CN116490777A - 用于使用氢交换质谱法鉴定结合位点的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于使用氢交换质谱法鉴定蛋白质药物产品与宿主细胞蛋白(HCP)之间的结合位点的方法。本申请还提供了用于修饰蛋白质药物产品以消除由HCP进行的切割或修饰的方法。另外，本申请提供了用于阻断蛋白质药物产品中鉴定出的结合位点以消除由HCP进行的切割或修饰的方法。

Description

用于使用氢交换质谱法鉴定结合位点的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月11日提交的美国临时专利申请第63/077,220号的优先权和权益，所述美国临时专利申请通过引用并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于使用氢交换质谱法鉴定所关注蛋白质或蛋白质药物产品中的宿主细胞蛋白的结合位点的方法。
背景技术
残留的宿主细胞蛋白(HCP)的存在可能会引起生物医药产品的潜在安全风险以及制造中的问题，特别是在存在具有酶促活性的HCP的情况下。由于重组DNA技术已经广泛用于在宿主细胞中产生生物医药产品，所以有必要去除杂质以获得具有高纯度的生物医药产品。在进行临床研究之前，进行纯化生物处理之后的任何残余杂质应以可接受的低水平存在。具体地，来源于哺乳动物表达系统，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的残余HCP可能危及产品安全性、质量和稳定性。有时，即使微量的特定HCP也可能引起免疫原性应答或不期望的修饰。因此，需要监测药物产品中以及制造过程期间的宿主细胞蛋白。
尽管通常在药物中鉴定出羧肽酶(G3H8V5)，但从未报告过其影响单克隆抗体的完整性。在本文中，在Fd'药物中鉴定出羧肽酶，并且描述了其对Fd'药物的稳定性的影响。Fd'药物中羧肽酶的量也被量化，并且发现表明，存在低至10ppm的羧肽酶可能会损害Fd'药物稳定性。这项研究的扩展表明，羧肽酶(G3H8V5)也可以影响Fab蛋白的稳定性，但不会影响由IgG1或IgG4工程化的重组单克隆抗体。
同时，尚未完全理解HCP与mAb之间的相互作用。最普遍接受的概念是HCP与mAb共存，因为HCP与mAb之间存在非特异性结合。在本文中，应用氢氘交换质谱法(HDX-MS)研究Fd'药物与羧肽酶之间的相互作用，并且鉴定了允许羧肽酶切割Fd'药物的特异性结合位点。在由Fabricator切割的Fab蛋白中也发现了类似的结合位点。然而，Fd'融合药物和mAb药物中未鉴定出特异性结合位点。
应当理解，存在对鉴定和表征具有酶促活性的HCP杂质的方法的需要。具体地，这些方法应该能够研究HCP的结合和/或酶促机制，如鉴定蛋白质药物产品中的HCP的结合位点。这些方法应该能够在制造过程期间对生物医药产品中和样品中的酶促HCP杂质提供稳健、可靠和灵敏的检测和表征。此外，这些方法应该能够基于蛋白质药物产品修饰消除或阻断HCP的酶促活性。
发明内容
限定HCP杂质的可接受的水平已经成为使用生物处理系统制造生物医药产品的关键问题。需要鉴定和表征残余HCP杂质，以研究HCP的结合和/或酶促机制。本申请提供了用于使用氢交换质谱法(HX-MS)，例如，氢/氘交换质谱法(HDX-MS)鉴定蛋白质药物产品中HCP的结合位点的方法。本申请还提供了用于修饰蛋白质药物产品以消除由酶促HCP进行的切割或修饰的方法。另外，本申请提供了用于阻断鉴定出的结合位点以消除由HCP进行的切割或修饰的方法。
本公开提供了一种用于鉴定所关注蛋白质与第二蛋白质之间的结合位点的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：使用氧化氘温育包含所述所关注蛋白质和所述第二蛋白质的样品；将水解剂添加到所述样品中，以获得具有至少一种消化物的混合物；使用质谱仪测定所述混合物中所述至少一种消化物的分子量数据；以及将所述至少一种消化物的所述分子量数据与从至少一种已知蛋白质标准品获得的数据相关联。一方面，所述第二蛋白质是宿主细胞蛋白。一方面，使用氧化氘在室温下温育所述样品，持续约60秒至约24小时。另一方面，所述方法进一步包括通过将pH调节至约2.3和/或将温度调节至约0℃来淬灭所述样品。另一方面，将所述混合物注入到与所述质谱仪联机的液相色谱系统中。又另一方面，所述质谱仪耦接到所述液相色谱系统。
一方面，所述第二蛋白质能够切割所述所关注蛋白质。另一方面，所述切割涉及酸性残基，如天冬氨酸残基或谷氨酸残基。另一方面，所述切割发生在所述所关注蛋白质的C端。另一方面，所述第二蛋白质是羧肽酶。一方面，所述第二蛋白质是丝氨酸类型羧肽酶。又另一方面，所述所关注蛋白质是VEGF结合蛋白或VEGF微阱。在另外的方面，所述所关注蛋白质是Fab或F(ab')2。一方面，所述所关注蛋白质是蛋白质药物产品、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。
本公开至少部分提供了一种用于修饰所关注蛋白质以消除由第二蛋白质对所关注蛋白质的切割的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)通过以下鉴定由所述第二蛋白质对所述所关注蛋白质的切割机制中涉及的残基：使用氧化氘温育包含所述所关注蛋白质和所述第二蛋白质的样品；将水解剂添加到所述样品中，以获得具有至少一种消化物的混合物；使用质谱仪测定所述混合物中所述至少一种消化物的分子量数据；以及将所述至少一种消化物的所述分子量数据与从至少一种已知蛋白质标准品获得的数据相关联；以及(b)使鉴定出的残基突变为第二残基，以消除由所述第二蛋白质对所述所关注蛋白质的切割。
一方面，所述第二蛋白质是宿主细胞蛋白。一方面，使用氧化氘温育所述样品，持续约60秒至约24小时。另一方面，将所述混合物注入到液相色谱系统中。另一方面，所述液相色谱系统与所述质谱仪联机。又另一方面，所述质谱仪耦接到所述液相色谱系统。一方面，所述第二蛋白质能够切割所述所关注蛋白质。另一方面，所述切割涉及酸性残基，如天冬氨酸残基或谷氨酸残基。另一方面，所述切割发生在所述所关注蛋白质的C端。另一方面，所述天冬氨酸残基突变为碱性氨基酸或中性氨基酸。又另一方面，所述谷氨酸残基突变为碱性氨基酸或中性氨基酸。在另外的方面，所述第二蛋白质是羧肽酶。一方面，所述第二蛋白质是丝氨酸类型羧肽酶。另一方面，所述所关注蛋白质是VEGF结合蛋白或VEGF微阱。一方面，所述所关注蛋白质是Fab或F(ab')2。另一方面，所述所关注蛋白质是蛋白质药物产品、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。
