RU2630664C2

RU2630664C2 - Антитела к теофиллину и способы их применения

Info

Publication number: RU2630664C2
Application number: RU2015102068A
Authority: RU
Inventors: Ульрих БРИНКМАНН; Ги ЖОРЖ; Айке ХОФФМАНН
Original assignee: Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date: 2012-07-04
Filing date: 2013-07-04
Publication date: 2017-09-11
Also published as: HUE029435T2; EP2869837B1; US20150238628A1; EP3138578A1; HK1203354A1; CN104394886B; EP3138578B1; RU2017128512A; US9925272B2; MX2014014381A; JP6549278B2; EP2869837A1; BR112014030843A2; JP6324376B2; RU2015102068A; CN107082810B; JP2015527983A; ES2600154T3; JP2018138561A; PL2869837T3

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу, специфически связывающемуся с теофиллином, или его фрагменту, специфически связывающемуся с теофиллином. Изобретение позволяет эффективно получать антитело, специфически связывающееся с теофиллином. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 6 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к антителам к теофиллину и способам их применения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Антитела, связывающие гаптены, можно применять в терапевтических и диагностических целях в качестве компонентов, осуществляющих захват. Например, связанные с гаптенами группировки, такие как флуорофоры, хелатирующие реагенты, пептиды, нуклеиновые кислоты, белки, липиды, наночастицы и многие другие агенты, могут вступать в реакцию со связывающими гаптены антителами и производными антител. Это позволяет эффективно детектировать такой "груз", а также осуществлять захват, аккумуляцию в необходимых участках, поперечное сшивание и другие опосредованные антителами действия. Поскольку характеристики и состав гаптенов могут влиять на состав и "поведение" связанных с гаптенами группировок (в т.ч. на размер, активность, биофизические свойства, фармакокинетику, биологическое действие и т.д.), создание разнообразных связывающих гаптены группировок является очень актуальным. Следовательно, для получения оптимизированных конъюгатов гаптенов можно соединить выбранный гаптен и заданный "груз". Затем указанные конъюгаты можно скомбинировать со связывающими гаптен группировками, обладающими оптимальными свойствами, с получением оптимальных комплексов антитело-гаптен-"груз". Также необходимы гуманизированные связывающие гаптен группировки, например, производные антитела. Это позволит существенно снизить риск нежелательных явлений, таких как иммуногенность, при применении в терапевтических целях.

WO 2010/119704 описывает антитела, специфически связывающиеся с бета олигомерами и их применение. US 4855226 описывает новый конкурентный метод определения теофиллина и реагент для него. WO 2010/045388 описывает применение белков, связывающих ММР-9 и ММР-12, для лечения и предупреждения системного склероза. US 6881536 описывает электрохемилюминесцентный метод определения, основанный на использовании частиц.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении предложены антитела к теофиллину и способы их применения.

Одним объектом в данном описании является гуманизированное антитело к теофиллину, где антитело содержит (а) гипервариабельный участок тяжелой цепи HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (б) гипервариабельный участок легкой цепи HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 и (в) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

В одном воплощении антитело характеризуется константой диссоциации при связывании с человеческим теофиллином (аффинностью) 10^-12 моль/л или менее.

В одном воплощении антитело также содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09, (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 и (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

В одном воплощении антитело также содержит (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 и (в) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

В одном воплощении антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в положении 71 вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток аргинин (нумерация по Кабату).

В одном воплощении антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в положении 46 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток лейцин (нумерация по Кабату).

В одном воплощении антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в положении 71 вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток аргинин (нумерация по Кабату) и в положении 46 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток лейцин (нумерация по Кабату).

В одном воплощении антитело содержит (а) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи VH, идентичную по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12; (б) последовательность вариабельного домена легкой цепи VL, идентичную по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или (в) последовательность VH как в (а) и последовательность VL как в (б), где аминокислотный остаток в положении 71 вариабельного домена тяжелой цепи (нумерация по Кабату) представляет собой аргинин, а аминокислотный остаток в положении 46 вариабельного домена легкой цепи (нумерация по Кабату) представляет собой лейцин.

В одном воплощении антитело содержит VH с последовательностью SEQ ID NO: 12.

В одном воплощении антитело содержит VL с последовательностью SEQ ID NO: 16.

Одним объектом в данном описании является антитело, содержащее VH с последовательностью SEQ ID NO: 12 и VL с последовательностью SEQ ID NO: 16.

В одном воплощении антитело представляет собой полноразмерное антитело lgG1 или полноразмерное антитело lgG4.

В одном воплощении антитело представляет моноклональное антитело.

В одном воплощении антитело представляет фрагмент антитела, связывающий теофиллин.

Одним объектом данного описания является фармацевтическая композиция, содержащая антитело, описанное в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

Одним объектом данного описания является антитело, описанное в данном документе, для применения в качестве лекарственного препарата.

Одним объектом данного описания является применение антитела, описанного в данном документе, для изготовления лекарственного препарата.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Экспрессия химерных и гуманизированных антител, связывающих теофиллин: результаты электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН-ПАГ) в восстанавливающих условиях демонстрируют состав и гомогенность химерного (средняя дорожка) и гуманизированного (правая дорожка) антител после очистки с использованием белка А и эксклюзионной хроматографии. Левая дорожка - маркер молекулярного веса. Тяжелой Н-цепи (верхняя полоса на уровне 50 кДа) и легкой L-цепи (нижняя полоса на уровне 25 кДа) определяются в виде одиночных полос, дополнительных белковых загрязнений не наблюдается.

Фиг. 2. Иммуноферментный анализ (ИФА) демонстрирует специфичное и эффективное связывание антитела с иммобилизованным теофиллином.

Фиг. 3. Профиль связывания антител, связывающих теофиллин, при исследовании методом SPR (от англ. surface plasmon resonance, поверхностный плазмонный резонанс).

Фиг. 4. а) Состав, структура и молекулярный вес Теофиллина-Cys-Су5; б) эксклюзионная хроматография демонстрирует чистоту и гомогенность очищенных вариантов антител, связывающих теофиллин; пик №2 соответствует очищенному продукту, отсутствие пика №1 указывает на отсутствие агрегатов в препаратах; в) образование ковалентных комплексов между антителами, связывающими теофиллин, и Теофиллином-Cys-Су5 по результатам ДСН-ПАГ в невосстанавливающих (левые дорожки) и восстанавливающих (правые дорожки) условиях; Су5 оказывается связанным с Н-цепью в невосстанавливающих условиях только в образцах, содержащих Теофиллин-Cys-Су5 и антитело с мутацией, вводящей цистеин, эти ковалентные конъюгаты распадаются при восстановлении (правые дорожки). Дорожки: 1 - маркер молекулярного веса; 2-4 - невосстанавливающие условия: 2 - антитело к теофиллину (без мутации, вводящей cys) + Теофиллин-Cys-Су5 (комплекс); 3 - cys_55-антитело к теофиллину + Теофиллин-Cys-Су5 (конъюгат); 4 - cys_54-антитело к теофиллину + Теофиллин-Cys-Су5 (конъюгат); 5-7 - восстанавливающие условия: 5 - антитело к теофиллину (без мутации, вводящей cys) + Теофиллин-Cys-Су5 (комплекс); 6 - cys_55-антитело к теофиллину + Теофиллин-Cys-Су5 (конъюгат); 7 - cys_54-антитело к теофиллину + Теофиллин-Cys-Су5 (конъюгат).

Фиг. 5. Аффинность антитела, связывающего теофиллин, оценивали методом поверхностного плазмонного резонанса в экспериментах на биосенсоре BIAcore. Fab-фрагменты антитела иммобилизовали на поверхности чипа при помощи захватывающего антитела анти-huFab и затем приводили в контакт с "грузом", соединенным с молекулой теофиллина (Тео-пептидом). Формировались комлексы 1:1 (Fab:теофиллин-"груз"). Наблюдалось быстрое связывание (высокая скорость ассоциации), при этом диссоциация не регистрировалась, т.е. значимого высвобождения связанного антигена не наблюдалось.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Определения

"Акцепторные каркасные участки человеческого происхождения" в данном описании представляют собой каркасные участки, содержащие аминокислотную последовательность каркасных участков вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученные на основе каркасных участков иммуноглобулина человека или консенсусных последовательностей каркасных участков человеческого происхождения, как описано ниже. Акцепторные каркасные участки, "полученные на основе" каркасных участков иммуноглобулина человека или консенсусных последовательностей каркасных участков человеческого происхождения, могут содержать ту же аминокислотную последовательность или могут иметь измененную аминокислотную последовательность. В некоторых воплощениях число аминокислотных замен равно 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых воплощениях последовательность человеческих акцепторных каркасных участков VL идентична последовательности каркасных участков VL иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасных участков человеческого происхождения.

"Аффинность" обозначает суммарную силу всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иначе, термин "аффинность связывания" в данном документе обозначает собственную аффинность связывания, которая отражает взаимодействие между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном) при соотношении 1:1. Аффинность молекулы X к своему партнеру Y обычно характеризуют константой диссоциации (Kd). Аффинность определяют общепринятыми способами, известными в данной области техники, включая описанные в данном документе. Некоторые типовые и приведенные в качестве примеров воплощения для измерения аффинности связывания описаны ниже.

Антитело, "подвергнутое аффинному созреванию", обозначает антитело с одной или несколькими модификациями в одном или нескольких гипервариабельных участках (HVR, от англ. hypervariable regions), по сравнению с материнским антителом, не имеющим таких модификаций, указанные модификации повышают аффинность антитела к антигену.

Термины "антитело к теофиллину" и "антитело, связывающее теофиллин" обозначают антитело, способное связывать теофиллин с аффинностью, достаточной для применения антитела в качестве диагностического и/или терапевтического агента, избирательно взаимодействующего с теофиллином. В одном воплощении связывание антитела к теофиллину с неспецифическим белком, отличным от теофиллина, составляет менее 10% от связывания антитела с теофиллином, например, при определении с помощью радиоиммунологического анализа (РИА). В некоторых воплощениях константа диссоциации (Kd) антитела, связывающегося с теофиллином, составляет ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М).

Термин "антитело" в данном документе используется в широком смысле и охватывает антитела с различной структурой, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую антигенсвязывающую активность, но не ограничивается ими.

"Фрагмент антитела" обозначает молекулу, отличную от интактного антитела, содержащую часть интактного антитела, связывающую антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.

"Антитело, связывающееся с тем же эпитопом", что и референтное антитело, обозначает антитело, блокирующее связывание референтного антитела с его антигеном в тестах конкурентного связывания на 50% или более, и наоборот, референтное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в тестах конкурентного связывания на 50% или более. Примеры тестов конкурентного связывания приводятся ниже.

Термин "химерное" антитело обозначает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит от конкретного источника или биологического вида, тогда как оставшаяся часть тяжелой и/или легкой цепи происходит от другого источника или биологического вида.

"Класс" антитела обозначает тип константного домена или константной области его тяжелой цепи. У человека существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть подразделены на подклассы, например, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 и lgA2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначаются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Термин "цитотоксический агент" в данном документе обозначает вещество, подавляющее или предотвращающее осуществление клеточной функции и/или вызывающее гибель или разрушение клетки. Цитотоксические агенты включают радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты, ингибирующие рост; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или энзиматически активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая фрагменты и/или их варианты; и различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже, но не ограничиваются ими.

"Эффекторные функции" обозначают такие формы биологической активности, приписываемые Fc-фрагменту антитела, которые варьируются в зависимости от класса антител. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC, от англ. complement dependent cytotoxicity); связывание Fc рецептора; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC, от англ. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity); фагоцитоз; снижение экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора) и активацию В-клеток.

