CN108369232B - 人IgG1结合多聚抗原的直接亲和力测量 - Google Patents

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Abstract

本文报道用于测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位与同多聚抗原的结合亲和力的方法，其包括步骤：i)在从pH7.5至pH 8.5的pH下、在还原剂存在下、在从30℃至42℃的温度下，孵育包含抗体和衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物10分钟至240分钟的时间，以将抗体切割为Fab和Fc区；和(ii)通过将前面步骤中获得的孵育反应混合物直接应用在表面等离振子共振法中，用表面等离振子共振法测定抗体Fab对其抗原的结合亲和力，从而测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位的结合亲和力。

Description

人IgG1结合多聚抗原的直接亲和力测量
本文报道用表面等离振子共振测定人IgG1结合二聚体抗原或多聚抗原的亲和力常数的快速便捷方法。该方法基于牙龈卟啉单胞菌 (porphyromonas gingivalis)的赖氨酸牙龈菌蛋白酶(gingipain)的高特异性和定量消化，产生完整Fab和Fc片段的同质混合物而无任何通常与其他蛋白水解酶相关的片段的过度消化。
背景技术
除其作用外，生物制药产品的质量具有决定性的重要性。因此，为了安全地将它们用作治疗剂，除详细研究作用方式外，绝对有必要测定基于蛋白质的药物的同一性、纯度和活性。
虽然mAb可通过多种分离手段和测试技术成功分析，但长期难以应用和优化RP-HPLC法(RP-HPLC，反相高效液相色谱)来分离抗体种类。但是，降解过程中常同时存在抗体的多种修饰，这使得更难以分析多种多样的色谱和电泳条带。利用液相色谱分离方法偶联高分辨率质谱仪 (LC/MS，液相色谱/质谱分析法)的分析产生关于多种种类的精确质量的信息，因此便于鉴定抗体变体(Dillon,T.M.等,J.Chromatogr.A,1053(2004) 299-305)。
木瓜蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)相对非特异地在精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)后切割肽键。如果孵育期足够长，木瓜蛋白酶消化导致完全水解。但是，抗体可通过有限蛋白酶解相对选择性地在其铰链区中切割(Lottspeich,F.和Engels,J.W., “Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag”Munich2nd Edition(2006) 201-214)。切割发生在将两条重链连接在一起的二硫键的N端侧。二硫键在此过程中得以保留，使得在消化后获得三个片段(2个Fab片段，1个Fc 片段)。两个N端片段称为抗原结合片段(Fab，抗原结合片段)，C端片段称为结晶片段(Fc，结晶片段)。每个Fab片段由完整轻链和氨基端一半的重链组成。Fc片段由仍通过二硫键连接在一起的两个羧基端一半的重链组成。
近年来，鉴定出了不同的IgG特异性蛋白酶。
WO 2015/40125中报道了链球菌红斑毒素B(SpeB)。将它描述为来自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的半胱氨酸蛋白酶，显示它在铰链区中将IgG切割为两个稳定的单体Fab片段和一个Fc片段。进一步报道SpeB 在Kabat编号系统的238和239位(EU编号系统的225和226位)之间切割 IgG的铰链区。
来自人病原体酿脓链球菌的也称为Mac-1或sib-38的半胱氨酸内切蛋白酶IdeS(免疫球蛋白降解酶S)是特异性切割免疫球蛋白G型(IgG)抗体重链的半胱氨酸蛋白酶。IgG是迄今唯一已知的IdeS底物(Vincents,B.等, Biochem.43(2004)15540-15549)。IdeS由339个氨基酸组成，包括含有29 个氨基酸的信号肽(von Pawel-Rammingen,U.等,EMBOJ.21(2002) 1607-1615)，其中氨基酸214至216形成RGD基序。IdeS在铰链区中Kabat 编号系统的249和250位(EU编号系统的236和237位)(包含在识别序列 LLGGP中的Gly-Gly)之间切割人IgG(G类免疫球蛋白)。在识别基序 PVAGP中的氨基酸丙氨酸和甘氨酸之间切割人IgG2。还切割IgG2a和 IgG3类型的鼠抗体(Vincents,B.等,Biochem.43(2004)15540-15549)。
牙龈卟啉单胞菌是进行性牙周病的主要致病因素(参见例如Kadowaki, T.等,J.Biol.Chem.269(1994)21371-21378)。已从其分离了牙龈菌蛋白酶、胰蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶等不同酶。
Kikuchi,Y.等报道了通过使用表面等离振子共振来测定抗体片段的浓度和结合亲和力(J.Biosci.Bioeng.100,(2005)311-317)。
WO 95/11298提供了基本纯的Lys牙龈菌蛋白酶复合体制备物和制备方法，其中将Lys牙龈菌蛋白酶表征为通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳估计具有105kDa的表观分子量，其中在不煮沸的情况下制备样品，该Lys牙龈菌蛋白酶具有在赖氨酸残基后切割的酰胺水解(amidolytic)和蛋白水解活性而没有在精氨酸残基后切割的酰胺水解和/或蛋白水解活性，其中酰胺水解和/或蛋白水解活性受TLCK、包括碘乙酰胺和碘乙酸的半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂抑制，其中该Lys牙龈菌蛋白酶的酰胺水解和/ 或蛋白水解活性对亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶、反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰胺基-(4-胍基)丁烷、包括二异丙基氟磷酸和苯甲基磺酰氟的丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂及对Lys牙龈菌蛋白酶复合体及其催化成分特异的抗体的抑制不敏感。
Inagaki,S.等报道了牙周炎患者对牙龈卟啉单胞菌的的牙龈菌蛋白酶抗体反应(J.Periodont.74(2003)1432-1439)。
Nguyen,H.等报道了表面等离振子共振是生物传感器应用的通用技术 (Sensors15(2015)10481-10510)。
发明概述