本公开至少部分提供了一种用于修饰所关注蛋白质以消除由第二蛋白质对所述所关注蛋白质的切割的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)通过以下鉴定所述所关注蛋白质与所述第二蛋白质之间的结合位点：使用氧化氘温育包含所述所关注蛋白质和所述第二蛋白质的样品；将水解剂添加到所述样品中，以获得具有至少一种消化物的混合物；使用质谱仪测定所述至少一种消化物的分子量数据；以及将所述至少一种消化物的所述分子量数据与从至少一种已知蛋白质标准品获得的数据相关联；以及(b)阻断所述鉴定出的结合位点，以消除由所述第二蛋白质对所述所关注蛋白质的切割。一方面，所述第二蛋白质是宿主细胞蛋白。一方面，使用氧化氘温育所述样品，持续约60秒至约24小时。一方面，将所述混合物注入到液相色谱系统中。一方面，所述液相色谱系统与所述质谱仪联机。一方面，所述质谱仪耦接到所述液相色谱系统。一方面，所述第二蛋白质能够切割所述所关注蛋白质。一方面，所述切割涉及酸性残基，如天冬氨酸残基或谷氨酸残基。另一方面，所述切割发生在所述所关注蛋白质的C端。一方面，所述第二蛋白质是羧肽酶。一方面，所述第二蛋白质是丝氨酸类型羧肽酶。一方面，所述所关注蛋白质是VEGF结合蛋白或VEGF微阱。一方面，所述所关注蛋白质是Fab或F(ab')2。一方面，所述所关注蛋白质是蛋白质药物产品、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。一方面，所述方法进一步包括使用基因突变、敲除、化学修饰、酶促修饰或其组合阻断所述鉴定出的结合位点。
当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其它方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。
附图说明
图1示出了根据示例性实施例的使用完整质谱法在不同中间时间点，包含第零天(T0)、第一天(T1)、第四天(T4)或第八天(T8)进行的对由HCP杂质引起的VEGF微阱的C端缺失的分析。
图2示出了根据示例性实施例的使用免疫沉淀作为鉴定HCP的概况分析方法。根据示例性实施例，使用链霉亲和素涂覆的磁珠和生物素化的抗HCP F550抗体来富集HCP。
图3示出了根据示例性实施例的使用完整质谱法在不同中间时间点进行的对由HCP杂质引起的MAB1的F(ab')2片段的C端缺失的分析。根据示例性实施例，HCP杂质存在于VEGF微阱样品中。
图4示出了根据示例性实施例的使用完整质谱法在不同中间时间点进行的对由重组羧肽酶引起的MAB1的F(ab')2片段的C端缺失的分析。
图5示出了根据示例性实施例的基于HX-MS分析结果的含有VEGF微阱和羧肽酶的蛋白质复合物的三维结构。根据示例性实施例，在VEGF微阱中鉴定出指示羧肽酶的结合位点的强保护区。
具体实施方式
在生物医药产品的制造期间，需要去除杂质以获得具有高纯度的生物医药产品。在制造、储存、运输、处理和施用期间应维持药物调配物的稳定性。生物医药产品中的残余宿主细胞蛋白(HCP)可能会由于损害产品稳定性和质量而对患者造成潜在的安全风险。具体地，一些具有酶促活性的HCP杂质，如蛋白酶，可能引起生物医药产品的不期望的降解、修饰或改变。特定酶促HCP的鉴定和消除对于确保产品安全性和稳定性至关重要。重要的是要了解酶促HCP的反应机制，包含酶促反应的工作条件、底物中酶促结合位点的位置、底物中切割/修饰位点的位置以及酶促反应的结果，如最终产物的化学结构。
本申请提供了用于使用HX-MS鉴定蛋白质药物产品中的HCP的结合位点的方法。本申请还提供了用于修饰蛋白质药物产品以消除由酶促HCP进行的蛋白质药物产品的切割或修饰的方法。本申请的方法可以进一步包含使蛋白质药物产品中的鉴定出的残基突变以消除由酶促HCP进行的切割或修饰的步骤，其中所述鉴定出的残基涉及鉴定出的结合和/或酶促机制。另外，本申请可以进一步包含阻断鉴定出的结合位点以消除由酶促HCP进行的生物医药产品的切割或修饰的方法。
在一些实施例中，本申请提供了用于使用HX-MS鉴定蛋白质药物产品中的HCP的结合位点的方法。本申请的方法包含以下步骤：使用氧化氘温育含有蛋白质药物产品和HCP的样品；将水解剂添加到所述样品中以获得肽混合物；使用质谱仪测定肽混合物的分子量数据；以及分析肽混合物的分子量数据/将肽混合物的分子量数据与已知的蛋白质标准品的数据相关联。一方面，通过与液相色谱系统在线耦接的质谱仪分析肽混合物。另一方面，本申请提供了用于修饰蛋白质药物产品以消除由酶促HCP进行的蛋白质药物产品的切割的方法。修饰蛋白质药物产品的方法包含以下步骤：鉴定涉及HCP的切割机制的氨基酸残基；以及将鉴定处的残基突变为不同的残基，以消除由HCP进行的蛋白质药物产品的切割。一方面，修饰蛋白质药物产品的方法包含以下步骤：鉴定涉及HCP的结合位点的氨基酸残基；以及阻断鉴定出的结合位点，以消除由HCP进行的蛋白质药物产品的切割。阻断所述鉴定出的结合位点的方法包含基因突变、敲除、化学修饰、酶促修饰或其组合。
一方面，HCP是丝氨酸类型羧肽酶，其能够在C端切割蛋白质药物产品。另一方面，所述丝氨酸类型羧肽酶的切割机制涉及酸性残基，如天冬氨酸残基或谷氨酸残基。在又另一方面，所述蛋白质药物产品是VEGF结合蛋白、VEGF微阱、Fab、F(ab')2、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。
提高生物医药产品的质量、功效和安全性的需求导致对鉴定和表征具有酶促活性的HCP杂质的需求不断增加。本公开提供了用于满足上述需求的方法。本文所公开的示例性实施例通过提供鉴定蛋白质药物产品与HCP之间的结合位点、修饰蛋白质药物产品以消除由HCP进行的切割以及阻断鉴定出的结合位点以消除由HCP进行的切割的方法来满足上述需求。
术语“一个(a)”应理解为意指“至少一个”；并且术语“约”和“大约”应理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员将理解的；并且在提供范围的情况下，包含端点。如本文所使用的，术语“包含(include/includes/including)”意指非限制性的并且被理解为分别意指“包括(comprise/comprises/comprising)”。
在一些示例性实施例中，本申请提供了一种用于使用氢交换质谱法鉴定所关注蛋白质与第二蛋白质之间的结合位点的方法，所述方法包括：使用氧化氘温育包含所述所关注蛋白质和所述第二蛋白质的样品；将水解剂添加到所述样品中，以获得具有至少一种消化物的混合物；使用质谱仪测定所述混合物中所述至少一种消化物的分子量数据；以及将所述至少一种消化物的所述分子量数据与从至少一种已知蛋白质标准品获得的数据相关联。一方面，所述第二蛋白质是宿主细胞蛋白。另一方面，所述所关注蛋白质是VEGF结合蛋白、VEGF微阱或者Fab或F(ab')2。在另外的方面，所述所关注蛋白质是蛋白质药物产品、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。
