CN115175930A - 用于产生和/或富集重组抗原结合分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供具有调节例如抗原分子之间的相互作用的活性的新型抗原结合分子。本发明涉及抗原结合分子，该抗原结合分子含有能够通过在两个抗原结合结构域之间形成的至少一个二硫键而彼此连接的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，以及产生这种抗原结合分子的方法。更具体地，本发明涉及用于增加或富集优选形式的抗体蛋白的方法，以及用于消除重组抗体蛋白的二硫键异质性的方法。

Description

用于产生和/或富集重组抗原结合分子的方法
技术领域
本发明涉及抗原结合分子，该抗原结合分子含有能够通过在两个抗原结合结构域之间形成的至少一个二硫键而彼此连接的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，以及产生这种抗原结合分子的方法。更具体地，本发明涉及用于增加或富集优选形式的抗体蛋白的方法，以及用于消除重组抗体蛋白的二硫键异质性的方法。
背景技术
抗体是以高亲和力特异性结合抗原的蛋白质。已知从低分子化合物到蛋白质的各种分子可以是抗原。由于开发了产生单克隆抗体的技术，因此抗体修饰技术得到了发展，使得易于获得识别特定分子的抗体。现在，抗体修饰技术不仅用于修饰蛋白质本身，而且已扩展到旨在增加新功能的领域，其中可考虑与低分子化合物缀合。例如，将在重链或轻链中包含游离半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸工程化抗体用作用于医学目的的抗体-药物偶联物(ADC)(PTL 1)。
抗体作为药物引起了人们的注意，因为它们在血浆中高度稳定且副作用较小。抗体不仅与抗原结合并表现出激动作用或拮抗作用，而且它们还诱导由效应细胞介导的细胞毒性活性(也称为效应功能)，包括ADCC(抗体依赖性细胞毒性)，ADCP(抗体依赖性细胞吞噬作用)，和CDC(补体依赖性细胞毒性)。利用这些抗体的功能，已经开发出用于癌症、免疫疾病、慢性疾病、感染等的药物(NPL 1)。
例如，已经开发了利用针对促进细胞毒性T细胞活化的共刺激分子的激动剂抗体的药物作为抗癌剂(NPL 2)。最近，发现对共抑制分子具有拮抗活性的免疫检查点抑制抗体可用作抗癌剂。这一发现导致一系列抑制CTLA4/CD80或PD-1/PD-L1相互作用的抗体药物的推出：伊匹单抗，纳武单抗，派姆单抗和阿替利珠单抗(NPL 1)。
但是，此类抗体有时无法以其原始天然IgG形式充分发挥预期效果。因此，已经开发了第二代抗体药物，其中根据使用目的，人为地增强或添加了天然IgG抗体的功能，或者减少了或缺失了天然IgG抗体的功能。第二代抗体药物包括，例如，具有增强或缺失的效应子功能的抗体(NPL 3)，以pH依赖方式与抗原结合的抗体(NPL 4)和每个分子与两个或多个不同抗原结合的抗体(与两个不同抗原结合的抗体通常称为“双特异性抗体”)(NPL 5)。
双特异性抗体有望成为更有效的药物。例如，已经开发出具有增强的抗肿瘤活性的抗体，该抗体通过与作为一种抗原的T细胞的细胞膜上表达的蛋白质和作为另一种抗原的癌症抗原结合而使细胞毒性T细胞与癌细胞交联(NPL 7，NPL 8和PTL 2)。先前报道的双特异性抗体包括具有两个抗体Fab结构域的分子，每个抗体Fab结构域具有不同的序列(常见的轻链双特异性抗体和杂种杂交瘤)，具有附着于抗体N或C末端的额外抗原结合位点的分子(DVD-Ig和scFv-IgG)，具有结合两种抗原的一个Fab结构域的分子(二合一IgG)，其中CH3结构域的环区已被改造以形成新的抗原结合位点(Fcab)的分子(NPL 9)，以及具有串联Fab-Fab的分子(NPL 10)。
同时，具有效应子功能的抗体通过甚至作用于以低水平表达靶抗原的正常细胞而容易引起副作用。因此，人们已经努力使抗体药物特异性地对靶组织发挥其效应子功能。以前报道的实例是在与细胞代谢物结合时结合活性改变的抗体(PTL 3)，在蛋白酶切割时变得能够与抗原结合的抗体(PTL 4)，和通过加入化合物调节嵌合抗原受体T细胞和癌细胞之间的抗体介导的交联的技术(ABT-737)(NPL 11)。
取决于靶标，可能难以获得激动剂抗体。特别是，对于膜蛋白(例如G蛋白偶联受体)，已经开发出许多不同的技术(NPL 12)。因此，需要用于增强抗体对这些靶标的激动作用的简单方法。已知的现有方法包括，例如，使抗DR4(死亡受体4)或抗DR5(死亡受体5)抗体交联的方法(NPL13)、使抗DR5(死亡受体5)抗体的纳米抗体多聚化的方法(NPL 14)、使抗血小板生成素受体抗体转化为共价双抗体(diabody)sc(Fv)2的方法(NPL 15)、改变抗CD40抗体的IgG亚类的方法(NPL 16)、使抗CD20抗体六聚化的方法(NPL 17)、环状抗体样分子的制备方法(PTL 5)等。另外，报道的使用双特异性抗体的方法包括，例如，使用针对不同表位的两种合适的抗促红细胞生成素抗体的组合作为双特异性抗体的方法(NPL 18)，使用用于指导功能的抗体和用于效应子功能的抗体的组合作为双特异性抗体的方法(NPL 19)，和将Cys残基引入对不同表位特异性的多个抗体片段并将它们缀合的方法(NPL 20、NPL 21和PTL 6)。
[引文列表]
[专利文献]
[PTL 1]WO 2016/040856
[PTL 2]WO 2008/157379
[PTL 3]WO 2013/180200
[PTL 4]WO 2009/025846
[PTL 5]WO 2017/191101
[PTL 6]WO 2018/027204
[非专利文献]
[NPL 1]Nature Reviews Drug Discovery(2018)17,197-223
[NPL 2]Clinical and Experimental Immunology(2009)157,9-19
[NPL 3]Current Pharmaceutical Biotechnology(2016)17,1298-1314
[NPL 4]Nature Biotechnology(2010)28,1203-1208
[NPL 5]MAbs(2012)4,182-197
[NPL 6]Nature Reviews Immunology(2010)10,301-316
[NPL 7]Sci Transl Med(2017)9(410),eaal4291
[NPL 8]Blood(2011)117(17):4403-4404
[NPL 9]Protein Eng Des Sel(2010)23(4),289-297
[NPL 10]J Immunol(2016)196(7):3199-3211
[NPL 11]Nature Chemical Biology(2018)14,112-117
[NPL 12]Exp Mol Med(2016)48(2):e207
[NPL 13]Nature Reviews Drug Discovery(2008)7,1001-1012
[NPL 14]MAbs(2014)6(6):1560-1570
[NPL 15]Blood(2005)105(2):562-566
[NPL 16]J Biol Chem(2008)283(23):16206-16215
[NPL 17]PLoS Biol(2016)14(1):e1002344
[NPL 18]Proc Natl Acad Sci U S A(2012)109(39):15728-15733
[NPL 19]Scientific Reports(2018)8,Article number:766
[NPL 20]PLoS One(2012)7(12):e51817
[NPL 21]Nucleic Acids Res(2010)38(22):8188-8195
发明概述
技术问题
本发明的目的是提供具有调节两个或更多个抗原分子之间的相互作用的活性的新型抗原结合分子(例如IgG抗体)，和/或提供用于制备或使用这种抗原结合分子的方法。更具体地，本发明通过在重链和/或轻链中引入突变通过在抗体的两个抗原结合结构域(两个Fab)之间引入一个或多个工程化二硫键，解决了常规抗体(例如野生型IgG)具有两个抗原结合结构域(例如两个Fab臂)的不受控的柔性的问题。具体地，通过在抗体的两个抗原结合结构域(两个Fab)的每个处引入一个或多个含硫醇氨基酸(例如半胱氨酸和蛋氨酸)，这样的抗体能够在两个抗原结合结构域(两个Fab)之间形成一个或多个二硫键。
解决问题的方案
本发明的抗原结合分子含有通过两个抗原结合结构域之间的至少一个二硫键彼此“能够连接”的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。至少一个二硫键“能够形成”在两个抗原结合结构域之间，例如在非铰链区的氨基酸残基之间。术语“能够连接”和“能够形成”包括二硫键已经形成的情况，以及二硫键尚未形成但稍后在合适的条件下将形成的情况。
在一个非限制性方面，IgG抗体的两个Fab之间的一个或多个工程化二硫键能够控制两个Fab臂的柔性、距离和/或细胞结合方向(即顺式或反式)，从而与没有一个或多个工程化二硫键的相应野生型IgG抗体相比，改善IgG抗体的活性和/或安全性。在一个非限制性方面，与没有一个或多个工程化二硫键的相应野生型IgG抗体相比，IgG的两个Fab之间的一个或多个工程化二硫键改善了IgG抗体的激动活性。此外，在另一个非限制性方面，与没有一个或多个工程化二硫键的相应野生型IgG抗体相比，IgG的两个Fab之间的一个或多个工程化二硫键改善了IgG抗体对蛋白酶消化的抗性。
在制备能够在抗体的两个Fab之间形成一个或多个工程化二硫键的抗体时，发明人进一步发现了相同抗体(相同序列)但具有不同二硫键结构的若干种构象同种型，特别是具有“配对半胱氨酸”的异构体和具有“游离或未配对半胱氨酸”的同种型(即，两种结构同种型)，可以在哺乳动物细胞中重组抗体生产过程中产生。因此，本发明的另一方面涉及提供在抗体的两个Fab之间具有一个或多个工程化二硫键的抗体的有效且容易的生产、纯化和分析。更具体地，本发明描述了用于增加“配对半胱氨酸”形式(即，具有在抗体的两个Fab之间形成的一个或多个工程化二硫键)的抗体的结构同质性和相对丰度的方法。换言之，本发明描述了用于降低“游离或未配对半胱氨酸”形式(即，在抗体的两个Fab之间没有形成工程化二硫键)的抗体的相对丰度的方法。
如下文进一步详细描述的，在本发明的一些实施方案中，添加还原试剂可促进抗体中一个或多个工程化二硫键的形成，从而产生结构上同质的分子。
更具体地，本发明提供以下内容：
[1]用于(i)生产抗体制剂，(ii)纯化具有所需构象的抗体，或(iii)改善抗体制剂的同质性的方法；
所述方法包括使抗体制剂与还原试剂接触，其中所述抗体包含能够通过至少一个二硫键彼此连接的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述至少一个二硫键能够在非铰链区的氨基酸残基之间形成。
[2]用于(i)生产抗体制剂，(ii)纯化抗体制剂，或(iii)改善抗体制剂的同质性的方法；
包括通过选自由以下各项组成的组的一个或多个层析步骤分离具有所需构象的抗体级分：反相层析、尺寸排阻层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析和电泳；其中所述具有所需构象的抗体的特征在于具有在非铰链区的氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键。
[2A][2]所述的方法，其中一个或多个层析步骤是离子交换层析(IEC)和/或疏水相互作用层析(HIC)，或IEC和HIC的混合模式层析。
[3][1]-[2A]中任一项所述的方法，其中所述抗体制剂包含两种或更多种结构同种型，其不同之处在于在非铰链区的氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键。
[3A][3]所述的方法，其中所述抗体制剂包含两种结构同种型，其不同之处在于在非铰链区的氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键。
[3B][1]至[3A]中任一项所述的方法，其中所述方法优先富集或增加抗体结构同种型的群体，所述抗体结构同种型具有在非铰链区的氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键。
[3C][1]至[3B]中任一项所述的方法，其中所述方法产生具有至少50％、60％、70％、80％、90％、优选至少95％摩尔比的所述抗体的同质抗体制剂，所述抗体具有在非铰链区的氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键。
[3D][1]至[3C]中任一项所述的方法，其中，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域各自包含铰链区或不包含铰链区。
[3E][1]至[3D]中任一项所述的方法，其中所述非铰链区的氨基酸残基是引入的或工程化的半胱氨酸。
[3F][1]至[3E]中任一项所述的方法，其中所述至少一个二硫键是链间二硫键。
[3I][1]至[3F]中任一项所述的方法，其中所述至少一个二硫键是不存在于野生型IgG中的工程化二硫键。
[4][1]至[3J]中任一项所述的方法，
其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的CH1区、CL区、VL区、VH区和/或VHH区之间形成。
[5][1]至[4]中任一项所述的方法，
其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域的CH1区和所述第二抗原结合结构域的CH1区之间形成。
[5.1][5]所述的方法，其中所述至少一个二硫键在CH1区中根据EU编号位置119至123、131至140、148至150、155至167、174至178、188至197和201至214中任一位置处在抗原结合结构域之间形成。
[5.2][5]所述的方法，其中所述至少一个二硫键在CH1区中根据EU编号位置119,122,123,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,148,150,155,156,157,159,160,161,162,163,164,165,167,174,176,177,178,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,201,203,205,206,207,208,211,212,213,214中任一位置处在抗原结合结构域之间形成。
[5.3][5]所述的方法，其中所述至少一个二硫键在CH1区中根据EU编号位置134,135,136,137,191,192,193,194,195或196中任一位置处在抗原结合结构域之间形成。
[5.4][5]所述的方法，其中所述至少一个二硫键在CH1区中根据EU编号位置135,136或191中任一位置处在抗原结合结构域之间形成。
[5.5][5]所述的方法，其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基之间形成，所述氨基酸残基选自由根据EU编号位置119,120,121,122和123组成的组。
[5.6][5]所述的方法，其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基之间形成，所述氨基酸残基选自由根据EU编号位置131,132,133,134,135,136,137,138,139和140组成的组。
[5.7][5]所述的方法，其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基之间形成，所述氨基酸残基选自由根据EU编号位置148,149和150组成的组。
[5.8][5]所述的方法，其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基之间形成，所述氨基酸残基选自由根据EU编号位置155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166和167组成的组。
[5.9][5]所述的方法，其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基之间形成，所述氨基酸残基选自由根据EU编号位置174,175,176,177和178组成的组。
[5.10][5]所述的方法，其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基之间形成，所述氨基酸残基选自由根据EU编号位置188,189,190,191,192,193,194,195,196和197组成的组。
[5.11][5]所述的方法，其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基之间形成，所述氨基酸残基选自由根据EU编号位置201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213和214组成的组。
[5.12][5]所述的方法，其中，在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基的位置之间的差异为三个氨基酸或更少。
[5.13][5]所述的方法，其中连接所述两个抗原结合结构域的所述至少一个二硫键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置135处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置132至138中的任何一个位置处的氨基酸残基连接而形成的。
[5.14][5]所述的方法，其中连接所述两个抗原结合结构域的所述至少一个二硫键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置136处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置133至139中的任何一个位置处的氨基酸残基连接而形成的。
[5.15][5]所述的方法，其中连接所述两个抗原结合结构域的所述至少一个二硫键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置191处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置188至194中的任何一个位置处的氨基酸残基连接而形成的。
[5.16][5]所述的方法，其中一个二硫键在CH1区中根据EU编号位置135处在两个抗原结合结构域之间形成。
[5.17][5]所述的方法，其中一个二硫键在CH1区中根据EU编号位置136处在两个抗原结合结构域之间形成。
[5.18][5]所述的方法，其中一个二硫键在CH1区中根据EU编号位置191处在两个抗原结合结构域之间形成。
[5A][5]所述的方法，其中所述CH1区的亚类是γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2、μ、δ或ε。
[6][5]-[5A]所述的方法，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的各自CH1区中根据EU编号位置191处的氨基酸残基之间形成一个二硫键。
[6A][6]所述的方法，其中在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的各自CH1区中，通过在根据EU编号以下位置处的氨基酸残基，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间形成另外的一个、两个或更多个二硫键：
(a)在两个抗原结合结构域各自的位置131至138、194和195的任意位置处的氨基酸残基之间；
(b)在两个抗原结合结构域各自的位置131处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(c)在两个抗原结合结构域各自的位置132处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(d)在两个抗原结合结构域各自的位置133处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(e)在两个抗原结合结构域各自的位置134处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(f)在两个抗原结合结构域各自的位置135处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(g)在两个抗原结合结构域各自的位置136处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(h)在两个抗原结合结构域各自的位置137处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(i)在两个抗原结合结构域各自的位置138处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(j)在两个抗原结合结构域各自的位置131处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(k)在两个抗原结合结构域各自的位置132处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(l)在两个抗原结合结构域各自的位置133处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(m)在两个抗原结合结构域各自的位置134处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(n)在两个抗原结合结构域各自的位置135处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(o)在两个抗原结合结构域各自的位置136处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(p)在两个抗原结合结构域各自的位置137处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；和
(q)在两个抗原结合结构域各自的位置138处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间。
[6B][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带相反电荷的氨基酸残基。
[6C][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带负电荷的氨基酸残基。
[6D][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带负电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基。
[6E][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CHl区中包含一个、两个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(a)位置136处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(b)位置137处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(c)位置138处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；和
所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CHl区中包含一个、两个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(d)位置193处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；
(e)位置194处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；和
(f)位置195处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)。
[6F-1][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CHl区中包含一个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(a)位置136处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；
(b)位置137处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；
(c)位置138处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；和
所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CHl区中包含一个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(d)位置193处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(e)位置194处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；和
(f)位置195处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。
[6F-2][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的每一个包含如表7、表82或表85所列的在各自CH1区中的任何特定带电荷的突变组合(根据EU编号)。
[6G][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个疏水性氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个疏水性氨基酸残基。
[6H][6G]所述的方法，其中所述疏水性氨基酸残基是丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)和/或色氨酸(Trp)。
[6I][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个“杵”氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个“臼”氨基酸残基。
[6J][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个“臼”氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个“杵”氨基酸残基。
[6K][6I]或[6J]所述的方法，其中所述“杵”氨基酸残基选自由色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)组成的组；并且所述“臼”氨基酸残基选自由丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(T)或丝氨酸(S)组成的组。
[6L][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个芳香族氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基。
[6M][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个芳香族氨基酸残基。
[6N-1][6L]或[6M]所述的方法，其中所述芳香族氨基酸残基选自由色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)和苯丙氨酸(Phe)组成的组；并且所述带正电荷的氨基酸残基选自由赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)组成的组。
[6N-2][6]或[6A]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的每一个包含如表10所列的在各自CH1区中的特定疏水性氨基酸突变组合(根据EU编号)中的任一个。
[7][1]至[4]中任一项所述的方法，其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域的CL区和所述第二抗原结合结构域的CL区之间形成。
[7.1][7]所述的方法，其中形成两个抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于CL区中根据Kabat编号位置108至112、121至128、151至156、184至190、195至196、200至203和208至213中的任一位置。
[7.2][7]所述的方法，其中形成两个抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于CL区中选自由以下各项组成的组的位置：根据Kabat编号位置108,109,112,121,123,126,128,151,152,153,156,184,186,188,189,190,195,196,200,201,202,203,208,210,211,212和213。
[7.3][7]所述的方法，其中形成两个抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于CL区中根据Kabat编号的位置126处。
[7.4][7]所述的方法，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个二硫键是通过将所述第一抗原结合结构域的CL区中的氨基酸残基和所述第二抗原结合结构域的CL区中的氨基酸残基连接而形成的。
[7.5][7]所述的方法，其中形成两个抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于独立地选自由根据Kabat编号位置108,109,110,111和112的位置处组成的组。
[7.6][7]所述的方法，其中形成两个抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于独立地选自由根据Kabat编号位置151,152,153,154,155和156的位置处组成的组。
[7.7][7]所述的方法，其中形成两个抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于独立地选自由根据Kabat编号位置184,185,186,187,188,189和190的位置处组成的组。
[7.8][7]所述的方法，其中形成两个抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于独立地选自由根据Kabat编号位置200,201,202和203的位置处组成的组。
[7.9][7]所述的方法，其中形成两个抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于独立地选自由根据Kabat编号位置208,209,210,211,212和213的位置处组成的组。
[7.10][7]至[7.9]所述的方法，其中，形成两个抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基的位置之间的差异为3个氨基酸或更少。
[7.11][7]所述的方法，其中连接所述两个抗原结合结构域的所述至少一个键是通过将两个抗原结合结构域的CL区中根据Kabat编号在位置126处的氨基酸残基彼此连接而形成的。
[8][1]至[4]中任一项所述的方法，其中，所述至少一个二硫键是通过将所述第一抗原结合结构域的CH1区中的氨基酸残基与所述第二抗原结合结构域的CL区中的氨基酸残基连接而形成的。
[8.1][8]所述的方法，其中在所述CH1区中的所述氨基酸残基选自由以下各项组成的组：根据EU编号的位置188,189,190,191,192,193,194,195,196和197，并且在所述CL区中的所述氨基酸残基选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号的位置121,122,123,124,125,126,127和128。
[8.2][8]所述的方法，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个二硫键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置191处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CL区中根据Kabat编号在位置126处的氨基酸残基连接而形成的。
[8A][7]至[8]所述的方法，其中所述CL区的亚类是κ或λ。
[9][1]至[4]中任一项所述的方法，其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的可变区之间形成。
[9.1][9]所述的方法，其中形成抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于VH区内。
[9.2][9]所述的方法，其中形成抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于选自由VH区内根据Kabat编号位置6,8,16,20,25,26,28,74和82b的位置处组成的组。
[9.3][9]所述的方法，其中形成抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于VL区内。
[9.4][9]所述的方法，其中形成抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于选自由VL区内根据Kabat编号位置21,27,58,77,100,105和107的位置处(κ亚类)组成的组。
[9.5][9]所述的方法，其中形成抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于选自由VL区内根据Kabat编号位置6,19,33和34的位置处(λ亚类)组成的组。
[9A][4]所述的方法，其中形成两个抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于VHH区内。
[9B][9A]所述的方法，其中形成抗原结合结构域之间的至少一个二硫键的所述氨基酸残基存在于VHH区选自由以下各项组成的组的位置处：根据Kabat编号位置4,6,7,8,9,10,11,12,14,15,17,20,24,27,29,38,39,40,41,43,44,45,46,47,48,49,67,69,71,78,80,82,82c,85,88,91,93,94和107。
[10][1]至[9B]中任一项所述的方法，其特征在于以下一项或多项：
(a)其中所述至少一个二硫键将两个抗原结合结构域的抗原结合方向限制为顺式抗原结合(即，结合同一细胞上的两个抗原)，或将两个抗原结合结构域限制为结合在空间上彼此接近的两个抗原；
(b)其中与不具有所述至少一个二硫键的相同相应抗体相比，所述至少一个二硫键将第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域保持在空间上彼此更接近；
(c)其中与不具有所述至少一个二硫键的相应相同抗体相比，所述至少一个二硫键降低第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的柔性和/或迁移率；
(d)其中与不具有所述至少一个二硫键的相应相同抗体相比，所述至少一个二硫键增加抗体对蛋白酶切割的抗性；
(e)其中与不具有所述至少一个二硫键的相应相同抗体相比，所述至少一个二硫键增强或减少由所述抗原结合分子结合的两个抗原分子之间的相互作用；
(f)其中所述方法产生抗体制剂，所述抗体制剂比未经所述方法处理的相同抗体制剂更同质；
(g)其中所述方法产生抗体制剂，所述抗体制剂与未经所述方法处理的相同抗体相比具有增加的生物学活性；
(h)其中所述方法产生抗体，所述抗体与未经所述方法处理的相同抗体相比具有增强的将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的活性；
(i)其中所述方法产生抗体，所述抗体与未经所述方法处理的相同抗体相比具有增强的稳定性；和
(j)其中所述方法优先富集具有在铰链区外部形成的至少一个二硫键的抗体，并且与未经所述方法处理的制剂相比，所述优先富集的形式具有选自以上(a)至(i)中任一项的药学上所需的性质。
[11][1]至[10]中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二抗原结合结构域各自具有Fab、Fab’、scFab、Fv、scFv或VHH结构。
[11A][11]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域各自包含Fab和铰链区，形成F(ab’)2结构。
[12][1]至[11A]中任一项所述的方法，其中，所述抗原结合分子进一步包含Fc区。
[12A][12]所述的方法，其中所述Fc区是与野生型人IgG1抗体的Fc区相比对FcγR的结合活性降低的Fc区。
[13][1]至[12A]中任一项所述的方法，其中所述抗体是IgG抗体，优选地IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
[14][1]至[13]中任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域二者均结合相同的抗原。
[14A][1]至[13]中任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域二者均结合所述抗原上的相同表位。
[14B][1]至[13]中任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域各自结合所述抗原上的不同表位。
[14C][1]至[13]中任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域各自结合不同的抗原。
[14D][1]至[13]中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二抗原结合结构域二者均具有相同的氨基酸序列。
[14E][1]至[13]中任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域各自具有不同的氨基酸序列。
[14F][1]至[14E]中任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域所结合的两个抗原中的至少一个是可溶性蛋白。
[14G][1]至[14E]中任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域所结合的两个抗原中的至少一个是膜蛋白。
[14H][1]至[14G]中任一项所述的方法，其具有调节两个抗原分子之间相互作用的活性。
[14I][14H]所述的方法，与不具有所述至少一个二硫键的相同相应抗体相比，其能够增强或减少两个抗原分子之间的相互作用。
[14J][14H]至[14I]中任一项所述的方法，其中所述两个抗原分子分别是配体和其受体，并且其中所述抗体具有促进所述配体激活所述受体的活性。
[14K][14H]至[14I]中任一项所述的方法，其中所述两个抗原分子分别是酶和其底物，并且其中所述抗原结合分子具有促进所述酶与所述底物的催化反应的活性。
[14L][14H]至[14I]中任一项所述的方法，其中所述两个抗原分子都是存在于细胞表面上的蛋白质，并且其中所述抗体具有促进表达所述第一抗原的细胞与表达所述第二抗原的细胞之间的相互作用的活性。
[14M][14L]中任一项所述的方法，其中表达所述第一抗原的细胞是具有细胞毒性活性的细胞，并且表达所述第二抗原的细胞是其靶细胞，并且其中所述抗体促进具有细胞毒性活性的所述细胞对所述靶细胞的损伤。
[14N][14M]所述的方法，其中所述具有细胞毒性活性的细胞是T细胞，NK细胞，单核细胞或巨噬细胞。
[14O][14N]所述的方法，其中与不具有所述至少一个二硫键的相同相应抗体相比，具有所述至少一个二硫键的抗体增强或减少两个抗原分子的活化。
[14P][14]至[14O]中任一项所述的方法，其中所述抗原分子选自由以下各项组成的组：属于细胞因子受体超家族的受体，G蛋白偶联受体，离子通道受体，酪氨酸激酶受体，免疫检查点受体，抗原受体，CD抗原，共刺激分子和细胞粘附分子。
[15][14]至[14P]中任一项所述的方法，其中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域各自能够与CD3结合。
[16][1]至[15]中任一项所述的方法，其中与抗体接触的所述还原试剂的pH为约3至约10。
[16A][16]所述的方法，其中与抗体接触的所述还原试剂的pH为约6、7或8。
[16B][16]所述的方法，其中与抗体接触的所述还原试剂的pH为约7。
[16C][16]所述的方法，其中与抗体接触的所述还原试剂的pH为约3。
[17][1]至[16B]中任一项所述的方法，其中所述还原试剂选自由TCEP、2-MEA、DTT、半胱氨酸、GSH和Na2SO3组成的组。
[17A][17]所述的方法，其中所述还原试剂是TCEP。
[18][17]至[17A]中任一项所述的方法，其中，所述还原试剂的浓度为约0.01mM至约100mM。
[19][18]所述的方法，其中所述还原试剂的浓度为约0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,1,2.5,5,10,25,50,100mM，优选地约0.01mM至25mM。
[20][1]至[19]中任一项所述的方法，其中，所述接触步骤进行至少30分钟。
[20A][1]至[19]中任一项所述的方法，其中所述接触步骤进行约2至约48小时。
[20B][1]至[19]中任一项所述的方法，其中所述接触步骤进行约2小时或约16小时。
[21][1]至[20B]中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在约20℃至37℃的温度下进行，优选地在23℃、25℃或37℃，更优选地在23℃下进行。
[22][1]至[21]中任一项所述的方法，其中在所述与还原试剂接触步骤之前至少部分纯化所述抗体。
[22A][22]所述的方法，其中所述抗体在所述接触之前通过亲和层析(优选地蛋白A层析)部分纯化。
[23][1]至[22]中任一项所述的方法，其中所述抗体的浓度为约1mg/ml至约50mg/ml。
[23A][23]所述的方法，其中所述抗体的浓度为约1mg/ml或约20mg/ml。
[24][1]至[23]中任一项所述的方法，其进一步包括分离具有所需构象的接触抗体的级分。
[24A][24]所述的方法，其中用于所述分离的程序选自由反相层析HPLC、尺寸排阻层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析、透析和电泳组成的组。
[24B][24]所述的方法，其中用于所述分离的程序是离子交换层析(IEC)和/或疏水相互作用层析(HIC)。
[24C][1]至[24B]中任一项所述的方法，其进一步包括除去还原试剂的步骤，优选地通过透析，更优选地通过层析方法。
[25]根据[1]至[24B]中任一项所述的方法制备的IgG抗体制剂，所述制剂具有在铰链区外部具有至少一个二硫键的所述IgG抗体的同质群体。
[26]根据[1]至[25]中任一项所述的方法制备的IgG抗体制剂，所述制剂具有至少50％、60％、70％、80％、90％、优选地至少95％摩尔比的在铰链区外部具有至少一个二硫键的所述IgG抗体。
[27][25]或[26]所述的制剂，其进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[28]药物组合物，其包含[25]中所限定的抗体的同质群体和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
另一方面，本发明还提供以下内容：
[1]抗原结合分子，其包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
[2][1]所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是共价键。
[3][2]所述的抗原结合分子，其中所述共价键是通过所述第一抗原结合结构域中的氨基酸残基与所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基的直接交联而形成的。
[4][3]所述的抗原结合分子，其中所述交联的氨基酸残基是半胱氨酸。
[5][4]所述的抗原结合分子，其中所述形成的共价键是二硫键。
[6][2]所述的抗原结合分子，其中所述共价键是通过所述第一抗原结合结构域中的氨基酸残基与所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基经由交联剂交联而形成的。
[7][6]所述的抗原结合分子，其中所述交联剂是胺反应性交联剂。
[8][7]所述的抗原结合分子，其中所述交联的氨基酸残基是赖氨酸。
[9][1]所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是非共价键。
[10][9]所述的抗原结合分子，其中所述非共价键是离子键，氢键或疏水键。
[11][10]所述的抗原结合分子，其中所述离子键在酸性氨基酸和碱性氨基酸之间形成。
[12][11]所述的抗原结合分子，其中所述酸性氨基酸是天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)，所述碱性氨基酸是组氨酸(His)，赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)。
[13][1]至[12]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个是人工引入的突变氨基酸残基。
[14][13]所述的抗原结合分子，其中所述突变氨基酸残基是半胱氨酸残基。
[15][1]至[14]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的至少一个自身具有与抗原结合的活性。
[16][1]至[15]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域均为相同类型的抗原结合结构域。
[17][1]至[16]中任一项所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键通过将存在于所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域上的相同位置处的氨基酸残基彼此连接而形成。
[18][1]至[16]中任一项所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键通过将存在于所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域上的不同位置处的氨基酸残基彼此连接而形成。
[19][1]至[18]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的至少一个包含与特定抗原结合的抗体片段。
[20][19]所述的抗原结合分子，其中所述抗体片段是Fab，Fab'，scFab，Fv，scFv或单域抗体。
[21][19]或[20]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的至少一个氨基酸残基存在于所述抗体片段内。
[22][21]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于恒定区内。
[23][22]所述的抗原结合分子，其中所述恒定区来源于人。
[24][22]或[23]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于CH1区内。
[25][24]所述的抗原结合分子，其中所述CH1区的亚类为γ1，γ2，γ3，γ4，α1，α2，μ，δ或ε。
[26][24]或[25]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于CH1区中根据EU编号位置119至123、131至140、148至150、155至167、174至178、188至197、201至214，和218至219中的任意一个位置。
