JP6521464B2 - 共有結合で連結されたポリペプチド毒素−抗体コンジュゲート - Google Patents

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Description

ポリペプチド毒素と抗体とを含む複合体であって、該複合体の構成要素が、単結合によって互いに共有結合で連結されている複合体を、本明細書では報告する。この共有結合的複合体を生産するための方法およびそれらの用途も報告する。
発明の背景
現在利用することができるハプテンに基づく送達プラットフォームの制約は、ハプテンと送達媒体との間の非共有結合的連結である。非共有結合的に連結されたペイロードは送達媒体から解離しうるので、送達媒体とペイロードとの間の安定な接続が望まれる応用例では、非共有結合的送達媒体-ペイロード複合体は不適切であるだろう。
これは、例えば腫瘍などにターゲティングされるべき毒性ペイロードであって、ペイロードが標的送達媒体から時期尚早に遊離した場合に有害作用（すなわち非特異的毒性）を引き起こすものでは、特に問題になりうる。
これらの短所に対処するためにさまざまなアプローチが報告されている。しかし、これらの技術はいずれも、オフターゲット活性を伴わない毒性ペイロードの送達、とりわけ毒性ポリペプチドの送達、を可能にするロバストで汎用性のあるプラットフォームにはならない。
1つのアプローチは、ペイロードを安定化する実体にペイロードを融合することである。そのような実体の例はヒト血清アルブミンまたはヒト免疫グロブリンFc領域である。このアプローチは、天然のアミノ酸残基で構成されていて、C末端またはN末端のいずれかにおける修飾を、その生物学的活性を喪失することなく許容する多くの線状ポリペプチドに、応用することができる。環状ポリペプチド、ステープルド（stapled）ポリペプチド、非天然アミノ酸残基または追加の修飾を含有するポリペプチドは、融合ポリペプチドとして組換え生産することができない。しかし、治療的応用にはそのようなポリペプチドが望ましい選択肢になる場合もある。なぜなら、それらはプロテアーゼ安定性、活性および特異性の点で、「通常の」線状ポリペプチドより優れていることが多いからである。しかしこれらの融合物では標的送達は達成できない。
治療用ポリペプチドのPK/安定性および生物物理学的挙動を改良するためのアプローチの1つであって、環状ポリペプチド、ステープルドポリペプチド、または非天然構造を含有するポリペプチドにも応用することができるものに、ポリマーへの化学的または酵素的コンジュゲーション、例えばPEG化またはHES化がある。しかしそのような修飾は、ポリペプチドの生物学的活性の著しい低減につながることが多く、また一定の状況では安全性または毒性の問題の原因にもなりうる。また、これらの修飾はターゲティング実体を欠いている。
治療用ポリペプチドの安定化またはPK調整のための既存の化学カップリング技術の大半が持つ大きな欠点は、その複雑さである。化学カップリング工程に加えて、これらの方法は、多くの場合、あいまいな化学量論および/または不明確な位置でPK調整実体につながっている、ポリペプチド誘導体の混合物をもたらす。加えて、現在使用されているポリペプチド修飾技術は、治療用ポリペプチドの生物学的活性を強く低減するか、さらには完全に喪失させる結果に終わることが多い。さらにまた、化学コンジュゲートの薬理学的特性および/または考えうる分解経路を予測することは困難である。
Metz, S., et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108（2011）8194-8424）(非特許文献1)は、標的ペイロード送達のための二重特異性ジゴキシゲニン結合性抗体を報告している。非共有結合的な抗体複合体形成によるハプテン化ペプチドのPK調整が、Hoffmann, E., et al.（J. Contr. Rel. 171（2013）48-56）（非特許文献2）によって報告されている。WO 2012/093068（特許文献1）では、抗dig抗体とペプチドにコンジュゲートされたジゴキシゲニンとの複合体の薬学的組成物が報告されている。ley抗原発現腫瘍細胞に対する組換えイムノトキシンの比較、すなわちアフィニティ、サイズ、および安定性の影響が、Bera, et al.（Bioconjug. Chem. 9（1998）736-743）（非特許文献3）によって報告されている。Lee H Pai, et al.は、モノクローナル抗体B3と、さまざまな形態のシュードモナス（Pseudomonas）外毒素とでできているイムノトキシンの抗腫瘍活性を報告している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88（1991）3358-3362）（非特許文献4）。
US 5,804,371（特許文献2）は、ハプテン標識ペプチドと、免疫学的検出方法におけるそれらの使用とを報告している。ジゴキシゲニン標識ペプチド（ブラジキニン）と、炎症組織におけるブラジキニンの化学発光酵素イムノアッセイへのその応用とが、Decarie, A., et al.（Peptides 15（1994）511-518）（非特許文献5）によって報告されている。
WO 2004/065569（特許文献3）には、多機能抗体が報告されている。
WO 2014/006124（特許文献4）には、共有結合で連結された抗原-抗体コンジュゲートが報告されている。
WO 2012/093068 US 5,804,371 WO 2004/065569 WO 2014/006124
Metz, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108（2011）8194-8424 Hoffmann, E., et al., J. Contr. Rel. 171（2013）48-56 Bera, et al., Bioconjug. Chem. 9（1998）736-743 Lee H Pai, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88（1991）3358-3362 Decarie, A., et al., Peptides 15（1994）511-518
ハプテン化ポリペプチド毒素と抗ハプテン抗体との間に共有結合を形成させることにより、ポリペプチド毒素の安定化およびPK特性の改良を達成できることがわかった。この共有結合は、抗ハプテン抗体の可変領域に導入された第1システイン残基（抗体の人為的システイン残基）と、ポリペプチド毒素に存在するまたはポリペプチド毒素に導入された第2システイン残基（（人為的）ポリペプチドシステイン残基）との間に形成される。
抗体の人為的システイン残基は、抗ハプテン抗体のCDRの1つの中に存在するが、抗ハプテン抗体のハプテン結合特性に干渉しない。ハプテン化ポリペプチド毒素のハプテンが抗ハプテン抗体によって結合されると、（人為的）ポリペプチドシステイン残基は、抗体の人為的システイン残基に接近する（空間的距離が近くなる）。このことが、ハプテン化ポリペプチド毒素と抗ハプテン抗体との間の共有結合の形成を可能にする。
（人為的）ポリペプチドシステイン残基は、ポリペプチド毒素とハプテンとをつなぐリンカー中にシステイン残基を導入するのではなく、ポリペプチド毒素のアミノ酸配列中に含まれていてもよく、したがってポリペプチド毒素そのもののコード領域内にあってもよいことがわかった。
組換え生産後に、抗体の人為的システイン残基と、（人為的）ポリペプチドシステイン残基はどちらも、別のシステイン残基またはグルタチオンとのジスルフィドとして、少なくとも部分的には「ブロックされる」と予想される。にも関わらず、そして非常に驚いたことに、組換え生産された人為的システイン含有抗ハプテン抗体と（人為的）システイン含有ハプテン化ポリペプチド毒素とを混合すると、他の試薬を追加しなくても、自発的位置決め酸化還元シャフリング反応（spontaneous positioned redox-shuffling reaction）によって、安定なジスルフィド結合が形成されることがわかった。共有結合的抗体-ポリペプチド毒素コンジュゲートは、結合特異性および送達特異性（ターゲティング）についても、ポリペプチド毒素の機能性（すなわち腫瘍細胞に対する細胞傷害活性）についても完全に機能的であり、循環中で非共有結合的複合体よりも安定であるという利点がある。抗体とポリペプチド毒素とを連結するジスルフィド結合は細胞内では切断されるので、ポリペプチド毒素は細胞内で特異的に共有結合的複合体から遊離することがわかった。
本明細書において報告する一局面は、ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体との（共有結合的）コンジュゲートであって、ジスルフィド結合が、ハプテンコンジュゲーションに使用されるポリペプチドのリジン残基の前または後のいずれかにあるシステイン残基と、該抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のシステイン残基との間に形成されている、（共有結合的）コンジュゲートである。
好ましい一態様において、ポリペプチドはポリペプチド毒素である。
一態様において、システイン残基は、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の1〜3残基前または1〜3残基後にある。この態様では、システイン残基が、リジン残基（N）に対して位置N-3、N-2、N-1、N＋1、N＋2またはN＋3の1つにある。
一態様において、システイン残基は、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の2残基前（すなわちリジン残基に対して位置N-2）または2残基後（すなわちリジン残基に対して位置N＋2）にある。
一態様において、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基は、ポリペプチドのN末端アミノ酸の10残基内にある。
一態様において、ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中に厳密に1つのリジン残基を含む。
本明細書において報告する一局面は、ハプテン化ポリペプチド毒素と抗ハプテン抗体との（共有結合的）コンジュゲートであって、ジスルフィド結合が、ハプテンコンジュゲーションに使用されるポリペプチド毒素のリジン残基の1〜3残基前または1〜3残基後のいずれかにあるシステイン残基と、該抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のシステイン残基との間に形成されている、（共有結合的）コンジュゲートである。
本明細書において報告する一局面は、ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体との（共有結合的）コンジュゲートであって、ジスルフィド結合が、ポリペプチド中のシステイン残基と、該抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のシステイン残基との間に形成されており、ポリペプチドがそのアミノ酸配列中に厳密に1つのリジン残基を含むことを特徴とする、（共有結合的）コンジュゲートである。
好ましい一態様において、ポリペプチドはポリペプチド毒素である。
一態様において、ジスルフィド結合の一部であるポリペプチド中のシステイン残基は、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の前または後のいずれかにある。
一態様において、システイン残基は、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の1〜3残基前または1〜3残基後にある。この態様では、システイン残基は、リジン残基（N）に対して位置N-3、N-2、N-1、N＋1、N＋2またはN＋3の1つにある。
一態様において、システイン残基は、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の2残基前（すなわちリジン残基に対して位置N-2）または2残基後（すなわちリジン残基に対して位置N＋2）にある。
一態様において、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基は、ポリペプチドのN末端アミノ酸の10残基内にある。
本明細書において報告するコンジュゲートおよび方法では、リンカーによる誘導体化後に、相互間にジスルフィド結合を形成するポリペプチド中のシステイン残基（（人為的）ポリペプチドシステイン残基）と抗体のCDR2中のシステイン残基（抗体の人為的システイン残基）との正しい空間的配向が可能になるハプテンであれば、どれでも使用することができる。
一態様において、抗ハプテン抗体はハプテン化ポリペプチドのハプテンに特異的に結合する（抗ハプテン抗体）。
一態様において、CDR2は重鎖CDR2である。
一態様において、ハプテン化ポリペプチドは、ハプテン、リンカー、およびポリペプチドを含む。一態様において、ポリペプチドはさらにペイロードにコンジュゲートされる。
一態様において、ポリペプチドはポリペプチド毒素である。一態様において、ポリペプチド毒素はPE25である。
一態様において、抗体の重鎖CDR2中のシステイン残基は、Kabatの重鎖可変ドメインナンバリングに従う位置52、または位置52a、または位置52b、または位置52c、または位置52d、または位置53にある。
一態様において、抗体の重鎖CDR2中のシステイン残基は、Kabatの重鎖可変ドメインナンバリングに従う位置52a、または位置52b、または位置52c、または位置53にある。
一態様において、抗体の重鎖CDR2中のシステイン残基は、Kabatの重鎖可変ドメインナンバリングに従う位置52bまたは位置53にある。
一態様において、抗体は、非ハプテン抗原に対する第1結合特異性とハプテンに対する第2結合特異性とを含む二重特異性抗体である。
一態様において、非ハプテン抗原は細胞表面抗原である。一態様において、細胞表面抗原は腫瘍関連抗原である。
一態様において、二重特異性抗体は完全長抗体である。一態様において、二重特異性抗体の一本の重鎖はホール（hole）突然変異を含み、それぞれの他方の鎖はノブ（knob）突然変異を含む。
一態様において、二重特異性抗体は、各C末端にscFvまたはscFabが直接的にまたはペプチドリンカーを介して融合されている完全長抗体である。
全ての局面の一態様において、抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。
一態様において、抗体の定常領域はIgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの定常領域である。
一態様において、抗体は、KabatのEUインデックスによるナンバリングに従う位置234および位置235にアラニンを持ち、かつ位置329にグリシンを持つ、IgG1サブクラスの定常領域を有する。
一態様において、抗体は、KabatのEUインデックスによるナンバリングに従う位置228にプロリンを持ち、位置235にグルタミン酸を持ち、位置329にグリシンを持つ、IgG4クラスの定常領域を有する。
一態様において、コンジュゲートは、1つの重鎖CDR2につき厳密に1つのジスルフィド結合を含む。
一態様において、ジスルフィド結合は、酸化還元活性作用物質を添加しなくても形成される。
一態様において、抗原またはハプテンは、リンカーを介してポリペプチドにコンジュゲートされる。一態様において、リンカーは非ペプチドリンカーである。一態様において、リンカーはカルボキシメチルリンカーまたはカプロン酸リンカーである。
一態様において、ハプテンは、ビオチン、またはテオフィリン、またはジゴキシゲニン、またはカルボラン、またはフルオレセイン、またはブロモデオキシウリジンである。一態様において、ハプテンはビオチンまたはジゴキシゲニンである。
本明細書において報告する一局面は、本明細書において報告するコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤である。
医薬として使用するための、本明細書において報告するコンジュゲート。
がんを処置するための、本明細書において報告するコンジュゲート。
ウイルス性疾患を処置するための、本明細書において報告するコンジュゲート。
本明細書において報告する一局面は、医薬の製造における、本明細書において報告するコンジュゲートの使用である。
本明細書において報告する一局面は、ポリペプチドの安定性を増加させるための、本明細書において報告するコンジュゲートの使用である。
本明細書において報告する一局面は、ポリペプチドのオフターゲット毒性効果を低減しまたは排除するための、本明細書において報告するコンジュゲートの使用である。
本明細書において報告する一局面は、ポリペプチドの活性を増加させるための、本明細書において報告するコンジュゲートの使用である。
本明細書において報告する一局面は、ポリペプチドのインビボ半減期を増加させるための、本明細書において報告するコンジュゲートの使用である。
本明細書において報告する一局面は、疾患の処置における、本明細書において報告するコンジュゲートの使用である。
本明細書において報告する一局面は、疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の本明細書において報告するコンジュゲートを個体に投与する工程を含む方法である。
本明細書において報告する一局面は、個体の疾患を処置する方法であって、有効量の本明細書において報告するコンジュゲートを個体に投与する工程を含む方法である。
一態様において、疾患はがんである。
本明細書において報告する一局面は、抗体の人為的システイン残基を含む抗体と（人為的）ポリペプチドシステイン残基を含むハプテン化ポリペプチドとの組み合わせを含む本明細書において報告するコンジュゲートを生産する方法であって、抗体の人為的システイン残基のアルファ炭素原子が、リンカーが融合されているポリペプチド毒素の原子から約10〜11オングストローム離れている方法である。
本明細書において報告する一局面は、本明細書において報告するコンジュゲートを生産する方法であって、以下の工程を含む方法である:
・ハプテンに特異的に結合しかつCDR2中に抗体の人為的システイン残基を有する抗体を、（人為的）ポリペプチドシステイン残基を含むハプテン化ポリペプチドと、溶液中で混和する工程、および
・溶液からコンジュゲートを回収する工程。
本明細書において報告する一局面は、ハプテン化化合物をターゲット細胞に標的送達するための二重特異性抗体であって、ハプテン化ポリペプチドに特異的に結合する第1結合部位と、該細胞の細胞表面マーカーに特異的に結合する第2結合特異性と、を含む二重特異性抗体である。
一態様において、ジスルフィド結合は、ハプテンコンジュゲーションに使用されるポリペプチドのリジン残基の前または後のいずれかにあるシステイン残基と、抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のシステイン残基との間に形成される。
一態様において、システイン残基は、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の1〜3残基前または1〜3残基後にある。この態様では、システイン残基は、リジン残基に対して位置N-3、N-2、N-l、N＋1、N＋2またはN＋3の1つにある。
一態様において、システイン残基は、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の2残基前（すなわちリジン残基に対して位置N-2）または2残基後（すなわちリジン残基に対して位置N＋2）にある。
一態様において、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基は、ポリペプチドのN末端アミノ酸の10残基内にある。
一態様において、ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中に厳密に1つのリジン残基を含む。
[本発明1001]
ハプテン化ポリペプチド毒素と抗ハプテン抗体とを含むコンジュゲートであって、
ポリペプチド毒素がリジン残基でハプテンにコンジュゲートされており、
ハプテン化ポリペプチド毒素が抗ハプテン抗体にジスルフィド結合によってコンジュゲートされており、
ジスルフィド結合が、
i）ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の1残基もしくは2残基前または1残基もしくは2残基後のいずれかにあるハプテン化ポリペプチド毒素のシステイン残基
と、
ii）該抗体のKabatに従って決定される重鎖CDR2中のシステイン残基
との間に形成されている、コンジュゲート。
[本発明1002]
前記抗体のCDR2中のシステイン残基のアルファ炭素原子が、ハプテンがコンジュゲートされているポリペプチドのリジン残基の原子（ハプテンは、ポリペプチドに直接コンジュゲートされているか、リンカーを介してコンジュゲートされている）から約10〜11オングストローム離れている、本発明1001のコンジュゲート。
[本発明1003]
システイン残基がリジン残基の2残基前または2残基後にある、本発明1001〜1002のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1004]
リジン残基がポリペプチド毒素のN末端アミノ酸の10残基内にある、本発明1001〜1003のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1005]
ポリペプチド毒素がそのアミノ酸配列内に厳密に1つのリジン残基を含む、本発明1001〜1004のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1006]
前記抗体の重鎖CDR2中のシステイン残基が、Kabatの重鎖可変ドメインナンバリングに従う位置52bまたは位置53にある、本発明1001〜1005のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1007]
前記抗体が、非ハプテン抗原に対する第1結合特異性とハプテンに対する第2結合特異性とを含む二重特異性抗体である、本発明1001〜1006のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1008]
酸化還元活性作用物質を添加することなくジスルフィド結合が形成される、本発明1001〜1007のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1009]
ハプテンが、ビオチン、またはテオフィリン、またはジゴキシゲニン、またはカルボラン、またはフルオレセイン、またはブロモデオキシウリジンである、本発明1001〜1008のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1010]
本発明1001〜1009のいずれかのコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤。
[本発明1011]
医薬として使用するための、本発明1001〜1009のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1012]
医薬が、がんを処置するための医薬である、本発明1011の使用。
（図１）VH53C突然変異が導入されている組換えヒト化抗ビオチン抗体およびVH53C突然変異が導入されていない組換えヒト化ビオチン抗体の結合の比較。BIAcore T100計器またはBIAcore 3000計器を使用し、表面プラズモン共鳴（SPR）技術によって、結合特性を分析した。a）ヒト化抗ビオチン抗体。ヒト化抗ビオチン抗体へのビオチン化siRNAの結合、KD＝624pM; b）ヒト化Cys53突然変異型抗ビオチン抗体。ビオチン化siRNAの結合、KD＝643pM; siRNA濃度: 0.14、0.41、1.23、3.70、11.1、33.3、および100nM;抗ビオチン抗体濃度: 2nM;センサーチップCM3; 抗ヒトIgG Fc抗体による抗体の結合。
Figure 0006521464
（図２）ハプテンと抗体の適当な位置にSH官能性を導入すると、抗体とハプテンは両者の間に共有結合を形成してコンジュゲートを生じることが可能になる。
（図３）SDS-PAGE自己蛍光バンドパターンの概略図（他にSDS-PAGEゲルの染色はない）:
A:抗体とハプテン-発蛍光団コンジュゲートとの間に共有結合が形成されていない場合は、還元条件下でも非還元条件下でも、遊離ハプテン-発蛍光団コンジュゲートの分子量に、1本の自己蛍光バンドを検出することができる。
B:抗体とハプテン-発蛍光団コンジュゲートとの間に共有結合が形成されている場合、非還元条件下では、抗体とハプテン-発蛍光団コンジュゲートとを合わせた分子量に、1本の自己蛍光バンドを検出することができる。還元条件下では、抗体とハプテン-発蛍光団コンジュゲート（ハプテン化化合物）とのコンジュゲート中のジスルフィド架橋が切断され、遊離ハプテン-発蛍光団コンジュゲートの分子量に、1本の自己蛍光バンドを検出することができる。
（図４）酸化還元活性作用物質、すなわち酸化作用物質（グルタチオンジスルフィド、GSSG）および還元作用物質（ジチオエリスリトール、DTE）の存在下での、ハプテン結合性Cys突然変異型抗体とハプテン-Cys-蛍光ラベルコンジュゲート（ハプテン化化合物）とのコンジュゲート形成:抗体の複合体形成と、それに続く所定の位置における共有結合による連結を、SDS PAGE分析における蛍光シグナルで検出する。非還元SDS-PAGE分析（上側の像）および還元SDS-PAGE分析（下側の像）を実施例11で述べるように行った。共有結合で抗体に連結されたハプテンは、非還元条件下で適当な位置に、サイズが大きいタンパク質結合型シグナルとして検出することができる。これらのシグナルは還元するとタンパク質を離れ、還元条件下では小さな実体として見える。
左:蛍光像
右:クーマシーブルー染色
シリーズ1: 52bC突然変異を持つ抗ジゴキシゲニン抗体
シリーズ2:位置52bに野生型残基を持つ抗ジゴキシゲニン抗体
（A）3mM DTEおよび10mM GSSGによる共有結合的カップリング;
（B）0.3mM DTEおよび1mM GSSGによる共有結合的カップリング;
（C）0.03mM DTEおよび0.1mM GSSGによる共有結合的カップリング。
（図５）酸化作用物質（グルタチオンジスルフィド、GSSG）だけが存在し、還元作用物質が存在しないか、またはどちらも存在しない場合の、ハプテン結合性Cys突然変異型抗体とハプテン-Cys-蛍光ラベルコンジュゲートとの複合体形成:抗体の複合体形成と、それに続く所定の位置における共有結合による連結を、SDS PAGE分析における蛍光シグナルによって検出する。非還元SDS-PAGE分析（上側の像）および還元SDS-PAGE分析（下側の像）を実施例12で述べるように行った。共有結合で抗体に連結されたハプテンは、非還元条件下では適当な位置に大きなサイズのタンパク質に結合したシグナルとして検出することができる。これらのシグナルは還元するとタンパク質を離れ、還元条件下では小さな実体として見える。左:蛍光像。右:クーマシーブルー染色。シリーズ1: 52bC突然変異を持つ抗ジゴキシゲニン抗体。シリーズ2:位置52bに野生型残基を持つ抗ジゴキシゲニン抗体。（A）添加物なし;（B）1mM GSSGによる共有結合的カップリング;（C）0.1mM GSSGによる共有結合的カップリング。
（図６）ビオシチンアミド（biocytinamid）と複合体を形成しているマウス抗ビオチン抗体のX線構造。ビオシチンアミドと相互作用しているアミノ酸残基は、スティックで表示した。
（図７Ａ）共有結合的コンジュゲートおよび非共有結合的複合体を、非複合体化抗原/ハプテンと比較した、インビボ血中PK試験の結果;ビオチン-Cy5非共有結合的複合体、および非複合体化ビオチン-Ser-Cy5（アスタリスク）の、Cy5媒介蛍光の相対的残存蛍光強度（％、黒い記号）;t＝0.08時間の時点における蛍光シグナルを100％に設定した;加えて、マウス血清試料中のヒトIgGの相対的残存濃度を示す（白抜きの記号）;t＝0.08時間におけるIgG血清中濃度（mg/ml）を100％に設定した。
（図７Ｂ）共有結合的コンジュゲートおよび非共有結合的複合体を、非複合体化抗原/ハプテンと比較した、インビボ血中PK試験の結果;共有結合（SS架橋）コンジュゲート、および非複合体化ビオチン-Ser-Cy5（アスタリスク）の、Cy5媒介蛍光の相対的残存蛍光強度（％、黒い記号）;t＝0.08時間の時点における蛍光シグナルを100％に設定した;加えて、マウス血清試料中のヒトIgGの相対的残存濃度を示す（白抜きの記号）;t＝0.08時間におけるIgG血清中濃度（mg/ml）を100％に設定した。
（図８）マウスの血清におけるジゴキシゲニン化PYYポリペプチドの量を決定するウェスタンブロット。
（図９）ハプテン化化合物と抗ハプテン抗体との、アフィニティーによって推進される複合体形成の分析。抗体の複合体形成と、それに続く所定の位置における共有結合による連結を、SDS PAGE分析における蛍光シグナルによって検出する。これは、実施例19で述べるように行った。左:非還元試料（ゲルの左側）および還元試料（ゲルの右側）による蛍光像。右:クーマシーブルー染色。1:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体＋ビオチン-Cys-Cy5；2:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC＋ビオチン-Cys-Cy5；3:ヒト化抗ビオチン抗体＋ビオチン-Cys-Cy5；4:ヒト化抗ビオチン抗体VH53C＋ビオチン-Cys-Cy5。白い矢印は、過剰の（カップリングしていない）ビオチン-Cys-Cy5を示しており、抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCを使用した場合には、それがかなり高い。これは、この場合のコンジュゲーション反応がアフィニティーによって推進されるものではないからである。
（図１０）ハプテン媒介部位特異的共有結合的ペイロードカップリングのために位置52bに追加のシステインを持つDig結合性抗体を形成させるのに必要な、Fab領域内のシステイン位置およびジスルフィドパターン。（A）機能的Fabフラグメントを形成するために必要なVHおよびCH1ドメイン内ならびにVLおよびCLドメイン内でのシステインおよびジスルフィドパターン。（B）ハプテン媒介部位特異的共有結合的ペイロードカップリングのために位置52bに追加のシステインを持つ機能的Fabフラグメントを形成するために必要な、VHおよびCH1ドメイン内ならびにVLおよびCLドメイン内でのシステインおよびジスルフィドパターン。（CおよびD）ミスフォールディングした非機能的抗体をもたらすであろうVH52b変異体のVHドメイン内での不正ジスルフィド結合形成の潜在的可能性。（E）ミスフォールディングした非機能的抗体をもたらすであろうVH52b変異体のFv領域内での潜在的不正ドメイン間ジスルフィド結合の例。
（図１１）ハプテン媒介部位特異的共有結合的ペイロードカップリングのために位置52bに追加システインを持つDig結合性ジスルフィド安定化一本鎖Fvを形成するのに必要なシステイン位置およびジスルフィドパターン。（A）機能的なscFv、dsscFvおよび52b突然変異型dsscFvを形成するために必要なVHドメイン内およびVLドメイン内のシステイン。（B）機能的なscFv、dsscFvおよび52b突然変異型dsscFvを生成するために形成させなければならないジスルフィド結合の正しいパターン。（C）ミスフォールディングした非機能的scFvをもたらすであろう不正ジスルフィド結合形成の潜在的可能性。（D）ミスフォールディングした非機能的dsscFvをもたらすであろう不正ジスルフィド結合形成の潜在的可能性。（E）ミスフォールディングした非機能的52b突然変異型dsscFvをもたらすであろう不正ジスルフィド結合形成の潜在的可能性。
（図１２）共有結合でカップリングされたペイロード用の送達媒体としてのLeY-Dig二重特異性抗体誘導体の組成。
（図１３）共有結合でカップリングされたペイロードの標的送達のための二重特異性抗ハプテン抗体誘導体の発現および精製。
（A）ウェスタンブロット分析のために、細胞培養上清をSDS PAGE（NuPAGE 4-12％Bis-Trisゲル（1.0mm×12ウェル）（Invitrogen;カタログ番号NP0322）に付し、次いでタンパク質をImmobilon Transferメンブレン（Immobilon-P）、すなわちポアサイズ0.45μmのPVDFに転写した。抗体誘導体は、1:1000希釈の、ヤギで生産された抗ヒトカッパ軽鎖）-アルカリホスファターゼ抗体（アフィニティ精製品）Sigma（カタログ番号A3813）、および1:1000希釈の、ヤギで生産された抗ヒトIgG（Fc特異的）-アルカリホスファターゼ抗体（Sigma,カタログ番号A9544）によって検出した。ウェスタンブロットの発色のために基質BCIP/NBT-Blue液体基質（Sigma,カタログ番号B3804）を適用した。レーン1-分子量マーカー;レーン2および3-重鎖が修飾されていない対照抗体;レーン4-H鎖が延長されているLeY-Dig（52bC）二重特異性抗体。
（B）SDS-PAGE分析（NuPAGE 4-12％Bis-Trisゲルと、それに続くクーマシーブリリアントブルーによる染色）により、タンパク質調製物の純度が実証され、それぞれの分子量計算値に対応する見掛けの分子サイズを持つIgGに関係するポリペプチド鎖が可視化される。レーン1-分子量マーカー;レーン2-還元された、H鎖が延長されているLeY-Dig（52bC）二重特異性抗体;レーン3-還元されていない、重鎖が延長されているLeY-Dig（52bC）二重特異的抗体;
（C）サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200）により、プロテインA精製後のLeY-Dig（52bC）二重特異性抗体誘導体のタンパク質調製物における均一性と凝集体の欠如とが実証される。
（図１４）Dig-Cy5非共有結合的複合体および共有結合的（ジスルフィド架橋）コンジュゲート、ならびに非複合体化Dig-Cy5のCy5媒介蛍光の相対的残存蛍光強度（％）;t＝0.08時間の時点における蛍光シグナルを100％に設定した;加えて、マウス血清試料中のヒトIgGの相対的残存量も示す;t＝0.08時間におけるIgG血清中濃度（mg/ml）を100％に設定した。
（図１５）非侵襲的眼イメージングによって決定した、非共有結合的複合体および共有結合的（ジスルフィド架橋）コンジュゲートのビオチン-Cy5ならびに非複合体化ビオチン-Cy5のCy5媒介蛍光のインビボ様条件下での薬物動態;黒い菱形:ビオチン-Cy5;黒い正方形:ビオチン-Cy5＋抗ビオチン抗体（複合体）;三角形: Cy5-ビオチン-抗ビオチン抗体コンジュゲート。
（図１６ａ）テオフィリン-Cys-Cy5の組成、構造および分子量。
（図１６ｂ）サイズ排除クロマトグラフィーにより、精製テオフィリン結合性抗体変異体の純度および均一性が実証される;ピーク番号2は精製された生成物を表す。ピーク番号1が存在しないことは、これらの調製物が凝集体を含まないことを示している。
（図１６ｃ）非還元（左側のレーン）および還元（右側のレーン）SDS PAGEによって実証される、テオフィリン結合性抗体とテオフィリン-Cys-Cy5との間の共有結合的複合体の形成; Cy5は、テオフィリン-Cys-Cy5とCys突然変異型抗体とを含有する試料でのみ、非還元条件下でH鎖にカップリングしているようであり、還元するとこれらの共有結合的コンジュゲートは崩壊する（右側のレーン）;レーン1:分子量マーカー; 2〜4 非還元-2:抗テオフィリン抗体（Cys突然変異なし）＋テオフィリン-Cys-Cy5（複合体）; 3:抗テオフィリン抗体-cys_55＋テオフィリン-Cys-Cy5（コンジュゲート）; 4:抗テオフィリン抗体-cys_54＋テオフィリン-Cys-Cy5（コンジュゲート）; 5〜7 還元-5:抗テオフィリン抗体（Cys突然変異なし）＋テオフィリン-Cys-Cy5（複合体）; 6:抗テオフィリン抗体-cys_55＋テオフィリン-Cys-Cy5（コンジュゲート）; 7:抗テオフィリン抗体-cys_54＋テオフィリン-Cys-Cy5（コンジュゲート）。
（図１７）ビオチン結合性抗体とビオチン-Cys-Cy5との共有結合的複合体の形成を、非還元SDS PAGEおよび還元SDS PAGEによって実証する;カップリング反応はマウス血清中、37℃で1時間行った。Cy5は、ビオチン-Cys-Cy5とCys突然変異型抗体とを含む試料において、非還元条件下でのみ、H鎖にカップリングしているようである。これらの共有結合的コンジュゲートは還元すると崩壊する（右側のレーン）;レーン1:分子量マーカー; 2〜3 非還元-2:抗ビオチン抗体（Cys突然変異なし）＋ビオチン-Cys-Cy5（複合体）; 3:抗ビオチン抗体-Cys＋ビオチン-Cys-Cy5（コンジュゲート）; 4〜5 還元-5:抗ビオチン抗体（Cys突然変異なし）＋ビオチン-Cys-Cy5（複合体）; 6:抗ビオチン抗体-Cys＋ビオチン-Cys-Cy5（コンジュゲート）。
（図１８）非侵襲的眼イメージングによって決定した、非共有結合的複合体および共有結合的（ジスルフィド架橋）コンジュゲートのビオチン-Cy5ならびに非複合体化ビオチン-Cy5のCy5媒介蛍光のインビボ薬物動態;黒い菱形:ビオチン-Cy5;黒い丸: 抗ビオチン抗体投与の24時間後に投与したビオチン-Cy5（インビボ複合体形成）;黒い正方形:抗ビオチン抗体-Cys投与の24時間後に投与したビオチン-Cys-Cy5（インビボコンジュゲート形成）。
（図１９）ビオシチンアミドとの複合体を形成しているマウス抗ビオチン抗体Fabフラグメントのタンパク質構造を決定した:複合体化ハプテンは負に荷電したアミノ酸クラスターに近接して配置されている;ハプテンとして、そのカルボキシル基がペイロードカップリング用に誘導体化されているビオチンは、（COOH基を欠くため）この位置での電荷反発がないので、効率よく結合する;これに対して、遊離の（通常の）ビオチンは、そのカルボキシル基がこの負荷電クラスターに近接し、それゆえに反発を受けることになるので、抗体に効率よく結合することができない。
（図２０Ａ）ポリペプチド毒素を標的送達するための抗ハプテン二重特異性抗体の概略図;ハプテンに結合するジスルフィド安定化scFvを組換え法によって重鎖（CH3ドメインのC末端）に融合する。あるいは、FabフラグメントのC末端に融合するか、組換え結合モジュールの他の位置に融合することもできる。Metz, S., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108（2011）8194-8199に記載されているように、二重特異性抗体をコードする配列を遺伝子合成によって生成し（Geneart, ドイツ）、発現ベクター中にサブクローニングし、生産し、精製した。19-11抗体（Metz et al.および27209 WO）のヒト化dsscFvをジゴキシゲニン結合実体として使用した; VHおよびVLをIgGのFabアームに導入した。また、Fabフォーマット配列はLeY結合性抗体B3（Metz et al参照）から得た。
（図２０Ｂ）二重特異性抗体の発現および精製:二重特異性抗体調製物の純度および均一性を実証するSECプロファイルおよびSDS-PAGE;一過性発現のために、Fab-Fv融合物の軽鎖および重鎖をコードするプラスミドをHEK293細胞に同時トランスフェクトし、無血清培地中で培養し、トランスフェクションの7日後に遠心分離および0.22μm濾過によって上清を清澄化し、二重特異性抗体を、プロテインA（IgG-Fv）と、それに続く20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0で平衡化したSEC（Superdex200 HiLoad 26/60, GE Healthcare）とによって精製し、320nmをバックグラウンドとする280nmでの光学密度によってタンパク質濃度を決定し、SDS-PAGEによって精製タンパク質の均一性を確認した。
（図２１Ａ）シュードモナス外毒素（PE）の誘導体;PEおよびPE変異体のドメイン組成、および部位特異的ジゴキシゲニン化のための新規変異体PE25（NLys-PE25SQΔ）の生成; PE25は、リジン側鎖の1級アミノ基において、Dig-NHSにより、ジゴキシゲニン化される;タンパク質のN末端も、NHS媒介ジゴキシゲニンコンジュゲーションのターゲットになりうる; PE25（NLysPE25SQΔ）では、アミノ酸配列（N末端）
Figure 0006521464
が、PE（pdb 1IKQ_A）のアミノ酸274〜284（ドメインIIプロセシング部位）に融合されており、その後ろにPE（pdb 1IKQ_A）のアミノ酸394〜612（ドメインIII）が続いている;加えて、位置406、432、467、490、513、548、590、592を、LR8M毒素誘導体（Hansen, J.K. et al, J. Immunotherapy 33（2010）297-304）の場合と同様に突然変異させ、位置606のリジンをグルタミンに突然変異させ、PEの最後のアミノ酸（リジン613）を欠失させた;アミノ末端配列は、S-PE25ではLys残基をSerに変えることによって、またNCK-PE25ではGly残基をCysに変えることによって、またNKC-PE25ではMet残基をCysに変えることによって改変した;これらの誘導体のコード配列を遺伝子合成（Geneart, ドイツ）または突然変異誘発法によって生成し、大腸菌（E.coli）における誘導発現用のベクターに挿入した。
（図２１Ｂ）シュードモナス外毒素誘導体の発現および精製:タンパク質はペリプラズムに分泌され、それを、以前に記述された技法を応用して精製した（Debinski, W. and Pastan, I., Cancer Res. 52（1992）5379-5385; Debinski, W. and Pastan, I., Bioconjug. Chem. 5（1994）40-46）;回収した細菌から浸透圧ショック法によって生成したペリプラズム調製物をQ-Sepharoseにロードすることでポリペプチド毒素を捕捉した;ポリペプチド毒素を塩勾配で溶出し、SECに供することで、凝集物とサイズの小さいタンパク質夾雑物が低レベルである単量体型ポリペプチド毒素を得た; SECを行い、毒素画分をPBS中に保存した。精製タンパク質の均一性はSECおよびSDS-PAGEによって確認した。
（図２１Ｃ）PE25、S-PE25、NKC-PE25およびNCK PE25のN末端配列: N末端メチオニンはATG開始コドンによってコードされており、大腸菌では翻訳後プロセシングによって除去されうるので、括弧内に示している。ハプテンにカップリングされることによるリジン残基を強調し（太字）、そのリジンの前または後にある追加システインを下線付き太字で示す。
（図２２Ａ）抗体と毒素との複合体化および共有結合的連結:NKC-PE25を含む共有結合的複合体の還元試料および非還元試料をSDS-PAGE（NuPAGE 4-12％Bis-Trisゲル（1.0mm×10ウェル）によって分離し、クーマシーブルー染色で可視化するか、Immobilon PVDF転写メンブレン（Immobilon-P）、ポアサイズ:0.45μmへのウェスタンブロットに付した（中央と右側のパネル）。ポリクローナル抗PE抗体によるウェスタンブロット分析（抗シュードモナス外毒素A、ウサギで生産された抗体（Sigma,カタログ番号P2318）、1:1000希釈、次に、抗ウサギIgG（全分子）-アルカリホスファターゼコンジュゲート、ヤギで生産された抗体（Sigma,カタログ番号A3687）、1:1000希釈）を中央のパネルに示す。マウスモノクローナル抗ジゴキシゲニン抗体MAK<DIG>M-19-11 IgG（マウスで生産された抗体, Roche）と、それに続く抗マウスIgG（Fc領域特異的）-アルカリホスファターゼコンジュゲート、ヤギで生産された抗体（Sigma,カタログ番号A7434）、1:1000希釈）によるウェスタンブロット分析を、右側のパネルに示す。どちらのブロットも基質BCIP/NBT-Blue液体基質で発色させた。
（図２２Ｂ）抗ジゴキシゲニン抗体とジゴキシゲニン化ポリペプチド毒素との複合体化および共有結合的連結:ジゴキシゲニン-スペーサー::抗ジゴキシゲニン抗体構造の構造モデル（PDB_3RA7,1）を、PE25（PDB_1K2Nおよび1IKQ、リンカーの第2部分は1ikqから採用する）と連結することにより、ジゴキシゲニン結合性Fvとの複合体を形成したジゴキシゲニン化PE25（Dig-PE25）の構成要素のモデルを作成した;アミノカプロン酸スペーサーを介してPE25の唯一のリジンに取り付けられた適当なサイズのジゴキシゲニンが、両構造をつないでいる;抗ジゴキシゲニン抗体のVH中の追加システインとNKC-PE25またはNCK PE25中のシステインとの間の共有結合的連結の考えうる立体配置を示す構造モデルも示す。
（図２２Ｃ）図２２の続きである。
（図２３）二重特異性抗体媒介標的毒素送達:腫瘍細胞に対する毒性効果を分析するために細胞増殖（BrdU）アッセイを行った;LeYを発現するMCF-7細胞を毒素単独（上側のパネル）またはIgG-Fvフォーマットの媒体-毒素複合体（下側のパネル）に48時間曝露した。
（図２４）細胞ターゲティング二重特異性抗体は、ターゲット細胞内で、ハプテン位置決めジスルフィド接続ペイロードを放出する。共焦点顕微鏡法により、MCF-7細胞への、そしてMCF-7細胞内への、ジスルフィドコンジュゲートビオチン-Cys-Cy5-ペイロードのbsAb標的送達が明らかになる。bsAbはAlexa標識huFc結合性抗体によって検出され、Bio-Cys-Cy5ペイロードはその蛍光によって検出される。bsAbとペイロードの共局在は混色によって示され（3）、孤立したbsAbは色1で現れ（1）、抗体を伴わないビオチンは色2で現れる（2）。画像（LeY発現MCF7細胞へのLeY-bsAb適用の6時間後）から、複合体からのビオチンの分離は、二次抗体による検出にとってbsAb媒体がまだ十分に無傷である時点で起こっていることがわかる。
発明の詳細な説明
I.定義