如本文所使用的，术语“氢交换质谱法”、“HX-MS”、“氢/氘交换质谱法”或“HDX-MS”是指使用质谱法(MS)测量并入到蛋白质分子中的氘。HX-MS可以用于监测溶液中蛋白质分子的结构和动力学方面，因为蛋白质分子暴露于氧化氘(氧化二氘、D2O或重水)可以在缺乏稳定氢键的无序区中诱导从酰胺H(氢)到酰胺D(氘)的快速交换，例如，进行氢交换反应、氢/氘交换反应或HDX反应。随后，基于质谱法(MS)的肽图谱可以用于测量单个蛋白质区段的质量位移。(Konermann等人,氢交换质谱法用于研究蛋白质结构和动力学(Hydrogenexchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics),《化学学会评论(Chem Soc Rev.)》2011年3月,40(3),第1224-1234页)在淬灭氢交换反应后，使蛋白质经受蛋白水解以获得肽混合物。随后，可以使用MS基于单个肽的质量位移来测定和分析这些肽中的氘交换的位置和相对量。氘含有中子和质子。由于氘原子核的重量是氢原子核的两倍，所以当其氢被氘替代时，蛋白质分子会变得更重。蛋白质分子的主链酰胺氢交换率(H/D交换率)的测量结果可以提供关于蛋白质结构、动力学和相互作用的详细信息。通过使用与MS的电喷雾电离源耦接的液相色谱法分析衍生的肽混合物，可以测量酰胺氘并入到完整蛋白质分子中。在蛋白质分子的天然结构内，氢交换率可以变化若干个数量级。氢交换速率取决于溶剂可及性和氢键。蛋白质分子的表面上的酰胺氢与水结合，表现出高氢交换率。位于蛋白质分子的稳定二级结构内的酰胺氢表现出低氢交换率。(Johnson等人,Apo-和Holo-肌红蛋白的蛋白质酰胺氢交换的质谱测量(Mass Spectrometric Measurement ofProtein Amide Hydrogen Exchange of Apo-and Holo-Myoglobin).《蛋白质科学(Protein Science)》,1994,3(12):2411–2418)
如本文所使用的，术语“蛋白质”包含具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包括一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常被称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体以及通过肽键连接的其合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成肽或多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。各种固相肽合成方法是本领域的技术人员已知的。蛋白质可以含有一个或多个多肽以形成单一功能性生物分子。蛋白质可以包含任何生物治疗性蛋白质、用于研究或疗法的重组蛋白、trap蛋白和其它嵌合受体Fc融合结合分子、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体。在另一个示例性方面，蛋白质可以包含抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统来产生，如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母(Pichia sp.))和哺乳动物系统(例如，CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于讨论生物治疗蛋白及其生产的综述，参见DariusGhaderi等人,用于生物治疗性糖蛋白的生产平台-非人类唾液酸化的发生、影响和挑战(Production platforms for biotherapeutic glycoproteins.Occurrence,impact,andchallenges of non-human sialylation),28《生物技术和基因工程综述(Biotechnologyand Genetic Engineering Reviews)》147-176(2012)。在一些示例性实施例中，蛋白质包括修饰、加合物和其它共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包含例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和其它单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAG标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记以及其它染料等。蛋白质可以根据组成和溶解度来分类，并且因此可以包含简单蛋白质，如球状蛋白质和纤维状蛋白质；缀合蛋白，如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及源性蛋白质，如初级源性蛋白质和次级源性蛋白质。
如本文所使用的，术语“水解剂”是指可以进行蛋白质分子的消化的大量不同药剂中的任何一种或其分子组合。可以进行酶促消化的水解剂的非限制性实例包含胰蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Glu-C、外膜蛋白酶T(OmpT)、化脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶以及来自佐氏曲霉(Aspergillus Saitoi)的蛋白酶。可以进行非酶促消化的水解剂的非限制性实例包含使用高温、微波、超声、高压、红外和溶剂(非限制性实例是乙醇和乙腈)。非酶促消化的实例还可以包含固定化酶消化(IMER)、磁性颗粒固定化酶和芯片上固定化酶。关于讨论蛋白质消化的可用技术的综述，参见Linda Switzar、Martin Giera和Wilfried M.A.Niessen,蛋白质消化：可用技术和最新发展概述(Protein Digestion:AnOverview of the Available Techniques and Recent Developments),12《蛋白质组学研究杂志(Journal of Proteome Research)》1067-1077(2013)。水解剂中的一种或组合可以以序列特异的方式切割蛋白质或多肽中的肽键，从而产生可预测的较短肽的集合。有若干种方法可以用于消化蛋白质分子。用于消化样品中的蛋白质分子的广泛接受的方法之一涉及使用蛋白酶。许多蛋白酶都是可用的，并且所述蛋白酶中的每种蛋白酶在特异性、效率和最佳消化条件方面都具有其自己的特性。蛋白酶是指内肽酶和外肽酶两者，如基于蛋白酶在肽内的非末端或末端氨基酸处切割的能力而分类的。可替代地，蛋白酶也指六个不同的类别：天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶、半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸蛋白酶，如根据催化机制分类的。术语“蛋白酶”和“肽酶”可互换使用，是指水解肽键的酶。蛋白酶也可以分为特异性和非特异性蛋白酶。如本文所使用的，术语“特异性蛋白酶”是指具有在肽的特定氨基酸侧链处切割肽底物的能力的蛋白酶。如本文所使用的，术语“非特异性蛋白酶”是指在肽的特定氨基酸侧链处切割肽底物的能力降低的蛋白酶。可以基于作为切割位点的特定氨基酸的数量与蛋白质序列中切割的氨基酸总数的比率来确定切割偏好。
如本文所使用的，术语“消化物”是指使用水解剂水解蛋白质的一个或多个肽键而获得的衍生产物，如肽。存在若干种方法用于使用适当的水解剂进行样品中的蛋白质的水解或消化，例如酶消化或非酶消化。