[27][26]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于CH1区中根据EU编号选自由以下各项组成的组的位置：位置119,122,123,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,148,150,155,156,157,159,160,161,162,163,164,165,167,174,176,177,178,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,201,203,205,206,207,208,211,212,213,214,218和219。
[28][27]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于CH1区中根据EU编号的位置134,135,136,137,191,192,193,194,195或196。
[29][28]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于CH1区中根据EU编号的位置135,136或191。
[30][24]至[29]中任一项所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过将所述第一抗原结合结构域的CH1区中的氨基酸残基和所述第二抗原结合结构域的CH1区中的氨基酸残基连接而形成的。
[31][30]所述的抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号位置119、120、121、122和123。
[32][30]所述的抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号位置131,132,133,134,135,136,137,138,139和140。
[33][30]所述的抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号位置148,149和150。
[34][30]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号位置155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166和167。
[35][30]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号位置174、175、176、177和178。
[36][30]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号位置188,189,190,191,192,193,194,195,196和197。
[37][30]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号位置201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213和214。
[38][30]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号位置218和219。
[39][30]至[38]中任一项所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基的位置之间的差异为三个氨基酸或更少。
[40][39]所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置135处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置132至138中的任何一个位置处的氨基酸残基连接而形成的。
[41][39]所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置136处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置133至139中的任何一个位置处的氨基酸残基连接而形成的。
[42][39]所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置191处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置188至194中的任何一个位置处的氨基酸残基连接而形成的。
[43][40]所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过将两个抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置135处的氨基酸残基彼此连接而形成的。
[44][41]所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过将两个抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置136处的氨基酸残基彼此连接而形成的。
[45][42]所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过将两个抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置191处的氨基酸残基彼此连接而形成的。
[45A][42]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的各自CH1区中根据EU编号位置191处的氨基酸残基之间形成一个二硫键。
[45B][45A]所述的抗原结合分子，其中在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的各自CH1区中，通过根据EU编号以下位置处的氨基酸残基，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间形成另外的一个、两个或更多个二硫键：
(a)在两个抗原结合结构域各自的位置131至138、194和195的任意位置处的氨基酸残基之间；
(b)在两个抗原结合结构域各自的位置131处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(c)在两个抗原结合结构域各自的位置132处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(d)在两个抗原结合结构域各自的位置133处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(e)在两个抗原结合结构域各自的位置134处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(f)在两个抗原结合结构域各自的位置135处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(g)在两个抗原结合结构域各自的位置136处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(h)在两个抗原结合结构域各自的位置137处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(i)在两个抗原结合结构域各自的位置138处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(j)在两个抗原结合结构域各自的位置131处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(k)在两个抗原结合结构域各自的位置132处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(l)在两个抗原结合结构域各自的位置133处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(m)在两个抗原结合结构域各自的位置134处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(n)在两个抗原结合结构域各自的位置135处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(o)在两个抗原结合结构域各自的位置136处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(p)在两个抗原结合结构域各自的位置137处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；和
(q)在两个抗原结合结构域各自的位置138处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间。
[45C][45A]或[45B]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带相反电荷的氨基酸残基。
[45D][45A]或[45B]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带负电荷的氨基酸残基。
[45E][45A]或[45B]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带负电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基。
[45F][45A]或[45B]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CHl区中包含一个、两个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(a)位置136处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(b)位置137处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(c)位置138处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；和
所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CHl区中包含一个、两个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(d)位置193处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；
(e)位置194处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；和
(f)位置195处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)。
[45G-1][45A]或[45B]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CHl区中包含一个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(a)位置136处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；
(b)位置137处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；
(c)位置138处的氨基酸残基是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；和
所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CHl区中包含一个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(d)位置193处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(e)位置194处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；和
(f)位置195处的氨基酸残基是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。
[45G-2][45A]或[45B]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的每一个包含如表7、表82或表85所列的在各自CH1区中的任何特定带电荷的突变组合(根据EU编号)。
[45H][45A]或[45B]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个疏水性氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个疏水性氨基酸残基。
[45I-1][45H]所述的抗原结合分子，其中所述疏水性氨基酸残基是丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)和/或色氨酸(Trp)。
[45I-2][45A]或[45B]所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的每一个包含如表10所列的在各自CH1区中的特定疏水性氨基酸突变组合(根据EU编号)的任一个。
[45J][45A]或[45B]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个“杵”氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个“臼”氨基酸残基。
[45K][45A]或[45B]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个“臼”氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个“杵”氨基酸残基。
[45L][45J]或[45K]所述的抗原结合分子，其中所述“杵”氨基酸残基选自由色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)组成的组；并且所述“臼”氨基酸残基选自由丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(T)或丝氨酸(S)组成的组。
[45M][45A]或[45B]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个芳香族氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基。
[45N][45A]或[45B]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个芳香族氨基酸残基。
[45O][45M]或[45N]所述的抗原结合分子，其中所述芳香族氨基酸残基选自由色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)和苯丙氨酸(Phe)组成的组；并且所述带正电荷的氨基酸残基选自由赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)组成的组。
[46][22]或[23]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于CL区内。
[47][46]所述的抗原结合分子，其中所述CL区的亚类是κ或λ。
[48][46]或[47]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于CL区中根据Kabat编号位置108至112、121至128、151至156、184至190、195至196、200至203，和208至213中的任意一个位置。
[49][48]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于CL区中选自由以下各项组成的组的位置：根据Kabat编号位置108,109,112,121,123,126,128,151,152,153,156,184,186,188,189,190,195,196,200,201,202,203,208,210,211,212和213。
[50][49]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于CL区中根据Kabat编号的位置126处。
[51][46]至[50]中任一项所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过将所述第一抗原结合结构域的CL区中的氨基酸残基和所述第二抗原结合结构域的CL区中的氨基酸残基连接而形成的。
[52][51]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号位置108、109、110、111和112。
[53][51]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号位置121,122,123,124,125,126,127和128。
[54][51]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号位置151,152,153,154,155和156。
[55][51]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号位置184,185,186,187,188,189和190。
[56][51]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号位置195和196。
[57][51]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号位置200,201,202和203。
[58][51]所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的所述氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号位置208,209,210,211,212和213。
[59][51]至[58]中任一项所述的抗原结合分子，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域中的氨基酸残基的位置之间的差异为三个氨基酸或更少。
[60][59]所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过将两个抗原结合结构域的CL区中根据Kabat编号在位置126处的氨基酸残基彼此连接而形成的。
[61][24]至[29]和[46]至[50]中任一项所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过将所述第一抗原结合结构域的CH1区中的氨基酸残基和所述第二抗原结合结构域的CL区中的氨基酸残基连接而形成的。
[62][61]所述的抗原结合分子，其中在所述CH1区中的所述氨基酸残基选自由以下各项组成的组：根据EU编号的位置188,189,190,191,192,193,194,195,196和197，并且在所述CL区中的所述氨基酸残基选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号的位置121,122,123,124,125,126,127和128。
[63][62]所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置191处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CL区中根据Kabat编号在位置126处的氨基酸残基连接而形成的。
[64][21]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于可变区内。
[65][64]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于VH区内。
[66][65]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于VH区内选自由以下各项组成的组的位置：根据Kabat编号的位置6,8,16,20,25,26,28,74和82b。
[67][64]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于VL区内。
[68][67]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于VL区(κ亚类)内选自由以下各项组成的组的位置：根据Kabat编号位置21,27,58,77,100,105和107。
[69][67]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于VL区(λ亚类)内选自由以下各项组成的组的位置：根据Kabat编号位置6,19,33和34。
[70][64]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于VHH区内。
[71][70]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于VHH区选自由以下各项组成的组的位置：根据Kabat编号位置4,6,7,8,9,10,11,12,14,15,17,20,24,27,29,38,39,40,41,43,44,45,46,47,48,49,67,69,71,78,80,82,82c,85,88,91,93,94和107。
[72][1]至[18]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域中的至少一个包含与特定抗原结合的非抗体蛋白，或其片段。
[73][72]所述的抗原结合分子，其中所述非抗体蛋白是一对彼此特异性结合的配体和受体中的任一个。
[74][1]至[73]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域包含铰链区。
[75][74]所述的抗原结合分子，其中存在于野生型铰链区内的至少一个半胱氨酸残基被另一个氨基酸残基置换。
[76][75]所述的抗原结合分子，其中所述半胱氨酸残基存在于所述铰链区内根据EU编号的位置226和/或229。
[77][74]或[76]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的至少一个氨基酸残基存在于所述铰链区内。
[78][77]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于铰链区选自由以下各项组成的组的位置：根据EU编号位置216,218和219。
[79][1]至[78]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域通过两个或更多个键彼此连接。
[80][79]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的至少一个氨基酸残基是存在于野生型序列中的氨基酸残基。
[81][80]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于铰链区内。
[82][81]所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基是铰链区中的半胱氨酸残基。
[83][80]至[82]中任一项所述的抗原结合分子，其中连接所述两个抗原结合结构域的至少一个键是通过存在于铰链区中的半胱氨酸残基彼此交联而形成的二硫键。
[84][83]所述的抗原结合分子，其中所述半胱氨酸残基存在于所述铰链区内根据EU编号的位置226和/或229。
[85][79]至[84]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域之间的键所起源的至少一个氨基酸残基存在于所述抗体片段内，并且至少一个氨基酸残基存在于所述铰链区内。
[86][85]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域各自包含Fab和铰链区，并且其中包含所述两个抗原结合结构域的抗原结合分子是F(ab')2。
[87][1]至[86]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域包含Fc区。
[88][87]所述的抗原结合分子，其中将促进Fc区多聚化的一个或多个氨基酸突变引入所述Fc区中。
[89][88]所述的抗原结合分子，其中促进多聚化的所述氨基酸突变包括在选自由以下各项组成的组的至少一个位置处的氨基酸突变：根据EU编号，位置247,248,253,254,310,311,338,345,356,359,382,385,386,430,433,434,436,437,438,439,440和447。
[90][88]或[89]所述的抗原结合分子，其中所述多聚化是六聚化。
[91][87]至[90]中任一项所述的抗原结合分子，其为全长抗体。
另一方面，本发明还提供以下内容：
[92][1]至[91]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域二者均结合相同的抗原。
[93][92]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域二者均结合到所述抗原上的相同表位。
[94][92]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域各自结合至所述抗原上的不同表位。
[95][1]至[91]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域各自结合至不同的抗原。
[96][93]所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域二者具有相同的氨基酸序列。
[97][93]至[95]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域各自具有不同的氨基酸序列。
[98][1]至[91]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域所结合的两个抗原中的至少一个是可溶性蛋白。
[99][1]至[91]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合结构域所结合的两个抗原中的至少一个是膜蛋白。
另一方面，本发明还提供以下内容：
[100][1]至[99]中任一项所述的抗原结合分子，其具有调节两个抗原分子之间相互作用的活性。
[101][100]所述的抗原结合分子，与对照抗原结合分子相比，其能够增强或减少两个抗原分子之间的相互作用，其中所述对照抗原结合分子和[100]所述的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。
[102][100]或[101]所述的抗原结合分子，其中所述两个抗原分子分别是配体和其受体，并且其中所述抗原结合分子具有促进所述配体激活所述受体的活性。
[103][100]或[101]所述的抗原结合分子，其中所述两个抗原分子分别是酶和其底物，并且其中所述抗原结合分子具有促进所述酶与所述底物的催化反应的活性。
[104][100]或[101]所述的抗原结合分子，其中所述两个抗原分子都是存在于细胞表面上的蛋白质，并且其中所述抗原结合分子具有促进表达所述第一抗原的细胞与表达所述第二抗原的细胞之间的相互作用的活性。
[105][104]所述的抗原结合分子，其中表达所述第一抗原的细胞是具有细胞毒性活性的细胞，并且表达所述第二抗原的细胞是其靶细胞，并且其中所述抗原结合分子促进具有细胞毒性活性的所述细胞对所述靶细胞的损伤。
[106][105]所述的抗原结合分子，其中所述具有细胞毒性活性的细胞是T细胞，NK细胞，单核细胞或巨噬细胞。
[107][1]至[99]中任一项所述的抗原结合分子，其具有调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的激活的活性。
[108][107]所述的抗原结合分子，其与对照抗原结合分子相比，增强或减少两个抗原分子的活化，其中所述对照抗原结合分子和[107]所述的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。
[109][107]或[108]所述的抗原结合分子，其中所述抗原分子选自由以下各项组成的组：属于细胞因子受体超家族的受体，G蛋白偶联受体，离子通道受体，酪氨酸激酶受体，免疫检查点受体，抗原受体，CD抗原，共刺激分子和细胞粘附分子。
[110][1]至[99]中任一项所述的抗原结合分子，其具有将两个抗原分子保持在空间上接近位置的活性。
[111][110]所述的抗原结合分子，其能够将两个抗原分子保持在比对照抗原结合分子更近的位置，其中所述对照抗原结合分子和[110]所述的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。
[112][1]至[99]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述两个抗原结合结构域处于在空间上接近的位置，和/或所述两个抗原结合结构域的迁移率降低。
[113][112]所述的抗原结合分子，其中，相比于对照抗原结合分子，所述两个抗原结合结构域位于更近的位置和/或所述两个抗原结合结构域具有更小的迁移率，其中所述对照抗原结合分子和[112]所述的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。
[114][1]至[99]中任一项所述的抗原结合分子，其对蛋白酶切割具有抗性。
[115][114]所述的抗原结合分子，其与对照抗原结合分子相比，对蛋白酶切割的抗性增强，其中所述对照抗原结合分子和[114]所述的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在所述两个抗原结合结构域之间少一个键。
[116][115]所述的抗原结合分子，其中与对照抗原结合分子相比，蛋白酶处理后剩余的全长分子的比例增加。
[117][115]或[116]所述的抗原结合分子，其中与对照抗原结合分子相比，蛋白酶处理后产生的特定片段的比例降低。
[118][1]至[99]中任一项所述的抗原结合分子，其中当用蛋白酶处理所述分子时，所述抗原结合结构域或其片段的二聚体被切除。
[119][118]所述的抗原结合分子，其中当所述对照抗原结合分子用所述蛋白酶处理时，所述抗原结合结构域或其片段的单体被切除，并且其中所述对照抗原结合分子和[118]所述的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。
[120][118]或[119]所述的抗原结合分子，其中所述蛋白酶切割铰链区。
[121][101]至[106]，[108]至[109]，[111]，[113]，[115]至[117]和[119]至[120]中任一项所述的抗原结合分子，其中所述少一个的键是起源于突变的氨基酸残基而形成的键。
[122][121]所述的抗原结合分子，其中所述突变的氨基酸残基是半胱氨酸残基。
另一方面，本发明还提供以下内容：
[123]一种药物组合物，其包含[1]至[122]中任一项的抗原结合分子和药学上可接受的载体。
另一方面，本发明还提供以下内容：
[124]用于调节两个抗原分子之间相互作用的方法，包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，
(b)向所述抗原结合分子添加至少一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键，和
(c)使(b)中产生的所述抗原结合分子与所述两个抗原分子接触。
[125]用于调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的活性的方法，所述方法包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，
(b)向所述抗原结合分子添加至少一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键，和
(c)使(b)中产生的所述抗原结合分子与所述两个抗原分子接触。
[126]用于将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的方法，包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，
(b)向所述抗原结合分子添加至少一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键，和
(c)使(b)中产生的所述抗原结合分子与所述两个抗原分子接触。
[127]一种将两个抗原结合结构域放置在空间上接近的位置处和/或降低所述两个抗原结合结构域的迁移率的方法，包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，和
(b)向所述抗原结合分子添加至少一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键。
[128]用于增加抗原结合分子对蛋白酶切割的抗性的方法，包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，和
(b)向所述抗原结合分子添加至少一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键。
另一方面，本发明还提供以下内容：
[129]用于制备具有调节两个抗原分子之间相互作用的活性的抗原结合分子的方法，包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加至少一个连接所述两个抗原结合结构域的键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞从而表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
[130]用于制备抗原结合分子的方法，所述抗原结合分子具有调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的激活的活性，该方法包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加至少一个连接所述两个抗原结合结构域的键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
[131]用于制备抗原结合分子的方法，所述抗原结合分子具有将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的活性，所述方法包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加至少一个连接所述两个抗原结合结构域的键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
[132]用于制备抗原结合分子的方法，其中两个抗原结合结构域存在于空间上接近的位置处和/或两个抗原结合结构域的迁移率降低，所述方法包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加至少一个连接所述两个抗原结合结构域的键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
[133]用于制备对蛋白酶切割具有增强的抗性的抗原结合分子的方法，其包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加至少一个连接所述两个抗原结合结构域的键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
另一方面，本发明还提供以下内容：
[134]用于鉴定通过彼此缔合而被激活的新的蛋白质分子对的方法，该方法包括：
(a)提供两个任意的蛋白质分子，
(b)通过[129]至[133]中任一项所述的方法制备抗原结合分子，所述抗原结合分子包含分别与所述两个蛋白质分子结合的两个抗原结合结构域，
(c)使(b)中制备的所述抗原结合分子与所述两个蛋白质分子接触，和
(d)评估所述两个蛋白质分子是否被激活。
[135][134]所述的方法，其中至少一种所述蛋白质分子选自由以下各项组成的组:属于细胞因子受体超家族的受体，G蛋白偶联受体，离子通道受体，酪氨酸激酶受体，免疫检查点受体，抗原受体，CD抗原，共刺激分子和细胞粘附分子。
附图简述
[图1]
图1显示了用于分析OKT3及其具有半胱氨酸置换的变体的非还原性SDS-PAGE凝胶图像(参见实施例1)。两条虚线表示上条带和下条带。可以认为下条带对应于具有在CH1区之间形成的一个或多个工程化二硫键的抗体。
[图2]
图2显示了用于分析具有半胱氨酸置换的OKT3变体和OKT3-KiH的非还原性SDS-PAGE凝胶图像(参见实施例1)。两条虚线表示上条带和下条带。
[图3]
图3显示了用于分析具有半胱氨酸置换的OKT3-KiH变体的非还原性SDS-PAGE凝胶图像(参见实施例1)。两条虚线表示上条带和下条带。
[图4]
图4显示了用于分析具有半胱氨酸置换的OKT3-KiH变体的非还原性SDS-PAGE凝胶图像(参见实施例1)。两条虚线表示上条带和下条带。
[图5]
图5显示了非还原性SDS-PAGE凝胶的图像，其中描述了每个样品的2-MEA浓度(左图)；和显示每个样品的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)的图表(右图)(参见实施例4)。通过与不同浓度的2-MEA混合使20mg/mL抗体反应。最左边的条和虚线表示对照(0mM 2-MEA)的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)。条中的数字是下条带与上条带比率的值(交联比率或交联％)。
[图6]
图6显示了非还原性SDS-PAGE凝胶的图像，其中描述了每个样品的2-MEA浓度(上图)；和显示每个样品的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)的图表(下图)(参见实施例4)。通过与不同浓度的2-MEA混合使20mg/mL抗体反应。最左边的条和虚线表示对照(0mM 2-MEA)的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)。条中的数字是下条带与上条带比率的值(交联比率或交联％)。
[图7]
图7显示了非还原性SDS-PAGE凝胶的图像，其中描述了每个样品的2-MEA浓度(左图)；和显示每个样品的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)的图表(右图)(参见实施例4)。通过与不同浓度的2-MEA混合使1mg/mL抗体反应。最左边的条和虚线表示对照(0mM2-MEA)的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)。条中的数字是下条带与上条带比率的值(交联率或交联％)。
[图8]
图8显示了非还原性SDS-PAGE凝胶的图像，其中描述了每个样品的2-MEA浓度(上图)；和显示每个样品的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)的图表(下图)(参见实施例4)。通过与不同浓度的2-MEA混合使1mg/mL抗体反应。最左边的条和虚线表示对照(0mM2-MEA)的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)。条中的数字是下条带与上条带比率的值(交联比率或交联％)。
[图9]
图9显示了非还原性SDS-PAGE凝胶的图像，其中描述了每个样品的TCEP浓度(左图)；和显示每个样品的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)的图表(右图)(参见实施例5)。通过与不同浓度的TCEP混合使20mg/mL抗体反应。最左边的条和虚线表示对照(0mMTCEP)的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)。条中的数字是下条带与上条带比率的值(交联比率或交联％)。
[图10]
图10显示了非还原性SDS-PAGE凝胶的图像，其中描述了每个样品的TCEP浓度(上图)；和显示每个样品的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)的图表(下图)(参见实施例5)。通过与每个浓度的TCEP混合使20mg/mL抗体反应。N.D.表示未检测到条带。最左边的条和虚线表示对照(0mM TCEP)的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)。条中的数字是下条带与上条带比率的值(交联比率或交联％)。
[图11]
图11显示了非还原性SDS-PAGE凝胶的图像，其中描述了每个样品的TCEP浓度(上图)；和显示每个样品的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)的图表(下图)(参见实施例5)。通过与每个浓度的TCEP混合使1mg/mL抗体反应。N.D.表示未检测到条带。最左边的条和虚线表示对照(0mM TCEP)的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)。条中的数字是下条带与上条带比率的值(交联比率或交联％)。
[图12]
图12显示了非还原性SDS-PAGE凝胶的图像，其中描述了每个样品的试剂浓度(上图)；和显示与DTT(左)或半胱氨酸(右)反应的样品的下条带与上条带比率(交联比率或交联％)的图表(参见实施例6)。通过与每个浓度的DTT或半胱氨酸混合使20mg/mL抗体反应。最左边的条和虚线表示对照(无还原试剂)的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)。条中的数字是下条带与上条带比率的值(交联比率或交联％)。
[图13]
图13显示了非还原性SDS-PAGE凝胶的图像，其中描述了每个样品的试剂浓度(上图)；和显示与GSH(左)或Na2SO3(右)反应的样品的下条带与上条带比率(交联比率或交联％)的图表(下图)(参见实施例6)。通过与每个浓度的GSH或Na2SO3混合使20mg/mL抗体反应。最左边的条和虚线表示对照(无还原试剂)的下条带与上条带的比率(交联比率或交联％)。条中的数字是下条带与上条带比率的值(交联比率或交联％)。
[图14]
图14显示了非还原性SDS-PAGE凝胶的图像(参见实施例7)。通过在pH3、4和5条件下与2-MEA或TCEP混合，使20mg/mL的抗体发生反应。图中描述了每个样品的缓冲液pH。泳道3、6和9：无还原试剂。泳道4、7和10：与1mM 2-MEA混合。泳道5、8和11：与0.25mM TCEP混合。
[图15]
图15显示了非还原性SDS-PAGE凝胶的图像(参见实施例7)。通过在pH 6、7和8条件下与2-MEA或TCEP混合，使20mg/mL的抗体发生反应。图中描述了每个样品的缓冲液pH。泳道3、6和9：无还原试剂。泳道4、7和10：与1mM 2-MEA混合。泳道5、8和11：与0.25mM TCEP混合。
[图16]
图16显示了图表，该图表显示了图14和15中抗体样品的下条带与上条带的比率(交联比率)(参见实施例7)。对于每个pH值，最左边的(白色)条代表对照(无还原试剂处理)的下条带与上条带比率(交联比率)。中间(阴影)条表示与1mM 2-MEA混合的样品的下条带与上条带比率(交联比率)。最右边的(黑色)条表示与0.25mM TCEP混合的样品的下条带与上条带比率(交联比率)。条中的数字是下条带与上条带比率的值(交联比率)。
[图17]
图17显示了对如实施例8-1中所述的OKT3.S191C抗体样品进行的阳离子交换层析的色谱图。
[图18]
图18显示了如实施例8-1中所述通过阳离子交换层析分离的OKT3.S191C抗体样品的非还原性SDS-PAGE分析的凝胶图像。泳道5和10：OKT3.S191C(未分级)。泳道6：RA3和RA4的混合物。泳道7：RA5和RA6的混合物。泳道8：RA7和RA8的混合物。泳道9：RA9和RA10的混合物。
[图19]
图19显示了如实施例8-2中所述对OKT3.S191C0110抗体样品进行的阳离子交换层析的色谱图。
[图20]
图20显示了如实施例8-2中所述通过阳离子交换层析分离的OKT3.S191C0110抗体样品的非还原性SDS-PAGE分析的凝胶图像。泳道3：OKT3.S191C0110(未分级)。泳道4：RA4和RA5的混合物。泳道5：RA6和RA7的混合物。泳道6：RA8和RA9的混合物。泳道7：RA10和RA11的混合物。泳道8：RB11和RB10的混合物。泳道9：RB8和RB7的混合物。泳道10：RB6和RB5的混合物。泳道11：RB4和RB3的混合物。
[图21]
图21描绘了如参考例1中所述的Fab彼此交联的修饰抗体的实例。该图示意性地显示了野生型抗体(WT)和以下修饰抗体之间的结构差异：抗体H链的CH1区相互交联的修饰抗体(HH型)，抗体L链的CL区相互交联的修饰抗体(LL型)，和抗体H链的CH1区与抗体L链的CL区交联的修饰抗体(HL或LH型)。
[图22]
图22显示了测定野生型抗CD3ε抗体分子(CD3-G4s)和修饰抗体分子(CD3-G4sLL，CD3-G4sHH)的CD3介导的激动剂活性的结果，其中所述修饰抗体分子是经由另外的二硫键通过将所述野生型分子的Fab-Fab连接而制备的，如参考例4-3中所述。
[图23]
图23显示了测定野生型抗CD3ε抗体分子(OKT3-G1s)和修饰抗体分子(OKT3-G1sLL,OKT3-G1sHH)的CD3介导的激动剂活性的结果，其中所述修饰抗体分子是经由另外的二硫键通过将所述野生型分子的Fab-Fab连接而制备的，如参考例4-3中所述。
[图24]
图24显示了测定野生型抗CD3ε抗体分子(CD3-G1s)，抗CD28抗体分子(CD28-G1s)和抗CD3εx抗CD28双特异性抗体(CD3//CD28-G1s)和修饰抗体分子(CD3//CD28-G1sLL,CD3//CD28-G1sHH,CD3//CD28-G1sLH,CD3//CD28-G1sHL)的CD3和/或CD28介导的激动剂活性的结果，其中所述修饰抗体分子是经由另外的二硫键通过将所述双特异性抗体的Fab-Fab连接而制备的，如参考例4-3中所述。
[图25]
图25显示了测定野生型抗CD3ε抗体分子(OKT3-G1s)，抗CD28抗体分子(CD28-G1s)和抗CD3εx抗CD28双特异性抗体(OKT3//CD28-G1s)和修饰抗体分子(OKT3//CD28-G1sHH,OKT3//CD28-G1sHL)的CD3和/或CD28介导的激动剂活性的结果，其中所述修饰抗体分子是经由另外的二硫键通过将所述双特异性抗体的Fab-Fab连接而制备的，如参考例4-3中所述。
[图26]
图26显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链可变区而制备的修饰抗体(MRAH.xxx-G1T4)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链恒定区而制备的修饰抗体(MRAH-G1T4.xxx)，如参考例5-2(1/8)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图27]
图27显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链可变区而制备的修饰抗体(MRAH.xxx-G1T4)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链恒定区而制备的修饰抗体(MRAH-G1T4.xxx)，如参考例5-2(2/8)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图28]
图28显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链可变区而制备的修饰抗体(MRAH.xxx-G1T4)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链恒定区而制备的修饰抗体(MRAH-G1T4.xxx)，如参考例5-2(3/8)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图29]