本明細書に関して「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義するヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（VL）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（VH）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含んでもよいし、アミノ酸配列変化を含んでいてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。いくつかの態様では、VLアクセプターヒトフレームワークの配列は、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはVLヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
「アミノ酸」という用語は、天然の、すなわち核酸によって直接的にまたは前駆体の形でコードされうる、カルボキシα-アミノ酸、または非天然のカルボキシα-アミノ酸の群を表す。個々の天然アミノ酸は、3つのヌクレオチドからなる核酸、いわゆるコドンまたは塩基トリプレットによってコードされる。各アミノ酸は少なくとも1つのコドンによってコードされる。このことは「遺伝暗号の縮重」として公知である。本願内で使用する用語「アミノ酸」は、アラニン（三文字記号:ala、一文字記号:A）、アルギニン（Arg、R）、アスパラギン（Asn、N）、アスパラギン酸（Asp、D）、システイン（Cys、C）、グルタミン（Gln、Q）、グルタミン酸（Glu、E）、グリシン（Gly、G）、ヒスチジン（His、H）、イソロイシン（Ile、I）、ロイシン（Leu、L）、リジン（Lys、K）、メチオニン（Met、M）、フェニルアラニン（Phe、F）、プロリン（Pro、P）、セリン（Ser、S）、スレオニン（Thr、T）、トリプトファン（Trp、W）、チロシン（Tyr、Y）、およびバリン（Val、V）を含む、天然のカルボキシα-アミノ酸を表す。非天然アミノ酸の例には、Aad（アルファ-アミノアジピン酸）、Abu（アミノ酪酸）、Ach（アルファ-アミノシクロヘキサン-カルボン酸）、Acp（アルファ-アミノシクロペンタン-カルボン酸）、Acpc（1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸）、Aib（アルファ-アミノイソ酪酸）、Aic（2-アミノインダン-2-カルボン酸; 2-2-Aicともいう）、1-1-Aic（1-アミノインダン-1-カルボン酸）,（2-アミノインダン-2-カルボン酸）、アリルグリシン（AllylGly）、アロイソロイシン（allo-Ile）、Asu（アルファ-アミノスベリン酸、2-アミノオクタン二酸）、Bip（4-フェニル-フェニルアラニン-カルボン酸）、BnHP（（2S,4R）-4-ヒドロキシプロリン）、Cha（ベータ-シクロヘキシルアラニン）、Cit（シトルリン）、シクロヘキシルグリシン（Chg）、シクロペンチルアラニン、ベータ-シクロプロピルアラニン、Dab（1,4-ジアミノ酪酸）、Dap（1,3-ジアミノプロピオン酸）、p（3,3-ジフェニルアラニン-カルボン酸）、3,3-ジフェニルアラニン、ジ-n-プロピルグリシン（Dpg）、2-フリルアラニン、ホモシクロヘキシルアラニン（HoCha）、ホモシトルリン（HoCit）、ホモシクロロイシン、ホモロイシン（HoLeu）、ホモアルギニン（HoArg）、ホモセリン（HoSer）、ヒドロキシプロリン、Lys（Ac）、（1）Nal（1-ナフチルアラニン）、（2）Nal（2-ナフチルアラニン）、4-MeO-Apc（1-アミノ-4-（4-メトキシフェニル）-シクロヘキサン-1-カルボン酸）、ノル-ロイシン（Nle）、Nva（ノルバリン）、オマチン（Omathine）、3-Pal（アルファ-アミノ-3-ピリジルアラニン-カルボン酸）、4-Pal（アルファ-アミノ-4-ピリジルアラニン-カルボン酸）、3,4,5,F3-Phe（3,4,5-トリフルオロ-フェニルアラニン）、2,3,4,5,6,F5-Phe（2,3,4,5,6-ペンタフルオロ-フェニルアラニン）、Pqa（4-オキソ-6-（1-ピペラジニル）-3（4H）-キナゾリン-酢酸（CAS 889958-08-1））、ピリジルアラニン、キノリルアラニン、サルコシン（Sar）、チアゾリルアラニン、チエニルアラニン、Tic（アルファ-アミノ-1,2,3,4,テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸）、Tic（OH）、Tle（tertブチルグリシン）、およびTyr（Me）があるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において「抗体」という用語は、最も広義に使用され、例えば限定するわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントなどといったさまざまな抗体構造を、それらが望ましい抗原結合活性を呈する限り、包含する。
「抗体フラグメント」という用語は、インタクト抗体以外の分子であって、インタクト抗体のうち、インタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む分子を表す。抗原フラグメントの例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2;ダイアボディ;線状抗体;一本鎖抗体分子（例えばscFv）;および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体があるが、それらに限定されるわけではない。
「ビオチン」、略して「BI」という用語は、5-［（3aS,4S,6aR）-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ［3,4-d］イミダゾール-4-イル］ペンタン酸を表す。ビオチンはビタミンHまたは補酵素Rとしても公知である。
「二重特異性抗体」という用語は、2つの異なる（抗原/ハプテン）結合特異性を有する抗体を表す。一態様では、本明細書において報告する二重特異性抗体は、2つの異なる抗原、すなわちハプテンおよび非ハプテン抗原である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来すると共に、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」とは、その重鎖が持っている定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要クラス、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかはさらに、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2などのサブクラス（アイソタイプ）に分割することができる。異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれている。
本明細書において使用する「ポリペプチド毒素」という用語は、細胞機能を阻害または防止し、かつ/または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。ポリペプチド毒素として、酵素およびそのフラグメント、例えば核酸分解酵素;毒素、例えば細菌、真菌、植物、または動物由来の、酵素活性毒素、ならびにそれらのフラグメントおよび/または変異体;細胞毒素（例えばシュードモナス外毒素、リシン、アブリン、ジフテリア（Diphtheria）毒素など）、酵素、成長因子、転写因子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
「ジゴキシゲニン」、略して「DIG」という用語は、3-［（3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R）-3,12,14-トリヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-テトラデカヒドロ-シクロペンタ［a］-フェナンスレン-17-イル］-2H-フラン-5-オン（CAS番号1672-46-4）を表す。ジゴキシゲニン（DIG）は、もっぱら植物ジギタリス・プルプレア（Digitalis purpurea）、ジギタリス・オリエンタリス（Digitalis orientalis）およびジギタリス・ラナタ（Digitalis lanata）（キツネノテブクロ）の花および葉に見いだされるステロイドである（Polya, G., Biochemical targets of plant bioactive compounds, CRC Press,ニューヨーク（2003）p.847）。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のFc領域に起因しうる生物学的活性を表し、抗体クラスによってさまざまである。抗体エフェクター機能の例として、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）; Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）;貪食;細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーション;およびB細胞活性化が挙げられる。
ある薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」という用語は、所望の治療結果または予防結果を達成するのに有効な量、投薬量、および必要な期間を表す。
抗体をパパイン消化すると、「Fab」フラグメントと呼ばれる2つの同一抗原結合性フラグメント（それぞれが単一の抗原結合部位を持つ）と、残りの「Fc」フラグメント（この名称はそれが容易に結晶化しうることを反映している）とが生成する。ペプシン処理では、2つの抗原結合性部位を有し、抗原を架橋する能力が残っている、F（ab'）2フラグメントが得られる。
Fabフラグメントは軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1定常ドメイン（CH1）も含有する。Fab'フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の1つまたは複数のシステインを含む数残基が重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に付加されている点でFabフラグメントとは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも1つの遊離チオール基を保持しているFab'の本明細書における名称である。F（ab'）2抗体フラグメントは、元々は、Fab'フラグメント間にヒンジシステインを有するFab'フラグメントの対として生産されたものである。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。
「Fv」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。この領域は、非共有結合で堅く会合した1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの3つの超可変領域が相互作用して、VH-VL二量体の表面に抗原結合部位を画定するのは、この構成でのことである。全体として、6つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与している。しかし、単一の可変ドメイン（すなわち、抗原に特異的な3つの超可変領域しか含まないFvの半分）でも、アフィニティーは結合部位全体より低いものの、抗原を認識し抗原に結合する能力は有している。
本明細書において「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を画定するために使用される。この用語は、ネイティブ配列Fc領域および変異体Fc領域を包含する。一態様では、ヒトIgG重鎖Fc領域が、Cys226またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで伸びている。ただし、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書において別段の指定がある場合を除き、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A. et al「Sequences of Proteins of Immunological Interest」第5版、Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）, NIH Publication 91-3242に記載のEUナンバリグシステム（EUインデックスともいう）に従う。
「フルオレセイン」、略して「FLUO」という用語は、6-ヒドロキシ-9-（2-カルボキシフェニル）-（3H）-キサンテン-3-オン、あるいは2-（6-ヒドロキシ-3-オキソ-（3H）-キサンテン-9-イル）安息香酸を表す。フルオレセインは、別名をレゾルシノールフタレイン、C.I.45350、ソルベントイエロー（solvent yellow）94、D&Cイエローno.7、アンギオフルオル（angiofluor）、ジャパンイエロー（Japan yellow）201、またはソープイエロー（soap yellow）ともいう。
「フレームワーク」、略して「FR」という用語は、超可変領域（HVR）残基以外の重鎖および軽鎖可変ドメインアミノ酸残基を表す。可変ドメインのFRは一般に、FR1、FR2、FR3、およびFR4という、4つのFRドメインからなる。したがって、VH（またはVL）にはHVR配列とFR配列が一般に以下の配列で現れる: FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
「人為的システイン残基」という用語は、親抗体またはポリペプチド毒素に工学的に導入されたシステインアミノ酸残基であって、チオール官能基（SH）を有し、分子内ジスルフィド架橋において対を形成していないものを表す。しかしそれにもかかわらず、遊離システインアミノ酸は、例えばグルタチオンなどと、分子間ジスルフィド架橋として対を形成することができる。
「完全長抗体」という用語は、ネイティブ抗体と実質的に類似する構造を有する抗体、または本明細書において定義するFc領域を含有する重鎖を有する抗体を表す。ネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合した2本の同一軽鎖と2本の同一重鎖とで構成される、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端に向かって、可変領域（VH）（可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインともいう）と、それに続く3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）とを有する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端に向かって、可変領域（VL）（可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインともいう）と、それに続く軽鎖定常（CL）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2タイプのうちの一方に割り当てることができる。
「完全長抗体」は、VLドメインとVHドメインならびに軽鎖定常（CL）ドメインおよび重鎖定常ドメインCH1、CH2およびCH3を含む抗体である。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えばヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であることができる。完全長抗体は、1種または複数種の「エフェクター機能」（この用語は、抗体のFc定常領域（ネイティブ配列Fc領域またはアミノ酸配列変異体Fc領域）に起因しうる生物学的活性を指す）を有しうる。抗体エフェクター機能の例としては、C1q結合;補体依存性細胞傷害;Fc受容体結合;抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）;貪食;およびB細胞受容体やBCRなどの細胞表面受容体のダウンレギュレーションが挙げられる。
「ハプテン」という用語は、タンパク質などの大きな担体に取り付けられた場合にのみ免疫応答を引き出すことができる小分子を表す。例示的なハプテンは、アニリン、o-、m-、およびp-アミノ安息香酸、キノン、ヒスタミン-スクシニル-グリシン（HSG）、ヒドララジン、ハロタン、インジウム-DTPA、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、テオフィリン、およびジニトロフェノール、およびブロモデオキシウリジンである。一態様では、ハプテンがビオチンまたはジゴキシゲニンまたはテオフィリンまたはカルボランまたはブロモデオキシウリジンである。
「ハプテン化ポリペプチド毒素」という用語は、ポリペプチド毒素に共有結合で連結されたハプテンからなる分子を表す。活性化ハプテン誘導体は、そのようなコンジュゲートを形成させるための出発材料としてよく使用される。
一態様において、ハプテンはジゴキシゲニンであり、リンカーを介してポリペプチド毒素に（一態様ではその3-ヒドロキシ基を介して）コンジュゲートされる。一態様において、リンカーは、a）1つまたは複数（一態様では3〜6個）のメチレン-カルボキシ-メチル基（-CH2-C（O）-）、および/またはb）1〜10個（一態様では1〜5個）のアミノ酸残基（一態様では、グリシン、セリン、グルタミン酸、β-アラニン、γ-アミノ酪酸、ε-アミノカプロン酸またはリジンから選択されるもの）、および/またはc）構造式NH2-［（CH2）nO］xCH2-CH2-COOH（式中、nは2または3であり、xは1〜10、一態様では1〜7である）を有する1つまたは複数（一態様では1つまたは2つ）の化合物を含む。最後の要素は（少なくとも部分的には）、式-NH-［（CH2）nO］xCH2-CH2-C（O）-のリンカー（部分）をもたらす。そのような化合物の一例は、例えば12-アミノ-4,7,10-トリオキサドデカン酸である（これはTEG（トリエチレングリコール）リンカーをもたらす）。このリンカーは、電荷を含有し、または/かつ水素橋を形成することができるので、安定化効果および可溶化効果を有する。加えて、ハプテンコンジュゲートポリペプチド毒素への抗ハプテン抗体の結合を立体的に容易にすることができる。一態様において、リンカーは、ポリペプチド毒素のアミノ酸の側鎖にある（例えばリジン側鎖にアミノ基を介してコンジュゲートされる）。一態様において、リンカーは、ポリペプチド毒素のアミノ末端またはカルボキシ末端にある。ポリペプチド上のリンカーの位置は、典型的には、ポリペプチドの生物学的活性が影響を受けない領域に選ばれる。それゆえに、リンカーの正確な取り付け位置は、ポリペプチド毒素および生物学的活性を担う関連構造要素に依存する。ハプテンを取り付けたポリペプチド毒素の生物学的活性は、インビトロアッセイで試験することができる。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」という用語は可換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらは初代形質転換細胞およびそこから派生した子孫を含み、継代数は考慮しない。子孫は核酸含有物について親細胞と完全には同一でなくてもよく、突然変異を含みうる。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択の目的にしたものと同じ機能または同じ生物学的活性を有する突然変異型子孫は、ここに包含される。
「ヒト抗体」とは、ヒトまたはヒト細胞が生産する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来するアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を持つものである。ヒト抗体のこの定義では、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体は特に除外される。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基とヒトFR由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。一定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つの可変ドメイン、典型的には2つの可変ドメインの実質上すべてを含み、その可変ドメインでは、HVR（例えばCDR）のすべてまたは実質上すべてが非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべてまたは実質上すべてがヒト抗体のモノに対応するであろう。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば非ヒト抗体）の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書において使用する「超可変領域」または「HVR」という用語は、抗体可変ドメインのうち、配列が超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」）、かつ/または構造上明確なループ（「超可変ループ）を形成し、かつ/または抗原接触残基（「抗原接触部（antigen contact）」を含有する領域のそれぞれを指す。一般に抗体は、6つのHVRを含み、そのうちの3つはVH中にあり（H1、H2、H3）、3つはVL中にある（L1、L2、L3）。
本明細書においてHVRは、
（a）アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196（1987）901-917）;
（b）アミノ酸残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、89〜97（L3）、31〜35b（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）に存在するCDR（Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）, NIH Publication 91-3242）;
（c）アミノ酸残基27c〜36（L1）、46〜55（L2）、89〜96（L3）、30〜35b（H1）、47〜58（H2）、および93〜101（H3）に存在する抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745（1996））;および
（d）HVRアミノ酸残基46〜56（L2）、47〜56（L2）、48〜56（L2）、49〜56（L2）、26〜35（H1）、26〜35b（H1）、49〜65（H2）、93〜102（H3）、および94〜102（H3）を含む（a）、（b）、および/または（c）の組み合わせ
を包含する。
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えばヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、および齧歯類（例えばマウスおよびラット）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一定の態様では、個体または対象がヒトである。
「単離された」抗体とは、その自然環境の一構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体が、例えば電気泳動法（例:SDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー法（例:イオン交換または逆相HPLC）による決定で、純度95％超または99％超まで精製される。抗体の純度を評価するための方法を概観するには、例えばFlatman, S. et al, J. Chrom. B 848（2007）79-87を参照されたい。
「単離された」核酸とは、その自然環境の一構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、当該核酸分子を通常含有する細胞に含まれている核酸分子であるが、当該核酸分子が染色体外に存在するか、またはその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が含まれる。
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、例えば天然の突然変異を含有する変異型抗体、またはモノクローナル抗体の生産時に生じる変異型抗体（そのような変異体の存在量は一般に少量である）などといった考えうる変異体抗体を除けば、前記集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基を指向する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示しており、何か特定の方法による抗体の生産を必要とするとみなしてはならない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定するわけではないがハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法などといったさまざまな技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的方法を、本明細書において説明する。
「単一特異性抗体」という用語は、1つ以上の結合部位を有し、そのそれぞれが同じ結合特異性を有する、すなわち同じ抗原またはハプテンに結合する、抗体を表す。
「裸の抗体」とは、異種部分（例えば細胞傷害性部分）または放射性ラベルにコンジュゲートされていない抗体を指す。裸の抗体は薬学的製剤中に存在しうる。
「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通例含まれていて、適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌および/または当該治療製品の使用上の注意に関する情報が記載されている説明書を指すために使用される。
「親抗体」とは、1つまたは複数のアミノ酸残基を1つまたは複数のシステイン残基で置き換える際の元となるアミノ酸配列を含む抗体である。親抗体はネイティブ配列または野生型配列を含みうる。親抗体は、他のネイティブ型、野生型、または修飾型の抗体との比較で、既存のアミノ酸配列修飾（付加、欠失および/または置換など）を有しうる。親抗体はハプテンに特異的に結合する。親抗体は、加えて、関心対象のターゲット抗原、例えば生物学的に重要なポリペプチドを指向してもよい。非ポリペプチド抗原を指向する抗体も考えられる。
「fMLP」という用語は、N-ホルミルメチオニン、ロイシンおよびフェニルアラニンからなるトリペプチドを表す。一態様では、エフェクター部分がfMLPまたはその誘導体である。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性パーセントが最大になるように配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後に、保存的置換を配列同一性の一部とみなさずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲に含まれるさまざまな方法で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使って、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要になるあらゆるアルゴリズムを含めて、配列をアラインメントするための適当なパラメータを決定することができる。ただし、本明細書における目的には、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使って、アミノ酸配列同一性パーセント（％）値を生成させる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech, Inc.によって作成されたものであり、米国著作権局（ワシントンD.C., 20559）に利用者向け文書と共に登録申請され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc.（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手するか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN-2プログラムは、digital UNIX V4.0DなどのUNIXオペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルすべきである。配列比較パラメータはいずれもALIGN-2プログラムによって設定され、変動することはない。
アミノ酸配列比較にALIGN-2を使用する場合、所与のアミノ酸配列Bに対する、または所与のアミノ酸配列Bとの、または所与のアミノ酸配列Bと対比した、所与のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性％（これは、所与のアミノ酸配列Bに対して、または所与のアミノ酸配列Bと、または所与のアミノ酸配列Bと対比して、一定のパーセントアミノ酸配列同一性を有する、または含む、所与のアミノ酸配列Aと、言い換えることもできる）は、次のように計算される。
分率X/Y×100
ここで、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2が、そのプログラムによるAとBとのアラインメントにおいて、完全一致（identical match）と記録したアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合に、Bに対するAのアミノ酸配列同一性パーセント（％）が、Aに対するBのアミノ酸配列同一性パーセント（％）と一致しないことは、理解されるであろう。別段の具体的言明がある場合を除き、本明細書において使用するアミノ酸配列同一性パーセント（％）値はすべて、すぐ上の段落で説明したように、ALIGN-2コンピュータプログラムを使って得られる。
「薬学的製剤」という用語は、そこに含まれる活性成分の生物学的活性が有効でありうるような形態にあり、かつその製剤の投与を受ける対象にとって許容できないほど毒性である追加構成要素を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」とは、活性成分以外の薬学的製剤の成分を指し、これは対照にとって無毒性である。薬学的に許容される担体として、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合で接続されたアミノ酸からなるポリマーであり、天然に生産されたか、合成的に生産されたかを問わない。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」ということができ、一方、2つ以上のポリペプチドからなる分子または100アミノ酸残基超の1つのポリペプチドを含む分子は「タンパク質」ということができる。ポリペプチドは、糖質基、金属イオン、またはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸構成要素も含みうる。非アミノ酸構成要素は、当該ポリペプチドを発現する細胞によって付加される場合があり、細胞のタイプによって異なりうる。本明細書では、ポリペプチドを、そのアミノ酸主鎖構造またはそれをコードする核酸によって定義する。糖質基などの付加物は一般的には明示しないが、それでも存在しうる。本発明で用いる場合のポリペプチドは、少なくとも3つのアミノ酸残基を含む。1つのアミノ酸残基は、抗ハプテン抗体とジスルフィド結合を形成するためのシステイン残基であり、1つのアミノ酸残基は、ハプテンとコンジュゲートするためのリジン残基である。当該ポリペプチドの第3のアミノ酸残基は、ハプテン化ポリペプチドにおいて、次のいずれかである：(i)ペイロードとのコンジュゲーションのための単一のアミノ酸残基；または(ii)ポリペプチド。ポリペプチド自身が、（例えば、ポリペプチド毒素のもののような）生物学的活性を有する、より大きいポリペプチドの一部であることもまた企図される。
ポリペプチド配列はすべて、一般に許容されている慣例に従い、アルファ-N末端アミノ酸残基を左側に置き、かつアルファ-C末端アミノ酸残基を右側に置いて記述される。本明細書において使用する用語「N末端」とは、ポリペプチド中のアミノ酸の遊離のアルファ-アミノ基を指し、用語「C末端」はポリペプチド中のアミノ酸の遊離のa-カルボン酸末端を指す。ある基をN末端に持つポリペプチドとは、ある基をN末端アミノ酸残基のアルファ-アミノ窒素上に保持するポリペプチドを指す。ある基をN末端に持つアミノ酸とは、ある基をアルファ-アミノ窒素上に保持するアミノ酸を指す。
別途、接頭語「D」によって（例えばD-AlaまたはN-Me-D-Ile）または小文字で記載することによって（例えばa、i、l（D型のAla、Ile、Leu））表示を行う場合を除き、本明細書および本願特許請求の範囲に記載するポリペプチド中のアミノ酸およびアミノアシル残基のアルファ炭素の立体化学は、天然の立体配置、すなわち「L」立体配置である。ポリペプチドのN末端にある一定のアシル置換基中のキラル中心の立体化学を指定するには、カーン-インゴールド-プレローグの「R」および「S」表記を使用する。「R,S」という表記は、2つのエナンチオマー型のラセミ混合物を示すものとする。この命名法は、Cahn, R.S., et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 5（1966）385-415に記載の命名法に従う。
「一本鎖Fv」、略して「scFv」という用語は、抗体のVHドメインとVLドメインとを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在する抗体フラグメントを表す。一態様において、このFvポリペプチドは、さらに、VHドメインとVLドメインとの間に、そのscFvが抗原結合のために望ましい構造を形成することができるようにするポリペプチドリンカーを含む。scFvを概観するには、Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, RosenburおよびMoore編, Springer-Verlag,ニューヨーク, pp. 269-315（1994）を参照されたい。
「テオフィリン」、略して「THEO」という用語は、1,3-ジメチル-7H-プリン-2,6-ジオンを表す。テオフィリンは別名ジメチルキサンチンという。
「処置」という用語（およびその文法上の変形、例えば「処置する」または「処置すること」）は、処置される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を表し、予防のために行うか、または臨床病理の過程において行うことができる。処置の望ましい効果としては、疾患の発生または再発を防止すること、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な何らかの病理学的帰結の減縮、転移を防止すること、疾患の進行速度を減少させること、疾患状態の改善または一時的緩和、および寛解または予後の改善が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、疾患の発達を遅延させるか、疾患の進行を遅らせるために、本発明の抗体を使用する。
「x価」、例えば「一価」または「二価」または「三価」または「四価」という用語は、1抗体分子中に指定した数（すなわち「x」個）の結合部位が存在することを表す。したがって「二価」、「四価」および「六価」という用語は、1抗体分子中に、それぞれ2つの結合部位、4つの結合部位、および6つの結合部位が存在することを表す。本明細書において報告する二重特異性抗体は少なくとも「二価」であり、「三価」または「多価」（例えば「四価」または「六価」）であってもよい。一態様では、本明細書において報告する二重特異性抗体は、二価、三価、または四価である。一態様では、二重特異性抗体は、二価である。一態様では、二重特異性抗体は、三価である。一態様では、二重特異性抗体は、四価である。
一定の局面および態様では、本明細書において報告する抗体は、2つ以上の結合部位を有し、かつ二重特異性である。すなわち、結合部位が2つより多い場合（すなわち抗体が三価または多価である場合）でも、抗体は二重特異性でありうる。二重特異性抗体という用語には、例えば、多価一本鎖抗体、ダイアボディ、およびトリアボディ、ならびに完全長抗体の定常ドメイン構造を有し、そこにさらなる抗原結合部位（例えば一本鎖Fv、VHドメインおよび/またはVLドメイン、Fab、または（Fab）2）が1つまたは複数のペプチドリンカーを介して連結されている抗体が包含される。抗体は単一の種に由来する完全長であってもよいし、キメラ化またはヒト化されていてもよい。抗原結合部位が2つより多い抗体の場合、そのタンパク質が2つの異なる抗原に対する結合部位を有する限り、一部の結合部位は同一であってもよい。すなわち、第1結合部位はハプテンに対して特異的であり、かつ第2結合部位は非ハプテン抗原に特異的であるか、またはその逆である。
「可変領域」という用語は、抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインであって、当該抗体のその抗原への結合に関与するドメインを表す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似する構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つの超可変領域（HVR）とを含んでいる（例えばKindt, T.J. et al. Kuby Immunology,第6版, W.H. Freeman and Co.,ニューヨーク（2007）の91頁を参照されたい）。抗原結合特異性を付与するにはVHドメインかVLドメインが1つあれば十分である。さらにまた、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体のVHドメインまたはVLドメインを使って、それぞれ相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることによって単離することもできる。例えばPortolano, S. et al, J. Immunol. 150（1993）880-887; Clackson, T. et al, Nature 352（1991）624-628）を参照されたい。
「ベクター」という用語は、そこに連結された別の核酸を伝播させる能力を有する核酸分子を表す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクターと、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターとが包含される。一定のベクターは、それが機能的に連結された核酸の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」という。
II.本明細書に報告するコンジュゲート
シュードモナス外毒素A鎖（PE）は、613個のアミノ酸残基からなる66kDaポリペプチドである。これは以下の3つの機能的ドメインで構成されている:真核細胞に結合するドメインI（N末端受容体結合ドメイン）、内部移行を担っていてタンパク質分解的にプロセシングされたIIになるドメインII、およびC末端にあってプロセシング後に細胞質に放出されるドメインIII。ドメインIIIはeEF2をADPリボシル化し、それがタンパク質合成の阻害とそれに続く細胞死を引き起こす。
PEのさまざまな切断型変異体の組成を図21Aに示す。切断型変異体NLysPE38では、細胞結合ドメインIおよびドメインIBが欠失している。この分子は、単独では、細胞傷害能が非常に低い。NLysPE38はそのN末端近くにリジン残基（Nlys）を含み、これを、NHSケミストリーで化学修飾することができる。ジスルフィド安定化Fv融合物（dsscFv融合物）に関して、プロセシング部位が保たれている限り、ドメインIIの大部分も、効力を失うことなく欠失させうることが、最近示された。そのような融合タンパク質内での切断型毒素変異体のサイズは約25kDaであった。切断型毒素変異体はドメインIII中にまだリジン残基を含有している。切断型毒素変異体NlysPE40QQRでは、例えば切断型毒素変異体を化学的にコンジュゲートする場合に、NHSなどのアミン修飾試薬によってドメインIIIが不活化されるリスクを低減するために、ドメインIIIのリジンがグルタミンおよび/またはアルギニンに置き換えられた。本明細書では、ドメインIおよびIBと共にドメインIIの大部分を欠失させ（CD22-LR8Mの毒素部分）、かつドメインIII中のリジンがセリンまたはグルタミンに交換されている、新規切断型PE変異体NLysPE25SQΔを報告する。加えて、この変異体は、C末端リジンも欠失しており、アミノ末端N-Lys伸長部を持っている。NLysPE25SQΔは、唯一のリジンをそのN末端に持つかなり小さな毒素部分である。このリジンの1級アミン（およびN末端の1級アミン）は、毒素の他の位置に影響を及ぼすことなくNHS試薬で修飾することができる。
二重特異性抗体へのハプテン媒介共有結合的カップリング用に追加のシステインを含有する毒素誘導体を生成させるために、NLysPE25SQΔ中、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の前または後のどちらかに、システインを入れた。
一局面において、本発明は、ハプテン化ポリペプチドとハプテンに特異的に結合する抗ハプテン抗体とを含む共有結合的コンジュゲートを、ポリペプチド中に適正に置かれたシステイン残基と、抗体の可変ドメイン中のシステイン残基、特に該抗体のKabatの重鎖可変ドメインナンバリングに従って決定されるCDR2中のシステイン残基、との間でのジスルフィド形成によって得ることができるという発見に基づいている。
一定の態様において、抗原はハプテンである。一態様において、ハプテンは、ビオチン、またはジゴキシゲニン、またはフルオレセイン、またはテオフィリン、またはカルボランである。
一態様において、ハプテン化ポリペプチドは、ハプテン、リンカー、およびポリペプチド毒素を含むコンジュゲートである。一態様において、ハプテンは、ビオチン、またはジゴキシゲニン、またはフルオレセイン、またはテオフィリン、またはカルボラン、またはブロモデオキシウリジンである。一態様において、ポリペプチドはポリペプチド毒素である。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体との共有結合的コンジュゲートは、良好な生物物理学的挙動および改良されたPK特性をポリペプチドに付与しうる。さらにまた、二重特異性抗体を使用する場合は、本コンジュゲートを使って、その二重特異性抗体の第2結合特異性によって認識される抗原を提示する細胞に、ポリペプチドをターゲティングすることができる。そのようなコンジュゲートは1つの抗ハプテン結合特異性と1つの（非ハプテン）抗原結合特異性とで構成される。抗体分子のハプテン化ポリペプチド分子に対する化学量論比は二重特異性抗体のフォーマットに依存し、1:1、1:2、2:1、2:2、2:4および4:2（抗体:ハプテン化ポリペプチド）であることができる。
ポリペプチドは、ハプテンにコンジュゲートされており、さらに抗ハプテン抗体にもコンジュゲートされているにもかかわらず、良好な生物学的活性を保っていることが望ましい。また（二重特異性ターゲティングモジュールの場合は）二重特異性抗体の細胞表面ターゲット結合部位が、共有結合でコンジュゲートされたハプテン化ポリペプチドの存在下で、その結合特異性およびアフィニティを保っていることが望ましい。
抗ハプテン抗体とハプテン化ポリペプチドとの共有結合的コンジュゲートを形成するには、反応性基の導入によって両化合物を修飾する必要がある。抗ハプテン抗体がハプテンに結合すると、それら2つの反応性基は近接して、共有結合の形成が可能になる。一態様において、修飾は、化合物のそれぞれにおけるチオール官能基の導入である。一態様において、チオール化合物はシステイン残基である。
突然変異させるべき位置は、以下の2つの要件を同時に満たさなければならない:（i）ハプテン位置決め効果を指向的カップリングに利用するために、カップリング位置は結合領域の近傍に存在すべきであり、かつ要件（ii）突然変異およびカップリングの位置は、ハプテン結合そのものには影響を及ぼさないような位置になければならない。適切な位置を見つけるためのこれらの要件は、事実上、互いに「相反」している。なぜなら、要件（i）は、結合部位に近い位置によって最もよく満たされ、一方、（ii）は結合部位から離れた位置によって最も安全に達成されるからである。
これらの事実上排他的な要件にもかかわらず、ハプテンの位置決めに影響を及ぼさずに突然変異させることができ、それでもなお同時に指向的共有結合的カップリングを可能にする抗ハプテン抗体中の位置が同定された。
第1の位置は、重鎖可変ドメインのKabatナンバリングに従うそれぞれ位置VH52bまたは位置VH53にある。抗体が、52a、52c、52c、および52dなどの間欠的残基（intermittent residue）を持たない短いVH CDR2を有する場合、位置は53である（抗体重鎖可変ドメインに関するKabatのナンバリング方式および規則によるナンバリングおよびアラインメント）。抗体が、残基52aおよび52bを含み、任意で52cおよび52dなどとしてさらなる残基を含む長いVH CDR2を有する場合、位置は52bである（抗体重鎖可変ドメインに関するKabatのナンバリング方式および規則によるナンバリングおよびアラインメント）。
第2の位置は、Kabatナンバリングに従う位置VH28にある。
例えば抗ジゴキシゲニン抗体構造では、ハプテンは、疎水性残基によって形成される深いポケット中で結合する。この結晶学的研究では、蛍光性ジゴキシゲニン-Cy5コンジュゲートが使用された。発蛍光団も、ジゴキシゲニンとCy5との間のリンカーも、その高いフレキシビリティおよびその結果生じる結晶内での乱れにより、構造中に見ることができなかった。しかし、リンカーおよびCy5は、重鎖のCDR2の方向を向いているジゴキシゲニンのO32に取り付けられる。ジゴキシゲニンのO32からKabatに従う位置52bにあるアミノ酸残基のCαまでの距離は約10.5Åである。