如本文所使用的，术语“宿主细胞蛋白”包含源自宿主细胞的蛋白质，并且可以与期望的所关注蛋白质无关。宿主细胞蛋白可以是工艺相关的杂质，所述杂质可以源自制造工艺并且可以包含三个主要类别：细胞底物源性、细胞培养物源性和下游源性。细胞底物源性杂质包含但不限于源自宿主生物体的蛋白质和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)。细胞培养物源性杂质包含但不限于诱导剂、抗生素、血清和其它介质组分。下游源性杂质包含但不限于酶、化学和生化加工试剂(例如，溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如，重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如，单克隆抗体)和其它可浸出物。
如本文所使用的，“微阱”或“微阱结合分子”是指能够与和可以用于产生微阱的融合结合分子的靶标相同的靶标结合的分子。此类微阱可以包含(i)嵌合多肽以及(ii)包括两个或更多个多肽的多聚体(例如，二聚体)分子，所述两个或更多个多肽例如通过一个或更多个二硫桥非共价或共价结合。
如本文所使用的，“VEGF微阱”或“VEGF微阱结合分子”可以能够与血管内皮生长因子(VEGF)结合，并且在治疗上有助于治疗或预防可通过抑制VEGF(例如，VEGF110、VEGF121或VEGF165)来治疗或预防的疾病，如血管生成性眼病和癌症。此类微阱包含(i)包括一个或多个VEGF受体结构域的嵌合多肽以及(ii)包括两个或更多个多肽的多聚体(例如，二聚体)分子，所述两个或更多个多肽例如通过一个或更多个二硫桥非共价结合。对VEGF的抑制包含例如拮抗VEGF与VEGF受体的结合。本申请的VEGF微阱的VEGF受体结构域组分包含VEGFR1的免疫球蛋白样(Ig)结构域2(Flt1)(R1D2)、VEGFR2的Ig结构域3(Flk1或KDR)(Flk1D3)(R2D3)和/或VEGFR3的Ig结构域3(Flt4)(Flt1D3或R3D3)。本文中引用的Ig结构域，例如，R1D2、R2D3、R2D4和R3D3，旨在不仅涵盖完整的野生型Ig结构域，还涵盖其变体，其基本上保留了野生型结构域的功能特性，例如，当并入到VEGF微阱中时，保留了形成功能性VEGF结合结构域的能力。对于本领域技术人员而言将显而易见的是，可以获得上述Ig结构域的许多变体，其将保持与野生型结构域基本上相同的功能特性。在一些方面，微阱结合分子可以包含微阱结合分子的变体。如本文所使用的，“变体”或“结合分子变体”可以包含由于至少一种氨基酸修饰或翻译后修饰而与靶结合分子不同的结合分子。变体可以指结合分子本身、包括结合分子的组合物或编码其的氨基酸序列。优选地，结合分子变体与亲本结合分子相比具有至少一种氨基酸修饰，例如，与亲本相比，从约一种到约十种氨基酸修饰，并且优选地从约一种到约五种氨基酸修饰。本文的结合分子变体序列将优选地与亲本结合分子序列具有至少约80％的同源性，并且更优选地至少约90％的同源性，最优选地至少约95％的同源性。在一些方面，微阱结合分子可以通过消化融合结合分子来产生。
如本文所使用的，术语“Fab”或“F(ab')2”是指一些特定抗体片段，如使用蛋白酶产生的抗体片段。适于产生抗体片段(如Fab或F(ab')2片段或VEGF微阱结合分子)的蛋白酶包含蛋白内切酶，如凝血酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶SpeB(FabULOUS)或半胱氨酸蛋白酶IdeS优选地，蛋白内切酶是半胱氨酸蛋白酶IdeS例如，IdeS在恒定序列ELLGGPS的两个甘氨酸残基之间的铰链区中特异性地切割人IgG，并且SpeB在序列KTHTCPPC内的苏氨酸与半胱氨酸之间的铰链区中切割。(Genovis公司(Genovis)#A0-FR1-020)是可商购获得的。
如本文所使用的，“蛋白质药物产品”包含性质上可以是完全或部分生物的活性成分。一方面，蛋白质药物产品可以包括肽、蛋白质、融合蛋白、抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、抗原、疫苗、肽-药物缀合物、抗体-药物缀合物、蛋白质-药物缀合物、细胞、组织或其组合。另一方面，蛋白质药物产品可以包括以下的重组、工程化、修饰、突变或截断版本：肽、蛋白质、融合蛋白、抗体、抗原、疫苗、肽-药物缀合物、抗体-药物缀合物、蛋白质-药物缀合物、细胞、组织或其组合。
如本文所使用的，“抗体”旨在指由四条多肽链、通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白分子。每条重链具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链具有轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL可以由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包含提及任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包含但不限于通过重组方式制备、表达、产生或分离的那些抗体，如从经转染以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。IgG包括抗体的子集。
如本文所使用的，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术衍生自完整抗体分子，所述标准技术如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域以及任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包含例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以合成。可以通过化学方法或通过分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如，将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型、或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
如本文所使用的，短语“双特异性抗体”包含能够选择性结合两个或多个表位的抗体。双特异性抗体通常包括两条不同的重链，每条重链特异性结合两个不同分子(例如，抗原)上或同一分子上(例如，同一抗原上)的不同表位。如果双特异性抗体能够与两个不同的表位(第一表位和第二表位)选择性结合，则第一重链对第一表位的亲和力通常比第一重链对第二表位的亲和力低至少一个至两个或三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可以位于相同或不同的靶标上(例如，位于相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别同一抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别同一抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且此类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。