本文报道用人IgG1亚类全长抗体产生的抗原结合片段(Fab)在表面等离振子共振法中测定该人IgG1亚类全长抗体与其抗原的结合亲和力的方法，由此通过与牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶孵育来酶促产生 Fab，并将反应混合物直接用于亲和力测定而无中间纯化。
本文报道的一方面是用于测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位与其同多聚抗原(homo-multimeric antigen)的结合亲和力的方法，其包括以下步骤：
-在足以将抗体切割为Fab和Fc区的条件下和时间内，孵育包含抗体和衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物；和
-通过将前面步骤中获得的孵育反应混合物直接应用在表面等离振子共振法中，用表面等离振子共振法测定抗体Fab对其抗原的结合亲和力；
和
从而测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位的结合亲和力。
本文报道的一方面是用于测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位与其同多聚抗原的结合亲和力的方法，其包括以下步骤：
-在从(pH)7.5至(pH)8.5的pH下、在还原剂存在下、在(从)30℃至 42℃的温度下，孵育包含抗体和牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶或其酶活性片段的混合物(从)10分钟至240分钟的时间，以将抗体切割为Fab 和Fc区；和
-通过将前面步骤中获得的孵育反应混合物直接应用在表面等离振子共振法中，用表面等离振子共振法测定抗体Fab对其抗原的结合亲和力；
和
从而测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位的结合亲和力。
在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：
-在从(pH)7.5至(pH)8.5的pH下、在还原剂存在下、在(从)30℃至 42℃的温度下，孵育包含抗体和衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物(从)10分钟至240分钟的时间，以将抗体切割为Fab 和Fc区；和
-通过将前面步骤中获得的孵育反应混合物直接应用在表面等离振子共振法中，用表面等离振子共振法测定抗体Fab对其抗原的结合亲和力；
和
从而测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位的结合亲和力。
在一个实施方案中，该衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽是牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶。在一个实施方案中，该衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03或SEQ ID NO:04或其功能性变体。在一个实施方案中，该牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶具有氨基酸序列SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03或SEQ ID NO:04，或是其功能性变体。在一个实施方案中，该衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽具有至少包含SEQ ID NO:01的残基230至739的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该还原剂选自2-巯基乙醇、半胱氨酸和二硫苏糖醇。在一个实施方案中，该还原剂是半胱氨酸。在一个实施方案中，该还原剂是浓度(从)0.5mM至10mM的半胱氨酸。在一个实施方案中，该还原剂是浓度约2mM的半胱氨酸。
在一个实施方案中，该pH值是约pH 8。
在一个实施方案中，该温度是(从)35℃至38℃。在一个实施方案中，该温度是约37℃。
在一个实施方案中，该孵育是孵育(从)30分钟至120分钟的时间。在一个实施方案中，该孵育是孵育约60分钟的时间。
在一个实施方案中，该抗体在两条重链多肽中都包含Fc区中的突变 P329G、L234A和L235A。
本文报道的一方面是用于选择(特异性结合同多聚抗原的)抗体的方法，其包括以下步骤：
-提供结合同一抗原的多种人IgG1亚类二价全长抗体；
-用上述 中任一项的方法测定该多种抗体中的每种抗体与其同多聚抗原的结合亲和力；和
-根据前面步骤中测定的结合亲和力选择一种或多种抗体。
发明详述
定义
如本文所使用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置按照 Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所述的Kabat编号系统编号，在本文中称为“Kabat编号”。具体而言，Kabat 等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号系统(参见647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，KabatEU 指数编号系统(参见661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和 CH3，在这种情况下，其在本文中通过参考“Kabat EU指数编号”进一步阐明)。
必须指出，除非文中另有明确说明，本文及所附权利要求书中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提到“一个细胞”包括多个这类细胞及其本领域技术人员已知的等同物等。另外，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。还应指出，术语“包含”、“包括”和“具有”可互换使用。
术语“约”指其后跟随的数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中，术语约指其后跟随的数值的+/-10％的范围。在一个实施方案中，术语约指其后跟随的数值的+/-5％的范围。