この位置は「普遍的な（universal）」位置であること、すなわちこの位置はどの（抗ハプテン）抗体にも適用することができ、それゆえに、結晶構造を用意し、ハプテン位置決め共有結合的カップリングを可能にする適当な位置を決定することによって新しい（抗ハプテン）抗体を修飾する必要が生じるたびに、一から始める必要はないことがわかった。
Kabatのナンバリング方式に従うそれぞれ突然変異VH52bCまたはVH53Cは、意外にも、分析した各ハプテン結合性抗体に使用することができた。抗体とそれらの結合ポケットの構造は極めて多様であるが、VH52bC/VH53C突然変異は、ハプテン（例えばジゴキシゲニン、ビオチン、フルオレセイン、テオフィリン、ならびにブロモデオキシウリジンなど）に結合する抗体へのハプテン/ハプテン化化合物の共有結合による取り付けに使用できることが示された。こうして、抗体の重鎖CDR2の内部にあってKabatのナンバリングに従う位置VH52b/VH53にあるアミノ酸残基をシステインに変えることは、構造設計または具体的抗体構造の知見をさらに必要とすることなく、また抗体の可変ドメインに固有の結合特性を妨害することもなく、他の（抗ハプテン）抗体に適用できることが、さらに明らかになった。
本明細書において報告するように修飾された抗体は、それぞれの親（すなわち野生型）抗ハプテン抗体のハプテン結合能を保っている。したがって、抗体の人為的システイン残基を含む抗ハプテン抗体はハプテンに結合し、一態様ではハプテンに特異的に結合する。
「〜に結合する抗体」という用語は、抗体がその抗原との複合体を特異的に形成できることを表す。特異的結合は、プラズモン共鳴アッセイ（BIAcore, GE-Healthcare,スウェーデン国ウプサラ）などのインビトロアッセイで検出することができる。複合体形成のアフィニティは、ka（化合物の会合による複合体形成の速度定数）、kD（解離定数、複合体の解離）、およびKD（kD/ka）を使って定義される。結合または特異的結合とは、約10-8M以下、一態様では約10-8M〜約10-13M、一態様では約10-9M〜約10-13Mの結合アフィニティ（KD）を意味する。したがって、ハプテンに結合して本明細書において報告する複合体を形成する抗体は、約10-8mol/l以下の結合アフィニティ（KD）で、一態様では約10-8mol/l〜約10-13mol/lの結合アフィニティ（KD）で、一態様では約10-9mol/l〜10-13mol/lの結合アフィニティ（KD）で、ハプテンに特異的に結合する。
抗体がハプテンに結合すると、形成される結合がジスルフィド結合である場合には、還元作用物質および/または酸化作用物質を添加しなくても、システイン修飾抗ハプテン抗体と、ハプテンにコンジュゲートされたシステイン修飾ポリペプチドとの間で、共有結合の形成が起こることがわかった。したがって、これら2つの化合物の間のジスルフィド架橋は、非共有結合的複合体が形成されると自発的に形成される。それゆえに、本明細書において報告する共有結合的複合体を形成させるための方法は、単に2つの化合物を混合するだけでよい。ジスルフィド結合を形成させるための唯一の前提条件は、2つの化合物が互いに適切に配向することである。
抗体の人為的システイン残基を含有する抗ハプテン抗体は、人為的ポリペプチドシステイン残基を含むハプテン化ポリペプチドと、部位特異的に、かつ効率よく、カップリングすることができる。
それぞれ位置VH52bまたはVH53（Kabatナンバリング方式に従う）のアミノ酸残基をシステイン残基で置き換えることで、抗ジゴキシゲニン抗体-VH52bCについてはSEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:28に示し、また抗テオフィリン抗体-VH53CについてはSEQ ID NO:84およびSEQ ID NO:92に示し、またビオチン抗体-VH53CについてはSEQ ID NO:52およびSEQ ID NO:60に示し、また抗フルオレセイン抗体-VH52bCについてはSEQ ID NO:108に示す、重鎖可変領域配列を持つ抗体誘導体を得た。
位置VH28（Kabatナンバリング方式に従う）の重鎖可変ドメインアミノ酸残基をシステイン残基で置き換えることで、それぞれSEQ ID NO:116、124、132、140、148、156、および164に示す重鎖可変領域配列を持つ抗体誘導体を得た。
一態様において、抗ジゴキシゲニン抗体は、（a）SEQ ID NO:09またはSEQ ID NO:25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（b）SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、（c）SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、（d）SEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（e）SEQ ID NO:14またはSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（f）SEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含むことを特徴とする。
一態様において、抗ビオチン抗体は、（a）SEQ ID NO:41またはSEQ ID NO:57のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（b）SEQ ID NO:42またはSEQ ID NO:58のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、（c）SEQ ID NO:43またはSEQ ID NO:59のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、（d）SEQ ID NO:45またはSEQ ID NO:61のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（e）SEQ ID NO:46またはSEQ ID NO:62のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（f）SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:64のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含むことを特徴とする。
一態様において、抗フルオレセイン抗体は、（a）SEQ ID NO:105またはSEQ ID NO:113のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（b）SEQ ID NO:106またはSEQ ID NO:114のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、（c）SEQ ID NO:107またはSEQ ID NO:115のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、（d）SEQ ID NO:109またはSEQ ID NO:117のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（e）SEQ ID NO:110またはSEQ ID NO:118のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（f）SEQ ID NO:111またはSEQ ID NO:119のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含むことを特徴とする。
一態様において、抗テオフィリン抗体は、（a）SEQ ID NO:73またはSEQ ID NO:89のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（b）SEQ ID NO:74またはSEQ ID NO:90のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、（c）SEQ ID NO:75またはSEQ ID NO:91のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、（d）SEQ ID NO:77またはSEQ ID NO:93のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（e）SEQ ID NO:78またはSEQ ID NO:94のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（f）SEQ ID NO:79またはSEQ ID NO:95のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含むことを特徴とする。
一態様において、抗ジゴキシゲニン抗体は、（a）（i）SEQ ID NO:09またはSEQ ID NO:25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および（iii）SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含むVHドメイン、および（b）（i）SEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:14またはSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（c）SEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含むVLドメイン、を含むことを特徴とする。
一態様において、抗ビオチン抗体は、（a）（i）SEQ ID NO:41またはSEQ ID NO:57のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:42またはSEQ ID NO:58のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および（iii）SEQ ID NO:43またはSEQ ID NO:59のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含むVHドメイン、および（b）（i）SEQ ID NO:45またはSEQ ID NO:61のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:46またはSEQ ID NO:6242のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（c）SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:63のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含むVLドメイン、を含むことを特徴とする。
一態様において、抗フルオレセイン抗体は、（a）（i）SEQ ID NO:105またはSEQ ID NO:113のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:106またはSEQ ID NO:114のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および（iii）SEQ ID NO:107またはSEQ ID NO:115のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含むVHドメイン、および（b）（i）SEQ ID NO:109またはSEQ ID NO:117のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:110またはSEQ ID NO:118のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（c）SEQ ID NO:111またはSEQ ID NO:119のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含むVLドメイン、を含むことを特徴とする。
一態様において、抗テオフィリン抗体は、（a）（i）SEQ ID NO:73またはSEQ ID NO:89のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:74またはSEQ ID NO:90のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および（iii）SEQ ID NO:75またはSEQ ID NO:91のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含むVHドメイン、および（b）（i）SEQ ID NO:77またはSEQ ID NO:93のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:78またはSEQ ID NO:94のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（c）SEQ ID NO:79またはSEQ ID NO:95のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含むVLドメイン、を含むことを特徴とする。
一態様において、抗ジゴキシゲニン抗体、および/または抗ビオチン抗体、および/または抗テオフィリン抗体は、ヒト化抗体である。
一態様において、抗ジゴキシゲニン抗体は、上記の態様のいずれかに記載のCDRを含み、さらにアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様において、抗ビオチン抗体は、上記の態様のいずれかに記載のCDRを含み、さらにアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様において、抗テオフィリン抗体は、上記の態様のいずれかに記載のCDRを含み、さらにアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様において、抗ジゴキシゲニン抗体は、SEQ ID NO:04またはSEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:28のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）配列を含むことを特徴とする。一定の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列との比較で置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、当該配列を含む抗ジゴキシゲニン抗体は、ジゴキシゲニンに結合する能力を保っている。一定の態様では、SEQ ID NO:01またはSEQ ID NO:09またはSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:25において、合計1〜10個のアミノ酸が置換され、挿入され、かつ/または欠失している。一定の態様において、置換、挿入、または欠失は、CDR外の領域（すなわちFR中）に存在する。任意で、抗ジゴキシゲニン抗体は、SEQ ID NO:01またはSEQ ID NO:09またはSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:25のVH配列（当該配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
一態様において、抗ジゴキシゲニン抗体は、SEQ ID NO:08またはSEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:32のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（VL）を含むことを特徴とする。一定の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVL配列は、参照配列との比較で置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、当該配列を含む抗ジゴキシゲニン抗体は、ジゴキシゲニンに結合する能力を保っている。一定の態様では、SEQ ID NO:08またはSEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:32において、合計1〜10個のアミノ酸が置換され、挿入され、かつ/または欠失している。一定の態様において、置換、挿入、または欠失は、CDR外の領域（すなわちFR中）に存在する。任意で、抗ジゴキシゲニン抗体は、SEQ ID NO:08またはSEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:32のVL配列（当該配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
一態様において、抗ビオチン抗体は、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:44またはSEQ ID NO:52またはSEQ ID NO:60のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）配列を含むことを特徴とする。一定の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列との比較で置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、当該配列を含む抗ビオチン抗体は、ビオチンに結合する能力を保っている。一定の態様では、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:44またはSEQ ID NO:52またはSEQ ID NO:60において、合計1〜10個のアミノ酸が置換され、挿入され、かつ/または欠失している。一定の態様において、置換、挿入、または欠失は、CDR外の領域（すなわちFR中）に存在する。任意で抗ビオチン抗体は、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:44またはSEQ ID NO:52またはSEQ ID NO:60のVH配列（当該配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
一態様において、抗フルオレセイン抗体は、SEQ ID NO:108またはSEQ ID NO:116のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）配列を含むことを特徴とする。一定の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列との比較で置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、当該配列を含む抗フルオレセイン抗体は、フルオレセインに結合する能力を保っている。一定の態様では、SEQ ID NO:108またはSEQ ID NO:116において、合計1〜10個のアミノ酸が置換され、挿入され、かつ/または欠失している。一定の態様において、置換、挿入、または欠失は、CDR外の領域（すなわちFR中）に存在する。任意で抗フルオレセイン抗体は、SEQ ID NO:108またはSEQ ID NO:116のVH配列（当該配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
一態様において、抗テオフィリン抗体は、SEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:84またはSEQ ID NO:92のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）配列を含むことを特徴とする。一定の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列との比較で置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、当該配列を含む抗テオフィリン抗体は、テオフィリンに結合する能力を保っている。一定の態様では、SEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:84またはSEQ ID NO:92において、合計1〜10個のアミノ酸が置換され、挿入され、かつ/または欠失している。一定の態様において、置換、挿入、または欠失は、CDR外の領域（すなわちFR中）に存在する。任意で抗テオフィリン抗体は、SEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:84またはSEQ ID NO:92のVH配列（当該配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
一態様において、抗ジゴキシゲニン抗体は、上述の態様のいずれかに記載のVHと上述の態様のいずれかに記載のVLとを含むことを特徴とする。一態様において、抗体は、それぞれSEQ ID NO:04またはSEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:28、およびSEQ ID NO:08またはSEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:32のVH配列およびVL配列（これらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
一態様において、抗ビオチン抗体は、上述の態様のいずれかに記載のVHと上述の態様のいずれかに記載のVLとを含むことを特徴とする。一態様において、抗体は、それぞれSEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:44またはSEQ ID NO:52またはSEQ ID NO:60、およびSEQ ID NO:40またはSEQ ID NO:48またはSEQ ID NO:56またはSEQ ID NO:64のVH配列およびVL配列（これらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
一態様において、抗フルオレセイン抗体は、上述の態様のいずれかに記載のVHと上述の態様のいずれかに記載のVLとを含むことを特徴とする。一態様において、抗体は、それぞれSEQ ID NO:108またはSEQ ID NO:116、およびSEQ ID NO:112またはSEQ ID NO:120のVH配列およびVL配列（これらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
一態様において、抗テオフィリン抗体は、上述の態様のいずれかに記載のVHと上述の態様のいずれかに記載のVLとを含むことを特徴とする。一態様において、抗体は、それぞれSEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:84またはSEQ ID NO:92、およびSEQ ID NO:72またはSEQ ID NO:80またはSEQ ID NO:88またはSEQ ID NO:96のVH配列およびVL配列（これらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
修飾点として同定されたさらにもう1つの位置は、Kabatナンバリングに従う位置VH28である。
Kabatに従う位置VH28にあるアミノ酸をシステインで置き換えることで、抗ジゴキシゲニン抗体-VH28CについてはSEQ ID NO:124およびSEQ ID NO:132、抗テオフィリン抗体-VH28CについてはSEQ ID NO:156およびSEQ ID NO:164、抗ビオチン抗体-VH28CについてはSEQ ID NO:140およびSEQ ID NO:148、そして抗フルオレセイン抗体-VH28CについてはSEQ ID NO:116として示す重鎖可変領域配列を持つ抗体誘導体が生成した。
ESI-MS分析により、ハプテン化された治療用ペプチドの共有結合的抗体コンジュゲーションは、非複合体化抗体または非複合体化ペプチドより大きい、所定のサイズのコンジュゲートをもたらすことが実証される。
（表１）TIC表
Figure 0006521464
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1）N末端ピログルタミン酸を持つHC
2）C末端Lysを持たないHC
3）グリコシル化部位が脱グリコシル化によりN→Dに変化しているHC
4）N末端にピログルタミン酸を持つLC
抗体アフィニティ
一定の態様において、本明細書において報告する抗体そのもの、または本明細書において報告する複合体中の抗体は、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM（例えば約10-8M以下、例えば約10-8M〜約10-13M、例えば約10-9M〜約10-13M）の解離定数（Kd）を有する。
一態様では、関心対象の抗体のFab型とその抗原とを使って、以下のアッセイで述べるように行われる放射性標識抗原結合アッセイ（RIA）によって、Kdが測定される。抗原に対するFabの溶液結合アフィニティーは、タイトレーションのための一連の濃度（a titration series）の非標識抗原の存在下で、Fabを最小濃度の（125I）-標識抗原と平衡化し、次に結合した抗原を抗Fab抗体被覆プレートで捕捉することによって測定される（例えばChen, Y. et al, J. Mol. Biol. 293（1999）865-881を参照されたい）。アッセイ条件を確立するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific）を50mM炭酸ナトリウム（pH9.6）中の5μg/mlの捕捉用抗Fab抗体（Cappel Labs）で一晩コーティングし、次に、PBS中の2％（w/v）ウシ血清アルブミンで、室温（およそ23℃）において2〜5時間ブロッキングする。非吸着性プレート（Nunc #269620）において（例えばPresta, L.G. et al, Cancer Res. 57（1997）4593-4599における抗VEGF抗体Fab-12の評価と同じように）100pMまたは26pM［125I］-抗原を関心対象のFabの段階希釈液と混合する。次に関心対象のFabを一晩インキュベートする。ただし、確実に平衡に到達させるために、インキュベーションをさらに長時間（例えば約65時間）続けてもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移して、室温で（例えば1時間）インキュベートする。次に溶液を除去し、プレートをPBS中の0.1％ポリソルベート20（TWEEN-20（登録商標））で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）; Packard）を加え、プレートをTOPCOUNT（商標）ガンマカウンター（Packard）で10分カウントする。最大結合量の20％以下を与える各Fabの濃度を競合結合アッセイにおいて試用するために選択する。
別の態様では、BIACORE（登録商標）-2000またはBIACORE（登録商標）-3000（BIAcore, Inc.,ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用し、25℃において、約10レスポンスユニット（RU）の固定化抗原CM5チップを使って、表面プラズモン共鳴アッセイでKdを測定する。簡単に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, BIACORE, Inc.）を、N-エチル-N'-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）で、供給者の説明書に従って活性化する。抗原を、10mM酢酸ナトリウム、pH4.8で、5μg/ml（約0.2μM）に希釈してから、カップリングされたタンパク質がおよそ10レスポンスユニット（RU）になるように、5μl/分の流量で注入する。抗原の注入に続いて、反応していない基をブロッキングするために、1Mエタノールアミンを注入する。速度論的測定の場合は、Fabの二倍段階希釈液（0.78nM〜500nM）を、0.05％ポリソルベート20（TWEEN-20（商標））界面活性剤を含むPBS（PBST）に入れ、25℃において、およそ25μl/分の流量で注入する。会合センサーグラムと解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより、単純1対1ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）Evaluation Softwareバージョン3.2）を使って、会合速度（kon）と解離速度（koff）を算出する。平衡解離定数（Kd）は、比koff/konとして算出される。例えばChen, Y. et al, J. Mol. Biol. 293（1999）865-881を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴でオン速度が106M-1s-1を越える場合は、増加する一連の濃度の抗原の存在下で、PBS、pH7.2中の20nM抗抗原抗体（Fab型）の、25℃における蛍光放出強度（励起＝295nm;蛍光＝340nm、バンドパス16nm）の増加または減少を、ストップフローを装備した分光測光器（Aviv Instruments）や撹拌キュベット付きの8000シリーズSLM-AMINCO（商標）分光測光器（ThermoSpectronic）などといった分光光度計で測定される蛍光消光技法を使って、会合速度を決定することができる。
抗体フラグメント
一定の態様では、本明細書に報告するコンジュゲート中の結合特異性は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントとしては、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2、Fv、およびscFvフラグメント、ならびに後述する他のフラグメントが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一定の抗体フラグメントを概観するには、Hudson, P.J. et al, Nat. Med. 9（2003）129-134を参照されたい。scFvフラグメントを概観するには、例えばPlueckthun, A.「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol. 113, RosenburgおよびMoore編, Springer-Verlag,ニューヨーク（1994）のp.269-315を参照されたい。また、WO93/16185および米国特許第5,571,894号および同第5,587,458号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加しているFabフラグメントおよびF（ab'）2フラグメントについての議論は、US5,869,046を参照されたい。
ダイアボディは2つの抗原結合部位を持つ抗体フラグメントであり、これは二価であっても、二重特異性であってもよい。例えばEP0404097; WO1993/01161; Hudson, P.J. et al, Nat. Med. 9（2003）129-134;およびHolliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（1993）6444-6448を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもHudson, P.J. et al, Nat. Med. 9（20039 129-134）に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。一定の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA;例えばUS6,248,516を参照されたい）。
抗体フラグメントは、本明細書において述べるように、例えば限定するわけではないが、インタクト抗体のタンパク質分解的消化、ならびに組換え宿主細胞（例えば大腸菌（E. coli）またはファージ）による生産など、さまざまな技法によって作製することができる。
キメラ抗体およびヒト化抗体
一定の態様では、本明細書に報告するコンジュゲート中の抗体は、キメラ抗体である。一定のキメラ抗体が、例えばUS4,816,567およびMorrison, S.L. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81（1984）6851-6855に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類）由来の可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスを親抗体から変化させた「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合性フラグメントが包含される。
一定の態様では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性およびアフィニティーを保ったまま、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化される。一般にヒト化抗体は、HVR、例えばCDR（またはその部分）が非ヒト抗体に由来し、FR（またはその部分）がヒト抗体配列に由来する1つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含むであろう。いくつかの態様では、例えば抗体の特異性またはアフィニティーを回復しまたは改良するために、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基が、非ヒト抗体（例えばHVR残基の由来源となった抗体）由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体と、それらを作製する方法は、例えばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13（2008）1619-1633に概説されており、また例えばRiechmann, I. et al., Nature 332（1988）323-329; Queen, C. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）10029-10033;米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号、および同第7,087,409号; Kashmiri, S.V. et al, Methods 36（2005）25-34（SDR（a-CDR）移植が記載されている）; Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28（1991）489-498（「リサーフェイシング（resurfacing）が記載されている）; Dall'Acqua, W.F. et al, Methods 36（2005）43-60（「FRシャフリング」が記載されている）;およびOsbourn, J. et al, Methods 36（2005）61-68およびKlimka, A. et al, Br. J. Cancer 83（2000）252-260（FRシャフリングのための「誘導選択（guided selection）」アプローチが記載されている）にも、さらに記載されている。
ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を使って選択されるフレームワーク領域（例えばSims, M.J. et al., J. Immunol. 151（1993）2296-2308を参照されたい）;特定サブグループの軽鎖または重鎖可変領域のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えばCarter, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89（1992）4285-4289およびPresta, L.G. et al, J. Immunol. 151（1993）2623-2632を参照されたい）;ヒト成熟（体細胞突然変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13（2008）1619-1633を参照されたい）;およびFRライブラリーのスクリーニングによって得られるフレームワーク領域（例えばBaca, M. et al, J. Biol. Chem. 272（1997）10678-10684およびRosok, M.J. et al, J. Biol. Chem. 271（19969 22611-22618を参照されたい）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
ヒト抗体
一定の態様において、本明細書において報告するコンジュゲート中の抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知のさまざまな技法を使って生産することができる。ヒト抗体は、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5（2001）368-374およびLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20（2008）450-459に概説されている。
ヒト抗体は、抗原攻撃に応答して無傷のヒト抗体またはヒト可変領域を持つ無傷の抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。そのような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有しており、それらは、内在性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わっているか、または染色体外に存在するか、もしくはその動物の染色体にランダムに組み込まれている。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法を概観するには、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23（2005）1117-1125を参照されたい。また、例えばXENOMOUSE（商標）技術が記載されているUS 6,075,181およびUS 6,150,584; HuMAb（登録商標）技術が記載されているUS 5,770,429; K-M MOUSE（登録商標）技術が記載されているUS 7,041,870、およびVelociMouse（登録商標）技術が記載されているUS 2007/0061900も参照されたい。そのような動物によって生成させた無傷の抗体のヒト可変領域は、例えば異なるヒト定常領域と組み合わせることなどによって、さらに改変することができる。
ヒト抗体はハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体生産用のヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は記載されている（例えばKozbor, D., J. Immunol. 133（1984）3001-3005; Brodeur, B.R. et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク（1987）, pp.51-63;およびBoerner, P. et al, J. Immunol. 147（1991）86-95を参照されたい）。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術によって生成させたヒト抗体は、Li, J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103（2006）3557-3562にも記載されている。さらなる方法には、例えば米国特許第7,189,826号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の生産が記載されている）およびNi, J., Xiandai Mianyixue 26（2006）265-268（ヒト-ヒトハイブリドーマが記載されている）に記載されているものがある。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20（2005）927-937およびVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27（2005）185-191にも記載されている。
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成させることもできる。そのような可変ドメイン配列は、次に、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法については後述する。
ライブラリー由来の抗体
本明細書に報告するコンジュゲート中の抗体は、1つまたは複数の所望の活性を持つ抗体に関してコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することもできる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成し、所望の結合特徴を有する抗体に関してそのようなライブラリーをスクリーニングするためのさまざまな方法が、当技術分野において公知である。そのような方法は、例えばHoogenboom, H.R. et al, Methods in Molecular Biology 178（2001）1-37に概説されており、また例えばMcCafferty, J. et al, Nature 348（1990）552-554; Clackson, T. et al, Nature 352（1991）624-628; Marks, J.D. et al, J. Mol. Biol. 222（1992）581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248（2003）161-175; Sidhu, S.S. et al, J. Mol. Biol. 338（2004）299-310; Lee, C.V. et al, J. Mol. Biol. 340（2004）1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101（2004）12467-12472;およびLee, C.V. et al, J. Immunol. Methods 284（2004）119-132に、さらに記載されている。
一定のファージディスプレイ法では、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12（1994）433-455に記載されているように、VH遺伝子とVL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって個別にクローニングし、それらをファージライブラリーでランダムに組み換えた後、そのライブラリーを抗原結合性ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的には抗体フラグメントを、一本鎖Fv（scFv）フラグメントとして、またはFabフラグメントとして、ディスプレイする。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築しなくても、免疫原に対する高アフィニティー抗体を与える。あるいは、Griffiths, A.D. et al, EMBO J. 12（1993）725-734に記載されているように、免疫化を一切行わずに、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングすることで、広範囲にわたる非自己抗原に対する抗体、そしてまた自己抗原に対する抗体の単一の供給源とすることもできる。最後に、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227（1992）381-388に記載されているように、幹細胞から非再編成V遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するPCRプライマーを使用することで可変性の高いCDR3領域をコードすると共に、インビトロで再編成を行うことにより、ナイーブライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、例えば次に挙げるものがある: US5,750,373、ならびにUS2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936、およびUS2009/0002360。
本明細書では、ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントを、ヒト抗体またはヒト抗体フラグメントとみなす。
抗体フォーマット
上に概略を記した抗体および抗体フラグメントを、さまざまな方法で組み合わせることで、異なる抗体フォーマットを生成させることができる。
例えば、1つまたは複数のscFv抗体フラグメントを、完全抗体の1つまたは複数のポリペプチド鎖のC末端に融合することができる。とりわけ、各重鎖C末端または各軽鎖C末端に、scFv抗体フラグメントを融合することができる。
