物开发和生产的不同阶段期间监测并表征此类剪切片段。
用于检测片段的测定的分析方法应显示出足够的准确性和分辨率，以检测并定量所需产品。由于蛋白质和一个或多个剪切片段的结构和物理化学性质之间的相似性，评估可能很困难。直接分析可能要求足够大量地分离一个或多个剪切片段以用于测定，这可能是不希望的，并且仅在所选定的情况下是可能的。
本领域中长期需要一种用于识别和定量抗体片段以及识别抗体上的片段化位点的方法和/或系统。
发明内容
基于蛋白质的生物制剂产品的开发、制造和销售的增长导致对表征蛋白质片段和蛋白质片段化位点的需求逐渐增加。
本文公开的示例性实施方案通过提供用于识别和定量抗体片段以及识别抗体上的片段化位点的方法和系统来满足上述要求。
本公开至少部分地提供了一种用于定量样品中的抗体片段的方法。
在一个示例性实施方案中，用于定量抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含片段的洗脱液，以及使用质谱仪定量洗脱液中片段的量。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有疏水相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有电荷-电荷相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使约10μg至约100μg的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含片段的洗脱液。在此实施方案的特定方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使用可与质谱仪相容的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。在另一个特定方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂，其中流动相可选自乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使用含有高达600mM总盐浓度的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使用流动相以0.2ml/min至0.4ml/min的流速洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述片段可为抗体的降解产物。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述片段为杂质。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体为单克隆抗体。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体为治疗性抗体。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体为双特异性抗体。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体为多特异性抗体。
在此实施方案的一个方面，用于定量样品中的抗体片段的方法可包括使用质谱仪定量所述洗脱液中片段的量，其中所述质谱仪可为串联质谱仪。
本公开至少部分地提供了一种用于识别样品中的抗体片段的方法。
在一个示例性实施方案中，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含片段的洗脱液，使用质谱仪确定洗脱液中片段的分子量，以及将片段的分子量数据与由至少一种已知蛋白质标准物获得的数据相关联。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使所述样品与具有带有疏水相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使所述样品与具有带有电荷-电荷相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使约10μg至约100μg的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含片段的洗脱液。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使用可与质谱仪相容的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂，其中流动相可选自乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。在另一个特定方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使用含有高达600mM总盐浓度的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使用流动相以0.2ml/min至0.4ml/min的流速洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述片段为抗体的降解产物。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体为单克隆抗体。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体为治疗性抗体。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体为双特异性抗体。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体为多特异性抗体。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述片段可为抗体的消化产物。
在此实施方案的一个方面，用于识别样品中的抗体片段的方法可包括使用质谱仪定量所述洗脱液中片段的量，其中所述质谱仪可为串联质谱仪。
本公开至少部分地提供了一种用于识别抗体片段化位点的方法。
在一个示例性实施方案中，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供洗脱液，使用质谱仪确定所述洗脱液中抗体片段的分子量数据，以及将片段的分子量数据与由至少一种已知蛋白质标准物获得的数据相关联。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有疏水相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有电荷-电荷相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使约10μg至约100μg包含抗体片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有电荷-电荷相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，以及使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含片段的洗脱液。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使用可与质谱仪相容的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。