术语“牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶”指在Kabat编号系统的238和239位(EU编号系统的225和226位)之间特异性切割人IgG1和 IgG3亚类重链的多肽，即在第二个氨基酸残基之后切割铰链区氨基酸序列 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVF(SEQ ID NO:05)，产生片段DK(SEQ ID NO:06)和THTCPPCPAPELLGGPSVF(SEQ ID NO:07)。在一个实施方案中，该多肽(即牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶)包含氨基酸序列 SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03或SEQ ID NO:04或其功能性变体。在一个实施方案中，该多肽(即牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶)具有至少包含SEQ ID NO:01的残基230至739的氨基酸序列。“牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶”具有EC编号3.4.22.47，也称为牙龈菌蛋白酶K、KGP、赖氨酸牙龈菌蛋白酶、PrtP蛋白酶、赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶、赖氨酸特异性牙龈菌蛋白酶、赖氨酸特异性牙龈菌蛋白酶K、或赖氨酸特异性牙龈菌蛋白酶蛋白酶。SEQ ID NO:01中显示示例性牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的全长氨基酸序列。此多肽是对赖氨酰键具有严格特异性的内肽酶。通过加入30 2-巯基乙醇、约50mM半胱氨酸、约30mM二硫苏糖醇、约2mM EDTA、约2mM EGTA或谷胱甘肽激活该多肽的酶活性。它在从pH 6.5至pH 9.5的pH范围内有活性，从约pH 7.5至约pH 8.5的pH(优选约pH 8.0)适于水解免疫球蛋白。在示例性IgG降解方法中，使用以下条件：IgG(终浓度15μM)、KGP(终浓度10nM活性蛋白酶)、Tris缓冲液(0.1mol/L,pH 8.0)、EDTA(终浓度1mM)、L-半胱氨酸(终浓度2mM)、37℃。切割人IgG一次，但如果去除糖结构 (glycostructure)则可发生第二切割。如果存在离液试剂和/或去垢剂，则可负面影响酶切割。因此，在一个实施方案中，在该方法中使用的所有溶液都缺乏离液试剂和/或去垢剂的情况下进行该方法。
术语“全长抗体”指包含两条所谓的轻免疫球蛋白链多肽(轻链)和两条所谓的重免疫球蛋白链多肽(重链)的抗体。全长抗体的每条重和轻免疫球蛋白链多肽包含含有能够与抗原相互作用的结合区的可变结构域(可变区)(通常是多肽链的氨基端部分)。全长抗体的每条重和轻免疫球蛋白链多肽包含恒定区(通常是羧基端部分)。重链的恒定区介导抗体与i)具有Fcγ受体(FcγR)的细胞如吞噬细胞或ii)具有也称为Brambell受体的新生儿Fc受体(FcRn)的细胞的结合。它还介导与一些因子的结合，包括经典补体系统的因子，如成分(C1q)。抗体轻链或重链的可变结构域转而包含不同区段，即四个构架区(FR)和三个高变区(CDR)。
本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本同质的抗体群体的抗体，即除可以小量存在的可能的天然存在的突变外，包含该群体的单种抗体是相同的。单克隆抗体高度特异，抗单个抗原部位。此外，与包含抗不同抗原部位(决定簇或表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体抗抗原上的单个抗原部位。除其特异性外，单克隆抗体的优势在于它们可以不受其他抗体污染地合成。修饰词“单克隆的”指抗体获自基本同质的抗体群体的性状，不解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
抗体“Fc区”不直接涉及与抗体的抗原的结合，但显示多种效应子功能。取决于重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体(免疫球蛋白)划分在IgA, IgD,IgE,IgG和IgM种类中。将这些种类中的一些进一步划分为亚类(同种型)，即IgG分为IgG1,IgG2,IgG3和IgG4，或IgA分为IgA1和IgA2。根据抗体所属免疫球蛋白种类，分别将免疫球蛋白重链恒定区称为
Figure BDA0001689310860000071
δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。本发明的抗体优选属于IgG种类。“抗体Fc区”是技术人员公知和基于抗体木瓜蛋白酶切割定义的术语。
亲和力测定：
通常，抗体如IgG种类全长抗体是二价的。因此，在测定亲和力时，它应是避免二价结合剂的亲合力效应(avidity effect)的“真实”亲和力。为了测定抗体结合二价或多价靶标的亲和力和结合动力学，因此有必要将二价抗体转为单价结合实体，如片段抗原结合(Fab)单位。
目前用于测定二价抗体亲和力的方法是两步法：
1：切割待分析的抗体以产生单价结合实体；和
2：纯化1的反应混合物。
备选地，可能重新克隆和表达Fab片段，其与上文所列方法相比需要甚至更多的时间和劳动。
IgG片段的产生：
通常，通过用非特异性蛋白酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶部分蛋白酶解消化IgG来产生Fab片段，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分别在铰链区上方或下方切割。片段包含连接重链的二硫键，但切割在轻链和重链间二硫键位点下方(Porter,1959；Nisonoff等,1960；Akita和Nakai,1993,Andrew和Titus, 2003；Mage,1987；Zhao等,2009；Andrew,S.M.和J.A.Titus.2003)。
胃蛋白酶消化IgG产生F(ab')2片段，其随后轻度还原产生Fab'片段。最有可能的是，铰链区更易受蛋白酶攻击，因为它暴露在外且是柔性的。随后，然后从消化混合物纯化片段。
但是，缺乏可重复性，未切割的IgG和过度消化通常是一个问题。
对于木瓜蛋白酶消化，例如难以获得同质Fab(Parham,1983；1986； Mage,1987)。固定化木瓜蛋白酶产品(例如木瓜蛋白酶琼脂糖树脂；参见例如Tischer,W.和V.Kasche,1999；Luo,Q.,等2002)允许更好地控制消化反应及有效地从粗蛋白酶消化产物去除Fab和Fc片段；但仍需要纯化。
获得单体抗原结合片段的另一种方法包括通过酿脓链球菌免疫球蛋白 G降解酶(IdeS)消化来产生F(ab')2片段，并用2-巯基乙胺(2-MEA)轻度还原来产生Fab'片段(vonPawel-Rammingen,U.等2002+2003；Ishikawa,E. 和S.Yoshitake,1980；DeSilva,B.S.等,1995)。
还可以通过将IgG还原为两个半IgG来获得IgG种类抗体的两个抗原结合结构域(rIgG；参见例如Billah,M.M.等,2010)。它是尤其是用弱还原剂如2-MEA仅选择性还原最可接近和最易还原的铰链区二硫键的产物。