图29显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链可变区而制备的修饰抗体(MRAH.xxx-G1T4)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链恒定区而制备的修饰抗体(MRAH-G1T4.xxx)，如参考例5-2(4/8)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图30]
图30显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链可变区而制备的修饰抗体(MRAH.xxx-G1T4)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链恒定区而制备的修饰抗体(MRAH-G1T4.xxx)，如参考例5-2(5/8)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图31]
图31显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链可变区而制备的修饰抗体(MRAH.xxx-G1T4)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链恒定区而制备的修饰抗体(MRAH-G1T4.xxx)，如参考例5-2(6/8)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图32]
图32显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链可变区而制备的修饰抗体(MRAH.xxx-G1T4)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链恒定区而制备的修饰抗体(MRAH-G1T4.xxx)，如参考例5-2(7/8)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图33]
图33显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链可变区而制备的修饰抗体(MRAH.xxx-G1T4)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的重链恒定区而制备的修饰抗体(MRAH-G1T4.xxx)，如参考例5-2(8/8)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图34]
图34显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链可变区而制备的修饰抗体(MRAL.xxx-k0)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链恒定区而制备的修饰抗体(MRAL-k0.xxx)，如参考例6-2(1/10)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图35]
图35显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链可变区而制备的修饰抗体(MRAL.xxx-k0)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链恒定区而制备的修饰抗体(MRAL-k0.xxx)，如参考例6-2(2/10)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图36]
图36显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链可变区而制备的修饰抗体(MRAL.xxx-k0)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链恒定区而制备的修饰抗体(MRAL-k0.xxx)，如参考例6-2(3/10)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图37]
图37显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链可变区而制备的修饰抗体(MRAL.xxx-k0)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链恒定区而制备的修饰抗体(MRAL-k0.xxx)，如参考例6-2(4/10)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图38]
图38显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链可变区而制备的修饰抗体(MRAL.xxx-k0)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链恒定区而制备的修饰抗体(MRAL-k0.xxx)，如参考例6-2(5/10)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图39]
图39显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链可变区而制备的修饰抗体(MRAL.xxx-k0)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链恒定区而制备的修饰抗体(MRAL-k0.xxx)，如参考例6-2(6/10)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图40]
图40显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链可变区而制备的修饰抗体(MRAL.xxx-k0)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链恒定区而制备的修饰抗体(MRAL-k0.xxx)，如参考例6-2(7/10)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图41]
图41显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链可变区而制备的修饰抗体(MRAL.xxx-k0)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链恒定区而制备的修饰抗体(MRAL-k0.xxx)，如参考例6-2(8/10)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图42]
图42显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链可变区而制备的修饰抗体(MRAL.xxx-k0)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链恒定区而制备的修饰抗体(MRAL-k0.xxx)，如参考例6-2(9/10)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图43]
图43显示了抗IL6R抗体(MRA)和以下修饰抗体的蛋白酶处理的结果：通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链可变区而制备的修饰抗体(MRAL.xxx-k0)，和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链恒定区而制备的修饰抗体(MRAL-k0.xxx)，如参考例6-2(10/10)中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体进行条带检测。
[图44]
图44显示了抗IL6R抗体(MRA)和通过将半胱氨酸置换引入抗IL6R抗体的轻链恒定区而制备的修饰抗体(MRAL-k0.K126C)的蛋白酶处理的结果，如参考例7-2中所述。将每种蛋白酶处理的抗体应用于非还原毛细管电泳，然后使用抗κ链抗体或抗人Fc抗体进行条带检测。
[图45]
图45显示了通过抗体样品的蛋白酶处理获得的每个条带的分子量与其推定结构之间的对应性，如参考例7-2中所述。在每个分子的结构下方还应注意该分子是否可以与抗κ链抗体或抗Fc抗体反应(在图44的电泳中是否检测到条带)。
[图46]
图46显示了测定抗CD3抗体分子(OKT3)、通过经由另外的二硫键将所述抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(H_T135C,H_S136C,H_S191C,和L_K126C)和抗KLH抗体分子(IC17)(阴性对照)的CD3介导的激动剂活性的结果，如参考例13-4中所述。
[图47]
图47显示了测定抗CD3抗体分子(OKT3)、通过将易于异源二聚化的杵-臼(Knobs-in-Holes)(KiH)修饰引入OKT3的重链恒定区而制备的修饰抗体分子(OKT3_KiH)、通过经由另外的二硫键将所述抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(H_S191C_KiH,H_S191C/V188C_KiH,H_S191C/P189C_KiH,H_S191C/S190C_KiH,H_S191C/S192C_KiH,H_S191C/L193C_KiH,H_S191C/G194C_KiH)和抗KLH抗体(IC17)(阴性对照)的CD3介导的激动剂活性的结果，如参考例14-4中所述。
[图48]
图48显示了测定以下各项的CD3介导的激动剂活性的结果：抗CD3抗体分子(OKT3)、通过经由另外的二硫键将所述抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(H_S191C)、通过将易于异源二聚化的杵臼(KiH)修饰引入OKT3的重链恒定区而制备的修饰抗体分子(OKT3_KiH)、通过经由另外的二硫键将所述抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(H_S191C_KiH)、通过将带正电的氨基酸置换引入OKT3_KiH的一个重链恒定区并将带负电的氨基酸置换引入另一个重链恒定区而制备的修饰抗体分子(0004//0004,0004//0006)、通过将带正电荷或带负电荷的氨基酸置换引入OKT3_KiH的一个重链恒定区而制备的修饰抗体分子(0004//OKT3,OKT3//0004,OKT3//0006)和抗KLH抗体分子(IC17)(阴性对照)，如参考例15-4中所述。
[图49]
图49显示了测定以下各抗体分子的CD3介导的激动剂活性的结果：抗CD3抗体分子(OKT3)，通过去除该抗体分子的铰链区内的二硫键而制备的修饰抗体分子(dh1,dh2,dh3)，通过经由额外的二硫键将那些分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(H_S191C_dh1,H_S191C_dh2,H_S191C_dh3)，和抗KLH抗体分子(IC17)(阴性对照)，如参考例16-4中所述。
[图50]
图50显示了测定以下各抗体分子的CD3介导的激动剂活性的结果：抗CD3单特异性抗体分子(OKT3-G1s)，通过经由额外的二硫键将该抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(OKT3-G1sHH)，通过经由额外的二硫键将抗CD3单特异性抗体(CD3-G1s)的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(CD3-G1sLL)，抗CD3双互补位(biparatopic)抗体分子(CD3//OKT3-G1s)，通过经由额外的二硫键将该抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(CD3//OKT3-G1sHH,CD3//OKT3-G1sLH),以及CD3-G1sLL和OKT3-G1s的组合(CD3-G1sLL+OKT3-G1s)，如参考例20中所述。
[图51A]
图51A显示了测定以下各抗体的CD3和/或PD1介导的激动剂活性的结果：抗CD3x抗PD1双特异性抗体和通过经由额外的二硫键将那些抗体的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子，如参考例22-1中所述。图51A示出了以下各项的激动剂活性：由抗CD3抗体(OKT3)和抗PD1抗体(117)组成的抗CD3x抗PD1双特异性抗体分子(OKT3//117-G1silent)，以及通过经由额外的二硫键将该抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(OKT3//117-G1silentHH,OKT3//117-G1silentHL,OKT3//117-G1silentLL)。
[图51B]
图51B显示了测定以下各项的CD3和/或PD1介导的激动剂活性的结果：抗CD3x抗PD1双特异性抗体和通过经由额外的二硫键将那些抗体的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子，如参考例22-1中所述。图51B示出了以下各项的激动剂活性：由抗CD3抗体(OKT3)和抗PD1抗体(10)组成的抗CD3x抗PD1双特异性抗体分子(OKT3//10-G1silent)，以及通过经由额外的二硫键将该抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(OKT3//10-G1silentHH,OKT3//10-G1silentHL)。
[图51C]
图51C显示了测定以下各项的CD3和/或PD1介导的激动剂活性的结果：抗CD3x抗PD1双特异性抗体和通过经由额外的二硫键将那些抗体的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子，如参考例22-1中所述。图51C示出了以下各项的激动剂活性：由抗CD3抗体(CD3)和抗PD1抗体(949)组成的抗CD3x抗PD1双特异性抗体分子(CD3//949-G1silent)，以及通过经由额外的二硫键将该抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(CD3//949-G1silentLH,CD3//949-G1silentHH,CD3//949-G1silentLL,CD3//949-G1silentHL)。
[图51D]
图51D显示了测定以下各项的CD3和/或PD1介导的激动剂活性的结果：抗CD3x抗PD1双特异性抗体和通过经由额外的二硫键将那些抗体的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子，如参考例22-1中所述。图51D示出了以下各项的激动剂活性：由抗CD3抗体(OKT3)和抗PD1抗体(949)组成的抗CD3x抗PD1双特异性抗体分子(OKT3//949-G1silent)，以及通过经由额外的二硫键将该抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(OKT3//949-G1silentHL,OKT3//949-G1silentHH,OKT3//949-G1silentLL)。
[图52]
图52示出了测定以下各项的CD3和/或PD1介导的激动剂活性的结果：由抗CD3抗体(OKT3)和抗PD1抗体(949)组成的抗CD3x抗PD1双特异性抗体分子(OKT3//949-G1silent)，以及通过经由额外的二硫键将该抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(OKT3//949-G1silentHH,OKT3//949-G1silentHL,OKT3//949-G1silentLH,OKT3//949-G1silentLL)，如参考例22-2中所述。
[图53A]
图53A显示了当组合使用CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时，评估对癌细胞生长的T细胞依赖性抑制作用的结果，如参考例23-1所述。当将上述CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体组合并允许其在靶细胞(表达GPC3的癌细胞)和效应细胞(T细胞)存在下起作用时，GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体使靶细胞和效应细胞靠近，并且CD28/CD3钳位双特异性抗体激活效应细胞。图53A显示了当GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体分子(GPC3/attCE115)用作将T细胞靶向癌细胞的抗体，以及GPC3/CD3钳位双特异性抗体分子(GPC3/clamp CD3)、KLH/CD3钳位双特异性抗体分子(KLH/clamp CD3)、CD28/CD3钳位双特异性抗体分子(CD28/clamp CD3)或通过经由额外的二硫键将该抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(CD28/clamp CD3_HH)用作激活T细胞的抗体时，对癌细胞生长的抑制作用。
[图53B]
和图53A一样，图53B显示了当组合使用CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时，评估对癌细胞生长的T细胞依赖性抑制作用的结果，如参考例23-1所述。图53B显示了当通过经由额外的二硫键将GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(GPC3/attCE115_LL)用作将T细胞靶向癌细胞的抗体，并且GPC3/CD3钳位双特异性抗体分子(GPC3/clamp CD3)、KLH/CD3钳位双特异性抗体分子(KLH/clamp CD3)、CD28/CD3钳位双特异性抗体分子(CD28/clamp CD3)或通过经由额外的二硫键将该抗体分子的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(CD28/clamp CD3_HH)用作激活T细胞的抗体时，对癌细胞生长的抑制作用。
[图54A]
图54A显示了如参考例23-2中所述组合使用CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时，评估T细胞产生的细胞因子的结果。当在靶细胞(表达GPC3的癌细胞)和效应细胞(T细胞)存在下，将上述CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体组合使用时，GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体使靶细胞和效应细胞靠近，并且CD28/CD3钳位双特异性抗体激活效应细胞。图54A显示了在靶细胞(表达GPC3的癌细胞)和效应细胞(T细胞)的存在下，当GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体分子(GPC3/attCE115)和通过经由额外的二硫键将CD28/CD3钳位双特异性抗体的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(CD28/clamp CD3_HH)单独或组合使用时的IL-6产生水平。
[图54B]
和图54A一样，图54B显示了如参考例23-2中所述组合使用CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时，评估T细胞产生的细胞因子的结果。图54B显示了在仅效应细胞(T细胞)的存在下，当GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体分子(GPC3/attCE115)和通过经由额外的二硫键将CD28/CD3钳位双特异性抗体的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(CD28/clamp CD3_HH)单独或组合使用时的IL-6产生水平。
[图54C]
和图54A一样，图54C显示了如参考例23-2中所述组合使用CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时，评估T细胞产生的细胞因子的结果。图54C显示了在靶细胞(表达GPC3的癌细胞)和效应细胞(T细胞)的存在下，当GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体分子(GPC3/attCE115)和通过经由额外的二硫键将CD28/CD3钳位双特异性抗体的Fab-Fab连接而制备的修饰抗体分子(CD28/钳位CD3_HH)单独或组合使用时的癌细胞生长抑制作用。
[图55A]
图55A是示意图，显示了如参考例23-1所述当组合使用CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时，T细胞依赖性癌细胞生长抑制的作用机制(图中的“ε”表示CD3ε)。图55A显示了在靶细胞(表达GPC3的癌细胞)和效应细胞(T细胞)存在下，当组合使用CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时癌细胞生长抑制的作用机制。
[图55B]
图55B是示意图，显示了如参考例23-1所述当组合使用CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时，T细胞依赖性癌细胞生长抑制的作用机制(图中的ε表示CD3ε)。图55B显示了在靶细胞(表达GPC3的癌细胞)和效应细胞(T细胞)存在下，当组合使用通过向CD28/CD3钳位双特异性抗体的Fab-Fab中引入额外的二硫键而被修饰的修饰抗体分子和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时癌细胞生长抑制的作用机制。
[图56A]
图56A是示意图，显示了如参考例23-2所述当组合使用CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时，T细胞产生细胞因子的作用机制(图中的ε表示CD3ε)。图56A显示了在靶细胞(表达GPC3的癌细胞)和效应细胞(T细胞)存在下，当组合使用通过向CD28/CD3钳位双特异性抗体的Fab-Fab中引入额外的二硫键而被修饰的修饰抗体分子和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时细胞因子产生的作用机制。
[图56B]
图56B是示意图，显示了如参考例23-2所述当组合使用CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时，T细胞产生细胞因子的作用机制(图中的ε表示CD3ε)。图56B显示了在仅效应细胞(T细胞)存在下，当组合使用通过向CD28/CD3钳位双特异性抗体的Fab-Fab中引入额外的二硫键而被修饰的修饰抗体分子和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体时细胞因子产生的作用机制。
[图57A]
图57A显示了测定以下各项的激动剂活性的结果：CD8/CD28双特异性抗体分子(CD8/CD28-P587)，和通过经由额外的二硫键将该抗体的Fab-Fab连接而产生的修饰抗体分子(CD8/CD28-P587(HH),CD8/CD28-P587(LL),CD8/CD28-P587(HL),CD8/CD28-P587(LH))，如参考例24中所述。抗KLH抗体分子(KLH-P587)被用作阴性对照。显示了通过使用来自两个不同供体的外周血单核细胞(PBMC)获得的结果(上图：供体A，下图：供体B)。图57A显示了PBMC中分裂的调节性T细胞(Treg)的比例。
[图57B]
图57B显示了测定以下各项的激动剂活性的结果：CD8/CD28双特异性抗体分子(CD8/CD28-P587)，和通过经由额外的二硫键将该抗体的Fab-Fab连接而产生的修饰抗体分子(CD8/CD28-P587(HH),CD8/CD28-P587(LL),CD8/CD28-P587(HL),CD8/CD28-P587(LH))，如参考例24中所述。图57B示出了PBMC中分裂的CD8α阳性T细胞的比例。
[图58]
图58显示了如实施例9-3中所述的对具有带电荷氨基酸置换的OKT3变体的抗体样品进行的阳离子交换层析(CIEX)的色谱图。
[图59]
图59显示了如实施例2-2和实施例9-3中所述的对具有带电荷氨基酸置换的OKT3变体的抗体样品进行的阳离子交换层析(CIEX)的色谱图。
[图60]
图60显示了实施例10-1中产生的OKT3和MRA抗体变体的下条带与上条带比率的散点图(非还原性SDS-PAGE凝胶图像)。Y轴表示如表87所示的MRA变体样品的下条带与上条带的比率，而X轴表示如表87所示的OKT3变体样品的下条带与上条带的比率。
[图61A]
图61A显示了如实施例10-3中所述的对具有带电荷氨基酸置换的OKT3变体的抗体样品进行的阳离子交换层析(CIEX)的色谱图。
[图61B]
图61B显示了如实施例10-3中所述的对具有带电荷氨基酸置换的MRA变体的抗体样品进行的阳离子交换层析(CIEX)的色谱图。
[图62A]
图62A是显示额外氨基酸突变对增强工程化二硫键的Fab交联的效果的示意图。(左)具有半胱氨酸置换的G1T4.S191C变体，例如CH1的S191C(欧盟编号)，包含交联和非交联抗体的混合物。(中)包含额外氨基酸突变X(X可以是带电荷氨基酸、疏水性氨基酸或杵-臼氨基酸)的G1T4.S191C变体显示出更高比例的交联抗体。(右)CH1-CH1界面的氨基酸位置(EU编号)，其中额外的氨基酸突变X(X可以是带电荷氨基酸、疏水性氨基酸或杵-臼氨基酸)可以促进工程化二硫键的交联。
[图62B]
图62B是显示额外突变对通过层析法例如CIEX分离交联和非交联Fab的效果的示意图。
[具体实施方案]
I.定义
在本文中，术语“抗原结合分子”在最广泛的意义上是指与抗原决定簇(表位)特异性结合的分子。在一个实施方案中，抗原结合分子是抗体，抗体片段或抗体衍生物。在一个实施方案中，抗原结合分子是非抗体蛋白或其片段或其衍生物。
在本文中，“抗原结合结构域”是指与抗原的全部或部分特异性结合并互补的区域。在本文中，抗原结合分子包含抗原结合结构域。当抗原的分子量大时，抗原结合结构域只能结合到抗原的特定部分。该特定部分称为“表位”。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含与特定抗原结合的抗体片段。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域提供。在非限制性实施方案中，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)二者。此类抗原结合结构域的实例包括“单链Fv(scFv)”，“单链抗体”，“Fv”，“单链Fv2(scFv2)”，“Fab”和“Fab’”。在其他实施方案中，抗原结合结构域包含与特定抗原结合的非抗体蛋白，或其片段。在具体的实施方案中，抗原结合结构域包含铰链区。
在本发明中，“特异性结合”是指在一种状态下的结合，在该状态下，参与特异性结合的分子之一不显示与除单个或多个结合伴侣分子以外的分子的任何显著结合。此外，当抗原结合结构域对抗原中包含的多个表位中的特定表位具有特异性时，也可以使用该术语。当由抗原结合结构域结合的表位包含在多个不同的抗原中时，包含该抗原结合结构域的抗原结合分子可以与具有该表位的各个抗原结合。
在本公开中，“结合到相同表位”是指两个抗原结合结构域所结合的表位至少彼此部分重叠。重叠的程度为但不限于至少10％或更多，优选地20％或更多，30％或更多，40％或更多，50％或更多，60％或更多，70％或更多，80％或更多，特别优选地90％或更多，最优选100％。
本文的术语“抗体”以最广义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中出现的变体抗体，这样的变体通常以少量存在)之外，构成该群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其它示例性方法在本文描述。
“天然抗体”指具有变化的结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻链和两条相同的重链组成，所述链通过二硫键结合。从N末端至C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给称为κ和λ的两个类型中的一个。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。抗体主要分为五类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
在本发明的一个实施方案中，恒定区优选地为抗体恒定区，更优选地为IgG1，IgG2，IgG3和IgG4型抗体恒定区，甚至更优选地为人IgG1，IgG2，IgG3和IgG4型抗体恒定区。此外，在本发明的另一个实施方案中，恒定区优选为重链恒定区，更优选为IgG1，IgG2，IgG3和IgG4型重链恒定区，甚至更优选为人IgG1，IgG2，IgG3和IgG4型重链恒定区。人IgG1恒定区，人IgG2恒定区，人IgG3恒定区和人IgG4恒定区的氨基酸序列是已知的。对于人IgG1，人IgG2，人IgG3和人IgG4的恒定区，具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of proteinsof immunological interest)(NIH出版号91-3242)中描述了多个具有遗传多态性的同种异型序列，它们中的任何一个都可用于本发明中。本发明的氨基酸修饰的恒定区可以包含其他氨基酸突变或修饰，只要它们包括本发明的氨基酸突变即可。
术语“铰链区”表示野生型抗体重链中的抗体重链多肽部分，其连接CH1结构域和CH2结构域，例如根据EU编号系统从约位置216至约位置230，或根据Kabat编号系统从约位置226到约位置243。已知在天然IgG抗体中，铰链区中根据EU编号的位置220处的半胱氨酸残基与抗体轻链中位置214处的半胱氨酸残基形成二硫键。还已知在两个抗体重链之间，在铰链区中根据EU编号，在位置226处的半胱氨酸残基和位置229处的半胱氨酸残基之间形成二硫键。通常，“铰链区”定义为从人IgG1的216延伸到238(EU编号)或从226延伸到251(Kabat编号)。该铰链可以进一步分为三个不同的区域，上铰链、中央铰链和下铰链。在人IgG1抗体中，这些区域通常定义如下：
上铰链：216-225(EU编号)或226-238(Kabat编号)，
中央铰链：226-230(EU编号)或239-243(Kabat编号)，
下铰链：231-238(EU编号)或244-251(Kabat编号)。
其他IgG同种型的铰链区可以通过将形成重链间SS键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放在相同位置而与IgG1序列对齐(例如，Brekke等人,1995,Immunol(参见Today 16:85-90的表1)。本文的铰链区包括野生型铰链区以及变体，在所述变体中，野生型铰链区中的氨基酸残基通过置换，添加或缺失而被改变。
术语“在非铰链区的氨基酸之间形成的二硫键”(或“在铰链区外部的氨基酸之间形成的二硫键”)是指通过位于以上定义的“铰链区”外部的任何抗体区域的氨基酸形成、相连(connect)或连接(link)的二硫键。例如，这种二硫键通过抗体中除铰链区以外的任何位置的氨基酸形成、相连或连接(例如，根据EU编号系统，从约位置216至约位置230，或根据Kabat编号系统,从约位置226到约位置243)。在一些实施方案中，此类二硫键通过位于CH1区、CL区、VL区、VH区和/或VHH区中的氨基酸形成、相连或连接。在一些实施方案中，此类二硫键通过位于CH1区中根据EU编号位置119至123、131至140、148至150、155至167、174至178、188至197、201至214的氨基酸形成、相连或连接。在一些实施方案中，此类二硫键通过位于CH1区中根据EU编号位置119,122,123,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,148,150,155,156,157,159,160,161,162,163,164,165,167,174,176,177,178,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,201,203,205,206,207,208,211,212,213,214处的氨基酸形成、相连或连接。在一些实施方案中，此类二硫键通过位于CH1区中根据EU编号位置188,189,190,191,192,193,194,195,196,和197处的氨基酸形成、相连或连接。在一个优选的实施方案中，此类二硫键通过位于CH1区中根据EU编号位置191处的氨基酸形成、相连或连接。
术语“Fc区”在本文中用于定义含有至少部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(残基446-447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)进行的，如在Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。
“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
术语“Fc受体”或“FcR”是指与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，其主要区别在于其胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见，例如，Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR在例如以下的文献中进行了综述：Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来将要被鉴定的那些。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))以及免疫球蛋白稳态的调节。测量与FcRn结合的方法是已知的(参见例如Ghetie和Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如Kindt等人KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman和Co.,第91页(2007).)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库分离。参见，例如,Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中的序列上高度可变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定环的(“高变环”)和/或含有抗原接触残基的(“抗原接触”)每个区域。通常，抗体包含六个HVR：VH中三个(H1,H2,H3)和VL中三个(L1,L2,L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处出现的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处出现的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处出现的抗原接触(MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明，可变结构域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人(见上文)进行编号。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下述顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文可互换地使用，指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用，并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，但可以包含突变。本文中包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文所用的术语”载体”是指能够使与其相连的另一个核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入到已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞生成或来源于利用人抗体库或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR都与人抗体的FR相对应。人源化抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。
“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原相结合。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；单链Fab(scFab)；单结构域抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“接触”是指在溶液中经受、暴露于溶液中。抗体、蛋白质或多肽可以与还原试剂接触，同时也与固体支持物(例如亲和柱或色谱基质)结合。优选地，溶液是缓冲的。为了最大限度地提高具有所需构象的抗体/蛋白质的产量，选择溶液的pH值以保护抗体/蛋白质的稳定性并使其最适合二硫键交换。在本发明的实践中，溶液的pH优选不是强酸性的。因此，一些pH范围大于pH5，优选约pH 6至约pH 11，更优选约pH 7至约pH 10，还更优选约pH 6至约pH 8。在本发明的一个非限制性实施方案中，发现最适pH为约pH 7。然而，本领域技术人员可以通过实验容易地确定本发明特定实施方案的最适pH。
术语“还原试剂”和“还原试剂”可互换使用。在一些实施方案中，所述还原试剂是游离硫醇。还原试剂优选包含选自由谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、2-氨基乙硫醇(2-MEA)、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、二硫代硝基苯甲酸酯、半胱氨酸和Na2SO3组成的组的化合物。在一些实施方案中，可以使用TCEP、2-MEA、DTT、半胱氨酸、GSH或Na2SO3。在一些优选实施方案中，可以使用2-MEA。在一些优选实施方案中，可以使用TCEP。
可以将还原试剂添加到发酵培养基中，其中产生重组蛋白的细胞在该发酵培养基中生长。在另外的实施方案中，还可以在用于分离重组蛋白的LC分离步骤期间将还原试剂添加到LC流动相中。在某些实施方案中，蛋白质被固定在LC柱的固定相上并且还原试剂是流动相的一部分。在具体的实施方案中，未处理的IgG抗体可以作为由峰数指示的异质混合物洗脱。使用还原/氧化偶联剂产生更简单和更均匀的峰模式。预期这种更均匀的目标峰可以作为更同质的IgG制剂分离。
还原试剂以足以增加所需构象(例如，抗体的“配对半胱氨酸”形式，其具有在抗体的两个Fab之间形成的一个或多个工程化二硫键，例如在非铰链区的氨基酸残基之间)的相对比例的浓度存在。还原试剂的最佳绝对浓度和摩尔比取决于总IgG的浓度，并且在某些情况下取决于特定的IgG亚类。当用于制备IgG1分子时，它还取决于蛋白质中未配对半胱氨酸的数量和可及性。通常，来自还原试剂的游离硫醇的浓度可以为约0.05mM至约100mM，更优选约0.1mM至约50mM，还更优选约0.2mM至约20mM。在一些优选的实施方案中，还原试剂的浓度为0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,1,2.5,5,10,25,50,100mM。在一些优选的实施方案中，可以使用0.05mM至1mM的2-MEA。在一些优选的实施方案中，可以使用0.01mM至25mM TCEP。
将重组蛋白的制剂与还原试剂接触足够长的时间以增加所需构象的相对比例。任何相对增加的比例都是合乎需要的，包括例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％和甚至80％或90％的具有不需要构象的蛋白质被转化为具有所需构象的蛋白质。可以通过将还原试剂提供给正在产生蛋白质的发酵培养基来进行接触。或者，接触发生在从产生蛋白质的细胞培养物中部分纯化蛋白质时。在其他实施方案中，在蛋白质已经从色谱柱洗脱之后但在任何进一步处理之前进行接触。基本上，接触可以在抗体的制备、纯化、储存或配制期间的任何阶段进行。在一些实施方案中，可以在接触之前通过亲和层析(例如蛋白A层析)进行部分纯化。
也可以用附着在层析柱的固定相上的抗体进行接触，而还原试剂是流动相的一部分；在这种情况下，接触可以作为层析纯化程序的一部分进行。代表性层析重折叠过程的示例可能包括尺寸排阻(SEC)；蛋白质A柱可逆吸附过程中的溶剂交换；疏水相互作用层析(HIC)；固定化金属亲和层析(IMAC)；反相层析(RPC)；使用固定的折叠催化剂，例如GroE1、GroES或其他具有折叠特性的蛋白质。柱上重折叠很有吸引力，因为它很容易使用市售的制备层析系统实现自动化。最近在(Li等人,2004)中综述了微生物细胞中产生的重组蛋白在柱上的再折叠。
如果接触步骤对重组蛋白的部分或高度纯化的制剂进行，则接触步骤可以进行短至约1小时至约4小时，并且长至约6小时至约4天。已经发现约2至约48小时或约16小时的接触步骤效果很好。接触步骤也可以在另一个步骤中进行，例如在固相上或在过滤或纯化的任何其他步骤中。
本发明的方法可以在宽的温度范围内进行。例如，本发明的方法已在约4摄氏度(“摄氏度”)至约37摄氏度的温度下成功实施，然而在较低温度下获得了最佳结果。用于接触重组蛋白的部分或完全纯化制剂的典型温度为约4摄氏度至约25摄氏度(环境温度)，或优选为23摄氏度，但也可在较低温度和较高温度下进行。
此外，预期该方法可以在高压下进行。以前，高静水压力(1000-2000巴)与低于1M的低非变性盐酸胍浓度已被用于解聚(溶解)和重新折叠由大肠杆菌产生的几种变性蛋白质作为包涵体，其包括人类生长激素和溶菌酶和β-内酰胺酶(St John等人,Proc NatlAcad Sci USA,96:13029-13033(1999))。即使不添加GdmHCl，B-内酰胺酶也能以高产量重新折叠活性蛋白。在另一项研究(Seefeldt等人，Protein Sci,13:2639-2650(2004))中，通过RPHPLC，在2000bas下通过高压调节重折叠获得的哺乳动物细胞产生的蛋白质bikunin的重折叠产率为70％，显著高于用传统的盐酸胍“稀释-重折叠”获得的55％的值(通过RP-HPLC)。这些发现表明，高静水压力有助于破坏分子间和分子内相互作用，导致蛋白质解折叠和解聚。高压对蛋白质的相互作用类似于蛋白质与离液剂的相互作用。因此，预期在本发明的方法中，不使用离液剂，而是使用高压来解折叠蛋白质。当然，在一些情况下也可以使用高压和离液剂的组合。
重组抗体/蛋白质的制备可以酌情与各种体积的还原试剂接触。例如，本发明的方法已经在分析实验室规模(1-50mL)、制备规模(50mL-10L)和制造规模(10L或更多)上成功实施。本发明的方法可以在小规模和大规模上进行，具有可重复性。因此，抗体的浓度可以是工业量(以克为单位的重量)(例如，特定IgG的工业量)或者备选地可以是毫克量。在具体实施方案中，反应混合物中重组抗体的浓度为约1mg/ml至约50mg/ml，更具体地，10mg/ml、15mg/ml或20mg/ml。特别考虑了这些浓度的重组IgG1分子。
在某些实施方案中，使用含有还原试剂的培养基产生的蛋白质在使用离液变性剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素或盐酸胍(GuHCl)的单独加工步骤中被进一步加工。需要大量的离液剂来观察可感知的接折叠。在一些实施方案中，加工步骤使用0.1M至2M离液剂，其产生与使用0.1M至2M盐酸胍等效的效果。在具体实施方案中，在大约1.0M盐酸胍或产生与1M盐酸胍相同或相似的重折叠量的其他离液剂量的存在下实现氧化重折叠。在一些实施方案中，该方法使用约1.5M至0.5M的离液剂。使用的离液剂的量基于在所述离液剂存在下蛋白质的结构稳定性。人们需要存在足够的离液剂来扰乱蛋白质的结构域相互作用的局部三级结构和/或四级结构，但少于完全解折叠分子和/或单个结构域的二级结构所需的量。为了确定蛋白质将通过平衡变性开始解折叠的点，本领域技术人员将离液剂滴定到含有蛋白质的溶液中并通过诸如圆二色性或荧光的技术监测结构。还有其他参数可用于解折叠或稍微扰乱可用于代替离液剂的蛋白质的结构。温度和压力是先前用于改变蛋白质结构的两个基本参数，并且可以用于在与氧化还原试剂接触时代替离液剂。发明人考虑到，本领域技术人员可以使用已显示使蛋白质结构变性或扰动的任何参数来代替离液剂。
二硫化物交换可以以本领域技术人员已知的任何方式淬灭。例如，可以通过纯化步骤去除还原试剂或降低其浓度，和/或通过例如酸化溶液使其化学灭活。通常，当反应通过酸化淬灭时，含有还原试剂的溶液的pH值将降低至低于pH 7。在一些实施方案中，将pH降低至低于pH 6。通常，pH降低至约pH 2和约pH 6之间。
在一些实施方案中，可以通过透析、缓冲液交换或本文所述的任何层析法进行去除还原试剂。
术语“优先富集(或增加)”是指增加所需形式的相对丰度，或增加所需形式的相对比例，或增加所需形式(结构同种型)的总数。在一些实施方案中，本文所述的方法增加抗体结构同种型(例如，具有在铰链区外部氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键的抗体)的相对丰度。在一个实施方案中，在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的各自CH1区中根据EU编号位置191处的氨基酸残基之间形成所述至少一个二硫键。在某些实施方案中，所述方法产生具有至少50％、60％、70％、80％、90％、优选至少95％摩尔比的所述抗体的同质抗体制剂，其中所述抗体具有在铰链区外部形成的至少一个二硫键。
抗体的“同质”群体是指主要包含单一形式的抗体的抗体群体，例如,溶液或组合物中至少50％,60％,70％,80％或更多，优选至少90％,95％,96％,97％,99％或100％的抗体处于适当折叠的形式。类似地，具有在铰链区外形成的至少一个二硫键的抗体的“同质”群体是指主要包含单一的、适当折叠的形式的所述抗体群体，例如至少50％、60％、70％、80％或更多，优选至少90％,95％,96％,97％,99％或100％摩尔比的具有在铰链区外部形成的至少一个二硫键的所述抗体。在一个优选实施方案中，所述抗体的“同质”群体包含在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的各自CH1区中根据EU编号位置191处的氨基酸残基(即，在CH1区中根据EU编号位置191处的“配对半胱氨酸”)之间形成的至少一个二硫键。
在优选的实施方案中，本发明的方法通过本文所述的步骤产生同质抗体群或同质抗体制剂。
可以使用多种分析和/或定性技术中的任何一种来确定抗体群是否是同质的，以及混合物中蛋白质/抗体构象的相对丰度或比例。如果在诸如色谱、电泳、过滤或其他纯化技术等的分离技术中两种构象解析不同，则可以使用这种纯化技术确定混合物中构象的相对比例。例如，重组IgG的至少两种不同构象可以通过疏水相互作用层析分离。此外，由于远紫外圆二色性已被用于估计蛋白质的二级结构组成(Perczel等人，1 991,ProteinEngrg.4:669-679)，因此这种技术可以确定是否存在蛋白质的替代构象。用于确定构象的另一种技术是荧光光谱法，它可用于确定可归属于色氨酸和酪氨酸荧光的三级结构中的互补差异。可用于确定构象差异以及因此确定构象相对比例的其他技术是在线SEC以测量聚集状态，差示扫描量热法以测量熔化转变(Tm)和组分焓，以及离液剂解折叠。另一种可用于确定构象差异并因此确定构象相对比例的技术是LC/MS检测以确定蛋白质的异质性。
或者，如果抗体/蛋白质的构象之间存在活性差异，则可以通过活性测定的方式(例如，与配体结合、酶活性、生物活性等)来确定混合物中构象的相对比例。也可以使用蛋白质的生物学活性。或者，可以使用结合测定，其中活性表示为活性单位/mg蛋白质。