在特定的方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂，其中流动相可选自乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。在另一个特定方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使用含有高达600mM总盐浓度的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使用流动相以0.2ml/min至0.4ml/min的流速洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体可为单克隆抗体。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体可为治疗性抗体。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体可为双特异性抗体。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述抗体可为多特异性抗体。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述样品含有多于两个片段。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述片段是由于抗体的降解而形成的。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述片段为抗体的消化产物。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使包含抗体片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，其中所述片段是由于抗体的降解而形成的。
在此实施方案的一个方面，用于识别抗体片段化位点的方法可包括使用质谱仪识别所述洗脱液中的片段，其中所述质谱仪可为串联质谱仪。
本公开至少部分地提供了一种混合模式色谱系统。
在一个示例性实施方案中，色谱系统可包括具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱柱以及质谱仪。
在此实施方案的一个方面，混合模式色谱系统可包括具有疏水相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂。
在此实施方案的一个方面，混合模式色谱系统可包括具有电荷-电荷相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂。
在此实施方案的一个方面，混合模式色谱系统可包括具有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂，其可用于洗脱约10μg至约100μg的样品。
在此实施方案的一个方面，混合模式色谱系统可包括能够接收流动相的混合模式尺寸排阻色谱树脂。
在此实施方案的一个方面，混合模式色谱系统可包括还能够接收具有片段的样品的混合模式尺寸排阻色谱树脂。
在此实施方案的一个方面，混合模式色谱系统可包括能够用流动相洗涤的混合模式尺寸排阻色谱树脂。
在此实施方案的一个方面，混合模式色谱系统可包括质谱仪，所述质谱仪耦接到具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱柱。
在此实施方案的一个方面，混合模式色谱系统可包括串联质谱仪。
在此实施方案的一个方面，混合模式色谱系统可包括具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱柱，其中所述混合模式尺寸排阻色谱树脂可与选自乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合的流动相相容。
在此实施方案的一个方面，混合模式色谱系统可包括具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱柱，其中所述混合模式尺寸排阻色谱树脂可使用含有高达600mM总盐浓度的流动相洗涤。
在此实施方案的一个方面，混合模式色谱系统可包括具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱柱，其中所述色谱柱可用流动相以0.2ml/min至0.4ml/min的流速进行洗涤。
附图说明
图1示出了用于使用尺寸排阻色谱法或离子交换色谱法来定量和/或识别蛋白质变体的系统的实例。
图2示出了Hofmeister系列，其显示出阴离子和阳离子对蛋白质沉淀(或促进疏水相互作用)的影响。
图3示出了根据示例性实施方案的混合模式尺寸排阻色谱质谱系统。
图4示出了根据示例性实施方案在使用具有不同盐浓度的流动相以0.3mL/min的流速对双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的消化混合物进行MM-SEC-MS分析时获得的提取离子色谱图(XIC)。
图5示出了根据示例性实施方案在以0.3mL/min的流速进行MM-SEC-MS分析时针对双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的消化混合物的蛋白质保留时间(分钟)对比流动相的总盐浓度的图表。
图6示出了根据示例性实施方案在使用具有不同盐浓度的流动相以0.2mL/min的流速对双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的消化混合物进行MM-SEC-MS分析时获得的提取离子色谱图(XIC)。
图7示出了根据示例性实施方案以0.2mL/min的流速进行MM-SEC-MS分析时针对双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的消化混合物的蛋白质保留时间(分钟)对比流动相的总盐浓度的图表。
图8示出了根据示例性实施方案进行MM-SEC-MS分析时流动相浓度对双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的F(ab)2片段的消化混合物的分离的影响。
图9示出了根据示例性实施方案在使用具有不同盐浓度的流动相以0.2mL/min的流速对抗体的消化且去糖基化的混合物进行MM-SEC-MS分析时获得的提取离子色谱图(XIC)。
图10示出了根据示例性实施方案以0.2mL/min的流速进行MM-SEC-MS分析时针对抗体的消化且去糖基化的混合物的蛋白质保留时间(分钟)对比流动相的总盐浓度的图表。
图11示出了根据示例性实施方案以0.2mL/min的流速进行MM-SEC-MS分析时流动相浓度对抗体的消化且去糖基化的混合物的分离的影响。
图12表示示出根据示例性实施方案当进行MM-SEC-MS分析时改变总盐浓度时的保留时间的趋势的图。
图13表示示出根据示例性实施方案当进行MM-SEC-MS分析时改变总盐浓度时的保留时间差值的趋势的图。
图14示出了根据示例性实施方案在Waters BEH SEC柱上进行MM-SEC-MS时对双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的消化混合物进行MM-SEC-MS分析时获得的提取离子色谱图(XIC)。
图15示出了根据示例性实施方案在Waters BEH SEC柱上进行MM-SEC-MS分析时针对双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的消化混合物的蛋白质保留时间(分钟)对比流动相的总盐浓度的图表。