最后，还可以通过重组表达轻链和重链Fd片段(VH-CH1)来获得Fab (Zhao等,2009)。但是，这在需要例如比较若干不同Fab时耗时且费力。
PCT/EP2015/057164中报道了用内切蛋白酶Lys-C在40分钟的hIgG 消化中有限消化，来通过质谱分析法分析链组装。使用此方法，Lys-C专一性地在铰链区上方切割一次，产生Fab和Fc片段。
在IgG种类抗体上铰链区中选择性切割的蛋白酶是来自酿脓链球菌的链球菌红斑毒素B(SpeB)(von Pawel-Rammingen,U.等2002)。此蛋白酶的活性需要还原剂如1-5mM范围内的DTT或TCEP(Persson,H.等,2013； www.genovis.com/fabulous)，导致同时还原所消化的抗体的链间巯基。
下表中显示IgG特异性蛋白酶及其切割位点(还参见Brezski,R.J.和 Jordan,R.E.,mAbs 2(2010)212-220)。
Figure BDA0001689310860000091
已研究牙龈卟啉单胞菌蛋白酶超过30年。将它们鉴定为活性需要还原剂存在的半胱氨酸蛋白酶。它们之一是半胱氨酸蛋白酶牙龈菌蛋白酶K (EC.3.4.22.47)。
回到1993年，Scott等纯化了牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶 (KGP)(Scott,C.F.等,J.Biol.Chem.268(1993)7935-7942)。
Scott等将半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽和2-巯基乙醇鉴定为激活 KGP的适宜还原剂。
KGP在P1位切割含有Lys的肽，P2的残基似乎不太重要。但是，如果Lys或Arg占据P2，则水解似乎阻断。KGP能够水解诸如BSA、酪蛋白、血红蛋白、酸溶性人胎盘I型胶原、人IgG和IgA的蛋白质底物(Curtis, M.A.等,Crit.Rev.Oral Biol.Med.12(2001)192-216)。
Okamoto,K.等(J.Biochem.120(1996)398-406)报道了牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的氨基酸序列，包括各结构域的鉴定。Slakeski,N. 等报道并在检索号U75366和AAB60809.1下保藏了kgp基因(Oral Microbiol.Immunol.14(1999)92-97)。已鉴定出若干C端截短但具有活性的形式。已发现，对于C端截短的蛋白质KGP(Δ1292–1732)、KGP(Δ1157–1732)、KGP(Δ738–1732)、KGP(Δ681–1732)和 KGP(Δ602–1732)，后两个突变体仅具有几乎测量不到的酶活性(参见例如 Sztukowska,M.等,Mol.Microbiol.54(2004)1393-1408)。
KGP对合成底物具有窄特异性，限于分别含有精氨酸和赖氨酸残基的肽键，但它们可以有限降解的方式降解免疫球蛋白G和A(Yamamoto,K. 等,In:Proteases:newPerspectives(1999),V.Turk(编辑),
Figure BDA0001689310860000101
Verlag Basel(CH),175-184；Yamamoto,K.等,In:N Katunuma,H Kido,H Fritz,J Travis(Eds):Medical Aspects ofProteases and Protease Inhibitors. lOS Press,Amsterdam,139-149；Kadowaki,T.等,J.Biol.Chem.269(1994) 21371-21378；Abe,N.等,J.Biochem.123(1998)305-312)。
Fujimura等于1998年报道了牙龈卟啉单胞菌的包膜结合精氨酸牙龈菌蛋白酶(RGP)和赖氨酸牙龈菌蛋白酶(KGP)的比较特性(Microbiol.Lett. 163(1998)173-179)。这些酶常通过还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇和半胱氨酸激活。甘氨酰-甘氨酸显著激活RGP-B，而EDTA和EGTA显著激活 KGP。RGP和KGP对显色合成底物的水解活性分别限于在P1位具有精氨酸和赖氨酸的化合物。在分别用三种酶处理IgG时，显示在各反应产物中产生了两个34kDa和15kDa(还原条件下的SDS)的新片段。发现KGP 活性的最适pH为7.5。巯基试剂激活RGP和KGP二者，而二硫苏糖醇是最好的KGP激活剂(20-30mM)，然后是巯基乙醇(20-30mM)和半胱氨酸(超过1.5mM但小于10mM)。KGP仅切开X-Y-Lys-pNA。
Vincents,B.等报道，牙龈卟啉单胞菌牙龈菌蛋白酶K可以水解人IgG 亚类1和3，由此在铰链区内的单个位点切割IgG1重链产生Fab和Fc片段，还在重链内但在CH2区周围的若干位点切割IgG3(FASEB J.,25(2011) 3741-3750)。IgG2的切割不由KGP介导(Guentsch,A.等,J.Periodont.res. 48(2013)458-465)。
de Diego,I.等报道了KGP活性位点的高分辨率晶体结构，表明催化可需要催化三联体Cys477-His444-Asp388，而不是常见于半胱氨酸蛋白酶中的半胱氨酸-组氨酸二联体(J.Biol.Chem.289(2014)32291-32302)。
下文描述不同抗体片段：
-F(ab')2片段：
F(ab')2片段具有约110kDa的分子量，包含通过铰链区二硫键连接的 IgG类全长抗体的两个抗原结合部位；它缺乏大部分但并非全部Fc区；
-Fab'片段：
Fab'片段具有约55kDa的分子量；其可以通过还原F(ab')2片段的铰链区二硫键形成；Fab'片段包含三个游离巯基；因为它源自F(ab')2，它可包含小部分Fc区；
-片段抗原结合-Fab：
Fab具有约50kDa的分子量；它是可从IgG和IgM种类抗体获得的单价结合片段；它包含都通过分子内二硫键连接的重链VH和CH1结构域及完整轻链；
-Fv片段：
Fv片段具有约25kDa的分子量；它是包含完整抗原结合部位(VH结构域和VL结构域)的最小抗体片段；Fv片段的VH和VL结构域通过非共价相互作用保持在一起；
-“rIgG”片段：
“rIgG”片段指通过仅还原全长抗体的铰链区二硫键(例如使用2-MEA) 获得的半抗体；它具有约75kDa的分子量；
-可结晶片段-Fc片段：
Fc片段具有约50kDa的分子量；它包含全长抗体重链的CH2和CH3 结构域及部分铰链区；两条链通过一个或多个二硫键(在铰链区中)保持在一起；Fc片段不能结合抗原，但负责全长抗体的效应子功能。
本文报道的方法：
与结合单体抗原的抗体不同，例如通过表面等离振子共振(SPR)测定结合二聚体或多聚抗原的抗体的无亲合力影响的亲和力不可行。