例えば、1つまたは複数の抗体Fabフラグメントを、完全抗体の1つまたは複数のポリペプチド鎖のC末端に融合することができる。とりわけ、各重鎖C末端または各軽鎖C末端に、抗体Fabフラグメントを融合することができる。
例えば、1つのscFvフラグメントと1つの抗体Fabフラグメントを抗体Fc-領域のN末端に融合することができる。
例えば、1つのscFvフラグメントまたは抗体Fabフラグメントを、抗体Fc領域のN末端に融合し、1つのscFvまたは抗体Fabフラグメントを抗体Fc領域のそれぞれの他方の鎖のC末端に融合することができる。
多重特異性抗体
例えばIgG抗体フォーマットと一本鎖ドメインの融合による四価二重特異性抗体など、多種多様な組換え抗体フォーマットが開発されている（例えばColoma, M.J., et al, Nature Biotech 15（1997）159-163; WO2001/077342およびMorrison, S.L., Nature Biotech 25（2007）1233-1234を参照されたい）。
例えばダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディ、ミニボディ、いくつかの一本鎖フォーマット（scFv、ビス-scFv）など、抗体のコア構造（IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM）がもはや保たれておらず、2つ以上の抗原を結合する能力を有するフォーマットが、他にもいくつか開発されている（Holliger, P., et al, Nature Biotech 23（2005）1126-1136; Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74（2007）3-14; Shen, J., et al, Journal of Immunological Methods 318（2007）65-74; Wu, C, et al, Nature Biotech. 25（2007）1290-1297）。
そのようなフォーマットはいずれも、抗体コア（IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM）を、さらなる結合タンパク質（例えばscFv）に融合するか、例えば2つのFabフラグメントまたはscFvを融合するために、リンカーを使用する（Fischer, N. and Leger, O., Pathobiology 74（2007）3-14）。天然の抗体に対して高い類似度を維持することによって、例えば補体依存性細胞傷害（CDC）や抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）などといった、Fc受容体結合を介して媒介されるエフェクター機能を保っておきたい場合がありうることは、留意しておく必要がある。
WO2007/024715には、改変多価および多重特異性結合タンパク質として、二重可変ドメイン免疫グロブリンが報告されている。生物活性抗体二量体を調製するためのプロセスが、US6,897,044に報告されている。互いにペプチドリンカーを介して連結された少なくとも4つの可変ドメインを有する多価FV抗体コンストラクトがUS7,129,330に報告されている。二量体型および多量体型抗原結合構造が、US2005/0079170に報告されている。接続構造によって互いに共有結合された3つまたは4つのFabフラグメントを含む三価または四価の単一特異性抗原結合タンパク質であって、天然免疫グロブリンでないものが、US6,511,663に報告されている。WO2006/020258には、原核細胞および真核細胞において効率よく発現させることができ、治療方法および診断方法に有用である、四価二重特異性抗体が報告されている。2タイプのポリペプチド二量体を含む混合物から、少なくとも1つの鎖間ジスルフィド連結によって連結された二量体を、少なくとも1つの鎖間ジスルフィド連結によって連結されていない二量体から分離し、または優先的に合成する方法が、US2005/0163782に報告されている。二重特異性四価受容体はUS5,959,083に報告されている。3つ以上の機能的抗原結合部位を持つ改変抗体はWO2001/077342に報告されている。
多重特異性および多価抗原結合性ポリペプチドはWO1997/001580に報告されている。WO1992/004053には、典型的には同じ抗原決定基に結合するIgGクラスのモノクローナル抗体から調製されるホモコンジュゲートを、合成的架橋によって共有結合で連結することが報告されている。WO1991/06305には、抗原に対する高いアビディティを有するオリゴマーモノクローナル抗体が報告されており、ここでは2つ以上の免疫グロブリン単量体が1つに会合されて四価また六価IgG分子を形成している典型的にはIgGクラスのオリゴマーが分泌される。インターフェロンガンマ活性が病因となる疾患を処置するために使用することができるヒツジ由来の抗体および改変抗体コンストラクトが、US6,350,860に報告されている。US2005/0100543では、二重特異性抗体の多価担体であるターゲティング可能なコンストラクトが報告されている。すなわち、ターゲティング可能なコンストラクトの各分子は、2つ以上の二重特異性抗体の担体として役立ちうる。遺伝子改変二重特異性四価抗体がWO1995/009917に報告されている。WO2007/109254には、安定化scFvからなるまたは安定化scFvを含む安定化結合分子が報告されている。
一定の態様では、本明細書において規定する抗体、または本明細書に報告するコンジュゲート中の抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。一定の態様では、結合特異性の一方はハプテンに対する特異性であり、他方は他の任意の（非ハプテン）抗原に対する特異性である。二重特異性抗体は細胞傷害性作用物質を細胞に局在化させるために使用することができる。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する2対の免疫グロブリン重鎖-軽鎖ペアの組換え同時発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305（1983）537-540、WO93/08829、およびTraunecker, A. et al, EMBO J. 10（1991）3655-3659参照）、および「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole）」工学（例えば米国特許第5,731,168号を参照されたい）などがあるが、それらに限定されるわけではない。多重特異性抗体は、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電的ステアリング効果（electrostatic steering effect）を工学的に作製すること（WO2009/089004）;2つ以上の抗体またはフラグメントを架橋すること（例えば米国特許第4,676,980号、およびBrennan, M. et al., Science 229（1985）81-83を参照されたい）;ロイシンジッパーを使って二重特異性抗体を生産すること（例えばKostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148（1992）1547-1553を参照されたい）;二重特異性抗体フラグメントを作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えばHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（1993）6444-6448を参照されたい）;および単鎖Fv（scFv）二量体を使用すること（例えばGruber, M et al., J. Immunol. 152（1994）5368-5374を参照されたい）;および例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147（1991）60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製することもできる。
一態様では、例えばWO96/027011、WO98/050431、Ridgway J.B., et al, Protein Eng. 9（1996）617-621、Merchant, A.M., et al, Nat Biotechnol 16（1998）677-681にいくつかの例と共に詳細に説明されている「ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-holes）」技術によって、二重特異性抗体の重鎖のCH3ドメインを改変する。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用表面を改変することで、それら2つのCH3ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化を増加させる。（2つの重鎖の）2つのCH3ドメインのそれぞれを「ノブ」とすることができ、その場合は他方が「ホール」になる。ジスルフィド架橋を導入するとヘテロ二量体が安定化し（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16（1998）677-681、Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35）、収量が増加する。
すべての局面の一態様では、二重特異性抗体は、以下の特徴を有する:
・一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインは、それぞれ、抗体CH3ドメイン間の元の界面を含む界面で接触し、
ここで、該界面は、二重特異性抗体の形成が促進されるように改変されており、その改変は、以下の特徴を有する:
a）一方の重鎖のCH3ドメインは、
二重特異性抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の界面と接触する一方の重鎖のCH3ドメインの元の界面内において、
あるアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、一方の重鎖のCH3ドメインの界面内で、他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の空洞に収まりうる突起が生成する
ように、改変され、
かつ
b）他方の重鎖のCH3ドメインは、
二重特異性抗体内の第1のCH3ドメインの元の界面と接触する第2のCH3ドメインの元の界面内において、
あるアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第2のCH3ドメインの界面内に、第1のCH3ドメインの界面内の突起が収まりうる空洞が生成する。
したがって、本明細書において報告する抗体は、一態様では、以下の特徴を有する:
・完全長抗体の第1重鎖のCH3ドメインと完全長抗体の第2重鎖のCH3ドメインは、それぞれ、抗体CH3ドメインの元の界面中に改変を含む界面で接触し、
ここで、i）第1重鎖のCH3ドメインでは、
あるアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、一方の重鎖のCH3ドメインの界面内で、他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の空洞に収まりうる突起が生成しており、
かつ、ii）第2重鎖のCH3ドメインでは、
あるアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第2のCH3ドメインの界面内に、第1のCH3ドメインの界面内の突起が収まりうる空洞が生成している。
一態様では、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）からなる群より選択される。
一態様では、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）、バリン（V）からなる群より選択される。
一態様では、両CH3ドメイン間にジスルフィド架橋を形成させることができるように、各CH3ドメインの対応する位置にアミノ酸としてシステイン（C）を導入することによって、両CH3ドメインがさらに改変される。
一態様では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にT366W突然変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメイン中にT366S、L368A、Y407V突然変異を含む。また、例えば「ノブ鎖」のCH3ドメインにY349C突然変異を導入し、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインにE356C突然変異またはS354C突然変異を導入することなどによって、CH3ドメイン間に追加の鎖間ジスルフィド架橋を使用することもできる（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16（1998）677-681）（ナンバリングはKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）のEUインデックスに従う）。
一態様では、二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349C、T366W突然変異を含み、かつ2つのCH3ドメインの他方にE356C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含む。一態様では、二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349C、T366W突然変異を含み、かつ2つのCH3ドメインの他方にS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含む（一方のCH3ドメイン中の追加Y349C突然変異と、他方のCH3ドメイン中の追加E356CまたはS354C突然変異とは、鎖間ジスルフィド結合を形成する）（KabatのEUインデックスによるナンバリング;（Kabat, E.A., et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）））。EP1870459A1に記載されているさらなるノブ・イントゥ-ホール技術を、上記に代えて、または上記に加えて使用することもできる。したがって、二重特異性抗体の別の例は、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中のR409D、K370E突然変異および「ホール鎖」のCH3ドメイン中のD399K、E357K突然変異である（KabatのEUインデックスによるナンバリング;（Kabat, E.A., et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991））。
一態様では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にT366W突然変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメイン中にT366S、L368A、Y407V突然変異を含み、さらに「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にR409D、K370E突然変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメイン中にD399K、E357K突然変異を含む。
一態様では、二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349C、T366W突然変異を含み、かつ2つのCH3ドメインの他方にS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含むか、または二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349C、T366W突然変異を含み、かつ2つのCH3ドメインの他方にS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含み、さらに「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にR409D、K370E突然変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメイン中にD399K、E357K突然変異を含む。CH3ドメイン中のこのようなノブ突然変異およびホール突然変異は、典型的には、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171、またはSEQ ID NO:172（ヒトIgG1サブクラスアロタイプ（コーカサス人およびアフリカ系アメリカ黒人または突然変異体L234A/L235AおよびL234A/L235A/P329G））、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、またはSEQ ID NO:175（ヒトIgG4サブクラスまたは突然変異体S228P、L235E、およびS228P/L235E/P329G）のヒト重鎖定常領域において使用される（ナンバリングはKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）のEUインデックスに従う）。
一態様では、二重特異性抗体は、CH3ドメイン中に上述の「ノブ」および「ホール」突然変異（例えば2つのCH3ドメインの一方にY349C、T366W突然変異および2つのCH3ドメインの他方にS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異）をさらに含むSEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、またはSEQ ID NO:175のヒト重鎖定常領域を含む（ナンバリングはKabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）のEUインデックスに従う）。
「オクトパス（Octopus）抗体」などといった3つ以上の機能的抗原結合部位を持つ改変抗体も、本明細書に含まれる（例えばUS2006/0025576を参照されたい）。
本明細書における抗体またはフラグメントには、ハプテンに結合する抗原結合部位と、別の異なる抗原に結合する抗原結合部位とを含む、「二重作用性（Dual Acting）Fab」、すなわち「DAF」も含まれる（例えばUS2008/0069820を参照されたい）。
本明細書における抗体またはフラグメントには、WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/112193、WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792、およびWO2010/145793に記載の多重特異性抗体も含まれる。
一態様では、二重特異性抗体の第1結合特異性がハプテンに対する結合特異性であり、かつ第2結合特異性が非ハプテン抗原に対する結合特異性である。一態様において、非ハプテン抗原は、白血球マーカーCD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a、b、c、CD13、CD14、CD18、CD19、CD22、CD23、CD27およびそのリガンド、CD28およびそのリガンドB7.1、B7.2、B7.3、CD29およびそのリガンド、CD30およびそのリガンド、CD40およびそのリガンドgp39、CD44、CD45およびアイソフォーム、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA-4、LFA-1およびTCR;組織適合性抗原MHCクラスIまたはII、ルイスY抗原、SLex、SLey、SLea、およびSLeb;インテグリンVLA-1、VLA-2、VLA-3、VLA-4、VLA-5、VLA-6、αVβ3、およびLFA-1、Mac-1、およびpl50,95、αVβ1、gpIIbIIIa、αRβ3、α6β4、αVβ5、αVβ6、およびαV 62 7;セレクチン類L-セレクチン、P-セレクチン、およびE-セレクチン、ならびにそれらの対抗受容体VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2、およびLFA-3;インターロイキンIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、およびIL-15から選択され;インターロイキン受容体は、IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-14R、およびIL-15Rからなる群より選択され;ケモカインは、PF4、RANTES、MIP1α、MCP1、NAP-2、Groα、Groβ、およびIL-8からなる群より選択され;成長因子は、TNFアルファ、TGFベータ、TSH、VEGF/VPF、VEGFA、VEGFB、VEGF111、VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、PTHrP、EGFファミリー、PDGFファミリー、エンドセリン、フィブロシン（Fibrosin）（FSF-1）、ヒトラミニン、およびガストリン放出ペプチド（GRP）、PLGF、HGH、HGHRからなる群より選択され;成長因子受容体は、TNFアルファR、RGFベータR、TSHR、VEGFR/VPFR、EGFR、PTHrPR、PDGFRファミリー、EPO-R、GCSF-Rおよび他の造血受容体からなる群より選択され;インターフェロン受容体は、IFNCαR、IFNβR、およびIFNλRからなる群より選択され; Igおよびその受容体は、IgE、FcγRI、およびFcγRIIからなる群より選択され;腫瘍抗原は、her2-neu、ムチン、CEAおよびエンドシアリンからなる群より選択され;アレルゲンは、チリダニ類抗原、lol pl（イネ科植物）抗原、およびウルシオールからなる群より選択され;ウイルスポリペプチドは、CMV糖タンパク質B、H、およびgCIII、HIV-1エンベロープ糖タンパク質、RSVエンベロープ糖タンパク質、HSVエンベロープ糖タンパク質、HPVエンベロープ糖タンパク質、肝炎ファミリー表面抗原からなる群より選択され;毒素は、シュードモナスエンドトキシンおよびオステオポンチン/ウロポンチン、ヘビ毒、クモ毒、およびハチ毒コノトキシンからなる群より選択され;血液因子は、補体C3b、補体C4a、補体C4b〜9、Rh因子、フィブリノゲン、フィブリン、およびミエリン関連成長阻害因子からなる群より選択され;酵素は、コレステロールエステル転移ポリペプチド、膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ、およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）からなる群より選択される。
抗体変異体
一定の態様では、本明細書に規定する抗体のアミノ酸配列変異体が考えられる。例えば、抗体の結合アフィニティーおよび/または他の生物学的性質を改良することが望ましいことがあるだろう。抗体のアミノ酸配列変異体は、その抗体をコードするヌクレオチド配列に適当な修飾を導入することによって調製するか、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾としては、例えば抗体のアミノ酸配列からの欠失、および/または抗体のアミノ酸配列への挿入、および/または抗体のアミノ酸配列内での残基の置換が挙げられる。最終コンストラクトが所望の特徴、例えば抗原結合性を有する限り、最終コンストラクトに到達するために、欠失、挿入、および置換をどのように組み合わせてもよい。
a）置換、挿入、および欠失変異体
一定の態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異導入の関心対象となる部位として、HVRおよびFRが挙げられる。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、生成物を所望の活性について、例えば保持された/改良された抗原結合性、減少した免疫原性、または改良されたADCCもしくはCDCについて、スクリーニングすることができる。
（表２）
Figure 0006521464
アミノ酸は、共通する側鎖の性質に従って、以下のようにグループ分けすることができる:
（1）疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
（2）中性親水性: Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
（3）酸性: Asp、Glu;
（4）塩基性: His、Lys、Arg;
（5）鎖の配向に影響を及ぼす残基: Gly、Pro;
（6）芳香族: Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスのものと交換することを伴うであろう。
置換変異体の一タイプでは、親抗体（例えばヒト化抗体またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基が置換される。一般に、結果として生じる変異体のうち、以降の研究のために選ばれるものは、親抗体と比較して一定の生物学的性質に修飾（例えば改良）（例えば増加したアフィニティー、低減した免疫原性）を有し、かつ/または親抗体の一定の生物学的性質を実質上保っているであろう。例示的置換変異体は、例えばファージディスプレイに基づく親和性成熟技法（本明細書に記載するものなど）を使って好都合に生成させることができる親和性成熟抗体である。簡単に述べると、1つまたは複数のHVR残基を突然変異させ、変異抗体をファージ上にディスプレイし、特定の生物学的活性（例えば結合アフィニティー）についてスクリーニングする。
例えば抗体アフィニティーを改良するために、HVRに改変（例えば置換）を加えることができる。そのような改変は、HVR「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟プロセス中に高頻度に突然変異を起こすコドンによってコードされている残基（例えばChowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207（2008）179-196を参照されたい）、および/またはSDR（a-CDR）に加えることができ、結果として生じた変異体VHまたはVLを結合アフィニティーについて試験する。二次ライブラリーを構築し、そこから再び選択することによる親和性成熟は、例えばHoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178（2002）1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様では、さまざまな方法のいずれか（例えばエラープローンPCR、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指定突然変異導入）によって、成熟用に選択された可変遺伝子に、多様性が導入される。次に、二次ライブラリーを作成する。次に、所望の親和性を持つ任意の抗体変異体を同定するために、ライブラリーをスクリーニングする。多様性を導入するための別の方法では、数個のHVR残基（例えば一度に4〜6残基）をランダム化するHVR指向的アプローチがとられる。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異導入法やモデリングなどを使って、特異的に同定することができる。特に重鎖CDR3および軽鎖CDR3を標的とすることが多い。
一定の態様では、その改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、置換、挿入、または欠失が、1つまたは複数のHVR内に存在してもよい。例えば、結合アフィニティーを実質的に低減しない保存的改変（例えば本明細書に規定する保存的置換）をHVRに加えることができる。そのような改変はHVR「ホットスポット」外またはSDR外にあるだろう。上に提示した変異体VHおよびVL配列の一定の態様では、各HVRが無改変であるか、または1つ、2つもしくは3つ以下のアミノ酸置換を含有する。
突然変異導入の標的とすることができる抗体の残基または領域を同定するための有用な一方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244（1989）1081-1085に記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異導入法」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基の群（例えばArg、Asp、His、Lys、およびGluなどの荷電残基）を同定し、それを中性アミノ酸または負荷電アミノ酸（例えばアラニンまたはポリアラニン）で置き換えることで、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。初回の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸の場所に、さらなる置換を導入してもよい。上記に代えて、または上記に加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定するための抗原-抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基および近隣残基は、置換の候補として標的にするか、または排除することができる。変異体をスクリーニングして、それらが所望の性質を持っているかどうかを決定することができる。
アミノ酸配列挿入には、単一アミノ酸残基または複数アミノ酸残基の配列内挿入だけでなく、長さが1残基から、100残基以上を含有するポリペプチドに及ぶ、アミノ末端および/またはカルボキシル末端融合も含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を持つ抗体も含まれる。抗体分子の他の挿入変異体としては、抗体のN末端またはC末端への（例えばADEPT用）の酵素または抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドの融合が挙げられる。
b）グリコシル化変異体
一定の態様では、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるために、本明細書に規定する抗体または本明細書に報告するコンジュゲートに含まれる抗体が改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって、都合よく達成することができる。
抗体がFc領域を含む場合は、そこに取り付けられる糖質を改変することができる。哺乳動物細胞によって生産されるネイティブ抗体は、典型的には、分岐したバイアンテナ型オリゴ糖を含み、それは一般的には、Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN結合によって取り付けられる。例えばWright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15（1997）26-32を参照されたい。オリゴ糖は、さまざまな糖質、例えばマンノース、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびにバイアンテナ型オリゴ糖構造の「ステム」中のGlcNAcに取り付けられたフコースを含みうる。いくつかの態様では、一定の改良された性質を持つ抗体変異体を作製するために、本発明の抗体中のオリゴ糖に修飾を加えることができる。
一態様では、Fc領域に（直接的または間接的に）取り付けられた、フコースを欠く糖質構造を有する抗体変異体が提供される。例えばそのような抗体におけるフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％または20％〜40％でありうる。フコースの量は、例えばWO2008/077546に記載されているようにMALDI-TOF質量分析によって測定される、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を、Asn297に取り付けられたすべての糖構造（例えば複合型、混成型および高マンノース型構造）の和と比較して算出することによって決定される。Asn297とは、Fc領域の位置297（Fc領域残基のEUナンバリング）付近に位置するアスパラギン酸残基を指すが、抗体における軽微な配列変動ゆえに、Asn297は、位置297の上流側または下流側±3アミノ酸付近、すなわち位置294と位置300の間に位置する場合もありうる。そのようなフコシル化変異体は改良されたADCC機能を有しうる。例えばUS2003/0157108、US2004/0093621を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例には、US2003/0157108、WO2000/61739、WO2001/29246、US2003/0115614、US2002/0164328、US2004/0093621、US2004/0132140、US2004/0110704、US2004/0110282、US2004/0109865、WO2003/085119、WO2003/084570、WO2005/035586、WO2005/035778、WO2005/053742、WO2002/031140、Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336（2004）1239-1249、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87（2004）614-622などがある。脱フコシル化抗体を生産する能力を有する細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損しているLec13 CHO細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249（1986）533-545;US2003/0157108;およびWO2004/056312、特に実施例3）、およびアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞などのノックアウト細胞株（例えばYamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87（2004）614-622、Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94（2006）680-688、およびWO2003/085107を参照されたい）などがある。
例えば抗体のFc領域に取り付けられたバイアンテナ型オリゴ糖がGlcNAcによってバイセクト化（bisect）されているバイセクト化（bisected）オリゴ糖を持つ抗体変異体が、さらに提供される。そのような抗体変異体は、低減したフコシル化および/または改良されたADCC機能を有しうる。そのような抗体変異体の例は、例えばWO2003/011878、米国特許第6,602,684号、およびUS2005/0123546に記載されている。Fc領域に取り付けられたオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は改良されたCDC機能を有しうる。そのような抗体変異体は、例えばWO1997/30087、WO1998/58964、およびWO1999/22764に記載されている。
c）Fc領域変異体
一定の態様では、本明細書に規定する抗体のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入することにより、Fc領域変異体を生成させることができる。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトFc領域配列（例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域）を含みうる。
一定の態様において、本発明では、全部ではなく一部のエフェクター機能を持つ抗体変異体が考えられ、その抗体変異体は、これにより、インビボでの抗体の半減期は重要であるものの、一定のエフェクター機能（例えば補体およびADCC）は不必要または有害であるような応用にとって望ましい候補になる。CDCおよび/またはADCC活性の低減/消耗を確認するために、インビトロおよび/またはインビボ細胞傷害性アッセイを行うことができる。例えば、抗体がFcγR結合を欠く（それゆえにおそらくADCC活性を欠く）が、FcRn結合能は保持していることを保証するために、Fc受容体（FcR）結合アッセイを行うことができる。ADCCを媒介するための主要細胞であるNK細胞がFcγRIIIだけを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9（1991）457-492の464頁の表3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えばHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83（1986）7059-7063、およびHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82（1985）1499-1502を参照されたい）、米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166（1987）1351-1361参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えばフローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc.、カリフォルニア州マウンテンビュー）、およびCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞がある。これに代えて、またはこれに加えて、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えばClynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95（1998）652-656に開示されているような動物モデルで、評価することもできる。抗体がC1qに結合することができず、したがってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合アッセイを行うこともできる。例えばWO2006/029879およびWO2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行うことができる（例えばGazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202（1996）163-171、Cragg, M.S. et al., Blood 101（2003）1045-1052、およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103（2004）2738-2743を参照されたい）。FcRn結合およびインビボクリアランス/半減期決定も、当技術分野において公知の方法を使って行うことができる（例えばPetkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18（2006: 1759-1769を参照されたい）。
エフェクター機能が低減している抗体には、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を持つものが含まれる（米国特許第6,737,056号）。そのようなFc突然変異体には、アミノ酸位置265、269、270、297、および327のうちの2つ以上に置換を持つFc突然変異体（残基265および297がアラニンに置換されているいわゆる「DANA」Fc突然変異体（米国特許第7,332,581号を含む）が含まれる。
FcRへの結合が改良または減縮されている一定の抗体変異体が記載されている（例えば米国特許第6,737,056号、WO2004/056312、およびShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276（2001）6591-6604を参照されたい）。
一定の態様では、抗体変異体が、ADCCを改良する1つまたは複数のアミノ酸置換、例えばFc領域の位置298、333、および/または334（残基のEUナンバリング）に置換を持つFc領域を含む。
いくつかの態様では、例えば米国特許第6,194,551号、WO99/51642、およびIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164（2000）4178-4184に記載されているように、C1q結合および/または補体依存性細胞傷害（CDC）の改変（すなわち改良または減縮）をもたらす改変が、Fc領域に加えられる。
半減期が増加しており、かつ胎児への母体IgGの移行の原因となる新生児型Fc受容体（FcRn）（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117（1976）587-593、およびKim, J.K. et al., J. Immunol. 24（1994）2429-2434）への結合が改良されている抗体が、US2005/0014934に記載されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を改良する1つまたは複数の置換をFc領域中に持つFc領域を含む。そのようなFc変異体として、Fc領域残基:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434のうちの1つまたは複数に置換を持つもの、例えばFc領域残基434の置換を持つものが挙げられる（米国特許第7,371,826号）。
Fc領域変異体の他の例については、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322（1988）738-740、US5,648,260、US5,624,821、およびWO94/29351も参照されたい。
d）システイン改変抗体変異体
一定の態様では、システイン改変抗体（cysteine engineered antibody）、例えば抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオMAb（thioMAb）」を作製することが望ましいであろう。特定の態様では、置換残基が抗体の接近可能部位に存在する。それらの残基をシステインで置換すると、それによって抗体の接近可能部位に活性チオール基が置かれることになり、本明細書においてさらに説明するように、それを使って、抗体を他の部分、例えば薬物部分またはリンカー-薬物部分にコンジュゲートすることで、イムノコンジュゲートを作製することができる。一定の態様では、次に挙げる残基のうちの任意の1つまたは複数をシステインで置換することができる:軽鎖のV205（Kabatナンバリング）、重鎖のA118（EUナンバリング）、および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変抗体は、例えば米国特許第7,521,541号に記載されているように生成させることができる。
e）抗体誘導体
一定の態様では、当技術分野において公知であり容易に入手することができる追加の非タンパク質部分を含有するように、本明細書に規定する抗体をさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分として水溶性ポリマーが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（PEG）、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびデキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性ゆえに、製造上の利点を有しうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分岐型であっても非分岐型であってもよい。抗体に取り付けられるポリマーの数はさまざまであってよく、2つ以上のポリマーが取り付けられる場合、それらは同じ分子または異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/またはタイプは、例えば限定するわけではないが、改良しようとする抗体の特定の特性または機能、その抗体誘導体が所定の条件下で治療に使用されるかどうかなどといった、考慮事項に基づいて決定することができる。
別の態様では、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱することができる非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一態様では、非タンパク質部分がカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102（2005）11600-11605）。放射線は任意の波長であってよく、例えば限定するわけではないが、通常の細胞を傷つけないが、非タンパク質部分を、抗体-非タンパク質部分に近接する細胞が死滅する温度まで加熱する波長が挙げられる。
ペイロード
「ペイロード」という用語は、細胞（中）に送達しかつ/または細胞に局在させることが望まれる活性を有する任意の分子またはそのような分子の組み合わせを表す。ペイロードとしては、ラベル、ポリペプチド毒素（例えばシュードモナス外毒素、リシン、アブリン、ジフテリア毒素など）、酵素、成長因子、転写因子、薬物、放射性核種、リガンド、抗体、リポソーム、ナノ粒子、ウイルス粒子、サイトカインなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