图16示出了根据示例性实施方案在使用40mM SEC缓冲液进行MM-SEC-MS分析时针对抗体的消化且去糖基化的混合物的蛋白质相对丰度对比保留时间(分钟)。
图17示出了根据示例性实施方案在进行MM-SEC-MS分析时针对抗体的消化且去糖基化的混合物的蛋白质保留丰度对比蛋白质质荷比的图表。
图18示出了在使用天然强阳离子交换色谱-质谱法进行MM-SEC-MS分析时针对抗体的消化且去糖基化的混合物的蛋白质相对丰度对比保留时间(分钟)。
图19示出了使用天然强阳离子交换色谱-质谱法进行抗体分析的消化且去糖基化的混合物的蛋白质保留丰度对比蛋白质质荷比的图表。
图20示出了根据示例性实施方案由对抗体进行Asp-N蛋白酶消化获得的片段的定量。
图21示出了根据示例性实施方案通过使用由对抗体进行胰蛋白酶蛋白酶消化获得的片段的识别和定量来确定的抗体对体内片段的易感性。
具体实施方式
酶促或非酶促抗体片段化可在抗体产物的加工期间形成作为杂质的抗体片段。基于蛋白质的疗法中存在的众多动态蛋白质种类对当前基于质谱的检测抗体片段和片段化位点的方法提出了挑战，因为抗体片段的数量可能处于低丰度。
可替代地，已设计多种抗体片段作为治疗剂。抗体片段的最显著优势包括尺寸、制造、组织渗透以及连接生成多特异性的能力。有时，研究或利用免疫球蛋白的一部分的活性而不受分子的其他部分干扰是有用的。可以选择性地将免疫球蛋白分子裂解成具有离散特征的片段。可使用消化或裂解免疫球蛋白蛋白结构的某些部分的还原剂和蛋白酶来完成抗体片段化(Nelson(2010)mAbs 2:77-83；12-Antibody fragments as therapeutics,编者：William R.Strohl,Lila M.Strohl,In Woodhead Publishing Series in Biomedicine,“Therapeutic Antibody Engineering,2012,265-595)。为了设计和评估此类抗体片段，通过特定的消化方法来识别抗体片段和抗体上的片段化位点可为重要的。
为了识别抗体片段和片段化位点，传统的基于分离的抗体纯度测定(诸如基于电泳和高效液相色谱(HPLC)的方法)缺乏所需的分辨率。通过与质谱耦接的反相液相色谱(RPLC)进行肽图分析也有一些局限性，因为RP-LC-MS的样品制备过程很长，并且在一些情况下，诸如高温、有机溶剂和酸性pH的色谱条件可诱导氧化伪影。疏水相互作用色谱(HIC)和蛋白A色谱也已用于分析抗体氧化，但可能需要更长的色谱运行时间，并且对不同片段的能力可能有限(Haverick等人mAbs,(2014)6:852-858；Boyd等人J.Chromatogr.BAnalyt.Technol.Biomed.Life Sci.(2011)879:955-960；以及Loew等人J.Pharm.Sci.(2012)101:4248-4257)。
另外，一些尺寸排阻色谱法或离子交换色谱法可用于分离在消化抗体时形成的抗体片段。可使用质谱仪或紫外线吸收系统进一步分析抗体片段。然而，来自尺寸排阻色谱或离子交换色谱柱的流动相不能直接注入质谱仪中，并且需要另外的步骤，包括改变流动相(参见图1)。
考虑到现有方法的局限性，开发了一种用于使用新的混合模式-尺寸排阻色谱-质谱系统来识别并定量抗体片段和抗体片段化位点的有效且高效的方法。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然在实践或测试中可使用类似或等同于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述特定的方法和材料。提及的所有出版物特此以引用的方式并入。
术语“一个/种(a)”应理解为意指“至少一个/种”；并且术语“约”和“大约”应理解为允许如本领域普通技术人员将理解的标准变化；并且在提供范围时，则包括端点。
生物制剂产品需要表现出高水平的效力、纯度和低水平的结构异质性。结构异质性常常影响药物的生物活性和功效。因此，表征和定量治疗性蛋白质和/或杂质在医药药物开发中很重要。蛋白质的结构异质性可由翻译后修饰以及制造和储存条件下的固有化学修饰引起。对于在生物技术工业中生产的蛋白质，对于纯化靶蛋白并给出最终产品质量的准确图像，互补分离技术是必要的。产品的复杂性消除了使用简单的一维分离策略。
如本文所用，术语“蛋白质”包括具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包含一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基组成的聚合物、相关的天然存在的结构变体以及其通过肽键连接的合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物。“合成的肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成的肽或多肽可例如使用自动化多肽合成仪来合成。各种固相肽合成方法是本领域技术人员已知的。蛋白质可含有一个或多个多肽以形成单一的功能性生物分子。蛋白质可包括生物治疗性蛋白质、用于研究或治疗的重组蛋白、trap蛋白和其他嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体中的任一种。在另一个示例性方面，蛋白质可包括抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可使用基于重组细胞的生产系统来产生，诸如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如毕赤酵母某种(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于讨论生物治疗性蛋白质及其生产的综述，参见Ghaderi等人,“Production platforms for biotherapeutic glycoproteins。Occurrence,impact,and challenges of non-human sialylation,”(Biotechnol.Genet.Eng.Rev.(2012)147-75)。在一些示例性实施方案中，蛋白质包含修饰、加合物和其他共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包括例如亲和素、链霉亲和素、生物素、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖、甘露糖和其他单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAG标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记和其他染料等。蛋白质可根据组成和溶解度来分类，并且因此可包括简单的蛋白质，诸如球状蛋白质和纤维状蛋白质；缀合蛋白，诸如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及衍生蛋白，诸如初级衍生蛋白和次级衍生蛋白。
在一些示例性实施方案中，蛋白质可为抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体或其组合。