亲和力描述抗体和其抗原间单个相互作用的强度。IgG种类的二价抗体具有两个抗原结合部位，亲合力常用于抗体相互作用，其中多个抗原结合部位同时与常处于多聚体结构的靶抗原相互作用。抗体的亲合力指多个亲和力的累积强度。常获得关于相互作用的亲合力，其中涉及常处于多聚体结构中的多个抗原结合部位。为了测定抗体的亲和力，有必要将二价抗体转化为单价结合实体如抗原结合片段(Fab)。
通过SPR测定靶向二聚体或多聚抗原的抗体的亲和力常数因此有必要产生单体抗原结合片段，如Fab。但是，Fab的产生很费力。通常，通过用木瓜蛋白酶部分蛋白酶解消化来产生Fab。
本文报道用于从IgG1亚类全长抗体产生Fab的快速便捷的方法。已发现，牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶可用于从IgG1亚类全长抗体产生Fab，因为用这种酶可达到高度特异和定量的蛋白酶消化，产生完整Fab和Fc片段的同质混合物，无任何通常与其他蛋白水解酶相关的过度消化，反应混合物可直接(即无任何中间纯化)应用于表面等离振子共振芯片。
更详细地，这是通过溶液内消化和Fab片段的SPR直接动力学亲和力测定来进行，无任何之前的纯化或清洁步骤。通过ESI-QTOF-MS验证了牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶对人IgG1的完全消化。
本文报道的方法可用于用表面等离振子共振法测定特异性结合二聚体或多聚抗原的例如IgG1亚类或包含源自人IgG1亚类的Fc区的人或人源化抗体的动力学速率常数。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：1) 使抗体与牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶孵育来完全切割它，产生 Fab和Fc片段的同质混合物；和2)通过表面等离振子共振(SPR)测定消化混合物中Fab的结合亲和力。消化混合物的直接SPR允许对Fab片段进行精确的动力学表征而无需任何之前的纯化。
已发现，通过用牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶消化而无后续纯化获得的通过SPR测定的IgG1亚类抗体Fab的亲和力常数，对应于通过重组表达或通过用木瓜蛋白酶消化且随后在SPR测量之前纯化获得的 Fab的亲和力常数。
本文报道的一方面是用于测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位与其抗原的结合亲和力的方法，其包括以下步骤：
-在足以将抗体切割为Fab和Fc区的条件下和时间内孵育包含抗体和衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物；和
-通过将前面步骤中获得的孵育反应混合物直接应用在表面等离振子共振法中，用表面等离振子共振法测定抗体Fab对其抗原的结合亲和力；
和
从而测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位的结合亲和力。
在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：
-在从pH 7.5至pH 8.5的pH下、在还原剂存在下、在从30℃至42℃的温度下，孵育包含抗体和衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物从10分钟至240分钟的时间，以将抗体切割为Fab和Fc 区；和
-通过将前面步骤中获得的孵育反应混合物直接应用在表面等离振子共振法中，用表面等离振子共振法测定抗体Fab对其抗原的结合亲和力；
和
从而测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位的结合亲和力。
在一个实施方案中，该衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽是牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶。在一个实施方案中，该衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03或SEQ ID NO:04或其功能性变体。在一个实施方案中，该衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽具有至少包含SEQ ID NO:01的残基230至739的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该还原剂选自2-巯基乙醇、半胱氨酸和二硫苏糖醇。在一个实施方案中，该还原剂是半胱氨酸。在一个实施方案中，该还原剂是浓度从0.5mM至10mM的半胱氨酸。在一个实施方案中，该还原剂是浓度约2mM的半胱氨酸。
在一个实施方案中，该pH值是约pH 8。
在一个实施方案中，该温度是从35℃至38℃。在一个实施方案中，该温度是约37℃。
在一个实施方案中，该孵育是孵育从30分钟至120分钟的时间。在一个实施方案中，该孵育是孵育约60分钟的时间。
在一个实施方案中，该抗体在两条重链多肽中都包含Fc区中的突变 P329G、L234A和L235A。
在一个实施方案中，该抗原是多聚抗原。在一个实施方案中，该抗原是同多聚抗原。在一个实施方案中，该抗原选自血管内皮生长因子A (VEGF-A)、癌胚抗原(CEA)、血管生成素-2(angiopoietin-2，ANG2)和成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
本文报道的一方面是用于选择抗体的方法，其包括以下步骤：
-提供结合同一抗原的多种人IgG1亚类二价全长抗体；
-用上述 中任一项的方法测定该多种抗体中的每种抗体与其抗原的结合亲和力；和
-根据前面步骤中测定的结合亲和力选择一种或多种抗体。
本文报道的方法允许快速测定二价全长抗体对其抗原的亲和力而无需重组产生抗体的单结合部位形式。使用本文报道的方法，可能测定二价全长抗体对其抗原的结合亲和力而无需进行用于产生二价全长抗体的Fab的反应混合物的中间纯化。
下文用抗体贝伐珠单抗(Bevacizumab)示例本文报道的方法。贝伐珠单抗是人IgG1亚类的人源化抗VEGF抗体。治疗性抗体贝伐珠单抗结合二聚体抗原，即VEGF-A(二聚体是同多聚体的一种形式)。
通过UHR ESI-QTOF质谱分析法分析了贝伐珠单抗Fab和消化产物的质量。木瓜蛋白酶消化后纯化的Fab和纯化的重组Fab的去卷积质谱 (deconvoluted mass)提供了两种材料高质量的证据，因为仅可检测到Fab 片段的质量。
更详细地，在用大小排阻层析对反应混合物脱盐后，通过电喷雾离子化质谱分析法验证了牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶对贝伐珠单抗的完全消化。未在MS图谱中鉴定到片段化或副产物。
为了比较，用木瓜蛋白酶消化了贝伐珠单抗。从MS图谱可见，由于抗体的非特异性片段化和功能丧失，木瓜蛋白酶不适合用于功能评估。