在下文详细描述的一些实施方案中，本发明使用IEC色谱法来确定抗体/蛋白质的异质性。在这种情况下，抗体被纯化或被认为是“同质的”，这意味着在通过IEC色谱分析时没有检测到对应于其他多肽的多肽峰或级分。在某些实施方案中，抗体被纯化或被认为是“同质的”，使得在通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析时没有可检测到对应于其他多肽的多肽条带。相关领域的技术人员将认识到，由于不同的糖基化、不同的翻译后加工等，对应于多肽的多个条带可以通过SDS-PAGE显现。最优选地，本发明的多肽被纯化至基本同质，如通过SDS-PAGE分析后的单个多肽条带所表明的。多肽条带可以通过银染、考马斯蓝染色和/或(如果多肽是放射性标记的)通过放射自显影来显现。
在此，SDS-PAGE分析条件的示例如下。不含2-巯基乙醇的样品缓冲溶液(x4)可用于制备电泳样品。样品可在标本浓度50或100微克/mL、70℃条件下处理10分钟，然后进行非还原性SDS-PAGE。在非还原性SDS-PAGE中，可以使用4％SDS-PAGE凝胶在125V下进行90分钟的电泳。然后，凝胶可以用CBB染色，并且可以捕获凝胶图像，并且可以使用成像装置对条带进行量化。在凝胶图像中，对于抗体变体样品，可以观察到若干条带，例如两条条带，即“上条带”和“下条带”。在这种情况下，上条带的分子量可以对应于亲本抗体(修饰前)的分子量。结构变化诸如通过Fab二硫键的交联可能是由半胱氨酸置换引起的，这可能导致电泳迁移率的变化。在这种情况下，可以认为下条带对应于具有在CH1区之间形成的一个或多个工程化二硫键的抗体。与对照样品相比，具有额外半胱氨酸置换的抗体变体样品可能显示出更高的下条带与上条带比率。额外的半胱氨酸置换可以增强/促进Fab的二硫键交联；并且可以增加具有在突变位置形成的工程化二硫键的抗体制剂的百分比或结构同质性；并且可以降低在突变位置没有形成工程化二硫键的抗体制剂的百分比。本文中，术语“下条带与上条带比率”是指在上述SDS-PAGE实验期间可以量化的下条带和上条带的数量/强度之间的比率。
可变片段(Fv)
在此，术语“可变片段(Fv)”是指由一对抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)构成的抗体来源的抗原结合结构域的最小单位。1988年，Skerra和Pluckthun发现，通过在细菌信号序列的下游插入抗体基因并在大肠杆菌中诱导该基因的表达，可以从大肠杆菌周质级分制备均质且具有活性的抗体(Science(1988)240(4855),1038-1041)。在由周质级分制备的Fv中，VH以便于与抗原结合的方式与VL缔合。
scFv，单链抗体和sc(Fv)2
在本文中，术语“scFv”，“单链抗体”和“sc(Fv)2”均指包含衍生自重链和轻链的可变区而不是恒定区的单多肽链的抗体片段。通常，单链抗体还在VH和VL结构域之间包含多肽接头，从而能够形成所需的结构，该结构被认为允许抗原结合。Pluckthun在“ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore,eds.,Springer-Verlag,New York,269-315(1994)”中详细讨论了单链抗体。还可参见国际专利公开WO1988/001649；美国专利号4,946,778和5,260,203。在特定的实施方案中，单链抗体可以是双特异性的和/或人源化的。
scFv是抗原结合结构域，其中形成Fv的VH和VL通过肽接头连接在一起(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85(16),5879-5883)。VH和VL可以通过肽接头保持在接近的位置处。
sc(Fv)2是单链抗体，其中两个VL和两个VH的四个可变区通过接头(例如肽接头)连接以形成单链(J Immunol.Methods(1999)231(1-2),177-189)。两个VH和两个VL可以源自不同的单克隆抗体。此类sc(Fv)2优选包括例如识别单抗原中存在的两个表位的双特异性sc(Fv)2，如Journal of Immunology(1994)152(11),5368-5374中所公开的。sc(Fv)2可以通过本领域技术人员已知的方法来制备。例如，sc(Fv)2可以通过经由接头例如肽接头连接scFv来制备。
在本文中，形成sc(Fv)2的抗原结合结构域的形式包括这样的抗体，其中两个VH单元和两个VL单元以VH，VL，VH和VL([VH]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VL])的顺序从单链多肽的N末端开始进行排列。两个VH单元和两个VL单元的顺序不限于上述形式，并且它们可以以任何顺序排列。形式的示例顺序如下所列。
[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]
[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]
[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]
[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]
[VL]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VH]
Fab，F(ab’)2和Fab’
“Fab”由单条轻链以及来自单条重链的CH1区和可变区组成。野生型Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。在本文中，除了野生型Fab分子之外，还包括Fab变体，其中野生型Fab分子中的氨基酸残基通过置换，添加或缺失而改变。在具体的实施方案中，Fab变体中包含的突变的氨基酸残基(例如，在置换，添加或插入后的半胱氨酸残基或赖氨酸残基)可与另一个重链分子或其部分(例如Fab分子)形成二硫键。
scFab是抗原结合结构域，其中单个轻链以及形成Fab的来自单个重链的CH1区和可变区通过肽接头连接在一起。轻链以及来自重链的CH1区和可变区可以通过肽接头保持紧密相邻。
“F(ab’)2”或“Fab”是通过用诸如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的蛋白酶处理免疫球蛋白(单克隆抗体)而产生的，并且是指通过在两条H链各自的铰链区之间存在的二硫键附近消化免疫球蛋白(单克隆抗体)而产生的抗体片段。例如，木瓜蛋白酶在两条H链各自的铰链区之间存在的二硫键上游切割IgG，以产生两个同源抗体片段，其中包含VL(L链可变区)和CL(L链恒定区)的L链通过在其C端区域的二硫键连接到包含VH(H链可变区)和CHγ1(H链恒定区的γ1区)的H链片段。这两个同源抗体片段中的每一个都称为Fab'。
“F(ab’)2”由两条轻链和两条重链组成，所述两条轻链和两条重链包括CH1结构域的恒定区和一部分CH2结构域，从而在两条重链之间形成二硫键。本文公开的F(ab′)2可优选如下制备。用诸如胃蛋白酶的蛋白酶部分消化包含所需抗原结合结构域的完整单克隆抗体等；并且Fc片段通过吸附到蛋白A柱上而被去除。蛋白酶没有特别限制，只要它能够在适当的设定酶反应条件下(例如pH)以选择性的方式切割整个抗体以产生F(ab′)2即可。这样的蛋白酶包括例如胃蛋白酶和无花果蛋白酶。
单域抗体
在本文中，术语“单域抗体”所指的那些在其结构上不受特别限制，只要该结构域可以自身发挥抗原结合活性即可。以IgG抗体为例的普通抗体在通过VH和VL的配对形成可变区的状态下发挥抗原结合活性。相反，已知单域抗体能够通过其自身的结构域结构单独发挥抗原结合活性，而无需与另一个结构域配对。单域抗体通常具有相对较低的分子量，并以单体形式存在。
单域抗体的实例包括但不限于天然缺乏轻链的抗原结合分子，例如骆驼科动物的VHH和鲨鱼的VNAR，以及包含全部或部分抗体VH结构域或全部或部分抗体VL结构域的抗体片段。作为包含全部或部分抗体VH/VL结构域的抗体片段的单域抗体的实例包括但不限于如上所述的源自人抗体VH或人抗体VL的人工制备的单域抗体，如例如在美国专利号6,248,516 B1中所述。在本发明的一些实施方案中，一个单域抗体具有三个CDR(CDR1，CDR2和CDR3)。
单域抗体可以从能够产生单域抗体的动物获得或通过免疫能够产生单域抗体的动物来获得。能够产生单域抗体的动物的实例包括但不限于骆驼科动物和转基因动物，其中已向所述动物中引入了具有产生单域抗体的能力的基因。骆驼科动物包括骆驼，美洲驼，羊驼，单峰驼，原驼等。已经引入了具有产生单域抗体的能力的基因的转基因动物的实例包括但不限于国际公开号WO2015/143414或美国专利公开号US2011/0123527 A1中所述的转基因动物。人源化的单链抗体也可以通过用人种系序列或与其相似的序列替换从动物获得的单域抗体的框架序列来获得。人源化单域抗体(例如，人源化VHH)是本发明的单域抗体的一个实施方案。
或者，可以通过ELISA，淘选等从含有单域抗体的多肽文库获得单域抗体。包含单域抗体的多肽文库的例子包括但不限于从各种动物或人类获得的天然抗体文库(例如，Methods in Molecular Biology 2012 911(65-78)和Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 2006 1764:8(1307-1319))，通过免疫各种动物获得的抗体文库(例如Journal of Applied Microbiology 2014 117:2(528-536))和从各种动物或人的抗体基因制备的合成抗体文库(例如Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1(35-43),Journal of Biological Chemistry 2016 291:24(12641-12657),和AIDS 201630:11(1691-1701))。
“结合活性”是指分子(例如抗体)的一个或多个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。在此，结合活性不严格限于结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。例如，当结合对的成员反映单价1:1相互作用时，结合活性是指固有结合亲和力(亲和力)。当结合对的一个成员能够单价结合和多价结合时，结合活性是每个结合强度的总和。分子X对其伴侣Y的结合活性通常可以用解离常数(KD)或“每单位量的配体结合的分析物的量”来表示。结合活性可以通过本领域已知的常规方法，包括本文所述的那些方法来测量。
如本文所用，“激动剂”抗原结合分子或“激动剂”抗体是显著增强其所结合的抗原的生物学活性的抗原结合分子或抗体。
如本文所用，“阻断”抗原结合分子或“阻断”抗体或“拮抗剂”抗原结合分子或“拮抗剂”抗体是显著抑制(部分或完全)其所结合的抗原的生物学活性的抗原结合分子或抗体。
本文所用的短语“实质上减少”或“实质上不同”是指两个数值之间的差异程度足够高(通常一个数值与分子关联，另一个数值与参考/比较分子关联)，使得本领域技术人员将认为在由所述值(例如，KD值)测量的生物学特征的背景下，两个值之间的差异具有统计学显著性。
如本文所用，术语“实质上相似”或“实质上相同”是指两个数值之间足够高的相似度(例如，一个数值与本发明的抗体相关联，另一个数值与参考/比较抗体相关联)，以便本领域技术人员会认为在由所述值(例如，KD值)测量的生物学特征的背景下，两个值之间的差异有很小或没有生物学和/或统计学显著性。
术语“药物制剂”和“药物组合物”指这样的制剂，其形式为允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效，并且不包含对待施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂或防腐剂。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)、兔以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
II.抗原结合分子
一方面，本公开部分基于以下发现：相比于不含有连接或通过较少键连接的抗原结合结构域的对照抗原结合分子，包含其中抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的抗原结合分子的各种活性增强或减少。在某些实施方案中，提供了具有将两个或更多个抗原分子保持在空间上接近的位置处的活性的抗原结合分子。本公开的抗原结合分子是有用的，例如，因为它能够调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的激活。在某些其他实施方案中，提供了通过抗原结合结构域之间的连接而获得对蛋白酶消化的抗性的抗原结合分子。
A.示例性抗原结合分子
<抗原结合分子的结构>
一方面，本公开提供了包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的抗原结合分子，并且所述抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
在上述方面的实施方案中，连接两个抗原结合结构域的一个或多个键中的至少一个是共价键。在某些实施方案中，所述共价键是通过第一抗原结合结构域中的氨基酸残基与第二抗原结合结构域中的氨基酸残基的直接交联而形成的。交联的氨基酸残基为例如半胱氨酸，并且形成的共价键为例如二硫键。
在某些其他实施方案中，所述共价键是通过第一抗原结合结构域中的氨基酸残基与第二抗原结合结构域中的氨基酸残基经由交联剂交联而形成的。交联剂是例如胺反应性交联剂，并且交联的氨基酸残基是例如赖氨酸。
在以上方面的一个实施方案中，连接抗原结合结构域的一个或多个键中的至少一个是非共价键。在某些实施方案中，非共价键是离子键、氢键或疏水键。离子键例如在酸性氨基酸和碱性氨基酸之间形成。酸性氨基酸是例如天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)。碱性氨基酸是例如组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)。
抗原结合结构域之间的键(连接两个抗原结合结构域的键)所起源的氨基酸残基分别存在于第一和第二抗原结合结构域中，并且抗原结合结构域之间的键是通过连接这些氨基酸残基形成的。在上述方面的一个实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个是人工引入的突变氨基酸残基，并且例如是人工引入的半胱氨酸残基。可以通过例如氨基酸置换的方法将这样的突变氨基酸残基引入野生型抗原结合结构域。本说明书公开了当抗原结合结构域包含例如抗体片段时，对于作为恒定区的CH1，CL和铰链区以及作为可变区的VH，VL和VHH区中的每一个，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基的位点，并且例如可以将半胱氨酸残基引入这样的位点。
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域中的至少一个自身具有与抗原结合的活性(即，单个抗原结合结构域独立地具有抗原结合活性)。在某些实施方案中，第一和第二抗原结合结构域中的每一个本身具有结合抗原的活性。
在上述方面的实施方案中，所述第一和第二抗原结合结构域均为相同类型的抗原结合结构域。如下所述，构成抗原结合结构域的蛋白质的实例包括衍生自抗体或非抗体蛋白质的多肽及其片段(例如，Fab，Fab'，scFab，Fv，scFv和单域抗体)。从这种分子形式的观点来看，当构成第一和第二抗原结合结构域的蛋白质的结构相同时，确定抗原结合结构域为相同类型。
在上述方面的实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键可以通过将存在于第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中相同位置的氨基酸残基彼此连接而形成，或者可以通过将分别位于不同位置的氨基酸残基彼此连接而形成。
抗原结合结构域中氨基酸残基的位置可以根据Kabat编号或EU编号系统(也称为EU索引)来显示，该编号系统描述于Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。例如，如果第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于抗原结合结构域中对应的相同位置，则根据Kabat编号或EU编号系统，这些氨基酸残基的位置可以表示为相同的编号。或者，如果第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于抗原结合结构域中不对应的不同位置，则根据Kabat编号或EU编号系统，这些氨基酸残基的位置可以表示为不同的数字。
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域中的至少一个包含与特异性抗原结合的抗体片段。在某些实施方案中，抗体片段是Fab，Fab'，scFab，Fv，scFv或单域抗体。在某些实施方案中，抗原结合结构域之间的键所源自的至少一个氨基酸残基存在于所述抗体片段内。
在上述方面的实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个存在于恒定区内。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于CH1区内，例如，其存在于CH1区内根据EU编号位置119至123、131至140、148至150、155至167、174至178、188至197、201至214，以及218至219的任何位置处。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于CH1区中选自由以下各项组成的组的位置：根据EU编号位置119,122,123,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,148,150,155,156,157,159,160,161,162,163,164,165,167,174,176,177,178,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,201,203,205,206,207,208,211,212,213,214,218和219。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于CH1区内根据EU编号位置134,135,136,137,191,192,193,194,195或196处。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于CH1区内根据EU编号位置135,136或191处。
在上述方面的实施方案中，恒定区衍生自人。在某些实施方案中，重链恒定区的亚类是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgM，IgD和IgE中的任何一个。在某些实施方案中，CH1区的亚类是γ1,γ2,γ3,γ4,α1,α2,μ,δ和ε中的任何一个。
在上述方面的实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过将所述第一抗原结合结构域的CH1区内的氨基酸残基和所述第二抗原结合结构域的CH1区内的氨基酸残基连接而形成的。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号，位置119、120、121、122和123。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号，位置131,132,133,134,135,136,137,138,139和140。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号，位置148,149和150。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号，位置155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166和167。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号，位置174、175、176、177和178。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号，位置188,189,190,191,192,193,194,195,196和197。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号，位置201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213和214。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据EU编号，位置218和219。
在上述方面的实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的每一个中，键所起源的氨基酸残基的位置差异是三个氨基酸或更少。这意味着，当在第一抗原结合结构域的CH1区内键所起源的氨基酸残基的位置和在第二抗原结合结构域的CH1区内键所起源的氨基酸残基的位置分别根据EU编号进行比较时，差异(即，距离)是三个氨基酸或更少。在某些实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置135处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置132至138中的任何一个位置处的氨基酸残基连接而形成的。在某些实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置136处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置133至139中的任何一个位置处的氨基酸残基连接而形成的。
在某些实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置191处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置188至194中的任何一个位置处的氨基酸残基连接而形成的。在示例性实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过将两个抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置135处的氨基酸残基彼此连接而形成的。在示例性实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过将两个抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置136处的氨基酸残基彼此连接而形成的。在示例性实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过将两个抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置191处的氨基酸残基彼此连接而形成的。
在上述方面的实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个存在于CL区内，例如，存在于CL区内根据Kabat编号位置108至112、121至128、151至156、184至190、195至196、200至203以及208至213的任何位置处。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于CL区中选自由以下各项组成的组的位置：根据Kabat编号位置108,109,112,121,123,126,128,151,152,153,156,184,186,188,189,190,195,196,200,201,202,203,208,210,211,212和213。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于CL区内根据Kabat编号位置126处。
在上述方面的实施方案中，恒定区衍生自人。在某些实施方案中，CL区的亚类是κ或λ。
在上述方面的实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过将所述第一抗原结合结构域的CL区内的氨基酸残基和所述第二抗原结合结构域的CL区内的氨基酸残基连接而形成的。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号，位置108、109、110、111和112。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号，位置121,122,123,124,125,126,127和128。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号，位置151,152,153,154,155和156。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号，位置184,185,186,187,188,189和190。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号，位置195和196。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号，位置200,201,202和203。在某些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中的氨基酸残基各自独立地选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号，位置208,209,210,211,212和213。
在上述方面的实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的每一个中，键所起源的氨基酸残基的位置差异(即，距离)是三个氨基酸或更少。这意味着，当在第一抗原结合结构域的CL区内键所起源的氨基酸残基的位置和在第二抗原结合结构域的CL区内键所起源的氨基酸残基的位置分别根据EU编号进行比较时，差异(即，距离)是三个氨基酸或更少。在示例性实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过将两个抗原结合结构域的CL区中根据Kabat编号在位置126处的氨基酸残基彼此连接而形成的。
在上述方面的实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过将所述第一抗原结合结构域的CH1区内的氨基酸残基和所述第二抗原结合结构域的CL区内的氨基酸残基连接而形成的。在某些实施方案中，第一抗原结合结构域的CH1区内的氨基酸残基选自由以下各项组成的组：根据EU编号的位置188,189,190,191,192,193,194,195,196和197，并且第二抗原结合结构域的CL区内的氨基酸残基选自由以下各项组成的组：根据Kabat编号的位置121,122,123,124,125,126,127和128。在示例性实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过将第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号在位置191处的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CL区中根据Kabat编号在位置126处的氨基酸残基连接而形成的。
在上述方面的实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个存在于可变区内。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于VH区内，例如，其存在于VH区内选自由以下各项组成的组的位置：根据Kabat编号位置6、8、16、20、25、26、28、74和82b。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于VL区内，并且例如，其存在于选自由以下各项组成的组的位置：VL区内根据Kabat编号的位置21、27、58、77、100、105和107(κ亚类)，以及VL区内根据Kabat编号的位置6、19、33和34(λ亚类)。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于VHH区内，例如，其存在于VHH区内选自由以下各项组成的组的位置：根据Kabat编号位置4,6,7,8,9,10,11,12,14,15,17,20,24,27,29,38,39,40,41,43,44,45,46,47,48,49,67,69,71,78,80,82,82c,85,88,91,93,94和107。
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域中的至少一个包含与特定抗原结合的非抗体蛋白，或其片段。在某些实施方案中，所述非抗体蛋白是一对彼此特异性结合的配体和受体中的任一个。这样的受体包括例如属于细胞因子受体超家族的受体，G蛋白偶联受体，离子通道受体，酪氨酸激酶受体，免疫检查点受体，抗原受体，CD抗原，共刺激分子和细胞粘附分子。
在上述方面的实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含铰链区。在某些实施方案中，存在于野生型铰链区中的至少一个半胱氨酸残基被置换为另一个氨基酸残基。这种半胱氨酸残基存在于例如野生型铰链区中根据EU编号的位置226和/或229处。在某些实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个存在于铰链区内，并且例如存在于铰链区内选自由以下各项组成的组的位置：根据EU编号位置216、218和219。
在上述方面的实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域通过两个或更多个键彼此连接。
在某些实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个是存在于野生型序列中的氨基酸残基，例如，是野生型铰链区中的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，连接第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的至少一个键是通过存在于野生型铰链区中的半胱氨酸残基彼此交联而形成的二硫键。这种半胱氨酸残基存在于例如野生型铰链区的根据EU编号的位置226和/或229处。
在某些实施方案中，抗原结合结构域之间的键所源自的至少一个氨基酸残基存在于抗体片段内，并且至少一个氨基酸残基存在于铰链区内。在示例性实施方案中，本公开的抗原结合分子是F(ab’)2，其中第一和第二抗原结合结构域均包含Fab和铰链区。
在上述方面的实施方案中，本公开的抗原结合分子还包含Fc区，并且例如，它是全长抗体。在某些实施方案中，将促进Fc区多聚化的一个或多个氨基酸突变引入本公开的抗原结合分子的Fc区中。这样的氨基酸突变包括，例如在选自由以下各项组成的组的至少一个位置处的氨基酸突变：根据EU编号，位置247,248,253,254,310,311,338,345,356,359,382,385,386,430,433,434,436,437,438,439,440和447(参见例如WO2016/164480)。在某些实施方案中，多聚化是六聚化。
<抗原结合分子结合的抗原>
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域二者都结合相同的抗原。在某些实施方案中，第一和第二抗原结合结构域二者都结合相同抗原上的相同表位。在某些其他实施方案中，第一和第二抗原结合结构域中的每一个结合相同抗原上的不同表位。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子是靶向一种特异性抗原的双互补位抗原结合分子(例如，双互补位抗体)。
在上述方面的另一个实施方案中，第一和第二抗原结合结构域各自结合不同的抗原。
在上述方面的另一个实施方案中，本公开的抗原结合分子是钳位抗原结合分子(例如，钳位抗体)。在本说明书中，钳位抗原结合分子是指与抗原/抗原结合分子复合物特异性结合的抗原结合分子，其中，所述复合物是在给定抗原A和与抗原A结合的抗原结合分子之间形成的，并且所述钳位抗原结合分子增加与抗原A结合的抗原结合分子对抗原A的结合活性(或者，稳定由抗原A和与抗原A结合的抗原结合分子形成的抗原/抗原结合分子复合物)。例如，CD3钳位抗体特异性结合抗原-抗体复合物，所述复合物是在CD3和对CD3的结合能力降低的抗体(结合减弱的CD3抗体)之间形成的复合物，从而能够增加结合减弱的CD3抗体对CD3的结合活性(或者，稳定由CD3和结合减弱的CD3抗体形成的抗原-抗体复合物)。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子中的第一和/或第二抗原结合结构域可以是来自钳位抗原结合分子的抗原结合结构域(钳位抗原结合结构域)。
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域二者均具有相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，第一和第二抗原结合结构域各自具有不同的氨基酸序列。
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域所结合的两个抗原中的至少一个是可溶性蛋白或膜蛋白。
<抗原结合分子的功能>
在上述方面的实施方案中，本公开的抗原结合分子具有将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的活性。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将两个抗原分子保持在比对照抗原结合分子更近的位置，并且对照抗原结合分子与本公开的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
在上述方面的另一个实施方案中，本公开的抗原结合分子具有调节两个抗原分子之间的相互作用的活性。不受特定理论的束缚，认为调节相互作用的活性是由于通过本公开的抗原结合分子将两个抗原分子保持在空间上更近的位置而引起的。在某些实施方案中，与对照抗原结合分子相比，本公开的抗原结合分子能够增强或减少两个抗原分子之间的相互作用，并且对照抗原结合分子与本公开的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
在某些实施方案中，被本发明的抗原结合分子结合的两个抗原分子分别是配体和其受体，并且本发明的抗原结合分子具有促进配体激活受体的活性。在某些其他实施方案中，被本公开的抗原结合分子结合的两个抗原分子分别是酶和其底物，并且本公开的抗原结合分子具有促进酶与底物的催化反应的活性。
此外，在某些其他实施方案中，被本公开的抗原结合分子结合的两个抗原分子都是存在于细胞表面上的抗原(例如蛋白质)，并且本公开的抗原结合分子具有促进表达第一抗原的细胞与表达第二抗原的细胞之间的相互作用的活性。例如，表达第一抗原的细胞和表达第二抗原的细胞分别是具有细胞毒性活性的细胞和其靶细胞，并且本公开的抗原结合分子促进具有细胞毒性活性的细胞对靶细胞的损伤。具有细胞毒性活性的细胞是例如T细胞，NK细胞，单核细胞或巨噬细胞。
在上述方面的实施方案中，本公开的抗原结合分子具有调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的激活的活性。不受特定理论的束缚，认为调节激活的活性是由于通过本公开的抗原结合分子将两个抗原分子保持在空间上更近的位置而引起的。在某些实施方案中，与对照抗原结合分子相比，本公开的抗原结合分子能够增强或减少两个抗原分子之间的激活，并且对照抗原结合分子与本公开的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。例如，这种抗原分子选自由以下各项组成的组：属于细胞因子受体超家族的受体，G蛋白偶联受体，离子通道受体，酪氨酸激酶受体，免疫检查点受体，抗原受体，CD抗原，共刺激分子和细胞粘附分子。
在上述方面的实施方案中，在本公开的抗原结合分子中，两个抗原结合结构域存在于空间上接近的位置和/或两个抗原结合结构域的迁移率降低。在某些实施方案中，与对照抗原结合分子相比，本公开的抗原结合分子具有存在于较近位置的两个抗原结合结构域和/或所述两个抗原结合结构域的迁移率进一步降低；并且，对照抗原结合分子与本公开的抗原结合分子的不同之处仅在于它在两个抗原结合结构域之间少一个键。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
在上述方面的实施方案中，本公开的抗原结合分子具有对蛋白酶切割的抗性。在某些实施方案中，与对照抗原结合分子相比，本公开的抗原结合分子具有增加的对蛋白酶切割的抗性，并且对照抗原结合分子与本公开的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。在某些实施方案中，在本公开的抗原结合分子中，与对照抗原结合分子相比，蛋白酶处理后剩余的全长分子(例如，全长IgG分子)的比例增加。在某些实施方案中，在本公开的抗原结合分子中，与对照抗原结合分子相比，蛋白酶处理后产生的特定片段(例如，Fab单体)的比例降低。
在上述方面的实施方案中，当本发明的抗原结合分子用蛋白酶处理时，抗原结合结构域或其片段的二聚体(例如，交联的Fab二聚体)被切除。在某些实施方案中，当对照抗原结合分子(其与本公开的抗原结合分子的不同之处仅在于它在两个抗原结合结构域之间少一个键)用蛋白酶处理时，抗原结合结构域或其片段的单体被切除。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。在这些实施方案中，蛋白酶可以切割抗原结合分子的铰链区。
在进一步的实施方案中，对照抗原结合分子与本公开的抗原结合分子的不同之处仅在于它在两个抗原结合结构域之间少一个键，并且少的一个键是由源自突变的氨基酸残基形成的键。突变的氨基酸残基是例如人工引入的半胱氨酸残基。
<药物组合物>
一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本公开的抗原结合分子和药学上可接受的载体。
<抗原结合分子的用途>
一方面，本公开提供了用于将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的方法，包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，
(b)向所述抗原结合分子添加至少一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键，和
(c)使(b)中产生的所述抗原结合分子与所述两个抗原分子接触。在某些实施方案中，以上(a)中所述的抗原结合分子中的两个抗原结合结构域可以通过一个或多个键彼此连接，并且在这种情况下，一个或多个键中的一些或全部是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中存在的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的所述至少一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。本公开还提供了将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的方法，该方法包括使两个抗原分子与本公开的抗原结合分子或药物组合物接触。本公开进一步提供了本公开的抗原结合分子或药物组合物，其用于将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处。
另一方面，本发明提供了用于调节两个抗原分子之间相互作用的方法，包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，
(b)向所述抗原结合分子添加至少一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键，和
(c)使(b)中产生的所述抗原结合分子与所述两个抗原分子接触。在某些实施方案中，以上(a)中所述的抗原结合分子中的两个抗原结合结构域可以通过一个或多个键彼此连接，并且在这种情况下，一个或多个键中的一些或全部是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中存在的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的所述至少一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。本公开还提供了用于调节两个抗原分子之间的相互作用的方法，该方法包括使两个抗原分子与本公开的抗原结合分子或药物组合物接触。本公开进一步提供了本公开的抗原结合分子或药物组合物，其用于调节两个抗原分子之间的相互作用。
此外，在另一方面，本公开提供了用于调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的活性的方法，所述方法包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，
(b)向所述抗原结合分子添加至少一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键，和
(c)使(b)中产生的所述抗原结合分子与所述两个抗原分子接触。在某些实施方案中，以上(a)中所述的抗原结合分子中的两个抗原结合结构域可以通过一个或多个键彼此连接，并且在这种情况下，一个或多个键中的一些或全部是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中存在的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的所述至少一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。本公开还提供了用于调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的活性的方法，该方法包括使两个抗原分子与本公开的抗原结合分子或药物组合物接触。本公开进一步提供了本公开的抗原结合分子或药物组合物，其用于调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的活性。
此外，在另一方面，本公开提供了用于将两个抗原结合结构域放置在空间上接近的位置处和/或降低所述两个抗原结合结构域的迁移率的方法，包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，和
(b)向所述抗原结合分子添加至少一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键。在某些实施方案中，以上(a)中所述的抗原结合分子中的两个抗原结合结构域可以通过一个或多个键彼此连接，并且在这种情况下，一个或多个键中的一些或全部是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中存在的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的所述至少一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
此外，在另一方面，本公开提供了用于增加抗原结合分子对蛋白酶切割的抗性的方法，包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，和
(b)向所述抗原结合分子添加至少一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键。在某些实施方案中，以上(a)中所述的抗原结合分子中的两个抗原结合结构域可以通过一个或多个键彼此连接，并且在这种情况下，一个或多个键中的一些或全部是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中存在的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的所述至少一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
在这些各种方法中使用的抗原结合分子可以具有本文所述的抗原结合分子的特征。
<制备抗原结合分子的方法>
一方面，本公开提供了用于制备抗原结合分子的方法，该抗原结合分子具有将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的活性，所述方法包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加至少一个连接所述两个抗原结合结构域的键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接；并且优选还包含使抗体制剂与还原试剂接触的步骤。
在某些实施方案中，所述与还原试剂的接触(“所述接触步骤”)优先富集或增加具有在非铰链区的氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键的抗体结构同种型的群体。在某些实施方案中，所述方法产生具有至少50％、60％、70％、80％、90％、优选至少95％摩尔比的所述抗体的同质抗体制剂，其中所述抗体具有在非铰链区的氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键。
在某些实施方案中，与抗体接触的所述还原试剂的pH为约3至约10。在某些实施方案中，与抗体接触的所述还原试剂的pH为约6、7或8。在一些实施方案中，与抗体接触的所述还原试剂的pH为约7或约3。
在某些实施方案中，所述还原试剂选自由TCEP、2-MEA、DTT、半胱氨酸、GSH和Na2SO3组成的组。在一些优选的实施方案中，还原试剂是TCEP。在某些实施方案中，还原试剂的浓度为约0.01mM至约100mM。
在一些优选的实施方案中，还原试剂的浓度为约0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,1,2.5,5,10,25,50,100mM，优选约0.01mM至25mM。在一个优选的实施方案中，还原试剂为0.01mM至25mM的TCEP。
在某些实施方案中，与还原试剂的接触步骤进行至少30分钟。在某些实施方案中，接触步骤进行约2至约48小时。在一些优选实施方案中，接触步骤进行约2小时或约16小时。
在某些实施方案中，接触步骤在约20摄氏度至37摄氏度优选23摄氏度、25摄氏度或37摄氏度，更优选23摄氏度的温度下进行。在某些实施方案中，在所述接触之前，所述抗体通过亲和层析(优选蛋白A层析)部分纯化。在某些实施方案中，抗体的浓度为约1mg/ml至约50mg/ml。在一些优选的实施方案中，抗体的浓度为约1mg/ml或约20mg/ml。
在某些实施方案中，所述接触步骤优先富集或增加具有在非铰链区的氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键的抗体结构同种型的群体。在某些实施方案中，所述接触步骤产生具有至少50％、60％、70％、80％、90％、优选至少95％摩尔比的所述抗体的同质抗体制剂，其中所述抗体具有在非铰链区的氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键。
在某些实施方案中，所述接触步骤产生抗体制剂，所述抗体制剂比未经所述方法处理的相同抗体制剂更同质。
在某些实施方案中，所述接触步骤产生抗体制剂，所述抗体制剂与未经所述方法处理的相同抗体相比具有增加的生物学活性。
在某些实施方案中，所述接触步骤产生抗体，所述抗体与未经所述方法处理的相同抗体相比具有增强的将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的活性。
在某些实施方案中，所述接触步骤产生抗体，所述抗体与未经所述方法处理的相同抗体相比具有增强的稳定性。
在某些实施方案中，所述接触步骤优先富集具有在铰链区外部形成的至少一个二硫键的抗体，并且相比于未经所述接触步骤处理的制剂，所述优先富集的形式具有选自以下(a)至(e)中任一项的药学上所需的性质：
(a)其中所述至少一个二硫键将两个抗原结合结构域的抗原结合方向限制为顺式抗原结合(即，结合同一细胞上的两个抗原)，或将两个抗原结合结构域限制为结合在空间上彼此接近的两个抗原；
(b)其中与不具有所述至少一个二硫键的相同相应抗体相比，所述至少一个二硫键将第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域保持在空间上彼此更接近；
(c)其中与不具有所述至少一个二硫键的相应相同抗体相比，所述至少一个二硫键降低第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的柔性和/或迁移率；