"Эффективное количество" агента, например, в фармацевтической композиции, обозначает количество, позволяющее достичь желаемый терапевтический или профилактический результат в необходимых дозировках и за необходимый период времени.

Термин "Fc фрагмент" в данном описании обозначает С-концевой участок тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий по меньшей мере часть константного участка. Термин включает Fc фрагменты с нативной последовательностью и варианты Fc фрагментов. В одном воплощении Fc фрагмент тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Рго230 до карбокси-конца тяжелой цепи. При этом С-концевой лизин (Lys447) Fc фрагмента может присутствовать или отсутствовать. Если не указано иначе, нумерация аминокислотных остатков Fc фрагмента или константного участка соответствует системе нумерации EU, также носящей название «EU index», согласно описанию Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

"Каркасные участки" или "FR" (от.англ. "framework regions") обозначают остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельных участков (HVR, от англ. hypervariable regions). FR вариабельного домена, как правило, состоит из 4 доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR в составе VH (или VL), как правило, располагаются в следующей последовательности: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термины "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "полное антитело" в данном описании используются взаимозаменяемо и обозначают антитело, имеющее структуру по существу схожую со структурой нативного антитела, или имеющее тяжелые цепи, содержащие Fc фрагмент, согласно данному описанию.

Термины "клетка-хозяин", "линия клеток-хозяев" и "культура клеток-хозяев" используются взаимозаменяемо и обозначают клетки, в которые была внедрена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты" и "трансформированные клетки", включающие первично трансформированные клетки и их потомков, независимо от числа пассажей. Потомство может быть не полностью идентично родительской клетке по содержанию нуклеиновой кислоты, но может иметь мутации. Сюда также включаются мутантные потомки, проявляющие при скрининге или отборе такие же функции или биологическую активность, как и исходные трансформированные клетки.

"Человеческое антитело" представляет собой антитело, имеющее аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, продуцируемого в организме или в клетках человека, или полученного из источника, не относящегося к человеку, но задействующего репертуар антител человека или иные последовательности, кодирующие антитела человека. Данное определение человеческого антитела в частности исключает гуманизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие остатки, не являющиеся человеческими.

"Консенсусные каркасные участки человеческого происхождения" это каркасные участки, представляющие наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в наборе последовательностей каркасных участков VL или VH иммуноглобулинов человека. Как правило, последовательности VL или VH иммуноглобулинов человека выбирают из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу согласно описанию Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном воплощении подгруппой для VL является подгруппа каппа I, согласно Kabat et al., см. выше. В одном воплощении подгруппой для VH является подгруппа III, согласно Kabat et al., см. выше.

"Гуманизированное" антитело обозначает химерное антитело, содержащее аминокислотные остатки гипервариабельных участков, не являющихся человеческими, и аминокислотные остатки каркасных участков человеческого происхождения. В определенных воплощениях гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все HVR (например, CDR, от англ. complementarity determining regions) соответствуют участкам антитела, не являющегося человеческим, и все или по существу все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело может содержать по меньшей мере часть константного участка антитела, полученного из антитела человека. "Гуманизированная форма" антитела, например, антитела не являющегося человеческим, обозначает антитело, прошедшее гуманизацию.

Термин "гипервариабельный участок" или "HVR" в данном описании обозначает каждый из участков вариабельного домена антитела, имеющих гипервариабельную последовательность и/или формирующих петли определенной структуры ("гипервариабельные петли"). Как правило, нативные антитела, состоящие из четырех цепей, имеют 6 HVR; три в VH (Н1, Н2, Н3), и три в VL (L1, L2, L3). Как правило, HVR содержат аминокислотные остатки гипервариабельных петель и/или "участков, определяющих комплементаность" (CDR), последние характеризуются наибольшей вариабельностью последовательности и/или задействованы в распознавании антигена. Например, гипервариабельные петли находятся между аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3). (Chothia, С. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Например, CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) находятся между аминокислотными остатками 24-34 в L1, 50-56 в L2, 89-97 в L3, 31-35 В в Н1, 50-65 в Н2 и 95-102 в Н3. (Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.) Как правило, CDR содержат аминокислотные остатки, образующие гипервариабельные петли, за исключением CDR1 в составе VH. CDR также включают "остатки, определяющие специфичность" или "SDR" (от англ. specificity determining regions), которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR находятся в составе участков CDR, обозначаемых "укороченными CDR", или a-CDR (от англ. abbreviated CDR). Например, a-CDR (а-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) образованы аминокислотными остатками в положениях 31-34 в L1, 50-55 в L2, 89-96 в L3, 31-35 В в Н1, 50-58 в Н2 и 95-102 в Н3. (См. Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). Если не указано иначе, остатки HVR и иные остатки вариабельного домена (например, остатки каркасного участка) в данном документе пронумерованы согласно Kabat et al., см. выше.

"Иммуноконъюгат" представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичной(ыми) молекулой(ами), включая цитотоксический агент, но не ограничиваясь им.

"Индивидуум" или "субъект" является млекопитающим. Млекопитающие включают одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и отличных от человека приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс), но не ограничиваются ими. В определенных воплощениях индивидуумом или субъектом является человек.

"Выделенное" антитело представляет собой антитело, изолированное от компонентов его естественного окружения. В некоторых воплощениях антитело очищено до степени чистоты более чем 95% или 99%, при определении, например, с помощью электрофоретических (например, с помощью ДСН-ПАГ, изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), капиллярного электрофореза) или хроматографических методов (например, с помощью ионообменной или обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)). Обзор способов оценки чистоты антител представлен, например, Flatman, S. et al., J. Chrom. В 848 (2007) 79-87.

"Выделенная" нуклеиновая кислота обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, изолированную от компонентов ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, обычно содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты находится внехромосомно или в участке хромосомы, отличном от естественного положения на хромосоме.

"Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к теофиллину" обозначает одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая такую(ие) молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в составе одного вектора или в отдельных векторах, при этом такая(ие) молекула(ы) нуклеиновой кислоты находи(я)тся в одном или нескольких местоположениях в клетке-хозяине.

Термин "моноклональное антитело" в данном документе обозначает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связывают один эпитоп, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, которые возникают естественным путем или в ходе получения препарата моноклонального антитела, при этом подобные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В противоположность препаратам поликлональных антител, обычно содержащим различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против единственной детерминанты или антигена. Таким образом, определение "моноклональное" указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как необходимость получения антитела определенным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут быть произведены с помощью различных технологий, включая гибридомную технологию, технологию рекомбинантной ДНК, технологию фагового дисплея и технологии с использованием трансгенных животных, имеющих все локусы человеческих иммуноглобулинов или их часть; данные способы и другие типовые способы производства моноклональных антител описаны в данном документе.

"Голое антитело" обозначает антитело, не конъюгированное с гетерологичным компонентом (например, цитотоксическим компонентом) или радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтической композиции.

"Нативные антитела" обозначают молекулы иммуноглобулинов, возникающие естественным образом и имеющие различные структуры. Например, нативные антитела класса IgG являются гетеротетрамерными гликопротеинами весом приблизительно 150000 дальтон, состоящими из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидной связью. В направлении от N- к С-концу каждой тяжелой цепи расположен вариабельный участок (VH), также обозначаемый вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которым следуют три константных домена (СН1, СН2 и СН3). Аналогично, в направлении от N- к С-концу каждой легкой цепи расположен вариабельный участок (VL), также обозначаемый вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым расположен константный легкий домен (CL). Легкая цепь антитела может относиться к одному из двух типов, обозначаемых каппа (κ) и лямбда (λ), в зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена.

Термин "листовка-вкладыш" обозначает инструкции, обычно вкладываемые в коммерческую упаковку терапевтических продуктов, содержащие информацию о показаниях к применению, способах применения, дозировках, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.

"Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" относительно референтной полипептидной последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в референтной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и расстановки пропусков (гэпов), если это необходимо для достижения наибольшего процента идентичности последовательностей, и без принятия каких-либо консервативных замен за часть идентичной последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности выполняют различными способами, известными в данной области техники, например, с помощью общедоступных компьютерных программ, таких как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут выбрать нужные параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. В данном документе значения % идентичности аминокислотной последовательности получены при помощи компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана в компании Genentech, Inc., исходный код был представлен вместе с пользовательской документацией в бюро по охране авторских прав США, Washington D.C., 20559, где было зарегистрировано авторское право под номером TXU510087. Доступ к программе ALIGN-2 можно получить в компании Genentech, Inc., South San Francisco, California, или скомпилировать код программы на основе исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для работы на платформе UNIX, включая платформу digital UNIX V4.0D. Все параметры для сравнения последовательностей заданы программой ALIGN-2 и остаются неизменными.

В случаях, когда для сравнения аминокислотных последовательностей используют ALIGN-2, процент идентичности заданной аминокислотной последовательности А к последовательности В, с последовательностью В, или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В (что можно также сформулировать как заданная аминокислотная последовательность А, имеющая или содержащая определенный процент идентичной аминокислотной последовательности к последовательности В, с последовательностью В, или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В) рассчитывают по формуле:

где X - это число аминокислотных остатков, которые были расценены программой для выравнивания последовательностей ALIGN-2 как абсолютные совпадения при выравнивании А и В в рамках этой программы, и где Y - это общее число аминокислотных остатков в В. Следует принимать во внимание, что когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, процент идентичности аминокислотной последовательности А с последовательностью В не будет равен проценту идентичности аминокислотной последовательности В с последовательностью А. Если не указано иначе, все значения % идентичности аминокислотных последовательностей, приведенные в данном документе, получены, как описано в предыдущем параграфе о применении компьютерной программы ALIGN-2.

Термин "фармацевтическая композиция" обозначает препарат, который находится в такой форме, которая обеспечивает эффективное проявление биологической активности содержащегося в нем активного ингредиента, и не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому предстоит введение композиции.

"Фармацевтически приемлемый носитель" обозначает ингредиент в фармацевтической композиции, отличный от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.

Термин "теофиллин", сокращенно "Тео", обозначает 1,3-диметил-7Н-пурин-2,6-дион. Теофиллин также известен под названием диметилксантин.

Используемый в данном документе термин "лечение" (и его грамматические производные, такие как "лечить" или "проводить лечение") обозначает клиническое вмешательство в попытке изменить естественный ход заболевания у индивида, получающего лечение, и может осуществляться как для профилактики, так и при наличии патологического состояния. Желательные эффекты от лечения включают предупреждение возникновения или повторного проявления заболевания, смягчение симптомов, уменьшение любых прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предупреждение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение состояния, а также ремиссию или улучшение прогноза, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях антитела по изобретению применяют, чтобы отсрочить развитие заболевания или чтобы замедлить прогрессирование заболевания.

Термин "вариабельный участок" или "вариабельный домен" обозначает домен легкой или тяжелой цепи антитела, задействованный в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей нативного антитела (VH и VL, соответственно), как правило, имеют схожую структуру, каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например., Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), c. 91). Для обеспечения специфичности связывания антигена может быть достаточно одного VH или VL домена. Кроме того, антитела, связывающиеся с конкретным антигеном, можно выделить с использованием VH или VL домена антитела, связывающегося с антигеном, при скрининге библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно. См., например, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

Термин "вектор", используемый в данном документе, обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, обеспечивающую передачу другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, инкорпорированный в состав генома клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы здесь обозначаются "экспрессирующие векторы".

Термин "гаптен" обозначает низкомолекулярную молекулу, которая способна вызывать иммунный ответ только будучи присоединенной к высокомолекулярному носителю, такому как белок. Примерами гаптенов являются анилин, о-, м- и п-аминобензойная кислота, хинон, гидралазин, галотан, флуоресцеин, биотин, дигоксигенин, теофиллин и динитрофенол. В одном воплощении гаптен представляет собой биотин или дигоксигенин, или теофиллин, или карборан.