图1(牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶消化1小时)、图2(木瓜蛋白酶消化1.5小时)和图3(木瓜蛋白酶消化2小时)中显示各自的MS图谱。可以看到，在使用牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶时，除铰链区中的单次切割外，未发生抗体片段化。
更详细地，通过UHR ESI-QTOF质谱分析法分析了重组贝伐珠单抗 Fab及木瓜蛋白酶和牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶消化产物的质量。木瓜蛋白酶消化后纯化的Fab和纯化的重组Fab的去卷积质谱揭示了两种材料的高质量，因为仅可分别检测到完整Fab 48208Da(理论平均质量：48208Da)和47726Da(理论平均质量：47726)的质量。木瓜蛋白酶消化的贝伐珠单抗的质谱的评价揭示了不仅存在48207Da Fab(理论平均质量：48208Da)和Fc片段(由于Fc N聚糖的异质性而存在多种质量)。此外，在木瓜蛋白酶消化产物中检测到了对应于质量x:23422Da和23453Da、 y:34587Da和z:47607Da的未归属片段。相反，牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶消化的贝伐珠单抗的去卷积质谱显示仅存在47969DaFab (理论平均质量：47970Da)和Fc片段(由于Fc N聚糖的而存在多种质量)。牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶消化完全，质谱分析未检测到任何未消化或单次切割的IgG(无一个Fab的IgG)。也未在牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶消化的粗消化混合物中检测到任何非特异性消化、过度消化或片段的进一步降解。
用不同贝伐珠单抗衍生的样品进行了本文报道的方法：
1)全长贝伐珠单抗；
2)重组产生的Fab；
3)用本文报道的方法产生的Fab(无中间纯化)(在功能性牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶存在下孵育后及再孵育24小时后直接测定)；
4)用木瓜蛋白酶产生的Fab(未终止反应，无中间纯化)；
5)用木瓜蛋白酶产生的Fab(终止反应，无中间纯化)；
6)用木瓜蛋白酶产生的Fab(进行中间纯化)。
为了比较所产生的不同贝伐珠单抗Fab的亲和力，测定了牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶消化而不纯化Fab的贝伐珠单抗的结合亲和力及重组瞬时表达的贝伐珠单抗Fab、木瓜蛋白酶消化后纯化的Fab的结合亲和力。
为了测定亲和力，将鼠抗His标记抗体固定化，将缀合His标记的二聚体VEGF-A捕获在传感芯片表面。然后，注入结合VEGF-A的分析物并流过表面。将导出传感图拟合至1:1Langmuir结合模型，并用于确定结合速率常数ka、解离速率常数kd和结合常数KD。通常，Fab片段的速率和结合常数全都非常相似(参见下表)。发现牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶消化混合物中Fab的结合常数为1.1nM，重组Fab和木瓜蛋白酶消化后纯化的Fab的结合常数分别测定为0.8和1.0nM。全长二价抗体的KD测定为0.18nM，证明与二聚体VEGF-A强结合。但在将木瓜蛋白酶消化混合物应用于固定化芯片表面时，我们未观察到与所捕获的二聚体VEGF-A的结合。因此，未测定到木瓜蛋白酶消化混合物的结合常数。发现VEGF-A表面在应用含有木瓜蛋白酶的样品后损伤，因为它不能再使用。
下表中显示结果。
Figure BDA0001689310860000171
可以看到，因为牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶对人IgG1特异，所以它未破坏固定化芯片表面。相反，在将未纯化的木瓜蛋白酶消化反应混合物应用于固定化芯片表面后。未观察到与它的结合。在应用含有木瓜蛋白酶的样品后VEGF表面不再能用，因为木瓜蛋白酶的存在已损伤了表面。
图4-1至4-4中显示各自的SPR传感图。
保存牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶消化的贝伐珠单抗并通过 SPR重复亲和力测定允许得出结论，消化产物在4℃分别稳定至少24小时和48小时，即未发生进一步消化或片段化。
除用牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶进行结合二聚体或多聚抗原的人IgG1的亲和力的测定外，在结合单体抗原的IgG1难以固定在SPR 金属表面上的情况下，也可以使用该蛋白酶。
此外，牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶将对Fab片段的结构分析及在原子分辨率(例如通过X射线晶体分析法)分析人IgG1-抗原结合的结构-功能关系非常有益。与IgG相比，Fab片段更易于结晶。
重组方法：
抗体可以用例如US 4,816,567中所述的重组方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供分离的编码本文所述抗体的核酸。这种核酸可以编码含有抗体VL的氨基酸序列和/或含有抗体VH的氨基酸序列(例如抗体轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供一个或多个包含这种核酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含以下(例如已用以下转化)：(1)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列和含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体；或 (2)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、 NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供产生本文报道的抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养上文提供的含有编码抗体的核酸的宿主细胞，并可选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组产生抗体，分离例如上文所述的编码抗体的核酸，并插入一个或多个载体用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这种核酸可以用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