ハプテン化化合物
本明細書において報告するハプテン化ポリペプチドは、それ単独で分子の1つでない場合には、治療用作用物質（薬物）、ポリペプチド毒素（例えばドキソルビシンや百日咳毒素などの毒素）、発蛍光団、例えばフルオレセインやローダミンのような蛍光色素、イメージング用または放射線治療用の金属のためのキレート剤、ペプチジルまたは非ペプチジルラベルまたは検出タグ、あるいはクリアランス調整作用物質、例えばポリエチレングリコールのさまざまな異性体、第3の構成要素に結合するペプチド、または他の糖質もしくは親油性作用物質に、さらにコンジュゲートすることができる。コンジュゲーションは直接的に行うか、または介在リンカーを介して行うことができる。
a）治療用作用物質（薬物）
ハプテン-薬物コンジュゲート（ADC、ハプテン化薬物）の薬物部分（D）は、細胞傷害性効果または細胞増殖抑制効果を有する任意の化合物、部分または基であることができる。薬物部分としては、（i）微小管阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはDNAインターカレーターとして機能しうる化学療法剤;（ii）酵素的に機能しうるポリペプチド毒素、および（iii）放射性同位体が挙げられる。
例示的な薬物部分としては、メイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン、トリコテシン、CC1065、カリケアマイシンおよび他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、およびそれらの立体異性体、等配電子体、類似体または誘導体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
ポリペプチド毒素には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖（Vitetta et al（1987）Science, 238:1098）、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-5）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害因子、クルシン、クロチン、シャボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害因子、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類（tricothecenes）（WO93/21232）などがある。
治療用放射性同位体としては、32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212B、212Pb、およびLuの放射性同位体が挙げられる。
放射性同位体または他のラベルは、公知の方法で組み込むことができる（Fraker et al（1978）Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57;「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」Chatal, CRC Press 1989）。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、複合体に放射性核種をコンジュゲートするための例示的キレート剤である（WO94/11026）。
b）ラベル
ハプテン化ポリペプチドは、ハプテン化ラベル部分をさらに含有することができる。ハプテンに共有結合で取り付けることができるラベル部分はどれでも使用することができる（例えばSingh et al（2002）Anal. Biochem. 304: 147-15; Harlow E. and Lane, D.（1999）Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー; Lundblad R. L.（1991）Chemical Reagents for Protein Modification,第2版, CRC Press,フロリダ州ボカラトンを参照されたい）。ラベルは、以下のように機能しうる:（i）検出可能なシグナルを提供する;（ii）第2ラベルと相互作用することで、第1ラベルまたは第2ラベルがもたらす検出可能なシグナルを調整する、例えばFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）を与える;（iii）電荷、疎水性、形状、または他の物理パラメータにより、移動度、例えば電気泳動移動度、または細胞透過性に影響を与える、または（iv）例えばイオン的複合体化を調整するために、捕捉部分を与える。
本明細書において報告するハプテン化ポリペプチドおよびラベルを含有するコンジュゲートは、例えば特別な細胞、組織または血清における関心対象の抗原の発現を検出するためなどといった、診断アッセイに役立ちうる。診断的応用には、第1結合特異性がターゲットに結合し、かつ第2結合特異性がハプテン化ラベルに結合する二重特異性抗体が使用されるであろう。ハプテン化ポリペプチドは、典型的には、検出可能部分で標識されるであろう。数多くのラベルを利用することができ、それらは一般に以下のカテゴリーに分類することができる。
（a）放射性同位体（放射性核種）、例えば3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At、または131Bi。放射性同位体標識コンジュゲートは、受容体を標的とするイメージング実験に有用である。ハプテン化ポリペプチドは、Current Protocols in Immunology（1991）Volumes 1 and 2, Coligenら編, Wiley-Interscience（ニューヨーク州ニューヨーク）刊に記載の技法を使って、放射性同位体金属を結合し、キレートし、または他の形で錯化するリガンド試薬で、さらに標識することができる。金属イオンを錯化しうるキレート配位子として、DOTA、DOTP、DOTMA、DTPAおよびTETA（Macrocyclics,テキサス州ダラス）が挙げられる。放射性核種は、本明細書において報告する複合体との錯化によってターゲティングすることができる（Wu et al, Nature Biotechnology 23（9）（2005）1137-1146）。放射性核種標識複合体による受容体ターゲットイメージングは、腫瘍組織における複合体または対応する治療用抗体の漸進的蓄積の検出および定量によって、経路活性化のマーカーになりうる（Albert et al（1998）Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 1207-1210）。
イメージング実験用のラベルとして好適な金属キレート錯体（US2010/0111856; US5,342,606; US5,428,155; US5,316,757; US5,480,990; US5,462,725; US5,428,139; US5,385,893; US5,739,294; US5,750,660; US5,834,456; Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65（1983）147-157; Meares et al, Anal. Biochem. 142（1984）68-78; Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem. 1（1990）59-65; Meares et al, J. Cancer（1990）, Suppl. 10:21-26; Izard et al, Bioconjugate Chem. 3（1992）346-350; Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22（1995）387-90; Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20（1993）955-62; Kukis et al, J. Nucl. Med. 39（1998）2105-2110; Verel et al, J. Nucl. Med. 44（2003）1663-1670; Camera et al, J. Nucl. Med. 21（1994）640-646; Ruegg et al, Cancer Res. 50（1990）4221-4226; Verel et al, J. Nucl. Med. 44（2003）1663-1670; Lee et al, Cancer Res. 61（2001）4474-4482; Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44（2003）1105-1112; Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10（1999）103-111; Miederer et al, J. Nucl. Med. 45（2004）129-137; DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4（1998）2483-90; Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18（2003）355-363; Nikula et al J. Nucl. Med. 40（1999）166-76; Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39（1998）829-36; Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20（1993）65-74; Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14（1999）209-20）。
（b）蛍光ラベル、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）、フルオレセインタイプ、例えばFITC、5-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン;ローダミンタイプ、例えばTAMRA;ダンシル;リサミン;シアニン類;フィコエリトリン類;テキサスレッド;およびそれらの類似体。蛍光ラベルは、例えばCurrent Protocols in Immunology（前掲）に開示されている技法を使ってポリペプチドにコンジュゲートすることができる。蛍光色素および蛍光ラベル試薬としては、Invitrogen/Molecular Probes（米国オレゴン州ユージーン）およびPierce Biotechnology, Inc.（イリノイ州ロックフォード）から市販されているものが挙げられる。
蛍光色素や化学発光色素などの検出ラベル（Briggs et al「Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids」J. Chem. Soc, Perkin-Trans. 1（1997）1051-1058）は検出可能なシグナルを与え、一般に、とりわけ以下に挙げる性質を持つ標識化に応用することができる:（i）無細胞アッセイでも細胞ベースのアッセイでも、少量のコンジュゲートを高感度に検出することができるように、標識コンジュゲートは非常に高いシグナルを与えると共に、低いバックグラウンドを持つべきであり、また（ii）著しい光退色を起こすことなく、蛍光シグナルを観察し、監視し、かつ記録することができるように、標識コンジュゲートは光安定性を示すべきである。膜または細胞表面、とりわけ生細胞への、標識コンジュゲートの細胞表面結合が関わる応用の場合は、ラベルは（iii）有効なコンジュゲート濃度および検出感度を得るために良好な水溶性を持つべきであり、かつ（iv）細胞の正常な代謝プロセスを乱さず、時期尚早な細胞死も引き起こさないように、生細胞に対して非毒性である。
（c）さまざまな酵素基質ラベルが入手可能であるか、または開示されている（例えばUS4,275,149を参照されたい）。酵素は一般に、さまざまな技法を使って測定することができる発色性基質の化学的変化を触媒する。例えば酵素は、基質の変色を触媒することができ、それは分光光度法で測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させうる。化学発光基質は化学反応によって電子的励起状態になり、次いで光を放出しうるので、その光を（例えばケミルミノメーターを使って）測定することができるか、またはその光が蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。酵素ラベルの例には、ルシフェラーゼ（例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ; US4,737,456）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、（3-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどがある。酵素をポリペプチドにコンジュゲートするための技法は、O'Sullivan et al.「Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay」Methods in Enzym.（J. Langone & IT Van Vunakis編）Academic Press,ニューヨーク, 73（1981）147-166に記載されている。
酵素と基質の組み合わせの例（US4,275,149; US4,318,980）には、例えば以下に挙げるものがある:
（i）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）と、基質としてのハイドロゲンペルオキシダーゼ（hydrogen peroxidase）。ここでは、ハイドロゲンペルオキシダーゼが色素前駆体（例えばオルト-フェニレンジアミン（OPD）または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩（TMB））を酸化する;
（ii）アルカリホスファターゼ（AP）と、発色性基質としてのパラ-ニトロフェニルリン酸;および
（iii）（3-D-ガラクトシダーゼ（（3-D-Gal）と、発色性基質（例えばp-ニトロフェニル-（3-D-ガラクトシダーゼ）または蛍光原基質4-メチルウンベリフェリル-（3-D-ガラクトシダーゼ。
本明細書に報告する標識ハプテン化ポリペプチドは、任意の公知アッセイ法、例えばELISA、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイに使用することができる（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques（1987）pp. 147-158, CRC Press, Inc.）。
本明細書に報告する標識ハプテン化ポリペプチドは、生物医学的分子イメージングのさまざまな方法および技法、例えば（i）MRI（磁気共鳴イメージング）;（ii）MicroCT（コンピュータ断層撮影）;（iii）SPECT（単光子放射型コンピュータ断層撮影）;（iv）PET（陽電子放射断層撮影法）Tinianow, J. et al Nuclear Medicine and Biology, 37（3）（2010）289-297; Chen et al, Bioconjugate Chem. 15（2004）41-49; US2010/0111856;（v）生物発光;（vi）蛍光;および（vii）超音波によるイメージングバイオマーカーおよびプローブとして有用である。イムノシンチグラフィは、放射性物質で標識されたコンジュゲートを動物またはヒト患者に投与し、そのコンジュゲートが局在する身体部位の写真を撮影するイメージング手法である（US6,528,624）。イメージングバイオマーカーは、客観的に測定され、正常な生物学的プロセス、病理学的プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答の指標として評価することができる。バイオマーカーにはいくつかのタイプがあると考えることができる:タイプ0マーカーは、疾患の天然の履歴マーカーであり、公知の臨床的指標、例えば関節リウマチにおける滑膜炎のMRI評価と、長期的に相関する;タイプIマーカーは、作用機序は臨床転帰とは関連しないかもしれないが、作用機序に従って介入の効果を捕捉する;タイプIIマーカーは、代替エンドポイントとして機能し、ここでは、バイオマーカーの変化またはバイオマーカーからのシグナルが臨床上の利益を予測することで、目標とした応答、例えばCTで測定される関節リウマチにおける骨びらんを「検証」する。このようにイメージングバイオマーカーからは、（i）ターゲットタンパク質の発現、（ii）ターゲットタンパク質に対する治療薬の結合、すなわち選択性、ならびに（iii）クリアランスおよび半減期薬物動態データに関する薬力学的（PD）治療情報を得ることができる。検査室ベースのバイオマーカーと比較したインビボイメージングバイオマーカーの利点としては、非侵襲的処置、定量化が可能、全身評価、反復的投薬と評価、すなわち複数時点、および前臨床（小動物）結果から臨床（ヒト）結果へと効果を移行できる可能性が挙げられる。いくつかの応用については、生体イメージングが前臨床試験における動物実験の代わりになり、そのような動物実験の数を最小限に抑える。
ペプチド標識法が周知である。Haugland（2003）Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley（1992）Bioconjugate Chem. 3:2; Garman,（1997）Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means（1990）Bioconjugate Chem. 1 :2; Glazer et al Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology（T. S. Work and E. Work, Eds.）American Elsevier Publishing Co.,ニューヨーク; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M.（1984）Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press,ニューヨーク; Pfieiderer, G.（1985）"Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGruyter,ベルリンおよびニューヨーク;ならびにWong（1991）Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, フロリダ州ボカラトン）; DeLeon-Rodriguez et al, Chem. Eur. J. 10（2004）1149-1155; Lewis et al, Bioconjugate Chem. 12（2001）320-324; Li et al, Bioconjugate Chem. 13（2002）110-115; Mier et al Bioconjugate Chem. 16（2005）240-237を参照されたい。
抗体コンジュゲート
本明細書に報告するコンジュゲート中の抗体は、それ単独で分子の1つでない場合には、治療用作用物質（薬物）、細胞傷害性作用物質（例えばドキソルビシンや百日咳毒素などの毒素）、発蛍光団、例えばフルオレセインやローダミンのような蛍光色素、イメージング用または放射線治療用の金属のためのキレート剤、ペプチジルまたは非ペプチジルラベルまたは検出タグ、あるいはクリアランス調整作用物質、例えばポリエチレングリコールのさまざまな異性体、第3の構成要素に結合するペプチド、または他の糖質もしくは親油性作用物質に、さらにコンジュゲートすることができる。
イムノコンジュゲート
本発明は、本明細書において報告する抗体を含有するイムノコンジュゲート、または1つもしくは複数のポリペプチド毒素、例えば化学療法剤または化学療法薬、増殖阻害性作用物質、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物由来の、酵素活性毒素、またはそれらのフラグメント）、または放射性同位体にコンジュゲートされた本明細書に報告するコンジュゲートも提供する。
一態様では、イムノコンジュゲートが、抗体が1つまたは複数の薬物、例えば限定するわけではないが、メイタンシノイド（US5,208,020、US5,416,064およびEP0 425 235 B1参照）;アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分DEおよびDF（MMAEおよびMMAF）（US5,635,483、US5,780,588、およびUS7,498,298参照）;ドラスタチン;カリケアマイシンまたはその誘導体（US5,712,374、US5,714,586、US5,739,116、US5,767,285、US5,770,701、US5,770,710、US5,773,001、およびUS5,877,296; Hinman, L.M. et al, Cancer Res. 53（1993）3336-3342;およびLode, H.N. et al, Cancer Res. 58（1998）2925-2928参照）;アントラサイクリン、例えばダウノマイシンまたはドキソルビシン（Kratz, F. et al, Curr. Med. Chem. 13（2006）477- 523; Jeffrey, S.C. et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16（2006）358-362; Torgov, M.Y. et al, Bioconjug. Chem. 16（2005）717-721; Nagy, A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97（2000）829-834; Dubowchik, G.M. et al, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12（2002）1529-1532; King, H.D. et al, J. Med. Chem. 45（2002）4336-4343;および米国特許第6,630,579号参照）;メトトレキサート;ビンデシン;タキサン類、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセル;トリコテセン;およびCC1065などにコンジュゲートされている、抗体-薬物コンジュゲート（ADC）である。
別の態様において、イムノコンジュゲートは、酵素活性毒素またはそのフラグメント、例えば限定するわけではないが、次に挙げるものにコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体を含む:ジフテリア毒素A鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖（緑膿菌由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ニガウリ阻害因子、クルシン、クロチン、サボウソウ阻害因子、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類。
別の態様において、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートが形成されるように放射性原子にコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体、または本明細書において報告する複合体を含む。放射性コンジュゲートの生産にはさまざまな放射性同位体を利用することができる。その例として、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、およびLuの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートを検出に使用する場合、それは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばTC99mまたはI123を含むか、核磁気共鳴（NMR）イメージング（磁気共鳴イメージング、MRIとも呼ばれている）用のスピンラベル、例えば、ここでもヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、または鉄を含みうる。
抗体と細胞傷害性作用物質のコンジュゲートは、N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）、スクシンイミジル-4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジプイミデートHCl）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えばビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えばビス-（p-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）などといった、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤を使って作製することができる。例えばリシン免疫毒素は、Vitetta, E.S. et al., Science 238（1987）1098-1104に記載されているように調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、抗体に放射性核種をコンジュゲートするための例示的キレート剤である。WO94/11026参照。リンカーは、細胞における細胞傷害性薬の放出を容易にする「切断可能リンカー」であることができる。例えば酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52（1992）127-131;米国特許第5,208,020号）を使用することができる。
本明細書におけるイムノコンジュゲートまたはADCでは、例えば限定するわけではないが（Pierce Biotechnology, Inc.（米国イリノイ州ロックフォード）などから）市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、およびSVSB（スクシンイミジル-（4-ビニルスルホン）ベンゾエート）などといった架橋試薬を使って調製された上述のコンジュゲートが明示的に考えられるが、それらに限定されるわけではない。
ハプテン化ポリペプチド毒素
本明細書において報告するコンジュゲート中のハプテンは、一態様において、細胞傷害性作用物質、例えばドキソルビシンまたは百日咳毒素などの毒素にコンジュゲートされる。そのようなコンジュゲートをハプテン化ポリペプチド毒素という。コンジュゲーションは、直接的に行うか、介在リンカーを介して行うことができる。
ポリペプチド毒素は、一態様において、酵素的に機能しうるタンパク質毒素である。タンパク質毒素としては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖（緑膿菌由来）、リシンA鎖（Vitetta et al（1987）Science, 238:1098）、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-5）、ツルレイシ阻害因子、クルシン、クロチン、シャボンソウ阻害因子、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類（WO 93/21232）が挙げられる。
ハプテンとポリペプチド毒素との間のコンジュゲートは、N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）、スクシンイミジル-4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジプイミデートHCl）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えばビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えばビス-（p-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）などといった、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤を使って作製することができる。例えばリシン免疫毒素は、Vitetta, E.S. et al., Science 238（1987）1098-1104に記載されているように調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、抗体に放射性核種をコンジュゲートするための例示的キレート剤である。WO 94/11026参照。リンカーは、細胞における細胞傷害性薬の放出を容易にする「切断可能リンカー」であることができる。例えば酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52（1992）127-131;米国特許第5,208,020号）を使用することができる。
一態様では、例えば限定するわけではないが（Pierce Biotechnology, Inc.（米国イリノイ州ロックフォード）などから）市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、およびSVSB（スクシンイミジル-（4-ビニルスルホン）ベンゾエート）などといった架橋試薬を使って、ハプテン化ポリペプチド毒素を作製する。
リンカー
「リンカー」という用語は、ポリペプチドにハプテンをコンジュゲート（連結）するために使用することができる二官能性部分または多官能性部分を表す。ハプテン化ポリペプチドは、ポリペプチドに結合すると共にハプテンにも結合するための反応性官能基を有するリンカーを使って、好都合に調製することができる。
一態様では、リンカーが、ポリペプチド上に存在する求核性基に対して反応性である求電子基を有する反応性部位を有する。例えばシステインチオール基はリンカー上の求電子基と反応性であり、リンカーへの共有結合を形成する。有用な求電子基として、別のチオール、マレイミド基およびハロアセトアミド（例えばKlussman et al, Bioconjugate Chemistry 15（4）（2004）765-773の766頁のコンジュゲーション法を参照されたい）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
チオール反応官能基の例としては、チオール、マレイミド、アルファ-ハロアセチル、活性化エステル、例えばスクシンイミドエステル、4-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
リンカーは、ハプテンをポリペプチドに連結するアミノ酸残基を含みうる。これらのアミノ酸残基は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド、またはドデカペプチド単位を形成しうる。アミノ酸残基としては、天然のアミノ酸残基、ならびに非天然のアミノ酸類似体、例えばシトルリン、またはβ-アミノ酸、例えばβ-アラニン、またはω-アミノ酸、例えば4-アミノ-酪酸が挙げられる。
別の態様では、リンカーが、ハプテン上に存在する求電子基との反応性に富む求核基を有する反応性官能基を有する。有用な求電子基として、アルデヒド基およびケトンカルボニル基が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。リンカーの求核基のヘテロ原子は、ハプテンまたはポリペプチド上の求電子基と反応して、ハプテンまたはポリペプチドへの共有結合を形成することができる。リンカー上の有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ハプテン上の求電子基は、リンカーを取り付けるための便利な部位になる。
ペプチドタイプのリンカーは、典型的には、2つ以上のアミノ酸および/またはペプチドフラグメントの間にペプチド結合を形成させることによって調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えばペプチド化学の分野において周知の液相合成法（E. Schroder and K. Lubke「The Peptide」volume 1（1965）76-136, Academic Press）に従って調製することができる。
別の態様では、可溶性または反応性を調整する基で、リンカーを置換することができる。例えば、スルホネート（SO3 -）またはアンモニウムなどの荷電置換基、またはPEGなどのポリマーは、試薬の水溶性を増加させ、リンカー試薬とハプテンまたはポリペプチドとのカップリング反応を容易にするか、または使用する合成経路に応じたカップリング反応を容易にする。
本明細書において報告するハプテンやポリペプチドを含むコンジュゲートでは、以下のリンカー試薬を使って調製される複合体が明示的に考えられるが、それらに限定されるわけではない: BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、およびSVSB（スクシンイミジル-（4-ビニルスルホン）ベンゾエート）、ならびにビス-マレイミド試薬: DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM（PEO）3、およびBM（PEO）4（これらはPierce Biotechnology, Inc.から市販されている）。ビス-マレイミド試薬は、例えばチオール基を、チオール含有薬物部分、ラベル、またはリンカー中間体に、逐次的にまたは同時進行的に取り付けることを可能にする。例えばチオール基との反応性に富むマレイミド以外の他の官能基としては、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。
例示的なリンカーとして、マレイミドストレッチャー（stretcher）およびパラ-アミノベンジルカルバモイル（PAB）自壊性（self-immolative）スペーサーを有するバリン-シトルリン（val-citまたはvc）ジペプチドリンカー試薬、ならびにマレイミドストレッチャーユニットおよびp-アミノベンジル自壊性スペーサーを有するphe-lys（Mtr）ジペプチドリンカー試薬が挙げられる。
システインチオール基は、求核性であり、リンカー試薬およびハプテン化化合物上の求電子基、例えば（i）活性エステル、例えばNHSエステル、HOBtエステル、ハロホルメート、および酸ハライド;（ii）アルキルハライドおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド;（iii）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基;ならびに（iv）スルフィド交換によるジスルフィド、例えばピリジルジスルフィドなどと反応して共有結合を形成する能力を有する。ハプテン化化合物上の求核基としては、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成する能力を有するアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
III.核酸
本明細書において報告する抗体のアミノ酸配列の変異体、または本明細書に報告するコンジュゲートに含まれる化合物のアミノ酸配列の変異体をコードするDNAは、当技術分野において公知のさまざまな方法によって調製することができる。これらの方法としては、部位指定（またはオリゴヌクレオチド媒介）突然変異導入法、PCR突然変異導入法、および以前に調製されたポリペプチドをコードするDNAのカセット突然変異導入法が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。組換え抗体の変異体は、制限フラグメント操作によって、または合成オリゴヌクレオチドを使ったオーバーラップ伸長PCRによって、構築することもできる。突然変異原プライマーはシステインコドン置換をコードする。標準的な突然変異導入技法を使用して、そのような修飾改変抗体をコードするDNAを生成させることができる。一般的指針は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー, 1989;およびAusubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience,ニューヨーク州ニューヨーク, 1993に見いだすことができる。
IV.発現および精製
ポリペプチドおよび抗体は、例えばUS4,816,567に記載されている組換え法および組成物を使って生産することができる。一態様では、本明細書に記載するポリペプチドおよび抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列（例えば抗体の軽鎖および/または重鎖）またはポリペプチドのアミノ酸配列をコードしうる。さらなる態様では、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。
一つの態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような態様の1つでは、宿主細胞が（1）抗体のVLを含むアミノ酸配列と抗体のVHを含むアミノ酸配列とをコードする核酸を含むベクター、または（2）抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1ベクターと、抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2ベクターとを含む（例えばそれらのベクターで形質転換されている）。一態様では、宿主細胞が真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ球系細胞（例えばY0、NS0、Sp20細胞）である。一態様では、抗体を作製する方法であって、上に規定した抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養すること、および任意で、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む方法が提供される。
本明細書において報告する抗体の組換え生産のために、抗体をコードする核酸、例えば上述のものを単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または発現のために1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手法を使って（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定することができる。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば抗体は、グリコシル化とFcエフェクター機能とが必要ない場合は特に、細菌中で生産することができる。細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えばUS5,648,237、US5,789,199、およびUS5,840,523を参照されたい（大腸菌における抗体フラグメントの発現を記載しているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology、Vol. 248, Lo, B.K.C.編, Humana Press,ニュージャージー州トトワ（2003）, pp.245-254も参照されたい）。発現後に、抗体を細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離して、さらに精製することができる。
原核生物だけでなく、糸状菌や酵母などの真核微生物も、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて部分的または完全にヒトのグリコシル化パターンを持つ抗体の生産をもたらす真菌株および酵母株を含めて、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22（2004）1409-1414、およびLi, H. et al., Nat. Biotech. 24（2006）210-215を参照されたい。
グリコシル化された抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎生物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎生物細胞の例として、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と一緒に使用することができる（特にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションに使用することができる）バキュロウイルス株は、数多く同定されている。
植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、および同第6,417,429号（トランスジェニック植物中で抗体を生産するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）を参照されたい。
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁培養に適応した哺乳動物細胞株は役立ちうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胎児腎臓株（Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36（1977）59-74に記載の293または293細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）、マウスセルトリ細胞（Mather, J.P., Biol. Reprod. 23（1980）243-252に記載のTM4細胞）、サル腎臓細胞（CV1）、アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76）、ヒト子宮頸癌細胞（HELA）、イヌ腎臓細胞（MDCK、バッファローラット肝臓細胞（BRL3A）、ヒト肺細胞（W138）、ヒト肝臓細胞（Hep G2）、マウス乳房腫瘍（MMT060562）、例えばMather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383（1982）44-68に記載のTRI細胞、MRC5細胞、およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR- CHO細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77（1980）4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株などがある。抗体生産に適した一定の哺乳動物宿主細胞株を概観するには、例えばYazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.編, Humana Press,ニュージャージー州トトワ（2004）pp.255-268を参照されたい。
V.薬学的製剤
本明細書において報告するコンジュゲートを含む薬学的製剤は、望ましい純度を有するそのようなコンジュゲートを1つまたは複数の随意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版, Osol, A.編（1980））と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度において受容者にとって一般に無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン;保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール）;低分子量（約10残基未満）のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;単糖、二糖、および他の糖質、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体（例えばZn-タンパク質錯体）;および/または非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）などがあるが、それらに限定されるわけではない。本明細書における、例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、間質薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）、例えばヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrhuPH20（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）が含まれる。rhuPH20を含む一定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は、US2005/0260186ならびにUS2006/0104968に記載されている。一局面では、sHASEGPが、1つまたは複数の追加グリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと併用される。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、US6,267,958に記載されている。水性抗体製剤としては、US6,171,586およびWO2006/044908に記載されているものが挙げられ、後者の製剤はヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。
