JP2014502607A - 抗dig抗体およびペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体の薬学的組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
US5,804,371(特許文献1)は、ハプテン標識ペプチドおよび免疫学的検出方法におけるこれらの使用に関する。
a)ジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、および
b)5〜60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニン
の複合体を含む薬学的組成物である。
a)ジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、および
b)5〜60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニン
の複合体であって、産生後に回収された、複合体である。1つの態様において、a)の抗体はモノクローナル抗体である。
-ジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、および5〜60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体を形成する工程
-結果として生じた複合体を回収する工程
を含む、本発明による複合体を産生する方法である。
本発明の1つの局面は、以下:
a)ジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、および
b)5〜60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニン
の複合体を含む、薬学的組成物である。
a)ジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、および
b)5〜60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニン
の複合体である。
Asp=D=アスパラギン酸;Ala=A=アラニン;Arg=R=アルギニン;Asn=N=アスパラギン;Gly=G=グリシン;Glu=E=グルタミン酸;Gln=Q=グルタミン;His=H=ヒスチジン;Ile=I=イソロイシン;Leu=L=ロイシン;Lys=K=リジン;Met=M=メチオニン;Phe=F=フェニルアラニン;Pro=P=プロリン;Ser=S=セリン;Thr=T=スレオニン;Trp=W=トリプトファン;Tyr=Y=チロシン;Cys=C=システイン;およびVal=V=バリン。
Ac=アセチル;Boc=9-フルオレニルメトキシカルボニル;Dde=;Fmoc=9-フルオレニルメトキシカルボニル;Mtr=4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル;Pbf=2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル;Trt=トリチル、tBu=tert-ブチル;TEG=4,7,10-トリオキサドデカン酸(=トリエチレングリコール(TEG)-リンカー)。
100X分数X/Y
のように計算することができる。式中、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、そのプログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一マッチとスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性はAに対するBの%アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されるだろう。特に定めのない限り、本明細書において用いられる全ての%アミノ酸配列同一性の値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用した直前の段落に記載のように得られる。
1つの局面において、本発明は、一部、a)ジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体およびb)5〜60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体;ならびにその薬学的組成物に基づく。ある特定の態様において、ジゴキシゲニンに結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、癌、代謝疾患、または炎症疾患、またはウイルス性疾患の診断または治療に有用である。
1つの局面において、本発明は、一部、a)ジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体およびb)5〜60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体に基づく。
本明細書で使用する「結合」または「に結合する」もしくは「特異的に結合する」抗体という用語は同義に用いられ、インビトロアッセイ、好ましくは、精製された野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ(BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)における抗体と腫瘍抗原エピトープとの結合を指す。結合親和性は、ka(抗体/抗原複合体からの抗体の解離速度定数)、kD (解離定数)、およびKD (kD/ka)という用語によって定義される。結合する、または特異的に結合するとは、10-8M以下、好ましくは、10-8M〜10-13M(1つの態様において、10-9M〜10-13M)の結合親和性(KD)を意味する。従って、本発明によるジゴキシゲニンに結合する抗体は、10-8mol/l以下、好ましくは、10-8M〜10-13M(1つの態様において、10-9M〜10-13M)の結合親和性(KD)でジゴキシゲニンに特異的に結合する。
強心配糖体ジゴキシン、ジギトキシン、およびジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体は、例えば、Hunter, M.M., et al., J. Immunol. 129 (1982) 1165-1172に記載のように作製することができる。このような抗体の一例は、高親和性(KD=9nM)で強心配糖体ジゴキシン、ジギトキシン、およびジゴキシゲニンに結合するモノクローナル抗体26-10である(Schildbach, J.F., et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 21739-21747; Burks, E.A., et al., PNAS 94 (1997) 412-417)。
ある特定の態様において、本明細書において提供される抗体はキメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号およびMorrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855)に記載されている。1つの態様において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サルに由来する可変領域)、およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変えられている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体はその抗原結合断片を含む。
ある特定の態様において、本明細書において提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技法を用いて産生することができる。ヒト抗体は、van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374およびLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459において概説されている。
本発明の抗体は、望ましい活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、このようなライブラリーを、望ましい結合特性を有する抗体についてスクリーニングするための様々な方法が当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37において概説され、例えば、McCafferty, J., et al., Nature 348, 552-554; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597; Marks, J.D., and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-176; Sidhu, S.S., et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V., et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;およびLee, C.V., et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132においてさらに説明されている。
ある特定の態様において、本明細書において提供された抗体のアミノ酸配列変種が意図される。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変種は、適切な改変を、抗体をコードするヌクレオチド配列に導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、および/または抗体のアミノ酸配列への挿入、および/または抗体のアミノ酸配列中の残基の置換が含まれる。最終構築物が望ましい特徴、例えば、抗原結合を有するのであれば、最終構築物に到達するために、欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせることができる。
ある特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変種が提供される。置換変異誘発用の関心対象の部位にはHVRおよびFRが含まれる。保存的置換を「保存的置換」という見出しを付けた以下の表に示した。さらに多くの実質的な変化を「例示的な置換」という見出しを付けた表1に示した。さらに、アミノ酸側鎖クラスに関して下記に記載した。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、生成物を、望ましい活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の低下、またはADCCもしくはCDCの改善についてスクリーニングすることができる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の方向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載のように、組換え方法および組成物を用いて産生することができる。1つの態様において、本明細書に記載の抗ジゴキシゲニン抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような1つの態様において、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターで形質転換されている)。1つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0、NSO、Sp20細胞)である。1つの態様において、抗ジゴキシゲニン抗体を作る方法であって、抗体の発現に適した条件下で、前記で提供されたような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する工程、および任意で、宿主細胞(または宿主細胞培地)から抗体を回収する工程を含む、方法が提供される。
本明細書において提供された抗ジゴキシゲニン抗体は、当技術分野において公知の様々なアッセイによって、その物理的特性/化学的特性および/または生物学的活性について特定、スクリーニング、または特徴付けることができる。
本明細書に記載のように、a)ジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体およびb)5〜60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体の薬学的製剤は、望ましい程度の純度を有するこのような抗体を1種類または複数種の任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.),(1980))と混合することによって凍結乾燥製剤または水溶液の形で調製される。薬学的に許容される担体は、一般的に、使用される投与量および濃度においてレシピエントに無毒であり、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);ならびに/または非イオン界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を含むが、これに限定されない。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、間質(insterstitial)薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、ヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標), Baxter International, Inc.)が含まれる。rHuPH20を含む、ある特定の例示的なsHASEGPおよび使用方法は、米国特許出願公開第2005/0260186号および同第2006/0104968号に記載されている。1つの局面において、sHASEGPは1種類または複数種のさらなるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わされる。