(d)其中与不具有所述至少一个二硫键的相应相同抗体相比，所述至少一个二硫键增加抗体对蛋白酶切割的抗性；或
(e)其中与不具有所述至少一个二硫键的相应相同抗体相比，所述至少一个二硫键增强或减少由所述抗原结合分子结合的两个抗原分子之间的相互作用。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的两个抗原结合结构域各自可包含用于连接两个抗原结合结构域的键所起源的一个或多个氨基酸残基，并且在这种情况下，抗原结合结构域之间的键所起源的一个或多个氨基酸残基的一些或全部是存在于野生型Fab或铰链区中的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的所述至少一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
在另一方面，本公开提供了用于制备具有调节两个抗原分子之间相互作用的活性的抗原结合分子的方法，包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加至少一个连接所述两个抗原结合结构域的键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的两个抗原结合结构域各自可包含用于连接两个抗原结合结构域的键所起源的一个或多个氨基酸残基，并且在这种情况下，抗原结合结构域之间的键所起源的一个或多个氨基酸残基的一些或全部是存在于野生型Fab或铰链区中的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的所述至少一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
此外，在另一方面，本公开提供了用于制备抗原结合分子的方法，所述抗原结合分子具有调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的激活的活性，该方法包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加至少一个连接所述两个抗原结合结构域的键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的两个抗原结合结构域各自可包含用于连接两个抗原结合结构域的键所起源的一个或多个氨基酸残基，并且在这种情况下，抗原结合结构域之间的键所起源的一个或多个氨基酸残基的一些或全部是存在于野生型Fab或铰链区中的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的所述至少一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
此外，另一方面，本公开提供了用于制备抗原结合分子的方法，所述抗原结合分子中两个抗原结合结构域存在于空间上接近的位置处和/或两个抗原结合结构域的迁移率降低，所述方法包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加至少一个连接所述两个抗原结合结构域的键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的两个抗原结合结构域各自可包含用于连接两个抗原结合结构域的键所起源的一个或多个氨基酸残基，并且在这种情况下，抗原结合结构域之间的键所起源的一个或多个氨基酸残基的一些或全部是存在于野生型Fab或铰链区中的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的所述至少一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
此外，在另一方面，本公开提供了用于制备对蛋白酶切割具有增加的抗性的抗原结合分子的方法，其包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加至少一个连接所述两个抗原结合结构域的键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的两个抗原结合结构域各自可包含用于连接两个抗原结合结构域的键所起源的一个或多个氨基酸残基，并且在这种情况下，抗原结合结构域之间的键所起源的一个或多个氨基酸残基的一些或全部是存在于野生型Fab或铰链区中的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的所述至少一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
在这些各个方面中制备的抗原结合分子可以具有本文所述的抗原结合分子的特征。
<筛选抗原结合分子的方法>
在另一方面，本公开提供了用于鉴定通过彼此缔合而被激活的新的蛋白质分子对的方法，该方法包括：
(a)提供两个任意的蛋白质分子，
(b)通过本发明的制备方法制备抗原结合分子，所述抗原结合分子包含分别与所述两种蛋白质分子结合的两个抗原结合结构域，
(c)使(b)中制备的所述抗原结合分子与所述两种蛋白质分子接触，和
(d)评估所述两种蛋白质分子是否被激活。
在某些实施方案中，两种蛋白质分子中的至少一个选自由以下各项组成的组：属于细胞因子受体超家族的受体，G蛋白偶联受体，离子通道受体，酪氨酸激酶受体，免疫检查点受体，抗原受体，CD抗原，共刺激分子和细胞粘附分子。
A.示例性抗原结合分子
<抗原结合分子的结构>
一方面，本公开提供了包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的抗原结合分子，并且所述抗原结合结构域通过两个或多个键彼此连接。在实施方案中，第一和第二抗原结合结构域中的至少一个自身具有与抗原结合的活性(即，单个抗原结合结构域独立地具有抗原结合活性)。在某些实施方案中，第一和第二抗原结合结构域中的每一个本身具有结合抗原的活性。
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域中的至少一个包含与特定抗原结合的抗体片段。在某些实施方案中，第一和/或第二抗原结合结构域包含铰链区。抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基分别存在于第一和第二抗原结合结构域中，并且抗原结合结构域之间的键是通过连接这些氨基酸残基形成的。在某些实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的至少一个氨基酸残基存在于抗体片段内。在某些实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的至少一个氨基酸残基存在于铰链区内。在某些实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的至少一个氨基酸残基存在于抗体片段内，并且至少一个氨基酸残基存在于铰链区内。
在上述方面的实施方案中，在第一和第二抗原结合结构域的至少一个中，抗原结合结构域之间的键所起源的多个氨基酸残基存在于一级结构中彼此间隔七个或更多个氨基酸的位置处。这意味着在上述多个氨基酸残基的任何两个氨基酸残基之间，存在六个或多个不是所述氨基酸残基的氨基酸残基。在某些实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的多个氨基酸残基的组合包括氨基酸残基对，其存在于一级结构中距离小于七个氨基酸的位置处。在某些实施方案中，如果第一和第二抗原结合结构域通过三个或更多个键彼此连接，则抗原结合结构域之间的键可源自三个或更多个氨基酸残基，所述氨基酸残基包括存在于一级结构中距离七个或更多个氨基酸的位置处的氨基酸残基对。
在某些实施方案中，存在于第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中相同位置处的氨基酸残基彼此连接以形成键。在某些实施方案中，存在于第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域中不同位置处的氨基酸残基彼此连接以形成键。
抗原结合结构域中氨基酸残基的位置可以根据Kabat编号或EU编号系统(也称为EU索引)来显示，该编号系统描述于Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。例如，如果第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于抗原结合结构域中对应的相同位置，则根据Kabat编号或EU编号系统，这些氨基酸残基的位置可以表示为相同的编号。或者，如果第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基存在于抗原结合结构域中不对应的不同位置，则根据Kabat编号或EU编号系统，这些氨基酸残基的位置可以表示为不同的数字。
在以上方面的实施方案中，连接抗原结合结构域的两个或多个键中的至少一个是共价键。在某些实施方案中，所述共价键是通过第一抗原结合结构域中的氨基酸残基与第二抗原结合结构域中的氨基酸残基的直接交联而形成的。交联的氨基酸残基为例如半胱氨酸，并且形成的共价键为例如二硫键。至少一个交联的半胱氨酸残基可以存在于铰链区内。
在某些其他实施方案中，所述共价键是通过第一抗原结合结构域中的氨基酸残基与第二抗原结合结构域中的氨基酸残基经由交联剂交联而形成的。交联剂是例如胺反应性交联剂，并且交联的氨基酸残基是例如赖氨酸。
在以上方面的实施方案中，连接抗原结合结构域的两个或多个键中的至少一个是非共价键。在某些实施方案中，非共价键是离子键，氢键或疏水键。
在上述方面的实施方案中，抗体片段是Fab，Fab’，scFab，Fv，scFv或单域抗体。
在上述方面的实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个存在于恒定区内。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于CH1区内，并且例如，其存在于CH1区内选自由以下各项组成的组的位置：根据EU编号位置119,122,123,131,132,133,134,135,136,137,139,140,148,150,155,156,157,159,160,161,162,163,165,167,174,176,177,178,190,191,192,194,195,197,213和214。在示例性的实施方案中，氨基酸残基存在于CH1区中根据EU编号的位置191处，并且在两个抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号的位置191处的氨基酸残基彼此连接以形成键。
在上述方面的一些实施方案中，在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的各自CH1区中根据EU编号位置191处的氨基酸残基之间形成一个二硫键。
在上述方面的一些实施方案中，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的各自CH1区中，通过根据EU编号以下位置处的氨基酸残基，在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域之间形成另外的一个、两个或更多个二硫键：
(a)在两个抗原结合结构域各自的位置131至138、194和195的任意位置处的氨基酸残基之间；
(b)在两个抗原结合结构域各自的位置131处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(c)在两个抗原结合结构域各自的位置132处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(d)在两个抗原结合结构域各自的位置133处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(e)在两个抗原结合结构域各自的位置134处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(f)在两个抗原结合结构域各自的位置135处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(g)在两个抗原结合结构域各自的位置136处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(h)在两个抗原结合结构域各自的位置137处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(i)在两个抗原结合结构域各自的位置138处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置194处的氨基酸残基之间；
(j)在两个抗原结合结构域各自的位置131处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(k)在两个抗原结合结构域各自的位置132处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(l)在两个抗原结合结构域各自的位置133处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(m)在两个抗原结合结构域各自的位置134处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(n)在两个抗原结合结构域各自的位置135处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(o)在两个抗原结合结构域各自的位置136处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；
(p)在两个抗原结合结构域各自的位置137处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间；和
(q)在两个抗原结合结构域各自的位置138处的氨基酸残基之间，以及在两个抗原结合结构域各自的位置195处的氨基酸残基之间。
在上述方面的一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带相反电荷的氨基酸残基。
在上述方面的一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带负电荷的氨基酸残基。
在上述方面的一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带负电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基。
在上述方面的一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CHl区中包含一个、两个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(a)位置136处的氨基酸残基，其是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(b)位置137处的氨基酸残基，其是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(c)位置138处的氨基酸残基，其是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；和
所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CHl区中包含一个、两个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(d)位置193处的氨基酸残基，其是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；
(e)位置194处的氨基酸残基，其是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；和
(f)位置195处的氨基酸残基，其是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)。
在上述方面的一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CHl区中包含一个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(a)位置136处的氨基酸残基，其是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；
(b)位置137处的氨基酸残基，其是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；
(c)位置138处的氨基酸残基，其是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)；和
所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CHl区中包含一个或更多个以下氨基酸残基(根据EU编号)：
(d)位置193处的氨基酸残基，其是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；
(e)位置194处的氨基酸残基，其是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)；和
(f)位置195处的氨基酸残基，其是谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。
在上述方面的一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个疏水性氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个疏水性氨基酸残基。
在上述方面的一些实施方案中，所述疏水性氨基酸残基是丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)和/或色氨酸(Trp)。
在上述方面的一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个“杵”氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个“臼”氨基酸残基。在上述方面的一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个“臼”氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个“杵”氨基酸残基。在一些实施方案中，所述“杵”氨基酸残基选自由色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)组成的组；并且所述“臼”氨基酸残基选自由丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(T)或丝氨酸(S)组成的组。
在上述方面的一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个芳香族氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基。在上述方面的一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合结构域中的任一个在各自的CH1区中位置136-138(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个带正电荷的氨基酸残基；并且所述第一和第二抗原结合结构域的另一个抗原结合结构域在各自的CH1区中位置193-195(根据EU编号)处包含一个、两个或更多个芳香族氨基酸残基。在一些实施方案中，所述芳香族氨基酸残基选自由色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)和苯丙氨酸(Phe)组成的组；并且所述带正电荷的氨基酸残基选自由赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)组成的组。
在某些实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个存在于铰链区内，并且例如存在于铰链区内选自由以下各项组成的组的位置：根据EU编号的位置216、218和219。
在某些实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个存在于CL区内，并且例如，存在于CL区内选自由以下各项组成的组的位置：根据EU编号，位置109,112,121,126,128,151,152,153,156,184,186,188,190,200,201,202,203,208,210,211,212和213。在示例性的实施方案中，氨基酸残基存在于CL区中根据EU编号位置126处，并且在两个抗原结合结构域的CL区中根据EU编号位置126处的氨基酸残基彼此连接，以便形成键。
在某些实施方案中，第一抗原结合结构域的CH1区中的氨基酸残基与第二抗原结合结构域的CL区中的氨基酸残基连接以形成键。在示例性的实施方案中，在第一抗原结合结构域的CH1区中根据EU编号的位置191处的氨基酸残基和在第二抗原结合结构域的CL区中根据EU编号的位置126处的氨基酸残基连接以形成键。
在上述方面的实施方案中，恒定区衍生自人。在某些实施方案中，重链恒定区的亚类是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgM，IgD和IgE中的任何一个。在某些实施方案中，CH1区的亚类是γ1，γ2，γ3，γ4，α1，α2，μ，δ和ε中的任何一个。在某些实施方案中，CL区的亚类是κ或λ。
在上述方面的实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个存在于可变区内。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于VH区内，并且例如，其存在于VH区内选自由以下各项组成的组的位置：根据Kabat编号位置8、16、28、74和82b。在某些实施方案中，氨基酸残基存在于VL区内，并且例如，其存在于VL区内选自由以下各项组成的组的位置：根据Kabat编号位置100、105和107。
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域二者均包含Fab和铰链区。
在某些实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个是存在于野生型Fab或铰链区中的氨基酸残基，并且例如，是铰链区中的半胱氨酸残基。此类半胱氨酸残基的实例包括根据EU编号在位置226和229处的半胱氨酸残基。
在某些其他实施方案中，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基中的至少一个是在野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基，并且例如，它是在野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基。可以通过例如氨基酸置换的方法将这种突变氨基酸残基引入野生型Fab或铰链区。本说明书公开了对于CH1，铰链，CL，VH和VL区中的每一个，抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基的位点，例如，可以将半胱氨酸残基引入这样的位点中。
备选地，在另一个实施方案中，存在于野生型Fab或铰链区中并且参与抗原结合结构域之间的键的氨基酸残基(例如，半胱氨酸残基)可以被另一个氨基酸置换或缺失。这种半胱氨酸残基的实例包括在铰链区中根据EU编号在位置220、226和229处的半胱氨酸残基以及在CL区中位置214处的半胱氨酸残基。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子是F(ab’)2，其中第一和第二抗原结合结构域二者均包含Fab和铰链区。
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域中的至少一个包含与特定抗原结合的非抗体蛋白，或其片段。在某些实施方案中，所述非抗体蛋白是一对彼此特异性结合的配体和受体中的任一个。这样的受体包括例如属于细胞因子受体超家族的受体，G蛋白偶联受体，离子通道受体，酪氨酸激酶受体，免疫检查点受体，抗原受体，CD抗原，共刺激分子和细胞粘附分子。
在上述方面的实施方案中，本公开的抗原结合分子还包含Fc区，并且例如，它是全长抗体。在某些实施方案中，将促进Fc区多聚化的一个或多个氨基酸突变引入本公开的抗原结合分子的Fc区中。这样的氨基酸突变包括，例如在选自由以下各项组成的组的至少一个位置处的氨基酸突变：根据EU编号，位置247,248,253,254,310,311,338,345,356,359,382,385,386,430,433,434,436,437,438,439,440和447(参见例如WO2016/164480)。在某些实施方案中，多聚化是六聚化。
<抗原结合分子结合的抗原>
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域二者都结合相同的抗原。在某些实施方案中，第一和第二抗原结合结构域二者都结合相同抗原上的相同表位。在某些其他实施方案中，第一和第二抗原结合结构域中的每一个结合相同抗原上的不同表位。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子是靶向一种特异性抗原的双互补位抗原结合分子(例如，双互补位抗体)。
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域各自结合不同的抗原。
在上述方面的另一个实施方案中，本公开的抗原结合分子是钳位抗原结合分子(例如，钳位抗体)。在本文中，钳位抗原结合分子是指与抗原/抗原结合分子复合物特异性结合的抗原结合分子，其中，所述复合物是由某抗原A和与抗原A结合的抗原结合分子形成的，并且从而增加与抗原A结合的抗原结合分子结合抗原A的活性(或者，稳定由抗原A和与抗原A结合的抗原结合分子形成的抗原/抗原结合分子复合物)。例如，CD3钳位抗体能够结合抗原-抗体复合物，所述复合物是由CD3和与CD3的结合能力减弱的抗体(结合减弱的CD3抗体)形成的，并且从而增加结合减弱的CD3抗体的CD3结合活性(或稳定由CD3和结合减弱的CD3抗体形成的抗原-抗体复合物)。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子中的第一和/或第二抗原结合结构域可以是衍生自钳位抗原结合分子的抗原结合结构域(钳位抗原结合结构域)。
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域二者均具有相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，第一和第二抗原结合结构域各自具有不同的氨基酸序列。
在上述方面的实施方案中，第一和第二抗原结合结构域所结合的两个抗原中的至少一个是可溶性蛋白或膜蛋白。
<抗原结合分子的功能>
在上述方面的实施方案中，本公开的抗原结合分子具有将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的活性。在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子能够将两个抗原分子保持在比对照抗原结合分子更近的位置，并且对照抗原结合分子与本公开的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
在上述方面的实施方案中，本公开的抗原结合分子具有调节两个抗原分子之间的相互作用的活性。不受特定理论的束缚，认为调节相互作用的活性是由于通过本公开的抗原结合分子将两个抗原分子保持在空间上更近的位置而引起的。在某些实施方案中，与对照抗原结合分子相比，本公开的抗原结合分子能够增强或减少两个抗原分子之间的相互作用，并且对照抗原结合分子与本公开的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
在某些实施方案中，被本发明的抗原结合分子结合的两个抗原分子分别是配体和受体，并且本发明的抗原结合分子具有促进配体激活受体的活性。在某些其他实施方案中，被本公开的抗原结合分子结合的两个抗原分子分别是酶和其底物，并且本公开的抗原结合分子具有促进酶与底物的催化反应的活性。
此外，在某些其他实施方案中，被本公开的抗原结合分子结合的两个抗原分子都是存在于细胞表面上的抗原(例如蛋白质)，并且本公开的抗原结合分子具有促进表达第一抗原的细胞与表达第二抗原的细胞之间的相互作用的活性。例如，表达第一抗原的细胞和表达第二抗原的细胞分别是具有细胞毒性活性的细胞和其靶细胞，并且本公开的抗原结合分子促进具有细胞毒性活性的细胞对靶细胞的损伤。具有细胞毒性活性的细胞是例如T细胞，NK细胞，单核细胞或巨噬细胞。
在上述方面的实施方案中，本公开的抗原结合分子具有调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的激活的活性。不受特定理论的束缚，认为调节激活的活性是由于通过本公开的抗原结合分子将两个抗原分子保持在空间上更近的位置而引起的。在某些实施方案中，与对照抗原结合分子相比，本公开的抗原结合分子能够增强或减少两个抗原分子之间的激活，并且对照抗原结合分子与本公开的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。例如，这种抗原分子选自由以下各项组成的组：属于细胞因子受体超家族的受体，G蛋白偶联受体，离子通道受体，酪氨酸激酶受体，免疫检查点受体，抗原受体，CD抗原，共刺激分子和细胞粘附分子。
在上述方面的实施方案中，本公开的抗原结合分子具有对蛋白酶切割的抗性。在某些实施方案中，与对照抗原结合分子相比，本公开的抗原结合分子具有增加的对蛋白酶切割的抗性，并且对照抗原结合分子与本公开的抗原结合分子的区别之处仅在于对照抗原结合分子在两个抗原结合结构域之间少一个键。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。在某些实施方案中，在本公开的抗原结合分子中，与对照抗原结合分子相比，蛋白酶处理后剩余的全长分子(例如，全长IgG分子)的比例增加。在某些实施方案中，在本公开的抗原结合分子中，与对照抗原结合分子相比，蛋白酶处理后产生的特定片段(例如，Fab单体)的比例降低。
在上述方面的实施方案中，当本发明的抗原结合分子用蛋白酶处理时，抗原结合结构域或其片段的二聚体(例如，交联的Fab二聚体)被切除。在某些实施方案中，当对照抗原结合分子(其与本公开的抗原结合分子的不同之处仅在于它在两个抗原结合结构域之间少一个键)用蛋白酶处理时，抗原结合结构域或其片段的单体被切除。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。在这些实施方案中，蛋白酶可以切割抗原结合分子的铰链区。
<药物组合物>
一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本公开的抗原结合分子和药学上可接受的载体。
<抗原结合分子的用途>
一方面，本公开提供了用于将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的方法，包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
(b)向所述抗原结合分子添加另一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键，和
(c)使(b)中产生的抗原结合分子与所述两个抗原结合分子接触。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的一个或多个键中的一些或全部是这样的键，其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中存在的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的另一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。本公开还提供了将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的方法，该方法包括使两个抗原分子与本公开的抗原结合分子或药物组合物接触。本公开进一步提供了本公开的抗原结合分子或药物组合物，其用于将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处。
另一方面，本发明提供了用于调节两个抗原分子之间相互作用的方法，包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
(b)向所述抗原结合分子添加另一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键，和
(c)使(b)中产生的抗原结合分子与所述两个抗原结合分子接触。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的一个或多个键中的一些或全部是这样的键，其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中存在的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的另一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。本公开还提供了用于调节两个抗原分子之间的相互作用的方法，该方法包括使两个抗原分子与本公开的抗原结合分子或药物组合物接触。本公开进一步提供了本公开的抗原结合分子或药物组合物，其用于调节两个抗原分子之间的相互作用。
此外，在另一方面，本公开提供了用于调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的活性的方法，所述方法包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接。
(b)向所述抗原结合分子添加另一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键，和
(c)使(b)中产生的抗原结合分子与所述两个抗原结合分子接触。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的一个或多个键中的一些或全部是这样的键，其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中存在的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的另一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。本公开还提供了用于调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的活性的方法，该方法包括使两个抗原分子与本公开的抗原结合分子或药物组合物接触。本公开进一步提供了本公开的抗原结合分子或药物组合物，其用于调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的活性。
此外，在另一方面，本公开提供了用于增加抗原结合分子对蛋白酶切割的抗性的方法，包括：
(a)提供包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子，其中所述两个抗原结合结构域通过一个或多个键彼此连接；和
(b)向所述抗原结合分子添加另一个将所述两个抗原结合结构域彼此连接的键。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的一个或多个键中的一些或全部是这样的键，其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中存在的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的另一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
在这些各种方法中使用的抗原结合分子可以具有本文所述的抗原结合分子的特征。
<制备抗原结合分子的方法>
一方面，本公开提供了用于制备抗原结合分子的方法，该抗原结合分子具有将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的活性，所述方法包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，其中两个抗原结合结构域各自包含用于连接两个抗原结合结构域的键所起源的一个或多个氨基酸残基，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加连接所述两个抗原结合结构域的另一个键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过两个或多个键彼此连接。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的抗原结合结构域之间的键所起源的一个或多个氨基酸残基中的一些或全部是存在于野生型Fab或铰链区中的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的另一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
在另一方面，本公开提供了用于制备具有调节两个抗原分子之间相互作用的活性的抗原结合分子的方法，包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，其中两个抗原结合结构域各自包含用于连接两个抗原结合结构域的键所起源的一个或多个氨基酸残基，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加连接所述两个抗原结合结构域的另一个键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过两个或多个键彼此连接。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的抗原结合结构域之间的键所起源的一个或多个氨基酸残基中的一些或全部是存在于野生型Fab或铰链区中的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的另一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
此外，在另一方面，本公开提供了用于制备抗原结合分子的方法，所述抗原结合分子具有调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的激活的活性，该方法包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，其中两个抗原结合结构域各自包含用于连接两个抗原结合结构域的键所起源的一个或多个氨基酸残基，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加连接所述两个抗原结合结构域的另一个键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过两个或多个键彼此连接。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的抗原结合结构域之间的键所起源的一个或多个氨基酸残基中的一些或全部是存在于野生型Fab或铰链区中的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的另一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
此外，在另一方面，本公开提供了用于制备对蛋白酶切割具有增加的抗性的抗原结合分子的方法，其包括：
(a)提供编码包含第一抗原结合结构域的多肽的核酸和编码包含第二抗原结合结构域的多肽的核酸，其中两个抗原结合结构域各自包含用于连接两个抗原结合结构域的键所起源的一个或多个氨基酸残基，
(b)将突变引入编码所述两个抗原结合结构域的核酸中，从而添加连接所述两个抗原结合结构域的另一个键，
(c)将(b)中产生的核酸引入宿主细胞，
(d)培养所述宿主细胞以表达所述两种多肽，和
(e)获得抗原结合分子，所述抗原结合分子是包含第一和第二抗原结合结构域的多肽，其中所述两个抗原结合结构域通过两个或多个键彼此连接。
在某些实施方案中，以上(a)中所述的抗原结合结构域之间的键所起源的一个或多个氨基酸残基中的一些或全部是存在于野生型Fab或铰链区中的氨基酸残基(例如，铰链区中的半胱氨酸残基)。在进一步的实施方案中，以上(b)中所述的另一个键是这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。
在这些各个方面中制备的抗原结合分子可以具有本文所述的抗原结合分子的特征。
<筛选抗原结合分子的方法>
在另一方面，本公开提供了用于鉴定通过彼此缔合而被激活的新的蛋白质分子对的方法，该方法包括：
(a)提供两个任意的蛋白质分子，
(b)通过本公开的制备方法，制备包含两个分别与两个蛋白质分子结合的抗原结合结构域的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有将两个蛋白质分子保持在接近位置处的活性，
(c)使(b)中制备的所述抗原结合分子与所述两个蛋白质分子接触，和
(d)评估所述两个蛋白质分子是否被激活。
在某些实施方案中，蛋白质分子中的至少一个选自由以下各项组成的组：属于细胞因子受体超家族的受体，G蛋白偶联受体，离子通道受体，酪氨酸激酶受体，免疫检查点受体，抗原受体，CD抗原，共刺激分子和细胞粘附分子。
<抗原结合结构域的连接>
在非限制性实施方案中，本公开的抗原结合分子中包含的两个或更多个抗原结合结构域是通过一个或多个键彼此连接的。在优选的实施方案中，本公开的抗原结合分子中包含的抗原结合结构域本身具有结合抗原的活性。在这样的实施方案中，本公开的包含两个抗原结合结构域的抗原结合分子能够结合两个或更多个抗原分子；本公开的包含三个抗原结合结构域的抗原结合分子能够结合三个或更多个抗原分子；本公开的包含四个抗原结合结构域的抗原结合分子能够结合四个或更多个抗原分子；并且本公开的包含N个抗原结合结构域的抗原结合分子能够结合N个或更多个抗原分子。
在某些实施方案中，本公开的抗原结合分子中包含的抗原结合结构域之间的至少一个键不同于在天然存在的抗体中发现的键(例如，在野生型Fab或铰链区)。在天然存在的抗体(例如天然存在的IgG抗体)的抗原结合结构域之间发现的键的实例包括铰链区中的二硫键。位于铰链区以外区域的氨基酸残基之间的键可以是抗体片段(例如Fab)内氨基酸残基之间的键，并且它们包括重链之间的键(HH)，轻链之间的键(LL)，以及重链和轻链之间的键(HL或LH)(见图21)。抗原结合结构域之间的键所起源的重链或轻链中的氨基酸残基的实例包括在可变区(VH区或VL区)或恒定区(CH1区，铰链区或CL区)内的上述位置处的氨基酸残基。
在非限制性实施方案中，抗原结合结构域之间的键可源自多个氨基酸残基，所述氨基酸残基存在于本公开的抗原结合分子中所包含的两个或多个抗原结合结构域中至少一个的一级结构中彼此分开的位置处。多个氨基酸残基之间的距离是这样的距离，其由于抗原结合结构域之间通过源自氨基酸残基的键的连接而得以实现两个或更多个足够接近的抗原结合结构域的结构。多个氨基酸残基之间的距离可以是例如4个或更多个氨基酸，5个或更多个氨基酸，6个或更多个氨基酸，7个或更多个氨基酸，8个或更多个氨基酸，9个或更多个氨基酸，10个或更多个氨基酸，11个或更多个氨基酸，12个或更多个氨基酸，13个或更多个氨基酸，14个或更多个氨基酸，15个或更多个氨基酸，20个或更多个氨基酸，25个或更多个氨基酸，30个或更多个氨基酸，35个或更多个氨基酸，40个或更多个氨基酸，45个或更多个氨基酸，50个或更多个氨基酸，60个或更多个氨基酸，70个或更多个氨基酸，80个或更多个氨基酸，90个或更多个氨基酸，100个或更多个氨基酸，110个或更多个氨基酸，120个或更多个氨基酸，130个或更多个氨基酸，140个或更多个氨基酸，150个或更多个氨基酸，160个或更多个氨基酸，170个或更多个氨基酸，180个或更多个氨基酸，190个或更多个氨基酸，200个或更多个氨基酸，210个或更多个氨基酸，或220个或更多个氨基酸。
此外，抗原结合结构域之间的键的数目和该键所起源的氨基酸残基的数目是这样的数目，其允许由于抗原结合结构域之间通过键的连接而得以实现两个或更多个足够接近的抗原结合结构域的结构。该数目可以是例如两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，六个或更多个，七个或更多个，八个或更多个，九个或更多个，或十个或更多个。
在某些实施方案中，只要两个或更多个足够接近的抗原结合结构域的结构是由于抗原结合结构域之间通过三个或更多个分别源自抗原结合结构域中三个或更多个氨基酸残基的键的连接而实现的，选自三个氨基酸残基的任何两个氨基酸残基之间的一级结构的距离在至少一个氨基酸残基对中可以是七个氨基酸或更多，并且在剩余的氨基酸残基对中可以是少于七个氨基酸。
关于本公开的抗原结合分子中包含的抗原结合结构域，“足够接近”是指两个或更多个抗原结合结构域接近于足以实现本公开的抗原结合分子的期望功能(活性)的程度。期望功能(活性)的实例包括将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的活性；调节两个抗原分子之间相互作用的活性；促进配体激活受体的活性；促进酶与底物催化反应的活性；促进表达第一抗原的细胞与表达第二抗原的细胞之间相互作用的活性；促进具有细胞毒性活性的细胞(例如T细胞，NK细胞，单核细胞，巨噬细胞)损伤靶细胞的活性；调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的激活的活性；和对抗原结合分子的蛋白酶切割的抗性。
在非限制性实施方案中，本公开的抗原结合分子中包含的抗原结合结构域之间的键可以是共价键或非共价键。共价键可以是通过使第一抗原结合结构域中的氨基酸残基与第二抗原结合结构域中的氨基酸残基直接交联而形成的共价键，例如半胱氨酸残基之间的二硫键。直接交联的氨基酸残基可以存在于抗体片段如Fab中，或存在于铰链区中。
在另一个实施方案中，所述共价键是通过第一抗原结合结构域中的氨基酸残基与第二抗原结合结构域中的氨基酸残基经由交联剂交联而形成的。例如，当使用胺反应性交联剂进行交联时，可以通过抗原结合结构域的N末端氨基酸的游离氨基或抗原结合结构域中的赖氨酸残基侧链的伯胺进行交联。胺反应性交联剂包括与伯胺形成化学键的官能团，例如异硫氰酸酯，异氰酸酯，酰基叠氮化物，NHS酯，磺酰氯，醛，乙二醛，环氧化物，环氧乙烷，碳酸酯，芳基卤化物，酰亚胺酯，碳二亚胺，酸酐和氟代酯。代表性的例子包括DSG(戊二酸二琥珀酰亚胺酯)，DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)，BS3(二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)，DSP(二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯))，DTSSP(3,3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯))，DST(酒石酸二琥珀酰亚胺酯)，BSOCOES(双(2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基)砜，EGS(乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))，Sulfo-EGS(乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))，DMA(己二亚胺酸二甲酯)，DMP(庚二亚胺酸二甲酯)，DMS(辛二亚胺酸二甲酯)和DFDNB(1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。其他交联剂的实例包括羧基/胺反应性，巯基反应性，醛反应性和光反应性交联剂。
用于连接抗原结合结构域的非共价键可以是离子键，氢键或疏水键。
抗原结合结构域之间的键数目是否大于对照抗原结合分子(例如，具有与天然存在的抗体结构基本相似的结构的抗原结合分子)的键数目，可以通过例如以下方法进行评估。首先，将目标抗原结合分子和对照抗原结合分子用切掉抗原结合结构域的蛋白酶(例如，切割铰链区交联位点N末端的蛋白酶，如木瓜蛋白酶和Lys-C)处理，然后进行非还原性电泳。接下来，识别部分抗原结合结构域的抗体(例如，抗κ链HRP标记的抗体)用于检测蛋白酶处理后存在的片段。当对于对照抗原结合分子仅检测到抗原结合结构域的单体(例如，Fab单体)，并且对于目标抗原结合分子检测到抗原结合结构域的多聚体(例如，Fab二聚体)时，则可以评估目标抗原结合分子的抗原结合结构域之间的键数目大于对照抗原结合分子的键数目。