典型的双特异性抗体具有两条重链，所述两条重链各自具有三条重链CDR，随后是CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性但可以与每条重链缔合，或者可以与每条重链缔合且可以结合由重链抗原结合区结合的表位中的一个或多个表位，或者可以与每条重链缔合且使得重链中的一条或两条重链能够与一个或两个表位结合。BsAb可以分成两个主要类别：一类是带有Fc区(IgG样)；以及另一类是缺乏Fc区，后者通常小于包括Fc的IgG和IgG样双特异性分子。IgG样bsAb可以具有不同的形式，如但不限于三功能抗体、旋钮成孔IgG(kih IgG)、crossMab、orth-Fab IgG、双可变结构域Ig(DVD-Ig)、二合一或双功能Fab(DAF)、IgG-单链Fv(IgG-scFv)或κλ体。非IgG样不同形式包含串联scFv、双功能抗体形式、单链双功能抗体、串联双功能抗体(TandAb)、双亲和力再靶向分子(DART)、DART-Fc、纳米抗体或通过对接锁定(dock-and-lock，DNL)方法产生的抗体(Gaowei Fan、Zujian Wang和Mingju Hao,双特异性抗体及其应用(Bispecific antibodies and their applications),8《血液学与肿瘤学杂志(Journalof Hematology&Oncology)》130；Dafne Müller和Roland E.Kontermann,双特异性抗体(Bispecific Antibodies),《治疗抗体手册(Handbook of Therapeutic Antibodies)》265-310(2014))。
如本文所使用的，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双功能抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域以及三功能抗体、四功能抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的组合，并且ScFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接子连接。在一些示例性实施例中，抗体片段含有足够的亲本抗体的氨基酸序列，所述氨基酸序列是所述亲本抗体的片段，使得其如亲本抗体那样与同一抗原结合；在一些示例性实施例中，片段与具有与亲本抗体的亲和力可比的亲和力的抗原结合和/或与亲本抗体竞争以与抗原结合。抗体片段可以通过任何方式产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的片段化酶促地或化学地产生和/或抗体片段可以由编码部分抗体序列的基因重组地产生。可替代地或另外地，抗体片段可以完全地或部分地合成产生。抗体片段可以任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外地，抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段可以任选地包括多分子复合物。功能性抗体片段通常包括至少约50个氨基酸，并且更通常包括至少约200个氨基酸。
一方面，使用氧化氘在室温下温育本申请的样品，持续约60秒至约24小时。一方面，所述方法进一步包括通过将pH调节至约2.3和/或将温度调节至约0℃来淬灭所述样品。一方面，将所述混合物注入到与所述质谱仪联机的液相色谱系统中。一方面，所述质谱仪耦接到所述液相色谱系统。另一方面，本申请的所述方法中的所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪，其中所述质谱仪耦接到液相色谱法系统。
如本文所使用的，“质谱仪”包含能够鉴定特异性分子物种并且测量其准确质量的装置。所述术语意味着包含任何分子检测器，多肽或肽可以洗脱到所述分子检测器中以进行检测和/或表征。质谱仪可以包含三个主要部分：离子源、质量分析器和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或簇可以被转移到气相中，并且同时(如以电喷雾电离的方式)被电离。离子源的选择在很大程度上取决于应用。
如本文所使用的，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指喷雾电离的过程，其中溶液中的阳离子或阴离子通过在大气压下高度带电荷的液滴流的形成和去溶剂化而被转移至气相，高度带电荷的液滴是通过在含有溶液的电喷雾针的尖端与反电极之间施加电势差而产生的。从溶液中的电解质离子产生气相离子通常有三个主要步骤。这些步骤是：(a)在ES输注尖端处产生带电荷的液滴；(b)通过溶剂蒸发和重复的液滴崩解使带电荷的液滴收缩，从而导致能够产生气相离子的小的高度带电荷的液滴；和(c)气相离子由非常小的并且高度带电荷的液滴产生的机理。阶段(a)-(c)通常发生在设备的大气压区域。在一些示例性实施例中，电喷雾电离质谱仪可以是纳米电喷雾电离质谱仪。
如本文所使用的，术语“三重四极杆质谱仪”是指由两个串联的四极质谱分析器组成的串联质谱仪，所述两个串联的四极质谱分析器之间具有(非质量分辨)仅射频(RF)的四极以充当碰撞诱导离解的室。在三重四极杆质谱仪中，将肽样品注入到耦接到MS仪器的液相色谱系统中。第一个四极杆可以用作滤质器以分离具有靶向m/z的肽。第二个四极杆充当碰撞室以将肽分解成片段。第三个四极杆充当来自初始母体肽的指定m/z片段的第二个滤质器。如本文所使用的，术语“串联质谱法”包含通过使用多阶段的质量选择和质量分离可以获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子可以被转移到气相中并被完整地电离，并且所述样品分子可以在第一质量选择步骤之后以一些可预测和可控制的方式被诱导分裂。多级MS/MS或MSn可以通过首先选择并分离前体离子(MS2)、将其碎裂、分离初级碎片离子(MS3)、将其碎裂、分离次级碎片(MS4)等来进行，只要可以获得有意义的信息或碎片离子信号可以是可检测的。串联MS已通过各种分析器组合成功地执行。对于特定应用，组合哪种分析器可以由许多不同的因素确定，如灵敏度、选择性和速度，以及大小、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别是空间串联和时间串联，但也存在混合的情况，其中时间串联分析器在空间上耦接或与空间串联分析器耦接。空间串联质谱仪包括离子源、前体离子激活装置和至少两个非捕获质量分析器。可以设计具体的m/z分离函数，使得在仪器的一个区段中离子被选择、在中间区域中离解，并且然后将产物离子传输到另一个分析器进行m/z分离和数据采集。在时间串联质谱仪中，离子源中产生的离子可以在同一物理装置中被捕获、分离、碎裂和m/z分离。
通过质谱仪鉴定的肽可以用作完整蛋白质及其翻译后修饰的替代代表。所述肽可以通过关联实验和理论MS/MS数据而用于蛋白质表征，后者从蛋白质序列数据库中的可能的肽产生。所述表征包含但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后修饰或鉴定翻译后修饰或可比性分析或其组合。