本発明の別の局面において、前記の障害の治療、予防、および/または診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器および容器に貼られている、または容器に関連するラベルまたは添付文書を備える。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器、IV溶液バック(IV solution bag)などが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、単独の組成物、または状態の治療、予防、および/もしくは診断に有効な別の組成物と組み合わされる組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バックまたは皮下注射針で穴を開けることができるストッパーを有するバイアルでもよい)。組成物中の少なくとも1種類の活性薬剤は本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、えり抜きの状態を治療するのに用いられることを示す。さらに、製造物品は、(a)本発明の抗体を含む組成物が中に入れられている第1の容器;および(b)さらなる細胞傷害剤または他の治療剤を含む組成物が中に入れられている第2の容器を備えてもよい。本発明のこの態様における製造物品は、ある特定の状態を治療するために組成物を使用することができることを示す添付文書をさらに備えてもよい。または、もしくはさらに、製造物品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、静菌性注射用水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液を含む第2の(または第3の)容器をさらに備えてもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
抗腫瘍作用を有するペプチド
抗DIG抗体
SEQ ID NO:36 マウス<Dig>19-11の軽鎖可変ドメインVL
SEQ ID NO:37 マウス<Dig>19-11の重鎖可変ドメインVH
SEQ ID NO:38 ヒト化<Dig>19-11の軽鎖可変ドメインVL
SEQ ID NO:39 ヒト化<Dig>19-11の重鎖可変ドメインVH
実施例1:マウスハイブリドーマクローン19-11に由来するマウス<Dig>IgG1κのVHドメインおよびVLドメインをコードするcDNAの単離および特徴付け
実施例2:mu<Dig>19-11のVHドメインおよびVLドメインのヒト化
実施例3:組換えヒト化<Dig>抗体および二重特異性誘導体の組成、発現および精製
実施例4:組換えヒト化<Dig>抗体、断片、および融合タンパク質とジゴキシゲニン化化合物との結合
実施例5:ジゴキシゲニン化化合物の作製
実施例6:ジゴキシゲニン化化合物と<Dig>IgGとの規定された複合体の作製
実施例7:ジゴキシゲニン化ペプチドおよび<Dig>抗体との複合体は機能を保持する
実施例8:抗体と複合体を形成したジゴキシゲニン化PYY(3〜36)由来ペプチドは細胞培養実験においてペグ化PYY(3〜36)由来ペプチドより優れた効力を有する
実施例9:ジゴキシゲニン化Cy5またはジゴキシゲニン化PYY由来ペプチドと<Dig>IgGとの複合体の血清安定性および血清中レベル
実施例10:ジゴキシゲニン化PYY由来ペプチドと<Dig>IgGとの複合体のインビボ活性
表1:マウス「野生型」DIG-IgGおよび組換え<Dig>誘導体と異なるジゴキシゲニン化抗原との結合親和性
表2:非改変ヒト由来ペプチドおよびジゴキシゲニン化ヒト由来ペプチドの細胞傷害抗力
表3:非改変フルオロフォアCy5およびジゴキシゲニン化フルオロフォアCy5および複合体を形成したフルオロフォアCy5の蛍光
表4:cAMPアッセイにおけるPYY誘導体のインビトロでの生物活性
表5:複合体を形成しなかったDig-フルオロフォアおよびDig-ペプチドならびに抗体と複合体を形成したDig-フルオロフォアおよびDig-ペプチドのPKパラメータ
抗Dig抗体
強心配糖体ジゴキシン、ジギトキシン、およびジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体は、例えば、Hunter, M.M., et al., J. Immunol. 129 (1982) 1165-1172に記載のように作製することができる。このような抗体の一例はモノクローナル抗体26-10である。26-10抗体は、高い親和性(KD=9nM)で強心配糖体ジゴキシン、ジギトキシン、およびジゴキシゲニンに結合する(Schildbach, J.F., et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 21739-21747; Burks, E.A., et al., PNAS 94 (1997) 412-417)。
マウスハイブリドーマクローン19-11に由来するマウス<Dig>IgG1κのVHドメインおよびVLドメインをコードするcDNAの単離および特徴付け
組換え<Dig>抗体、抗体断片、および融合タンパク質を設計、作製、最適化、および特徴付けするための必要条件は、タンパク質および(DNA)の配列情報が入手できることである。従って、ハイブリドーマクローン19-11から、マウス<Dig>抗体のVHドメインおよびVLドメインについて、この情報を入手した。後で実施することが必要な実験工程は、(i)<Dig>を産生する19-11ハイブリドーマ細胞からのRNAの単離、(ii)このRNAからcDNAへの変換、次いで、VHを有するPCR断片およびVLを有するPCR断片への変換、ならびに(iii)大腸菌(E.coli)における増殖のためのプラスミドベクターへのこれらのPCR断片の組込み、ならびにこれらのDNA(および推定タンパク質)配列の決定であった。本明細書に記載の実験工程のさらなる詳細はPCT/EP2010/004051に記載されている。
Rneasy-Kit(Qiagen)を適用して、5x10e6個の抗体発現ハイブリドーマ細胞(クローン19-11)からRNAを調製した。簡単に述べると、沈殿した細胞をPBSで1回洗浄し、沈殿させ、その後に、溶解のために500μlのRLT-Puffer(+β-ME)に再懸濁した。Qiashredder(Qiagen)に通すことによって細胞を完全に溶解し、次いで、製造業者のマニュアルに記載のように、マトリックスにより媒介される精製手順(ETOH, RNeasyカラム)に供した。最後の洗浄工程後に、50ulのRNaseフリー水に溶解してカラムからRNAを回収した。1:20に希釈した試料のA260およびA280を定量することによって、回収されたRNAの濃度を求めた。ホルムアミド-アガロースゲルでの変性RNAゲル電気泳動によって、単離されたRNA試料の完全性(質、分解の程度)を分析した(Maniatis Manualを参照されたい)。これらのRNAゲル電気泳動の例は、インタクトな18sリボソームRNAおよび28sリボソームRNAを表す別個のバンドを示した。これらのバンドが損なわれていないこと(とこれらのバンドの強度比が約2:1であること)からRNA調製物の質は良好なことが示された。19-11ハイブリドーマから単離されたRNAを分注して凍結し、-80Cで保管した。
標準的な5'-RLM RACEプロトコールのための記載の反応を用いてFirstChoice Kit(Ambion)試薬キットを適用することによって、19-11 RNA調製物から後の(RACE-)PCR反応用のcDNAを調製した。PCR反応にはPwo DNAポリメラーゼを使用した。このために、10μgの19-11 RNAまたは対照RNA(マウス胸腺由来)を適用し、記載のように5 'RACEアダプターを組み込むように処理した。本発明者らは「アウターPCR(outer PCR)」反応を適用する必要はなく、「インナーPCR(inner PCR)」に直接進んだ。これは、5 'RACE Inner Primter(キットから入手)およびC-κ特異的プライマーまたはCH1特異的プライマーからなるプライマーペアを組み合わせることを伴った。VL領域を増幅するcκ用のプライマー配列は、
であった。VH領域を増幅するCH1用のプライマー配列は、
であった。これらのプライマー組み合わせの場合、60℃のアニーリング温度が適しており、PCRを実施するために55〜65C/(勾配PCR)の温度が適用されている(94C 0.5分、55〜65C 1分〜72C 1分、35サイクル、72Cで10分間の伸長により終了)。抗体VH領域を含有するDNA断片またはVL領域を含有するDNA断片の成功した特異的増幅は、19-11 RNAから得られた600bp〜800bpの別個のDNA断片の出現によって反映される。これらのDNA断片は、<Dig>ハイブリドーマ19-11のVHコード配列およびVLコード配列を含有する。
VHコードPCR断片およびVLコードPCR断片を、標準的な分子生物学的技法(Maniatis Manual)によるアガロースゲル抽出およびその後の精製によって単離した。製造業者の説明書に正確に従ってpCR bluntII topoキット(Invitrogen)を適用することによって、Pwoによって作製された精製PCR断片をベクターpCR bluntII topoに挿入した。Topo連結反応物を形質転換によって大腸菌Topo10-one-shotコンピテント細胞に導入した。この後、VL含有インサートまたはVH含有インサートを有するベクターを含有する大腸菌クローンをLB-カナマイシン寒天プレート上のコロニーとして特定した。その後に、これらのコロニーからプラスミドを調製し、EcoRIによる制限消化によってベクター中の望ましいインサートの存在を確認した。ベクターバックボーンは、インサートの両側に隣接するEcoRI制限認識部位を含有するので、インサートを有するプラスミドは、約800bp(VLの場合)または600bp(VHの場合)のEcoRiから放出可能なインサートを有することによって規定された。VHおよびVLの複数クローンに対する自動DNA配列決定によって19-11 VLおよびVHのDNA配列および推定タンパク質配列を決定した。<Dig>クローン19-11のVLのアミノ酸配列をSEQ ID NO:36に示し、<Dig>クローン19-11のVH配列を SEQ ID NO:37に示した。
mu<Dig>19-11のVHドメインおよびVLドメインのヒト化
抗体配列のヒト化の目的は、マウス由来の最初の抗体の全機能を保持しているが、ヒト免疫系によって「外来」として認識される配列も構造も有さない(あるいはごくわずかしか有さない、または無関連な配列もしくは構造を有する)分子を作製することである。この課題に対処することができる様々な手順が利用可能であり、公表されている(Almagro, J.C., and Fransson, J., Frontiers in Bioscience 13 (2008) 1619-1633; Hwang, W.Y.K., and Foote, J., Methods 36 (2005) 3-10)。抗体の可変領域の機能は二次および三次(および四次)構造によって決まるが、構造の形成はVHおよびVL(ならびに隣接する実体および相互作用する実体)の一次配列に基づく。このために、ヒト化の大きな課題は、タンパク質一次配列をいくつかの位置で変える必要があるのにもかかわらず、構造によって規定される機能を(完全に)保持することである。従って、抗体の機能的に重要な領域(CDR領域)の構造に関する知識はヒト化を助けるのに極めて重要である。ヒト化mu<Dig>19-11由来変種を作製するために、本発明者らは、以下の実験ウェットラボ手順ならびにインシリコ手順を組み合わせた。本発明者らは、(i)mu<Dig>19-11の抗原結合部位のインシリコ予測から開始して、(ii)高度のヒト類似性ならびに全機能を保持する高い可能性を有するインシリコhu<Dig>変種を予測することができた。最後に、(iii)本発明者らは、本発明者らのインシリコモデルを検証し、本発明者らのインシリコモデルに改良を加えるために、抗原<Dig>を伴うおよび伴わない抗体(断片)の(X線)構造を実験により決定した。本明細書に記載の設計パラメータおよび実験工程のさらなる詳細はPCT/EP2010/004051に記載されている。
mu<Dig>19-11 Fv領域の本発明者らのインシリコ構造モデルの基盤は、実験により決定されたVH mRNA配列およびVL mRNA配列から推定されたタンパク質配列である。これらの配列によってコードされるタンパク質の構造モデルは、マウス抗体のFvドメインのホモロジーモデリングとエネルギー最小化によってインシリコにより作製された。このために、ホモロジーモデリング用に適用するCDR配列およびフレームワーク配列を、PDB(Protein DataBank)を介して相同性について別々に検索した。それぞれのCDRおよびフレームワークについて、さらに多くのホモログ構造が重ね合わせられた。その後に、軽鎖および重鎖の異なる部分からモデルを組み立てた後に、複合体の(エネルギー)最小化を行った。本発明者らのホモロジーモデリング手順から得られたmu<Dig>19-11Fv領域の構造モデルから、推定された構造のかなり独特な特徴の1つは、VH-VL境界面の中の深いところまで及んでいるように見える、よく目につく空洞であることが分かった。この狭い空洞が形成するための主要な決定要因はVHの長いCDR3ループである。空洞の内部には、1個のメチオニン(深い残基)、2個のセリン、2個のプロリン、数個のチロシン(壁に隣接する)が並んでいる。この抗体によって認識される抗原ジゴキシゲニンは、ハプテンのように深い空洞の中に入って結合する。