通过将半胱氨酸引入到对照抗原结合分子中而产生的修饰的抗原结合分子中的半胱氨酸之间的二硫键的形成可以通过例如以下方法来评估。首先，将目标抗原结合分子与胰凝乳蛋白酶在20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中温育，然后通过LC/MS检测预期从每种抗体的氨基酸序列生成的肽的质量。如果检测到与当新引入的半胱氨酸形成二硫键时应产生的肽的理论质量相对应的成分，则可以将引入的半胱氨酸评估为已形成二硫键。此外，如果在向样品中添加用于还原二硫键的试剂(例如，三(2-羧乙基)膦)后分析包含上述抗原结合分子的样品时该成分变得不可检测，则上述评估的正确性将进一步得到强有力的验证。
<对蛋白酶切割的抗性>
在非限制性实施方案中，本公开的抗原结合分子具有对蛋白酶切割的抗性。在某些实施方案中，与对照抗原结合分子(例如，具有与天然存在的抗体结构基本相似的结构的抗原结合分子)相比，本公开的抗原结合分子对蛋白酶切割的抗性增加，其中与抗原结合分子相比，对照抗原结合分子的抗原结合结构域之间的键数目少一个或多个。在进一步的实施方案中，少的一个键可以选自这样的键：其中抗原结合结构域之间的键所起源的氨基酸残基源自野生型Fab或铰链区中不存在的突变氨基酸残基(例如，野生型Fab或铰链区中不存在的半胱氨酸残基)。相比于对照抗原结合分子，如果对于抗原结合分子，蛋白酶处理后剩余的全长分子(例如，全长IgG分子)的比例增加，或者蛋白酶处理后产生的特定片段(例如Fab单体)的比例减少，则可以评估对蛋白酶切割的抗性增加(蛋白酶抗性改善)。
在某些实施方案中，相对于所有抗原结合分子，蛋白酶处理后剩余的全长分子的比例可以是例如0.5％或更多，1％或更多，1.5％或更多，2％或更多，2.5％或更多，3％或更多，3.5％或更多，4％或更多，4.5％或更多，5％或更多，7.5％或更多，10％或更多，12.5％或更多，15％或更多，20％或更多，25％或更多，30％或更多，35％或更多，40％或更多，45％或更多，或50％或更多。在某些其他实施方案中，相对于所有的抗原结合分子，蛋白酶处理后产生的抗原结合结构域(例如，Fab)的单体的比例可以是例如99％或更少，98％或更少，97％或更少，96％或更少，95％或更少，94％或更少，93％或更少，92％或更少，91％或更少，90％或更少，85％或更少，80％或更少，75％或更少，70％或更少，60％或更少，50％或更少，40％或更少，30％或更少，20％或更少，或10％或更少。在某些其他实施方案中，相对于所有抗原结合分子，蛋白酶处理后产生的抗原结合结构域(例如，Fab)的二聚体的比例可以是例如0.5％或更多，1％或更多，1.5％或更多，2％或更多，2.5％或更多，3％或更多，3.5％或更多，4％或更多，4.5％或更多，5％或更多，7.5％或更多，10％或更多，12.5％或更多，15％或更多，20％或更多，25％或更多，30％或更多，35％或更多，40％或更多，45％或更多，或50％或更多。
蛋白酶的实例包括但不限于Lys-C，纤溶酶，人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)和木瓜蛋白酶。
在进一步的方面，根据任何上述实施方案的抗原结合分子可单独或组合地掺入以下1-7节中所述的任何特征：
1.抗原结合分子亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗原结合分子的解离常数(KD)为1μM或更小，100nM或更小，10nM或更小，1nM或更小，0.1nM或更小，0.01nM或更小，或0.001nM或更小(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗原结合分子是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab′，Fab′-SH，F(ab′)2，Fv和scFv片段，以及本文所述的其他片段。对于某些抗体片段的综述，请参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体(salvage receptor)结合表位残基并具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗原结合分子是嵌合抗体。某些嵌合抗体在例如美国专利号4,816,567；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴的非人灵长类动物的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转变”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化，以降低对人类的免疫原性，同时保持亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人抗体(例如HVR残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗原结合分子是人抗体。可使用本领域中已知的多种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
5.文库衍生的抗原结合分子
可通过筛选组合文库以获得具有一种或多种所需活性的抗原结合分子来分离本发明的抗原结合分子。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选这些文库以获得具有所需结合特征的抗原结合分子。这些方法于例如Hoogenboom等人，Methodsin Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，2001)中评述，并且进一步于例如McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methodsin Molecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中描述。
6.多特异性抗原结合分子
在某些实施方案中，本文提供的抗原结合分子是多特异性抗原结合分子，例如双特异性抗原结合分子。多特异性抗原结合分子是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗原结合分子。在某些实施方案中，结合特异性之一是针对特定抗原(例如，CD3)的，而另一种是针对任何其他抗原(例如，CD28或癌症抗原)的。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子可以结合单个抗原上的两个不同表位。可以将双特异性抗原结合分子制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗原结合分子的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983)),WO 93/08829,和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))，及“杵臼(knob-in-hole)”(也称为“杵臼”或“KiH”)工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168)。也可通过以下方法制备多特异性抗原结合分子：用于制备抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电导引作用(WO 2009/089004A1)；将两个或多个抗体或片段交联(参见例如美国专利号4,676,980，及Brennan等人，Science，229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见，例如Kostelny等人，J.Immunol.，148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见，例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber等人，J.Immunol.，152:5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文中也包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见例如US 2006/0025576A1)。
7.抗原结合分子变体
在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗原结合分子的结合亲和力和/或其他生物学特性。可通过在编码抗原结合分子的核苷酸序列中引入适当修饰或通过肽合成来制备抗原结合分子的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如抗原结合分子氨基酸序列内的残基的缺失和/或向其中插入和/或对其置换。可以进行缺失、插入和置换的任何组合，以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
a)置换、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗原结合分子变体。用于置换性诱变的感兴趣的位点包括HVR和FR。保守性置换显示在下表的“优选置换”的标题下。更多实质性变化在下表中的“示例性置换”的标题下提供，且如下文关于氨基酸侧链类别进一步所描述的。可将氨基酸置换引入感兴趣的抗原结合分子中，并筛选产物以获得所需活性，例如保持/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
原始残基 示例性置换 优选置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
可根据常见侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守性置换将需要将这些类别之一的成员换成另一类别。
一种类型的置换变体涉及置换亲本抗原结合分子(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗原结合分子在某些生物学特性方面将具有修饰(例如改善)(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)，和/或将基本上保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟的抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(例如本文中所述的那些)方便地产生。简言之，一个或多个HVR残基被突变，且变体抗体展示在噬菌体上，并对其进行筛选以获得特定生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中进行改变(例如置换)，例如以改善抗原结合分子的亲和力。这些改变可在HVR“热点”(即，由在体细胞成熟过程中经历高频率突变的密码子编码的残基)中进行(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))；和/或在接触抗原的残基中进行，其中测试所得的变体VH或VL的结合亲和力。通过构建和从第二文库重新选择来进行的亲和力成熟已于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，(2001))中描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR(error-prone PCR)、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入经选择用于成熟的可变基因中。随后建立第二文库。随后筛选该文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗原结合分子变体。另一引入多样性的方法涉及HVR定向方法，其中若干个HVR残基(例如每次4-6个残基)是随机的。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴别抗原结合中所涉及的HVR残基。特别地，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可在一个或多个HVR内进行，只要这些改变不实质上降低抗原结合分子结合抗原的能力即可。举例来说，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中所提供的保守性置换)。这些改变可以例如在HVR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR未经改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
用于鉴别可被靶向诱变的抗原结合分子的残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或靶残基的组(例如，诸如arg、asp、his、lys和glu的带电荷残基)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以确定抗原结合分子与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的置换。备选地或另外地，可以分析抗原和抗原结合分子的复合物的晶体结构，以鉴定抗原结合分子和抗原之间的接触点。这些接触残基及邻近残基可以作为置换候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定其是否含有所需特性。
氨基酸序列插入包括从一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的长度范围内的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗原结合分子。抗原结合分子的其他插入变体包括酶(例如用于ADEPT的酶)或增加抗原结合分子的血浆半衰期的多肽融合至抗原结合分子的N-或C-末端。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，本文所提供的抗原结合分子被改变，以增加或降低抗原结合分子被糖基化的程度。对抗原结合分子的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便建立或移除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗原结合分子包含Fc区时，则附接于其上的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一般通过N-键附接于Fc区CH2结构域的Asn297的支链双触角寡糖。参见，例如，Wright等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及与双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc附接的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明抗原结合分子中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改良特性的抗原结合分子变体。
在一个实施方案中，提供具有缺乏与Fc区附接(直接或间接)的岩藻糖的糖结构的抗原结合分子变体。举例来说，该抗原结合分子中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于如MALDI-TOF质谱法所测量的所有与Asn 297附接的糖结构(例如复合、杂合及高甘露糖结构)的总和，计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量，例如如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297处(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗原结合分子中的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297的上游或下游约+/-3个氨基酸处，即介于位置294与300之间。这些岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗原结合分子变体有关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基的抗原结合分子的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺乏的Lec13CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1，Presta，L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其实施例11)；和敲除细胞系，例如敲除α1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda等人，Biotechnol.Bioeng，94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)。
进一步提供具有平分型寡糖(bisected oligosaccharide)的抗原结合分子变体，例如其中与抗原结合分子Fc区附接的双触角寡糖被GlcNAc平分。这些抗原结合分子变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这些抗体变体的实例例如在WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等)中描述。也提供在与Fc区附接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗原结合分子变体。这些抗原结合分子变体可具有改善的CDC功能。这些抗原结合分子变体在例如WO1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)和WO 1999/22764(Raju,S.)中描述。
C)Fc区变体
在某些实施方案中，可在本文所提供抗原结合分子的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述人Fc区序列在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)。
在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些但非所有效应子功能的抗原结合分子变体，这使其成为应用的理想候选物，在所述应用中抗原结合分子的体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(例如补体及ADCC)是不必要或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗原结合分子缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达总结于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见，例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。或者，可采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CytoTox 96(注册商标)非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。用于这些测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，感兴趣的分子的ADCC活性可在体内评估，例如，在诸如Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开的动物模型中评估。也可进行C1q结合测定，以证明抗原结合分子不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见，例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合及体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗原结合分子包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个置换的那些抗原结合分子(美国专利号6,737,056)。这些Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了与FcR的结合增加或减少的某些抗原结合分子变体。(参见，例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等人.，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗原结合分子变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的置换。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，增加或减少)，例如，如美国专利号6,194,551，WO 99/51642和Idusogie等人.，J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述具有增加的半衰期及增加的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，其中FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含具有一个或多个置换的Fc区，所述置换增加Fc区与FcRn的结合。这些Fc变体包括在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有置换(例如，Fc区残基434的置换)的那些Fc变体(美国专利号7,371,826)。
还参见Duncan&Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351，它们涉及Fc区变体的其他实例。
d)半胱氨酸工程化的抗原结合分子变体
在某些实施方案中，可能需要建立半胱氨酸工程化的抗原结合分子，例如“thioMAb”，其中抗原结合分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在特定的实施方案中，置换的残基出现在抗原结合分子的可接近位点。通过用半胱氨酸置换那些残基，从而将反应性硫醇基团定位在抗原结合分子的可接近位点，并且该基团可用于将抗原结合分子与其他部分(例如药物部分或接头-药物部分)缀合，以建立如本文进一步所述的免疫缀合物。在某些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化的抗原结合分子可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生。
e)抗原结合分子衍生物
在某些实施方案中，本文所提供的抗原结合分子可经进一步修饰，以含有本领域中已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适于抗原结合分子衍生化的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性可能具有生产优势。聚合物可以是任何分子量的，且可有分支或无分支。与抗原结合分子附接的聚合物的数目可以变化，且若附接多于一个聚合物，则其可以是相同的或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于包括但不限于以下的考虑因素来确定：待改善的抗原结合分子的特定性质或功能、抗原结合分子衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
关于本公开中的抗原结合分子，所需性质(活性)的实例可包括但不特别限于结合活性，中和活性，细胞毒性活性，激动剂活性，拮抗剂活性和酶活性。激动剂活性是细胞内转导信号的活性，例如，通过抗体与抗原诸如受体的结合来诱导一些生理活性的改变。生理活性的实例可以包括但不限于增殖活性，存活活性，分化活性，转录活性，膜转运活性，结合活性，蛋白水解活性，磷酸化/去磷酸化活性，氧化还原活性，转移活性，溶核活性，脱水活性，细胞死亡诱导活性和细胞凋亡诱导活性。
在另一个实施方案中，提供了抗原结合分子与可通过暴露于辐射来选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。该辐射可具有任何波长，且包括但不限于，不损伤普通细胞但能将非蛋白质部分加热至可杀死抗原结合分子-非蛋白质部分附近的细胞的温度的波长。
B.重组方法和组合物
抗原结合分子可以使用重组方法和组合物制备，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本公开中的抗原结合分子(包含本文所述的抗原结合结构域的多肽)的分离的核酸。该核酸可编码包含抗原结合分子VL的氨基酸序列和/或包含抗原结合分子VH的氨基酸序列(例如抗原结合分子的轻链和/或重链)。在进一步的实施方案中，提供了包含该核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含该核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含以下各项(例如已经用以下各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗原结合分子的VL的氨基酸序列和包含抗原结合分子的VH的氨基酸序列，或(2)包含编码含有抗原结合分子的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码含有抗原结合分子的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp2/0细胞)。在一个实施方案中，提供了制备本公开抗原结合分子的方法，其中所述方法包括，在适合抗原结合分子表达的条件下，培养包含编码所述抗原结合分子的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗原结合分子。
为了重组产生本公开的抗原结合分子，分离编码抗原结合分子(例如上文所描述的抗原结合分子)的核酸，并将其插入一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸可以易于使用常规程序分离和测序(例如通过使用能够与编码抗原结合分子重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗原结合分子的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗原结合分子可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。)在表达后，抗原结合分子可以以可溶级分从细菌细胞糊状物中分离，并且可进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是用于编码抗原结合分子的载体的合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗原结合分子。参见Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等人，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适于表达糖基化抗原结合分子的合适的宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。
还可利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中产生抗原结合分子的PLANTIBODIESTM技术)。
也可将脊椎动物细胞用作宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977)中所描述的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，如例如在Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合产生抗原结合分子的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
C.测定
本文提供的抗原结合分子可以通过本领域已知的各种测定法对其物理/化学特征和/或生物学活性进行鉴定、筛选或表征。
1.结合测定和其他测定
在一个方面中，例如通过已知方法如ELISA、蛋白质印迹法等，测试本公开的抗原结合分子的抗原结合活性。
2.活性测定
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的其抗原结合分子的测定法。生物学活性可以包括例如将两个抗原分子保持在空间上接近的位置处的活性，调节两个抗原分子之间相互作用的活性，通过配体促进受体激活的活性，促进酶与底物催化反应的活性，促进表达第一抗原的细胞与表达第二抗原的细胞之间相互作用，促进具有细胞毒性活性的细胞(例如T细胞，NK细胞，单核细胞或巨噬细胞)损伤靶细胞的活性，调节通过彼此缔合而被激活的两个抗原分子的激活的活性，和对蛋白酶切割的抗性。还提供了在体内和/或体外具有这种生物学活性的抗原结合分子。
此外，本公开中的抗原结合分子可以根据与抗原结合分子结合的抗原分子的类型发挥各种生物学活性。这样的抗原结合分子的实例包括与T细胞受体(TCR)复合物结合(例如，CD3)并具有诱导T细胞激活的活性(激动剂活性)的抗原结合分子；以及与TNF受体超家族分子(例如OX40或4-1BB)或其他共刺激分子(例如CD28或ICOS)结合并具有促进上述激活的活性(激动剂活动)的抗原结合分子。在某些实施方案中，通过本发明的抗原结合分子中包含的两个或更多个抗原结合结构域的连接，增强或减弱了通过与抗原分子结合而施加的这种生物学活性。不受理论的限制，在某些实施方案中，由于两个或多个抗原分子之间的相互作用是通过与本公开中抗原结合分子的结合来调节的(例如，促进两个或多个抗原之间的缔合)，因此可以实现这种增强或减弱。
在某些实施方案中，测试本发明的抗原结合分子的这种生物学活性。可以使用由抗原和抗原结合分子组成的复合物的诸如晶体结构分析，电子显微镜和基于电子断层扫描的结构分析等技术来评估两个抗原分子是否在空间上保持接近。还可以通过上述技术评估两个抗原结合结构域在空间上是否彼此接近或者两个抗原结合结构域的迁移率是否降低。具体地，关于使用电子断层扫描分析IgG分子的三维结构的技术，请参见例如，Zhang等人，Sci.Rep.5:9803(2015)。在电子断层扫描中，可以通过直方图显示对象分子可能形成的结构的出现频率，从而可以对结构变化(例如降低的结构域迁移率)进行分布评估。例如，当直方图显示了与结构相关的参数(例如两个结构域之间的距离和角度)可以获取的值之间的关系以及它们的出现频率时，如果它们的分布面积减少，则可以确定两个结构域的迁移率降低。可以通过根据靶抗原分子的类型从已知的活性测量系统中选择并使用适当的活性测量系统来评估通过两个抗原分子的相互作用而发挥的活性。可以使用本领域技术人员已知的方法或以下实施例中描述的方法来评估对蛋白酶切割的作用。
D.药物制剂(药物组合物)
本文所述的抗原结合分子的药物制剂是通过以下制备的：将具有所需纯度的此类抗原结合分子与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合(Remington’sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980))，所述药物制剂为冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl paraben)，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属复合体(例如Zn-蛋白质复合体)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(HYLENEX(注册商标),Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一方面中，sHASEGP与一个或多个另外的葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗原结合分子制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗原结合分子制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文的制剂还可以含有超过一种的活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。此类活性成分以对预期目的有效的量合适地组合存在。
可以将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微胶囊中，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中、胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗乳液中。这些技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗原结合分子的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为定型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可以容易地实现，例如，通过经由无菌滤膜过滤实现。
实施例
以下是本公开的抗原结合分子和方法的实施例。应该理解，在上文提供的一般性描述下，可以实施多种其他的实施方案。
[实施例1]Fab区内具有1个或多个二硫键的抗体的生产、纯化、评价方法的优化
在参考实施例1-25中描述了在抗体的不同位置具有单对半胱氨酸置换的抗体的制备和评估。基于非还原性SDS-PAGE的结果(参考例8-2、9-2、10-2和11-2；也参见图1至4)，发现具有半胱氨酸置换的一些抗体制剂包括两种或更多种在电泳迁移率上不同的结构变体/同种型，即从非还原性SDS-PAGE凝胶图像中观察到的双条带、三条带或若干条带。例如，在G1T4.S191C-IgG1变体(CH1区位置191处的半胱氨酸置换)中观察到两条条带，相对于对应于亲本抗体的条带,新条带(对应于具有在CH1区位置191处的两个Fab之间形成的一个二硫键的抗体制剂)的百分比约为66.3％。结果表明，G1T4.S191C-IgG1变体的抗体制剂包含两种或更多种结构同种型，它们的区别在于工程化半胱氨酸之间形成的一个二硫键，特别是具有“配对半胱氨酸”的同种型或具有“游离或未配对半胱氨酸”的同种型”，可以在重组抗体生产过程中产生。
如下文进一步详细描述的，以下非限制性实施例旨在提供高效且简便的抗体生产、纯化和分析，该抗体具有在抗体的两个Fab之间形成的工程化二硫键；用于增加“配对半胱氨酸”形式(即，具有在抗体的两个Fab之间形成的一个或多个工程化二硫键)的抗体的结构同质性和相对丰度的方法；或用于降低“游离或未配对半胱氨酸”形式(即，在抗体的两个Fab之间没有形成工程化二硫键)的抗体的相对丰度的方法。
实施例1-1生产在Fab区内具有多个额外二硫键的抗体
为了提高具有在抗体CH1区位置191处形成的工程化二硫键的G1T4.S191C-IgG1变体的抗体制备百分比，通过半胱氨酸置换将额外的一个或两个二硫键引入抗人CD3抗体OKT3(重链：OKT3VH0000-G1T4(SEQ ID NO:1242)，轻链：OKT3VL0000-KT0(SEQ ID NO:1243))的重链。
结构上暴露于OKT3重链恒定区(G1T4,SEQ ID NO:1244)表面的氨基酸残基被半胱氨酸置换以产生表1所示的OKT3重链恒定区的变体(G1T4.S191C,SEQ ID NO:1245)。此外，结构上暴露于G1T4.S191C表面的其他氨基酸残基被半胱氨酸置换，以产生表2所示的G1T4.S191C变体。这些重链恒定区各自与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ ID NO:1246)连接以产生OKT3重链变体，并通过本领域已知的方法产生编码相应基因的表达载体。
类似地，结构上暴露于OKT3重链恒定区1(G1T4k,SEQ ID NO:1263)和恒定区2(G1T4h,SEQ ID NO:1264)表面的氨基酸残基分别被半胱氨酸置换以产生表3所示的OKT3重链恒定区的变体。此外，结构上暴露于表3所示变体表面的其他氨基酸残基被半胱氨酸置换以产生表4所示的变体。这些重链恒定区各自与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ ID NO:1246)连接以产生OKT3重链变体，并通过本领域已知的方法产生编码相应基因的表达载体。应当注意的是，在本实施例中，将CH3区的杵臼(KiH)突变引入重链恒定区1和2，以促进异二聚化。
将如上所述产生的OKT3重链变体与OKT3轻链组合。表5和6中所示的OKT3变体通过本领域技术人员已知的方法使用Expi293细胞(Life Technologies)通过瞬时表达进行表达，并通过本领域技术人员已知的方法用Protein A纯化。在本实施例中，将OKT3和OKT3-KiH称为“亲本抗体”，将OKT3.S191C和OKT3-KiH.S191C称为“S191C变体”，将它们的变体分别称为“额外变体”。
[表1]
具有单个半胱氨酸置换的G1T4变体
重链恒定区的变体 半胱氨酸置换的位置(EU编号) SEQ ID NO：
G1T4.S191C 191 1245
[表2]
具有额外半胱氨酸置换的G1T4.S191C变体
Figure BDA0003785290370001271
[表3]
具有单个半胱氨酸置换的G1T4k和G1T4h变体
Figure BDA0003785290370001281
[表4]
具有额外半胱氨酸置换的G1T4k.S191C和G1T4h.S191C变体
Figure BDA0003785290370001282
[表5]
具有半胱氨酸置换的OKT3变体
Figure BDA0003785290370001291
[表6]
具有半胱氨酸置换的OKT3-KiH变体
Figure BDA0003785290370001301
Figure BDA0003785290370001311
实施例1-2评估在Fab区内具有多个额外二硫键的抗体在聚丙烯酰胺凝胶中的电 泳迁移率
通过非还原性SDS-PAGE检查实施例1-1中产生的抗体是否在聚丙烯酰胺凝胶中显示不同的电泳迁移率。
样品缓冲溶液(2ME-)(x4)(Wako；198-13282)用于制备电泳样品。样品在标本浓度50微克/mL、70℃条件下处理10分钟，然后进行非还原性SDS-PAGE。在非还原性SDS-PAGE中，使用4％SDS-PAGE mini 15孔1.0mm 15孔(TEFCO；Cat#01-052-6)在125V下电泳90分钟。然后，将凝胶用CBB染料染色，用ChemiDocTouchMP(BIORAD)捕获凝胶图像，并用Image Lab(BIORAD)定量条带。
凝胶图像如图1至图4所示。在凝胶图像中，在S191C变体中观察到两个条带(“上条带”和“下条带”)，上条带的分子量对应于亲本抗体的分子量。结构变化诸如通过Fab二硫键的交联很可能是由半胱氨酸置换引起的，从而导致电泳迁移率的变化。因此，可以认为下条带对应于具有在CH1区之间形成的一个或多个工程化二硫键的抗体。在具有额外半胱氨酸置换的抗体变体样品中，与S191C变体相比，它们中的大多数显示出更高的下条带与上条带比率。因此，结果表明，表6中列出的S191C变体的额外半胱氨酸置换可能增强/促进Fab的二硫键交联，并且额外的半胱氨酸置换可能是改善或增加具有在抗体CH1区位置191处形成的工程化二硫键的S191C变体的抗体制剂的百分比或结构同质性的有效方法。
[实施例2]Fab区内具有额外二硫键和带电荷突变的抗体的评价
实施例2-1生产在Fab区内具有额外二硫键和带电荷突变的抗体
将一个二硫键和电荷突变引入抗人CD3抗体OKT3(重链：OKT3VH0000-G1T4(SEQ IDNO:1242)，轻链：OKT3VL0000-KT0(SEQ ID NO:1243))的重链。
结构上暴露于OKT3重链恒定区(G1T4,SEQ ID NO:1244)表面的氨基酸残基被半胱氨酸置换以产生表1所示的OKT3重链恒定区的变体(G1T4.S191C,SEQ ID NO:1245)。此外，结构上暴露于G1T4.S191C表面的其他氨基酸残基被带电荷的氨基酸置换，以产生表7所示的G1T4.S191C变体。这些重链恒定区各自与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ ID NO:1246)连接以产生OKT3重链变体，并通过本领域已知的方法产生编码相应基因的表达载体。
[表7]
具有额外带电荷氨基酸置换的G1T4.S191C变体
Figure BDA0003785290370001331
Figure BDA0003785290370001341
Figure BDA0003785290370001351
Figure BDA0003785290370001361
将如上所述产生的OKT3重链变体与OKT3轻链组合。表8中所示的OKT3变体通过本领域已知的方法使用Expi293细胞(Life Technologies)通过瞬时表达进行表达，并通过本领域已知的方法用蛋白A纯化。在本实施例中，OKT3被称为“亲本抗体”，OKT3.S191C被称为“S191C变体”，其变体被称为“带电荷变体”。
[表8]
具有半胱氨酸和带电荷氨基酸置换的OKT3变体
Figure BDA0003785290370001371
Figure BDA0003785290370001381
Figure BDA0003785290370001391
Figure BDA0003785290370001401
实施例2-2评估在Fab区内具有额外二硫键和带电荷突变的抗体在聚丙烯酰胺凝 胶中的电泳迁移率
与实施例1-2类似，用实施例2-1中产生的带电荷变体进行非还原性SDS-PAGE，捕获凝胶图像，并对条带强度进行定量。
在凝胶图像中，在S191C变体中观察到两条条带，上条带的分子量与亲本抗体的分子量相对应。结构变化诸如通过Fab二硫键的交联很可能是由半胱氨酸置换引起的，从而导致电泳迁移率的变化。因此，可以认为下条带对应于具有在CH1区之间形成的一个或多个工程化二硫键的抗体。下条带与上条带的比率如表9所示。在带电荷变体中，与S191C变体相比，它们中的大多数显示出更高的下条带与上条带比率。因此，结果表明，表7中列出的S191C变体的额外带电荷氨基酸突变可能增强/促进Fab的二硫键交联，并且额外带电荷氨基酸突变可能是改善或增加具有在抗体CH1区位置191处形成的工程化二硫键的S191C变体的抗体制剂的百分比或结构同质性的有效方法。
[表9]
具有半胱氨酸和带电荷氨基酸置换的OKT3变体的下条带与上条带的比率
Figure BDA0003785290370001411
Figure BDA0003785290370001421
Figure BDA0003785290370001431
Figure BDA0003785290370001441
[实施例3]Fab区内具有额外二硫键和疏水性突变的抗体的评价
实施例3-1生产在Fab区内具有额外二硫键和疏水性突变的抗体
将一个二硫键和电荷突变引入抗人CD3抗体OKT3(重链：OKT3VH0000-G1T4(SEQ IDNO:1242)，轻链：OKT3VL0000-KT0(SEQ ID NO:1243))的重链。
结构上暴露于OKT3重链恒定区(G1T4,SEQ ID NO:1244)表面的氨基酸残基被半胱氨酸置换以产生表1所示的OKT3重链恒定区的变体(G1T4.S191C,SEQ ID NO:1245)。此外，结构上暴露于G1T4.S191C表面的其他氨基酸残基被疏水性氨基酸置换，以产生表10所示的G1T4.S191C变体。这些重链恒定区各自与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ ID NO:1246)连接以产生OKT3重链变体，并通过本领域已知的方法产生编码相应基因的表达载体。
[表10]
具有疏水性氨基酸置换的G1T4.S191C
Figure BDA0003785290370001451
将如上所述产生的OKT3重链变体与OKT3轻链组合。表11中所示的OKT3变体通过本领域已知的方法使用Expi293细胞(Life Technologies)通过瞬时表达进行表达，并通过本领域已知的方法用蛋白A纯化。在本实施例中，OKT3被称为“亲本抗体”，OKT3.S191C被称为“S191C变体”，并且其变体被称为“疏水性变体”。
[表11]
具有半胱氨酸和疏水性氨基酸置换的OKT3变体
Figure BDA0003785290370001461
Figure BDA0003785290370001471
实施例3-2评估在Fab区内具有额外二硫键和疏水性突变的抗体在聚丙烯酰胺凝 胶中的电泳迁移率
类似于实施例1-2，对实施例3-1中制备的疏水性变体进行非还原性SDS-PAGE，捕获凝胶图像，并定量条带。
在凝胶图像中，在S191C变体中观察到两条条带，并且上条带的分子量与亲本抗体的分子量相对应。结构变化诸如通过Fab二硫键的交联很可能是由半胱氨酸置换引起的，从而导致电泳迁移率的变化。因此，可以认为下条带对应于具有在CH1区之间形成的一个或多个工程化二硫键的抗体。下条带与上条带的比率如表12所示。在疏水性变体中，与S191C变体相比，它们中的大多数显示出更高的下条带与上条带比率。结构变化诸如通过Fab二硫键的交联很可能是由半胱氨酸置换引起的，从而导致电泳迁移率的变化。因此，结果表明，表10中列出的S191C变体的额外疏水性氨基酸突变可能增强/促进Fab的二硫键交联，并且额外疏水性氨基酸突变可能是改善或增加具有在抗体CH1区位置191处形成的工程化二硫键的S191C变体的抗体制剂的百分比或结构同质性的有效方法。
[表12]
具有半胱氨酸和疏水性氨基酸置换的OKT3变体的下条带与上条带的比率
Figure BDA0003785290370001481
Figure BDA0003785290370001491
[实施例4]通过还原试剂诸如2-MEA去半胱氨酸化促进Fab中二硫键形成的效果评价
实施例4-1制备在重链中具有半胱氨酸置换的抗体
抗人IL6R中和抗体MRA的重链中位置191(EU编号)的氨基酸残基被半胱氨酸置换(重链：MRAH-G1T4.S191C(SEQ ID NO:1426，轻链：MRAL-k0(SEQ ID NO:1427)。通过本领域已知的方法产生编码相应基因的表达载体。
抗体通过本领域已知的方法使用Expi293细胞(Life Technologies)通过瞬时表达进行表达，并通过本领域已知的方法用蛋白A纯化。使用Jumbosep离心过滤器(PALL:OD030C65)将其浓缩至24.1mg/mL，以使用高浓度。
实施例4-2制备用2-MEA处理的抗体样品
使用实施例4-1中制备的抗体，检查了用还原试剂诸如2-MEA(2-巯基乙胺)处理/孵育是否可以通过诱导不形成二硫键交联的加帽半胱氨酸残基的去半胱氨酸化来促进Fab中二硫键的形成。
将2-MEA(Sigma-Aldrich：M6500)溶解在25mM NaCl、20mM磷酸钠缓冲液，pH7.0中。将抗体和2-MEA混合至表13中所示的浓度，并在5mM NaCl、20mM磷酸钠缓冲液、pH7.0中于37℃孵育2小时。为了停止还原反应，将含有2-MEA的混合物的缓冲液更换为不含2-MEA的缓冲液。然后，将样品在室温下孵育过夜用于再氧化。
[表13]
每个样品中抗体和2-MEA的浓度
Figure BDA0003785290370001501
实施例4-3用抗体和2-MEA评估各浓度样品在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率
通过非还原性SDS-PAGE检查实施例4-2中制备的用2-MEA处理的抗体样品在聚丙烯酰胺凝胶中是否表现出不同的电泳迁移率(即不同的下带与上带比率)。
样品缓冲溶液(2ME-)(x4)(Wako；198-13282)用于制备电泳样品。样品在标本浓度100微克/mL、70℃条件下处理10分钟，然后进行非还原性SDS-PAGE。在非还原性SDS-PAGE中，使用4％SDS-PAGE mini 15孔1.0mm 15孔(TEFCO；01-052-6)在125V下电泳90分钟。然后，将凝胶用CBB染料染色，用ChemiDocTouchMP(BIORAD)捕获凝胶图像，并用Image Lab(BIORAD)定量条带。