如本文所使用的，术语“液相色谱系统”或“色谱系统”是指其中由液体或气体携带的化学混合物可以由于化学实体在其固定液相或固相周围或在固定液相或固相上方流动时的差异分布而分离成组分的过程。色谱法的非限制性实例包含传统的反相(RP)、离子交换(IEX)、混合模式色谱法和正相色谱法(NP)。
示例性实施例
本文所公开的实施例提供了用于使用氢交换质谱法鉴定蛋白质药物产品与HCP之间的结合位点的方法，以研究HCP的结合和/或酶促机制。
在一些示例性实施例中，本申请提供了一种用于使用氢交换质谱法鉴定所关注蛋白质与第二蛋白质之间的结合位点的方法，所述方法包括：使用氧化氘温育包含所述所关注蛋白质和所述第二蛋白质的样品；将水解剂添加到所述样品中，以获得具有至少一种消化物的混合物；使用质谱仪测定所述混合物中所述至少一种消化物的分子量数据；以及将所述至少一种消化物的所述分子量数据与从至少一种已知蛋白质标准品获得的数据相关联。
一方面，本申请的水解剂可以进行酶促消化，所述水解剂包含胰蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Glu-C、外膜蛋白酶T(OmpT)、化脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶以及来自佐氏曲霉(Aspergillus Saitoi)的蛋白酶。
一方面，本申请的第二蛋白质是HCP、酶促HCP、羧肽酶、丝氨酸类型羧肽酶或羧肽酶G3H8V5。
一方面，本申请的所关注蛋白质是VEGF结合蛋白、VEGF微阱、抗体的Fab区、抗体的F(ab')2区、蛋白质药物产品、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。
在一些示例性实施例中，本申请的方法包括使用氧化氘在室温下温育所述样品持续约60秒至约24小时的步骤，以及通过将pH调节至约2.3和/或将温度调节至约0℃来淬灭所述样品的步骤。
一方面，本申请的方法包括用氧化氘温育含有所关注蛋白质和第二蛋白质的样品持续约60秒至约24小时、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约55分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约15小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约36小时或约72小时的步骤。一方面，本申请的方法包括用氧化氘在室温下、在约18℃下、在约25℃下、在约30℃下或在约37℃下温育含有所关注蛋白质和第二蛋白质的样品持续约60秒至约24小时、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约55分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约15小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约36小时或约72小时的步骤。
一方面，本申请的方法包括通过将反应混合物的pH调节至约2.3、约2.0、约2.1、约2.2、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8或约2.9来淬灭样品的步骤。一方面，本申请的方法包括通过将反应混合物的温度调节至约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃或约5℃来淬灭样品的步骤。
应当理解，所述方法不限于上述HCP杂质、酶促结合位点、氢交换质谱法、VEGF结合蛋白、VEGF微阱、Fab片段、F(ab')2片段、蛋白质药物产品、肽、蛋白质、液相色谱系统或质谱仪中的任一种。
如本文提供的用数字和/或字母连续标记的方法步骤并不意味着将所述方法或其任何实施例限制为特定指示顺序。在整个说明书中引用了各种出版物，包含专利、专利申请、公开的专利申请、登录号、技术文章和学术文章。这些所引用的参考文献中的每个参考文献通过引用整体并且出于所有目的并入本文。除非另外描述，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。通过参考以下实例将更全面地理解本公开，提供这些实例以更详细地描述本公开。实例旨在说明并且不应被解释为限制本公开的范围。
实例
实例1.酶促HCP的鉴定和表征
将含有VEGF微阱和HCP杂质的样品在37℃下温育约2周或更长时间。在不同的中间时间点，如第零天(T0)、第一天(T1)、第四天(T4)或第八天(T8)采集测试样品，并使用完整质谱法进行分析。图1示出了使用完整质谱法在不同中间时间点进行的对VEGF微阱的C端缺失的分析。如图1所示，在时间点T1处观察到一个甘氨酸残基(G)从VEGF微阱中缺失。在时间点T4处观察到甘氨酸(G)、亮氨酸-甘氨酸(LG)和亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(LLG)的缺失。在时间点T8处观察到亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(LLG)的缺失。收集数据，直到时间点T16。在时间点T16处没有观察到另外的切割。结果指示，存在由酶促HCP进行的从VEGF微阱的C端残基逐步切割。
免疫沉淀作为概况分析方法，用于鉴定引起VEGF微阱的C端逐步缺失的HCP。使用链霉亲和素涂覆的Dynabead(磁珠)和生物素化的抗HCP F550抗体来富集HCP。图2示出了使用免疫沉淀作为鉴定HCP的概况分析方法。通过免疫沉淀和LC-MS/MS分析，羧肽酶G3H8V5被鉴定为有助于从VEGF微阱中逐步切割C端残基。具体地，将5μL的1M乙酸添加到10mg的蛋白质样品中，并且在室温下温育30分钟。添加110μL的10x TBS和20μL的过量的1M Tris-HCl(pH 8)，使pH回到7.5，然后立即将25μg的F550生物素化的抗HCP抗体添加到每个样品中。将样品在4℃下轻轻摇动温育过夜。将1.5mg的磁珠洗涤，然后添加到每个样品中，并且悬浮于1x TBS中，并且在室温下轻轻旋转温育2小时。然后将珠粒用HBS-T和1x TBS洗涤，并用100μL的50％乙腈、含0.1M乙酸的MilliQ水，通过以800rpm振荡5分钟进行两次来洗脱。将每个抗体样品干燥并重新悬浮于20μL的尿素变性和还原溶液(8M尿素，10mM DTT，0.1MTris-HCl，pH 7.5)中，并且在56℃下以500rpm温育30分钟。然后将6μL的50mM碘乙酰胺添加到每个样品中，以混合并在室温下在黑暗中反应30分钟。将50μL的20ng/μL胰蛋白酶添加到每个样品中，在37℃下消化，以750rpm振荡过夜。将经消化的样品用4μL 10％甲酸酸化，并且将20μL转移到玻璃小瓶中进行LC-MS/MS分析。将剩余部分储存在-80℃下。