抗ジゴキシゲニン抗体のヒト化VH配列およびVL配列をさらに最適化するために、本発明者らは親(マウス)抗体の構造を実験により決定した。このために、周知の最新方法(パパイン消化)を適用した、精製IgGのプロテアーゼ消化によってFab断片を作製した。プロテインAクロマトグラフィー(Fcを除去する)によって、残存しているFc断片からFab断片を分離し、その後に、サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex200 HiLoad 120ml 16/60ゲル濾過カラム, GE Healthcare, Sewden)に供して、タンパク質断片を除去した。結晶化のために、20mM His-HCl、140mM NaCl、pH6.0に溶解した精製FabおよびCy5標識ジゴキシゲニン(DIG-3-cme-dea-Cy5=DIG-Cy5/粉末)をジゴキシゲニン化蛍光色素Cy5(Dig-Cy5)と複合体形成した。結晶準備の前に、タンパク質溶液を濃縮した。複合体形成のために、DIG-Cy5を20mM His-HCl、140mM NaCl、pH6.0に溶解し、5:1の最終モル比まで濃縮タンパク質溶液に添加した。DIG-Cy5と複合体を形成したマウスFabの結晶は、タンパク質溶液(24mg/ml)1μlと、60%(v/v)2-メチル-1,3-プロパンジオール(propandiol)(MPD)/0.1M酢酸ナトリウムpH4.6/5mM CaCl2を含有するリザーバー溶液1μlを混合した後に、25℃で懸垂滴蒸気拡散法を用いて得られた。結晶をさらに凍結保護する必要なく、液体窒素結晶で急速冷凍した。DIG-Cy5と複合体を形成したマウスFabの回折データを、2009年9月11日にX06SA(SLS, Villingen, Switzerland)において収集した。データは、XDS(Kabsch, J. Appl. Cryst. 21 (1993) 916-924)を用いて統合およびスケール変更した。複合体の結晶は、a=b=138.01Å、c=123.696、α=β=γ=90°で空間群P42212に属し、2.8Åの分解能まで解析された。PDB ID 3cfd, 2a6d, 2a6jを有する構造に基づく検索モデルを作製することによって(Debler, E.W., et al., Science 319 (2008) 1232-1235; Sethi, D.K., et al., Immunity 24 (2006) 429-438)、プログラムBALBES(Long, F., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 64 (Pt.1) (2008) 125-132を参照されたい)を用いた分子置換によって構造を解析した。非対称単位の中に合計2個のFab分子を配置することができた。初期モデルを完了し、プログラムCOOT(Emsley, P., and Cowtan, K., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (Pt.12 Pt.1) (2004) 2126-2132)を用いた手作業のモデル構築およびプログラムPHENIX(Zwart, P.H., et al., Methods Mol. Biol. 426 (2008) 419-435)を用いた精密化によって精密化した。初回の精密化の後に、DIG-Cy5のDIG部分の差電子密度(difference electron density)が現われた。DIGモデルはPDB ID 1lkeから入手し(Korndorfer, LP., et al., J. Mol. Biol. 330 (2003) 385-396)、DIGの精密化パラメータはオンラインツールPRODRG(Schuttelkopf, A.W., and van Aalten, D.M., Acta Crystallogr. D Biol. Crystalogr. 60 (Pt.8) (2004) 1355-1363)によって作成した。最後の精密化工程のために電子密度の中にDIGモデルを配置した。図はプログラムPYMOL(DeLano, W.L., The PyMOL Molecular Graphics System (2008))を用いて作成した。
2.8Åの分解能で結合領域を実験により決定した結果から、リガンドとその抗体との結合様式を特徴付けることができる。この結果から、構造は、本発明者らが一次配列のインシリコ分析によって予測した構造モデルにおおむね似ていることがさらに裏付けられた。親抗体の可変領域のインシリコモデル構造ならびに実験により決定された「現実の」構造(さらなる詳細についてはPCT/EP2010/004051を参照されたい)を入手できることが、組換えジゴキシゲニン結合モジュールの詳細なモデリングおよびタンパク質操作を介したさらなる改善のための必要条件である。望ましいヒト化VHドメインおよびヒト化VLドメインに相当するアミノ酸配列が、CDRグラフティングならびに結合特異性および親和性を調節するさらなる変異の導入に基づく手順を適用することによって規定された。この手順の基礎となる基本原理は、ヒト生殖系列の中での、マウス配列と異なる各アミノ酸の「スコア値」の帰属(attribution)である。このスコアは、抗原認識能力または複合体安定性に及ぼすアミノ酸電荷の推定上の影響によって規定される。低いスコアおよび相対的な高い使用頻度に基づいてヒト生殖系列が選択される。結果として生じるヒト化分子にt細胞エピトープがごくわずかしか無いように、または全く無いようにするために、このヒト化手順にはTEPITOPE分析(T細胞エピトープを予測する)が含まれる。最初に、この手順によって規定された「ヒト」配列は、スコアが高すぎる場合(負の干渉の高い可能性を示す)、(最初の)マウス配列と交換する必要がある場合がある。これは、CDRまたはCDR配列の周囲領域におけるアミノ酸変化に最も頻繁に必要とされる。場合によっては、安定性および機能性を保持するために、マウス残基への「逆突然変異」がCDRだけでなくフレームワークの中でも必要とされる。本発明者らが選択した、結果として生じたhu<Dig>変種は、ヒトフレームワークVH3 11およびVL1 39の組み合わせに基づいており、ヒトと高度の類似性を有する。VLの場合、ヒトVK1 39のフレームワークおよびIGKJ4-01/02生殖系列のヒトj要素において逆突然変異を組込む必要はなかった。これは、高いヒト特徴および比較的少ない数のTEPITOPEアラートにつながった。VH変種は、ヒトVH3 23生殖系列およびヒトJ IGHJ6-01-2に由来する。変種JはヒトVH3 11生殖系列において構築された。さらに、本発明者らのスコアリング法を用いて、本発明者らは、ヒト特徴を高め、TEPITOPEアラートの数を減らすためにCDRの中に1つのヒトアミノ酸を導入することができた。ヒト化VHのアミノ酸配列をSEQ ID NO:38に示し、ヒト化VLのアミノ酸配列をSEQ ID NO:39に示した。
抗ジゴキシゲニン抗体のヒト化VH配列およびヒト化VL配列のさらなる最適化を適用して、ジゴキシゲニンに対する親和性がさらに高いモジュールを作製した。実験により決定された予測構造ならびにインシリコで計算された予測構造(前記を参照されたい。実験による構造決定のない構造モデリングに基づく)に基づいて、本発明者らは、変化すると親和性に影響し得る3つの位置を特定した。これらは、VHドメインの(Kabat位置)Ser49、Ile57、およびAla60に位置した。アミノ酸VHSer49とAlaを交換、VHIle57とAlaを交換、およびVHAla60とProを交換することによって、それぞれの抗体誘導体が作製された。この配列からなる結合実体を発現させ、標準的なプロテインAおよびサイズ排除技術を用いて精製することができた(実施例3の「組換えヒト化<Dig>抗体、断片、および二重特異性融合タンパク質の組成、発現、および精製」を参照されたい)。結果として生じた分子は完全に機能し、ヒト化親分子と比較してジゴキシゲニンに対する改善した親和性を示した。これは表面プラズモン共鳴(BiaCore)実験によって証明された(詳細については、実施例4の「組換え<Dig>抗体、断片、および二重特異性融合タンパク質とジゴキシゲニン化抗原との結合」を参照されたい)。これらの実験の結果から、VH49変異、VH57変異、およびVH60変異を導入することによってジゴキシゲニンに対する親和性が約10倍改善したと判明した。この後に、Dig結合可変領域の実験により決定された構造を検査することによって、これらの位置の関係が確かめられた。
組換えヒト化<Dig>抗体の組成、発現、および精製
キメラIgGもしくはヒト化IgGを形成するために、または他の抗体配列を有する二重特異性融合タンパク質を作製するために、マウス<Dig>モジュールおよびヒト化<Dig>モジュールをヒト抗体定常領域と組み合わせた。Digに結合するヒト化<Dig>IgGの作製には、(i)このような分子のアミノ配列およびヌクレオチド配列を設計および規定すること、(ii)これらの分子を、トランスフェクトされた哺乳動物培養細胞において発現させること、ならびに(iii)これらの分子を、トランスフェクトされた細胞の上清から精製することが必要であった。概念実証研究用のモデル系として用いられたように、Digならびに他の標的(例えば、受容体型チロシンキナーゼHer2またはIGF1R)に結合する二重特異性誘導体も作製した。例えば、ここで、ペプチドまたはフルオロフォアの規定された複合体形成を以下の実施例において証明することができた。本明細書に記載の実験工程のさらなる詳細はPCT/EP2010/004051に記載されている。
(最初の)マウスmu<Dig>19-11 Fv領域の結合特異性を有するヒト化IgGを作製するために、本発明者らは、前記で規定されたヒト化VH配列とIgG1のCH1-CH2-CH3のN末端をインフレームで融合した。同様に、本発明者らは、前記で規定されたヒト化VL配列とCκのN末端をインフレームで融合した。結果として生じたhu<Her2><Dig>IgG H鎖およびL鎖のアミノ酸配列はPCT/EP2010/004051に記載されている。ヒト化ジゴキシゲニン結合IgGの模式図を図1に示した。
FreeStyle(商標)293発現系を用いて製造業者の説明書(Invitrogen, USA)に従って、ヒト胚腎臓293-F細胞の一過的トランスフェクションによって、<Dig>IgGおよび二重特異性抗体誘導体を発現させた。このために、対応する二重特異性抗体の軽鎖および重鎖を、原核生物選択マーカーおよび真核生物選択マーカーを有する発現ベクターの中に構築した。これらのプラスミドを大腸菌において増幅し、精製し、その後に、一過的トランスフェクションに適用した。細胞を取り扱うために、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M.(eds.), John Wiley & Sons, Incに記載のように標準的な細胞培養法を使用した。懸濁FreeStyle(商標)293-F細胞をFreeStyle(商標)293 Expression培地に入れて37℃/8%CO2で培養し、トランスフェクションの日に細胞を1〜2x106生細胞/mlの密度で新鮮培地に播種した。250mlの最終トランスフェクション体積のために333μlの293fectin(商標)(Invitrogen, Germany)ならびに250μgの1:1モル比の重鎖プラスミドDNAおよび軽鎖プラスミドDNAを用いて、DNA-293fectin(商標)複合体をOpti-MEMI培地(Invitrogen, USA)に溶解して調製した。トランスフェクションの7日後に、IgGまたは二重特異性抗体を含有する細胞培養上清を、14000gで30分の遠心分離および滅菌フィルター(0.22μm)に通す濾過によって清澄化した。精製まで上清を-20℃で保管した。細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を求めるために、アフィニティHPLCクロマトグラフィーを適用した。このために、プロテインAに結合する抗体および誘導体を含有する細胞培養上清を、200mM KH2PO4、100mMクエン酸ナトリウム、pH7.4に溶解してApplied Biosystems Poros A/20カラムにアプライし、UltiMate 3000 HPLCシステム(Dionex)によって200mM NaCl、100mMクエン酸、pH2,5を用いてマトリックスから溶出させた。溶出したタンパク質をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。精製された標準IgG1抗体は標準として役立った。
発現プラスミドのトランスフェクションの7日後に、HEK293細胞上清を収集した。この中に含まれる組換え抗体(誘導体)を上清からプロテインA-Sepharose(商標)(GE Healthcare, Sweden)を用いたアフィニティクロマトグラフィーおよびSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーによって二段階で精製した。簡単に述べると、単一特異性抗体を含有する清澄化培養上清および二重特異性抗体を含有する清澄化培養上清を、PBS緩衝液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および2.7mM KCl、pH7.4)で平衡化したHiTrap ProteinA HP(5ml)カラムにアプライした。結合しなかったタンパク質を平衡化緩衝液によって洗い流した。二重特異性抗体を0.1Mクエン酸緩衝液、pH2.8によって溶出させ、タンパク質含有画分を0.1ml 1M Tris、pH8.5によって中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、Amicon Ultra遠心フィルター装置(MWCO:30K, Millipore)によって3mlの体積まで濃縮し、20mM ヒスチジン(Histidin)、140mM NaCl、pH6.0で平衡化したSuperdex200 HiLoad 120 ml 16/60ゲル濾過カラム(GE Healthcare, Sweden)にロードした。精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、Pace et. al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423に従ってアミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、280nmでの光学密度(OD)とバックグラウンド補正として320nmでのODを測定することによって求めた。単量体抗体画分をプールし、瞬間冷凍し、-80℃で保管した。後のタンパク質分析および特徴付けのために、試料の一部を用意した。DIGHu2抗体構築物および二重特異性DIG構築物の均一性を、還元剤(5mM 1,4-ジチオトレイトール(dithiotreitol))の存在下および非存在下のSDS-PAGEならびにクーマシーブリリアントブルー染色によって確認した。NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen, USA)を製造業者の説明書に従って使用した(4〜20%Tris-グリシンゲル)。還元条件下で、IgGに関連する(二重特異性Fv融合にも関連する)ポリペプチド鎖は、SDS-PAGEの際に、計算分子量と類似する見かけの分子サイズを示した。全ての構築物の発現レベルはプロテインAによって分析された。平均タンパク質収率は、このような非最適化一過的発現実験において6〜35mg精製タンパク質/L細胞培養上清であった。本明細書に記載の発現工程および精製工程のさらなる詳細はPCT/EP2010/004051に記載されている。
組換えヒト化<Dig>抗体、断片、および融合タンパク質とジゴキシゲニン化化合物との結合