如本文所用，术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(C.sub.L1)。VH和VL区可进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，穿插有被称为框架区(FR)的较保守区。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在不同的示例性实施方案中，抗-大-ET-1抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系序列相同，或可为天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可基于两个或更多个CDR的并行分析来定义。如本文所用，术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。可使用诸如蛋白水解消化或重组基因工程化技术的任何合适的标准技术例如从完整抗体分子衍生出抗体的抗原结合片段，所述重组基因工程化技术涉及编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA的操纵和表达。此类DNA为已知的和/或为从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)轻易可获得的或可为合成的。可以化学方式或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子；形成半胱氨酸残基；修饰、添加或去除氨基酸等。
如本文所用，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如像抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fc片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域，以及三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段为免疫球蛋白重链和轻链可变区的组合，并且ScFv蛋白为重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区通过肽接头连接。抗体片段可通过各种方式产生。例如，抗体片段可通过使完整抗体片段化来酶促或化学产生，且/或其可由编码部分抗体序列的基因重组产生。可替代地或另外，抗体片段可全部或部分合成产生。抗体片段可任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外，抗体片段可包含例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段可任选地包括多分子复合物。
如本文所用，术语“消化”是指蛋白质肽键的水解。存在使用适当的水解剂对样品中的蛋白质执行消化的几种方法，例如酶促消化或非酶促消化。
如本文所用，术语“水解剂”是指可进行蛋白质消化的大量不同剂中的任一种或组合。可执行酶消化的水解剂的非限制性实例包括胰蛋白酶、胞内蛋白酶Arg-C、胞内蛋白酶Asp-N、胞内蛋白酶Glu-C、外膜蛋白酶T(OmpT)、酿脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和佐氏曲霉(AspergillusSaitoi)蛋白酶。可执行非酶促消化的水解剂的非限制性实例包括使用高温、微波、超声波、高压、红外、溶剂(非限制性实例为乙醇和乙腈)、固定化酶消化(IMER)、磁性粒子固定化酶和片上固定化酶。对于讨论可用的蛋白质消化技术的最新综述，参见Switazar等人,“Protein Digestion:An Overview of the Available Techniques and RecentDevelopments”(J.Proteome Research 2013,12,1067-1077)。一种水解剂或水解剂的组合可以序列特异性方式裂解蛋白质或多肽中的肽键，从而生成较短肽的可预测集合。
用于消化样品中的蛋白质的一种广泛接受的方法涉及蛋白酶的使用。许多蛋白酶是可用的，并且每种蛋白酶在特异性、效率和最佳消化条件方面都有自己的特征。蛋白酶是指内肽酶和外肽酶，如根据蛋白酶在肽内非末端或末端氨基酸处裂解的能力来分类的。可替代地，蛋白酶也是指六种不同的类别，天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶、半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸蛋白酶，如根据催化机制分类的。术语“蛋白酶”和“肽酶”可互换使用，以指水解肽键的酶。
蛋白酶也可分为特异性蛋白酶和非特异性蛋白酶。如本文所用，术语“特异性蛋白酶”是指具有在肽的特定氨基酸侧链处裂解肽底物的能力的蛋白酶。
如本文所用，术语“非特异性蛋白酶”是指具有降低的在肽的特定氨基酸侧链处裂解肽底物的能力的蛋白酶。裂解偏好可基于作为裂解位点的特定氨基酸的数目与蛋白质序列中裂解的氨基酸的总数的比率。
如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可通过本领域可获得的或已知的任何方式衍生自单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆。可用于本公开的单克隆抗体可使用本领域已知的多种技术来制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。
如本文所用，术语“色谱法”是指以下过程，其中由于化学实体在固定液相或固相周围或上方流动时的差异分布，可将由液体或气体携带的化学混合物分离成组分。
如本文所用，术语“混合模式色谱法(MMC)”或“多模式色谱法”包括其中溶质通过超过一种相互作用模式或机制与固定相相互作用的色谱法。MMC可用作传统反相色谱(RP)、离子交换色谱(IEX)和正相色谱(NP)的替代或补充工具。与分别以疏水相互作用、亲水相互作用和离子相互作用为主要相互作用模式的RP、NP和IEX色谱不同，混合模式色谱可采用这些相互作用模式中两种或更多种的组合。混合模式色谱介质可提供无法通过单一模式色谱法重现的独特选择性。与基于亲和力的方法相比，混合模式色谱可提供潜在的成本节约、更长的柱寿命和操作灵活性。
短语“尺寸排阻色谱法”或“SEC”或“凝胶过滤”包括液相柱色谱技术，所述技术可根据分子在溶液中的大小来分选分子。
如本文所用，术语“SEC色谱树脂”或“SEC色谱介质”在本文中可互换使用，并且可包括在SEC中使用的从所需产物分离杂质(例如，对于双特异性抗体产物为同源二聚体污染物)的任何种类的固相。树脂的体积、待使用的柱的长度和直径以及动态容量和流速可取决于几个参数，诸如待处理的流体体积、待经受过程的流体中蛋白质的浓度。
如本文所用，术语“混合模式尺寸排阻色谱法”或“MM-SEC”可包括通过除基于蛋白质尺寸的分离以外的其他相互作用来分离蛋白质的任何色谱方法。另外的或次级相互作用可利用以下机制中的一种或多种：阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用、亲水相互作用、电荷-电荷相互作用、氢键结合、π-π键结合和金属亲和力。混合模式尺寸排阻色谱树脂可指用于MM-SEC分离的任何类型的固相。非限制性实例为Sepax Zenix SEC-300、Waters BEH300或Agilent Bio SEC-3。
如本文所用，术语“疏水功能”是指作为次级相互作用的蛋白质与SEC色谱树脂的疏水相互作用。它们还显著影响峰形，这将对过程的分辨能力产生显著影响。在高离子强度的流动相中，疏水相互作用最强。为了选择在树脂中包括疏水功能的流动相，各种离子可以所谓的憎溶(soluphobic)系列排列，这取决于它们是促进疏水相互作用(盐析效应)还是破坏水的结构(离液效应(chaotropic effect))以及是否导致疏水相互作用减弱(参见图2)。阳离子可根据增加盐析效应排序为Ba++；Ca++；Mg++；Li+；Cs+；Na+；K+；Rb+；NH4+，而阴离子可根据增加离液效应排序为PO-；SO4 -；CH3CO2 -；Cl-；Br-；NO3 -；ClO4 -；I-；SCN-。一般来讲，Na、K或NH4硫酸盐有效促进HIC中的配体-蛋白质相互作用。可配制影响相互作用强度的盐，所述相互作用强度关系给出如下：(NH4)2SO4>Na2SO4>NaCl>NH4Cl>NaBr>NaSCN。