凝胶图像如图5至图8所示。在凝胶图像中，在没有(0mM)还原试剂的样品中观察到两条条带(对照；每张图中的泳道3)，以及上部条带的分子量对应于亲本抗体。结构变化诸如通过Fab二硫键的交联很可能是由半胱氨酸置换引起的，从而导致电泳迁移率的变化。因此，可以认为下条带对应于具有在CH1区之间形成的一个或多个工程化二硫键的抗体。结果表明，与未经2-MEA处理的抗体样品相比，用2-MEA处理/孵育的大多数抗体样品显示出较高的下条带与上条带比率。结果表明，将抗体与还原试剂(如2-MEA)孵育可能是改善或增加具有在抗体CH1区位置191处形成的工程化二硫键的S191C变体的抗体制剂的百分比或结构同质性的有效方法。
[实施例5]通过还原试剂诸如TCEP去半胱氨酸化促进Fab中二硫键形成的效果评价
实施例5-1制备用TCEP处理的抗体样品
使用实施例4-1中制备的抗体，检查了用还原试剂诸如TCEP处理/孵育是否可以通过诱导不形成二硫键交联的加帽半胱氨酸残基的去半胱氨酸化来促进Fab中二硫键的形成。
将TCEP(Sigma-Aldrich:C4706)溶解在超纯水中并用NaOH将pH值调节至7。将抗体和TCEP混合至表14中所示的浓度，并在5mM NaCl、20mM磷酸钠缓冲液、pH7.0中于37℃孵育2小时。为了停止还原反应，将含有TCEP的混合物的缓冲液更换为不含TCEP的缓冲液。然后，将样品在室温(RT)下孵育过夜用于再氧化。
[表14]
每个样品中抗体和TCEP的浓度
Figure BDA0003785290370001521
实施例5-2用抗体和TCEP评估各浓度样品在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率
类似于实施例4-3，对实施例5-1中用TCEP处理的抗体样品进行非还原性SDS-PAGE，捕获凝胶图像，并定量条带。
凝胶图像如图9至图11所示。在凝胶图像中，在没有(0mM)还原试剂的样品中观察到两条条带(对照；每张图中的泳道3)，以及上条带的分子量对应于亲本抗体。结构变化诸如通过Fab二硫键的交联很可能是由半胱氨酸置换引起的，从而导致电泳迁移率的变化。因此，可以认为下条带对应于具有在CH1区之间形成的一个或多个工程化二硫键的抗体。结果表明，与未经TCEP处理的抗体样品相比，用TCEP孵育/处理的大多数样品显示出更高的下条带与上条带比率。结果表明，将抗体与还原试剂(如TCEP)孵育可能是改善或增加具有在抗体CH1区位置191处形成的工程化二硫键的S191C变体的抗体制剂的百分比或结构同质性的有效方法。
[实施例6]通过其他还原试剂去半胱氨酸化促进Fab中二硫键形成的效果评价
实施例6-1使用4种还原试剂制备反应样品
使用实施例1-1中制备的抗体，检查了四种不同的还原试剂(即DTT、半胱氨酸、GSH、Na2SO3)是否可以通过诱导不形成二硫键交联的加帽半胱氨酸残基的去半胱氨酸化来促进Fab中二硫键的形成。
将DTT(Wako:040-29223)、L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich:168149)、谷胱甘肽(Wako:077-02011)和Na2SO3(Wako:198-03412)溶解在25mM NaCl、20mM磷酸钠缓冲液中，pH7.0。用HCl将Na2SO3调节至pH 7。将抗体和每种还原试剂混合至表15中所示的浓度，并在5mM NaCl、20mM磷酸钠缓冲液、pH7.0中于室温(RT)下孵育过夜。为了停止还原反应，将含有每种还原试剂的混合物的缓冲液更换为不含还原试剂的缓冲液。然后，将样品在室温下孵育过夜用于再氧化。
[表15]
每个样品中抗体和还原剂的浓度
Figure BDA0003785290370001541
实施例6-2用抗体和4种还原试剂评估各浓度样品在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁 移率
类似于实施例4-3，对实施例6-1中制备的抗体样品进行非还原性SDS-PAGE，捕获凝胶图像，并定量条带。
凝胶图像如图12和图13所示。在凝胶图像中，在没有(0mM)还原试剂的样品中观察到两条条带(对照；每张图中的泳道3)，以及上条带的分子量对应于亲本抗体。结构变化诸如通过Fab二硫键的交联很可能是由半胱氨酸置换引起的，从而导致电泳迁移率的变化。因此，可以认为下条带对应于具有在CH1区之间形成的一个或多个工程化二硫键的抗体。
结果表明，与没有还原试剂处理的抗体样品相比，用不同还原试剂(DTT、半胱氨酸、GSH和Na2SO3)孵育/处理的样品都显示出更高的下条带与上条带比率。结果表明，将抗体与还原试剂孵育可能是改善或增加具有在抗体CH1区位置191处形成的工程化二硫键的S191C变体的抗体制剂的百分比或结构同质性的有效方法。
[实施例7]还原试剂诸如2-MEA和TCEP在不同pH缓冲液中的去半胱氨酰化效果评价
实施例7-1制备用2-MEA和TCEP处理的抗体样品
使用实施例4-1中制备的抗体，检查2-MEA和TCEP是否可以在各种pH条件下促进Fab中二硫键的形成。
将2-MEA(Sigma-Aldrich：M6500)和TCEP(Sigma-Aldrich：C4706)溶解在25mMNaCl、20mM磷酸钠缓冲液，pH7.0中。特别是，用NaOH将TCEP的pH值调节到7。在表16所示的每个pH条件下，将20mg/mL抗体与1mM 2-MEA或0.25mM TCEP混合。pH缓冲液的组成如下：50mM乙酸pH3.1，50mM乙酸用1M Tris碱调节至pH4.0，50mM乙酸用1M Tris碱调节至pH5.0，25mMNaCl，20mM磷酸钠缓冲液pH6.0，25mM NaCl，20mM磷酸钠缓冲液pH7.0，25mM NaCl，20mM磷酸钠缓冲液pH8.0。混合样品在每个pH缓冲液中于37摄氏度孵育2小时。为了停止还原反应，将含有还原试剂的混合物的缓冲液更换为不含还原试剂的缓冲液。然后，将样品在室温下孵育过夜用于再氧化。
[表16]
每个样品中包含抗体和还原剂的反应缓冲液的pH
Figure BDA0003785290370001561
实施例7-2评估每种pH缓冲液中样品在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率
类似于实施例4-3，对实施例7-1中制备的反应样品进行非还原性SDS-PAGE，捕获凝胶图像，并定量条带。
凝胶图像如图14至图16所示。在凝胶图像中，在没有(0mM)还原试剂的样品中观察到两条条带(对照；每个图中的泳道3、6和9)，以及上条带的分子量对应于亲本抗体。结构变化诸如通过Fab二硫键的交联很可能是由半胱氨酸置换引起的，从而导致电泳迁移率的变化。因此，可以认为下条带对应于具有在CH1区之间形成的一个或多个工程化二硫键的抗体。
结果显示，与没有还原试剂处理的抗体样品相比，在不同pH条件下用还原试剂孵育/处理的抗体样品显示出更高的下条带与上条带比率。
[实施例8]阳离子交换层析分离交联的OKT3.S191C及其变体
实施例8-1通过阳离子交换层析的OKT3.S191C的分级(Fractionation)
在UltiMate 3000 UHPLC系统(Thermo Scientific Dionex)上以0.5ml/min的流速在ProPacTM WCX-10 BioLC柱4mm x 250mm(Thermo)上进行阳离子交换层析(CIEX)。柱温设定为40摄氏度。用35％流动相A(CX-1pH梯度缓冲液A,pH5.6,Thermo)与65％流动相B(CX-1pH梯度缓冲液B,pH10.2,Thermo)混合平衡层析柱后，加载80微克OKT3.S191C(重链：OKT3VH0000-G1T4.S191C(SEQ ID NO:1428)，轻链：OKT3VL0000-KT0(SEQ ID NO:1243))。然后用65％至85％流动相B的线性梯度洗脱柱子20分钟。通过UV检测器(280nm)进行检测。进行了四次进样，在11到17分钟之间总共收集了12个级分，以30秒的间隔取样(图17)。使用非还原性SDS-PAGE(如实施例7-2中所述)浓缩和评估每个级分。使用ChromeleonTM 6.8(Thermo Scientific Dionex)分析色谱图。
如非还原性SDS-PAGE数据(图18)所示，酸性峰包含非交联的Fab(上条带)，而主峰仅包含交联的Fab(下条带)。这表明未交联的物质洗脱得更快(在级分RA3-6中)，并且可以使用阳离子交换层析法将交联的Fab从它们中分离出来。
实施例8-2通过阳离子交换层析的OKT3.S191C0110的分级(Fractionation)
在UltiMate 3000 UHPLC系统(Thermo Scientific Dionex)上以0.5ml/min的流速在ProPacTM WCX-10 BioLC柱4mm x 250mm(Thermo)上进行阳离子交换层析(CIEX)。柱温设定为40摄氏度。用35％流动相A(CX-1 pH梯度缓冲液A,pH5.6,Thermo)与65％流动相B(CX-1 pH梯度缓冲液B,pH10.2,Thermo)混合平衡层析柱后，加载约100微克OKT3.S191C0110(重链：OKT3VH0000-G1T4.S191C0110(SEQ ID NO:1429)，轻链：OKT3VL0000-KT0(SEQ ID NO:1243))。然后用65％至100％流动相B的线性梯度洗脱柱子20分钟。通过UV检测器(280nm)进行检测。进行了三次进样，在10和30分钟之间总共收集了40个级分，以30秒的间隔取样(图19)。使用非还原性SDS-PAGE(实施例7-2中所述)浓缩和评估每个级分。使用ChromeleonTM 6.8(Thermo Scientific Dionex)分析色谱图。
如SDS-PAGE数据(图20)所示，在酸性峰和碱性峰中观察到具有非交联Fab的抗体种类(上条带)，而主峰仅包含具有交联Fab的抗体种类(下条带)。这表明额外的电荷突变影响了具有非交联Fab的抗体种类中的表面电荷。阳离子交换层析法是纯化具有交联Fab的抗体的有用工具。
[实施例9]Fab区内具有额外二硫键和带电荷突变的抗体的评价
实施例9-1制备在Fab区内具有额外二硫键和带电荷突变的抗体
将一个二硫键和带电荷突变引入抗人CD3抗体OKT3(重链：OKT3VH0000-G1T4(SEQID NO:1242)，轻链：OKT3VL0000-KT0(SEQ ID NO:1243))的重链。
结构上暴露于OKT3重链恒定区(G1T4,SEQ ID NO:1244)表面的氨基酸残基被半胱氨酸置换以产生OKT3重链恒定区的变体(G1T4.S191C,SEQ ID NO:1245)。此外，结构上暴露于G1T4.S191C表面的CH1-CH1界面氨基酸残基被带电荷氨基酸置换(图62A)，以产生表82所示的G1T4.S191C变体。这些重链恒定区各自与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ ID NO:1246)连接以产生OKT3重链变体，并通过本领域已知的方法产生编码相应基因的表达载体。
[表82]
具有带电荷氨基酸置换的G1T4.S191C变体
Figure BDA0003785290370001591
Figure BDA0003785290370001601
将以上产生的OKT3重链变体与OKT3轻链组合。表83中所示的OKT3变体通过本领域已知的方法使用Expi293细胞(Life Technologies)通过瞬时表达进行表达，并通过本领域已知的方法用蛋白A纯化。在本实施例中，OKT3被称为“亲本抗体”，OKT3.S191C被称为“S191C变体”，其变体被称为“带电荷变体”。
[表83]
具有半胱氨酸和带电荷氨基酸置换的OKT3变体
Figure BDA0003785290370001611
Figure BDA0003785290370001621
实施例9-2评估在Fab区内具有额外二硫键和带电荷突变的抗体在聚丙烯酰胺凝 胶中的电泳迁移率
类似于实施例1-2，对实施例9-1中制备的带电荷变体进行非还原性SDS-PAGE，捕获凝胶图像，并定量条带。
在凝胶图像中，在S191C变体中观察到两条条带，并且上条带的分子量与亲本抗体的分子量相似。下条带与上条带的比率如表84所示。在带电荷变体中，与S191C变体相比，它们中的大多数显示出更高的下条带与上条带比率。结构变化诸如通过Fab二硫键的交联很可能是由半胱氨酸置换引起的，从而导致电泳迁移率的变化。因此，对S191C变体的额外带电荷突变可能会增强Fab的交联。
[表84]
具有半胱氨酸和带电荷氨基酸置换的OKT3变体的下条带与上条带的比率
Figure BDA0003785290370001631
Figure BDA0003785290370001641
实施例9-3通过阳离子交换层析评估在Fab区内具有额外二硫键和带电荷突变的 抗体的峰分离
在Alliance HPLC系统(Waters)上以0.5ml/min的流速在ProPacTM WCX-10BioLC柱4mm x 250mm(Thermo)上进行阳离子交换层析(CIEX)。柱温设定为40摄氏度。用35％流动相A(CX-1pH梯度缓冲液A,pH5.6,Thermo)与65％流动相B(CX-1pH梯度缓冲液B,pH10.2,Thermo)混合平衡柱后，加载实施例9-1中产生的80微克带电荷变体。然后用65％至100％流动相B的线性梯度洗脱柱子35分钟。通过UV检测器(280nm)进行检测。CIEX的色谱图如图58和59所示。
在图58和59中，在一些带电荷变体中观察到与图19相似的峰模式，其可以分离交联和非交联的Fab。S191C变体的额外带电荷突变很可能不仅可以增强Fab的交联，还可以增强通过CIEX的交联和非交联Fab的分离。另请参见图62B。
[实施例10]Fab区内具有额外二硫键和带电荷突变的不同抗体的评价
实施例10-1制备在Fab区内具有额外二硫键和带电荷突变的不同抗体
将一个二硫键和带电荷突变引入抗人CD3抗体OKT3(重链：OKT3VH0000-G1T4(SEQID NO:1242)，轻链：OKT3VL0000-KT0(SEQ ID NO:1243))的重链。类似地，将一个二硫键和带电荷突变引入抗人IL-6R抗体MRA(重链：MRAH-G1T4(SEQ ID NO:15)，轻链：MRAL-k0(SEQID NO:16))的重链。
结构上暴露于OKT3和MRA重链恒定区(G1T4,SEQ ID NO:1244)表面的氨基酸残基被半胱氨酸置换以产生OKT3重链恒定区的变体(G1T4.S191C,SEQ ID NO:1245)。此外，结构上暴露于G1T4.S191C表面的CH1-CH1界面氨基酸残基被带电荷氨基酸置换(图62A)，以产生表85所示的G1T4.S191C变体。这些重链恒定区各自与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ IDNO:1246)和MRA重链可变区(MRAH,SEQ ID NO:P17)连接以产生OKT3和MRA重链变体，并通过本领域已知的方法产生编码相应基因的表达载体。
[表85]
具有带电荷氨基酸置换的G1T4.S191C变体
Figure BDA0003785290370001661
将上述产生的OKT3和MRA重链变体分别与OKT3和MRA轻链组合。表86中所示的OKT3和MRA变体通过本领域已知的方法使用Expi293细胞(Life Technologies)通过瞬时表达进行表达，并通过本领域已知的方法用蛋白A纯化。在本实施例中，将OKT3和MRA称为“亲本抗体”，将OKT3.S191C和MRA.S191C称为“S191C变体”，并将它们的变体称为“带电荷变体”。
[表86]
具有半胱氨酸和带电荷氨基酸置换的OKT3和MRA变体
Figure BDA0003785290370001671
实施例10-2评估在Fab区内具有额外二硫键和带电荷突变的不同抗体在聚丙烯酰 胺凝胶中的电泳迁移率
通过非还原性SDS-PAGE检查实施例10-1中产生的抗体是否在聚丙烯酰胺凝胶中显示不同的电泳迁移率。
样品缓冲溶液(2ME-)(x4)(Wako；198-13282)用于制备电泳样品。样品在标本浓度75微克/mL、70℃条件下处理10分钟，然后进行非还原性SDS-PAGE。在非还原性SDS-PAGE中，使用4％SDS-PAGE mini 15孔1.0mm 15孔(TEFCO；Cat#01-052-6)在126V下电泳90分钟。然后，将凝胶用CBB染料染色，用ChemiDocTouchMP(BIORAD)捕获凝胶图像，并用Image Lab(BIORAD)定量条带。
在凝胶图像中，在S191C变体中观察到两条条带，并且上条带的分子量与亲本抗体的分子量相似。下条带与上条带的比率显示在表87中，并绘制在图60中所示的散点图中。观察到OKT3和MRA中下条带与上条带的比率之间的良好相关性。因此，对S191C变体的额外带电荷突变可能不仅增强OKT3的Fab交联，而且增强与其他抗原(如MRA)结合的其他抗体的Fab交联。
[表87]
具有半胱氨酸和带电荷氨基酸置换的OKT3和MRA变体的下条带与上条带的比率
原始抗体 OKT3变体的名称 下条带与上条带的比率(％)
OKT3 OKT3 0
OKT3 OKT3.S191C 72.4
OKT3 OKT3.S191C0159 80.9
OKT3 OKT3.S191C0161 83.0
OKT3 OKT3.S191C0162 83.3
OKT3 OKT3.S191C0164 78.7
OKT3 OKT3.S191C0165 81.0
OKT3 OKT3.S191C0167 79.6
OKT3 OKT3.S191C0177 80.5
OKT3 OKT3.S191C0179 79.9
OKT3 OKT3.S191C0180 83.9
OKT3 OKT3.S191C0182 77.8
OKT3 OKT3.S191C0183 88.0
OKT3 OKT3.S191C0185 84.8
MRA MRA 0
MRA MRA.S191C 70.8
MRA MRA.S191C0159 80.3
MRA MRA.S191C0161 78.8
MRA MRA.S191C0162 81.6
MRA MRA.S191C0164 77.7
MRA MRA.S191C0165 78.0
MRA MRA.S191C0167 76.7
MRA MRA.S191C0177 80.5
MRA MRA.S191C0179 78.9
MRA MRA.S191C0180 81.4
MRA MRA.S191C0182 82.7
MRA MRA.S191C0183 88.9
MRA MRA.S191C0185 80.9
实施例10-3通过阳离子交换层析评估在Fab区内具有额外二硫键和带电荷突变的 不同抗体的峰分离
在Alliance HPLC系统(Waters)上以0.5ml/min的流速在ProPacTM WCX-10 BioLC柱4mm x 250mm(Thermo)上进行阳离子交换层析(CIEX)。柱温设定为40摄氏度。用45％流动相A(CX-1 pH梯度缓冲液A，pH5.6，Thermo)与55％流动相B(CX-1pH梯度缓冲液B,pH10.2,Thermo)混合平衡柱后，加载实施例10-1中产生的80微克带电荷变体。然后用55％至95％流动相B的线性梯度洗脱柱子40分钟。通过UV检测器(280nm)进行检测。CIEX的色谱图如图61A和61B所示。
在图61A和61B中，观察到OKT3和MRA变体之间的相似峰模式。因此，对S191C变体的额外带电荷突变可能不仅增强OKT3的交联和非交联Fab之间的分离，而且还增强与其他抗原(如MRA)结合的其他抗体的交联和非交联Fab之间通过CIEX的分离。
[参考实施例1]Fab交联抗体的概念
与天然配体及其融合蛋白相比，激动剂抗体在诸如稳定性、药代动力学和生产方法等方面具有优越的性能，并且它们的药物开发正在进行中。然而，通常，具有强活性的激动剂抗体比仅结合抗体或中和抗体更难获得。因此，需要解决该问题的方法。
激动剂抗体所需的性质可能取决于配体的类型。对于针对以死亡受体(DR)，OX40、4-1BB，CD40等为代表的TNF受体超家族的激动剂抗体，据报道，抗体或配体的多聚化有助于激活。作为提高该效果的技术，据报道以下技术可以增强激动剂活性：使用天然配体，通过抗-Fc抗体的交联，通过FcγR的交联，抗体结合结构域的多聚化，通过抗体Fc的多聚化等。还已知的是，对于某些类型的抗原，使用抗体Fab结构或scFv调节抗原结合位点的距离会导致激动剂活性的增强，而与多聚化无关。
作为另一种技术，已经报道了针对细胞因子受体的激动剂抗体，该激动剂抗体是能够结合相同抗原内的不同表位的双特异性抗体。此外，已经报道了通过使用化学缀合以相似的方式交联两个不同的Fab来改善激动剂活性的方法。
除了以上提到的那些方法，还需要更多的方法来改善激动剂抗体的活性。但是，尚未报道实现这一目标的简单方法。因此，发明人开发了一种通过引入最小突变使Fab彼此交联的方法，并证明了这实际上增强了激动剂活性，从而完成了本发明。在图21中示出了示例性实施方案。
[参考实施例2]修饰抗体的表达载体的制备，以及修饰抗体的表达和纯化
使用PCR，In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(TAKARA)等通过本领域技术人员已知的方法，对插入动物细胞表达载体中的抗体基因进行氨基酸残基序列置换，以构建修饰抗体的表达载体。通过本领域技术人员已知的方法确定所得表达载体的核苷酸序列。将产生的表达载体瞬时导入FreeStyle293(注册商标)或Expi293(注册商标)细胞(Invitrogen)中，并使细胞在培养上清液中表达修饰的抗体。使用rProtein A Sepharose(注册商标)Fast Flow(GE Healthcare)，通过本领域技术人员已知的方法从获得的培养上清液中纯化修饰抗体。使用分光光度计测量280nm处的吸光度。使用PACE法由测量值计算吸收系数，并用于计算抗体浓度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
通过本领域技术人员已知的方法，使用用于HPLC的Agilent 1260 Infinity(注册商标)(Agilent Technologies)和作为凝胶过滤色谱柱的G3000SWXL(TOSOH)，来分析修饰抗体的聚集体的量。纯化的抗体的浓度为0.1mg/mL，并注入10μL的抗体。
表17显示了通过这种方法制备的抗体(抗CD3ε抗体，抗CD28抗体和抗CD3εx抗CD28双特异性抗体)。
[表17]
抗体名称，序列号
Figure BDA0003785290370001721
HH：在两个H链恒定区中将位置191(EU编号)更改为Cys
LL：在两个L链恒定区中将位置126(EU编号)更改为Cys
HL，LH：在一个H链恒定区中将位置191(EU编号)更改为Cys，并且在一个L链恒定区中将位置126(EU编号)更改为Cys
[参考实施例3]双特异性抗体的制备
将纯化的抗体透析到TBS(WAKO)缓冲液中，并将其浓度调整为1mg/mL。制备10x反应缓冲液250mM 2-MEA(SIGMA)。将参考实施例2中制备的两种不同的同型二聚体抗体等量混合。向该混合物中，加入1/10体积的10x反应缓冲液并混合。使混合物在37℃下静置90分钟。反应后，将混合物透析到TBS中以获得双特异性抗体的溶液，其中上述两种不同的抗体被异二聚化。通过上述方法测量抗体浓度，并对抗体进行后续实验。
[参考实施例4]激动剂活性的评估
参考实施例4-1 Jurkat细胞悬浮液的制备
从烧瓶中收集Jurkat细胞(TCR/CD3效应细胞(NFAT)，Promega)。用测定缓冲液(RPMI 1640培养基(Gibco)，10％FBS(HyClone)，1％MEM非必需氨基酸(Invitrogen)和1mM丙酮酸钠(Invitrogen))洗涤细胞，然后以3x106细胞/mL悬浮在测定缓冲液中。对该Jurkat细胞悬浮液进行后续实验。
参考实施例4-2：发光试剂溶液的制备
将100mL的Bio-Glo萤光素酶测定缓冲液(Promega)添加到Bio-Glo萤光素酶测定底物(Promega)的瓶中，并颠倒混合。将瓶避光，并在-20℃冷冻。对该发光试剂溶液进行后续实验。
参考实施例4-3 T细胞激活测定
基于萤光素酶发光的倍数变化，评估通过激动剂信号传导的T细胞激活。前述Jurkat细胞是用具有NFAT响应序列的萤光素酶报道基因转化的细胞。当细胞被抗TCR/CD3抗体刺激时，NFAT途径通过细胞内信号传导被激活，从而诱导萤光素酶表达。将如上所述制备的Jurkat细胞悬浮液以每孔10μL(3x104个细胞/孔)的浓度添加到384孔平底白板中。接着，以每孔20μL添加以各自浓度(150,15,1.5,0.15,0.015,0.0015,0.00015,0.000015nM)制备的抗体溶液。将该板在5％CO2培养箱中于37℃下静置24小时。温育后，将发光试剂溶液解冻，并且将30μL溶液添加到每个孔中。然后将板在室温下静置10分钟。使用光度计测量板的每个孔中的萤光素酶发光。
结果，与野生型分子(未修饰的分子)相比，具有连接抗CD3ε抗体的Fab-Fab的额外的二硫键的修饰分子显示出变化的CD3介导的信号传导，如图22和23所示。此外，如图24和25所示，与野生型分子相比，由抗CD3ε抗体和抗CD28抗体组成的具有连接Fab-Fab的额外二硫键的双特异性抗体的修饰分子还显示出差异很大的CD3和/或CD28介导的信号传导。
这些结果表明，引入本发明的修饰可以增强或减少抗原结合分子例如抗体所具有的激动剂活性。
[参考实施例5]评估在重链的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
参考实施例5-1：评估在重链的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
对抗人IL6R中和抗体MRA(重链：MRAH-G1T4(SEQ ID NO:15)，轻链：MRAL-k0(SEQID NO:16))的重链可变区和恒定区进行研究，其中在结构上暴露于表面的任意氨基酸残基被半胱氨酸置换。
用半胱氨酸置换MRA重链可变区(MRAH，SEQ ID NO:17)中的氨基酸残基，以产生表18所示的MRA重链可变区变体。将这些MRA重链可变区变体各自与MRA的重链恒定区(G1T4，SEQ ID NO:18)连接以产生MRA重链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法产生编码相应基因的表达载体。
另外，将MRA的重链恒定区(G1T4，SEQ ID NO:18)中的氨基酸残基置换为半胱氨酸，以产生表19中所示的MRA重链恒定区变体。将这些MRA重链恒定区变体各自与MRA的重链可变区(MRAH,SEQ ID NO:17)连接以产生MRA重链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法产生编码相应基因的表达载体。
将以上产生的MRA重链变体与MRA轻链结合。表20中所示的所得MRA变体使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(Life Technologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达来表达，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。
[表18]
MRA重链可变区的变体和半胱氨酸置换的位置
Figure BDA0003785290370001751
Figure BDA0003785290370001761
[表19]
MRA重链恒定区的变体和半胱氨酸置换的位置
Figure BDA0003785290370001771
Figure BDA0003785290370001781
Figure BDA0003785290370001791
[表20]
Figure BDA0003785290370001801
Figure BDA0003785290370001811
Figure BDA0003785290370001821
Figure BDA0003785290370001831
Figure BDA0003785290370001841
参考实施例5-2：评估在重链的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体的蛋白酶介 导的Fab片段化
使用切割抗体的重链铰链区以引起Fab片段化的蛋白酶，检查参考实施例5-1中制备的MRA变体是否获得蛋白酶抗性从而抑制其片段化。所用的蛋白酶是Lys-C(内切蛋白酶Lys-C测序级)(SIGMA；11047825001)。反应在2ng/μL蛋白酶、100μg/mL抗体、80％25mMTris-HCl pH 8.0、20％PBS和35℃的条件下进行2小时，或在2ng/μL蛋白酶、20μg/mL抗体、80％25mM Tris-HCl pH 8.0、20％PBS和35℃的条件下进行1小时。然后将样品进行非还原性毛细管电泳。Wes(Protein Simple)用于毛细管电泳，并且HRP标记的抗κ链抗体(abcam；ab46527)用于检测。结果示于图26至图33中。MRA的Lys-C处理导致重链铰链区的切割，导致IgG的条带在约150kDa处消失，并且Fab的条带在约50kDa处出现。对于参考实施例5-1中制备的MRA变体，在蛋白酶处理后，一些显示在大约96kDa处出现的Fab二聚体条带，并且一些显示在大约150kDa处检测到的未消化的IgG条带。使用专用于Wes的软件(Compass for SW；Protein Simple)输出蛋白酶处理后获得的每个条带的面积，以计算未消化的IgG、Fab二聚体等的条带面积百分比。每个条带的计算百分比显示在表21中。
[表21]
Figure BDA0003785290370001851
Figure BDA0003785290370001861
Figure BDA0003785290370001871
Figure BDA0003785290370001881
从该结果发现，在表22所示的MRA变体中，重链可变区或重链恒定区中的半胱氨酸置换改善了重链铰链区的蛋白酶抗性。备选地，该结果表明Fab二聚体是通过Fab-Fab之间的共价键形成的。
[表22]
Figure BDA0003785290370001891
Figure BDA0003785290370001901
[参考实施例6]评估在轻链的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
参考实施例6-1：评估在轻链的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
对抗人IL6R中和抗体MRA(重链：MRAH-G1T4(SEQ ID NO:15)，轻链：MRAL-k0(SEQID NO:16))的轻链可变区和恒定区进行研究，其中在结构上暴露于表面的任意氨基酸残基被半胱氨酸置换。
用半胱氨酸置换MRA轻链可变区(MRAL,SEQ ID NO:19)中的氨基酸残基，以产生表23所示的MRA轻链可变区变体。将这些MRA轻链可变区变体各自与MRA的轻链恒定区(k0,SEQID NO:20)连接以产生MRA轻链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
另外，将MRA的轻链恒定区(k0,SEQ ID NO:20)中的氨基酸残基置换为半胱氨酸，以制备表24中所示的MRA轻链恒定区变体。将这些MRA轻链恒定区变体各自与MRA的轻链可变区(MRAL,SEQ ID NO:19)连接以产生MRA轻链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
将以上制备的MRA轻链变体与MRA重链组合。表25中所示的所得MRA变体是使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(Life Technologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达而表达的，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。
[表23]
MRA轻链可变区的变体和半胱氨酸置换的位置
Figure BDA0003785290370001911
Figure BDA0003785290370001921
[表24]
MRA轻链恒定区的变体和半胱氨酸置换的位置
Figure BDA0003785290370001931
Figure BDA0003785290370001941
Figure BDA0003785290370001951
[表25]
Figure BDA0003785290370001961
Figure BDA0003785290370001971
Figure BDA0003785290370001981
Figure BDA0003785290370001991
Figure BDA0003785290370002001
参考实施例6-2：评估在轻链的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体的蛋白酶介 导的Fab片段化
使用切割抗体的重链铰链区以引起Fab片段化的蛋白酶，检查参考实施例6-1中制备的MRA变体是否获得蛋白酶抗性从而抑制其片段化。所用的蛋白酶是Lys-C(内切蛋白酶Lys-C测序级)(SIGMA；11047825001)。反应在2ng/μL蛋白酶、100μg/mL抗体、80％25mMTris-HCl pH 8.0、20％PBS和35℃的条件下进行2小时，或在2ng/μL蛋白酶、20μg/mL抗体、80％25mM Tris-HCl pH 8.0、20％PBS和35℃的条件下进行1小时。然后将样品进行非还原性毛细管电泳。Wes(Protein Simple)用于毛细管电泳，并且HRP标记的抗κ链抗体(abcam；ab46527)用于检测。结果示于图24至图43中。MRA的Lys-C处理导致重链铰链区的切割，导致IgG的条带在约150kDa处消失，并且Fab的条带在约50kDa处出现。对于参考实施例6-1中制备的MRA变体，在蛋白酶处理后，一些显示在大约96kDa处出现的Fab二聚体条带，并且一些显示在大约150kDa处检测到的未消化的IgG条带。使用专用于Wes的软件(Compass for SW；Protein Simple)输出蛋白酶处理后获得的每个条带的面积，以计算未消化的IgG、Fab二聚体等的条带面积百分比。每个条带的计算百分比显示在表26中。
[表26]
Figure BDA0003785290370002021
Figure BDA0003785290370002031
Figure BDA0003785290370002041
Figure BDA0003785290370002051
Figure BDA0003785290370002061
从该结果发现，在表27所示的MRA变体中，轻链可变区或轻链恒定区中的半胱氨酸置换改善了重链铰链区的蛋白酶抗性。备选地，该结果表明Fab二聚体是通过Fab-Fab之间的共价键形成的。
[表27]
Figure BDA0003785290370002071
[参考实施例7]评估具有半胱氨酸置换的抗体的方法的研究
参考实施例7-1：制备在轻链中具有半胱氨酸置换的抗体
抗人IL6R中和抗体MRA(重链：MRAH-G1T4(SEQ ID NO:15)，轻链：MRAL-k0(SEQ IDNO:16)的轻链恒定区(k0,SEQ ID NO:20)中根据Kabat编号位置126处的氨基酸残基被半胱氨酸置换，以产生MRA轻链恒定区变体k0.K126C(SEQ ID No:231)。将该MRA轻链恒定区变体与MRA轻链可变区(MRAL,SEQ ID NO:19)连接以产生MRA轻链变体，并通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
将以上制备的MRA轻链变体与MRA重链组合。所得的MRA变体MRAL-k0.K126C(重链：MRAH-G1T4(SEQ ID NO:15)，轻链可变区：MRAL(SEQ ID NO:19)，轻链恒定区：k0.K126C(SEQID NO:231))使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(Life Technologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达而表达，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。
参考实施例7-2：评估轻链中具有半胱氨酸置换的抗体的蛋白酶介导的毛细管电 泳
使用切割抗体的重链铰链区以引起Fab片段化的蛋白酶，检查参考实施例7-1中制备的MRA轻链变体是否获得蛋白酶抗性从而抑制其片段化。所用的蛋白酶是Lys-C(内切蛋白酶Lys-C测序级)(SIGMA；11047825001)。在0.1、0.4、1.6或6.4ng/μL蛋白酶，100μg/mL抗体，80％25mM Tris-HCl pH 8.0，20％PBS和35℃的条件下进行反应2小时。然后将样品进行非还原性毛细管电泳。Wes(Protein Simple)用于毛细管电泳，并且HRP标记的抗κ链抗体(abcam；ab46527)或HRP标记的抗人Fc抗体(Protein Simple；043-491)用于检测。结果显示在图44中。对于用Lys-C处理的MRA，用抗κ链抗体进行的检测显示在约150kDa处条带消失，在约50kDa处出现新条带，并且在低Lys-C浓度下也显示在113kDa处出现弱条带。用抗人Fc抗体进行的检测显示在约150kDa处条带消失，在约61kDa处出现新条带，并且在低Lys-C浓度下也显示在113kDa处出现弱条带。另一方面，对于参考实施例7-1中制备的MRA变体，在约150kDa处的条带几乎不消失，并且在约96kDa处出现新的条带。用抗人Fc抗体进行的检测显示，在约150kDa处的条带几乎没有消失，并且在约61kDa处出现新的条带，并且在低Lys-C浓度下在113kDa处也出现了弱条带。以上结果表明，如图45所示，在约150kDa处的条带是IgG，在约113kDa处的条带是其中重链铰链被切割一次的单臂形式，在约96kDa处的条带是Fab二聚体，在约61kDa处的条带是Fc，并且在约50kDa处的条带是Fab。
[参考实施例8]评估在IgG1的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
参考实施例8-1：制备在IgG1的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
对抗人IL6R中和抗体MRA-IgG1(重链：MRAH-G1T4(SEQ ID NO:15)，轻链：MRAL-k0(SEQ ID NO:16))的重链和轻链进行研究，其中在结构上暴露于表面的任意氨基酸残基被半胱氨酸置换。
用半胱氨酸置换MRA-IgG1重链可变区(MRAH,SEQ ID NO:17)中的氨基酸残基，以制备表28中所示的MRA-IgG1重链可变区变体。将这些MRA-IgG1重链可变区变体各自与MRA-IgG1重链恒定区(G1T4，SEQ ID NO:18)连接以制备MRA-IgG1重链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。此外，用半胱氨酸置换MRA-IgG1重链恒定区(G1T4，SEQ ID NO:18)中的氨基酸残基，以制备表29中所示的MRA-IgG1重链恒定区变体。将这些MRA-IgG1重链恒定区变体各自与MRA-IgG1重链可变区(MRAH,SEQ ID NO:17)连接以制备MRA-IgG1重链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
[表28]
Figure BDA0003785290370002101
Figure BDA0003785290370002111
[表29]
Figure BDA0003785290370002121
Figure BDA0003785290370002131
Figure BDA0003785290370002141
类似地，用半胱氨酸置换MRA-IgG1轻链可变区(MRAL,SEQ ID NO:19)中的氨基酸残基，以制备表30中所示的MRA-IgG1轻链可变区变体。将这些MRA-IgG1轻链可变区变体各自与MRA-IgG1轻链恒定区(k0,SEQ ID NO:20)连接以制备MRA-IgG1轻链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。此外，用半胱氨酸置换MRA-IgG1轻链恒定区(k0,SEQ ID NO:20)中的氨基酸残基，以制备表31中所示的MRA-IgG1轻链恒定区变体。将这些MRA-IgG1重链恒定区变体各自与MRA-IgG1轻链可变区(MRAL,SEQ ID NO:19)连接以制备MRA-IgG1轻链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
[表30]
Figure BDA0003785290370002151
Figure BDA0003785290370002161
[表31]
Figure BDA0003785290370002171
Figure BDA0003785290370002181
Figure BDA0003785290370002191
将以上制备的MRA-IgG1重链变体与MRA-IgG1轻链组合，或将MRA-IgG1重链与MRA-IgG1轻链变体组合。表32和33中所示的所得MRA-IgG1重链变体和MRA-IgG1轻链变体是使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(Life Technologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达而表达的，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。
[表32]
Figure BDA0003785290370002201
Figure BDA0003785290370002211
Figure BDA0003785290370002221
Figure BDA0003785290370002231
Figure BDA0003785290370002241
[表33]
Figure BDA0003785290370002251
Figure BDA0003785290370002261
Figure BDA0003785290370002271
Figure BDA0003785290370002281
Figure BDA0003785290370002291
参考实施例8-2：评估在IgG1的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体在聚丙烯酰 胺凝胶中的电泳迁移率
用非还原性SDS-PAGE检查参考实施例8-1中制备的MRA-IgG1变体是否显示出与MRA-IgG1不同的电泳迁移率。使用样品缓冲液(2ME-)(x4)(Wako；198-13282)制备电泳样品，在样品浓度为50μg/mL和70℃的条件下处理样品10分钟，然后进行非还原性SDS-PAGE。在非还原性SDS-PAGE中，使用4％SDS-PAGE mini 15孔1.0mm 15孔(TEFCO；Cat#01-052-6)在125V下电泳90分钟。然后，将凝胶用CBB染料染色，用ChemiDocTouchMP(BIORAD)捕获凝胶图像，并用Image Lab(BIORAD)定量条带。
从获得的凝胶图像中，根据每种MRA-IgG1变体的条带模式，将变体分为7组：单条(与MRA-IgG1相似的分子量区域有一条带)，双条(与MRA-IgG1相似的分子量区域有两条带)，三条(与MRA-IgG1相似的分子量区域有三条带)，多条(与MRA-IgG1相似的分子量区域有4个或更多的条带)，LMW(分子量区域低于MRA-IgG1的条带)，HMW(分子量区域高于MRA-IgG1的条带)和模糊(不清楚和难以确定的条带)。关于归类为“双条”的MRA-IgG1变体，两条带之一显示出与MRA-IgG1相同的电泳迁移率，而另一条带则显示出稍微更快或更慢的迁移率。因此，对于归类为“双条”的MRA-IgG1变体，还计算了相对于MRA-IgG1显示出不同迁移率的条带百分比(新条带的百分比(％))。表34和表35分别显示了MRA-IgG1重链变体和MRA-IgG1轻链变体的条带模式分组以及条带百分比的计算结果。从表34和表35中可以看出，分为双条组和三条组的变体在表36中显示。在这些变体中，半胱氨酸置换很可能引起结构变化，例如Fab的交联，从而导致电泳迁移率的变化。值得注意的是，尽管表35表示MRAL.K107C-IgG1“无数据”，但是在该变体中半胱氨酸置换的位置即位置107(Kabat编号)是结构上暴露于表面的残基在铰链区中所存在的位置。因此，在该变体中，半胱氨酸置换也很有可能引起结构变化，例如Fab的交联，并导致电泳迁移率变化。
[表34]
Figure BDA0003785290370002311
Figure BDA0003785290370002321
Figure BDA0003785290370002331
Figure BDA0003785290370002341
Figure BDA0003785290370002351
[表35]
Figure BDA0003785290370002361
Figure BDA0003785290370002371
Figure BDA0003785290370002381
Figure BDA0003785290370002391
Figure BDA0003785290370002401
[表36]
Figure BDA0003785290370002411
Figure BDA0003785290370002421
[参考实施例9]评估在IgG4的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
参考实施例9-1：制备在IgG4的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
对抗人IL6R中和抗体MRA-IgG4(重链：MRAH-G4T1(SEQ ID NO:310)，轻链：MRAL-k0(SEQ ID NO:16))的重链和轻链进行研究，其中在结构上暴露于表面的任意氨基酸残基被半胱氨酸置换。
用半胱氨酸置换MRA-IgG4重链可变区(MRAH,SEQ ID NO:17)中的氨基酸残基，以制备表37中所示的MRA-IgG4重链可变区变体。将这些MRA-IgG4重链可变区变体各自与MRA-IgG4重链恒定区(G4T1,SEQ ID NO:311)连接以制备MRA-IgG4重链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。此外，用半胱氨酸置换MRA-IgG4重链恒定区(G4T1,SEQ ID NO:311)中的氨基酸残基，以制备表38中所示的MRA-IgG4重链恒定区变体。将这些MRA-IgG4重链恒定区变体各自与MRA-IgG4重链可变区(MRAH,SEQ ID NO:17)连接以制备MRA-IgG4重链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
[表37]
Figure BDA0003785290370002431
Figure BDA0003785290370002441
[表38]
Figure BDA0003785290370002451
Figure BDA0003785290370002461
Figure BDA0003785290370002471
将以上制备的MRA-IgG4重链变体与MRA-IgG4轻链组合，或将MRA-IgG4重链与参考实施例8-1中制备的MRA-IgG4轻链变体组合。表39和40中所示的所得MRA-IgG4重链变体和MRA-IgG4轻链变体是使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(LifeTechnologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达而表达的，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。
[表39]
Figure BDA0003785290370002481
Figure BDA0003785290370002491
Figure BDA0003785290370002501
Figure BDA0003785290370002511
Figure BDA0003785290370002521
[表40]
Figure BDA0003785290370002531
Figure BDA0003785290370002541
Figure BDA0003785290370002551
Figure BDA0003785290370002561
Figure BDA0003785290370002571
参考实施例9-2：评估在IgG4的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体在聚丙烯酰 胺凝胶中的电泳迁移率
类似于参考实施例8-2，用参考实施例9-1中制备的MRA-IgG4变体进行非还原性SDS-PAGE，捕获凝胶图像，并定量条带。