以下で述べる分析は、ヒト化手順によって完全な結合活性を保持している<Dig>誘導体が生じたかどうか評価するために行った。このために、Biacore T100またはBiacore 3000機器(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala)を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって、組換え<Dig>誘導体の結合特性を分析した。このシステムは分子相互作用研究用に十分に確立している。これは、リガンド/分析物結合を連続リアルタイムモニタリングし、従って、様々なアッセイ設定において会合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)、および平衡定数(KD)を求めることができる。SPR技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップ表面近くの屈折率を測定することに基づく。屈折率の変化から、固定化されたリガンドと、溶解状態で注入された分析物の相互作用によって引き起こされる表面の質量変化が分かる。分子が、表面にある固定化リガンドに結合すれば質量が増大し、解離すれば質量が減少する。結合研究を行うために、捕捉用の抗ヒトIgG抗体を、アミンカップリング化学を用いてCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。フローセルを、0.1M N-ヒドロキシスクシンイミドおよび0.1M 3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル-N-エチルカルボジイミドの1:1混合物によって5μl/minの流速で活性化した。特に断りのない限り、10μg/mlの抗ヒトIgG抗体を酢酸ナトリウム、pH5.0に溶解して注入した。これによって、約12000RUの表面密度が得られた。参照対照フローセルを同様に処理したが、捕捉用抗体の代わりにビヒクル緩衝液のみで処理した。1Mエタノールアミン/HCl pH8.5を注入することによって表面をブロックした。ヒト化タンパク質変種の結合と、最初のハイブリドーマ19-11に由来するマウス<Dig>IgGの結合を比較するために、抗ヒトIgG抗体について前記で述べられたのと同様に、捕捉用抗マウスIgG抗体をCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。組換え<Dig>誘導体の機能を評価するために、(i)ヒト化IgG、(ii)hu<Dig>ジスルフィド安定化scFvを有する融合タンパク質を含む組換えhu<Dig>モジュールの結合を、ジゴキシゲニン化抗原を用いてアッセイした。結果として生じた結合親和性を、組換えヒト化モジュールが得られたマウス「野生型」DIG-IgGの結合と比較した。
抗マウスIgG抗体を、前記と同様にCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。2μg/mlの抗ヒトIgG抗体を注入し、これによって約600RUの表面密度が得られた。それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、0.85%H3PO4を60秒間、5μl/minで注入し、次いで、5mM NaOHを60秒間、5μl/minで注入することによって、再生を行った。分析しようとする試料をHBS-P(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、0.005%Surfactant P20)で希釈し、5μl/minの流速で注入した。接触時間(会合相)は1〜5nMの濃度の抗体の場合、3分であった。結合親和性を測定するために、様々なジゴキシゲニン化抗原を漸増濃度にして注入した。漸増濃度は、DIG-BP4については0.3125nM、0.625nM、1.25nM、2.5nM、5nM、および10nMであった。接触時間(会合相)は3分であり、解離時間(ランニング緩衝液による洗浄)は30μl/minの流速で各分子について5分であった。全ての相互作用を25℃(標準温度)で行った。マウス<DIG>19 11の場合、それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、10mMグリシン/HCl pH1.5の再生溶液を30μl/minの流速で60秒間注入した。ヒト化<DIG>IgGの場合、0.85%H3PO4を60秒間5μl/minで注入し、次いで、5mM NaOHを60秒間5μl/minで注入することによって、再生を行った。シグナルは1シグナル/秒の割合で検出した。これらの分析の結果を表1に示した。これから、組換えヒト化<Dig>は、マウス親抗体と同じ機能および高親和性でジゴキシゲニン化化合物に結合することが分かる。ジゴキシゲニン化タンパク質(Dig-BP4、欧州特許EP1545623B1)に対するマウス抗体のKdは33pMであることが判明し、ヒト化抗体のKdは<76pMであった。同様に、ジゴキシゲニン化核酸(siRNA-Dig)に対するマウス抗体のKdは269pMであることが判明し、ヒト化抗体のKdは12nMであった。従って、本発明者らは、<Dig>抗体の機能がそのヒト化変種において保持されたと結論付けた(ヒト化 VHのアミノ酸配列をSEQ ID NO:38に示し、ヒト化 VLのアミノ酸配列をSEQ ID NO: 39に示した)。
抗マウスIgG抗体および抗ヒトIgG抗体を、前記と同様にCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。分析しようとする試料をHBS-Pで希釈し、5μl/minの流速で注入した。接触時間(会合相)は1〜5nMの濃度の抗体の場合、3分であった。結合親和性を測定するために、様々なジゴキシゲニン化抗原を漸増濃度にして注入した。漸増濃度は、DIG-BP4については0.3125nM、0.625nM、1.25nM、2.5nM、5nM、および10nMであり、DIG-siRNAについては0.018〜120nMであった。接触時間(会合相)は3分であり、解離時間(ランニング緩衝液による洗浄)は30μl/minの流速で各分子について5分であった。全ての相互作用を25℃(標準温度)で行った。それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、10mMグリシン/HCl pH1.5の再生溶液を30μl/minの流速で60秒間注入した。RNAseがリガンドとして用いられる時には、0.85%H3PO4を60秒間、5μl/minで注入し、次いで、5mM NaOHを60秒間、5μl/minで注入することによって、再生を行った。シグナルは1シグナル/秒の割合で検出した。これらの分析の結果を表1に示した。これから、適用された二重特異性融合タンパク質(Her2-Dig)に存在する組換えヒト化<Dig>scFvモジュールは、マウス親抗体と同じ機能および高親和性で、ジゴキシゲニン化したタンパク質および核酸に結合することが分かる。ジゴキシゲニン化タンパク質(Dig-BP4)に対するマウス抗体のKdは33pMであることが判明し、ヒト化単鎖FvのKdは68pMであった。同様に、ジゴキシゲニン化核酸(siRNA-Dig、実施例11を参照されたい)に対するマウス抗体のKdは269pMであることが判明し、ヒト化単鎖FvのKdは35nMであった。従って、本発明者らは、野生型抗体の機能が、二重特異性融合タンパク質に存在する組換えヒト化<Dig>scFvモジュールにおいても保持されると結論付けた。
ジゴキシゲニン化化合物の作製
ジゴキシゲニン結合抗体と複合体形成するための化合物を作製するために、(i)適切なリンカーを介してジゴキシゲニンを化合物にカップリングし、(ii)化合物がその機能を保持するように、このカップリングが行われるのを確実なものにすることが必要である。これらの機能を評価するために本発明者ら例として調製した化合物には、ジゴキシゲニン化フルオロフォア(Dig-Cy5)および一組のジゴキシゲニン化ペプチド誘導体が含まれる。カップリング手順および試薬を図2Aに模式的に示した。Dig-Cy5およびジゴキシゲニン化PYYペプチド誘導体の組成を、それぞれ、図2Bおよび図2Cに示した。この技術を評価するために本発明者らが例として使用したペプチドは、メリチン、FALLLv1、FALLv2、およびFam5bである。後ろの3つのペプチドは、ヒト由来の生理活性ペプチドのスクリーニングにおいて特定された。これらのペプチドは、アミノ末端システインを付加することによってジゴキシゲニンにカップリングすることができる。
確立したプロトコール(FastMoc 0.25mmol)に従って、Fmoc化学を用いる自動化Applied Biosystems ABI 433Aペプチド合成機において、ペプチド合成を行った。反復サイクルにおいて、対応するFmocアミノ酸を連続してカップリングすることによって、ペプチド配列を組み立てた。カップリング工程ごとに、樹脂を、N-メチルピロリドンに溶解した20%ピペリジンで処理することによって、N末端Fmoc基を除去した。カップリングは、DMFに溶解したHBTU/HOBt(各1mmol)およびDIPEA(2mmol)によって活性化されたFmoc保護アミノ酸(1mmol)を用いて行った(45〜60分間ボルテックスする)。カップリング工程ごとに、NMPに溶解したAc2O(0.5M)、DIPEA(0.125M)、およびHOBt(0.015M)の混合物で処理する(10分間ボルテックスする)ことによって、未反応アミノ基をキャッピングした。各工程の間に、樹脂をN-メチルピロリドンおよびDMFによって大規模に洗浄した。立体障害アミノ酸を自動化二重カップリングに組込んだ。このために、カップリングサイクルの間にキャッピング工程なく、樹脂を1mmolの活性化基本要素によって2回処理した。標的配列が完了したら、標準的なアミノ酸カップリング条件を用いて、Fmoc-12-アミノ-4,7,10-トリオキサドデカン酸(TEG-スペーサー)をFAM5BおよびINF7ペプチドとカップリングした。その後に、全てのペプチド配列(スペーサーを有するFAM5BおよびINF7、スペーサーを有さないメリチン、FaLLv1、およびFALLv2)のアミノ末端にFmoc-Cys(Trt)-OHを取り付けた。最後のFmoc脱保護の後に、ペプチド樹脂をフィルターフリットに入れ、トリフルオロ酢酸、水、およびトリイソプロピルシラン(19mL:0.5mL:0.5mL)の混合物によって2.5時間処理した。切断溶液を濾過し、冷(0℃)ジイソプロピルエーテル(300mL)を添加してペプチドを沈殿させて、無色の固体を得た。無色の固体をジイソプロピルエーテルによってくりかえし洗浄した。粗生成物を酢酸/水混合物に再溶解し、凍結乾燥し、その後に、0.1%TFAを含有するアセトニトリル/水勾配を用いた調製用逆相HPLC(Merck Cromolith prep RP-18e カラム, 100x25mm)によって精製した。
対応するシステイン改変ペプチド(6〜20mg)を0.1M KPO4緩衝液(1mL)に溶解した溶液に、100μLのDMFに溶解した等モル量のジゴキシゲニン-3-カルボキシ-メチル-エチルアミドマレイミドを添加した。反応混合物を周囲温度で2〜20時間、穏やかに混合し、濾過し、標的化合物を、0.1%TFAを含有するアセトニトリル/水勾配を用いた調製用逆相HPLC(Merck Cromolith prep RP-18eカラム, 100x25mm)によって単離した。凍結乾燥の後に、ジゴキシゲニン-ペプチド結合体を無色の固体として得た。ペプチドメリチンの分子量は2949.64であり、結果として生じたペプチド-Dig結合体の分子量は3520.33である。ペプチドFaLLv1の分子量は4710.59であり、結果として生じたペプチド-Dig結合体の分子量は5384.43である。ペプチドFALLv2の分子量は4791.76であり、結果として生じたペプチド-Dig結合体の分子量は5465.59である。ペプチドFam5bの分子量は3634.37であり、結果として生じたペプチド-Dig結合体の分子量は5410.47である。ペプチドINF7の分子量は2896.25であり、結果として生じたペプチド-Dig結合体の分子量は3466.94である。抗体との複合体形成の時点まで、本発明者らは、H2Oに溶解した結合体を分注して-20℃で保管した。図7Aは、ペプチド-ジゴキシゲニン複合体の組成を模式的に示す。
PYY(3〜36)-ペプチド誘導体(moPYYと呼ばれる)は、樹脂に結合したペプチド配列Ac-IK(Dde)-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(tBu)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel-RAM樹脂の自動固相合成によって得られた。確立したプロトコール(FastMoc 0.25mmol)に従って、Fmoc化学を用いる自動化Applied Biosystems ABI 433Aペプチド合成機において、ペプチド合成を行った。TentaGel RAM樹脂(ローディング:0.18mmol/g; Rapp Polymers, Germany)を用いて、対応するFmoc-アミノ酸(スケール:0.25mmol)を連続カップリングすることによって、ペプチド配列を反復サイクルにおいて組み立てた。カップリング工程ごとに、N-メチルピロリドン(NMP)に溶解した20%ピペリジンで樹脂(3x2.5分)を処理することによって、N末端Fmoc基を除去した。カップリングは、DMFに溶解したHBTU/HOBt(各1mmol)およびDIPEA(2mmol)によって活性化されたFmoc保護アミノ酸(1mmol)を用いて行った(45〜60分間ボルテックスする)。位置2、3、および14それぞれにおいて、アミノ酸誘導体Fmoc-Lys(ivDde)-OH、Fmoc-Pqa-OH、およびFmoc-N-Me-Arg(Mtr)-OHを合成配列に組み込んだ。カップリング工程ごとに、NMPに溶解したAc2O(0.5M)、DIPEA(0.125M)、およびHOBt(0.015M)の混合物で処理する(10分間ボルテックスする)ことによって、未反応アミノ基をキャッピングした。各工程の間に、樹脂をN-メチルピロリドンおよびDMFによって大規模に洗浄した。立体障害アミノ酸を自動化二重カップリングに組込んだ。このために、カップリングサイクルの間にキャッピング工程なく、樹脂を1mmolの活性化基本要素によって2回処理した。標的配列が完了した後、さらなる操作のために樹脂をフリット固相反応器に移した。
ペプチド