本明細書における製剤は、処置される特定適応症の必要に応じて、2つ以上の活性成分、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含有しうる。そのような活性成分は、適宜、意図した目的に有効な量で組み合わせされて存在する。
活性成分は、例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入するか、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）に封入するか、またはマクロエマルションに封入することができる。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版, Osol, A.編（1980）に開示されている。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、抗体またはコンジュゲートを含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、マトリックスがフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態にあるものが挙げられる。
インビボ投与に使用される製剤は一般に滅菌状態にある。滅菌性は例えば滅菌濾過膜による濾過などによって容易に達成することができる。
VI.治療方法および治療組成物
本明細書に報告するコンジュゲートはいずれも治療方法に使用することができる。
一局面では、医薬として使用するための、本明細書に報告するコンジュゲートが提供される。さらなる局面では、疾患の処置において使用するための本明細書に報告するコンジュゲートが提供される。一定の態様では、処置方法において使用するための本明細書に報告するコンジュゲートが提供される。一定の態様において、本発明は、個体に有効量の本明細書に報告するコンジュゲートを投与する工程を含む、個体を処置する方法において使用するための、本明細書に報告するコンジュゲートを提供する。そのような態様の1つにおいて、本方法はさらに、個体に有効量の少なくとも1つの追加治療剤、例えば後述するものを投与することを含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。
さらなる局面において、本発明は、医薬の製造または調製における本明細書に報告するコンジュゲートの使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患を処置するための医薬である。さらなる一態様では、医薬は、疾患を有する個体に有効量の該医薬を投与する工程を含む疾患の処置方法において使用するための医薬である。そのような態様の1つにおいて、本方法はさらに、個体に、有効量の少なくとも1つの追加治療剤、例えば後述するものを投与する工程を含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。
さらなる一局面において、本発明は、疾患を処置するための方法を提供する。一態様では、本方法は、そのような疾患を有する個体に有効量の本明細書に報告するコンジュゲートを投与する工程を含む。そのような態様の1つでは、本方法はさらに、有効量の少なくとも1つの追加治療剤、例えば後述するものを、個体に投与する工程を含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。
さらなる局面において、本発明は、例えば上記の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に報告するコンジュゲートのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一態様では、薬学的製剤は、本明細書に報告するコンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様では、薬学的組成物は、本明細書に報告するコンジュゲートのいずれかと、少なくとも1つの追加治療剤、例えば後述するものとを含む。
本明細書に報告するコンジュゲートは、単独で、または他の作用物質と組み合わせて、治療に使用することができる。例えば本明細書に報告するコンジュゲートは、少なくとも1つの追加治療剤と同時投与することができる。
上記の併用治療には、併用投与（この場合は2つ以上の治療剤が同じ製剤または別個の製剤に含まれている）、および個別投与（この場合は、本発明の抗体の投与を、追加治療剤および/またはアジュバントの投与の前に、同時に、および/または後に、行うことができる）が包含される。本明細書に報告するコンジュゲートは放射線療法と併用することもできる。
本明細書に報告するコンジュゲート（および任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与、および鼻腔内投与、そして局所処置にとって望ましい場合は、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短期間であるか慢性的であるかにも一部依存して、任意の適切な経路で、例えば静脈内注射または皮下注射などの注射によって、行うことができる。限定するわけではないが、単回投与、またはさまざまな時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含む、さまざまな投薬スケジュールが、本明細書では考えられる。
本明細書に報告するコンジュゲートは、優良医療規範（good medical practice）に合致する方法で、製剤化され、調合され、投与されるであろう。この文脈において考慮すべき因子には、処置される特定障害、処置される特定哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および医療従事者に公知の他の因子が含まれる。コンジュゲートは、問題の障害を防止または処置するために現在使用されている1つまたは複数の作用物質と共に製剤化する必要はないが、任意でそのようにしてもよい。そのような他の作用物質の有効量は、製剤中に存在するコンジュゲートの量、障害または処置のタイプ、および上で述べた他の因子に依存する。これらは、一般に、上述したものと同じ投薬量および投与経路で使用されるか、本明細書に記載する投薬量の約1〜99％で、または実験的/臨床的に適当であると決定された任意の投薬量および任意の経路で使用される。
疾患の防止または処置に関して、本明細書に報告するコンジュゲートの適当な投薬量（単独で使用する場合、または1つもしくは複数の他の追加治療剤と併用する場合）は、処置すべき疾患のタイプ、コンジュゲートのタイプ、疾患の重症度および経過、コンジュゲートを防止のために投与するか治療のために投与するか、治療歴、患者の病歴およびコンジュゲートに対する応答、ならびに担当医の裁量に依存するであろう。コンジュゲートは、患者に1回で、または一連の処置で、適切に投与される。疾患のタイプおよび重症度に依存して、例えば1回または複数回の独立した投与によるか、または持続注入によるかを問わず、約1μg/kg〜15mg/kg（例えば0.5mg/kg〜10mg/kg）のコンジュゲートを、患者に投与するための初回候補投薬量とすることができる。典型的な1日量は、上述の因子に依存して約1μg/kgから100mg/kgまで、またはそれ以上に及ぶかもしれない。数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依存して、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、維持されるであろう。コンジュゲートの例示的投薬量の1つは約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲にあるだろう。したがって約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kgまたは10mg/kg（またはそれらの任意の組み合わせ）の1つまたは複数の用量を患者に投与することができる。そのような用量は（例えば患者がコンジュゲートの投与を約2回〜約20回、例えば約6回受けることになるように）間欠的に、例えば毎週または3週ごとに投与することができる。高用量の初回負荷量を投与した後、それより低い用量を1回または複数回投与することができる。ただし他の投薬レジメンも役立ちうる。この治療の進行は、従来の技法およびアッセイによって容易に監視される。
上記の製剤または治療方法はいずれも、本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートの代わりに、または本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使って行うこともできると理解される。
VII.製造品
本発明の別の局面では、上述の障害の処置、防止および/または診断に有用な材料が入っている製造品が提供される。製造品は、容器、および容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器として、例えば瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、さまざまな素材で形成されうる。容器は、組成物を単独で、または当該状態を処置、防止および/または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば容器は静脈内溶液バッグであるか、皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも1つの活性作用物質は本明細書に報告する抗体または複合体である。ラベルまたは添付文書は、当該組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。さらにまた、本製造品は、（a）本明細書に報告する抗体または複合体を含む組成物が入っている第1容器と、（b）さらなる細胞傷害性作用物質または他の治療剤を含む組成物が入っている第2容器とを含みうる。本発明のこの態様の製造品は、さらに、特定の状態を処置するために当該組成物を使用できることを示す添付文書を含みうる。これに代えて、またはこれに加えて、本製造品はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えば静菌性注射用水（BWFI）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などを含む第2（または第3）の容器を含みうる。これは、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料、例えば他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジなどを、さらに含みうる。
VIII.具体的態様
1.ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体との（共有結合的）コンジュゲートであって、ジスルフィド結合が、ハプテンコンジュゲーションに使用されるポリペプチドのリジン残基の前または後のいずれかにあるシステイン残基と、該抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のシステイン残基との間に形成されている、（共有結合的）コンジュゲート。
2.システイン残基が、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の1〜3残基前または1〜3残基後にある、項目1記載のコンジュゲート。
3.ポリペプチドがポリペプチド毒素である、項目1〜2のいずれか一項記載のコンジュゲート。
4.前記CDR2が重鎖CDR2である、項目1〜3のいずれか一項記載のコンジュゲート。
5.ポリペプチド毒素がリジン残基でハプテンにコンジュゲートされているハプテン化ポリペプチド毒素と抗ハプテン抗体とを含む（共有結合的）コンジュゲートであって、
ハプテン化ポリペプチド毒素が、ジスルフィド結合によって抗ハプテン抗体にコンジュゲートされており、
ジスルフィド結合が、
i）ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の1残基もしくは2残基前または1残基もしくは2残基後のいずれかにあるハプテン化ポリペプチド毒素のシステイン残基
と、
ii）該抗体のKabatに従って決定される重鎖CDR2中のシステイン残基
との間に形成されている、（共有結合的）コンジュゲート。
6.ポリペプチドがそのアミノ酸配列中に厳密に1つのリジン残基を含む、項目1〜5のいずれか一項記載のコンジュゲート。
7.ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体との（共有結合的）コンジュゲートであって、ジスルフィド結合が、ポリペプチド中のシステイン残基と、抗体のKabatに従って決定される重鎖CDR2中のシステイン残基との間に形成されており、ポリペプチドがそのアミノ酸配列中に厳密に1つのリジン残基を含む、（共有結合的）コンジュゲート。
8.システイン残基が、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の2残基前（すなわちリジン残基に対して位置N-2）または2残基後（すなわちリジン残基に対して位置N＋2）にある、項目1〜7のいずれか一項記載のコンジュゲート。
9.ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基が、前記ポリペプチドのN末端アミノ酸の10残基内にある、項目1〜8のいずれか一項記載のコンジュゲート。
10.抗ハプテン抗体がハプテン化ポリペプチドのハプテンに特異的に結合する（抗ハプテン抗体）、項目1〜9のいずれか一項記載のコンジュゲート。
11.ハプテン化ポリペプチドが、ハプテン、リンカー、およびポリペプチドを含む、項目1〜10のいずれか一項記載のコンジュゲート。
12.ポリペプチドが、カルボキシメチル基またはカプロン酸スペーサーを介してハプテンにコンジュゲートされている、項目1〜10のいずれか一項記載のコンジュゲート。
13.前記抗体のCDR2中のシステイン残基のアルファ炭素原子が、ハプテンがコンジュゲートされているポリペプチドのリジン残基の原子から約10〜11オングストローム離れている（ハプテンは、ポリペプチドに直接コンジュゲートされているか、リンカーを介してコンジュゲートされている）、項目1〜12のいずれか一項記載のコンジュゲート。
14.ポリペプチドがさらにペイロードにコンジュゲートされている、項目1〜13のいずれか一項記載のコンジュゲート。
15.ポリペプチド毒素がPE25である、項目1〜14のいずれか一項記載のコンジュゲート。
16.ポリペプチド毒素がヒト化（脱免疫化）PE25変異体である、項目1〜14のいずれか一項記載のコンジュゲート。
17.前記抗体の重鎖CDR2中のシステイン残基が、Kabatの重鎖可変ドメインナンバリングに従う位置52、または位置52a、または位置52b、または位置52c、または位置52d、または位置53にある、項目1〜16のいずれか一項記載のコンジュゲート。
18.前記抗体の重鎖CDR2中のシステイン残基が、Kabatの重鎖可変ドメインナンバリングに従う位置52a、または位置52b、または位置52c、または位置53にある、項目1〜17のいずれか一項記載のコンジュゲート。
19.前記抗体の重鎖CDR2中のシステイン残基が、Kabatの重鎖可変ドメインナンバリングに従う位置52bまたは位置53にある、項目1〜18のいずれか一項記載のコンジュゲート。
20.前記抗体が、非ハプテン抗原に対する第1結合特異性とハプテンに対する第2結合特異性とを含む二重特異性抗体である、項目1〜19のいずれか一項記載のコンジュゲート。
21.ハプテン化ポリペプチド毒素と二重特異性抗体とを含む（共有結合的）コンジュゲートであって、
二重特異性抗体が、非ハプテン抗原に対する第1結合特異性と、ハプテンに対する第2結合特異性とを含み、
ポリペプチド毒素が、リジン残基においてハプテンにコンジュゲートされており、
ハプテン化ポリペプチド毒素が、ジスルフィド結合によって抗ハプテン抗体にコンジュゲートされており、
ジスルフィド結合が、
i）ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の2残基前または2残基後にあるハプテン化ポリペプチド毒素のシステイン残基
と、
ii）該抗体のKabatに従って決定される重鎖CDR2中の位置52bまたは位置53にあるシステイン残基
との間に形成されている、（共有結合的）コンジュゲート。
22.抗体分子のハプテン化ポリペプチド分子に対する化学量論比（抗体:ハプテン化ポリペプチド）が、1:1または1:2または2:1または2:2または2:4および4:2である、項目1〜21のいずれか一項記載のコンジュゲート。
23.非ハプテン抗原が細胞表面抗原である、項目1〜22のいずれか一項記載のコンジュゲート。
24.細胞表面抗原が腫瘍関連抗原である、項目23記載のコンジュゲート。
25.二重特異性抗体が完全長抗体である、項目1〜24のいずれか一項記載のコンジュゲート。
26.二重特異性抗体の一方の重鎖がホール突然変異を含み、それぞれの他方の鎖がノブ突然変異を含む、項目25記載のコンジュゲート。
27.二重特異性抗体が、各C末端にscFvまたはscFabが直接的にまたはペプチドリンカーを介して融合されている完全長抗体である、項目1〜26のいずれか一項記載のコンジュゲート。
28.前記抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、項目1〜27のいずれか一項記載のコンジュゲート。
29.前記抗体の定常領域がIgGlサブクラスまたはIgG4サブクラスのものである、項目1〜28のいずれか一項記載のコンジュゲート。
30.前記抗体が、KabatのEUインデックスによるナンバリングに従う位置234および位置235にアラニン、そして位置329にグリシンを持つ、IgG1サブクラスの定常領域を有する、項目1〜29のいずれか一項記載のコンジュゲート。
31.前記抗体が、KabatのEUインデックスによるナンバリングに従う位置228にプロリン、位置235にグルタミン酸、そして位置329にグリシンを持つIgG4クラスの定常領域を有する、項目1〜29のいずれか一項記載のコンジュゲート。
32.1つの重鎖CDR2につき厳密に1つのジスルフィド結合を含む、項目1〜31のいずれか一項記載のコンジュゲート。
33.ジスルフィド結合が、酸化還元活性作用物質を添加することなく形成される、項目1〜32のいずれか一項記載のコンジュゲート。
34.ハプテンがリンカーを介してポリペプチドにコンジュゲートされている、項目1〜33のいずれか一項記載のコンジュゲート。
35.リンカーが非ペプチドリンカーである、項目34記載のコンジュゲート。
36.ハプテンが、ビオチン、またはテオフィリン、またはジゴキシゲニン、またはカルボラン、またはフルオレセイン、またはブロモデオキシウリジンである、項目1〜35のいずれか一項記載のコンジュゲート。
37.抗ジゴキシゲニン抗体が、（a）SEQ ID NO:09またはSEQ ID NO:25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（b）SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、（c）SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、（d）SEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（e）SEQ ID NO:14またはSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（f）SEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
38.抗ビオチン抗体が、（a）SEQ ID NO:41またはSEQ ID NO:57のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（b）SEQ ID NO:42またはSEQ ID NO:58のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、（c）SEQ ID NO:43またはSEQ ID NO:59のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、（d）SEQ ID NO:45またはSEQ ID NO:61のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（e）SEQ ID NO:46またはSEQ ID NO:62のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（f）SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:64のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
39.抗フルオレセイン抗体が、（a）SEQ ID NO:105またはSEQ ID NO:113のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（b）SEQ ID NO:106またはSEQ ID NO:114のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、（c）SEQ ID NO:107またはSEQ ID NO:115のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、（d）SEQ ID NO:109またはSEQ ID NO:117のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（e）SEQ ID NO:110またはSEQ ID NO:118のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（f）SEQ ID NO:111またはSEQ ID NO:119のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
40.抗テオフィリン抗体が、（a）SEQ ID NO:73またはSEQ ID NO:89のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（b）SEQ ID NO:74またはSEQ ID NO:90のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、（c）SEQ ID NO:75またはSEQ ID NO:91のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、（d）SEQ ID NO:77またはSEQ ID NO:93のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（e）SEQ ID NO:78またはSEQ ID NO:94のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（f）SEQ ID NO:79またはSEQ ID NO:95のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
41.抗ジゴキシゲニン抗体が、
（a）（i）SEQ ID NO:09またはSEQ ID NO:25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および（iii）SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含むVHドメイン、および
（b）（i）SEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:14またはSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（c）SEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含むVLドメイン
を含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
42.抗ビオチン抗体が、
（a）（i）SEQ ID NO:41またはSEQ ID NO:57のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:42またはSEQ ID NO:58のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および（iii）SEQ ID NO:43またはSEQ ID NO:59のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含むVHドメイン、および
（b）（i）SEQ ID NO:45またはSEQ ID NO:61のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:46またはSEQ ID NO:6242のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（c）SEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:63のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含むVLドメイン
を含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
43.抗フルオレセイン抗体が、
（a）（i）SEQ ID NO:105またはSEQ ID NO:113のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:106またはSEQ ID NO:114のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および（iii）SEQ ID NO:107またはSEQ ID NO:115のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含むVHドメイン、および
（b）（i）SEQ ID NO:109またはSEQ ID NO:117のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:110またはSEQ ID NO:118のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（c）SEQ ID NO:111またはSEQ ID NO:119のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含むVLドメイン
を含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
44.抗テオフィリン抗体が、
（a）（i）SEQ ID NO:73またはSEQ ID NO:89のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:74またはSEQ ID NO:90のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および（iii）SEQ ID NO:75またはSEQ ID NO:91のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含むVHドメイン、および
（b）（i）SEQ ID NO:77またはSEQ ID NO:93のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、（ii）SEQ ID NO:78またはSEQ ID NO:94のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および（c）SEQ ID NO:79またはSEQ ID NO:95のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含むVLドメイン
を含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
45.抗ジゴキシゲニン抗体、および/または抗ビオチン抗体、および/または抗テオフィリン抗体が、ヒト化抗体である、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
46.抗ジゴキシゲニン抗体が、上記の項目のいずれかに記載のCDRを含み、さらにアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
47.抗ビオチン抗体が、上記の項目のいずれかに記載のCDRを含み、さらにアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
48.抗テオフィリン抗体が、上記の項目のいずれかに記載のCDRを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
49.抗ジゴキシゲニン抗体が、SEQ ID NO:04またはSEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:28のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）配列を含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
50.少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列との比較で置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、当該配列を含む抗ジゴキシゲニン抗体は、ジゴキシゲニンに結合する能力を保っている、項目49記載のコンジュゲート。
51. SEQ ID NO:01またはSEQ ID NO:09またはSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:25において、合計1〜10個のアミノ酸が置換され、挿入され、かつ/または欠失している、項目49〜50のいずれか一項記載のコンジュゲート。
52.置換、挿入、または欠失が、CDR外の領域（すなわちFR中）に存在する、項目49〜51のいずれか一項記載のコンジュゲート。任意で、抗ジゴキシゲニン抗体は、SEQ ID NO:01またはSEQ ID NO:09またはSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:25のVH配列（当該配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
53.抗ジゴキシゲニン抗体が、SEQ ID NO:08またはSEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:32のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（VL）を含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
54.少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVL配列は、参照配列との比較で置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、当該配列を含む抗ジゴキシゲニン抗体は、ジゴキシゲニンに結合する能力を保っている、項目53記載のコンジュゲート。
55. SEQ ID NO:08またはSEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:32において、合計1〜10個のアミノ酸が置換され、挿入され、かつ/または欠失している、項目53〜54のいずれか一項記載のコンジュゲート。一定の項目において、置換、挿入、または欠失は、CDR外の領域（すなわちFR中）に存在する。
56.抗ジゴキシゲニン抗体が、SEQ ID NO:08またはSEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:32のVL配列（当該配列の翻訳後修飾を含む）を含む、項目53〜55のいずれか一項記載のコンジュゲート。
57.抗ビオチン抗体が、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:44またはSEQ ID NO:52またはSEQ ID NO:60のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）配列を含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
58.少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列との比較で置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、当該配列を含む抗ビオチン抗体はビオチンに結合する能力を保っている、項目57記載のコンジュゲート。
59.SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:44またはSEQ ID NO:52またはSEQ ID NO:60において、合計1〜10個のアミノ酸が置換され、挿入され、かつ/または欠失している、項目57〜58のいずれか一項記載のコンジュゲート。
60.置換、挿入、または欠失が、CDR外の領域（すなわちFR中）に存在する、項目57〜59のいずれか一項記載のコンジュゲート。
61.抗ビオチン抗体が、SEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:44またはSEQ ID NO:52またはSEQ ID NO:60のVH配列（当該配列の翻訳後修飾を含む）を含む、項目57〜60のいずれか一項記載のコンジュゲート。
62.抗フルオレセイン抗体が、SEQ ID NO:108またはSEQ ID NO:116のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）配列を含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
63.少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列との比較で置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、当該配列を含む抗フルオレセイン抗体はフルオレセインに結合する能力を保っている、項目62記載のコンジュゲート。
64. SEQ ID NO:108またはSEQ ID NO:116において、合計1〜10個のアミノ酸が置換され、挿入され、かつ/または欠失している、項目62〜63のいずれか一項記載のコンジュゲート。
65.置換、挿入、または欠失が、CDR外の領域（すなわちFR中）に存在する、項目62〜64のいずれか一項記載のコンジュゲート。
66.抗フルオレセイン抗体が、SEQ ID NO:108またはSEQ ID NO:116のVH配列（当該配列の翻訳後修飾を含む）を含む、項目62〜65のいずれか一項記載のコンジュゲート。
67.抗テオフィリン抗体が、SEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:84またはSEQ ID NO:92のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）配列を含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
68.少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列との比較で置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、当該配列を含む抗テオフィリン抗体はテオフィリンに結合する能力を保っている、項目67記載のコンジュゲート。
69. SEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:84またはSEQ ID NO:92において、合計1〜10個のアミノ酸が置換され、挿入され、かつ/または欠失している、項目67〜68のいずれか一項記載のコンジュゲート。
70.置換、挿入、または欠失が、CDR外の領域（すなわちFR中）に存在する、項目67〜69のいずれか一項記載のコンジュゲート。
71.抗テオフィリン抗体がSEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:84またはSEQ ID NO:92のVH配列（当該配列の翻訳後修飾を含む）を含む、項目67〜70のいずれか一項記載のコンジュゲート。
72.抗ジゴキシゲニン抗体が、上述の項目のいずれかに記載のVHと上述の項目のいずれかに記載のVLとを含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
73.前記抗体が、それぞれSEQ ID NO:04またはSEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:28、およびSEQ ID NO:08またはSEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:24またはSEQ ID NO:32のVH配列およびVL配列（これらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む、項目72記載のコンジュゲート。
74.抗ビオチン抗体が、上述の項目のいずれかに記載のVHと上述の項目のいずれかに記載のVLとを含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
75.前記抗体が、それぞれSEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:44またはSEQ ID NO:52またはSEQ ID NO:60、およびSEQ ID NO:40またはSEQ ID NO:48またはSEQ ID NO:56またはSEQ ID NO:64のVH配列およびVL配列（これらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む、項目74記載のコンジュゲート。
76.抗フルオレセイン抗体が、上述の項目のいずれかに記載のVHと上述の項目のいずれかに記載のVLとを含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
77.前記抗体が、それぞれSEQ ID NO:108またはSEQ ID NO:116、およびSEQ ID NO:112またはSEQ ID NO:120のVH配列およびVL配列（これらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む、項目76記載のコンジュゲート。
78.抗テオフィリン抗体が、上述の項目のいずれかに記載のVHと上述の項目のいずれかに記載のVLとを含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
79.前記抗体が、それぞれSEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:84またはSEQ ID NO:92、およびSEQ ID NO:72またはSEQ ID NO:80またはSEQ ID NO:88またはSEQ ID NO:96のVH配列およびVL配列（これらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む、項目78記載のコンジュゲート。
80.項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤。
81.医薬として使用するための、項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲート。
82.がんを処置するための、項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲート。
83.ウイルス性疾患を処置するための、項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲート。
84.医薬の製造における、項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲートの使用。
85.ポリペプチドの安定性を増加させるための、項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲートの使用。
86.ポリペプチドのオフターゲット毒性効果を低減するかまたは排除するための、項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲートの使用。
87.ポリペプチドの活性を増加させるための、項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲートの使用。
88.ポリペプチドのインビボ半減期を増加させるための、項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲートの使用。
89.疾患の処置における、項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲートの使用。
90.有効量の項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲートを個体に投与する工程を含む、疾患を有する個体を処置する方法。
91.有効量の項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲートを個体に投与する工程を含む、個体の疾患を処置する方法。
92.疾患ががんである、項目91記載の方法。
93.抗体の人為的システイン残基のアルファ炭素原子が、リンカーが融合されているポリペプチドの原子から約10〜11オングストローム離れている、抗体の人為的システイン残基を含む抗体と、人為的ポリペプチドシステイン残基を含むハプテン化ポリペプチドとの組み合わせを含む項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲートを生産する方法。
94.項目1〜79のいずれか一項記載のコンジュゲートを生産する方法であって、以下の工程を含む方法:
・ハプテンに特異的に結合しかつCDR2中に抗体の人為的システイン残基を有する抗体を、人為的ポリペプチドシステイン残基を含むハプテン化ポリペプチドと、溶液中で混和する工程、および
・溶液からコンジュゲートを回収する工程。
95.ハプテン化化合物をターゲット細胞に標的送達するための二重特異性抗体であって、ハプテン化ポリペプチドに特異的に結合する第1結合部位と該細胞の細胞表面マーカーに特異的に結合する第2結合特異性とを含む、二重特異性抗体。
96.ジスルフィド結合が、ハプテンコンジュゲーションに使用されるポリペプチドのリジン残基の前または後のいずれかにあるシステイン残基と、抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のシステイン残基との間に形成される、項目95記載の二重特異性抗体。
97.システイン残基が、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の1〜3残基前または1〜3残基後にある、項目95〜96のいずれか一項記載の二重特異性抗体。この態様において、システイン残基は、該リジン残基に対して位置N-3、N-2、N-1、N＋1、N＋2またはN＋3のいずれかにある。
98.システイン残基が、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の2残基前（すなわちリジン残基に対して位置N-2）または2残基後（すなわちリジン残基に対して位置N＋2）にある、項目95〜97のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
99.ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基が、前記ポリペプチドのN末端アミノ酸の10残基内にある、項目95〜98のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
100.ポリペプチドがそのアミノ酸配列中に厳密に1つのリジン残基を含む、項目95〜99のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
本明細書において言及する全ての文献の開示は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の理解を助けるために、以下に実施例、図および配列を提供するが、本発明の真の範囲は、本願特許請求の範囲に記載するとおりである。記載する手法に、本発明の要旨から逸脱することなく、変更を加えうることはいうまでもない。
実施例において使用するハプテン化化合物の合成は、PCT/EP2013/064100およびWO 2012/093068に報告されている。
実施例1
ジゴキシゲニン存在下でのマウス抗ジゴキシゲニンFv領域の結合領域およびビオチン存在下でのマウス抗ビオチンFv領域の結合領域の結晶化およびX線構造決定
ジゴキシゲニン結合性抗体のFabフラグメントの構造の決定は、WO 2011/003557およびWO 2011/003780に詳述されており、Metz, S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108（2011）8194-8199にも公表されている（3RA7）。
マウス抗ビオチン抗体の構造を決定した。そのために、周知の最新方法（パパイン消化）を応用して、精製IgGのプロテアーゼ消化によってFabフラグメントを生成させ、次にそれを精製した。