羧肽酶是HCP，其通常可以在药物物质中鉴定出。羧肽酶G3H8V5是丝氨酸类型羧肽酶，其可以通过从蛋白质底物的C端剪切不超过三个氨基酸残基来催化肽键的水解。羧肽酶G3H8V5的切割机制涉及酸性残基，如天冬氨酸残基或谷氨酸残基。使用免疫沉淀富集的样品和未富集的样品两者进一步对羧肽酶G3H8V5的存在进行定量，如表1所示。使用具有最高丰度的G3H8V5的3种肽，包含GAGHMVPTDKPR[m/z 633.32462+]、LFPEYK[m/z 398.71562+]和LYQSMNSQYLK[m/z 687.83972+]的峰面积，与掺入的hPLBD2(一种宿主蛋白，人类假定磷脂酶B样2)肽GLEDSYEGR[m/z 1139.36982+]、QNLDPPVSR[m/z 1139.36902+]和SVLLDAASGQLR[m/z1448.47352+]的峰面积进行比较，用于IP富集后羧肽酶的定量，并指示浓度为15ppm。通过直接消化，随后通过PRM方法，使用羧肽酶的具有最高丰度的3种肽GAGHMVPTDKPR[m/z633.32462+]、LFPEYK[m/z 398.71562+]和LYQSMNSQYLK[m/z 687.83972+]的峰面积与VEGF微阱的具有最高丰度的3种肽FLSTLTIDGVTR[m/z 661.86942+]、SDQGLYTCAASSGLMTK[m/z895.40842+]和SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGR[m/z 1397.66242+]的峰面积进行比较来对未富集的样品进行定量，并且指示浓度为24.5ppm。
表1.羧肽酶G3H8V5的定量。
羧肽酶G3H8V5 VEGF微阱 hPLBD2
IP样品 15ppm
未富集的样品 24.5ppm
实例2.VEGF微阱样品中羧肽酶活性的确认
使用不同的蛋白质底物，MAB1的F(ab')2片段，进一步确认了作为HCP杂质存在于VEGF微阱样品中的羧肽酶的活性。使用(例如，半胱氨酸蛋白酶IdeS)消化单克隆抗体MAB1，以产生与VEGF微阱共享类似C端残基的特异性F(ab')2片段。半胱氨酸蛋白酶IdeS可以在铰链下方的特定位点处消化抗体，以产生F(ab')2和Fc/2片段。这种特异性F(ab')2片段在其C端处含有特定区，所述区可以充当由羧肽酶进行的切割的底物。将VEGF微阱样品和MAB1的F(ab')2片段以1:1的比率混合在一起，其中VEGF微阱样品含有HCP杂质。将混合物在37℃下温育约2周或更长时间。在不同的中间时间点，如第零天(T0)、第三天(T3)、第五天(T5)或第十天(T10)采集测试样品，并使用完整质谱法进行分析。图3示出了使用完整质谱法在不同中间时间点进行的对MAB1的F(ab')2片段的C端缺失的分析。如图3所示，在时间点T3和T5处观察到不同比例的甘氨酸(G)、亮氨酸-甘氨酸(LG)和亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(LLG)的缺失。在时间点T10处观察到苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸(FLG)的缺失。结果指示，存在由羧肽酶进行的从MAB1的F(ab')2片段的C端残基逐步切割。结果指示，HCP杂质中的羧肽酶剪切了VEGF微阱和MAB1的F(ab')2片段两者的C端，其中HCP杂质存在于VEGF微阱样品中。
将MAB1的F(ab')2片段和重组羧肽酶混合在一起，用于进一步研究羧肽酶的剪切机制。将混合物在37℃下温育约2周或更长时间。在不同的中间时间点，如第零天(T0)、第三天(T3)、第五天(T5)或第十天(T10)采集测试样品，并使用完整质谱法进行分析。图4示出了使用完整质谱法在不同中间时间点进行的对由重组羧肽酶引起的MAB1的F(ab')2片段的C端缺失的分析。如图4所示，在时间点T3和T5处观察到不同比例的甘氨酸(G)、亮氨酸-甘氨酸(LG)和亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(LLG)的缺失。在时间点T10处观察到苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸(FLG)的缺失。结果指示由重组羧肽酶进行的从MAB1的F(ab')2片段的C端残基逐步切割。
实例3.使用氢交换质谱法(HX-MS)鉴定结合位点
使用氢交换质谱法(HX-MS)鉴定VEGF微阱中羧肽酶的结合位点，以了解羧肽酶G3H8V5的结合和剪切机制。进一步研究了VEGF微阱中羧肽酶G3H8V5的结合位点的位置和氨基酸序列。由于蛋白质分子暴露于氧化氘可以在缺乏稳定氢键的无序区(Konermann等人)或没有保护的区中诱导从酰胺H到酰胺D的快速交换，因此可以使用质谱法(MS)测定由于质量位移而将氘并入到蛋白质分子的特定位点的测量。
在添加有氧化氘的溶液中制备包含羧肽酶的VEGF微阱样品，用于进行氢交换反应，例如，氢/氘交换反应。使用氧化氘在室温下温育所述样品，持续约60秒至约24小时。随后，通过将pH调节至约2.3和/或将温度调节至约0℃来淬灭氢交换反应。淬灭氢交换反应之后，使样品经受蛋白水解，如胰蛋白酶消化，以获得肽混合物。将肽混合物注入到与质谱仪在线耦接的液相色谱系统中。分析并测定肽混合物的分子量数据。随后，基于肽的质量位移，使用MS测定和分析肽混合物中氘交换的位置和相对量。由于氘原子核的重量是氢原子核的两倍，所以当其氢被氘替代时，肽分子会变得更重。
测量了含有VEGF微阱和羧肽酶的蛋白质复合物的主链酰胺氢交换率，以研究蛋白质复合物的结构、动力学和相互作用。在蛋白质复合物的结构内，氢交换率变化了若干个数量级，因为氢交换率取决于溶剂可及性和氢键。蛋白质复合物的表面上的酰胺氢表现出高氢交换率。位于蛋白质复合物的稳定结构内的两个蛋白质分子之间的结合位点的酰胺氢表现出无法检测的或低的氢交换率。当蛋白质分子的区被埋时，此区中的酰胺氢被保护不受氢交换的影响。图5示出了基于HX-MS分析结果的含有VEGF微阱和羧肽酶的蛋白质复合物的三维结构。如图5所示，在VEGF微阱中鉴定出指示羧肽酶的结合位点的强保护区。涉及结合位点的氨基酸是VEGF微阱的位置170-186处的氨基酸，序列为LTIDGVTRSDQGLYTCA。VEGF微阱中的谷氨酸残基被鉴定为涉及由羧肽酶进行的从VEGF微阱的C端剪切三个氨基酸残基。
成功地鉴定了羧肽酶的结合位点和剪切机制可以导致开发用于消除VEGF微阱的C端切割的方法。涉及切割机制的特异性谷氨酸残基可以突变为碱性或中性氨基酸，以消除由羧肽酶进行的对VEGF微阱的切割。另外，可以使用基因突变、敲除、化学修饰、酶促修饰或其组合来阻断鉴定出的结合位点以消除由羧肽酶进行的对VEGF微阱的切割。

Claims (48)

1.一种用于鉴定所关注蛋白质与第二蛋白质之间的结合位点的方法，所述方法包括：
使用氧化氘温育包含所述所关注蛋白质和所述第二蛋白质的样品；
将水解剂添加到所述样品中，以获得具有至少一种消化物的混合物；
使用质谱仪测定所述混合物中所述至少一种消化物的分子量数据；以及
将所述至少一种消化物的所述分子量数据与从至少一种已知蛋白质标准品获得的数据相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二蛋白质是宿主细胞蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其中使用氧化氘温育所述样品，持续约60秒至约24小时。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品在室温下温育。