(100mg、40.6μmol)を水(5mL)に溶解した溶液に、NMP(1mL)に溶解したジゴキシゲニン-3-カルボキシ-メチル-N-ヒドロキシスクシンイミド(26.6mg、48.8μmol)を添加した。トリエチルアミン(13.6L、97.6μmol)を添加し、混合物を室温で2時間、回転させた。その後に、NMP(0.5mL)に溶解したさらなるジゴキシゲニン-3-カルボキシ-メチル-N-ヒドロキシスクシンイミド(13.3mg、24.4μmol)、およびトリエチルアミン(6.8μL、48.8μmol)を添加し、溶液を15時間、回転させた。粗生成物を、0.1%TFAを含有するアセトニトリル/水勾配を用いた調製用逆相HPLC(Merck Cromolith prep RP-18eカラム, 100x25mm)によって精製して、無色の固体としてDig-PYYペプチド(29mg、10.0μmol、25%)を得た。ペプチド誘導体の分析特徴付けのために、本発明者らは以下の条件を適用し、以下のデータを受け取った:分析HPLC:tR=11.3分(Merck Chromolith Performance RP-18e、100x4.6mm、水+0.1%TFA→アセトニトリル/水+0.1%TFA 80:20、25分);
。抗体との複合体形成の時点まで、本発明者らは、ジゴキシゲニン化ペプチドを凍結乾燥物として4℃で保管した。図2CはDIG-moPYYの構造を示す。
ジゴキシゲニン化Cy5を作製するために、モノバックエチレンジアミン(monobac ethylendiamine)を用いて、DIG-カルボキシメチル-NHSエステル(DE3836656)を変換した。その後に、Bocを除去し、遊離したアミンをCy5-NHSエステル(GE Healthcare, PA15106)と反応させた。DIG-Cy5を精製するために、RP18カラムを用いたHPLCを行った。溶出剤Aは、0.1%TFAを含有するH2Oであり、溶出剤Bは、0.1%TFAを含有するアセトニトリルであった。60分にわたって行った溶出の間に、溶出剤Bの濃度を0%から100%に上げた。Cy5の分子量は791.99Daである。結果として生じたCy5-Dig結合体の分子量は1167.55Daである。抗体との複合体形成の時点まで、本発明者らは、PBSに溶解した結合体を分注して-20℃で保管した。図2BはCy5-ジゴキシゲニン結合体の構造を示す。
ジゴキシゲニン化ペプチドまたはフルオロフォアと<Dig>IgGとの規定された複合体の作製
ジゴキシゲニン化ペプチドとジゴキシゲニン結合抗体および抗体誘導体との複合体は、優れた生物物理学的特性および改善したPKパラメータをペプチドに付与し得る。さらに、万一、二重特異性抗体が例示的な概念実証複合体として適用された場合には、このような複合体は、二重特異性抗体変種によって認識される抗原をディスプレイする細胞にペプチドを標的化することができる。これらの複合体は、その2つの高親和性Dig結合部位において2つの(それぞれ部位において1つの)ジゴキシゲニン化ペプチドを結合させる1つのヒト化<標的>-<Dig>IgGからなる。このような複合体の組成を図3に示した。ジゴキシゲニン化されているのにもかかわらず、ならびに抗体と複合体を形成しているのにもかかわらず、ペプチドが優れた生物学的活性を保持していることが望ましい。(二重特異性標的モジュールの場合)複合体を形成したジゴキシゲニン化ペプチドの存在下で、二重特異性抗体誘導体の細胞表面標的結合部位が、その結合特異性および親和性を保持していることも望ましい。この技術を評価するために本発明者らが例として使用した一組のペプチドは、メリチン、FALLLv1、FALLv2、およびFam5bである。後ろの3つのペプチドは、ヒト由来の生理活性ペプチドのスクリーニングにおいて特定された。メリチンおよび3つのヒト由来ペプチドの生物学的活性は、ヒト腫瘍細胞株に対する細胞傷害作用を確かめることによってインビトロで評価することができる。さらに、この技術を評価するために本発明者らが例として使用した別のペプチドはペプチドチロシンチロシンまたは膵臓ペプチドYYショートPYY(3〜36)類似体(WO2007/065808)である。位置2にあるリジンを介してジゴキシゲニン化されていれば、以下の文章においてDIG-moPYYと呼ばれる。この化合物を図2Cに図示した。ペプチドmoPYYおよびその誘導体はNPY受容体ファミリーのY2受容体(Y2R)に結合し、それによってNPY受容体ファミリーのY2受容体(Y2R)を調節する。PYYは、食事に反応して回腸および結腸の中の神経内分泌細胞によって分泌される。PYYは胃運動低下を阻害し、消化効率および栄養分吸収効率を増大させ、おそらくY2受容体によって媒介される食欲を低下させることが示されている。PYYは食物摂取のバランスを取ることによってエネルギーホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしているので、このペプチドはII型糖尿病または肥満の治療に有用な可能性がある(WO2007/065808)。moPYYはインビトロで高度かつ特異的な活性があるが、他の多くの治療用ペプチドと同様に生物内で安定性が限定され、血清半減期が短いという欠点を有する。これらの問題に対処するアプローチの1つは部位特異的ペグ化(WO2007/065808)であったが、PEGは多くの場合において(受容体への)ペプチドの到達および活性を妨げることが知られている。従って、抗体:Dig-ペプチド複合体の作製はペグ化の代替として役立つかもしれない。このような複合体を作製するために、(i)適切なリンカーを介してジゴキシゲニンをペプチドとカップリングし、これによって、ペプチドが抗体表面上に露出し、従って、その活性の保持を可能にすること;および(ii)治療用ペプチドの生物学的活性が保持されている、<Dig>IgGとジゴキシゲニン化ペプチドの複合体を作製することが必要である。この技術を評価するために本発明者らが例として使用した別の化合物はDig-Cy5(図2B)である。この分子は蛍光特性を有し、従って、その活性はインビトロならびにインビボで蛍光画像化によって確かめることができる。
抗体とジゴキシゲニン化化合物との複合体を作製するために、(i)ジゴキシゲニン化ペプチドとジゴキシゲニン結合抗体誘導体との複合体を作製および特徴付ける必要がある。これらの複合体は、規定された様式(2個のDig-ペプチドが1個の<Dig>IgGに結合する)で形成されるものとする。(ii)これらの複合体が化合物またはペプチドの活性を保持することを確実なものにする。組換え<IGF1R>-<Dig>二重特異性抗体および<Her2>-<Dig>二重特異性抗体をカップリング反応のタンパク質成分として使用した。これらの分子の組成および精製は前述されている。ジゴキシゲニン化ペプチドと<IGF1R>-<Dig>および<Her2>-<Dig>二重特異性抗体との複合体を作製するために、本発明者らは、(メリチン、FALLv1、FALLv2)ペプチド-Dig結合体をH2Oに1mg/mlの最終濃度まで溶解した。二重特異性抗体を、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH=6.0緩衝液に溶解して1mg/ml(4.85μM)の濃度にした。ペプチドおよび二重特異性抗体を上下にピペッティングすることによって2:1モル比(ペプチド:抗体)まで混合し、RTで15分間インキュベートした。次いで、複合体をさらに改変することなくインビトロアッセイにおいて使用した。これらのアッセイのための複合体の希釈は、Opti-MEM1(Invitrogen Madison, WI)に溶解して行った。結果として生じた複合体は、抗体誘導体1つにつき2つのDig-ペプチドを有する単量体IgG様分子と規定された。これらの二重特異性ペプチド複合体の規定された組成(および2:1のペプチド:タンパク質比)はサイズ排除クロマトグラフィーおよび装填/競合実験によって確かめられた。図3は、このような規定された抗体複合体の模式図を示す。メリチン、FALL、またはFam5Bとジゴキシゲニン結合実体とのカップリングのさらなる詳細はPCT/EP2010/004051に記載されている。
ヒト化<Dig>IgGおよびマウス<Dig>IgGまたは二重特異性抗体誘導体をカップリング反応のタンパク質成分として使用した。これらの分子の組成および精製は前述されている。ジゴキシゲニン化Cy5とジゴキシゲニン結合抗体との複合体を作製するために、本発明者らは、Cy5-Dig結合体をPBSに0.5mg/mlの最終濃度まで溶解した。抗体または抗体誘導体を、20mMヒスチジンおよび140mM NaClからなる緩衝液、pH6に溶解して1mg/ml(5μM)の濃度で使用した(少なくとも10mg/mlの抗体または抗体誘導体の濃度を用いて最適な結果を得ることができる)。ジゴキシゲニン化Cy5および抗体(-誘導体)を2:1のモル比(ジゴキシゲニン化Cy5:抗体)まで混合した。この手順の結果として、規定された組成の複合体の均一な調製物が生じた。図4は、2つのジゴキシゲニン結合部位を含有する二重特異性抗体誘導体がDig-Cy5と様々な化学量論比でインキュベートされた装填実験の結果を例示的に示す。抗体の装填は、サイズ排除カラムによって抗体関連フルオロフォアの蛍光(650/667nm)を測定することによって確かめることができる。これらの実験の結果から、装填は、抗体がジゴキシゲニン結合部位を含有する場合にのみ生じ、Dig結合特異性のない抗体(例えば、Her2結合IgGまたはIGF1R結合IgG)はDig-Cy5に結合しないことが証明された。さらに、2:1のDig-Cy5:IgG比に達するまで、二価Dig結合抗体誘導体について装填シグナルの増大が観察された。その後、装填に関連する蛍光シグナルはプラトーに達する。これは、1つの二価抗Dig IgGが2分子のDig-Cy5を結合することを証明している。結合複合体は、この期間内で、かつ分析サイズ排除手順に関連する実験条件下で解離しないのでかなり安定している。
ジゴキシゲニン化ペプチドとマウスハイブリドーマ由来<Dig>IgGとの複合体を作製するために、mu<IgG>(10mM KPO4、70mM NaCl; pH7.5からの凍結乾燥物)を12mlの水に溶解し、20mM His、140mM NaCl;pH6.0に対して透析して、11mlの緩衝液中に300mg(2x10-6mol)を得た(c=27.3mg/ml)。DIG-moPYY(11.57mg、4x10-6mol、2eq.)を1時間以内に2.85mgの4つの部分に分けて添加し、室温でもう1時間インキュベートした。複合体形成反応が完了した後に、ペプチド-IgG複合体を、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0に溶解して、Superdex 200 26/60 GLカラム(320ml)を介したサイズ排除クロマトグラフィーによって流速2.5ml/minで精製した。溶出された複合体を4ml画分中に収集し、プールし、0.2μmフィルターで滅菌して、14.3mg/mlの濃度のIgG/ペプチド複合体234mgを得た。同様に、ヒト化<Dig>IgGのペプチド複合体を作製するために、hu<Dig>IgGの濃度を20mM His、140mM NaCl、pH6.0に溶解して10.6mg/ml(0.93ml中に9.81mg、6.5x10-8mol)にした。0.57mg=1.97x10-7mol=3.03eq.のジゴキシゲニン化ペプチドDIG-moPYYを凍結乾燥物としてIgG溶液に添加した。ペプチドおよび抗体を室温で1.5時間インキュベートした。過剰なペプチドを、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0に溶解して、Superose 6 10/300 GLカラムを介したサイズ排除クロマトグラフィーによって0.5ml/minの流速で除去した。溶出された複合体を0.5ml画分中に収集し、プールし、0.2μmフィルターで滅菌して、1.86mg/mlの濃度のIgG/ペプチド複合体4.7mgを得た。結果として生じたペプチド-IgG複合体は単量体IgG様分子として規定された。図5は、DIG-moPYYペプチドとヒト化<Dig>IgGおよびマウス<Dig>IgGとの複合体のサイズ排除プロファイルを示す。結果として生じた複合体は、1つの抗体誘導体につき2つのDig-PYY誘導体を有する単量体IgG様分子として規定された。これらのペプチド複合体の規定された組成はサイズ排除クロマトグラフィーによって確かめられた。サイズ排除クロマトグラフィーはまたタンパク質凝集物が存在しないことも示した(図5)。規定された組成(および2:1のペプチド:タンパク質比)のこれらの二重特異性ペプチド複合体は、SEC-MALS(サイズ排除クロマトグラフィー-多角度光散乱検出)分析、図6によってさらに確かめられた。SEC-MALS分析のために、100〜500μgのそれぞれの試料を、0.25〜0.5ml/minの流速で、移動相として1xPBS pH7.4を用いてSuperdex 200 10/300 GLサイズ排除カラムに適用した。光散乱を、Wyatt miniDawn TREOS/QELS検出器を用いて検出し、屈折率を、Wyatt Optilab rEX-検出器を用いて測定した。結果として生じたデータを、ソフトウェアASTRA(バージョン5.3.4.14)を用いて分析した。SECMALLS分析の結果から、複合体の質量、半径、およびサイズに関する情報が得られる。次いで、これらのデータを、対応する無装填抗体のデータと比較した。これらの実験の結果から、DIG-moPYYをDig結合抗体に曝露すると、1つの二価IgGにつき2つのDIG-moPYY誘導体を含有する複合体が生じることが証明された。従って、DIG-moPYYは、規定された部位(結合領域)において、かつ規定された化学量論でDig結合抗体と複合体を形成することができる。結合複合体は、この期間内で、かつ分析SEC-MALLS手順に関連する実験条件下で解離しないのでかなり安定している。表面プラズモン共鳴研究を適用することによる複合体の特徴付けから、複合体形成反応によって、規定された、かつ完全に装填した分子が生じたというさらなる証拠が得られた。ジゴキシゲニン結合抗体を、シグナル増大をもたらすSPRチップに結合することができる。その後に、DIG-moPYYを添加すると、全ての結合部位が完全に占有されるまでシグナルはさらに増大する。これらの状態で、さらに多くのDIG-moPYYを添加しても、シグナルはこれ以上増大しない。このことから、装填反応は特異的であり、シグナルはDig-ペプチドの非特異的な付着性(stickyness)によって引き起こされないことが分かる。さらに、Dig-ペプチドが抗体から分離するという証拠がないので、抗体の装填は極めて安定している。これらの実験の結果から、DIG-moPYYをDig結合抗体に曝露すると、規定されたサイズの分子の良好に規定された組成物が生じることが証明される。従って、DIG-moPYYは、規定された部位(結合領域)において、かつ規定された化学量論でDig結合抗体と複合体を形成することができる。結果として生じた組成物は、SECにおいて良好に規定され、かつ均一であるように見える。結合複合体は、この期間内で、かつSECまたはSPR手順に関連する実験条件下で解離しないのでかなり安定している。