結晶化のために、20mM His-HCl、140mM NaCl、pH6.0中のアポFabフラグメント（精製Fab）を13mg/mlまで濃縮した。蒸気拡散シッティングドロップ法で、0.2μlのタンパク質溶液を0.2μLのリザバー溶液と混合することにより、結晶化液滴を21℃に設定した。0.1M Tris pH8.5、0.01M塩化コバルト、20％ポリビニルピロリドンK15から5日以内に結晶が現れ、8日以内に0.3mm×0.06mm×0.03mmの最終サイズまで成長した。
15％グリセロールを凍結保護物質として結晶を採取した後、液体N2で瞬間凍結した。回折像は、Swiss Light SourceのビームラインX10SAにおいて、100Kの温度で、Pilatus 6M検出器を使って収集し、プログラムXDS（Kabsch, W., J. Appl. Cryst. 26（1993）795-800）で処理し、SCALA（BRUKER AXSから入手）でスケーリングすることで、2.22Å分解能までのデータを得た。このFabフラグメント結晶は単斜晶系空間群P21に属し、格子定数はa＝90.23Å、b＝118.45Å、c＝96.79Åおよびβ＝117.53°で、結晶学的非対称単位あたり4つのFab分子を含有する（表3参照）。
CCP4ソフトウェアスイートからの標準的結晶学プログラムを使って、PDBエントリ3PQPを探索モデルとする分子置換法で構造を解き、電子密度を計算し、X線構造を精密化した（CCP4, Collaborative Computational Project, Acta Crystallogr. D, 760-763（1994））。COOTを使って構造モデルを電子密度に合わせた（Emsley, P., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60（2010）486-501）。REFMAC5（Murshudov, G.N., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53（1997）240-55）およびautoBUSTER（Global Phasing Ltd.）で座標を精密化した。
（表３）単斜晶系muM33 Fabフラグメントアポ結晶に関するデータ収集および構造精密化の統計値
Figure 0006521464
1括弧内は最外殻分解能の値を示す。
2Rmerge＝Σ|I-<I>|/ΣI（式中、Iは強度である）。
3Rcryst＝Σ|F0-<Fc>|/ΣFo（式中、Foは構造因子振幅観測値であり、Fcは構造因子振幅計算値である）。
4Rfreeは精密化に際して省略した総データの5％に基づいて計算した。
5PROCHECK［Laskowski, R.A., et al., J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291（1993）］で計算した。
ビオチン誘導体との複合体を形成しているFabフラグメントの結晶化については、浸漬法に使用するFabフラグメントのアポ結晶が、スクリーニング後、3日以内に、0.8Mコハク酸から析出し、それが5日以内に0.25mm×0.04mm×0.04mmの最終サイズまで成長した。ビオシチンアミドを100mMの濃度で水に溶解した。次に、その化合物を結晶化溶液に10mMの作業濃度まで希釈し、結晶化液滴中の結晶に適用した。結晶を2μlの10mM化合物溶液で3回洗浄し、最後にビオシチンアミドと共に21℃で16時間インキュベートした。
15％グリセロールを凍結保護物質として結晶を採取し、次に液体N2中で瞬間凍結した。回折像は、Swiss Light SourceのビームラインX10SAにおいて、100Kの温度で、Pilatus 6M検出器を使って収集し、プログラムXDS（Kabsch, W., J. Appl. Cryst. 26（1993）795-800）で処理し、SCALA（BRUKER AXSから入手）でスケーリングすることで、2.35Å分解能までのデータを得た。このFabフラグメント結晶は単斜晶系空間群P21に属し、格子定数はa＝89.09Å、b＝119.62Å、c＝96.18Åおよびβ＝117.15°で、結晶学的非対称単位あたり4つのFab分子を含有する（表4参照）。
CCP4ソフトウェアスイートからの標準的結晶学プログラムを使って、アポFabフラグメントの座標を探索モデルとする分子置換法で構造を解き、電子密度を計算し、X線構造を2.5Åの分解能まで精密化した（CCP4）。COOT（Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. & Cowtan, K. Features and development of COOT. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 486-501（2010））を使って、構造モデルを電子密度に合わせた。REFMAC5（Murshudov, G.N., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53, 240-255（1997））およびautoBUSTER（Global Phasing Ltd.）で座標を精密化した。
（表４）単斜晶系muM33 Fabフラグメントビオシチンアミド複合体結晶に関するデータ収集および構造精密化の統計値
Figure 0006521464
1括弧内は最外殻分解能の値を示す。
2Rmerge＝Σ|I-<I>|/ΣI（式中、Iは強度である）。
3Rcryst＝Σ|F0-<Fc>|/ΣFo（式中、Foは構造因子振幅観測値であり、Fcは構造因子振幅計算値である）。
4Rfreeは精密化に際して省略した総データの5％に基づいて計算した。
5PROCHECK［Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S. & Thornton, J.M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structure. J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291（1993）］で計算した。
実験的構造決定の結果を図6に示す。複合体の結晶形は、非対称単位中に4つの独立したビオシチンアミド:抗ビオチンFab複合体を含有しており、ビオシチンアミドは全てのFab分子によって同じように結合されていた。ビオシチンアミドは、重鎖のCDR1およびCDR3ならびに3つ全ての軽鎖CDRによって形成されるポケットに結合している。リガンドの結合ポケットは、重鎖からの残基ASN29、ASP31、THR32、PHE33、GLN35、TRP99およびTRP106ならびに軽鎖からのASN31、TYR32、LEU33、SER34、TYR49、SER50、PHE91およびTYR96によって画定されている。ビオチンヘッド基は、ポケットの一端にあるCDR2およびCDR1の残基と水素結合を形成する。すなわち、ビオシチンアミドのN3はSer50のヒドロキシル酸素と相互作用し、一方、O22は、同じ残基のバックボーンアミド窒素と接触している。加えて、ビオシチンアミドのO22は、Ser34のヒドロキシル基酸素に水素結合もしている。これに加えて、ビオシチンアミドと、結合ポケットを裏打ちしている芳香族側鎖との間に、疎水性相互作用が観察される。ビオチンの（CH2）4脂肪族テールの末端にあるアミド結合は、重鎖CDR1のPHE33にスタッキングし、PHE33のバックボーンアミド窒素およびAsp31へのさらなる水素結合によって安定化されている。これが、活性実体への連結部位であるアミド窒素を、窒素に続く原子が結合ポケットを離れて溶媒の方向に向くように配置している。
2.5Åの分解能での結合領域の実験的決定の結果により、組換えビオチン結合モジュールのタンパク質工学による詳細なモデリングとさらなる改良にとっての必要条件であるリガンドとその抗体との結合様式の特徴付けが可能になる。
実施例2
共有結合的コンジュゲーションのための官能基が導入されている抗ハプテン抗体の定義と生成
上述した抗ハプテン抗体のヒト化VHおよびVL配列の誘導体化を行って、抗原/ハプテンを所定の位置で抗体に共有結合でカップリングすることができる化合物を生成した。
ジゴキシゲニンに結合した抗ジゴキシゲニンFabフラグメントの実験的に決定された構造（3RA7）（Metz, S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108（2011）8194-8199）を使って、改変することで、抗体とその複合体化抗原/ハプテンとの間で起こる部位特異的カップリング反応が可能になる位置を同定した。ビオシチンアミドに結合した抗ビオチンFabフラグメントの構造（実施例5参照）を使って、ビオチン結合性抗体フラグメントに関して導入されたシステイン残基の位置が正しいことを確認し、同定された位置の一般的応用可能性の証拠を得た。
突然変異させるべき位置は、以下の2つの要件を同時に満たさなければならない:（i）抗原/ハプテン位置決め効果を指向的カップリングに利用するために、カップリング位置は結合領域の近傍に存在すべきであり、かつ要件（ii）突然変異およびカップリングの位置は、抗原/ハプテン結合そのものには影響を及ぼさないように配置されなければならない。適切な位置を見つけるためのこれらの要件は、事実上、互いに「相反」している。なぜなら、要件（i）は、結合部位に近い位置によって最もよく満たされ、一方、（ii）は結合部位から離れた位置によって最も安全に達成されるからである。
これらの事実上排他的な要件にもかかわらず、ハプテンの位置決めに影響を及ぼさずに突然変異させることができ、それでもなお同時にハプテン化化合物の指向的共有結合的カップリングを可能にする位置を、本発明者らは同定することができた。
第1の位置は、各抗体のCDR2の実際の長さに依存して、Kabatナンバリングに従う位置VH52bまたは位置VH53にある。抗ジゴキシゲニン抗体構造では、ハプテンは、疎水性残基によって形成される深いポケット中で結合する。この結晶学的研究では、蛍光性ジゴキシゲニン-Cy5コンジュゲートが使用され、この場合、発蛍光団も、ジゴキシゲニンとCy5との間のリンカーも、その高いフレキシビリティおよびその結果生じる結晶内での乱れにより、構造中に見ることができなかった。しかし、リンカーおよびCy5は、重鎖のCDR2の方向を向いているジゴキシゲニンのO32に取り付けられる。ジゴキシゲニンのO32（上記参照）からKabatに従う位置52bにあるアミノ酸残基のCαまでの距離は約10.5Åである。
位置VH52b/VH53のアミノ酸をCysで置き換えることで、抗ジゴキシゲニン抗体-VH52bCについてはSEQ ID NO:20およびSEQ ID NO:28、抗テオフィリン抗体-VH53CについてはSEQ ID NO:84およびSEQ ID NO:92、抗ビオチン抗体-VH53CについてはSEQ ID NO:52およびSEQ ID NO:60、そして抗フルオレセイン抗体-VH52bCについてはSEQ ID NO:108として示す重鎖可変領域配列を持つ抗体誘導体が生成した。
修飾点として同定されたさらにもう1つの位置は、Kabatナンバリングに従う位置VH28である。
そこで、本発明者らは、Kabatに従う位置VH28にシステインを導入した。位置VH28のアミノ酸をCysで置き換えることで、抗ジゴキシゲニン抗体-H28CについてはSEQ ID NO:124およびSEQ ID NO:132、抗テオフィリン抗体-VH28CについてはSEQ ID NO:156およびSEQ ID NO:164、抗ビオチン抗体-VH28CについてはSEQ ID NO:140およびSEQ ID NO:148、そして抗フルオレセイン抗体-VH28CについてはSEQ ID NO:116として示す重鎖可変領域配列を持つ抗体誘導体が生成した。
これらの位置の1つは「普遍的な」位置であること、すなわちこの位置はどの抗体にも適用することができ、それゆえに、結晶構造を用意し、ハプテン位置決め共有結合的カップリングを可能にする適当な位置を決定することによって新しい抗体を修飾する必要が生じるたびに、一から始める必要はないことがわかった。
Kabat重鎖可変領域ナンバリングに従うそれぞれ突然変異VH52bCまたはVH53Cは、各ハプテン結合性抗体（抗ハプテン抗体）に使用することができる。抗体とそれらの結合ポケットの構造は極めて多様であるが、VH52bC/VH53C突然変異は、ジゴキシゲニン、ビオチン、フルオレセインならびにテオフィリンに結合する抗体への抗原/ハプテンの共有結合による取り付けに使用できることが示された。
これらの配列で構成される結合性実体を発現させ、標準的なプロテインAクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーで精製することができる（実施例3参照）。その結果得られた分子は、完全に機能的であり、その無修飾親分子と同じように、それぞれのコグネイトハプテンに対する親和性を保っていた。これは表面プラズモン共鳴（SPR）実験によって実証された（実施例4参照）。
実施例3
組換え抗ハプテン抗体の組成、発現および精製
マウス抗ハプテン抗体可変領域およびヒト化抗ハプテン抗体可変領域をヒト由来の定常領域と組み合わせて、単一特異性または二重特異性キメラまたはヒト化抗体を形成させた。
単一特異性ヒト化抗ハプテン抗体を生成し、またハプテンに特異的に結合すると共に、異なる非ハプテンターゲット（例えば受容体チロシンキナーゼまたはIGF-1R）にも特異的に結合する二重特異性ヒト化抗ハプテン抗体を生成するには、（i）そのような分子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の設計と定義、（ii）トランスフェクト培養哺乳動物細胞におけるこれらの分子の発現、および（iii）トランスフェクト細胞の上清からのこれらの分子の精製が必要であった。これらの工程は、以前、WO 2012/093068に記述したように行った。
通常は、（元の）マウス抗ハプテン抗体の結合特異性を有するIgGクラスのヒト化抗体を生成するために、サブクラスIgG1のヒトFc領域のCH1-ヒンジ-CH2-CH3のN末端に、ヒト化VH配列をインフレームで融合した。同様に、ヒト化VL配列を、ヒトCLカッパ定常領域のN末端にインフレームで融合した。
ハプテン結合特異性だけでなく他のターゲットに対する特異性も持つ二重特異性抗体誘導体を生成するために、抗ハプテン抗体scFvフラグメントまたはFabフラグメントを前述の抗体の重鎖のC末端にインフレームで融合した。多くの場合、適用された抗ハプテンscFvを、以前に記載されたVH44-VL100ジスルフィド結合の導入（例えばReiter, Y., et al, Nature biotechnology 14（1996）1239-1245）によって、さらに安定化した。
発現プラスミド
重鎖および軽鎖を発現させるための発現カセットを含む発現プラスミドを、哺乳動物細胞発現ベクター中で、別々に組み立てた。
これにより、個々の要素をコードする遺伝子セグメントが、上に概説したように接合された。
コドン使用頻度を推定するために使用することができるヒト軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A., et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）, NIH Publication No 91-3242に記載されている。
κ軽鎖の転写単位は以下の要素で構成される:
・ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・Kozak配列を含む合成5'-UT、
・シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・5'端にユニークBsmI制限部位が配置され、3'端にスプライスドナー部位とユニークNotI制限部位が配置された、クローン化可変軽鎖cDNA、
・イントロン2マウスIg-κエンハンサーを含むゲノムヒトκ遺伝子定常領域（Picard, D., and Schaffner, W. Nature 307（1984）80-82）、および
・ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化（「ポリA」）シグナル配列。
γ1重鎖の転写単位は以下の要素で構成される:
・ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・Kozak配列を含む合成5'-UT、
・シグナル配列イントロンを含む修飾マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・5'端にユニークBsmI制限部位が配置され、3'端にスプライスドナー部位とユニークNotI制限部位が配置された、クローン化単一特異性可変重鎖cDNAまたはクローン化二重特異性融合scFv-可変重鎖cDNA、および
・マウスIg-μエンハンサーを含むゲノムヒトγ1重鎖定常領域（Neuberger, M.S., EMBO J. 2（1983）1373-1378）、および
・ヒトγ1免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリA」）シグナル配列。
κ軽鎖発現カセットおよびγ1重鎖発現カセットの他に、これらのプラスミドは
・ハイグロマイシン耐性遺伝子、
・エプスタイン・バー・ウイルス（EBV）の複製起点oriP、
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製起点、
・大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
組換えDNA技法
クローニングは、Sambrook et al., 1999（前記）に記載の標準的クローニング技法を使って行った。分子生物学用試薬は全て（別段の表示がなければ）市販品であり、製造者の説明書に従って使用した。
コード領域、突然変異またはさらなる遺伝要素を含有するDNAは、Geneart AG（レーゲンスブルク）によって合成された。
DNA配列は、SequiServe（SequiServe GmbH,ドイツ）で行われた二本鎖シークエンシングによって決定された。
DNAおよびタンパク質の配列分析と配列データ管理
配列の作成、マッピング、分析、アノテーション、および図解には、Vector NTI Advanceスイート・バージョン9.0を使用した。
抗ハプテン抗体および誘導体の発現
懸濁状態のヒト胎児腎臓293（HEK293）細胞の一過性トランスフェクションによって抗ハプテン抗体を発現させた。そのために、対応する単一特異性抗体または二重特異性抗体の軽鎖および重鎖を、上に概説したように原核生物用および真核生物用の選択マーカーを保因する発現ベクター中に構築した。これらのプラスミドを大腸菌で増幅し、精製し、次に一過性トランスフェクションに適用した。細胞の取り扱いには、Current Protocols in Cell Biology（2000）, Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.およびYamada, K.M.編, John Wiley & Sons, Inc.に記載されているように、標準的細胞培養技法を使用した。
細胞を適当な発現培地中、37℃/8％CO2で培養した。トランスフェクションの日に、細胞を1〜2×106生細胞/mLの密度で新鮮培地に播種した。250mlの最終トランスフェクション体積用に250μgの重鎖および軽鎖プラスミドDNAを1:1のモル比で含むOpti-MEM I培地（Invitrogen、米国）中に、トランスフェクション試薬とのDNA複合体を調製した。トランスフェクションの7日後に、14,000gで30分間の遠心分離と、滅菌フィルタ（0.22μm）での濾過によって、単一特異性または二重特異性抗体を含有する細胞培養上清を清澄化した。上清を精製まで-20℃で保存した。
細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を決定するために、アフィニティHPLCクロマトグラフィーを適用した。そのために、プロテインAに結合する単一特異性もしくは二重特異性抗体またはその誘導体を含有する細胞培養上清を、200mM KH2PO4、100mMクエン酸ナトリウムを含むpH7.4の溶液中のApplied Biosystems Poros A/20カラムに適用した。このクロマトグラフィー材料からの溶出は、200mM NaCl、100mMクエン酸を含むpH2.5の溶液を適用することによって行った。UltiMate 3000 HPLCシステム（Dionex）を使用した。溶出したタンパク質をUV吸光度とピーク面積の積分によって定量した。精製IgG1抗体を標準とした。
ジゴキシゲニン、フルオレセイン、テオフィリンまたはビオチンに結合する抗ハプテン抗体の精製
トランスフェクションの7日後にHEK293細胞上清を回収した。そこに含まれる組換え抗体（または抗体誘導体）を、プロテインA-Sepharose（商標）アフィニティクロマトグラフィー（GE Healthcare,スウェーデン）を使ったアフィニティクロマトグラフィーと、Superdex200サイズ排除クロマトグラフィーとにより、上清から2段階で精製した。簡単に述べると、抗体を含有する清澄化培養上清を、PBS緩衝液（10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaClおよび2.7mM KCl、pH7.4）で平衡化したMabSelect SuReプロテインA（5〜50ml）カラムに適用した。結合していないタンパク質を平衡化緩衝液で洗い流した。抗体（または抗体誘導体）を50mMクエン酸緩衝液（pH3.2）で溶出させた。タンパク質含有画分を0.1mlの2M Tris緩衝液（pH9.0）で中和した。次に、溶出したタンパク質画分をプールし、Amicon Ultra遠心分離フィルタデバイス（MWCO:30K, Millipore）で濃縮し、20mMヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0）で平衡化したSuperdex200 HiLoad 26/60ゲル濾過カラム（GE Healthcare,スウェーデン）にロードした。精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、Protein Science 4（1995）2411-2423に従いアミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用し、280nmにおける光学密度（OD）を、バックグラウンド補正としての320nmにおけるODと共に決定することによって決定した。単量体型の抗体画分をプールし、瞬間凍結し、-80℃で保存した。試料の一部を後続のタンパク質分析および特徴付けに供した。
抗体の均一性は、還元剤（5mM 1,4-ジチオスレイトール）の存在下および非存在下でSDS-PAGEを行い、クーマシーブリリアントブルーで染色することによって確認した。NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen,米国）を、製造者の説明書に従って使用した（4-20％ Tris-グリシンゲル）。
還元条件下で、IgGに関係するポリペプチド鎖は、SDS-PAGE後に、計算上の分子量に類似する見掛けの分子サイズに同定された。全てのコンストラクトの発現レベルをプロテインAによって分析した。平均タンパク質収量は、上述の非最適化一過性発現実験では、細胞培養上清1リットルあたり精製タンパク質6mg〜35mgであった。
実施例4
ビオチン標識化合物（ハプテン化化合物）への組換えヒト化抗ビオチン抗体の結合
ヒト化手法およびその後のシステイン突然変異の導入によって完全な結合活性を保っている誘導体が得られたかどうかを決定するために、以下の実験を行った。
組換え抗ビオチン抗体誘導体の結合特性を、バイオレイヤー干渉法（BLI）技術により、 Octet QK計器（Fortebio Inc.）を使って、分析した。これは、分子相互作用を研究するための確立されたシステムである。BLi技術は、バイオセンサーチップの表面と内部対照とから反射される白色光の干渉パターンの測定に基づいている。バイオセンサーチップへの分子の結合は、測定することができる干渉パターンのシフトをもたらす。上述のヒト化手法が抗ビオチン抗体のビオチンへの結合能を減少させたかどうかを解析するために、キメラ型およびヒト化型の抗体がビオチン化タンパク質に結合する能力について、それらの特性を直接比較した。結合研究は、抗huIgG Fc抗体捕捉（anti-huIgG Fc antibody Capture）（AHC）バイオセンサー（Fortebio Inc.）上で抗ビオチン抗体を捕捉することによって行った。まず、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中、濃度が0.5mg/mlの抗体溶液において、バイオセンサーを1分間インキュベートした。その後、安定なベースラインに到達するように、バイオセンサーを1×PBS（pH7.4）中で1分間インキュベートした。20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中にビオチン化タンパク質を0.06mg/mlの濃度で含有する溶液において、抗体被覆バイオセンサーを5分間インキュベートすることによって、結合を測定した。解離は1×PBS（pH7.4）中で5分間モニターした。その結果得られたキメラ抗ビオチン化抗体とヒト化抗ビオチン抗体に関する結合曲線を直接比較した。
ヒト化型の抗体は、キメラ抗体に等しいか、またはキメラ抗体より良好な、ビオチン化抗原の結合を示した。Kabat位置VH53にCys突然変異を持つヒト化抗体にも同じことがいえる。ビオチン化タンパク質はバイオセンサーへの残存非特異的結合を示し、それは、ビオチンを結合しないハーセプチンでバイオセンサーを被覆すると低減した。したがって、抗ビオチン抗体の機能性は、そのヒト化変異体（SEQ ID NO:44および48、SEQ ID NO:60および64に示す配列によって定義されるもの）でも保たれていた。
表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴測定は、BIAcore（登録商標）T200計器（GE Healthcare Biosciences AB、スウェーデン）で、25℃において行った。およそ4300レゾナンスユニット（RU）の捕捉系（ヒト抗体捕捉キット（Human Antibody Capture Kit）BR-1008-39（GE Healthcare Biosciences AB、スウェーデン）の10μg/ml抗ヒト捕捉（Anti-human Capture）（IgG Fc））を、GE Healthcareが供給している標準的なアミンカップリングキット（BR-1000-50）を使って、CM3チップ（GE Healthcare、BR-1005-36）にpH5.0でカップリングした。アミンカップリングのためのランニング緩衝液はHBS-N（10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、GE Healthcare、BR-1006-70）とした。続く結合研究用のランニングおよび希釈緩衝液は、PBS-T（0.05％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水）pH7.4とした。ヒト化抗ビオチン抗体の捕捉は、2nM溶液を5μl/分の流量で60秒間注入することによって行った。ビオチン化siRNAをPBS-Tで0.14〜100nM（1:3希釈系列）の濃度に希釈した。各濃度を30μ1/分の流量で180秒間注入することによって結合を測定した（解離時間600秒）。流量5μl/分の3M MgCl2溶液による30秒間の洗浄で、表面を再生した。BIAevaluationソフトウェア（GE Healthcare Biosciences AB、スウェーデン）を使ってデータを評価した。抗ヒトIgG Fc表面から得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率の差を補正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。KDおよび速度論的パラメータの計算にはラングミュア1:1モデルを使用した。
ヒト化抗ビオチン抗体SEQ ID NO:44および48ならびにヒト化抗ビオチン抗体VH53C SEQ ID NO:60および64について、表面プラズモン共鳴（SPR）による速度論的結合解析を行った。濃度が2nMの抗ビオチン抗体を、CM3センサーチップに結合している抗ヒトIgG Fc抗体によって捕捉した。ビオチン化siRNA（Mw:13868Da）の結合を、0.41、1.23、3.7、11.1、33.3、100および300nMの濃度で記録した。測定は二重に行った。計算されたKDは、ヒト化抗ビオチン抗体およびヒト化抗ビオチン抗体VH53Cについて、それぞれ0.633nMおよび0.654nMであった。
実施例5
ハプテン化化合物と抗ハプテン抗体との非共有結合的複合体の生成
一般的方法:
抗ハプテン抗体とハプテン化化合物（＝ペイロードにコンジュゲートされたハプテン）との複合体の生成は、所定の複合体をもたらすべきであり、これらの複合体中の化合物（＝ペイロード）はその活性を保っていることが保証されるべきである。ハプテン化化合物とそれぞれの抗ハプテン抗体との複合体を生成させるために、ハプテン化化合物を最終濃度が1mg/mlになるようにH2Oに溶解した。抗体は、20mMヒスチジン緩衝液、140mM NaCl、pH＝6.0中で、1mg/ml（4.85μM）の最終濃度まで濃縮した。ハプテン化ペイロードと抗体とを、モル比が2:1（化合物対抗体）になるように、上下にピペッティングすることによって混合し、室温で15分間インキュベートした。
あるいは、ハプテン化化合物を最終濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。抗体は、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH=8.2中で、10mg/mlの最終濃度まで濃縮した。ハプテン化化合物と抗体とを、モル比が2.5:1（化合物対抗体）になるように、上下にピペッティングすることによって混合し、室温および350rpmで、60分間インキュベートした。
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体との複合体-非共有結合的ジゴキシゲニン-Cy5複合体-を形成させるための例示的方法
ヒト化およびマウス抗ジゴキシゲニン抗体または二重特異性抗ジゴキシゲニン抗体誘導体を抗体構成要素として使用した。ジゴキシゲニン化Cy5と抗ジゴキシゲニン抗体の複合体を生成させるために、Cy5-ジゴキシゲニンコンジュゲートをPBSに溶解して、最終濃度を0.5mg/mlにした。抗体は、20mMヒスチジンおよび140mM NaCl、pH6で構成される緩衝液中、1mg/ml（約5μM）の濃度で使用した。ジゴキシゲニン化Cy5と抗体とを2:1のモル比（ジゴキシゲニン化Cy5対抗体）で混合した。この手法により、所定の組成を持つ複合体の均一な調製物が得られた。
複合体化反応は、サイズ排除カラムで、抗体会合発蛍光団の蛍光（650/667nm）を決定することによって監視することができる。これらの実験の結果は、抗体がジゴキシゲニンに対する結合特異性を持っている場合にのみ複合体化が起こることを実証している。ジゴキシゲニンに対する結合特異性を持たない抗体はジゴキシゲニン-Cy5コンジュゲートに結合しない。二価抗ジゴキシゲニン抗体では、ジゴキシゲニン-Cy5コンジュゲート対抗体の比が2:1になるまで、シグナルの増加を観察することができる。その後、組成依存的蛍光シグナルはプラトーに到達する。
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体の複合体-ビオチン-Cy5/キメラ抗ビオチン抗体（ヒトIgGサブクラス）複合体-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化Cy5（ビオチン-Cys-Cy5）の複合体を生成させるために、0.16mgのビオチン-Cys-Cy5を、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。1mgの抗体を、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、10.1mg/ml（約69μM）の濃度で使用した。ビオチン-Cys-Cy5と抗体とを2.5:1のモル比（ビオチン-Cys-Cy5対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを、実施例6aで述べるようにSDS-PAGEで分析した。蛍光の検出は実施例6aで述べるように行った。
ビオチン化蛍光色素と抗ビオチン抗体との複合体-ビオチン-Ser-Cy5/ヒト化抗ビオチン抗体-を形成させるための例示的方法
リンカー内にセリン残基を含有するビオチン誘導体化Cy5（ビオチン-Ser-Cy5）の複合体を生成させるために、0.61mgのビオチン-Ser-Cy5を、10mg/mlの濃度になるように、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0に溶解した。18.5mgのヒト化抗ビオチン抗体を、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、10mg/ml（約69μM）の濃度で使用した。ビオチン-Ser-Cy5と抗体とを2.5:1のモル比（ビオチン-Ser-Cy5対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら室温で60分間インキュベートした。次に、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0を移動相とし、1.5ml/分の流量で、Superdex 200 16/60高負荷分取用（high load prep）カラム（GE Healthcare）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーに、試料を付した。ピーク画分を収集し、SDS-PAGEで純度を分析した。色素対抗体比は、（1）280nm（タンパク質）および650nm（Cy5）で試料の吸光度を測定し、（2）式:標識されたタンパク質のA650/ε（Cy5）×タンパク質濃度（M）＝タンパク質1モルあたりの色素のモル数（ここで、ε（Cy5）＝250000M-1cm-1、複合体のA650＝47.0、およびタンパク質濃度は86.67μMである）を使用することによって計算した。その結果得られた色素対抗体分子の比は2.17であった。これは、すべての抗体パラトープがビオチン-Cy5分子で飽和していることを示している。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体の複合体-ジゴキシゲニン-PYY（3-36）/抗ジゴキシゲニン抗体複合体-を形成させるための例示的方法
ジゴキシゲニン化ポリペプチドと抗ジゴキシゲニン抗体との非共有結合的複合体を生成させるために、マウスハイブリドーマ由来の抗体（10mM KP04、70mM NaCl; pH7.5からの凍結乾燥物）を12mlの水に溶解し、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0を含む溶液に対して透析することにより、11mlの緩衝液中に300mg（2×10-6mol）を得た（c＝27.3mg/ml）。ジゴキシゲニン-PYY（3-36）コンジュゲート（11.57mg、4×10-6mol、2等量）を2.85mgずつ4回に分けて1時間以内に加え、室温でさらに1時間インキュベートした。複合体化反応の完了後に、複合体を、流量2.5ml/分の20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0におけるSuperdex 200 26/60 GLカラム（320ml）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。溶出した複合体を各4mlの画分に収集し、プールし、0.2μmフィルタで滅菌することにより、234mgの複合体を14.3mg/mlの濃度で得た。同様にして、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体の複合体を生成させるために、抗体を、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中、10.6mg/ml（0.93ml中に9.81mg、6.5×10-8mol）の濃度に調節した。0.57mg＝1.97×10-7mol＝3.03等量のジゴキシゲニン化ポリペプチド（DIG-PYY）を、凍結乾燥物として、抗体溶液に加えた。ポリペプチドと抗体とを室温で1.5時間インキュベートした。過剰のポリペプチドを、流量0.5ml/分の20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0におけるSuperose 6 10/300 GLカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。溶出した複合体を各0.5mlの画分に収集し、プールし、0.2μmフィルタで滅菌することにより、4.7mgの複合体を1.86mg/mlの濃度で得た。
結果として得られたハプテン化ポリペプチド-抗ハプテン抗体複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーに単一ピークが現れることから、単量体型のIgG様分子であることが明らかになった。結果として得られた複合体は、1抗体分子あたり2つのジゴキシゲニン-PYY誘導体を保有する単量体型IgG様分子であることが明らかになった。サイズ排除クロマトグラフィーは、これらのペプチド複合体の所定の組成を裏付けると共に、タンパク質凝集体が存在しないことも示した。これらの二重特異性ペプチド複合体の所定の組成（および2:1というポリペプチド対タンパク質比）は、SEC-MALS（サイズ排除クロマトグラフィー-多角度レーザー光散乱法）によって、さらに裏付けられた。SEC-MALS分析のために、100〜500μgの各試料を、1×PBS pH7.4を移動相として、0.25〜0.5ml/分の流量で、Superdex 200 10/300 GLサイズ排除カラムに適用した。光散乱はWyatt MiniDawn TREOS/QELS検出器で検出した、屈折率はWyatt Optilab rEX検出器で測定した。その結果得られたデータを、ソフトウェアASTRA（バージョン5.3.4.14）を使って解析した。SEC-MALLS分析の結果は、複合体の質量、半径およびサイズに関する情報を与える。次に、これらのデータを対応する非複合体化抗体のデータと比較した。これらの実験の結果は、ジゴキシゲニン化PYYを抗ジゴキシゲニン抗体に曝露すると、1抗体分子につき2つのジゴキシゲニン-PYY誘導体を含有する複合体がもたらされることを実証している。このように、ジゴキシゲニン化PYYは、抗ジゴキシゲニン抗体と、所定の部位（結合領域）かつ所定の化学量論で、複合体を形成することができる。
表面プラズモン共鳴研究による複合体の特徴付けにより、複合体化反応が所定の完全に複合体化した分子を生成させるという追加の証拠が得られた。抗ジゴキシゲニン抗体をSPRチップに結合させることができ、それがシグナルの増加をもたらす。次に、ジゴキシゲニン-PYYコンジュゲートを添加すると、すべての結合部位が完全に占有されるまで、さらなるシグナルの増加が起こる。すべての結合部位が完全に占有された状態になると、ジゴキシゲニン-PYYをさらに添加しても、シグナルはそれ以上増加しない。これは、複合体化反応が特異的であること、そしてシグナルがジゴキシゲニン化ポリペプチドの非特異的不着によって引き起こされるのではないことを示している。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体との複合体-Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot/キメラ抗ビオチン抗体複合体-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン化PYYポリペプチドの非共有結合的複合体を生成させるために、0.19mgのAc-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biotを、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。抗体は、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、10.7mg/ml（約73μM）の濃度で使用した。Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot対抗体）で混合し、室温、350rpmで、60分間インキュベートした。その結果得られた複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて単一ピークが存在することから、単量体型のIgG様分子（95％モノマー）であることが明らかになった。得られた複合体を、SDS-PAGEとそれに続くウェスタンブロット解析によって、さらに分析した。10μgの複合体を4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）と混合し、95℃で5分間インキュベートした。試料を4-12％Bis-Trisポリアクリルアミドゲル（NuPAGE、Invitrogen）にのせ、それを200Vおよび120mAで35分間泳動した。ポリアクリルアミドゲル中で分離した分子をPVDFメンブレン（孔径0.2μm、Invitrogen）に25Vおよび160mAで40分間転写した。メンブレンを、1×PBST（1×PBS＋0.1％Tween20）中、1％（w/v）脱脂乳により、室温で1時間ブロッキングした。メンブレンを1×PBST中で5分間ずつ3回洗浄した後、ストレプトアビジン-PODコンジュゲート（2900U/ml、Roche）（1:2000希釈で使用）と共にインキュベートした。メンブレン上のビオチンに結合したストレプトアビジン-PODの検出は、Lumi-Lightウェスタンブロッティング基質（Roche）を使って行った。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体との複合体-Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot/キメラ抗ビオチン抗体複合体-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン化PYYポリペプチドの非共有結合的複合体を生成させるために、0.16mgのAc-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biotを、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。抗体は、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、10.7mg/ml（約73μM）の濃度で使用した。Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot対抗体）で混合し、室温、350rpmで、60分間インキュベートした。その結果得られた複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、63％が単量体型IgG様分子であり、37％が二量体型可溶性凝集体であることが明らかになった。得られた複合体を、SDS-PAGEとそれに続くウェスタンブロット解析によって、さらに分析した。10μgの複合体を4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）と混合し、95℃で5分間インキュベートした。試料を4-12％Bis-Trisポリアクリルアミドゲル（NuPAGE、Invitrogen）にのせ、それを200Vおよび120mAで35分間泳動した。ポリアクリルアミドゲル中で分離した分子をPVDFメンブレン（孔径0.2μm、Invitrogen）に25Vおよび160mAで40分間転写した。メンブレンを、1×PBST（1×PBS＋0.1％Tween20）中、1％（w/v）脱脂乳により、室温で1時間ブロッキングした。メンブレンを1×PBST中で5分間ずつ3回洗浄した後、ストレプトアビジン-PODコンジュゲート（2900U/ml、Roche）（1:2000希釈で使用）と共にインキュベートした。メンブレン上のビオチンに結合したストレプトアビジン-PODの検出は、Lumi-Lightウェスタンブロッティング基質（Roche）を使って行った。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体との複合体-Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo）/キメラ抗フルオレセイン抗体複合体-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するフルオレセインコンジュゲートPYYポリペプチドの非共有結合的複合体を生成させるために、0.33mgのAc-PYY（PEG3-Cys-PEG2-5-Fluoを、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。抗体は、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.99mg/ml（約68μM）の濃度で使用した。Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-5-Fluoと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo）対抗体）で混合し、室温、350rpmで、60分間インキュベートした。その結果得られた複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、76％単量体型IgG様分子および24％二量体型可溶性凝集体であることが明らかになった。得られた複合体を、SDS-PAGEと、それに続くポリアクリルアミドゲル内でのフルオレセイン関連蛍光の検出とによって、さらに分析した。8μgの複合体を4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）と混合し、95℃で5分間インキュベートした。フルオレセイン関連蛍光はLumiImager F1デバイス（Roche）を使用して645nmの励起波長で記録した。