如本文所用，术语“质谱仪”包括能够识别特定分子物质并测量其准确质量的装置。所述术语意在包括可在其中洗脱多肽或肽以进行检测和/或表征的任何分子检测器。质谱仪可包括三个主要部分：离子源、质量分析器和检测器。离子源的作用是产生气相离子。可将分析物的原子、分子或簇转移到气相中并同时进行电离(如电喷雾电离)。离子源的选择在很大程度上取决于应用。
如本文所用，术语“质量分析器”包括可根据质量分离物质(即，原子、分子或簇)的装置。可用于快速蛋白质测序的质量分析器的非限制实例为飞行时间(TOF)、扇形磁场/扇形电场、四极滤质器(Q)、四极离子阱(QIT)、轨道阱、傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)以及还有加速器质谱(AMS)技术。
如本文所用，术语“串联质谱法”包括通过使用质量选择和质量分离的多个阶段获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子可被转移到气相中并被完整电离，并且可在第一质量选择步骤之后以某种可预测且可控制的方式诱导它们分解。多阶段MS/MS或MSn可通过以下方法进行：首先选择并分离前体离子(MS2)、使其片段化、分离出初级片段离子(MS3)、使其片段化、分离出次级片段(MS4)，以此类推，只要人们可获得有意义的信息或片段离子信号是可检测的。串联MS已成功地与多种分析仪组合一起使用。对于某个应用，要组合哪些分析仪取决于许多不同的因素，诸如灵敏度、选择性和速度，还取决于尺寸、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别为空间串联和时间串联，但也存在时间串联分析仪在空间中耦接或与空间串联分析仪耦接的混合方法。
本文所公开的实施方案提供了用于快速表征样品中的蛋白质的组合物、方法和系统。
如本文所用，术语“包括(include、includes和including)”意在是非限制性的，并且应分别理解为意指“包含(comprise、comprises和comprising)”。
本公开提供了用于定量样品中的抗体片段的方法，所述方法包括使样品与具有混合模式色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含片段的洗脱液，以及使用质谱仪定量洗脱液中的片段。
本公开提供了用于识别样品中的抗体片段的方法，所述方法包括使样品与具有混合模式色谱树脂的色谱系统接触；使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含片段的洗脱液，使用质谱仪确定洗脱液中片段的分子量，以及将片段的分子量数据与由至少一种已知蛋白质标准物获得的数据相关联以识别片段。
本公开还提供了用于识别抗体的片段化位点的方法，所述方法包括使包含抗体片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供洗脱液，使用质谱仪确定所述洗脱液中抗体片段的分子量数据，以及将片段的分子量数据与由至少一种已知蛋白质标准物获得的数据相关联。
在一些特定的示例性实施方案中，色谱系统可包括具有另外的相互作用的尺寸排阻色谱树脂。
在一些特定的示例性实施方案中，色谱系统可包括具有疏水相互作用功能的尺寸排阻色谱树脂。
在一些特定的示例性实施方案中，色谱系统可包括具有电荷-电荷相互作用功能的尺寸排阻色谱树脂。
在一些示例性实施方案中，片段可为抗体的消化产物。消化产物可通过水解剂形成。水解剂可包括使用酶消化或非酶消化执行消化的剂。水解剂可为可使用酶消化执行消化的剂，并且可包括胰蛋白酶、胞内蛋白酶Arg-C、胞内蛋白酶Asp-N、胞内蛋白酶Glu-C、外膜蛋白酶T(OmpT)、酿脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和佐氏曲霉蛋白酶。水解剂也可为可使用非酶消化执行消化的剂，并且可包括使用高温、微波、超声波、高压、红外、溶剂。消化产物可为产物相关杂质。
在一些示例性实施方案中，片段可包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一些示例性实施方案中，抗体可为具有在约4.5至约9.0范围内的pI的蛋白质。在一个方面，抗体可为具有以下pI的蛋白质：约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0。
在一些示例性实施方案中，片段可为具有在约4.5至约9.0范围内的pI的蛋白质。在一个方面，片段可为具有以下pI的蛋白质：约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0。
在一个示例性实施方案中，样品中的片段数量可为至少两个。
在一些示例性实施方案中，加载在色谱系统上的样品中的总蛋白量可在约10μg至约100μg的范围内。在一个示例性实施方案中，加载在色谱系统上的样品的量可为约10μg、约12.5μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg或约100μg。
在一些示例性实施方案中，用于洗脱片段的流动相可以是可与质谱仪相容的流动相。在一个方面，流动相可为乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。
在一个示例性实施方案中，流动相的总浓度范围可高达约600mM。在一个方面，流动相的总浓度可为约5mM、约6mM、7mM、约8mM、9mM、约10mM、12.5mM、约15mM、17.5mM、约20mM、25mM、约30mM、35mM、约40mM、45mM、约50mM、55mM、约60mM、65mM、约70mM、75mM、约80mM、75mM、约95mM、100mM、约110mM、120mM、约130mM、140mM、约150mM、160mM、约170mM、180mM、约190mM、200mM、约225mM、250mM、约275mM、300mM、约325mM、350mM、约375mM、400mM、约4205mM、450mM、约475mM、500mM、约525mM、550mM、约575mM或约600mM。
在一些示例性实施方案中，流动相可具有约0.1ml/min至约0.4ml/min的流速。在一个方面，流动相的流速可为约0.1ml/min、约0.15ml/min、约0.20ml/min、约0.25ml/min、约0.30ml/min、约0.35ml/min或约0.4ml/min。
在一个示例性实施方案中，质谱仪可为串联质谱仪。
在另一个示例性实施方案中，质谱仪可包括纳米喷雾。
在一些示例性实施方案中，抗体可为单克隆抗体。
在一些示例性实施方案中，抗体可为治疗性抗体。
在一些示例性实施方案中，抗体可为免疫球蛋白蛋白。
在一些示例性实施方案中，抗体可为双特异性抗体。
在一个示例性实施方案中，双特异性抗体可为抗CD20/CD3单克隆抗体。
在一个示例性实施方案中，使用小鼠成纤维细胞系MG87生成抗体。
在一些示例性实施方案中，片段可为在消化抗体时形成的抗体片段。
在一个示例性实施方案中，片段可为翻译后修饰的蛋白质。
在另一个示例性实施方案中，片段可为生物制剂产品中发现的杂质。
在另一个示例性实施方案中，片段可为在生物制剂产品制造期间发现的杂质。