Термин "гаптен, конъюгированный с" или "конъюгированное с гаптеном соединение" обозначает гаптен, ковалентно связанный с другим компонентом, таким как полипептид или метка. Активированные производные гаптена часто используют в качестве исходного материала для получения таких конъюгатов. В одном воплощении гаптен представляет собой дигоксигенин и конюгирован с компонентом при помощи линкера (в одном воплощении через свою 3-гидрокси группу). В одном воплощении линкер содержит: а) одну или несколько (в одном воплощении от трех до шести) метилен-карбоксиметильных групп (-СН₂-С(O)-) и/или б) от 1 до 10 (в одном воплощении от 1 до 5) аминокислотных остатков (в одном воплощении выбранных из глицина, серина, глутмата, β-аланина, γ-аминобутировой кислоты, ε-аминокапроновой кислоты или лизина) и/или в) одно или несколько соединений (в одном воплощении одно или два соединения), имеющих структурную формулу NH₂-[(CH₂)_nO]_xCH₂-CH₂-COOH, где n равно 2 или 3, а х принимает значения от 1 до 10, в одном воплощении от 1 до 7. Последний элемент формирует (по меньшей мере частично) линкер (часть линкера), имеющего формулу -NH-[(CH₂)_nO]_xCH₂-CH₂-C(O)-. Одним из примеров таких соединений является 12-амино-4,7,10-триоксадодекановая кислота (формирует триэтиленгликолевый (ТЭГ) линкер). В одном воплощении линкер также содержит малеимидную группу. Линкер оказывает стабилизирующее и солюбилизирующее действие, поскольку несет заряд и/или может образовывать водородные связи. Кроме того, он стерически способствует связыванию между антителом к гаптену и полипептидом, конъюгированным с гаптеном. В одном воплощении линкер расположен на боковой цепи аминокислоты полипептида (например, конъюгирован с боковой цепью лизина или цистеина через аминогруппу или тиоловую группу). В одном воплощении линкер расположен на амино-конце или карбокси-конце полипептида. Участок полипептида, в котором будет располагаться линкер, обычно подбирают таким образом, чтобы расположение линкера не влияло на биологическую активность полипептида. Таким образом, точка присоединения линкера зависит от природы полипептида и соответствующих структурных элементов, отвечающих за биологическую активность. Биологическую активность полипептида, к которому присоединяют гаптен, можно исследовать in vitro.

Термин "образование ковалентного комплекса" означает, что после формирования нековалентного комплекса, например, между антителом к теофиллину и теофиллином, образуется ковалентная связь между двумя партнерами, входящими в состав комплекса. Образование ковалентной связи не требует добавления дополнительных реагентов.

II. Композиции и способы

В одном аспекте изобретение основано на антителах, которые связываются с теофиллином. Такие антитела описаны в данном документе. Антитела по изобретению могут найти применение, например, в качестве моноспецифических антител для связывания конъюгированных с теофиллином соединений и в качестве мультиспецифических антител в диагностике или лечении всевозможных заболеваний, благодаря специфичному связыванию конъюгированного с теофиллином соединения и универсальной способности антитела переносить связанные с ним молекулы.

А. Примеры антител к теофиллину

В одном аспекте изобретения предложены выделенные антитела, которые связываются с теофиллином. В некоторых воплощениях антитела к теофилину представляют собой гуманизированные антитела к теофиллину. В некоторых воплощениях антитела к теофиллину, описанные в данном документе, связывают конъюгированные с теофиллином соединения, не влияя на биологическую активность соединения, конъюгированного с теофиллином и специфически связанного с антителом через теофиллин. Таким образом, данные антитела можно применять для улучшения фармакокинетических свойств соединений, конъюгированных с теофиллином, если антитело представляет собой моноспецифическое антитело. Кроме того, данные антитела можно применять для направленной доставки конъюгированного с теофиллином соединения, если антитело представляет собой би- или мультиспецифическое антитело, у которого одна связывающая детерминанта направлена против теофиллина и может использоваться как универсальная детерминанта для "груза", тогда как вторая связывающая детерминанта специфически связывается, например, с молекулой клеточной поверхности и обеспечивает избирательность связывания би- или мультиспецифического антитела.

В одном аспекте изобретения предложено антитело к теофиллину, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; (г) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (д) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06 и (е) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07.

В одном аспекте изобретения предложено антитело к теофиллину, содержащее последовательности по меньшей мере одного, по меньшей мере двух или по меньшей мере трех HVR VH, выбранных из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01, (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02 и (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03. В одном воплощении антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03. В другом воплощении антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03 и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07. В следующем воплощении антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02. В следующем воплощении антитело содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01, (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02 и (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03.

В другом аспекте изобретения предложено антитело к теофиллину, содержащее последовательности по меньшей мере одного, по меньшей мере двух или по меньшей мере трех HVR VL, выбранных из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05, (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06, и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07. В одном воплощении антитело содержит (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05, (б) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06, и (в) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07.

В другом аспекте антитело к теофиллину, согласно изобретению, содержит (а) домен VH, содержащий последовательности по меньшей мере одного, двух или трех HVR VH, выбранных из (i) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01; (ii) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02 и (iii) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; и (б) домен VL, содержащий последовательности по меньшей мере одного, двух или трех HVR VL, выбранных из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06 и (iii) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07.

В другом аспекте изобретения предложено антитело к теофиллину, содержащее (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06, и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07.

В одном воплощении антитело является гуманизированным.

В одном аспекте изобретения предложено гуманизированное антитело к теофиллину, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (г) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (д) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (е) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

В одном аспекте изобретения предложено гуманизированное антитело к теофиллину, содержащее последовательности по меньшей мере одного, по меньшей мере двух или по меньшей мере трех HVR VH, выбранные из (a) HVR-Н1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09, (б) HVR-Н2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 и (в) HVR-Н3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В одном воплощении антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В другом воплощении антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В следующем воплощении антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В следующем воплощении антитело содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09, (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 и (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

В другом аспекте изобретения предложено гуманизированное антитело к теофиллину, содержащее последовательности по меньшей мере одного, по меньшей мере двух или по меньшей мере трех HVR VL, выбранные из: (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В одном воплощении антитело содержит: (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (в) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

В другом аспекте антитело к теофиллину, согласно изобретению, содержит: (а) домен VH, содержащий последовательности по меньшей мере одного, по меньшей мере двух или всех трех HVR VH, выбранных из (i) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09; (ii) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 и (iii) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и (б) домен VL, содержащий последовательности по меньшей мере одного, по меньшей мере двух или всех трех HVR VL, выбранных из (i) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (ii) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (iii) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

В другом аспекте изобретения предложено гуманизированное антитело к теофиллину, содержащее: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15.

В другом аспекте изобретения предложено гуманизированное антитело к теофиллину, содержащее: (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06 и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 07, где аминокислотный остаток в положении 60 в составе HVR-H2 представляет собой А, а аминокислотный остаток в положении 61 в составе HVR-H2 представляет собой Q.

В одном воплощении гуманизированное антитело к теофиллину содержит HVR, как в любом из вышеуказанных воплощений, а также содержит акцепторные каркасные участки человеческого происхождения, например, каркасные участки иммуноглобулина человека или консенсусные каркасные участки человеческого происхождения. В одном воплощении гуманизированное антитело к теофиллину содержит HVR, как в любом из вышеуказанных воплощений, а также содержит

- R в положении 71.

Положение 71 по Кабату соответствует остатку под номером 72 в последовательностях SEQ ID NO: 04, 12 и 20.

Данную замену (обратную мутацию) осуществили для повышения аффинности гуманизированного антитела к теофиллину.

В другом аспекте антитело к теофиллину содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 04. В некоторых воплощениях последовательность VH, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с референтной последовательностью, но антитело к теофиллину, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связывать теофиллин. В некоторых воплощениях в последовательности SEQ ID NO: 04 замещено, вставлено и/или удалено в сумме от 1 до 10 аминокислот. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции находятся в областях, за пределами HVR (т.е. в FR). Возможно, антитело к теофиллину содержит последовательность VH, представленную SEQ ID NO: 04, включая пост-трансляционные модификации данной последовательности. В конкретном воплощении VH содержит один, два или три HVR, выбранные из: (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01, (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02 и (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03.

В одном воплощении гуманизированное антитело к теофиллину содержит HVR, как в любом из вышеуказанных воплощений, а также содержит акцепторные каркасные участки человеческого происхождения, например, каркасные уастки иммуноглобулина человека или консенсусные каркасные участки человеческого происхождения. В одном воплощении гуманизированное антитело к теофиллину содержит VH, содержащий HVR-H, как в любом из вышеуказанных воплощений, а также содержит

- R в положении 71.

В другом аспекте предложено антитело к теофиллину, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), идентичный по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 08. В некоторых воплощениях последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с референтной последовательностью, но антитело к теофиллину, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связывать теофиллин. В некоторых воплощениях в последовательности SEQ ID NO: 08 замещено, вставлено и/или удалено в сумме от 1 до 10 аминокислот. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции находятся в областях, за пределами HVR (т.е. в FR). Возможно, антитело к теофиллину содержит последовательность VL, представленную SEQ ID NO: 08, включая пост-трансляционные модификации данной последовательности. В конкретном воплощении VL содержит один, два или три HVR, выбранные из: (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05, (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06, и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07.

В другом аспекте предложено антитело к теофиллину, где антитело содержит VH, как в любом из вышеуказанных воплощений, и VL, как в любом из вышеуказанных воплощений. В одном воплощении антитело содержит последовательности VH и VL как в последовательностях SEQ ID NO: 04 и SEQ ID NO: 08, соответственно, включая пост-трансляционные модификации данных последовательностей.

В одном воплощении гуманизированное антитело к теофиллину содержит HVR, как в любом из вышеуказанных воплощений, а также содержит акцепторные каркасные участки человеческого происхождения, например, каркасные участки иммуноглобулина человека или консенсусные каркасные участки человеческого происхождения. В одном воплощении гуманизированное антитело к теофиллину содержит VL, содержащий HVR-L как в любом из вышеуказанных воплощений, а также содержит

-Lb положении 46.

Положение 46 по Кабату соответствует остатку под номером 51 в последовательностях SEQ ID NO: 08, 16 и 24.

В другом аспекте гуманизированное антитело к теофиллину содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях последовательность VH, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с референтной последовательностью, но антитело к теофиллину, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связывать теофиллин. В некоторых воплощениях в последовательности SEQ ID NO: 12 замещено, вставлено и/или удалено в сумме от 1 до 10 аминокислот. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции находятся в областях, за пределами HVR (т.е. в FR). Возможно, антитело к теофиллину содержит последовательность VH как в последовательности SEQ ID NO: 12, включая пост-трансляционные модификации данной последовательности. В конкретном воплощении VH содержит один, два или три HVR, выбранные из: (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09, (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 и (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

В другом аспекте предложено гуманизированное антитело к теофиллину, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), идентичный по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. В некоторых воплощениях последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с референтной последовательностью, но антитело к теофиллину, содержащее данную последовательность, сохраняет способность связывать теофиллин. В некоторых воплощениях в последовательности SEQ ID NO: 16 замещено, вставлено и/или удалено в сумме от 1 до 10 аминокислот. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции находятся в областях, за пределами HVR (т.е. в FR). Возможно, антитело к теофиллину содержит последовательность VL как в последовательности SEQ ID NO: 16, включая пост-трансляционные модификации данной последовательности. В конкретном воплощении VL содержит один, два или три HVR, выбранные из: (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

В другом аспекте предложено гуманизированное антитело к теофиллину, где антитело содержит VH, как в любом из вышеуказанных воплощений, и VL, как в любом из вышеуказанных воплощений. В одном воплощении антитело содержит последовательности VH и VL как в последовательностях SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 16, соответственно, включая посттрансляционные модификации данных последовательностей.