适合用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时，可以在细菌中产生抗体。抗体片段和多肽在细菌中的表达参见例如US 5,648,237、 US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,248卷,Lo,B.K.C.(编辑),HumanaPress,Totowa,NJ (2003),245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以从可溶性级分中的细菌细胞糊分离抗体，并可以进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是编码抗体的载体的适宜的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,T.U., Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等,Nat.Biotech.24(2006) 210-215。
适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的杆状病毒毒株。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用适应悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾 CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(描述于例如Graham,F.L.等,J.Gen Virol.36(1977)59-74中的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(描述于例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中的 TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞 (HELA)；犬肾细胞(MDCK)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞 (W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；描述于例如 Mather,J.P.等,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中的TRI细胞； MRC 5细胞；及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等,Proc.Natl.Acad. Sci.USA 77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki,P. 和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,248卷,Lo,B.K.C.(编辑), Humana Press,Totowa,NJ(2004),255-268页。
一般色谱方法为本领域技术人员已知，例如Chromatography,第5版, Part A:Fundamentals and Techniques,Heftmann,E.(编辑)；Elsevier Science PublishingCompany,纽约,(1992)；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods inBiosciences,Deyl,Z.(编辑),Elsevier Science BV,Amsterdam,荷兰,(1998)；Chromatography Today,Poole,D.F. 和Poole,S.K.,Elsevier Science PublishingCompany,纽约,(1991)；Scopes, Protein Purification:Principles and Practice(1982)；Sambrook,J.等(编辑),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；或CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等(编辑),John Wiley&Sons, Inc.,纽约。
引文：
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提供以下实施例和附图来辅助理解本发明，所附权利要求书中显示本发明的真实范围。应理解，可在所示流程中进行修改而不背离本发明的精神。
附图简述
图1.用牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶在37℃消化1小时的贝伐珠单抗的UHR ESI-QTOF质谱分析。仅检测到Fab和Fc。
图2.用木瓜蛋白酶在37℃消化1.5小时的贝伐珠单抗的UHR ESI-QTOF质谱分析。除Fab和Fc片段外，还检测到若干Fab和抗体片段。
图3.用木瓜蛋白酶在37℃消化2小时的贝伐珠单抗的UHR ESI-QTOF质谱分析。检测到若干抗体片段。鉴定不到Fab和Fc片段。
图4-1.贝伐珠单抗的表面等离振子共振传感图。
图4-2.重组贝伐珠单抗Fab的表面等离振子共振传感图。
图4-3.用牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶消化的贝伐珠单抗的表面等离振子共振传感图。
图4-4.贝伐珠单抗、不终止消化的情况下用木瓜蛋白酶消化的贝伐珠单抗和终止消化的情况下用木瓜蛋白酶消化的贝伐珠单抗的表面等离振子共振传感图。
实施例
贝伐珠单抗获自Roche Diagnostics GmbH(Mannheim,德国)。木瓜蛋白酶作为浓度10mg/mL的悬液获自Sigma-Aldrich/Roche Diagnostics GmbH。牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶以商品名GingisKHAN获自Genovis(Lund,瑞典)。将GingisKHAN复溶(reconstitute)在200μL 双蒸水(ddH2O)中，得到2000U/200μL，每次消化前在50μL ddH2O中现配10x还原剂(终浓度：20mM半胱氨酸)。
实施例1
瞬时Fab表达和纯化