在一些示例性实施方案中，使用流动相洗涤混合模式色谱树脂需要少于约30分钟。在一个方面，使用流动相洗涤混合模式色谱树脂所需的时间可为约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟或约30分钟。
在一些示例性实施方案中，色谱系统可用于至少约3次样品运行而无需清洁。在一个方面，色谱系统可用于至少约3次样品运行、至少约4次样品运行、至少约5次样品运行、至少约6次样品运行、至少约7次样品运行或至少约8次样品运行而无需清洁。
应当理解，所述方法不限于上述蛋白质、片段、杂质和柱中的任一种，并且可通过任何合适的方式进行用于识别或定量的方法。
本公开还提供了一种混合模式色谱系统，所述系统包括能够使用流动相洗涤以提供洗脱液的色谱柱110以及耦接到色谱柱110的质谱仪120(参见图3)。
在一个示例性实施方案中，色谱柱110可能够使用样品加载装置100与包含抗体片段的样品接触。
在一些示例性实施方案中，可加载在色谱柱110上的样品的量可在约10μg至约100μg范围内。在一个方面，可加载在色谱柱110上的样品的量可为约10μg、约12.5μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg或约100μg。
在一些示例性实施方案中，色谱柱110可能够用流动相洗涤。在一个方面，流动相可为乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。
在一个示例性实施方案中，可用于色谱柱110的流动相的总浓度范围可高达约600mM。在一个方面，可用于色谱柱110的流动相的总浓度可为约5mM、约6mM、7mM、约8mM、9mM、约10mM、12.5mM、约15mM、17.5mM、约20mM、25mM、约30mM、35mM、约40mM、45mM、约50mM、55mM、约60mM、65mM、约70mM、75mM、约80mM、75mM、约95mM、100mM、约100mM、120mM、约130mM、140mM、约150mM、160mM、约170mM、180mM、约190mM、200mM、约225mM、250mM、约275mM、300mM、约325mM、350mM、约375mM、400mM、约425mM、450mM、约475mM、500mM、约525mM、550mM、约575mM或约600mM。
在另一个示例性实施方案中，可用于色谱柱110的流动相可具有0.1ml/min至0.4ml/min的流速。在一个方面，可用于色谱柱110的流动相的流速可为约0.1ml/min、约0.15ml/min、约0.20ml/min、约0.25ml/min、约0.30ml/min、约0.35ml/min或约0.4ml/min。
在一个示例性实施方案中，用于能够与包含抗体片段的样品接触的色谱柱110的流动相可用于洗脱片段。
在一些示例性实施方案中，色谱柱110可能够与质谱仪120耦接。
在一个示例性实施方案中，质谱仪120可包括纳米喷雾。
在一些示例性实施方案中，质谱仪120可为串联质谱仪。
在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130片段(如图3所示)。片段可包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一个示例性实施方案中，混合模式色谱系统可用于识别140和/或定量130多于一个片段。
在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130单克隆抗体片段。
在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130治疗性抗体片段。
在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130免疫球蛋白蛋白片段。
在一个示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130IgG1蛋白片段。
在一个示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130IgG4蛋白片段。
在一个示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130双特异性抗体片段。
在一个示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130抗CD20/CD3单克隆抗体片段。
在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130在抗体消化时形成的抗体片段的片段。
在另一个示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130可作为在生物制剂产品中发现的杂质的片段。
在另一个示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130片段，其中所述片段可为在生物制剂产品制造期间发现的杂质。
在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130片段，其中所述片段可为具有在约4.5至约9.0范围内的pI的蛋白质。
在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统可能够识别140和/或定量130片段，其中所述片段可为产物相关杂质。
在一个示例性实施方案中，样品中的片段数量可为至少两个。
在一些示例性实施方案中，色谱柱110能够用于至少约3次样品运行而无需清洁。
在一个示例性实施方案中，色谱柱110可用于至少约3次样品运行、至少约4次样品运行、至少约5次样品运行、至少约6次样品运行、至少约7次样品运行或至少约8次样品运行而无需清洁。
应当理解，所述系统不限于上述蛋白质、杂质、流动相或色谱柱中的任一种。
用数字和/或字母连续标记如本文提供的方法步骤并不意味着将方法或其任何实施方案局限于特定的指示顺序。
不同的出版物(包括专利、专利申请、公布的专利申请、登录号、技术文献和学术文章)在整个说明书中引用。这些引用的参考文献各自整体并出于所有目的以引用的方式并入本文。
通过参考以下实施例，将更充分地理解本公开，提供所述实施例以更详细地描述本公开。它们旨在说明而不应解释为限制本公开的范围。
实施例
实施例1.与质谱耦接的混合模式尺寸排阻色谱(MM-SEC-MS)
通过与UV检测器和电喷雾质谱仪(Thermo Exactive EMR，USA).]耦接的Acquity系统(Waters，Milford，MA，USA)进行分离。质谱仪在正分辨率模式下运行，并且从m/z[2000–15,000]记录数据。根据制造商的程序，在采集范围内实现校准。
实施例2.在Zenix-SEC柱上使用MM-SEC-MS检测双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的消化混合物中的片段
2.1双特异性抗体的样品制备
抗CD20 x抗CD3双特异性抗体是基于被修饰来减少Fc结合的IgG4同种型的铰链稳定的CD20xCD3双特异性全长抗体(Ab)。它被设计来结合T细胞(通过CD3)和CD20表达细胞。通过遵循如Smith等人(Sci.Rep.(2015)5:17943)所述的方法来产生双特异性抗体。
2.2双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的片段的生成
在37℃下，将1mg双特异性抗体用100单位的
Figure BDA0003118363860000281