从获得的凝胶图像中，根据每种MRA-IgG4变体的条带模式，将变体分为7组：单条(与MRA-IgG4相似的分子量区域有一条带)，双条(与MRA-IgG4相似的分子量区域有两条带)，三条(与MRA-IgG4相似的分子量区域有三条带)，多条(与MRA-IgG4相似的分子量区域有4个或更多的条带)，LMW(分子量区域低于MRA-IgG4的条带)，HMW(分子量区域高于MRA-IgG4的条带)和模糊(不清楚和难以确定的条带)。关于归类为“双条”的MRA-IgG4变体，两条带之一显示出与MRA-IgG4相同的电泳迁移率，而另一条带则显示出稍微更快或更慢的迁移率。因此，对于归类为“双条”的MRA-IgG4变体，还计算了相对于MRA-IgG4显示出不同迁移率的条带百分比(新条带的百分比(％))。表41和表42分别显示了MRA-IgG4重链变体和MRA-IgG4轻链变体的条带模式分组以及条带百分比的计算结果。从表41和表42中可以看出，分为双条组和三条组的变体在表43中显示。在这些变体中，半胱氨酸置换很可能引起结构变化，例如Fab的交联，从而导致电泳迁移率的变化。值得注意的是，尽管表26表示MRAL.K107C-IgG4“无数据”，但是在该变体中半胱氨酸置换的位置即位置107(Kabat编号)是结构上暴露于表面的残基在铰链区中所存在的位置。因此，在该变体中，半胱氨酸置换也很有可能引起结构变化，例如Fab的交联，并导致电泳迁移率变化。
[表41]
Figure BDA0003785290370002591
Figure BDA0003785290370002601
Figure BDA0003785290370002611
Figure BDA0003785290370002621
[表42]
Figure BDA0003785290370002631
Figure BDA0003785290370002641
Figure BDA0003785290370002651
Figure BDA0003785290370002661
Figure BDA0003785290370002671
[表43]
Figure BDA0003785290370002681
Figure BDA0003785290370002691
Figure BDA0003785290370002701
[参考实施例10]评估在IgG2的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
参考实施例10-1：制备在IgG2的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
对抗人IL6R中和抗体MRA-IgG2(重链：MRAH-G2d(SEQ ID NO:312)，轻链：MRAL-k0(SEQ ID NO:16))的重链和轻链进行研究，其中在结构上暴露于表面的任意氨基酸残基被半胱氨酸置换。
用半胱氨酸置换MRA-IgG2重链可变区(MRAH,SEQ ID NO:17)中的氨基酸残基，以制备表44中所示的MRA-IgG2重链可变区变体。将这些MRA-IgG2重链可变区变体各自与MRA-IgG2重链恒定区(G2d,SEQ ID NO:313)连接以制备MRA-IgG2重链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。此外，用半胱氨酸置换MRA-IgG2重链恒定区(G2d,SEQ ID NO:313)中的氨基酸残基，以制备表45中所示的MRA-IgG2重链恒定区变体。将这些MRA-IgG2重链恒定区变体各自与MRA-IgG2重链可变区(MRAH,SEQ ID NO:17)连接以制备MRA-IgG2重链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
[表44]
Figure BDA0003785290370002711
Figure BDA0003785290370002721
[表45]
Figure BDA0003785290370002731
Figure BDA0003785290370002741
Figure BDA0003785290370002751
将以上制备的MRA-IgG2重链变体与MRA-IgG2轻链组合，或将MRA-IgG2重链与参考实施例8-1中制备的MRA-IgG2轻链变体组合。表46和47中所示的所得MRA-IgG2重链变体和MRA-IgG2轻链变体使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(LifeTechnologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达而表达，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。
[表46]
Figure BDA0003785290370002761
Figure BDA0003785290370002771
Figure BDA0003785290370002781
Figure BDA0003785290370002791
Figure BDA0003785290370002801
[表47]
Figure BDA0003785290370002811
Figure BDA0003785290370002821
Figure BDA0003785290370002831
Figure BDA0003785290370002841
Figure BDA0003785290370002851
参考实施例10-2：评估在IgG2的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体在聚丙烯酰 胺凝胶中的电泳迁移率
类似于参考实施例8-2，用参考实施例10-1中制备的MRA-IgG2变体进行非还原性SDS-PAGE，捕获凝胶图像，并分析条带。
从获得的凝胶图像中，根据每种MRA-IgG2变体的条带模式，将变体分为7组：单条(在140kDa附近的分子量区域有一个条带)，双条(在140kDa附近的分子量区域有两条带)，三条(在140kDa附近的分子量区域有三条带)，多条(在140kDa附近的分子量区域有4个或更多的条带)，LMW(分子量区域低于140kDa附近的条带)，HMW(分子量区域高于140kDa附近的条带)和模糊(不清楚和难以确定的条带)。表48和表49分别显示了MRA-IgG2重链变体和MRA-IgG2轻链变体的条带模式分组结果。从表48和表49中可以看出，分为双条组和三条组的变体在表50中显示。值得注意的是，尽管表33表示MRAL.K107C-IgG2“无数据”，但是在该变体中半胱氨酸置换的位置即位置107(Kabat编号)是结构上暴露于表面的残基在铰链区中所存在的位置。因此，该变体也可以被分类为“双条”。
[表48]
Figure BDA0003785290370002871
Figure BDA0003785290370002881
Figure BDA0003785290370002891
Figure BDA0003785290370002901
[表49]
Figure BDA0003785290370002911
Figure BDA0003785290370002921
Figure BDA0003785290370002931
Figure BDA0003785290370002941
Figure BDA0003785290370002951
[表50]
Figure BDA0003785290370002961
Figure BDA0003785290370002971
Figure BDA0003785290370002981
Figure BDA0003785290370002991
Figure BDA0003785290370003001
Figure BDA0003785290370003011
Figure BDA0003785290370003021
[参考实施例11]评估在λ链的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
参考实施例11-1：制备在λ链的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
对抗人CXCL10中和抗体G7-IgG1(重链：G7H-G1T4(SEQ ID NO:314)，轻链：G7L-LT0(SEQ ID NO:316))的轻链(λ链)进行了研究，其中在结构上暴露于表面的任意氨基酸残基被半胱氨酸置换。
用半胱氨酸置换G7-IgG1轻链可变区(G7L,SEQ ID NO:317)中的氨基酸残基，以制备表51中所示的G7-IgG1轻链可变区变体。将这些G7-IgG1轻链可变区变体各自与G7-IgG1轻链恒定区(LT0,SEQ ID NO:318)连接以制备G7-IgG1轻链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。此外，用半胱氨酸置换G7-IgG1轻链恒定区(LT0,SEQ ID NO:318)中的氨基酸残基，以制备表52中所示的G7-IgG1轻链恒定区变体。将这些G7-IgG1重链恒定区变体各自与G7-IgG1轻链可变区(G7L,SEQ ID NO:317)连接以制备G7-IgG1轻链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
[表51]
Figure BDA0003785290370003031
Figure BDA0003785290370003041
[表52]
Figure BDA0003785290370003051
Figure BDA0003785290370003061
Figure BDA0003785290370003071
将以上制备的G7-IgG1轻链变体与G7-IgG1重链组合，并且表53中所示的所得G7-IgG1轻链变体使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(Life Technologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达而表达，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。
[表53]
Figure BDA0003785290370003081
Figure BDA0003785290370003091
Figure BDA0003785290370003101
Figure BDA0003785290370003111
Figure BDA0003785290370003121
参考实施例11-2：评估在λ链的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体在聚丙烯酰 胺凝胶中的电泳迁移率
类似于参考实施例8-2，用参考实施例11-1中制备的G7-IgG1变体进行非还原性SDS-PAGE，捕获凝胶图像，并定量条带。
从获得的凝胶图像中，根据每种G7-IgG1变体的条带模式，将变体分为7组：单条(与G7-IgG1相似的分子量区域有一条带)，双条(与G7-IgG1相似的分子量区域有两条带)，三条(与G7-IgG1相似的分子量区域有三条带)，多条(与G7-IgG1相似的分子量区域有4个或更多的条带)，LMW(分子量区域低于G7-IgG1的条带)，HMW(分子量区域高于G7-IgG1的条带)和模糊(不清楚和难以确定的条带)。关于归类为“双条”的G7-IgG1变体，两条带之一显示出与G7-IgG1相同的电泳迁移率，而另一条带则显示出稍微更快或更慢的迁移率。因此，对于归类为“双条”的G7-IgG1变体，还计算了相对于G7-IgG1显示出不同迁移率的条带百分比(新条带的百分比(％))。表54显示了G7-IgG1轻链变体的条带模式分组以及条带百分比的计算结果。从表54中可以看出，分类为双条组和三条组的变体在表55中显示。在这些变体中，半胱氨酸置换很可能引起结构变化，例如Fab的交联，从而导致电泳迁移率的变化。在该参考实施例中，没有评估其中在位置107a(Kabat编号)处的氨基酸残基被半胱氨酸置换的变体。然而，位置107a(Kabat编号)是结构上暴露于表面的残基在铰链区中所存在的位置。因此，在该变体中，半胱氨酸置换也很有可能引起结构变化，例如Fab的交联，并导致电泳迁移率变化。
[表54]
Figure BDA0003785290370003141
Figure BDA0003785290370003151
Figure BDA0003785290370003161
Figure BDA0003785290370003171
Figure BDA0003785290370003181
[表55]
G7-IgG1轻链变体名称 组 新条带的百分比(％)
G7L.Q6C-IgG1 三条 -
G7L.V19C-IgG1 双条 32.3
G7L.V33C-IgG1 三条 -
G7L.N34C-IgG1 双条 43.8
LT0.Q108C-IgG1 双条 10.6
LT0.P109C-IgG1 双条 42.9
LT0.E123C-IgG1 双条 57.5
LT0.Q126C-IgG1 三条 -
LT0.Q195C-IgG1 双条 30.1
LT0.V196C-IgG1 双条 82.9
LT0.G200C-IgG1 双条 15.5
LT0.S203C-IgG1 双条 32.4
[参考实施例12]评估在VHH的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
参考实施例12-1：制备在VHH的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体
将抗人IL6R中和VHH，IL6R90(SEQ ID NO:319)，与人IgG1 Fc区(G1T3dCH1dC,SEQID NO:320)融合以制备IL6R90-Fc(IL6R90-G1T3dCH1dC,SEQ ID NO:321)，并且对其进行了研究，其中在结构上暴露于表面的IL6R90区域中的任意氨基酸残基被半胱氨酸置换。
用半胱氨酸置换IL6R90区域内的氨基酸残基，并通过本领域技术人员已知的方法制备编码表56所示的IL6R90-Fc VHH区变体的基因的表达载体。将这些IL6R90-Fc VHH区变体各自与人IgG1的Fc区(G1T3dCH1dC,SEQ ID NO:320)连接以制备IL6R90-Fc变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
[表56]
Figure BDA0003785290370003201
Figure BDA0003785290370003211
Figure BDA0003785290370003221
以上制备的和表57中所示的IL6R90-Fc变体使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(Life Technologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达而表达，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。
[表57]
Figure BDA0003785290370003231
Figure BDA0003785290370003241
Figure BDA0003785290370003251
参考实施例12-2：评估在VHH的不同位置处具有半胱氨酸置换的抗体在聚丙烯酰 胺凝胶中的电泳迁移率
用非还原性SDS-PAGE检查参考实施例12-1中制备的IL6R90-Fc变体是否显示出与IL6R90-Fc不同的电泳迁移率。使用样品缓冲液(2ME-)(x4)(Wako；198-13282)制备电泳样品，在样本浓度为50μg/mL和70℃的条件下处理样品10分钟，然后进行非还原性SDS-PAGE。将Mini-PROTEAN TGX预制凝胶4-20％15孔(BIORAD；456-1096)用于非还原性SDS-PAGE，并在200V下进行电泳2.5小时。然后，将凝胶用CBB染料染色，用ChemiDocTouchMP(BIORAD)捕获凝胶图像，并用Image Lab(BIORAD)定量条带。
从获得的凝胶图像中，根据每种IL6R90-Fc变体的条带模式，将变体分为7组：单条(与IL6R90-Fc相似的分子量区域有一条带)，双条(与IL6R90-Fc相似的分子量区域有两条带)，三条(与IL6R90-Fc相似的分子量区域有三条带)，多条(与IL6R90-Fc相似的分子量区域有4个或更多的条带)，LMW(分子量区域低于IL6R90-Fc的条带)，HMW(分子量区域高于IL6R90-Fc的条带)和模糊(不清楚和难以确定的条带)。关于归类为“双条”的IL6R90-Fc变体，两条带之一显示出与IL6R90-Fc相同的电泳迁移率，而另一条带则显示出稍微更快或更慢的迁移率。因此，对于归类为“双条”的IL6R90-Fc变体，还计算了相对于IL6R90-Fc显示出不同迁移率的条带百分比(新条带的百分比(％))。表58显示了IL6R90-Fc变体的条带模式分组以及条带百分比的计算结果。从表58中可以看出，分类为双条组和三条组的变体在表59中显示。在这些变体中，半胱氨酸置换很可能引起结构变化，例如VHH的交联，从而导致电泳迁移率的变化。
[表58]
Figure BDA0003785290370003271
Figure BDA0003785290370003281
Figure BDA0003785290370003291
[表59]
Figure BDA0003785290370003301
Figure BDA0003785290370003311
[参考实施例13]评估在Fab内具有半胱氨酸置换的抗体的CD3激动剂活性
参考实施例13-1：制备在恒定区具有半胱氨酸置换的抗体
对抗人CD3激动剂抗体OKT3(重链：OKT3VH0000-G1T4(SEQ ID NO:1007)，轻链：OKT3VL0000-KT0(SEQ ID NO:1008))进行了研究，其中在结构上暴露于表面的任意氨基酸残基被半胱氨酸置换。
用半胱氨酸置换OKT3重链恒定区(G1T4,SEQ ID NO:1009)中的氨基酸残基，以制备表60中所示的OKT3重链恒定区变体。将这些OKT3重链恒定区变体各自与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ ID NO:1010)连接以制备OKT3重链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
[表60]
Figure BDA0003785290370003312
类似地，用半胱氨酸置换OKT3轻链恒定区(KT0,SEQ ID NO:1011)中的氨基酸残基，以制备表61中所示的OKT3轻链恒定区变体。将该OKT3轻链恒定区变体与OKT3轻链可变区(OKT3VL0000,SEQ ID NO:1012)连接以制备OKT3轻链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
[表61]
Figure BDA0003785290370003321
将以上制备的OKT3重链变体和OKT3轻链变体分别与OKT3轻链和OKT3重链组合，并且表62所示的OKT3变体使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(LifeTechnologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达而表达，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。进一步地，类似地制备抗KLH抗体IC17(重链：IC17HdK-G1T4(SEQ ID NO:1013)，轻链：IC17L-k0(SEQ ID NO:1014))作为阴性对照。
[表62]
Figure BDA0003785290370003322
参考实施例13-2Jurkat细胞悬浮液的制备
从烧瓶中收集Jurkat细胞(TCR/CD3效应细胞(NFAT)，Promega)。用测定缓冲液(RPMI 1640培养基(Gibco)，10％FBS(HyClone)，1％MEM非必需氨基酸(Invitrogen)和1mM丙酮酸钠(Invitrogen))洗涤细胞，然后以3x106细胞/mL悬浮在测定缓冲液中。该Jurkat细胞悬浮液进行后续实验。
参考实施例13-3：发光试剂溶液的制备
将100mL的Bio-Glo萤光素酶测定缓冲液(Promega)添加到Bio-Glo萤光素酶测定底物(Promega)的瓶中，并颠倒混合。将瓶避光，并在-20℃冷冻。对该发光试剂溶液进行后续实验。
参考实施例13-4：评估在恒定区具有半胱氨酸置换的抗体的T细胞激活
基于萤光素酶发光的倍数变化，评估通过激动剂信号传导的T细胞激活。前述Jurkat细胞是用具有NFAT响应序列的萤光素酶报道基因转化的细胞。当细胞被抗TCR/CD3抗体刺激时，NFAT途径通过细胞内信号传导被激活，从而诱导萤光素酶表达。将如上所述制备的Jurkat细胞悬浮液以每孔10μL(3x104个细胞/孔)的浓度添加到384孔平底白板中。接着，以每孔20μL添加以各自浓度(10,000,1,000,100,10,1和0.1ng/mL)制备的抗体溶液。将该板在5％CO2培养箱中于37℃下静置24小时。温育后，将发光试剂溶液解冻，并且将30μL溶液添加到每个孔中。然后将板在室温下静置10分钟。使用光度计测量板的每个孔中的萤光素酶发光。通过将添加了抗体的孔中的发光量除以缺少抗体的孔中的发光量来确定发光量(倍数)。
结果，如图46所示，在恒定区具有半胱氨酸置换的OKT3变体中，与OKT3相比，多个变体大大增加了T细胞的活化状态。该结果显示存在多个可以使Fab交联并增强CD3激动剂活性的半胱氨酸修饰。
[参考实施例14]评估在两个Fab中具有不同半胱氨酸置换的抗体的CD3激动剂活性
参考实施例14-1：制备在恒定区具有异源半胱氨酸置换的抗体
对抗人CD3激动剂抗体OKT3(重链：OKT3VH0000-G1T4(SEQ ID NO:1007)，轻链：OKT3VL0000-KT0(SEQ ID NO:1008))进行了研究，其中在结构上暴露于表面的任意氨基酸残基被半胱氨酸置换。
用半胱氨酸置换OKT3重链恒定区1(G1T4k,SEQ ID NO:1015)中的氨基酸残基，以制备表63中所示的OKT3重链恒定区变体。将这些OKT3重链恒定区变体与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ ID NO:1010)连接以制备OKT3重链变体1，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。类似地，用半胱氨酸置换OKT3重链恒定区2(G1T4h,SEQ ID NO:1016)中的氨基酸残基，以制备表64中所示的OKT3重链恒定区变体。将这些OKT3重链恒定区变体各自与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ ID NO:1010)连接以制备OKT3重链变体2，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。应当注意的是，本参考实施例中的重链恒定区1和2在CH3区引入了杵臼(KiH)修饰，以促进异二聚化。
[表63]
Figure BDA0003785290370003341
[表64]
Figure BDA0003785290370003342
将以上制备的OKT3重链变体1和OKT3重链变体2与OKT3轻链组合，并且表65所示的OKT3变体使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(Life Technologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达而表达，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。进一步地，类似地制备抗KLH抗体IC17(重链：IC17HdK-G1T4(SEQ ID NO:1013)，轻链：IC17L-k0(SEQ ID NO:1014))作为阴性对照。
[表65]
Figure BDA0003785290370003351
参考实施例14-2 Jurkat细胞悬浮液的制备
如参考实施例13-2那样制备Jurkat细胞悬浮液。
参考实施例14-3：发光试剂溶液的制备
如参考实施例13-3那样制备发光试剂溶液。
参考实施例14-4：评估在恒定区具有异源半胱氨酸置换的抗体的T细胞激活
如参考实施例13-4中那样评估T细胞激活。
结果，如图47所示，与OKT3相比，在抗体的两个恒定区具有不同半胱氨酸置换的OKT3变体大大增加了T细胞活化状态。该结果显示，即使Fab之间的不同半胱氨酸置换也能够使Fab交联并增强CD3激动剂活性。
[参考实施例15]评估在Fab内具有电荷修饰的抗体的CD3激动剂活性
参考实施例15-1：制备在恒定区具有带电荷氨基酸置换的抗体
对抗人CD3激动剂抗体OKT3(重链：OKT3VH0000-G1T4(SEQ ID NO:1007)，轻链：OKT3VL0000-KT0(SEQ ID NO:1008))的重链进行了研究，其中在结构上暴露于表面的任意氨基酸残基被带电荷氨基酸置换。
用精氨酸(R)或赖氨酸(K)置换OKT3重链恒定区1(G1T4k,SEQ ID NO:1015)中的氨基酸残基，以制备表66中所示的OKT3重链恒定区变体。将这个OKT3重链恒定区变体与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ ID NO:1010)连接以制备OKT3重链变体1，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。类似地，用天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)置换OKT3重链恒定区2(G1T4h,SEQ ID NO:1016)中的氨基酸残基，以制备表67中所示的OKT3重链恒定区变体。将这些OKT3重链恒定区变体各自与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ IDNO:1010)连接以制备OKT3重链变体2，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。应当注意的是，本参考实施例中的重链恒定区1和2的CH3区引入了杵臼(KiH)修饰，以促进异二聚化。
[表66]
Figure BDA0003785290370003361
[表67]
Figure BDA0003785290370003362
将以上制备的OKT3重链变体1和OKT3重链变体2与OKT3轻链组合，并且表68所示的OKT3变体使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(Life Technologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达而表达，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。进一步地，类似地制备抗KLH抗体IC17(重链：IC17HdK-G1T4(SEQ ID NO:1013)，轻链：IC17L-k0(SEQ ID NO:1014))作为阴性对照。
[表68]
Figure BDA0003785290370003371
参考实施例15-2Jurkat细胞悬浮液的制备
如参考实施例13-2那样制备Jurkat细胞悬浮液。
参考实施例15-3：发光试剂溶液的制备
如参考实施例13-3那样制备发光试剂溶液。
参考实施例15-4：评估在恒定区被除半胱氨酸以外的氨基酸置换的抗体的T细胞 激活
如参考实施例13-4中那样评估T细胞激活。
结果，如图48所示，与OKT3相比，在一个恒定区引入带正电荷的氨基酸置换而在另一恒定区引入带负电荷的氨基酸置换的OKT3变体大大增加了T细胞的活化状态。同时，与OKT3相比，在一个恒定区引入带正电荷或负电荷的氨基酸置换而在另一恒定区没有修饰的OKT3变体几乎不改变T细胞活化状态。该结果显示，不仅半胱氨酸置换而且带电荷氨基酸置换也可以通过非共价键使Fab交联并增强CD3激动剂活性。
[参考实施例16]评估在Fab内具有半胱氨酸置换并且在铰链区中缺乏二硫键的抗体的CD3激动剂活性
参考实施例16-1：制备在Fab内具有半胱氨酸置换并且在铰链区中缺乏二硫键的 抗体
对抗人CD3激动剂抗体OKT3(重链：OKT3VH0000-G1T4(SEQ ID NO:1007)，轻链：OKT3VL0000-KT0(SEQ ID NO:1008))的重链进行了研究，其中除去了铰链区中的二硫键并且在结构上暴露于表面的氨基酸残基被半胱氨酸置换。
用丝氨酸置换OKT3重链恒定区(G1T4,SEQ ID NO:1009)的铰链区中的半胱氨酸，以制备表69中所示的OKT3重链恒定区变体。用半胱氨酸置换这些OKT3重链恒定区变体的位置191(EU编号)处的氨基酸残基，以制备表70中所示的OKT3重链恒定区变体。将这些OKT3重链恒定区变体各自与OKT3重链可变区(OKT3VH0000,SEQ ID NO:1010)连接以制备OKT3重链变体，并且通过本领域技术人员已知的方法制备编码相应基因的表达载体。
[表69]
Figure BDA0003785290370003381
[表70]
Figure BDA0003785290370003382
将以上制备的OKT3重链变体与OKT3轻链组合，并且表71所示的OKT3变体使用FreeStyle293细胞(Invitrogen)或Expi293细胞(Life Technologies)通过本领域技术人员已知的方法通过瞬时表达而表达，并通过本领域技术人员已知的方法用蛋白质A进行纯化。进一步地，类似地制备抗KLH抗体IC17(重链：IC17HdK-G1T4(SEQ ID NO:1013)，轻链：IC17L-k0(SEQ ID NO:1014))作为阴性对照。
[表71]
Figure BDA0003785290370003391
参考实施例16-2Jurkat细胞悬浮液的制备
如参考实施例13-2那样制备Jurkat细胞悬浮液。
参考实施例16-3：发光试剂溶液的制备
如参考实施例13-3那样制备发光试剂溶液。
参考实施例16-4：评估在Fab内具有半胱氨酸置换并且在铰链区中缺乏二硫键的 抗体的T细胞激活
如参考实施例13-4中那样评估T细胞激活。
结果，如图49所示，与OKT3相比，仅去除了铰链区中的二硫键的OKT3变体减少或几乎不改变T细胞活化状态。另一方面，与OKT3相比，去除了铰链区中的二硫键并在恒定区引入半胱氨酸置换的OKT3变体大大提高了T细胞活化状态。该结果表明，即使当铰链区中没有二硫键时，Fab内的半胱氨酸置换也能够使Fabs交联并增强CD3激动剂活性。
[参考实施例17]修饰抗体的表达载体的制备，以及修饰抗体的表达和纯化
使用PCR，In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(TAKARA)等通过本领域技术人员已知的方法，对插入动物细胞表达载体中的抗体基因进行氨基酸残基序列置换，以构建修饰抗体的表达载体。通过本领域技术人员已知的方法确定所得表达载体的核苷酸序列。将产生的表达载体瞬时导入FreeStyle293(注册商标)或Expi293(注册商标)细胞(Invitrogen)中，并使细胞在培养上清液中表达修饰抗体。使用蛋白质A等通过本领域技术人员已知的方法从获得的培养上清液中纯化修饰抗体。使用分光光度计测量280nm处的吸光度。使用PACE法由测量值计算吸收系数，并用于计算抗体浓度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
[参考实施例18]双特异性抗体的制备
将纯化的抗体透析到TBS或PBS缓冲液中，并将其浓度调整为1mg/mL。制备10x反应缓冲液250mM 2-MEA(SIGMA)。将参考实施例17中制备的两种不同的同型二聚体抗体等量混合。向该混合物中，加入1/10体积的10x反应缓冲液并混合。使混合物在37℃下静置90分钟。反应后，将混合物透析到TBS或PBS中以获得双特异性抗体的溶液，其中上述两种不同的抗体被异二聚化。通过上述方法测量抗体浓度，并对抗体进行后续实验。
[参考实施例19]激动剂活性的评估
参考实施例19-1Jurkat细胞悬浮液的制备
从烧瓶中收集Jurkat细胞(TCR/CD3效应细胞(NFAT)，Promega)。用测定缓冲液(RPMI 1640培养基(Gibco)，10％FBS(HyClone)，1％MEM非必需氨基酸(Invitrogen)和1mM丙酮酸钠(Invitrogen))洗涤细胞，然后以3x106细胞/mL悬浮在测定缓冲液中。对该Jurkat细胞悬浮液进行后续实验。
参考实施例19-2：发光试剂溶液的制备
将100mL的Bio-Glo萤光素酶测定缓冲液(Promega)添加到Bio-Glo萤光素酶测定底物(Promega)的瓶中，并颠倒混合。将瓶避光，并在-20℃冷冻。对该发光试剂溶液进行后续实验。
参考实施例19-3 T细胞激活测定
基于萤光素酶发光的倍数变化，评估通过激动剂信号传导的T细胞激活。前述Jurkat细胞是用具有NFAT响应序列的萤光素酶报道基因转化的细胞。当细胞被抗TCR/CD3抗体刺激时，NFAT途径通过细胞内信号传导被激活，从而诱导萤光素酶表达。将如上所述制备的Jurkat细胞悬浮液以每孔10μL(3x104个细胞/孔)的浓度添加到384孔平底白板中。接着，以每孔20μL添加以各自浓度(150,15,1.5,0.15,0.015,0.0015,0.00015和0.000015nM)制备的抗体溶液。将该板在5％CO2培养箱中于37℃下静置24小时。温育后，将发光试剂溶液解冻，并且将30μL溶液添加到每个孔中。然后将板在室温下静置10分钟。使用光度计测量板的每个孔中的萤光素酶发光。
[参考实施例20]使用Jurkat细胞评估CD3双互补位抗体的激动剂活性
根据参考实施例17、18和19制备抗体并评估其活性。该实施例中使用的抗体示于表72中。
[表72]
Figure BDA0003785290370003411
结果，与缺少额外二硫键的双特异性抗体相比，具有连接两种类型抗CD3双特异性抗体的Fab-Fab的额外二硫键的修饰分子显示出变化的CD3介导的信号传导，如图50所示。
该结果表明，引入本发明的修饰能够增强或减少具有针对相同靶标的不同表位的双特异性抗原结合分子所具有的激动剂活性。
[参考实施例21]使用Jurkat细胞评估CD137激动剂活性
根据参考实施例17、18和19制备抗体并评估其活性。在本参考实施例中使用的抗体如下：普通的抗CD137抗体，在其重链恒定区中引入了促进抗体缔合(六聚化)的突变的抗体，以及通过用额外二硫键将上述每个抗体的Fab-Fab相连而制备的修饰抗体。
基于萤光素酶发光的倍数变化，评估通过激动剂信号传导的T细胞激活。GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat细胞系(Promega)的细胞是用具有NFAT响应序列的萤光素酶报道基因转化的细胞。当细胞被抗CD137抗体刺激时，NFAT途径通过细胞内信号传导被激活，从而诱导萤光素酶表达。将用测定培养基(99％RPMI，1％FBS)以2x106细胞/mL制备的Jurkat细胞悬浮液以每孔25μL(5x104细胞/孔)添加到96孔平底白板中。接下来，以每孔25μL添加以各自抗体浓度(终浓度：45,15,5,1.667,0.556,0.185,0.062和0.021μg/mL)制备的含有ATP的抗体溶液或不含ATP的抗体溶液。ATP的终浓度为250nM。将该板在5％CO2培养箱中于37℃下静置6小时。温育后，将发光试剂溶液解冻，并且将75μL溶液添加到每个孔中。然后将板在室温下静置10分钟。使用光度计测量板的每个孔中的萤光素酶发光。将每个孔的发光值除以不添加抗体的孔的发光值定义为发光倍数，其用作评估每种抗体的活性的指标。
结果，与普通的抗CD137抗体相比，引入了六聚化修饰的抗体显示出增加的激动剂活性。此外，在修饰的抗体(其中每个抗体都被引入了额外的二硫键)中，观察到了激动剂活性的协同增加。
该结果表明，引入本发明的修饰可以增强抗CD137激动剂抗体的活性。
[参考实施例22]使用Jurkat细胞评估CD3//PD1双特异性抗体的激动剂活性
参考实施例22-1
根据参考实施例17、18和19制备抗体并评估其活性。该实施例中使用的抗体示于表74中。
[表74]
Figure BDA0003785290370003431
结果，在由抗CD3抗体和抗PD1抗体的组合组成的多个双特异性抗体中，与缺少额外的二硫键的双特异性抗体相比，带有连接Fab-Fab的额外二硫键的修饰分子显示了CD3和/或PD1介导的信号传导的很大变化，如图51所示。
该结果表明，引入本发明的修饰能够增强或减少抗原结合分子例如抗体所具有的激动剂活性。
参考实施例22-2
根据参考实施例2、3和4制备抗体并评估其活性。该参考实施例中使用的抗体示于表75中。
[表75]
Figure BDA0003785290370003441
PD-1激动剂信号传导的存在与否是通过当PD-1在SHP2附近时来自BRET的荧光信号(618nm)与来自作为供体的SHP2的发光(460nm)之比来评估的。在测定前一天，将表达PD-L1的抗原呈递细胞(Promega，#J109A)以4.0x104个细胞/100μL/孔接种到96孔板(Costar，#3917)中的含有10％FBS的F-12培养基(Gibco，11765-054)中，并将细胞在CO2培养箱中于37℃培养16-24小时。在测定当天，将HaloTag nanoBRET 618配体(Promega，#G980A)用Opti-MEM(Gibco，#31985-062)稀释250倍。去除用于培养表达PD-L1的抗原呈递细胞的培养基，并以25μL/孔加入稀释的HaloTag nanoBRET 618配体。将用含有10μg/mLPD-L1抑制抗体的Opti-MEM稀释的待评估样品(40、8和1.6μg/mL)以25μL/孔添加。将PD-1/SHP2Jurkat细胞(Promega，#CS2009A01)以5x104细胞/50μL/孔添加到上述96孔板中，彻底悬浮，然后在CO2培养箱中于37℃温育2.5小时。将nanoBRET Nano-Glo底物(Promega，#N157A)用Opti-MEM稀释100倍，并在温育后将其以25μL/孔添加到96孔板中。将板在室温下静置30分钟，然后使用Envision(PerkinElmer,2104EnVision)测量Em460mM和Em618nm。将获得的值应用于以下等式，以计算BRET比(mBU)。
618nm/460nm＝BU
BU x 1000＝mBU
平均mBU实验—平均mBU无PD_L1封闭对照＝BRET比(mBU)
结果，在由抗CD3抗体和抗PD1抗体组成的双特异性抗体中，与缺少额外的二硫键的双特异性抗体相比，带有连接Fab-Fab的额外二硫键的修饰分子显示了CD3和/或PD1介导的信号传导的很大变化，如图52所示。
[参考实施例23]评估CD28/CD3钳位双特异性抗体的激动剂活性
参考实施例23-1：实时细胞生长抑制测定(xCELLigence测定)
抗体是根据参考实施例17和18制备的。该实施例中使用的抗体示于表76中。
[表76]
Figure BDA0003785290370003451
抗体的T细胞依赖性癌细胞生长抑制作用是使用xCELLigence RTCA MP仪器(ACEABiosciences)进行评估的。将被迫表磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)(SEQ ID NO:1241)的人肝癌细胞系SK-Hep-1的细胞(SK-pca31a)用作靶细胞，并将人外周血单核细胞(PBMC:CellularTechnology Limited(CTL))用作效应细胞。将1×104个SK-pca31a细胞接种到E-Plate 96(ACEA Biosciences)上。第二天，添加2x105个PBMC细胞和抗体，使终浓度为0.001、0.01、0.1、1或10μg/mL。用xCELLigence每15分钟监测细胞生长，并继续培养72小时。通过以下等式计算细胞生长抑制作用(CGI:％)。
CGI(％)＝100-(CIAb×100/CINoAb)
在以上等式中，“CIAb”是添加抗体后72小时的孔的细胞指数(用xCELLigence测量的细胞生长指数)。此外，“CINoAb”是不添加抗体72小时后孔的细胞指数。
参考实施例23-2：细胞因子产生测定
如下所述评估抗体从T细胞的细胞因子产生。
将SK-pca31a用作靶细胞，并将PBMC(Cellular Technology Limited(CTL))用作效应细胞。将1×104个SK-pca31a细胞接种到96孔板上。第二天，添加2x105个PBMC细胞和抗体，使终浓度为0.01、0.1、1或10μg/mL。72小时后收集培养上清液，并使用AlphaLISA(PerkinElmer)测量人IL-6。
结果
组合使用CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体不会导致细胞生长抑制作用。但是，通过在CD28/CD3钳位双特异性抗体的Fab-Fab之间引入额外的二硫键进行修饰，观察到了对癌细胞生长的抑制作用(图53和图55)。进一步地，当将引入有上述修饰的CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体与表达GPC3的株系和PBMC共培养时，观察到细胞因子的产生；然而，仅将引入有上述修饰的CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体添加到PBMC不会导致细胞因子的产生(图54和图56)。因此，表明了引入有上述修饰的CD28/CD3钳位双特异性抗体和GPC3/结合减弱的CD3双特异性抗体对抑制癌细胞生长和诱导T细胞中细胞因子产生的作用取决于癌抗原的表达。
[参考实施例24]评估CD8/CD28双特异性抗体的激动剂活性
抗体是根据参考实施例17和18制备的。该参考实施例中使用的抗体示于表77中。
[表77]
Figure BDA0003785290370003461
从健康志愿者血液样品中分离的人外周血单核细胞(PBMC)用于评估制备的样本。将肝素(0.5mL)与50mL血液混合，并进一步用50mL PBS稀释。通过以下两个步骤分离人PBMC。在步骤1中，将添加了Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)的Leucosep(greinerbio-one)在室温下以1000xg离心1分钟，然后向其中加入用PBS稀释的血液，并将混合物在室温下以400x g离心30分钟。在步骤2中，离心后从管中收集血沉棕黄层，然后用60mL PBS(Wako)洗涤。用培养基(5％的人血清(SIGMA)，95％的AIM-V(Thermo FischerScientific))将分离的人PBMC调整至1x107/mL的细胞密度。将得到的细胞悬浮液以1mL/孔接种到24孔板的孔中，并将板在5％CO2培养箱中于37℃温育。
两天后，从接种的细胞中去除培养基，并用500μL PBS洗涤细胞，然后使用细胞消化液(accutase)(nacalai tesque)收集细胞。接下来，将细胞用经PBS稀释的ViaFluor 405(Biotium)溶液调节至1x106/mL的细胞密度，使其终浓度为2μM，然后在37℃静置15分钟。随后，将细胞再次用培养基悬浮，然后以每孔2×105个细胞接种到96孔板的孔中。向其中添加抗体溶液以使抗体的终浓度为0.1、1和10μg/mL，并将细胞在5％CO2培养箱中于37℃培养4天。
培养结束后，使用流式细胞仪(BD LSRFortessa(TM)X-20(BD Biosciences))(FCM)研究生长细胞的百分比。根据减少的ViaFluor 405荧光强度的百分比计算生长细胞的百分比。荧光标记的抗CD8α抗体，抗CD4抗体，抗Foxp3抗体等用于进行用CD8α阳性T细胞和调节性T(Treg)细胞的分析。结果，在一些样本中观察到活性增加，如图57所示。
[参考实施例25]评估引入的半胱氨酸之间的二硫键形成
通过将半胱氨酸引入人源化模型抗体的轻链和重链中来制备修饰的抗体，并评估新引入的半胱氨酸之间二硫键的形成。通过以下来进行评估：将样品抗体在20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中与胰凝乳蛋白酶一起温育，并使用LC/MS检测推测为由每种抗体的氨基酸序列产生的肽的质量。每种抗体是根据参考实施例17和18制备的。本实施例中使用的抗体示于表78中。
[表78]
Figure BDA0003785290370003481
首先，分析了其中轻链的位置126(Kabat编号)处的赖氨酸被半胱氨酸置换的不同亚类(IgG1，IgG2和IgG4)的修饰抗体。结果，在所有分析的抗体中，检测到了对应于在位置126处的半胱氨酸之间具有二硫键的肽的理论质量的成分，如表79所示。此外，当将具有二硫键还原作用的三(2-羧乙基)膦添加到IgG1样品中时，该成分消失，表明该肽中位置126处的半胱氨酸之间形成了二硫键。同时，表明亚类的差异不影响该二硫键的形成。
[表79]
Figure BDA0003785290370003482
n.d.：未检出
接下来，对修饰抗体进行分析，在所述修饰抗体中IgG1重链的位置162(EU编号)处的丙氨酸或位置191(EU编号)处的丝氨酸被半胱氨酸置换。结果，检测到与在引入的半胱氨酸之间具有二硫键的肽的理论质量相对应的成分，分别如表80和81所示。此外，当将三(2-羧乙基)膦添加到引入了191位半胱氨酸的修饰抗体的样品中时，该成分消失(表81)。以上表明了，还在引入了重链中的半胱氨酸之间形成了二硫键。
[表80]
Figure BDA0003785290370003483
[表81]
Figure BDA0003785290370003491
n.d.：末检出
尽管出于清楚理解的目的，已经通过图示和实施例的方式详细地描述了前述发明，但是描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入。
工业适用性
在非限制性实施方案中，本公开的抗原结合分子是有用的，因为它能够将多个抗原分子保持在空间上接近的位置，调节多个抗原分子之间的相互作用，和/或调节通过彼此缔合而被激活的多个抗原分子的激活。在其他实施方案中，本公开的抗原结合分子是有用的，因为与常规的抗原结合分子相比，其具有增加的对蛋白酶切割抗性。

Claims (15)

1.用于产生抗体制剂的方法，所述方法包括使抗体制剂与还原试剂接触，其中所述抗体包含能够通过至少一个二硫键彼此连接的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述至少一个二硫键能够在非铰链区中的氨基酸残基之间形成。
2.权利要求1所述的方法，其中所述抗体制剂包含两种结构同种型，其不同之处在于在非铰链区中的氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法优先富集或增加抗体结构同种型的群体，所述抗体结构同种型具有在非铰链区中的氨基酸残基之间形成的至少一个二硫键。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述至少一个二硫键是链间二硫键。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的CH1区、CL区、VL区、VH区和/或VHH区之间形成。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一个二硫键在所述第一抗原结合结构域的CH1区和所述第二抗原结合结构域的CH1区之间形成。
7.权利要求6所述的方法，其中在所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的各自CH1区中根据EU编号位置191处的氨基酸残基之间形成所述至少一个二硫键。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述抗体是IgG抗体，优选IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中与抗体接触的所述还原试剂的pH为约3至约10。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述还原试剂选自由TCEP、2-MEA、DTT、半胱氨酸、GSH和Na2SO3组成的组。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述接触步骤进行至少30分钟。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在约20摄氏度至37摄氏度的温度下进行，优选在23摄氏度、25摄氏度或37摄氏度，更优选在23摄氏度下进行。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述抗体的浓度为约1mg/ml至约50mg/ml。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中在所述与还原试剂接触之前，所述抗体通过亲和层析进行部分纯化。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其进一步包括去除还原试剂的步骤，优选通过透析，更优选通过层析方法去除。
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