В следующем аспекте изобретения антитело к теофиллину, согласно любому из вышеуказанных воплощений, представляет собой моноклональное антитело, включая химерное, гуманизированное или человеческое антитело. В одном воплощении антитело к теофиллину представляет собой фрагмент антитела, например, Fv, Fab, Fab', scFv, диатело или F(ab')₂ фрагмент. В другом воплощении антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное антитело lgG1 или lgG4 или антитело другого класса или изотипа, согласно данному описанию.

В следующем аспекте антитело к теофиллину, согласно любому из вышеуказанных воплощений, может иметь любые признаки, описанные ниже в разделах 1-5, как в отдельности, так и в сочетании:

1. Аффинность антитела

В некоторых воплощениях предложенное здесь антитело имеет константу диссоциации (Kd) ≤ 0,001 нМ (например, 10^-12 М или менее, например, от 10^-12 М до 10^-13 М).

В одном воплощении Kd определяют, исследуя связывание радиоактивно меченого антигена (РИА), где используют Fab версию антитела, представляющего интерес, и его антиген, согласно следующему ниже описанию. Аффинность связывания Fab с антигеном в растворе оценивают после установлении равновесия между Fab и (¹²⁵I)-меченым антигеном в минимальной концентрации в присутствии серии последовательных разведений немеченого антигена, с последующей иммобилизацией связанного антигена на планшете, покрытом антителом к Fab (см., например, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Для оптимизации условий эксперимента в многолуночные планшеты MICROTITER® (Thermo Scientific) инкубируют в течение ночи с захватывающим анти-Fab антителом (Cappel Labs) в концентрации 5 мкг/мл в 50 мМ растворе карбоната натрия (рН 9,6), а затем блокируют 2% (вес/об) раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в течение 2-5 часов при комнатной температуре (приблизительно 23°С). В неадсорбирующих планшетах (Nunc #269620) смешивают 100 пМ или 26 пМ [¹²⁵I]-антигена с последовательными разведениями Fab, представляющего интерес (например, аналогично исследованию антитела к VEGF, Fab-12, согласно Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599). Представляющий интерес Fab затем инкубируют в течение ночи, однако инкубация может продолжаться в течение большего периода времени (например, приблизительно 65 часов), чтобы обеспечить достижение равновесия. Затем смесь переносят в планшет для иммобилизации и инкубируют при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют, а планшет восьмикратно отмывают 0,1% раствором полисорбата 20 (TWEEN-20®) в ФСБ. После высыхания планшетов добавляют по 150 мкл/лунку сцинтиллянта (MICROSCINT-20 ™; Packard) и считывают сигнал в планшетах при помощи гамма счетчика TOPCOUNT ™ (Packard) в течение десяти минут.Концентрации каждого Fab, обеспечивающие связывание на уровне 20% или менее от максимального, используют в тестах конкурентного связывания.

В другом воплощении Kd измеряют при помощи поверхностного плазмонного резонанса с применением BIACORE®-2000 или BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с иммобилизацией антигена на поверхности чипа СМ5 до уровня связывания ~10 единиц RU. Вкратце, карбоксиметилированные декстрановые чипы биосенсора (СМ5, BIACORE, Inc.) активируют с помощью N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида гидрохлорида (EDC) и А/-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разводят раствором 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8, до концентрации 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инжектированием со скоростью 5 мкл/мин до достижения уровня связывания белка приблизительно 10 единиц RU. После инжектирования антигена инжектируют 1 М этаноламин для блокирования непрореагировавших групп.Для определения кинетики инжектируют Fab, последовательно разведенные в два раза (от 0,78 нМ до 500 нМ) в ФСБ, содержащем 0,05% сурфактант полисорбат 20 (TWEEN-20™) (ФСБТ) при 25°С со скоростью приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) рассчитывают, используя простую модель связывания один к одному, предоженную Ленгмюром (при помощи программного обеспечения (BIACORE® Evaluation Software версии 3.2) при одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение k_off/k_on См., например, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881. Если при измерении методом поверхностного плазмонного резонанса, описанным выше, скорость ассоциации превышает 10⁶ М^-1 с^-1, то скорость ассоциации определяют, используя метод гашения флуоресценции, позволяющий определить увеличение или уменьшение интенсивности испускаемой флуоресценции (возбуждение = 295 нм; эмиссия = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) 20 нМ антитела, направленного против антигена, (в форме Fab) в ФСБ, рН 7,2, при 25°С в присутствии возрастающих концентраций антигена. Измерения проводят с помощью спектрофотометра, например, спектрофотометра с функцией остановки потока (Aviv Instruments) или спектрофотометра SLM-AMINCO ™ серии 8000 (ThermoSpectronic) с функцией перемешивания в кювете.

2. Фрагменты антител

В некоторых воплощениях предложенное здесь антитело предствляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антител включают Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv и scFv фрагменты, а также другие фрагменты, описанные ниже, но не ограничиваются ими. Обзор некоторых фрагментов антител представлен в публикации Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Обзор scFv фрагментов представлен, например, Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315; см. также WO 93/16185 и патенты US 5571894 и 5587458. В патенте US 5869046 обсуждаются Fab и F(ab')₂ фрагменты, содержащие аминокислотные остатки эпитопа связывания «рецептора спасения» и имеющие повышенное время полужизни in vivo.

Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть бивалентными или биспецифическими. См., например, ЕР 0404097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 и Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Триатела и тетратела также описаны Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134).

Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи или его часть, или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых воплощениях однодоменные антитела представляют собой однодоменные антитела человека (Domantis, Inc., Waltham, MA; см., например, патент US 6248516 В1).

Возможно получение фрагментов антител с применением различных методик, включая протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продукцию в рекомбинантных клетках-хозяевах (например, Е.coli или фагах), согласно данному описанию.

3. Химерные и гуманизированные антитела

В некоторых воплощениях предложенное здесь антитело представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте US 4816567 и Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). В одном примере химерное антитело содержит вариабельный участок, не являющийся человеческим (например, вариабельный участок, происходящий из организма мыши, крысы, хомяка, кролика или отличного от человека примата, например, обезьяны), и константный участок человеческого происхождения. В следующем примере химерное антитело представляет собой антитело "с переключенным классом", у которого класс или подкласс были изменены по сравнению с родительским антителом. Химерные антитела охватывают также их антигенсвязывающие фрагменты.

В некоторых воплощениях химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, антитело, не являющееся человеческим, подвергают гуманизации, чтобы снизить иммуногенность для человека, при этом сохраняя специфичность и аффинность родительского антитела, не являющегося человеческим. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их части) получены из антитела, не являющегося человеческим, a FR (или их части) получены на основе последовательностей антитела человека. Возможно, гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константного участка человеческого антитела. В некоторых воплощениях некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками антитела, не являющегося человеческим (например, антитела из которого получены аминокислотные остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

Гуманизированные антитела и способы их получения представлены, например, в обзоре Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, и более подробно описаны, например, Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, С.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US Patent Nos. 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (описание пересадки SDR (a-CDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (описание "изменения поверхности" ("resurfacing")); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (описание "перегруппировки FR" ("FR shuffling")); Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68, и Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (описание "направленного отбора" для "перегруппировки FR").

Каркасные участки человеческого происхождения, которые могут быть использованы для гуманизации, включают: каркасные участки, выбранные при помощи метода "максимального соответствия" ("best-fit method", см., например Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; каркасные участки, полученные из консенсусных последовательностей человеческих антител с вариабельными участками легкой или тяжелой цепей определенной подгруппы (см., например, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 и Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); зрелые каркасные участки человеческого происхождения (с соматическими мутациями) или каркасные участки зародышевой линии (неперестроенные) (см., например, Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633) и каркасные участки, полученные при скрининге библиотек FR (см., например, Baca, М. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 and Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618).

4. Мультиспецифические антитела

В некоторых воплощениях предложенное здесь антитело представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, имеющие связывающие детерминанты по меньшей мере для двух различных сайтов. В некоторых воплощениях одна из связывающих детерминант предназначена для теофиллина, а другая - для любого другого антигена. В некоторых воплощениях биспецифические антитела могут связывать два различных эпитопа теофиллина. Биспецифические антитела также могут применяться для доставки цитотоксических агентов к клеткам, экспрессирующим теофиллин, с которым связывается антитело. Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

Способы получения мультиспецифических антител включают рекомбинантную ко-экспрессию пар тяжелая цепь-легкая цепь двух иммуноглобулинов, имеющих разную специфичность (см. Milstein, С.and Cuello, А.С., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, and Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), и инженерию "knob-in-hole" (см., например, патент US 5,731,168). Мультиспецифические антитела также могут быть получены за счет наведения электростатических зарядов для получения молекул антител с гетеродимерными Fc-фрагментами (WO 2009/089004); сшивания двух или более антител или их фрагментов (см., например, патент US 4676980 и Brennan, М. et al., Science 229 (1985) 81-83); использования «лейциновых застежек» для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; с помощью технологии "диател" для получения фрагментов биспецифических антител (см., например, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); использования димеров одноцепочечных Fv (sFv) (см., например, Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374) и получения триспецифических антител, например, согласно описанию Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).

Рекомбинантные антитела с тремя или более функциональными антигенсвязывающими сайтами, включая антитела типа "Octopus antibodies," также включены в данное описание (см., например, US 2006/0025576).

В данном описании антитело или фрагмент также охватывают "Fab двойного действия" или "DAF" (от англ. "Dual Acting Fab"), содержащий антигенсвязывающий сайт, связывающий специфический антиген, а также другой отличный антиген (см., например, US 2008/0069820).

Антитело или фрагмент также охватывают мультиспецифические антитела, описанные в документах WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2010/145793.

5. Варианты антител

Некоторые воплощения относятся к вариантам аминокислотных последовательностей антител, предложенных в данном документе. Например, может требоваться улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антитела могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в составе аминокислотной последовательности антитела. Для получения конечной конструкции можно осуществлять любые комбинации делеций, вставок и замен, при условии, что конечная конструкция будет обладать желаемыми характеристиками, например, связыванием антигена.

а) Варианты с заменами, вставками и делециями

В некоторых воплощениях предложены варианты антитела, имеющие одну или более аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для проведения замещающего мутагенеза, включают HVR и FR. Консервативные замены представлены в Таблице 1 под заголовком "предпочтительные замены". Более значительные замены представлены в Таблице 2 под заголовком "примеры замен", и подробнее описаны ниже, с указанием класса боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно вводить в антитело, представляющее интерес, и проводить скрининг полученных продуктов на предмет желаемой активности, например, сохранения/улучшения связывания антигена, понижения иммуногенности или улучшения ADCC или CDC.

Аминокислотные остатки можно сгруппировать в соответствии с общими свойствами боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены влекут за собой замещение представителя одного из этих классов представителем другого класса.

Один вид замен включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(е) вариант(ы), отбираемый(е) для дальнейшего изучения, имее(ю)т модификации (например, улучшение) определенных биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) по сравнению с родительским антителом и/или в значительной степени сохраняе(ю)т определенные биологические свойства родительского антитела. Примером варианта с заменами является антитело, подвергнутое аффинному созреванию, которое может быть легко получено, например, при помощи технологии увеличения аффинности с использованием фагового дисплея, подробно описанной в данном документе. Вкратце, один или более остатков HVR подвергают мутации и проводят скрининг вариантов антитела, экспрессируемых фагом, по определенной биологической активности (например, аффинности связывания).