在0.1M Tris-HCl缓冲液pH 7.5中消化60分钟。
2.3 MM-SEC-MS
在如实施例1所述的系统上使用Zenix SEC-300MK柱(4.6×300nm，3μm)等度地进行使用MM-SEC-MS的分析。通过在280nm处的UV监测洗脱。
进行了八组实验，其中流动相的总浓度不同：10mM缓冲液、20mM缓冲液、30mM缓冲液、40mM缓冲液、50mM缓冲液、60mM缓冲液、70mM缓冲液和75mM缓冲液。以0.3mL/min的流速进行洗脱。在Waters Acquity I-class UPLC系统上进行色谱，其中柱温为室温。使用由14:1摩尔比的乙酸铵(缓冲液A)和碳酸氢铵(缓冲液B)组成的流动相进行平衡。
对于分析运行，进样负载由10μg总蛋白组成。使用由乙酸铵(缓冲液A)和碳酸氢铵(缓冲液B)组成的等度梯度进行洗脱。通过使用Intact Mass软件分析质谱数据。
当使用较低浓度的流动相时，观察到片段之间的分离增加(例如，对于10mM缓冲液浓度，观察到双特异性Ab的F(ab)2片段、同源二聚体1的F(ab)2片段和Fc片段之间的显著分离(参见图4)。较低的盐浓度增强了MM-SEC柱中的电荷-电荷相互作用，这提供了双特异性Ab的片段之间的更好分离(参见图4和图5)。
实施例3.在Zenix-SEC柱上使用MM-SEC-MS检测双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的消化混合物中的片段
3.1如2.1和2.2所示进行双特异性抗体的样品制备以及双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体的片段的生成。
3.2 MM-SEC-MS
在如实施例1所述的系统上使用Zenix SEC-300MK柱(4.6×300nm，3μm)等度地进行使用MM-SEC-MS的分析。通过在280nm处的UV监测洗脱。
进行了六组实验，其中流动相的总浓度不同：50mM缓冲液、60mM缓冲液、70mM缓冲液、75mM缓冲液、100mM缓冲液和300mM缓冲液。以0.2mL/min的流速进行洗脱。在WatersAcquity I-class UPLC系统上进行色谱，其中柱温为室温。使用流动相进行平衡。
对于分析运行，进样负载由10μg总蛋白组成。使用由乙酸铵(缓冲液A)和碳酸氢铵(缓冲液B)组成的等度梯度进行洗脱。通过使用来自Protein Metrics的Intact Mass软件分析质谱数据。
较低的盐浓度增强了MM-SEC柱中的电荷-电荷相互作用，并且较高的盐浓度增强了MM-SEC柱中的疏水相互作用。在50mM缓冲液浓度下，系统显示出在双特异性抗体的F(ab)2片段与Fc片段之间的更好分离，而在300mM下，系统显示出在双特异性抗体的F(ab)2片段与同源二聚体1的F(ab)2片段之间的更好分离(参见图6和图7)。双特异性抗体和同源二聚体1的F(ab)2片段与双特异性抗体和同源二聚体2的F(ab)2片段的保留时间差异进一步表明，在300mM的高缓冲液浓度下获得更好的分离(图8)。
实施例4.使用Zenix SEC-300,3μm,
Figure BDA0003118363860000301
7.8×300mm检测抗体分子(Ab1)的片段
4.1 Ab1片段的生成
在37℃下，将0.5mg Ab1用[50单位]
Figure BDA0003118363860000302
在0.1M Tris-HCl缓冲液pH7.5中消化60分钟以形成片段。
4.2 MM-SEC-MS
在如实施例1所述的系统上使用Zenix SEC-300MK柱(4.6×300nm，3μm)等度地进行使用MM-SEC-MS的分析。通过在280nm处的UV监测洗脱。
进行了五组实验，其中流动相的总浓度不同：30mM缓冲液、40mM缓冲液、66mM缓冲液、100mM缓冲液和200mM缓冲液。以0.2mL/min的流速进行洗脱。在Waters Acquity I-Class UPLC系统上进行色谱，其中柱温为室温。使用流动相进行平衡。
对于分析运行，进样负载由10μg总蛋白组成。使用由乙酸铵(缓冲液A)和碳酸氢铵(缓冲液B)组成的等度梯度进行洗脱。通过使用来自Protein Metrics的Intact Mass软件分析质谱数据。
使用不同浓度的流动相的运行表明，较低的盐浓度增强了MM-SEC柱中的电荷-电荷相互作用，从而提供更好的片段分离(参见图9和图10)。比较Ab1的Fc片段与Ab1的F(ab)2片段的保留时间，30mM的流动相浓度提供最佳分离。此外，HC同源二聚体-F(ab)2与HC*CDR3剪切产物的保留时间的差异进一步表明，在30mM的低缓冲液浓度下获得更好的分离(图11)。
如实施例1至3所示的片段在不同缓冲液浓度下显示出更好的分离。此影响可能是由于不同类型的与所用的尺寸排阻色谱树脂的相互作用：蛋白质的电荷、形状或疏水性。在给定盐浓度下蛋白质上的电荷取决于pI值(表1和表2)。在pI值差异较大的情况下，获得了与MM-SEC介质的电荷相互作用的显著差异。对于同一类IgG分子，疏水性差异源自Fab区。在较低的盐浓度下，保留时间可由电荷-电荷相互作用驱动，并且在较高的盐浓度下，保留时间由疏水相互作用驱动。因此，可在MM-SEC-MS系统中使用盐浓度较高的流动相分离酸性或疏水性分子，并且可在MM-SEC-MS系统中使用盐浓度较低的流动相分离碱性分子(参见图12和图13)。
表1
Figure BDA0003118363860000311
表2.
Figure BDA0003118363860000312
实施例5.在Waters BEH SEC柱上使用MM-SEC-MS检测双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的消化混合物中的片段
5.1如2.1和2.2所示进行双特异性抗体的样品制备以及双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体的片段的生成。
5.2 MM-SEC-MS
在如实施例1所述的系统上使用Waters BEH SEC柱(4.6×300nm，3μm)等度地进行使用MM-SEC-MS的分析。通过在280nm处的UV监测洗脱。
进行了八组实验，其中流动相的总浓度不同：20mM缓冲液、27.6mM缓冲液、30mM缓冲液、40mM缓冲液、50mM缓冲液、100mM缓冲液、150mM缓冲液和300mM缓冲液。以0.2mL/min的流速进行洗脱。在Waters Acquity I-class UPLC系统上进行色谱，其中柱温为室温。使用流动相进行平衡。
对于分析运行，进样负载由10μg总蛋白组成。使用由乙酸铵(缓冲液A)和碳酸氢铵(缓冲液B)组成的等度梯度进行洗脱。通过使用Intact Mass软件分析质谱数据。
与在Zenix SEC柱上进行的过程相似，对双特异性Ab、同源二聚体1和同源二聚体2的消化混合物进行的MM-SEC-MS分析在较低缓冲液浓度(即20mM缓冲液)下显示出较大的分离(参见图14和图15)。
实施例6.使用MM-SEC-MS识别Ab1中新的HC*CDR3剪切位点。
6.1 Ab1片段的生成
Ab1片段是使用如4.1中描述的方法生成的
6.2 MM-SEC-MS
在如实施例1所述的系统上使用Zenix SEC柱(4.6×300nm，3μm)等度地进行使用MM-SEC-MS的分析。通过在280nm处的UV监测洗脱。
使用总浓度为40mM缓冲液的流动相进行分析，并且以0.2mL/min的流速进行洗脱。在Waters Acquity I-class UPLC系统上进行色谱，其中柱温为室温。使用流动相进行平衡。