ジゴキシゲニン化ペプチドおよび<Dig>抗体との複合体は機能を保持する
抗体と生理活性化合物との複合体形成を目的とした全ての技術のために対処する必要のある非常に重要な話題の1つは、化合物の機能が保持されていなければならないということである。本発明者らが説明する抗体技術は、生理活性ペプチドに対して2つの調節工程を有する。第1の工程では、本発明者らは、ジゴキシゲニンを生理活性ペプチドに共有結合する。第2の工程では、このジゴキシゲニン化ペプチドと、大きなタンパク質である抗体誘導体との複合体を形成させる。ペプチドの活性を保持するために、両工程のために改変ペプチドの活性を確実なものとすることが重要である。すなわち、活性アッセイは、(i)ジゴキシゲニン化後にペプチドの機能が保持されている、および(ii)ジゴキシゲニン化ペプチドとマウス<Dig>またはヒト化<Dig>との複合体形成後に機能が保持されていることを示す必要がある。
ジゴキシゲニンによるペプチドメリチン、FALLv1、およびFALLv2の付加または変化によってペプチドの生物学的活性が変わるかどうか評価するために、本発明者らはインビトロアッセイを行った。これらのペプチドが細胞傷害性であるので、これらの生物学的活性は死細胞数をモニタリングすることによって容易に分析することができる。この数を測定するために、CytoTox-Gloアッセイ(Promega Madison, WI)を使用した。表2は、メリチン、Fallv1、およびFallv2ペプチド、ならびにこれらのDIG改変変種の生物学的活性を評価するために実施された、これらのCytoTox-Glo-アッセイの結果を示す。これらのアッセイのために、H322M細胞を96ウェルプレートの中に15.000細胞/ウェルの密度で播種した。細胞を、10%FCS、Na+ピロベート(Pyrovate)、L-グルタミン、およびNEAAミックスを含むRPMIに入れ、37℃、5%CO2、および85%湿度で24時間インキュベートした。次いで、ペプチドおよびそのDIG改変変種を示された濃度で細胞に添加した。細胞をさらに48時間インキュベートした。この期間の後に、細胞を、CytoTox-Glo-アッセイ試薬を用いて製造業者の説明書に従って処理した。手短に述べると、このアッセイは、試薬中の蛍光発生ペプチドを切断する培地中のプロテアーゼの存在によって死細胞を検出する。従って、このアッセイの蛍光は死細胞を表している。次いで、96ウェルプレートを、InfiniteF200ルミネッセンスリーダー(Tecan Austria, Groding)において分析した。これらのアッセイの結果(表2)から、ジゴキシゲニン化ペプチドは、非改変ペプチドと比較した時に、その生物学的活性を保持していることが分かる。CytoTox-GloアッセイのIC50値は、非改変ペプチドについては3.28μM、ジゴキシゲニン化ペプチドメリチンについては3.98μMであった。Fallv1およびFallv2の活性は、ジゴキシゲニンと結合体化された時に同様に保持された(表2)。従って、ジゴキシゲニン化は生物学的活性を妨げなかった。本発明者らは、メリチン、FALLv1、およびFALLv2ペプチドのジゴキシゲニン化がこれらの生物学的活性を妨げないと結論づけた。ハプテンとの共有結合だけでなく、ペプチドと大きな抗体分子との複合体形成もペプチドの生物学的活性に影響を及ぼすことがある。IgG由来分子は大きなタンパク質(ペプチドの10〜40倍のサイズ)であるので、このような分子がペプチドの到達を立体的に妨げる可能性があり、従って、生物学的活性を妨げる可能性があることは経験的に排除することができない。この話題に対処するために、本発明者らは、細胞傷害性ペプチドFALLv1およびFam5bに対するペプチド-抗体複合体のインビトロ活性を分析した。再度、本発明者らは、これらのペプチドには腫瘍細胞株に対する細胞傷害性があるという事実を利用し、従って、前記のように細胞傷害アッセイおよび生存アッセイにおいてペプチドの機能を試験した。これらのアッセイの結果から、ジゴキシゲニン化ペプチドは、ジゴキシゲニン結合抗体誘導体と複合体を形成した時にその生物学的活性を保持することが分かった。さらに、本発明者らは、このようなペプチドを腫瘍細胞に標的化するために二重特異性抗体を利用した時に、(PCT/EP2010/004051に示したように)非標的化細胞と比較して、標的化細胞に対してペプチドによって媒介される高い細胞傷害性を示すことができた。
Cy5のジゴキシゲニン化によってCy5の蛍光特性が変わるかどうか評価するために、本発明者らはCy5の励起スペクトルおよび発光スペクトルを比較し、これを、新たに作製されたDig-Cy5のスペクトルおよび二重特異性抗体との複合体内にあるDig-Cy5と比較した。表3は、これらの分析の結果をまとめたものである。Cy5とジゴキシゲニンとの結合体化ならびにDig-Cy5と抗体との複合体形成によってCy5の蛍光特性は妨げられない。
PYY由来ペプチドの望ましい機能は、そのコグネイト受容体NPY2に結合し、そのコグネイト受容体NPY2のシグナル伝達を妨害することである。NPY2受容体を介したシグナル伝達は代謝プロセスに関与する、および/または代謝プロセスを調節する。ペプチドmoPYYをジゴキシゲニンで改変してDIG-moPYYを作製することによって、この活性が影響を受けるかどうか評価するために、本発明者らは、NPY2受容体を発現するHEK293細胞において、フォルスコリン刺激によるcAMP蓄積をDIG-moPYYが阻害する能力を評価した(cAMPアッセイ)。同時に、本発明者らは、ジゴキシゲニン化に使用した位置と同じ位置においてPEGで誘導体化されたmoPYYペプチド(PEG-moPYY)の活性を評価した。図7は、PYY(3〜36)、そのY2受容体特異的改変類似体moPYY、そのDig改変変種DIG-moPYY、ペグ化変種PEG-moPYY、および抗体と複合体を形成したDig変種の生物学的活性を評価するために実施されたcAMP-アッセイの結果を示す。cAMPアゴニストアッセイのために、以下の材料:384ウェルプレート; Tropix cAMP-Screen Kit; cAMP ELISA System (Applied Biosystems, カタログ番号T1505; CS 20000); フォルスコリン (Calbiochem カタログ番号 344270); 細胞: HEK293/hNPY2R; 増殖培地: ダルベッコ改変イーグル培地 (D-MEM, Gibco); 10% 胎仔ウシ血清 (FBS, Gibco)、 熱失活; 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (Pen 10000 単位/mL:Strep 10000mg/mL, Gibco);500μg/mL G418(ジェネティシン, Gibcoカタログ番号11811-031);およびプレーティング培地:DMEM/F12 w/oフェノールレッド(Gibco); 10%FBS(Gibco, カタログ番号10082-147)、熱失活;1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco, カタログ番号15140-122);500μg/mL G418(ジェネティシン、Gibco, カタログ番号11811-031)を使用した。
ジゴキシゲニン化抗体と複合体を形成したmoPYYペプチドは細胞培養実験においてペグ化moPYYペプチドより優れた効力を有する。
PEGとペプチドとの共有結合によってペプチドの機能は妨げられることが多く、従って、ペプチドの活性は低下する。例えば、取り付けられるペプチドより長いことが多いPEG鎖はペプチドに「巻き付き」、それによって、極めて重要な領域の到達を防ぐ可能性がある。ハプテンとの共有結合だけでなく、ペプチドと大きな抗体分子との複合体形成も生物学的活性に影響を及ぼす可能性がある。IgGがPEG鎖のようにペプチドに「巻き付き」、それによって、極めて重要な領域の到達を防ぐことができるのはまずないように思われる。しかしながら、IgGは大きなタンパク質(ペプチドの10〜40倍のサイズ)であるので、このような分子がペプチドの到達を立体的に妨げ、従って、生物学的活性を妨げる可能性があることは経験的に排除することができない。この話題に対処するために、本発明者らは、PYY由来ペプチドを対象にして、ペプチドとそのコグネイト受容体との相互作用を扱うcAMPアッセイにおいて、ペプチド-IgG複合体のインビトロ活性とPEG-ペプチドのインビトロ活性を比較した(cAMPアッセイの詳細については前記を参照されたい)。
ジゴキシゲニン化Cy5またはジゴキシゲニン化moPYYペプチドと<Dig>IgGとの複合体の血清安定性および血清中レベル
本発明者らのペプチド改変技術の目的は、ペプチドの治療適用性を改善することである。ペプチドを治療に適用する主なボトルネックは、現在、インビボでの限定された安定性ならびに/または短い血清半減期および速いクリアランスである。抗体とハプテン標識ペプチドとの複合体形成がこれらの問題を克服し得るかどうか評価するために、本発明者らは、インビボでの抗体とフルオロフォアまたはペプチドの複合体のPKパラメータを求め、これらと非改変化合物のPKと比較した。このために、本発明者らは、(i)ジゴキシゲニン結合IgGにジゴキシゲニン化フルオロフォアDig-Cy5またはジゴキシゲニン化Dig-PYYペプチド誘導体を装填する;(ii)複合体を形成しなかった化合物および複合体を形成した化合物を動物に適用する、ならびに(iii)これらの動物において化合物の血清中濃度を経時的に分析する必要があった。
Dig-Cy5複合体を作製するために、886.1nmolの凍結乾燥DIG-Cy5を4つの部分に分けて、ゆっくりと振盪しながら、20mMヒスチジン/140mM NaCl pH6.0に溶解した446.4nmol抗DIG-抗体にRTで1時間以内に添加した。最後の部分を添加した後に、試料を計2時間インキュベートした。DIG-PYY複合体の場合、691.7nmolの凍結乾燥DIG-PYYを、20mMヒスチジン/140mM NaCl pH6.0中の364nmolの抗DIG-抗体に添加し、DIG-Cy5複合体と同様に処理した。試料を、移動相として20mMヒスチジン/140mM NaCl pH6.0を用いてSuperdex 200 HiLoad 16/60 prep gradeサイズ排除カラムに適用した。複合体を含有する画分をプールし、遠心濾過装置(Vivaspin 20, 30kDa MWCO, GE Healthcare)を用いて19.4mg/ml(DIG-Cy5複合体)および19.9mg/ml(DIG-PYY複合体)まで濃縮した。DIG-Cy5含有試料のタンパク質濃度を、式((A280-(A649xCF))x希釈率)/εによって求めた。CFは、0.008と求められた補正率A280nm/A649nmである。抗体へのDIG-Cy5のローディングは、式:(A649nm/(εcy5xタンパク質濃度M))x希釈率を用いて1.2モルDIG-Cy5/モル抗体と計算された。DIG-PYY複合体のローディングはSEC-MALLSによって求められ、結果として1:1のDIG-PYY:抗体比となった。全ての試料を、無菌条件下でPVDF注射器フィルター(0.22μm孔径)を用いて濾過した。
抗体と低分子蛍光基質との複合体形成のPKパラメータに及ぼす影響を分析するために、20mMヒスチジン/140mM NaCl pH6.0に溶解した32.1nmolのDIG-Cy5または対応する抗体複合体化化合物を、それぞれの物質について2匹の雌マウス(NRMI系統)に適用した。マウスの体重は、抗体複合体の場合、24g、25g、複合体を形成しなかったDIG-Cy5の場合、24gおよび25gであった。以下の時点:マウス1については0.08時間、2時間、および24時間、マウス2については0.08時間、4時間、24時間の後に、約0.1mlの血液試料を収集した。RTで1時間後に、遠心分離(9300xg、3分、4℃)によって少なくとも40μlの血清試料を入手した。血清試料を-80℃で保管した。所定の時点での血清中の化合物の量を求めるために、本発明者らはDig-Cy5の蛍光特性を利用した。血清試料中のCy5関連蛍光を、Cary Eclipse蛍光分光光度計(Varian)を用いて120μl石英キュベット中で室温で測定した。励起(Exitation)波長は649nmであり、発光を670nmで測定した。適切な発光強度範囲に達するように、血清試料を1xPBSで希釈した。それぞれの試料と同じように1xPBSで希釈した未処置マウス血清をブランクプローブとして使用した。図8および表4は、注射5分後の(ピーク)血清中レベルに対して基準化されたCy5媒介蛍光の相対(%)レベルとして表された、これらの分析の結果を示す。さらに小さな分子量の化合物について予想されたように、複合体を形成しなかったDig-Cy5は血清から急速になくなる。注射2時間後、適用され、かつ血清中に5分後に検出可能な蛍光の5%未満しか検出できなかった。さらに後の時点である注射4時間後および24時間後では、Cy5媒介シグナルは検出できなかった。このことから、化合物は循環から急速に除去されたことが分かる。複合体を形成しなかった化合物とは対照的に、抗体と複合体を形成した化合物は高レベルかつ後の時点で検出可能であった。注射2時間後、依然として、適用された蛍光の約70%(5分レベルを100%に設定した)が血清中に検出可能であった。後の時点でも有意なCy5媒介蛍光レベルが検出可能であり、4時間(時間)で5分値の約60%が検出可能であり、注射24時間後で約40%が検出可能であった。このことから、抗体複合体形成は低分子化合物の血清半減期を有意に延ばすことが分かる。