Модификации (например, замены) могут осуществляться внутри HVR, например, для увеличения аффинности антитела. Такие изменения можно проводить в "горячих точках" HVR, т.е. в остатках, кодируемых кодонами, которые в процессе соматического созревания с высокой частотой подвергаются мутациям (см., например, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), и/или SDR (a-CDR), а у полученных вариантов VH или VL исследовать аффинность связывания. Повышение аффинности путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек описано, например, Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. В некоторых воплощениях для повышения аффинности повышают изменчивость вариабельных генов, выбранных для повышения аффинности при помощи любого из существующих разнообразных методов (например, ПЦР пониженной точности, перестройки цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). После этого создают вторичную библиотеку. Затем проводят скрининг библиотеки для выявления любых вариантов антител с необходимой аффинностью. Другой способ повышения изменчивости включает методы, направленные на изменение HVR, когда рандомизируют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков одновременно). Остатки HVR, задействованные в связывании антигена, можно идентифицировать, например, при помощи аланин-сканирующего мутагенеза или моделирования. В частности, изменениям часто подвергаются CDR-H3 и CDR-L3.

В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции могут возникать в составе одного или нескольких HVR, при условии, что такие изменения существенным образом не снижают способность антитела связывать антиген. Например, могут быть выполнены консервативные замены в HVR (например, описанные здесь консервативные замены), которые существенным образом не снижают аффинность связывания. Такие замены могут располагаться за пределами "горячих точек" HVR или SDR. В некоторых воплощениях, каждый HVR либо остается без изменений, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен в составе вариантов последовательностей VH и VL, приведенных выше.

Эффективным способом идентификации остатков или участков антитела, которые могут стать мишенями направленного мутагенеза, является "аланин-сканирующий мутагенез", описанный Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. В этом способе выявляют целевой аминокислотный остаток или группу целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) и замещают нейтральными или отрицательно заряженными аминокислотами (например, аланином или полиаланином), чтобы выяснить, изменится ли взаимодействие антитела с антигеном. Если при первоначальной замене аминокислот функциональные свойства молекулы изменяются, в этих позициях проводят дальнейшие замены. В качестве альтернативы или дополнения можно провести анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для выявления точек контакта между антителом и антигеном. Данные остатки, задействованные в контактах, а также соседние с ними остатки могут стать кандидатами для замены. Можно проводить скрининг вариантов с целью выявления у них желаемых свойств.

Вставки охватывают присоединение аминокислотных последовательностей в амино- и/или карбокси-концевых областях, длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сотни или более остатков, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примером вставки в концевой области является антитело с N-концевым остатком метионила. Другие варианты молекул антител со вставками включают соединение N- или С-конца антитела с ферментом (например, ADEPT) или полипептидом, позволяющее увеличить время полужизни антитела в сыворотке.

Один предпочтительный вариант представляет собой вариант с одним остатком цистеина, у которого аминокислотный остаток в составе вариабельного домена тяжелой цепи в положении 53 по Кабату представляет собой цистеин.

б) Варианты гликозилирования

В некоторых воплощениях предложенное антитело модифицировано для повышения или понижения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования антитела легко достигается за счет изменения аминокислотной последовательности таким образом, что создаются или удаляются один или несколько сайтов гликозилирования.

В случаях, когда антитело содержит Fc фрагмент, можно модифицировать присоединенные к нему углеводы. Нативные антитела, продуцируемые в клетках млекопитающих, обычно содержат разветвленные двухантенные олигосахариды, которые как правило присоединены посредством N-гликозидной связи к Asn297 СН2 домена Fc фрагмента. См., например, Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32. Олигосахариды могут включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стволе» двухантенной олигосахаридной структуры. В некоторых воплощениях для создания вариантов антитела с некоторыми улучшенными свойствами модифицируют олигосахариды в составе антитела по изобретению.

В одном воплощении предложены варианты антител, у которых углеводная структура, присоединенная (напрямую или опосредовано) к Fc фрагменту, может быть лишена фукозы. Например, содержание фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяют путем расчета среднего содержания фукозы в составе углеводной цепи, присоединенной к Asn297, относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), при определении методом масс-спектрометрии MALDI-TOF, например, согласно WO 2008/077546. Asn297 обозначает остаток аспарагина, находящийся приблизительно в положении 297 Fc фрагмента (нумерация остатков Fc фрагмента соответствует системе EU); однако Asn297 может также находиться на расстоянии ± 3 аминокислот от позиции 297, т.е. между позициями 294 и 300, вследствие незначительных вариаций в последовательности антител. Такие варианты с измененной степенью фукозилирования могут проявлять повышенную ADCC. См, например, US 2003/0157108; US 2004/0093621. Примеры публикаций, описывающих "дефукозилированные" или "лишенные фукозы" варианты антител, включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Примеры клеточных линий, способных продуцировать дефукозилированные антитела, включают клетки Lec13 CHO с нарушением фукозилирования белков (Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108 и WO 2004/056312, в частности, Пример 11) и клеточные линии с выключенными генами, например, с выключенным геном α-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, клетки ОНО с выключенными генами (см., например, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688 и WO 2003/085107).

Также известны варианты антител с бисекционными (разветвленными) олигосахаридами, например, в которых двухантенный олигосахарид, присоединенный к Fc фрагменту антитела, разделен "пополам" GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь пониженную степень фукозилирования и/или повышенную ADCC. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878; US 6,602,684 и US 2005/0123546. Также предложены варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в составе олигосахарида, присоединенного к Fc фрагменту. Данные варианты антител могут обладать улучшенной CDC функцией. Такие варианты антител описаны, например, в документах WO 1997/30087; WO 1998/58964 и WO 1999/22764. (430)

в) Варианты с модификациями Fc фрагмента

В некоторых воплощениях Fc фрагмент антитела, описанного в данном документе, можеть иметь одну или две аминокислотные модификации, таким образом получают варианты Fc фрагмента. Вариант с модификацией Fc фрагмента может содержать последовательность Fc фрагмента человеческого происхождения (например, Fc фрагмента lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4 человека), имеющую аминокислотную модификацию (например, замену) в одной или нескольких аминокислотных позициях.

В некоторых воплощениях изобретение относится к варианту антитела, обладающему некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его подходящим кандидатом для применений, в которых время полужизни антитела in vivo имеет важное значение, однако некоторые эффекторные функции (например, комплемент- и антитело-зависимая клеточная цитотоксичность) являются необязательными или нежелательными. Для подтверждения снижения/устранения CDC и/или ADCC активностей можно исследовать цитотоксичность in vitro и/или in vivo. Например, можно исследовать связывание с Fc рецепторами (FcR), чтобы подтвердить, что антитело не связывается с FcyR (следовательно, по всей вероятности, не обладает ADCC активностью), но сохраняет способность связывать FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные, касающиеся экспрессии FcR на гемопоэтических клетках, кратко изложены в Таблице 3 на стр. 464 в публикации Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. He являющиеся исчерпывающими примеры исследований in vitro, позволяющие оценить ADCC активность молекулы, представляющей интерес, описаны в патенте US 5500362 (см., например, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063 и Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); U.S. Patent No. 5821337 (see Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). В альтернативном случае можно использовать нерадиоактивные методы исследования (см, например, нерадиоактивный метод исследования цитотоксичности для проточной цитометрии ACTI™ (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; и нерадиоактивный метод исследования цитотоксичности CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Эффекторные клетки, подходящие для таких исследований, включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и естественные киллерные клетки (NK). В качестве дополнения или альтернативы ADCC активность молекулы, представляющей интерес, можно оценить in vivo, например, в модели на животных, такой как описанная Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Также, можно исследовать связывание C1q, чтобы подтвердить, что антитело не способно связывать C1q и, следовательно, не обладает CDC активностью. См., например, определение связывания C1q и С3с методом ИФА в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно выполнять исследование CDC (см., например, Gazzano-Santoro, Н., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; and Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). Способы, известные в области техники, позволяют также исследовать связывание FcRn и клиренс/время полужизни in vivo (см., например, Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).

Антитела со сниженной эффекторной функцией охватывают антитела с заменой одного или нескольких остатков в позициях 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 в Fc фрагмента (патент US 6737056). Такие мутанты Fc включают мутанты Fc с заменами двух или нескольких аминокислот в позициях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемые мутанты Fc "DANA", у которых остатки в позициях 265 и 297 замещены аланином (патент US 7332581).

Описаны некоторые варианты антител с усиленным или ослабленным связыванием с FcR (см., например, патент US 6737056; WO 2004/056312 и Shields, R.L et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

В некоторых воплощениях вариант антитела содержит Fc фрагмент, имеющий одну или несколько аминокислотных замен, которые приводят к улучшению ADCC, например, замены в позициях 298, 333 и/или 334 Fc фрагмента (нумерация остатков согласно системе EU).

В некоторых воплощениях модификации Fc фрагмента приводят к изменению (т.е. улучшению или нарушению) связывания C1q и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в патенте US 6194551, WO 99/51642 и Idusogie, Е.Е. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

Антитела с увеличенным временем полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным рецептором FcRn, отвечающим за транспорт материнских IgG к плоду (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593 и Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), описаны в US 2005/0014934. Эти антитела содержат Fc фрагмент с одной или несколькими заменами, которые улучшают связывание Fc фрагмента с FcRn. Такие варианты с модификациями Fc включают варианты с заменами одного или нескольких остатков Fc фрагмента в позициях: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замены остатка в позиции 434 в Fc фрагмента (патент US 7371826).

См. также Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5624821 и WO 94/29351, описывающие другие примеры вариантов с модификациями Fc фрагмента.

г) Модифицированные цистеином варианты антител

В некоторых воплощениях может быть целесообразным создание модифицированных цистеином антител, например, "thioMAbs," в которых один или несколько остатков антитела замещены остатками цистеина. В конкретных воплощениях замещаемые остатки располагаются в доступных сайтах антитела. В результате замены этих остатков на цистеин в доступных сайтах антитела возникают реакционноспособные тиоловые группы, которые могут использоваться для конъюгирования антитела с другими компонентами, например, компонентами лекарств или фрагментами линкер-лекарство, для создания конъюгата антитела, согласно описанию ниже. В некоторых воплощениях цистеином могут быть замещены один или несколько из следующих остатков: V205 легкой цепи (нумерация по Кабат), А118 тяжелой цепи (нумерация EU) и S400 (нумерация EU) Fc области тяжелой цепи. Модифицированные цистеином антитела могут быть получены, как описано, например, в патенте US 7521541.

д) Производные антител

В некоторых воплощениях предложенное в данном документе антитело может быть также модифицировано с целью введения дополнительных небелковых компонентов, известных в данной области техники и легко доступных. Компоненты, подходящие для получения производных антитела, включают водорастворимые полимеры, но не ограничиваются ими. Не являющиеся исчерпывающими примеры водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (как гомополимеры, так и случайные сополимеры), а также декстран или поли(п-винил пирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пролипропиленоксида и этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерол), поливиниловый спирт и их смеси, но не ограничиваются ими. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества при производстве благодаря своей стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьироваться, в случае присоединения более одного полимера, их молекулы могут быть идентичными или различаться. Как правило, число и/или тип полимеров, применяемых для получения производных, определяется исходя из того, какие конкретные свойства или функции антитела, нуждаются в улучшении, и того, будет ли производное антитела применяться в терапии при определенных условиях, и т.д., но не ограничивается данными соображениями.

В другом воплощении предложены конъюгаты антитела и небелковые компоненты, которые могут избирательно нагреваться под воздействием излучения. В одном воплощении небелковый компонент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Излучение может иметь любую длину волны, включая, но не ограничиваясь длинами волн, не повреждающими обычные клетки, но нагревающими небелковый компонент до температуры, которая вызывает гибель клеток, расположенных вблизи небелкового компонента антитела.