5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过将pH调节至约2.3来淬灭所述样品。
6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过将温度调节至约0℃来淬灭所述样品。
7.根据权利要求1所述的方法，其中将所述混合物注入到液相色谱系统中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述液相色谱系统与质谱仪联机。
9.根据权利要求7所述的方法，其中质谱仪耦接到所述液相色谱系统。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二蛋白质能够切割所述所关注蛋白质。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述切割涉及酸性残基。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述切割涉及天冬氨酸残基或谷氨酸残基。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二蛋白质是羧肽酶。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二蛋白质是丝氨酸类型羧肽酶。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述所关注蛋白质是VEGF结合蛋白或VEGF微阱。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述所关注蛋白质是使用半胱氨酸蛋白酶IdeS产生的Fab或F(ab')2。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述所关注蛋白质是蛋白质药物产品、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。
18.一种用于修饰所关注蛋白质以消除由第二蛋白质对所关注蛋白质的切割的方法，所述方法包括：
通过以下鉴定由第二蛋白质对所述所关注蛋白质的切割机制中涉及的残基：
使用氧化氘温育包含所述所关注蛋白质和所述第二蛋白质的样品；
将水解剂添加到所述样品中，以获得具有至少一种消化物的混合物；
使用质谱仪测定所述混合物中所述至少一种消化物的分子量数据；以及
将所述至少一种消化物的所述分子量数据与从至少一种已知蛋白质标准品获得的数据相关联；以及
使鉴定出的残基突变为第二残基，以消除由所述第二蛋白质对所述所关注蛋白质的切割。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二蛋白质是宿主细胞蛋白。
20.根据权利要求18所述的方法，其中使用氧化氘温育所述样品，持续约60秒至约24小时。
21.根据权利要求18所述的方法，其中将所述混合物注入到液相色谱系统中。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述液相色谱系统与质谱仪联机。
23.根据权利要求21所述的方法，其中质谱仪耦接到所述液相色谱系统。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二蛋白质能够切割所述所关注蛋白质。
25.根据权利要求18所述的方法，其中所述切割涉及酸性残基。
26.根据权利要求18所述的方法，其中所述切割涉及天冬氨酸残基或谷氨酸残基。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述残基为天冬氨酸并且突变为碱性氨基酸或中性氨基酸。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述残基为谷氨酸并且突变为碱性氨基酸或中性氨基酸。
29.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二蛋白质是羧肽酶。
30.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二蛋白质是丝氨酸类型羧肽酶。
31.根据权利要求18所述的方法，其中所述所关注蛋白质是VEGF结合蛋白或VEGF微阱。
32.根据权利要求18所述的方法，其中所述所关注蛋白质是使用半胱氨酸蛋白酶IdeS产生的Fab或F(ab')2。
33.根据权利要求18所述的方法，其中所述所关注蛋白质是蛋白质药物产品、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。
34.一种用于修饰所关注蛋白质以消除由第二蛋白质对所关注蛋白质的切割的方法，所述方法包括：
通过以下鉴定所述所关注蛋白质与所述第二蛋白质之间的结合位点：
使用氧化氘温育包含所述所关注蛋白质和所述第二蛋白质的样品；
将水解剂添加到所述样品中，以获得具有至少一种消化物的混合物；
使用质谱仪测定所述至少一种消化物的分子量数据；以及
将所述至少一种消化物的所述分子量数据与从至少一种已知蛋白质标准品获得的数据相关联以鉴定结合位点；以及
阻断所述鉴定出的结合位点，以消除由所述第二蛋白质对所述所关注蛋白质的切割。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二蛋白质是宿主细胞蛋白。
36.根据权利要求34所述的方法，其中使用氧化氘温育所述样品，持续约60秒至约24小时。
37.根据权利要求34所述的方法，其中将所述混合物注入到液相色谱系统中。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述液相色谱系统与质谱仪联机。
39.根据权利要求37所述的方法，其中质谱仪耦接到所述液相色谱系统。
40.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二蛋白质能够切割所述所关注蛋白质。
41.根据权利要求34所述的方法，其中所述切割涉及酸性残基。
42.根据权利要求34所述的方法，其中所述切割涉及天冬氨酸残基或谷氨酸残基。
43.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二蛋白质是羧肽酶。
44.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二蛋白质是丝氨酸类型羧肽酶。
45.根据权利要求34所述的方法，其中所述所关注蛋白质是VEGF结合蛋白或VEGF微阱。
46.根据权利要求34所述的方法，其中所述所关注蛋白质是使用半胱氨酸蛋白酶IdeS产生的Fab或F(ab')2。
47.根据权利要求34所述的方法，其中所述所关注蛋白质是蛋白质药物产品、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。
48.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括使用基因突变、敲除、化学修饰、酶促修饰或其组合阻断所述鉴定出的结合位点。
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