对于分析运行，进样负载由10μg总蛋白组成。使用由乙酸铵(缓冲液A)和碳酸氢铵(缓冲液B)组成的等度梯度进行洗脱。通过使用来自Protein Metrics的Intact Mass软件分析质谱数据。样品的总离子色谱图显示出两个峰，其中保留时间分别为16分钟和17分钟。一个峰的质量分析具有质荷比为5162.62和6663.59的片段(参见图16)。此峰在16min时显示出两个m/z峰分布，一个(电荷态中的一个为5162.62)对应于K105和F106之间的酰胺键水解，但片段仍通过非共价相互作用保持在一起，另一个m/z峰分布(电荷态中的一个为m/z6663.59)对应于水解产物的解离片段。另一个峰显示出质荷比为5161.43的片段(图16和图17)。将质量与基于Ab1序列的计算进行比较，并识别为具有一个剪切位点(酰胺键水解)的双特异性Ab-F(ab)2(MW＝98,069.8)、缺少HC*(E1-K105)的双特异性Ab-F(ab)2(MW＝86,612.7)和完整的双特异性Ab F(ab)2(MW＝98,048.1)。这些片段导致识别双特异性Ab的HC中的在赖氨酸105与苯丙氨酸106之间的片段化位点。
6.3通过天然SCX-MS确认HC*CDR3剪切位点
使用YMC BioPro SP-F柱(4.6×100nm)进行使用强阳离子色谱法的分析。通过在280nm处的UV监测洗脱。通过与UV检测器和电喷雾质谱仪(Thermo Exactive EMR，USA)耦接的Acquity系统(Waters，Milford，MA，USA)进行分离。质谱仪在正分辨率模式下运行，并且从m/z 2000–15,000记录数据。根据制造商的程序，在采集范围内实现校准。
使用梯度洗脱以4mL/min流速进行分析：在18min内从100％A到100％B；其中溶剂A为20mM乙酸铵pH 5.6，并且溶剂B为140mM乙酸铵+10mM碳酸氢铵。使用流动相进行平衡。
对于分析运行，进样负载由50μg总蛋白组成。如上所述进行洗脱。通过使用来自Protein Metrics的Intact Mass软件分析质谱数据。样品的色谱图显示出两个峰，其中保留时间分别为12分钟和13分钟。一个峰的质量分析具有质荷比为5162.66和6663.51的片段。另一个峰显示出质荷比为5161.51的片段(图18和图19)，这证实了通过使用MM-SEC-MS系统获得的片段：具有一个剪切位点(酰胺键水解)的双特异性Ab-F(ab)2(MW＝98,069.8)、缺少HC*(E1-K105)的双特异性Ab-F(ab)2(MW＝86,612.7)和完整的双特异性Ab F(ab)2(MW＝98,048.1)。
6.4 HC*CDR3剪切片段的定量
在37℃下，将100ug的HC*CDR3剪切片段用2ug AspN酶在0.1M Tris-HCl缓冲液pH7.5中消化18小时以形成其片段。使用PepMap柱得到的片段色谱图提供了Ab1的HC*CDR3剪切片段的定量(图20)。
6.5Ab1对血浆蛋白酶的在体内形成HC*CDR3剪切片段的易感性
在如实施例1所述的系统上使用Zenix SEC-300MK柱(4.6×300nm，3μm)等度地对形成的消化片段进行MM-SEC-MS分析。通过在280nm处的UV监测洗脱。使用胰蛋白酶预测体内Ab1对血浆蛋白酶的形成HC*CDR3剪切片段(在实施例6.2中识别)的易感性。在37℃下，以200:1的比率向如4.1所述的Ab1抗体的消化片段中添加胰蛋白酶。
将由10μg总蛋白组成的进样负载加载到柱上。使用总浓度为30mM的流动相(乙酸铵(缓冲液A)和碳酸氢铵)进行分析，并且以0.2mL/min的流速进行洗脱。在Waters AcquityI-Class UPLC系统上进行色谱，其中柱温为室温。
在添加胰蛋白酶的零时间点，片段化显示出存在HC*CDR3剪切片段(图21，上图)。在添加胰蛋白酶后35分钟的时间进行类似分析，片段化显示出在HC*CDR3剪切片段存在下的显著增加(图21，下图)。这指示抗体Ab1在位点(K105-F106)处被胰蛋白酶裂解，从而表明体内抗体Ab1易于在体内发生此种裂解。

Claims (18)

1.一种用于识别抗体的片段化位点的方法，所述方法包括：
使包含所述抗体的至少一个片段的样品与具有带有另外的功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触；
使用流动相洗涤所述混合模式尺寸排阻色谱树脂，以提供具有所述抗体的所述至少一个片段的洗脱液；
使用质谱仪确定所述洗脱液中所述抗体的所述至少一个片段的分子量数据；以及
将所述抗体的所述至少一个片段的分子量数据与由至少一种已知蛋白质标准物获得的数据相关联。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述流动相具有乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述流动相的总浓度小于约600mM的乙酸铵和碳酸氢铵。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述流动相的流速为约0.2ml/min至约0.4ml/min。
5.如权利要求1所述的方法，其中加载到所述混合模式尺寸排阻色谱树脂上的所述样品的量为约10μg至约100μg。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体为双特异性抗体。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体为治疗性抗体。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪耦接至所述色谱系统。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体的所述片段化位点是在所述抗体的铰链区中。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体的所述片段化位点是在恒定免疫球蛋白结构域中。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体的所述片段化位点是在所述抗体的可变结构域中。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述另外的功能为电荷-电荷相互作用功能。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述另外的功能为疏水相互作用功能。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个片段为F(ab)2片段。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个片段为Fc片段。
17.一种用于识别抗体的片段的方法，所述方法包括：
使包含所述抗体的所述片段的样品与具有带有疏水功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触；
使用流动相洗涤所述混合模式尺寸排阻色谱树脂，以提供具有所述抗体的所述片段的洗脱液；
使用质谱仪确定所述洗脱液中所述抗体的所述片段的分子量数据；以及
将所述抗体的所述片段的分子量数据与由至少一种已知蛋白质标准物获得的数据相关联以识别所述片段。
18.一种用于定量抗体的片段的方法，所述方法包括：
使包含所述抗体的所述片段的样品与具有带有疏水功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触；
使用流动相洗涤所述混合模式尺寸排阻色谱树脂，以提供具有所述抗体的所述片段的洗脱液；以及
定量所述抗体的所述片段的量。
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