Б. Рекомбинантные способы и композиции

Антитела можно получать с помощью рекомбинантных способов и композиций, например, описанных в патенте US 4816567. В одном воплощении предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вариант антитела к теофиллину, описанного в данном документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В следующем воплощении предложены один или несколько векторов (например, экспрессирующих векторов), содержащих такую нуклеиновую кислоту. В следующем воплощении предложены клетки-хозяева, содержащие такую нуклеиновую кислоту. В одном из таких воплощений клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидную клетку (например, клетку Y0, NS0, Sp20). В одном воплощении предложен способ получения антитела к теофиллину, где способ включает культивирование клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, согласно описанию выше, при условиях, подходящих для экспрессии антитела, и возможно, выделение антитела из клеток-хозяев (или среды культивирования клеток-хозяев).

Для получения варианта антитела к теофиллину рекомбинантным способом нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, согласно описанию выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетках-хозяевах. Данную нуклеиновую кислоту легко выделить и секвенировать при помощи стандартных методов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).

Клетки-хозяева, подходящие для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают клетки прокариот или эукариот, описанные в данном документе. Например, антитела могут производиться в бактериях, в частности, когда гликозилирование и эффекторные функции Fc не являются необходимыми. Экспрессия фрагментов антител и полипептидов в бактериях описана, например, в документах US 5648237, US 5789199 и US 5840523 (см. также Charlton, К.А., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, описывающих экспрессию фрагментов антител в Е.coli). После экспрессии антитело можно выделить из бактериальной массы в виде растворимой фракции и затем очистить.

Кроме прокариот в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, подходят микроорганизмы-эукариоты, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, у которых пути гликозилирования "гуманизированы" для получения антител с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. См. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414 и Li, Н. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии (гликозилированных) полипептидов также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Также найдены многочисленные штаммы бакуловирусов, которые используют совместно с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

В качестве хозяев также используют культуры клеток растений. См., например, патенты US 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описывающие технологию PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).

В качестве хозяев также используют клетки позвоночных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, адаптированные для роста в суспензии. Другими примерами клеточных линий млекопитающих, используемых в качестве хозяев, являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7); линия человеческих эмбриональных клеток почки (клетки 293 или 293Т, описанные, например, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК); мышиные клетки сертоли (клетки ТМ4, описанные, например, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени крысы буффало (BRL 3А); клетки легких человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI (описанные, например, Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; клетки MRC 5; и клетки FS4. Другие клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев, включают клетки яичников китайского хомячка (СНО), включая клетки DHFR" СНО (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220) и линии клеток миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых клеточных линий млекопитающих, подходящих в качестве хозяев для получения антител, представлен, например, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.

В. Количественные методы анализа

Идентификацию, скрининг или исследование физических/химических свойств и/или биологической активности предложенных в данном документе антител к теофиллину проводят с помощью различных количественных методов анализа, известных в области техники.

Исследование связывания и другие количественные методы анализа

В одном аспекте определяют антигенсвязывающую активность антитела по изобретению, например, при помощи таких известных способов, как ИФА, вестерн-блоттинг и т.д.

В другом аспекте для идентификации антитела, конкурирующего с антителом, описанным в данном документе, за связывание с теофиллином, применяют конкурентный анализ.

В типовом исследовании конкуренции антител иммобилизованный теофиллин инкубируют с раствором, содержащим первое меченое антитело, связывающееся с теофиллином, и второе немеченое антитело, у которого определяют способность конкурировать с первым антителом за связывание с теофиллином. Второе антитело может находиться в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный теофиллин инкубируют с раствором, содержащим первое меченое антитело, но не содержащим второго немеченого антитела. После инкубации в условиях, позволяющих связаться первому антителу с теофиллином, избыток несвязанного антитела удаляют, и определяют количество метки, связавшейся с иммобилизованным теофиллином. Если количество метки, связавшейся с иммобилизованным теофиллином, существенно снижено в исследуемом образце по отношению к контрольному образцу, это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с теофиллином. См. Harlow, Е. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988).

Г. Иммуноконъюгаты

В изобретении также предложены иммуноконъюгаты, содержащие антитело к теофиллину, описанное в данном документе, конъюгированное с одним или несколькими цитотоксическими агентами, например, химиотерапевтическими агентами или лекарствами, подавляющими рост агентами, токсинами (например, белковыми токсинами, энзиматически активными токсинами бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения и их фрагментами) или радиоактивными изотопами.

В одном воплощении иммуноконгъюгат представляет собой конъюгат антитело-лекарство (ADC, от англ. antibody-drug conjugate), в составе которого антитело конъюгировано с одним или несколькими лекарствами, включая майтансиноид (см. US 5208020, US 5416064 и ЕР 0425235 В1); ауристатин, например, лекарственные фрагменты DE и DF монометилауристатина (ММАЕ и MMAF) (см. US 5635483, US 5780588 и US 7498298); доластатин, калихеамицин или их производные (см. US 5712374, US 5714586, US 5739116, US 5767285, US 5770701, US 5770710, US 5773001 и US 5877296; Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342 и Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); антрациклин, например, дауномицин или доксорубицин (см. Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343 и патент US 6630579); метотрексат; виндезин; таксан, например, доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел, ортатаксел; трихотецен; и СС1065, но не ограничиваясь ими.

В другом воплощении иммуноконъюгат содержит описанное в данном документе антитело, конъюгированное с энзиматически активным токсином или его фрагментом, включая А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, РАРМ и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, ретстриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены, но не ограничиваясь ими.

В другом воплощении иммуноконъюгат содержит описанное в данном документе антитело, конъюгированное с радиоактивным изотопом и формирующее "радиоконъюгат". Существует большое разнообразие радиоактивных изотопов для получения радиоактивных конъюгатов. Примеры их включают At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu. Если радиоконъюгат применяют для детекции, он может содержать радиоактивный изотоп для проведения сцинтиграфического исследования, например, TC^99m или I¹²³, или спиновую метку для проведения исследования методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного под названием магнитного резонансного исследования), например, иод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

Конъюгаты антитела с цитотоксическим агентом можно получать с помощью различных бифункциональных сшивающих агентов для присоединения белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметил адипимидат HCl), активные эфиры (такие как дисукцинимидил суберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо соединения (такие как бис (р-азидобензоил) гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис-(р-диазоний-бензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол 2,6-диизоцианат) и соединения с двумя активными атомами фтора (такие как 1,5-дифлуоро-2,4-динитробензен). Например, иммунотоксин рицина может быть получен согласно описанию Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104. Меченая углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен триаминопентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгирования меченого радиоактивным изотопом нуклеотида с антителом. См. WO94/11026. Линкер может быть "расщепляемым линкером", обеспечивающим высвобождение цитотоксического лекарства в клетках. Например, можно использовать кислотолабильный линкер, чувствительный к пептидазам линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; U.S. Patent No. 5208020).

Иммуноконъюгаты или конъюгаты антитело-лекарство в данном документе явным образом охватывают но не ограничиваются конъюгатами, полученными с помощью образующих поперечные связи реагентов, включающих, но не ограничивающихся BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)-бензоат), которые доступны для приобретения (например, в компании Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, U.S.A).

Д. Способы и композиции для диагностики и детекции

Термин «детекция» в данном описании охватывает количественное и качественное определение.

В одном воплощении предложено антитело к теофиллину для применения в способе диагностики или детекции. Такой способ может представлять собой способ in vitro или in vivo.

В некоторых воплощениях предложены меченые антитела к теофиллину. Метки охватывают детектируемые напрямую метки или компоненты (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также компоненты, например, ферменты или лиганды, детектируемые опосредовано, например, при помощи ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия, но не ограничиваются ими. Примеры меток включают радиоизотопы ³²Р, ¹⁴С, ¹²⁵I, ³Н и ¹³¹I, флуорофоры, например, редкоземельные хелаты или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу (патент US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP, от англ. horseradish peroxidase), щелочную фосфатазу, В-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, оксидазы гетероциклических соединений, такие как уриказа и ксантин-оксидаза, связанные с ферментом, использующим пероксид водорода для окисления хромогена, таким как пероксидаза хрена, лактопероксидаза или микропероксидаза, теофиллин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы, и им подобные, но не ограничиваются ими.

Е. Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции антитела к теофиллину, описанного в данном документе, изготавливают путем смешивания данного антитела к теофиллину, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или несколькими возможными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)), в форме лиофилизированного препарата или водного раствора. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают: буферы, например, фосфатный, цитратный и содержащие другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензил аммоний хлорид; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, такие как поли(винил)пирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; углеводы, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), но не ограничиваются ими. Примеры фармацевтически приемлемых носителей в данном документе также включают диспергирующие агенты, такие как активные в нейтральных условиях 5 растворимые гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Примеры некоторых sHASEGP, включая rHuPH20, и способы их применения описаны в публикациях US 2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP комбинируют с одним или несколькими 10 гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.

Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в патенте US 6,267,958. Водные композиции антител включают описанные в патентах US 6,171,586 и WO 2006/044908, последние содержат гистидин-ацетатный буфер.

В состав композиций также могут входить несколько активных 15 ингредиентов, необходимых для лечения конкретного заболевания, предпочтительно имеющих комплементарную активность и не оказывающих друг на друга отрицательного влияния. Например, может быть целесообразным включение [[перечень лекарств, которые можно скомбинировать с антителом к теофиллину]]. Такие активные ингредиенты соответственно находятся в 20 комбинации в количествах, эффективных для намеченного использования.

Активные ингредиенты могут находиться в микрокапсулах, приготовленных, например, с помощью технологии коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, в микрокапсулах гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулах поли-25 (метил метакрилата), соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных препаратов (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методики описаны Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980).

Можно изготавливать препараты с пролонгированным высвобождением. Примеры подходящих препаратов с пролонгированным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, в которых матрицы находятся в форме профилированных изделий, например, в виде пленок или микрокапсул.

Препараты для введения in vivo, как правило, стерильны. Стерильность достигают, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Ж. Терапевтические способы и композиции

Любое из предложенных в данном документе антител к теофиллину можно применять в терапевтических способах.

В одном аспекте предложено антитело к теофиллину для применения в качестве лекарственного препарата. В некоторых воплощениях предложено антитело к теофиллину для применения в способе лечения.

В следующем аспекте изобретения предложено применение антитела к теофиллину в производстве или изготовлении лекарственного средства.

В следующем аспекте изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие любое из предложенных здесь антител к теофиллину. В одном воплощении фармацевтическая композиция содержит любое из предложенных здесь антител к теофиллину и фармацевтически приемлемый носитель.

Антитела по изобретению можно применять для терапии либо в отдельности, либо в комбинации с другими агентами. Например, антитело по изобретению можно вводить одновременно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом.

Такие комбинированные терапии, упомянутые выше, включают комбинированное введение (когда два или более терапевтических агентов включены в состав одного или нескольких препаратов) и раздельное введение, когда введение антитела по изобретению осуществляют до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Антитела по изобретению также можно применять в комбинации с лучевой терапией.

Антитело по изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, при необходимости местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральное введение включает внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование можно выполнять любым подходящим способом, например, посредством инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, отчасти в зависимости от того, является ли введение кратковременным или длительным. Возможны различные режимы дозирования, включая однократное или многократное введение через различные промежутки времени, болюсное введение и пульсовое введение, но не ограничиваясь ими.