抗体とジゴキシゲニン化ペプチドとの複合体形成のPKパラメータに及ぼす影響を分析するために、20mMヒスチジン/140mM NaCl pH6.0に溶解した32.1nmolのペプチドDIG-moPYYまたは対応する抗体複合体化ペプチドを、それぞれの物質について2匹の雌マウス(NRMI系統)に適用した。マウスの体重は、<DIG>-DIG-moPYYの場合、23gおよび25g、DIG-moPYYの場合、28gおよび26gであった。以下の時点:マウス1については0.08時間、2時間、および24時間、マウス2については0.08時間、4時間、24時間の後に、約0.1mlの血液試料を収集した。RTで1時間後に、遠心分離(9300xg、3分、4℃)によって少なくとも40μlの血清試料を入手した。血清試料を-80℃で保管した。所定の時点での血清中のジゴキシゲニン化ペプチドの量の測定はDig-Cy5より難しいことが判明した。この理由は、本発明者らには血清試料中のペプチドを検出する直接的な手段が無かったことにあった。従って、本発明者らは、血清中のジゴキシゲニン化ペプチドを検出するウエスタンブロット関連アッセイを考案した。第1の工程では、血清試料を還元SDS-PAGEによって分離した。このための試料調製は高濃度のSDSおよび還元剤に血清を曝露することを含んだので、Dig-ペプチドを(完全に変成した/折り畳まれていない)<Dig>IgGから放出することができる。抗体複合体からのペプチドの放出を媒介し、SDS-PAGEによっつてペプチドを分離するために、2μlのそれぞれの血清試料を18μl の20mMヒスチジン/140mM NaCl pH6.0で希釈し、6.7μlの4xLDS試料緩衝液および3μlの10x試料還元剤(NuPAGE, Invitrogen)と95℃で5分間、混合した。対照として、同じ系統の未処置マウスの血清2μlを使用した。試料を4〜12%Bis-Trisゲル(NuPAGE, Invitrogen)に適用し、ランニング緩衝液として1xMES(Invitrogen)を用いて200V/120mAで20分間、移動させた。その後に、分離したタンパク質およびペプチドを、XCell Sure Lock(登録商標)Mini-Cellシステム(Invitrogen)を用いてPVDF膜(0.22μm孔径, Invitrogen)に25V/130mAで40分間ブロットした。膜を、1xPBS+1%Tween20(PBST)に溶解した1 % スキムミルクでRTで1時間ブロックした。その後に、ジゴキシゲニン化ペプチドを、抗ジゴキシゲニン抗体を用いて膜上で検出した。このために、1%スキムミルク/PBST 10mlに溶解した13μg/mlの濃度の抗ジゴキシゲニン抗体MAK<DIG>M-19-11-IgG(SP/Q)を膜にRTで2時間、適用した。膜を1xPBSTで3x5分間、洗浄した。LumiLightPLUSウェスタンブロッティングキット(Roche)のPODにカップリングさせた抗マウスIgG Fab断片を、1%スキムミルク/PBST 10mlで1:25に希釈してRTで1時間、適用した。膜を1xPBSTで3x5分間、洗浄した。検出は、4mlのLumiLightウェスタンブロッティング基質中で膜をRTで5分間インキュベートすることによって行った。化学ルミネセンスをLumiImager F1(Roche)によって検出した。曝露時間は20分であった。本発明者らの分析の結果を図9および表4に示した。血清中のタンパク質濃度が高く、Dig-ペプチドのサイズがかなり小さかったために、ウエスタンブロット由来シグナルの正確な定量は保証されない。さらに、ウエスタンブロットから派生した技法は定量データではなく定性データ(バンドの存在対非存在)を提供する。それにもかかわらず、これらの技術上の制約にもかかわらず、本発明者らは、様々な時点でマウス血清中のDig-ペプチドの存在を証明することができた。抗体と複合体を形成したペプチドが与えられたマウス(図9A)は最も早い時点で強いシグナルを示した(投与の5分後)。ブロット上での対照ペプチドのサイズおよび場所により示されたように、これらのシグナルは、はっきりとペプチドのものとみなすことができた。これらの血清試料中で、高質量のさらなるシグナルも目に見えた。これらは血清中に存在するペプチドであり、本発明者らのアッセイにおける異常な電気泳動挙動を示しているのかもしれない。抗体と複合体を形成したペプチドで処置されたマウスの血清中に、ペプチド関連シグナルは初期の時点で最も強く、時が経つにつれて減少した。それにもかかわらず、全ての時点および投与して24時間後でさえも、良好なシグナルによりペプチドは依然として検出可能であった。対照的に、複合体を形成しなかったペプチドが与えられたマウスでは、放出された小さなペプチドのものとみなすことができるシグナルは、最も早い時点でもほとんど検出することができなかった。図9Bは、正常な露出条件下ではブロット上に遊離ペプチドがほとんど目に見えないことを示す。ブロットのコントラスト強調および長い露出時間は、投与5分後に、いくらかのペプチドの存在を証明することができるが、微量にしか証明することができない。もっと後の時点では、規定されたペプチドのバンドはコントラストを強調しても検出することができない。さらに、複合体を形成しなかったペプチドが与えられたマウスにおいて、さらに高質量のさらなるシグナルもかなり弱かった。これらの実験から、本発明者らは、複合体を形成しなかったペプチドのマウス血清中の半減期は非常に短いと結論づけた。対照的に、同じペプチドであるが、抗体と複合体を形成した形のペプチドが与えられたマウスは、かなり長期間にわたって血清中にこれらのペプチドの存在を示す。注射して24時間後でさえも、これらのマウスの血清中にペプチドをはっきりと特定することができる。従って、抗体複合体形成は低分子蛍光化合物の薬物動態を改善するだけでなく(図8を参照されたい)、ジゴキシゲニン化ペプチドの薬物動態も改善する。
ジゴキシゲニン化PYY由来ペプチドと<Dig>IgGとの複合体のインビボ活性
説明されたペプチド改変技術の目的はペプチドの治療適用性を改善することである。ペプチドを治療に適用する主なボトルネックは、現在、インビボでの限定された安定性ならびに/または短い血清半減期および速いクリアランスである。短い血清半減期および速いクリアランスは、その結果として、治療用ペプチドの治療抗力を限定することが多い。抗体とハプテン標識ペプチドが複合体形成すると、ペプチドを含む低分子化合物の血清半減期が延びるので(前記を参照されたい)、本発明者らは、このことが、複合体を形成しなかったペプチドと比較して、抗体と複合体を形成したペプチドの治療効力の改善につながる可能性があると考えた。この話題に対処するために、本発明者らは、ペプチド-抗体複合体のインビボ生物学的活性を確かめ、これらと、複合体を形成しなかったペプチドのインビボ生物学的活性を比較した。
Claims (17)
- a)ジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、および
b)5〜60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニン
の複合体を含む、薬学的組成物。 - 前記ペプチドが10〜50個のアミノ酸を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
- a)の抗体がモノクローナル抗体である、請求項1または2のいずれか記載の薬学的組成物。
- a)の抗体がSEQ ID NO:37の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:36の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- a)の抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- a)の抗体がSEQ ID NO:39の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO:38の軽鎖可変ドメインを含む、請求項5記載の薬学的組成物。
- a)ジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、および
b)5〜60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニン
の複合体であって、産生後に回収された、複合体。 - 前記ペプチドが10〜50個のアミノ酸を含む、請求項8記載の複合体。
- a)の抗体がモノクローナル抗体である、請求項8〜9のいずれか記載の複合体。
- a)の抗体がSEQ ID NO.1の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO 2の軽鎖可変ドメインを含む、請求項8〜10のいずれか一項記載の複合体。
- a)の抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項8〜10のいずれか一項記載の複合体。
- a)の抗体がSEQ ID NO.3の重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO 4の軽鎖可変ドメインを含む、請求項12記載の複合体。
- 代謝疾患の治療のための、請求項1〜7のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 癌の治療のための、請求項1〜7のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 炎症性疾患の治療のための、請求項1〜7のいずれか一項記載の薬学的組成物。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020505472A (ja) * | 2017-01-27 | 2020-02-20 | ボード オブ スーパーバイザーズ オブ ルイジアナ ステート ユニバーシティ アンド アグリカルチュアル アンド メカニカル カレッジ | 自己免疫性糖尿病のための二官能性低分子ペプチド |
JP2021521144A (ja) * | 2018-04-10 | 2021-08-26 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | キャップ付加を伴うリキシセナチドの合成 |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR102012011493A2 (pt) * | 2012-05-15 | 2015-09-01 | Fundação Butantan | Método de produção e obtenção de fragmento fab do anticorpo anti-digoxina monoclonal a partir da técnica de clonagem em biologia molecular |
SI2869848T1 (sl) | 2012-07-04 | 2017-01-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Kovalentno vezani konjugati antigen-protitelo |
BR112014030843A2 (pt) | 2012-07-04 | 2019-10-15 | Hoffmann La Roche | anticorpo anti-teofilina, formulação farmacêutica e uso do anticorpo |
EP2870180B1 (en) | 2012-07-04 | 2024-08-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Anti-biotin antibodies and methods of use |
JP6608827B2 (ja) | 2013-12-20 | 2019-11-20 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | ヒト化抗タウ(pS422)抗体及び使用方法 |
RU2682754C2 (ru) * | 2014-01-03 | 2019-03-21 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Конъюгаты полипептидного токсина и антитела, соединенных ковалентной связью |
PL3089996T3 (pl) * | 2014-01-03 | 2021-12-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dwuswoiste przeciwciała przeciw haptenowi/przeciw receptorowi występującemu w barierze krew-mózg, ich kompleksy i ich zastosowanie jako przenośniki wahadłowe występujące w barierze krew-mózg |
CN105873615B (zh) * | 2014-01-03 | 2020-12-25 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 共价连接的helicar-抗helicar抗体缀合物及其用途 |
JP6654581B2 (ja) | 2014-06-26 | 2020-02-26 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 抗brdu抗体および使用方法 |
AR100978A1 (es) | 2014-06-26 | 2016-11-16 | Hoffmann La Roche | LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS |
MA41898A (fr) * | 2015-04-10 | 2018-02-13 | Hoffmann La Roche | Dérivés de quinazolinone bicyclique |
EP3744732A1 (en) | 2015-06-24 | 2020-12-02 | F. Hoffmann-La Roche AG | Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use |
KR102506295B1 (ko) * | 2020-08-28 | 2023-03-08 | 국립암센터 | 디그옥시제닌에 대한 인간화 항체 및 이의 용도 |
CN116396392B (zh) * | 2023-01-17 | 2023-10-27 | 珠海重链生物科技有限公司 | 一种特异性针对异羟基洋地黄毒甙元的抗体及其相关应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5983056A (ja) * | 1982-09-23 | 1984-05-14 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | ジゴキシゲニン免疫原複合体に対する抗体およびそれらを用いるジゴキシン測定免疫試験法 |