抗体轻链和重链Fd片段作为基因合成物(gene synthese)订购，并用标准克隆流程通过独特限制位点克隆入各条链分开的表达载体，使得能够在悬浮生长的HEK细胞中分泌表达。使用抗体载体的Maxiprep(Qiagen, 目录号12163)制备物、Opti-MEM I培养基(Invitrogen,目录号31985)、 293fectin(Invitrogen,目录号31985070)和无血清FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen,目录号12338018)中1-2×10E+06活细胞/mL的初始细胞密度，按照厂家说明书转染(1:1质粒比)入HEK293-F细胞(Invitrogen,目录号510029)。在摇瓶中培养7天后通过14,000×g离心30分钟收集含有抗体的细胞培养物上清，并滤过0.22μm除菌滤器(Thermo Scientific,目录号566-0020)。直接从上清纯化抗体，或者将上清保存于-80℃直至纯化。通过SEC和BioAnalyzer分析所纯化的Fab的质量。
实施例2
用木瓜蛋白酶酶切贝伐珠单抗
不进行纯化：
抗体在20mM组氨酸、140mM NaCl、pH 6.0中稀释至1mg/mL终浓度，加入2μL 250mML-半胱氨酸(Sigma-Aldrich,Schnelldorf,德国) 和10.9μL稀释的木瓜蛋白酶(7.34U/mL于20mM组氨酸、140mM NaCl、 pH 6.0中)，37℃孵育1小时。
进行纯化：
抗体在5mM半胱氨酸存在下与木瓜蛋白酶(0.8U/mg mAb；Sigma-Aldrich/Roche)在37℃孵育170分钟。为了从未切割的抗体、Fc片段和木瓜蛋白酶分离Fab，按照厂家的流程将混合物应用于CaptureSelect IgG-CH1和MabSelectSuRe亲和层析(GE Healthcare)。最后，用140mM NaCl、20mM组氨酸(pH 6.0)作为运行缓冲液进行使用Superdex 7510/300 GL柱(GE Healthcare)的大小排阻层析。使用根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm光密度(OD)来测定Fab的蛋白质浓度。通过存在和缺乏还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)下的SDS-PAGE及考马斯亮兰染色来分析纯度。
实施例3
用牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶酶切贝伐珠单抗
将GingisKHAN复溶在200μL ddH2O中，得到2000U/200μL，每次消化前在50μLddH2O中现配10x还原剂(终浓度：20mM半胱氨酸)。将100μg抗体在100mM Tris、pH 8.0中稀释至1mg/mL终浓度，随后用 10μL GingisKHAN和11μL现配的10x还原剂在37℃消化1小时。
实施例4
ESI-QTOF质谱分析
使用含2％甲酸(v/v)的40％乙腈，在Sephadex G25柱(Kronlab, 5x250mm,TAC05/250G0-SR)上通过HPLC对样品脱盐。在配有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4GUHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik) 上通过ESI-QTOF MS测定总质量。用碘化钠(WatersToF G2-Sample Kit 2 Part:700008892-1)进行校准。对于重组和纯化的Fab，按900-2600m/z (ISCID:0.0eV)进行数据获取，对于hIgG1或消化的hIgG1，按900-4000 m/z(ISCID:0.0eV)进行数据获取。用内部开发的Roche软件工具评价原始质谱，并转化为单个相对摩尔质量。为了显示结果，用同一内部开发的软件来产生去卷积质谱。
实施例5
表面等离振子共振
用BIAcore T200仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振来研究结合亲和力和动力学。所有实验均用PBS-T(10mM Na2HPO4、140mM NaCl、0.05％Tween 20,pH 7.4)作为运行和稀释缓冲液在25℃进行。用标准胺偶联化学将抗His标记(GE Healthcare,#28995056)或抗人Fab抗体 (GE Healthcare,#28958325)固定在S系列CM5传感芯片(GEHealthcare, #29104988)上。将带组氨酸标记的人VEGF或全长IgG/Fab捕获在表面上，产生10至50RU的响应。分析物按2.2nM至1800nM浓度按30μL/分钟流速注射至表面(结合期)180秒。通过用运行缓冲液洗涤来监测解离期至多 3600秒。通过按5μL/分钟流速注射10mM甘氨酸pH 1.5 60秒来再生表面。通过减去获自模拟表面的响应和减去空白注射(双参考)来校正体积折射率差值。用BIAevaluation软件将导出曲线拟合至1:1Langmuir结合模型。
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Claims (6)

1.用于测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位与同多聚抗原的结合亲和力的方法，包括以下步骤：
-在8的pH下、在2mM终浓度的还原剂L-半胱氨酸的存在下、在37℃的温度下，孵育包含终浓度为15μM的抗体和终浓度为10nM活性蛋白酶的牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶或其酶活性片段的混合物30分钟至120分钟的时间，以将抗体切割为Fab和Fc区；其中用孵育混合物在无终止反应且无中间纯化下直接进行结合亲和力的测定，和
-通过将前面步骤中获得的孵育反应混合物直接应用在表面等离振子共振法中，用表面等离振子共振测定抗体Fab对其抗原的结合亲和力；
和
从而测定人IgG1亚类二价全长抗体的结合部位的结合亲和力。
2.权利要求1的方法，其中牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶具有氨基酸序列SEQID NO:02或SEQ ID NO:03或SEQ ID NO:04。
3.权利要求2的方法，其中衍生自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸牙龈菌蛋白酶的多肽具有至少包含SEQ ID NO:01的残基230至739的氨基酸序列。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中孵育是孵育约60分钟的时间。
5.权利要求1至3中任一项的方法，其中抗体在两条重链多肽中都包含Fc区中的突变P329G、L234A和L235A。
6.用于选择特异性结合同多聚抗原的抗体的方法，包括以下步骤：
-提供结合同一同多聚抗原的多种人IgG1亚类二价全长抗体；
-用权利要求1至5中任一项的方法测定多种抗体中的每种抗体与其抗原的结合亲和力；和
-根据前面步骤中测定的结合亲和力选择一种或多种抗体。
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