Антитела по изобретению изготавливают, дозируют и вводят в соответствии с требованиями надлежащей медицинской практики. Факторы, которые необходимо при этом учитывать, включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, получающее лечение, клиническое состояние индивидуального пациента, причину нарушения, место введения агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные медицинскому персоналу. Антитело не обязательно, но возможно находится в комбинации с одним или несколькими агентами, используемыми на данный момент для предупреждения или лечения обсуждаемого нарушения. Эффективное количество этих иных агентов зависит от количества антитела, присутствующего в препарате, типа нарушения или лечения и других факторов, обсуждавшихся выше. Как правило, их применяют в таких же дозировках и вводят такими же способами, как описанные в данном документе, или как приблизительно от 1 до 99% описанных здесь дозировок, или в любой дозировке и любым способом, который считают подходящим с эмпирической/клинической точки зрения.

Соответствующая дозировка антитела по изобретению (при использовании отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами) для предупреждения или лечения заболевания будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли антитело в целях профилактики или лечения, от предшествующего лечения, истории болезни пациента и ответа на антитело, а также от выбора лечащего врача. Соответственно, антитело вводят пациенту единовременно или на протяжении серии процедур. В зависимости от типа и тяжести заболевания возможная первоначальная дозировка для введения антитела пациенту может составлять приблизительно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5 мг/кг - 10 мг/кг), например, в виде одного или нескольких отдельных введений, или в виде непрерывной инфузии. Как правило, одна дозировка может варьироваться приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. При повторяющемся введении на протяжении нескольких дней или более, в зависимости от патологического состояния, лечение продолжают до тех пор, пока не наступит желаемое подавление симптомов заболевания. Одним из примеров дозировки антитела может быть диапазон приблизительно от 0,05 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг. Таким образом, пациенту вводят одну или несколько доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любые их комбинации). Эти дозы можно вводить с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получил приблизительно от двух до двадцати, или, например, приблизительно шесть доз антитела). Возможно введение начальной ударной дозы, за которой следует введение одной или нескольких более низких доз. Однако, возможны и другие режимы дозирования. Успех данного лечения легко отследить при помощи известных методик и тестов.

Очевидно, что любой из вышеупомянутых препаратов или терапевтических способов, в которых используют иммуноконъюгат по изобретению, можно применять в качестве альтернативы или дополнения к антителу к теофиллину.

III. Изделия

В другом аспекте изобретения предложены изделия, содержащие материалы, которые могут найти применение в лечении, предупреждении и/или диагностике нарушений, описанных выше. Изделия содержат контейнер и этикетку или листовку-вкладыш на контейнере или внутри него. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, пакеты с раствором для внутривенного введения и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая самостоятельно или в комбинации с другой композицией является эффективной при лечении, предупреждении и/или диагностике патологических состояний, и может иметь отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, которую можно проткнуть иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой антитело по изобретению. На этикетке или листовке-вкладыше указано, что композицию применяют для лечения предпочтительного патологического состояния. Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция содержит антитело по изобретению и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция содержит цитотоксический или иной терапевтический агент. Изделие в данном воплощении изобретения может также содержать листовку-вкладыш, с указанием, что композиции можно применять в лечении конкретного патологического состояния. В качестве альтернативы или дополнения изделие может также содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически-приемлемый буфер, например, бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может также содержать другие материалы, привлекательные с коммерческой и с потребительской точки зрения, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы и шприцы.

Очевидно, что любое из вышеупомянутых изделий может содержать иммуноконъюгат по изобретению в качестве альтернативы или дополнения к антителу к теофиллину.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже приведены примеры способов и композиций по изобретению. Очевидно, что с учетом общего описания, приведенного выше, могут осуществляться многие другие воплощения.

Пример 1. Выделение и характеристика кДНК, кодирующей домены VH и VL мышиного антитела к теофиллину класса lgG1 с легкой каппа-цепью, полученного с использованием мышиной гибридомы

Для получения информации о последовательностях белка (и ДНК) доменов VH и VL мышиного антитела к гаптену теофиллину использовали непосредственно клоны гибридомы. Затем провели следующие этапы экспериментов: (i) выделение РНК из антитело-продуцирующих клеток гибридомы, (ii) конвертацию данной РНК в кДНК, получение ПЦР-фрагментов, кодирующих VH и VL, и (iii) встраивание данных ПЦР-фрагментов в плазмидные векторы для наработки в E.coli и определение последовательности их ДНК (и выведение последовательности белка).

Выделение РНК из клеток гибридомы:

РНК выделяли из 5×10⁶ клеток гибридомы, экспрессирующих антитело, с помощью набора RNeasy-Kit (Qiagen). Вкратце, осажденные клетки однократно промывали ФСБ, осаждали и затем ресуспендировали в 500 мкл лизирующего буфера RLT (с добавлением бета-меркаптоэтанола (R.-ME). Для полного лизиса клетки пропускали через колонки Qiashredder (Qiagen) и затем подвергали процедуре очистки, опосредованной матриксом (этанол, колонки RNeasy), согласно описанию в руководстве производителя. После последнего этапа отмывки РНК элюировали с колонок в 50 мкл свободной от РНКаз воды. Концентрацию выделенной РНК определяли по показателям А260 и А280 в образцах, разведенных 1:20. Качество выделенных образцов РНК (интактность, степень деградации) анализировали с помощью денатурирующего электрофореза в геле агарозы с формамидом (см. руководство Маниатиса). Получили отдельные полосы, представляющие интактные 18s и 28s РНК, что свидетельствовало о хорошем качестве препаратов РНК. Выделенную РНК гибридом замораживали и хранили в аликвотах при -80°С.

Получение фрагментов ДНК, кодирующих VH и VH, при помощи ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК, клонирование данных фрагментов ДНК в плазмиды и определение последовательности их ДНК и аминокислотной последовательности

Для последующего проведения реакций ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (RACE-PCR) получали кДНК из препаратов РНК с помощью методов, описанных в заявке на международный патент РСТ/ЕР2011/074273. Затем из агарозного геля выделяли ПЦР-фрагменты, кодирующие VH и VL, с последующей очисткой с применением стандартных методов молекулярной биологии. Очищенные ПЦР-фрагменты, синтезированные с помощью полимеразы PWO, встраивали в вектор pCR bluntll topo с применением набора pCR bluntll topo (Invitrogen), точно следуя инструкциям производителя. Продуктами лигирования Торо трансформировали компетентные клетки E.coli Торо10-one-shot. Затем по колониям на чашках с LB-агаром, содержащим канамицин, идентифицировали клоны E.coli, которые содержали вектор со вставками VL или VH. Из этих колоний выделяли плазмидную ДНК и подтверждали наличие необходимой вставки в составе вектора путем рестрикции с помощью EcoRI. Поскольку вектор содержал сайты, распознаваемые рестриктазой EcoRI, фланкирующие вставку с каждой стороны, плазмиды, несущие вставки, идентифицировали по наличию фрагментов размером приблизително 800 пн (в случае VL) или 600 пн (в случае VH). Последовательность ДНК и выведенную белковую последовательность VL и VH определяли путем автоматического секвенирования ДНК множества клонов, для VL и для VH.

Последовательность VL мышиного антитела к теофиллину представлена последовательностью SEQ ID NO: 08. Последовательность VH мышиного антитела к теофиллину представлена последовательностью SEQ ID NO: 04.

Пример 2. Гуманизация доменов УН и VL мышиного антитела к теофиллину

Гуманизацию мышиного антитела, связывающего теофиллин, осуществляли следующим образом: гуманизированное антитело к теофиллину было получено на основе комбинации человеческих каркасных участков IGHV4-31-02 и IGKV2-30-01 в зародышевой конфигурации. Гуманизированный VH получен на основе зародышевой последовательности IGHV4-31-02 человека и J элемента зародышевой последовательности IGHJ4-01-3 человека. В положении 71 каркасного участка 3 ввели одну обратную мутацию (V71R). Гуманизированный VL получен на основе зародышевой последовательности IGHV2-30-01 человека и J элемента зародышевой последовательности IGKJ2-01 человека. В положении 46 каркасного участка 2 ввели одну обратную мутацию (R46L). Аминокислотная последовательность гуманизированного VH представлена последовательностью SEQ ID NO: 12, а аминокислотная последовательность гуманизированного VL представлена последовательностью SEQ ID NO: 16.

Пример 3. Состав, экспрессия и выделение рекомбинантных антител к теофиллину

Для получения моно- или биспецифических химерных или гуманизированных антител комбинировали вариабельные области мышиного и гуманизированного антитела к теофиллину и константные области, имеющие человеческое происхождение.

Для создания моноспецифических гуманизированных антител к теофиллину и биспецифических гуманизированных антител к теофиллину, специфически связывающихся с теофиллином, а также с различными мишенями, отличными от теофиллина (например, рецепторными тирозинкиназами или IGF-1R) было необходимо (i) сконструировать и определить аминокислотные и нуклеотидные последовательности таких молекул, (ii) экспрессировать данные молекулы в трансфецированных культивируемых клетках млекопитающих и (iii) выделить данные молекулы из надосадочной жидкости трансфецированных клеток. Данные этапы выполняли, как описано в публикации РСТ/ЕР2011/074273.

Для создания гуманизированного антитела класса IgG, имеющего связывающую детерминанту (исходного) мышиного антитела к теофиллину, гуманизированную последовательность VH объединяли в рамке считывания с N-концом последовательности СН1-шарнир-СН2-СН3 Fc фрагмента человеческого lgG1. Аналогично, гуманизированную последовательность VL объединяли в рамке считывания с N-концом константной области CL-каппа человеческого происхождения.

Для создания производных биспецифического анитела, имеющих связывающую детерминанту для теофиллина, а также детерминанты для других мишеней, антитело к теофиллину, представляющее собой scFv или Fab-фрагмент, объединяли в рамке считывания с С-концом тяжелой цепи антител, описанных ранее. Во многих случаях использованные scFv к гаптену дополнительно стабилизировали за счет введения дисульфидной связи VH44-VL100, как описано ранее (например, Reiter, Y., et al., Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245).

Экспрессирующие плазмиды

Экспрессирующие плазмиды, содержащие экспрессионные кассеты для экспрессии тяжелой и легкой цепей, собирали по отдельности в векторах для экспрессии в клетках млекопитающих.

Таким образом, генные сегменты, кодирующие отдельные элементы, собирали, как описано выше.

Общие сведения о нуклеотидных последовательностях легкой и тяжелой цепей, имеющих человеческое происхождение, из которых можно получить информацию о частотах использования кодонов, приведены в публикации Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242.

Транскрипционная единица легкой κ-цепи имеет в своем составе следующие элементы:

- предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека (hCMV),

- синтетический 5'-нетранслируемый участок, включая последовательность Козак,

- сигнальную последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, включая интрон сигнальной последовательности,

- клонированную кДНК вариабельной области легкой цепи, несущую рестрикционный сайт Bsml на 5' конце и донорный сайт сплайсинга и уникальный рестрикционный сайт Notl на 3' конце,

- ген, кодирующий константную область человеческой κ-цепи, включая энхансер 2 интрона гена κ-цепи lg мыши (Picard, D., and Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82) и

- сигнальную последовательность полиаденилирования (поли-А) κ-цепи иммуноглобулина человека.

Транскрипционная единица тяжелой γ1-цепи имеет в своем составе следующие элементы:

- сигнальную последовательность модифицированной тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, включая интрон сигнальной последовательности,

- клонированную кДНК вариабельной области тяжелой цепи моноспецифического антитела или клонированную кДНК, объединяющую scFv с вариабельной областью тяжелой цепи биспецифического антитела, несущую уникальный рестрикционный сайт Bsml на 5' конце и донорный сайт сплайсинга и уникальный рестрикционный сайт Notl на 3' конце,

- ген, кодирующий константную область человеческой тяжелой yl-цепи, включая энхансер гена μ-цепи lg мыши (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378) и

- сигнальную последовательность полиаденилирования (поли-А) γ1-цепи иммуноглобулина человека.