JPH05504761A (ja) * | 1989-12-07 | 1993-07-22 | ゲーエスエフ―フォルシュンクスツェントルム フュア ウムベルト ウント ゲズントハイト ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 哺乳類のhiv感染症の治療のための方法及び組成物 |
JP2002537362A (ja) * | 1999-02-22 | 2002-11-05 | ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ビオチン化ケモカイン抗体複合体 |
JP2009518349A (ja) * | 2005-12-07 | 2009-05-07 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 神経ペプチド2受容体アゴニスト |
Family Cites Families (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US6548640B1 (en) | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
WO1989006692A1 (en) | 1988-01-12 | 1989-07-27 | Genentech, Inc. | Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function |
DE3836656A1 (de) | 1988-10-27 | 1990-05-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue digoxigenin-derivate und ihre verwendung |
US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
US6150584A (en) | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
JPH05509294A (ja) | 1990-04-06 | 1993-12-22 | ラ ホヤ キャンサー リサーチ ファウンデーション | 血栓症治療のための方法および組成物 |
US5770429A (en) | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
DE69129154T2 (de) | 1990-12-03 | 1998-08-20 | Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. | Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften |
AU675916B2 (en) | 1991-06-14 | 1997-02-27 | Genentech Inc. | Method for making humanized antibodies |
US7018809B1 (en) | 1991-09-19 | 2006-03-28 | Genentech, Inc. | Expression of functional antibody fragments |
AU5081193A (en) * | 1992-08-31 | 1994-03-29 | Magainin Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of gynecological malignancies with biologically active peptides |
AU684992B2 (en) | 1994-07-25 | 1998-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Hapten-marked peptides |
US5789199A (en) | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
US5840523A (en) | 1995-03-01 | 1998-11-24 | Genetech, Inc. | Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides |
US6267958B1 (en) | 1995-07-27 | 2001-07-31 | Genentech, Inc. | Protein formulation |
US6171586B1 (en) | 1997-06-13 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
US6040498A (en) | 1998-08-11 | 2000-03-21 | North Caroline State University | Genetically engineered duckweed |
US6610833B1 (en) | 1997-11-24 | 2003-08-26 | The Institute For Human Genetics And Biochemistry | Monoclonal human natural antibodies |
EP1034298B1 (en) | 1997-12-05 | 2011-11-02 | The Scripps Research Institute | Humanization of murine antibody |
DE60022369T2 (de) | 1999-10-04 | 2006-05-18 | Medicago Inc., Sainte Foy | Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff |
US7125978B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Medicago Inc. | Promoter for regulating expression of foreign genes |
IL149809A0 (en) | 1999-12-15 | 2002-11-10 | Genentech Inc | Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
JP3523245B1 (ja) | 2000-11-30 | 2004-04-26 | メダレックス,インコーポレーテッド | ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物 |
JP4753578B2 (ja) | 2002-06-03 | 2011-08-24 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 合成抗体ファージライブラリー |
JP4237703B2 (ja) | 2002-09-27 | 2009-03-11 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | インスリン様成長因子結合タンパク質−4及びポリ(エチレングリコール)の接合体 |
US20050079574A1 (en) | 2003-01-16 | 2005-04-14 | Genentech, Inc. | Synthetic antibody phage libraries |
US7871607B2 (en) | 2003-03-05 | 2011-01-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases |
US20060104968A1 (en) | 2003-03-05 | 2006-05-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases |
RU2386638C2 (ru) | 2004-03-31 | 2010-04-20 | Дженентек, Инк. | Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела |
US7785903B2 (en) | 2004-04-09 | 2010-08-31 | Genentech, Inc. | Variable domain library and uses |
JO3000B1 (ar) | 2004-10-20 | 2016-09-05 | Genentech Inc | مركبات أجسام مضادة . |
JP5167473B2 (ja) | 2005-03-03 | 2013-03-21 | コヴェックス・テクノロジーズ・アイルランド・リミテッド | 抗血管新生化合物 |
GB0504857D0 (en) | 2005-03-09 | 2005-04-13 | Imp College Innovations Ltd | Novel compounds and their effects on feeding behaviour |
EP1957531B1 (en) | 2005-11-07 | 2016-04-13 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences |
WO2007064919A2 (en) | 2005-12-02 | 2007-06-07 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with restricted diversity sequences |
AR060871A1 (es) | 2006-05-09 | 2008-07-16 | Genentech Inc | Union de polipeptidos con supercontigos optimizados |
CN101505795B (zh) * | 2006-07-03 | 2013-02-13 | 查尔斯·戴维·阿代尔 | 用于调节细胞粘附分子表达的组合物 |
CN100592373C (zh) | 2007-05-25 | 2010-02-24 | 群康科技(深圳)有限公司 | 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法 |
US8293714B2 (en) | 2008-05-05 | 2012-10-23 | Covx Technology Ireland, Ltd. | Anti-angiogenic compounds |
CN102481367B (zh) * | 2009-07-06 | 2015-04-29 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 结合地高辛配基的双特异性抗体 |
-
2011
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-
2013
- 2013-06-27 US US13/929,231 patent/US20130280279A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5983056A (ja) * | 1982-09-23 | 1984-05-14 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テツド | ジゴキシゲニン免疫原複合体に対する抗体およびそれらを用いるジゴキシン測定免疫試験法 |
JPH05504761A (ja) * | 1989-12-07 | 1993-07-22 | ゲーエスエフ―フォルシュンクスツェントルム フュア ウムベルト ウント ゲズントハイト ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 哺乳類のhiv感染症の治療のための方法及び組成物 |
JP2002537362A (ja) * | 1999-02-22 | 2002-11-05 | ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ビオチン化ケモカイン抗体複合体 |
JP2009518349A (ja) * | 2005-12-07 | 2009-05-07 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 神経ペプチド2受容体アゴニスト |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6014030570; Decarie, Anick: Peptides Vol.15, No.3, 1994, pp.511-518 * |
JPN6014030572; Pollaro, L.: MedChemComm Vol.1, 2010, pp.319-324 * |
JPN6015027091; Blais C Jr, et al.: 'Digoxigenin-labeled peptides for the immunological quantification of intracellular signaling protein' Bio Techniques Vol.23, No.6, 199712, p.1098-1103 * |
JPN6015027093; 生化学辞典(第3版) , 20020701, p.1048-1049, 株式会社 東京化学同人 * |
JPN6015027094; Travis SM, et al.: 'Bactericidal activity of mammalian cathelicidin-derived peptides' Infection and Immunity Vol.68, No.5, 200005, p.2748-2755 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020505472A (ja) * | 2017-01-27 | 2020-02-20 | ボード オブ スーパーバイザーズ オブ ルイジアナ ステート ユニバーシティ アンド アグリカルチュアル アンド メカニカル カレッジ | 自己免疫性糖尿病のための二官能性低分子ペプチド |
JP2021521144A (ja) * | 2018-04-10 | 2021-08-26 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | キャップ付加を伴うリキシセナチドの合成 |
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