Помимо кассет для экспрессии легкой κ-цепи или тяжелой γ1-цепи данные плазмиды содержали:

- ген устойчивости к гигромицину,

- ориджин репликации oriP виуса Эпштейна-Барр (EBV, от англ. Epstein-Barr virus)

- ориджин репликации вектора pUC18, обеспечивающий репликацию данной плазмиды в Е.coli, и

- ген бета-лактамазы, придающий Е.coli устойчивость к ампициллину.

Технологии рекомбинации ДНК

Клонирование выполняли, используя стандартные методы клонирования, описанные Sambrook et al., 199 (см. выше). Все реагенты для молекулярной биологии приобретали (если не указано обратное) и использовали согласно инструкциям производителя.

ДНК, содержащую кодирующие последовательности, мутации или другие генетические элементы, синтезировали в компании Geneart AG, Регенсбург.

Последовательность ДНК определяли путем секвенирования двуцепочечной матрицы в компании SequiServe (SequiServe GmbH, Германия).

Анализ последовательностей ДНК и белка и обработка данных

Для получения, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрирования последовательностей использовали программное обеспечение Vector NTI Advance suite версии 9.0.

Экспрессия антител к теофиллину и их производных

Антитела к теофиллину экспрессировали при помощи транзиторной трансфекции эмбриональных клеток почки человека (HEK 293) в суспензии. С этой целью конструировали экспрессирующие векторы, кодирующие легкую и тяжелую цепи соответствующих моно- или биспецифических антител и несущие маркеры селекции для прокариотических и эукариотических клеток, как описано выше. Данные плазмиды амплифицировали в E.coli, очищали и затем использовали для транзиторной трансфекции. Для работы с клетками использовали стандартные методы культивирования клеток, описанные в Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.В., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.

Клетки культивировали в соответствующей среде для экспрессии при 37°С/8% CO₂. В день трансфекции клетки высаживали в свежой среде в плотности 1-2×10⁶ жизнеспособных клеток/мл. Комплексы ДНК с реагентами для трансфекции готовили в среде Opti-MEM I (Invitrogen, США), содержащей 250 мкг плазмидной ДНК, кодирующей тяжелую и легкую цепи, в молярном соотношении 1:1 в конечном объеме 250 мл. Через 7 дней после трансфекции надосадочную жидкость, содержащую моноспецифическое или биспецифическое антитело, просветляли при помощи центрифугирования при 14000 g в течение 30 мин и фильтровали через стерильный фильр (0,22 мкм). Надосадочную жидкость хранили при -20°С до выделения.

Для определения концентрации антител и производных в культуральной надосадочной жидкости использовали аффинную ВЭЖХ. Для этого культуральную надосадочную жидкость, содержащую моно- или биспецифические антитела или их производные, связывающиеся с белком А, наносили на колонку Applied Biosystems Poros А/20 в растворе, содержащем 200 мМ KH₂PO₄, 100 мМ цитрата натрия, рН 7,4. Элюирование с хроматографического материала осуществляли при помощи раствора, содержащего 200 мМ NaCl, 100 мМ лимонной кислоты, рН 2,5. Использовали систему ВЭЖХ UltiMate 3000 (Dionex). Для количественной оценки элюированного белка определяли поглощение в УФ области и измеряли площади пиков. В качестве стандарта использовали очищенное антитело lgG1.

Выделение антител к теофиллину

Надосадочную жидкость собирали через семь дней после трансфекции клеток HEK 293. Рекомбинантное антитело, содержащееся в надосадочной жидкости, выделяли в два этапа при помощи аффинной хроматографии с применением сефарозы с иммобилизованным белком A (GE Healthcare, Швеция) и эксклюзионной хроматографии с применением Superdex200. Вкратце, просветленную культуральную надосадочную жидкость, содержащую антитело, наносили на колонку MabSelectSuRe Protein А (5-50 мл), уравновешенную ФСБ (10 мМ Na₂HPO₄, 1 мМ KH₂PO₄, 137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl, рН 7,4). Несвязанные белки удаляли путем промывания уравновешивающим буфером. Антитела (или производные) элюировали 50 мМ цитратным буфером, рН 3,2. Фракции, содержащие белок, нейтрализовали 0,1 мл 2М Трис-буфера, рН 9,0. Затем элюированные белковые фракции объединяли, концентрировали при помощи центрифужных фильтров Amicon Ultra (MWCO: 30 К, Millipore) и загружали в колонку для гель-фильтрации Superdex200 HiLoad 26/60 (GE Healthcare, Швеция), уравновешенную 20 мМ гистидина, 140 мМ NaCl, рН 6,0. Концентрацию белка в препаратах очищенных антител и их производных определяли по оптической плотности (ОП) при 280 нм, с коррекцией на величину фонового поглощения при 320 нм, используя молярный коэффициент экстинкции, рассчитанный по аминокислотной последовательности согласно Расе et. al., Protein Science, 1995, 4, 2411-2423. Фракции, содержащие мономерные антитела, объединяли, мгновенно замораживали и хранили при -80°С. Часть образцов использовали для последующего анализа и характеризации белков.

Гомогенность антител подтверждали при помощи ДСН-ПАГ в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента (5 мМ 1,4-дитиотрейтол) с окрашиванием Кумасси бриллиантовым синим. Систему гелей NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen, США) использовали в соответствии с инструкциями производителя (4-20% Трис-глициновые гели).

При разделении методом ДСН-ПАГ в восстанавливающих условиях наблюдаемая молекулярная масса полипептидных цепей IgG соответствовала рассчетной молекулярной массе. Уровень экспрессии всех конструкций анализировали с применением белка А. В данных экспериментах с транзиторной экспрессией без оптимизации средний выход белка составлял от 6 мг до 35 мг очищенного белка на литр культуральной надосадочной жидкости.

На Фиг. 1 показаны результаты анализа экспрессированных химерных и гуманизированных антител, связывающих теофиллин, методом ДСН-ПАГ. Состав и гомогенность химерных и гуманизированных антител после очистки с применением белка А и эксклюзионной хроматографии оценивали по наличию Н-цепей и L-цепей антител в виде одиночных полос, дополнительных белковых загрязнений не наблюдали.

Пример 4. Исследование специфического связывания антитела с теофиллином

Для исследования специфического связывания антитела методом ИФА планшеты для ИФА, покрытые стрептавидином, загружали биотинилированным теофиллином (500 нг/мл в ФСБ) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После двукратного промывания для удаления несвязанного антигена добавляли антитела в концентрациях от 50 до 3000 нг/мл (в ФСБ) и инкубировали в течение 30 мин. После двукратного промывания связанное антитело определяли при помощи конъюгата анти-huFc Fab-HRP и субстрата ABTS (измеряя поглощение при 405 нм). На Фиг. 2 показано, что химерное и гуманизированное антитело специфически и дозозависимо связываются с теофиллином, иммобилизованным на планшете для ИФА. Напротив, контрольное антитело, распознающее иной антиген LeY (углевод), не вызывает появления сигнала в данном тесте.

Для определения аффинности антитела, специфически связывающего теофиллин, использовали метод SPR. Профиль связывания антител к теофиллину показан на Фиг. 3. Рассчитанные показатели аффинности (KD) составили 20 нМ и 17 нМ, соответственно, для мышиного (верхний ряд) и гуманизированного (нижний ряд) антител (см. таблицу ниже).

Пример 5. Образование ковалентных комплексов между теофиллином и антителом к теофиллину

Для исследования образования ковалентных комплексов, в которые входят теофиллин и связывающие теофиллин антитела, как системы, распознающие гаптен, в качестве флуоресцентного "груза" использовали Теофиллин-Cys-Cy5, полученный с помощью методов синтеза и выделения, описанных выше. Структура синтезированного производного Теофиллин-Cys-Су5 показана на Фиг. 4. Чтобы продемонстрировать формирование ковалентной дисульфидной связи получали связывающие теофиллин антитела, имеющие дополнительный Cys в положениях 54 или 55 вариабельной области тяжелой цепи (Cys-антитело к теофиллину). Степень чистоты данных антител показана на примере варианта Y54C на Фиг. 46. Даные производные антитела образовывали комплексы с Теофиллином-Cys-Су5, которые затем разделяли при помощи ДСН-ПАГ в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях, как описано в Примере 3. Су5, находящийся в комплексе с антителом к теофиллину благодаря формированию дисульфидной связи, детектировали в невосстанавливающих условиях в геле по флуоресценции, испускаемой Н-цепью, как описано в Примере 3. На Фиг. 4в показано, что ковалентные комплексы между антителом формировались в результате обыкновенного нагружения антитела, как и в случае образования дисульфидной связи при использовании в качестве гаптена дигоксигенина, флуоресцеина или биотина. Как и предполагали, данные комплексы диссоциировали в восстанавливающих условиях, т.е. "груз" отщеплялся от Н-цепи при восстановлении дисульфидной связи (Фиг. 4в).

Пример 6. Связывающее теофиллин антитело демонстрирует чрезвычайно высокую аффинность связывания со своим антигеном

Аффинность антитела, связывающего теофиллин, оценивали методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием биосенсора BIAcore (Фиг. 5). Fab-фрагменты антитела иммобилизовали на поверхности чипа при помощи захватывающего антитела анти-huFab и затем приводили их в контакт с "грузом", соединенным с молекулой теофиллина (Тео-пептидом). Формировались комплексы 1:1 (Fab:теофиллин-"груз"/). Наблюдалось быстрое связывание (высокая скорость ассоциации), при этом диссоциация не регистрировалась, т.е. значимого высвобождения связанного антигена не наблюдалось. Таким образом, антитело демонстрировало неожиданно высокую аффинность, не превышавшую нескольких пикомолей, возможно, составлявшую менее 1 пМ (Фиг. 5). Поскольку в данных экспериментальных условиях диссоциацию не наблюдали, точные значения k_D определить не удалось (пределы чувствительности метода не позволяли зарегистрировать высвобождение антитела). Таким образом, возможно, аффинность антитела находится в субпикомолярном диапазоне.

Claims

1. Антитело, специфически связывающееся с теофиллином, или его фрагмент, специфически связывающийся с теофиллином, содержащее:

(а) гипервариабельный участок тяжелой цепи HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03,

(б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02,

(в) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01,

(г) гипервариабельный участок легкой цепи HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07,

(д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06 и

(е) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05.

2. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой гуманизированное антитело и содержит в положении 71 вариабельного домена тяжелой цепи, согласно нумерации по Кабату, аминокислотный остаток аргинин.

3. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой гуманизированное антитело и содержит в положении 46 вариабельного домена легкой цепи, согласно нумерации по Кабату, аминокислотный остаток лейцин.

4. Антитело по п. 1, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи VH, представленную SEQ ID NO: 04, и последовательность вариабельного домена легкой цепи VL, представленную SEQ ID NO: 08,

где аминокислотный остаток в положении 71 вариабельного домена тяжелой цепи, согласно нумерации по Кабату, представляет собой аргинин, а аминокислотный остаток в положении 46 вариабельного домена легкой цепи, согласно нумерации по Кабату, представляет собой лейцин.

5. Антитело по п. 2, содержащее последовательность VH, представленную SEQ ID NO: 04.

6. Антитело по любому из пп. 2 или 5, содержащее последовательность VL, представленную SEQ ID NO: 08.

7. Антитело, специфически связывающееся с теофиллином, или его фрагмент, специфически связывающийся с теофиллином, содержащее последовательность VH, представленную SEQ ID NO: 04, и последовательность VL, представленную SEQ ID NO: 08.

8. Антитело по пп. 1 или 7, представляющее собой полноразмерное антитело lgG1 или полноразмерное антитело lgG4.

9. Антитело по пп. 1 или 7, представляющее собой моноклональное антитело.

10. Антитело по пп. 1 или 7, представляющее собой фрагмент антитела, специфически связывающийся с теофиллином.