実施例6
酸化還元作用物質の存在下でのハプテン化色素またはハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体VH52bC/VH53Cとの所定の共有結合的コンジュゲートの生成
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Dig-Cys-Ahx-Cy5/抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
抗ハプテン抗体とシステイン-リンカーを含有するハプテン化蛍光色素との共有結合的コンジュゲートの生成は、抗ハプテン抗体のCDR2中のVH52bCと、ハプテンと蛍光色素の間にあるリンカー中のシステインとの間の特異的位置でジスルフィド架橋が形成されている所定のコンジュゲートをもたらす。コンジュゲーション反応を酸化還元試薬の存在下で行った。Dig-Cys-Ahx-Cy5を20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0に溶解した。10％（v/v）酢酸を滴下することによって可溶化を容易にした。最終濃度を0.4mg/mlに調節した。20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中の抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCを10mg/mlの濃度にした。抗ジゴキシゲニン抗体を対照として使用し、抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCと同じ方法で処理した。4.7nmolの各抗体を2.5モル等量のDig-Cys-Ahx-Cy5と混合した。これは、11.7nmolのこの物質を4回（各2.9nmol）に分けて15分ごとに加えることによって行った。これらの添加の間は、穏やかに振とうしながら、試料を25℃でインキュベートした。最終回分の添加後に、0.64nmolの各抗体-Dig-Cys-Ahx-Cy5複合体を、以下の酸化還元試薬が入っている緩衝液に移した:3mM DTE（ジチオエリスリトール）＋10mM GSSG（酸化型グルタチオン）、0.3mM DTE＋1mM GSSG、および0.03mM DTE＋0.1mM GSSG。すべての試料をこれらの条件下で15分間インキュベートした。インキュベーション後に試料を半分（各0.34nmol）に分割し、SDSゲル電気泳動用に調製した。そのために、4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）を加えた。各試料につき、10×NuPAGE試料還元剤（Invitrogen）を加えることによって、還元タイプも調製した。すべての試料を、70℃で5分間インキュベートしてから、1×MOPS緩衝液（Invitrogen）による4-12％Bis-Trisポリアクリルアミドゲル（NuPAGE, Invitrogen）での電気泳動に付した。ゲル内のCy5関連蛍光をLumiImager F1デバイス（Roche）により、645nmの励起波長で検出した。蛍光の検出後にゲルをSimplyBlue SafeStain（Invitrogen）で染色した。ゲルを図4に示す。
抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC（図8、上側のゲル、レーン1A〜C）では部位特異的ジスルフィド結合形成が示され、 CDR2中にシステインを持たない抗ジゴキシゲニン抗体を使用した場合（レーン2A〜C）は、低いバックグラウンド蛍光シグナルであった。対照反応におけるバックグラウンドシグナルは、抗体鎖間ジスルフィド結合の形成に通常関与するシステインへのDig-Cys-Ahx-Cy5のカップリングによって説明することができる。酸化還元試薬の量を増加させると、抗体重鎖と抗体軽鎖をつなぐジスルフィド架橋が著しく低減し、主として3/4抗体（-1×LC）、HC二量体（-2×LC）および1/2抗体（1×HC＋1×LC）が生産される。抗体に共有結合で連結されていないDig-Cys-Ahx-Cy5の蛍光は、ゲルの最下部に検出することができる。図8の下側のゲルは、試料を還元した場合は、抗体重鎖および抗体軽鎖付近にCy5関連蛍光を検出することができないことを示しており、このことから、共有結合による連結は、実際に、ジスルフィド架橋によって形成されていたことがわかる。各ゲルのクーマシー染色は、各レーン中のタンパク質の総量が等しかったことを示している。
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Dig-Cys-Cy5/抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
Dig-Cys-Cy5を、3.25mg/mlの最終濃度になるように、8.3mM HCl、10％（v/v）DMFに溶解した。20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中の抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC抗体を15mg/mlの濃度にした。抗ジゴキシゲニン抗体を対照として使用し、抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCと同じ方法で処理した。13.3nmolの各抗体を、1mM GSH（還元型グルタチオン）および5mM GSSG（還元型グルタチオン）の存在下、10mg/mlの最終抗体濃度で、2モル等量のDig-Cys-Cy5と混合した。これは、26.6nmolのこの物質を、5分ごとに2回に分けて加えることによって行った。これらの添加の間は、穏やかに撹拌しながら室温で試料をインキュベートした。最終回分の添加後に、試料を室温で1時間インキュベートした。SDS-PAGEと、それに続くCy5関連蛍光シグナルの記録によって、カップリング反応の効率を評価した。SDS-PAGE用に5、10および20μgの各試料を調製した。そのために、4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）を加えた。すべての試料を70℃で5分間インキュベートしてから、1×MOPS緩衝液（Invitrogen）による4-12％Bis-Trisポリアクリルアミドゲル（NuPAGE, Invitrogen）での電気泳動に付した。LumiImager Flデバイス（Roche）を使用し、645nmの励起波長で、ゲル内のCy5関連蛍光を検出した。蛍光の検出後に、ゲルをSimplyBlue SafeStain（Invitrogen）で染色した。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-PEG3-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）/ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するジゴキシゲニン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、1.4mgのPEG3-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）を10mg/mlの濃度になるように100％DMFに溶解した。1mgの抗体を、5mM Tris-HCl、1mM EDTA、1mM GSH、5mM GSSG、pH8.2で構成される緩衝液中、10mg/ml（約68μM）の濃度で使用した。PEG3-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）と抗体とを2:1のモル比（PEG3-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）対抗体）で混合し、100rpmで撹拌しながら室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種のうちの43％が2つのポリペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、46％が1つのポリペプチド分子にカップリングされた抗体であり、11％がカップリンしていない抗体と同定された。
実施例7
酸化還元作用物質の非存在下でのハプテン化色素およびハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体VH52bC/VH53Cとの所定の共有結合的コンジュゲートの生成
共有結合的抗ハプテン抗体/ハプテン化ポリペプチドまたはハプテン化色素ジスルフィド連結コンジュゲートを生成させるには、（i）ポリペプチドを抗体表面の上に露出させることでその活性を保つことを可能にする適切な反応性基（例えばシステイン、マレイミドなど）含有リンカーを介して、ハプテン（例えばジゴキシゲニン、フルオレセイン、ビオチンまたはテオフィリン）をポリペプチドまたは色素にカップリングすること、および（ii）ポリペプチドの生物学的活性が保たれている、ハプテン化ポリペプチドとシステイン突然変異を持つ抗ハプテン抗体（＝抗体VH52bC/VH53C）との部位特異的共有結合的コンジュゲートを生成させること、および（iii）抗体鎖間ジスルフィド架橋の還元を避けるために、還元剤の非存在下で反応を行うことが必要である。
一般的方法:
抗ハプテン抗体とハプテン化化合物とのコンジュゲートの生成は、所定の化学量論でコンジュゲートをもたらすべきであり、これらのコンジュゲート中の化合物はその活性を保っていることが保証されるべきである。ハプテン化化合物とそれぞれの抗ハプテン抗体とのコンジュゲートを生成させるために、ハプテン化化合物を最終濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。抗ハプテン抗体VH52bC/VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH=8.2中、10mg/mlの濃度にした。ハプテン化化合物と抗ハプテン抗体VH52bC/VH53Cとを、モル比が2.5:1（化合物対抗体）になるように、上下にピペッティングすることによって混合し、室温および350rpmで、60分間インキュベートした。
システイン含有リンカーを介してハプテンにコンジュゲートされたポリペプチドを、以下、ハプテン-Cys-ポリペプチドまたはポリペプチド-Cys-ハプテンと呼ぶ。ポリペプチドは遊離のN末端を有してもよいし、例えばアセチル基（Ac-ポリペプチド-Cys-ハプテン）またはPEG残基（PEG-ポリペプチド-Cys-ハプテン）でキャッピングされたN末端を有してもよい。
以下、システイン含有リンカーを介してハプテンにコンジュゲートされた蛍光色素を色素-Cys-ハプテンまたはハプテン-Cys-色素と呼ぶ。
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Dig-Cys-Ahx-Cy5/抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
抗体-Dig-Cys-Ahx-Cy5複合体を酸化還元化合物不含、0.1mM GSSG（酸化型グルタチオン）含有または1mM GSSG含有の緩衝液に移した点以外は、試料をまさに実施例6aで述べたとおりに調製した。その結果得られた蛍光スキャンおよびクーマシー染色したポリアクリルアミドゲルを図5に示す。3つの条件のいずれもが、部位特異的ジスルフィド結合形成に関して同様の特異性を示し（図5、上側のゲル、レーン1A〜C）、バックグラウンド反応のレベルは低かった（図5、レーン2A〜C）。これは、還元作用物質が存在しなくてもジスルフィド結合の形成は達成できることを裏付けている。3/4抗体（-1×LC）、HC二量体（-2×LC）および1/2抗体（1×HC＋1×LC）は、実施例6と比較して、残存量しか検出されないので、これは、抗体を著しく安定化し/抗体の崩壊を低減する。
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Dig-Cys-Cy5/抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
13.3nmolの抗体を、酸化還元試薬の非存在下、10mg/mlの最終抗体濃度で2モル等量のDig-Cys-Cy5と混合した点以外は、試料をまさに実施例6bで述べたとおりに調製した。
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-ビオチン-Cys-Cy5/キメラ抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化Cy5のコンジュゲートを生成させるために、0.16mgのビオチン-Cys-Cy5を、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。1mgの抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.7mg/ml（約68μM）の濃度で使用した。ビオチン-Cys-Cy5と抗体とを2.5:1のモル比（Ac-ビオチン-Cys-Cy5対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを、実施例6aで述べるようにSDS-PAGEで分析した。蛍光の検出は実施例6aで述べるように行った。
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-ビオチン-Cys-Cy5/ヒト化抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化Cy5のコンジュゲートを生成させるために、0.16mgのビオチン-Cys-Cy5を、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。1mgのヒト化抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、7.4mg/ml（約51μM）の濃度で使用した。ビオチン-Cys-Cy5と抗体とを2.5:1のモル比（Ac-ビオチン-Cys-Cy5対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを、実施例6aで述べるようにSDS-PAGEで分析した。蛍光の検出は実施例6aで述べるように行った。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）/ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するジゴキシゲニン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、2.4mgのAc-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）を、5mg/mlの濃度になるように、20％アセテートに溶解した。10mgのヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC（68.4nmol）を、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0で構成される緩衝液中、19.5mg/ml（約133μM）の濃度で使用した。Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）と抗体とを2:1のモル比（Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）対抗体）で混合し、100rpmで撹拌しながら室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析で分析した。検出された分子種のうちの7.4％が2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、40％は1つのペプチド分子にカップリングされた抗体であり、52％はカップリングしていない抗体と同定された。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-βAla-Biot）/キメラ抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.19mgのAc-PYY（PEG3-Cys-βAla-Biot）を10mg/mlの濃度になるように100％DMFに溶解した。1mgのキメラ抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.7mg/ml（約67μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-βAla-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-βAla-Biot］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種のうちの87.7％は、2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、12.3％は、1つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定された。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Biot）/キメラ抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.16mgのAc-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Biot）を、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。1mgのキメラ抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.9mg/ml（約68μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Biot］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種の100％が2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定された。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-βAla-Biot）/ヒト化抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.06mgのAc-PYY（PEG3-Cys-βAla-Biot）を、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。0.8mgのヒト化抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9mg/ml（約62μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-βAla-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-βAla-Biot］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種のうちの62.2％が2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、33.9％は1つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、3.9％はカップリングしていない抗体と同定された。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Biot）/ヒト化抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.08mgのAc-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Biot）を濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。0.8mgのヒト化抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9mg/ml（約62μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Biot］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種のうちの71.4％は2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、26％は1つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、2.5％はカップリングしていない抗体と同定された。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Fluo）/抗フルオレセイン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.33mgのAc-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluoを、濃度が10mg/mlになるように、100％DMFに溶解した。1mgの抗フルオレセイン抗体VH52bCを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.3mg/ml（約63μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluoと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluo］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種のうちの95％は2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、5％は1つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定された。
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Fluo）/抗フルオレセイン抗体VH28C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.33mgのAc-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluoを、濃度が10mg/mlになるように、100％DMFに溶解した。1mgの抗フルオレセイン抗体VH28Cを、50mM Tris-HCl, 1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.5mg/ml（約63μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluoと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluo］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種の100％が、2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定された。
実施例8
共有結合テオフィリン-抗テオフィリン抗体複合体の生成
ハプテン認識系としてテオフィリンとテオフィリン結合抗体とを利用する共有結合的抗体複合体の形成を評価するために、ハプテンをテオフィリンと交換した点以外は、一般にジゴキシゲニン-Cys-Cy5またはビオチン-Cys-Cy5について説明した合成技術および精製技術を応用することにより、テオフィリン-Cys-Cy5を、蛍光ペイロードとして生成させた（実施例8を参照のこと）。合成されたテオフィリン-Cys-Cy5の誘導体の組成物は、図16aに示されている。共有結合ジスルフィドの形成を実証するために、重鎖可変領域の位置54または位置55に計画的Cysを含有するテオフィリン結合抗体を生成させた（抗テオフィリン抗体-Cys）。これらの抗体の純度は、図16bに例示的にY54C変異体について示されている。これらの抗体誘導体をテオフィリン-Cys-Cy5と複合体化し、次に、実施例12で述べたように非還元条件下および還元条件下でのSDS-PAGEに付した。非還元条件下では、ジスルフィドで連結された抗テオフィリン抗体複合体化Cy5が、実施例12での記載と同様にゲル内に、そのH鎖関連蛍光によって検出された。これは図16cに記載されており、ジゴキシゲニン、フルオレセインまたはビオチンをハプテンとして使用した場合に観察されたジスルフィドと同じように、簡単な添加反応の結果として、抗体間の共有結合的複合体が形成されていたことを実証するものである。これらの複合体は、還元すると、予想どおり解離した。すなわちジスルフィドが還元された状態になった場合にのみ、ペイロードをH鎖から放出した（図16c）。
実施例9
インビボ様条件下での共有結合的ハプテン-抗体複合体の生成と、インビボでの直接的ジスルフィド形成の証拠
インビボ様条件下での共有結合的ハプテン-抗体複合体の形成を評価するために、抗ビオチン抗体-Cysを、ビオチン-Cys-Cy5と共に、マウス血清中、37℃で60分、インキュベートした。次にプロテインAによって抗体をマウス血清から捕捉した。その後、捕捉された抗体を実施例12で述べたように非還元条件下および還元条件下でSDS-PAGEに付した。ジスルフィド連結抗体複合体化Cy5は、実施例12での記載と同様に、ゲル内でのそのH鎖関連蛍光によって検出された。図17は、抗体との共有結合的複合体が、37℃の血清中で、すなわちインビボ条件に似た条件下で形成することを実証している。これらの複合体は、還元すると、予想どおり解離する。すなわちペイロードは、ジスルフィドが還元された場合にのみ、H鎖から放出される（図17）。血清は多量のタンパク質、ペプチドおよび他の化合物（ジスルフィド形成反応を妨害しうるもの）を含有するので、ハプテンの位置決め後に、抗体とペイロードとの間に、血清の存在下でさえ、指向的なジスルフィド結合が形成されうるという知見は予想外である。ハプテンの位置決め後に、37℃の血清中で抗体とペイロードとの間に指向的なジスルフィド結合が形成されうるという知見は、事前ターゲティング（pre-targeting）状況、すなわち抗体とハプテン-ペイロードとの個別適用と、それに続く抗体複合体のインビボアセンブリおよびそれに続くジスルフィド形成において、このPK調整系を応用することができるという可能性を切り開くものでもある。
潜在的なインビボ「事前ターゲティング」応用をさらに評価するために、実施例18で述べる動物の眼の非侵襲的光学イメージング技術により、ビオチン-Cy5の薬物動態を事前ターゲティング条件下で決定した。これらの実験では、毛細管中のCy5の蛍光を明らかにする動物の眼の光学的イメージングにより、Cy5の存在を非侵襲的に決定した。ビオチン-Cy5の注射の10分後に本発明者らがマウスの眼に検出したCy5媒介蛍光値を100％値と設定し、その後の時点で測定される蛍光値を、それとの比較で表現した。この実験では、1mgの抗体（抗ビオチン抗体または抗ビオチン抗体-Cys（＝抗ビオチン抗体のCys突然変異体）のいずれか）を、ビオチン-Cy5の注射および眼イメージングの開始の24時間前に適用した。対照群には、抗ビオチン抗体を事前注射（pre-inject）しなかった。
これらの実験の結果を図18に示す。抗体が事前に注射されていない動物にビオチン-Cy5を注射したところ、低い血清中半減期および低い曝露レベルで排除された（◆）。抗ビオチン抗体（Cys突然変異なし）を24時間前に注射した動物に注射されたビオチン-Cy5の血清中レベルおよび半減期は、著しく増加した。これは、抗体が、循環中のその抗原を（ペイロードと共に）捕捉し、抗原の（そしてまた、コンジュゲートされたペイロードの）血清中半減期を延長することを示している。抗ビオチン抗体-Cys（すなわち共有結合的ペイロードカップリングのために本明細書において報告するCys突然変異を含有する抗体）を24時間前に注射した動物に注射されたビオチン-Cys-Cy5の相対的血清中レベルおよび半減期は、さらに一層増加した。これらの試料では、相対的Cy5レベルが、非複合体化化合物より高いだけでなく、複合体化した（ただしジスルフィド結合していない）Cy5のレベルよりも高かった。このように、ハプテン複合体化ジスルフィド連結ペイロード（インビボで事前ターゲティング条件下で形成されるもの）は、非共有結合的複合体化ペイロードよりも、循環中で安定であり、より高い曝露レベルに到達することができる。
実施例10
抗ハプテン抗体とのコンジュゲート中および複合体中のポリペプチドは機能性を保っている
本発明者らは、非共有結合的ハプテン-ポリペプチドコンジュゲートの一部であるポリペプチドおよび抗ハプテン抗体との複合体中のポリペプチドが、機能性を保っていることを、以前に示した（WO2011/003557、WO2011/003780およびWO2012/093068）。カップリングされたペプチドが、共有結合的ジスルフィドカップリング後も機能性を保っていることを実証するために、抗ジゴキシゲニン抗体と複合体化したポリペプチドの生物学的活性と、抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCを使ったそれらのジスルフィドコンジュゲートの生物学的活性とを比較した。
治療上望まれるPYY由来ペプチドの機能性は、そのコグネイト受容体NPY2に結合して、そのシグナリングを妨害することである。NPY2受容体を介したシグナリングは、代謝プロセスに関与し、かつ/または代謝プロセスを調節している。
ポリペプチドDig-PYYと抗ジゴキシゲニン抗体の複合体化もしくはSSコンジュゲーションまたはポリペプチドDig-Cys-PYYと抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCとのコンジュゲーションが、それぞれ、その活性に影響を及ぼすかどうかを評価するために、本発明者らは、NPY2受容体を発現するHEK293細胞において、フォルスコリン刺激によるcAMP蓄積を阻害するその能力を評価した（cAMPアッセイ）。
PYY（3-36）、そのY2受容体特異的修飾類似体moPYY、その抗体複合体化Dig変異体、およびそのジスルフィドコンジュゲートDig-Cys誘導体の生物学的活性を評価するために行ったcAMPアッセイの結果を、以下の表6に示す。
（表６）
Figure 0006521464
cAMPアゴニストアッセイには、以下の材料を使用した: 384ウェルプレート; Tropix cAMPスクリーンキット; cAMP ELISAシステム（Applied Biosystems、カタログ番号T1505; CS 20000）;フォルスコリン（Calbiochemカタログ番号344270）;細胞: HEK293/hNPY2R;増殖用培地:ダルベッコ変法イーグル培地（D-MEM, Gibco）; 10％ウシ胎児血清（FBS, Gibco）,熱非働化; 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Pen 10000単位/mL: Strep 10000mg/mL, Gibco）; 500μg/mL G418（ジェネティシン、Gibcoカタログ番号11811-031）;およびプレーティング培地: DMEM/F12（フェノールレッド不含）（Gibco）; 10％FBS（Gibco、カタログ番号10082-147）,熱非働化; 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco、カタログ番号15140-122）; 500μg/mL G418（ジェネティシン、Gibco、カタログ番号11811-031）。
アッセイを行うために、1日目に、培地を捨て、フラスコ（T225）1本につき10mLのPBSで単層細胞を洗浄した。PBSをデカントした後、5mL VERSENE（Gibco、カタログ番号1504006）を使って細胞を剥離した（37℃で5分）。フラスコを軽くタッピングし、細胞懸濁液をプールした。各フラスコを10mLのプレーティング培地ですすぎ、1000rpmで5分間遠心分離した。懸濁液をプールし、カウントした。HEK293/hNPY2Rの場合、懸濁液をプレーティング培地に2.0×105細胞/mLの密度で再懸濁した。Multi-dropディスペンサを使って50μlの細胞（HEK293/hNPY2R-10,000細胞/ウェル）を384ウェルプレートに移した。プレートを37℃で終夜インキュベートした。2日目に、細胞が75〜85％コンフルエントであることを確認した。培地および試薬を室温にした。希釈液を調製する前に、ジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma、カタログ番号D2650）中の刺激化合物の原液を、5〜10分間、32℃まで温めた。0.5mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX、Calbiochem、カタログ番号410957）および0.5mg/mL BSAを含むDMEM/F12中に、希釈液を調製した。刺激培地中の最終DMSO濃度は1.1％であり、フォルスコリン濃度は5μMであった。ペーパータオル上で細胞プレートをしずかに反転し、タッピングして細胞培地を除去した。50μLの刺激培地を各ウェルに入れた（各濃度を4つ一組にして行った）。プレートを室温で30分間インキュベートし、細胞を顕微鏡下で毒性について調べた。処理の30分後に、刺激培地を捨て、50μL/ウェルのアッセイ溶解緩衝液（Tropixキットの一部として提供されるもの）を加えた。プレートを37℃で45分間インキュベートした。20μLの溶解物をTropixキットの刺激プレートからプレコート抗体プレート（384ウェル）に移した。10μLのAPコンジュゲートと20μLの抗cAMP抗体とを加えた。プレートを室温で1時間、振とうしながらインキュベートした。次に、洗浄緩衝液（各洗浄につき1ウェルあたり70μL）でプレートを5回洗浄した。プレートをタッピングして乾燥させた。30μL/ウェルのCSPD/Sapphire-II RTU基質/エンハンサー溶液を加え、室温で45分インキュベートした（振とう）。ルミノメータ（VICTOR-V）でシグナルを1秒間/ウェル測定した。
これらのアッセイの結果（表6）は、野生型PYYと比べて修飾ペプチド誘導体moPYYの活性の低下はごくわずかでしかないことを示している。cAMPアッセイのIC50値は野生型PYYでは0.09nM、修飾類似体では0.14nMであった。共有結合的ジスルフィドコンジュゲーションは、生物学的活性のわずかな低減をもたらした。IC50値は、コンジュゲートでは5-36nMであった。驚いたことに、共有結合的ジスルフィドコンジュゲートは、IC50値が10.91nMである非共有結合的複合体より、活性が2倍高い。
実施例11
ビオチン化Cy5とヒト化抗ビオチン抗体VH53Cとの共有結合的コンジュゲートと比較した、ビオチン化Cy5とヒト化抗ビオチン抗体との複合体の血清中安定性
ここに記載するペプチド修飾技術の目的は、ペプチドの治療応用可能性を改良することである。ペプチドの治療的応用にとって大きな障害は、現在は限られているインビボでの安定性および/または短い血清中半減期ならびに迅速なクリアランスである。発蛍光団の抗体コンジュゲートのPKパラメータをインビボで決定し、非共有結合的抗体-発蛍光団複合体のPKと比較した。そこで、（i）抗ビオチン抗体VH53Cをビオチン化発蛍光団 Biot-Cys-Cy5に共有結合でコンジュゲートし、（ii）抗ビオチン抗体とビオチン化発蛍光団Biot-Cy5との非共有結合的複合体を生成させ、（iii）共有結合でコンジュゲートした化合物と、非共有結合的に複合体化した化合物とを、動物に適用し、（iv）Cy5の蛍光（A650）の決定と、ヒト化抗体を特異的に検出するELISA法による対応する抗体の決定とにより、これらの動物における化合物の血清中濃度を経時的に測定した。
実験手法
小さな蛍光基質の抗体複合体化がPKパラメータに及ぼす影響を分析するために、20mMヒスチジン/140mM NaCl、pH6.0中の、13nmolのCy5-ビオチン/ヒト化抗ビオチン抗体VH53C-コンジュゲート、または対応する抗体と非共有結合的に複合体化した化合物、または蛍光化合物のみを、各物質につき6匹の雌マウス（NRMI系統）に適用した。約0.1mlの血液試料を以下の時点後に収集した:第1群のマウス1、2、および3については0.08時間、4時間および48時間、第2群のマウス1、2、および3については0.08時間、24時間および72時間。室温で1時間後に、遠心分離（9300×g、3分、4℃）によって、少なくとも50μlの血清試料を得た。血清試料を-80℃で保存した。
所与の時点における血清中の化合物の量を決定するために、Cy5の蛍光特性を使用する。すなわち、血清試料中のCy5関連蛍光を120μl石英キュベット中、室温で、Cary Eclipse蛍光分光測光器（Varian）を使って測定した。励起波長を640nmとし、発光を667nmで測定した。発光強度が適当な範囲に入るように、血清試料を1×PBSで希釈した。それぞれの試料と同じ希釈度で1×PBSに希釈した無処置マウスの血清をブランクプローブとして使用したが、それらは蛍光シグナルを何も示さなかった。
共有結合的コンジュゲート、非共有結合的複合体および非複合体化ハプテン-Cy5を使用した分析の結果を図7に示す。データは、注射の5分後の（ピーク）血清中レベルに対して正規化したCy5媒介蛍光の相対的（％）レベルとして示されている。非複合体化ビオチン-Ser-Cy5は、かなり分子量の小さい化合物なので、血清から迅速に消失する。適用して5分後に検出可能であった蛍光のうち、注射の1時間後に依然として検出可能であったのは、6％に過ぎなかった。それより後の時点である、注射の2時間後、4時間後、および24時間後には、Cy5媒介シグナルを検出することはできなかった。
抗体複合体化化合物は、注射の4時間後に、適用された蛍光（5分レベルを100％と設定）のうちの約50％を、依然として血清中に検出することができた。その後の時点でもCy5媒介蛍光レベルを検出することができ、2時間時点では5分値の約22％が検出可能であり、注射の48時間後には約12％が検出可能であり、72時間後は8％が依然として検出可能であった。抗体コンジュゲート化合物は、抗体複合体化化合物より著しく長いインビボ半減期を示す。注射の4時間後では、適用した蛍光（5分レベルを100％と設定）のうちの58％を、依然として血清中に検出することができた（抗体複合体化化合物より1.16倍高い）。24時間後に35％（1.6倍）、48時間後に31％（2.6倍）、そして72時間後に26％（3.3倍）のCy5媒介蛍光が、血清中に検出された。実験の最初の24時間において複合体化化合物とコンジュゲート化合物の蛍光の減少が同じぐらいであるのは、複合体とコンジュゲートの初期分布が似ていることで説明することができる。24時間後は、抗体コンジュゲート化合物のインビボ安定性が、相違の原因である。
所与の時点における血清中のヒトIgG抗体の量を決定するために、以下のアッセイ原理を使用した:抗ヒトカッパ鎖モノクローナルIgG抗体でコーティングした固相（Maxisorb（登録商標）マイクロタイタープレート、NUNC-Immuno（商標））上に、血清試料中のヒトIgG1抗体を捕捉した。血清試料を1:105および1:106に希釈し、100μlのこれらの希釈液をウェルに加えた。インキュベーション後にウェルを各300μlのPBS/0.05％Tween 20で3回洗浄した。ヒトIgG抗体の検出は、まず、C末端でジゴキシゲニン化された抗ヒトCH1ドメインIgG（濃度0.25μg/ml）を100μl加えることによって行った。各300μlの1×PBS/0.05％Tween 20で3回洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）にコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体Fabフラグメント（濃度25mU/mL）を100μl加えた。最後に、各ウェルに100μlのABTS（登録商標）を加えた。周囲温度で30分間のインキュベーション後に、市販のマイクロタイタープレートELISAリーダー（例えばTecan Sunrise）において、吸光度（OD）を405nmおよび492nm［405/492］で測定した。
抗体-ビオチン-Cy5複合体および抗体-ビオチン-Cy5コンジュゲートで処置したマウスにおけるBio-Cy5血清中レベルおよびヒトIgGの血清中レベルを図7に示す。データは、注射の5分後の（ピーク）血清中レベルに対して正規化した相対的（％）ヒトIgGレベルとして示されている。抗体-ハプテン複合体と抗体-ハプテンコンジュゲートの相対的ヒトIgG血清中レベルはどちらも、抗体-ハプテンコンジュゲートについて測定された相対的蛍光と一致している。このように、ビオチン-Cys-Cy5化合物は、それをコンジュゲートした抗体と類似するインビボ安定性を示し、それは、抗体-ハプテンコンジュゲートがインビボで無傷のままであることを意味している。抗体-ハプテン複合体の場合は、明らかにこれが当てはまらず、相対的Cy5媒介蛍光は、相対的ヒトIgG血清中レベルより早く減少する。これは、複合体がインビボで時間の経過と共にペイロードを放出することを意味している。
要約すると、ハプテン化化合物のインビボ安定性は、抗ハプテン抗体に結合されると、著しく増加する。しかし、ハプテンCy5血清中レベルは抗体血清中レベルの減少よりも早いので、抗体-ハプテン複合体はインビボでは完全には安定でない。抗体-ハプテン-Cy5コンジュゲートの場合はこれが当てはまらず、正常IgG抗体と類似するインビボ挙動を示す。
Dig-ペプチド血清中動態（非共有結合的複合体と共有結合的コンジュゲートの比較）
ジゴキシゲニン化ポリペプチドの抗体複合体化および抗体コンジュゲーションがPKパラメータに及ぼす影響を分析するために、20mMヒスチジン/140mM NaCl pH6.0中、32.1nmolのポリペプチド、または対応する抗体と非共有結合的に複合体化したポリペプチドを、各物質につき2匹の雌マウス（NRMI系統）に適用した。マウスの体重はMAK-DIG-PYYについては23gおよび25g、DIG-PYYについては28gおよび26gであった。約0.1mlの血液試料を以下の時点後に収集した:マウス1については0.08時間、2時間および24時間、マウス2については0.08時間、4時間、24時間。室温で1時間後に、遠心分離（9300×g、3分、4℃）によって、少なくとも40μlの血清試料を得た。血清試料を-80℃で保存した。
所与の時点における血清中のジゴキシゲニン化ペプチドの量を決定することは、血清試料中のポリペプチドを検出するためにとりうる直接的手段がないので、Dig-Cy5の決定と比較して困難であった。そこで、血清中のジゴキシゲニン化ペプチドを検出するためのウェスタンブロット関連アッセイを確立した。第1段階では、血清試料を還元SDS-PAGEで分離した。高濃度のSDSおよび還元作用物質への血清の曝露を試料調製に含めたので、複合体化されたDig-ポリペプチドコンジュゲートは（完全に変性/折りたたまれていない）抗ジゴキシゲニン抗体から放出された状態になりうるが、共有結合的コンジュゲートの方は、結合したままであった。非共有結合的抗体複合体からのポリペプチドの放出を媒介し、個々の構成要素をSDS-PAGEで分離するために、2μlの各血清試料を18μlの20mMヒスチジン/140mM NaCl pH6.0に希釈し、6.7μlの4×LDS試料緩衝液および3μlの10×試料還元剤（NuPAGE, Invitrogen）と95℃で5分間混合した。同じ系統の無処置マウスの血清2μlを対照として使用した。試料を4-12％Bis-Trisゲル（NuPAGE, Invitrogen）に適用し、ランニング緩衝液として1×MES（Invitrogen）を使用して、200V/120mAで20分泳動した。次に、分離したポリペプチドをPVDFメンブレン（孔径0.22μm, Invitrogen）にXCell Sure Lock（登録商標）Mini-Cellシステム（Invitrogen）を使って25V/130mAで40分ブロッティングした。メンブレンを、1×PBS＋1％Tween20（PBST）中の1％脱脂乳により、室温で1時間ブロッキングした。次に、抗ジゴキシゲニン抗体を使って、メンブレン上のジゴキシゲニン化ポリペプチドを検出した。そのために、濃度13μg/mlの抗ジゴキシゲニン抗体を、10mlの1％脱脂乳/PBST中、室温で2時間、メンブレンに適用した。メンブレンを1×PBST中で5分×3回洗浄した。LumiLightPLUSウェスタンブロッティングキット（Roche）のPODにカップリングされた抗マウスIgG Fabフラグメントを、10mlの1％脱脂乳PBST中、1:25希釈液として室温で1時間適用した。メンブレンを1×PBSTで5分×3回洗浄した。検出は、メンブレンを4mlのLumiLightウェスタンブロッティング基質中、室温で5分インキュベートすることによって行った。化学発光を20分間の曝露時間でLumiImager Fl（Roche）を使って検出した。
これらの分析の結果を図8Aおよび図8Bに示す。さまざまな時点におけるマウス血清中のジゴキシゲニンポリペプチドの存在/量を決定した。抗体複合体化ペプチドを与えたマウス（図8左）は、最も早い時点（投与の5分後）で強いシグナルを示した。これらのシグナルは、対照のブロット上でのサイズおよび場所によって示されるとおり、明確に割り当てることができた。抗体複合体化ポリペプチドで処置したマウスの血清では、ポリペプチド関連シグナルが、初期の時点で最も強く、時間の経過と共に減少した。それでもなお、ポリペプチドはすべての時点において、投与の24時間後でさえ、依然として良好なシグナルで検出可能であった。
非複合体化ポリペプチドを与えたマウスでは、この小さなポリペプチドに関係づけうるシグナルは、最も早い時点でさえ、ほとんど検出することができなかった。図6の右側は、通常の曝露条件下では、遊離のポリペプチドはブロット上には見られないことを示している。ブロットのコントラスト強化により、投与の5分後に、何らかのポリペプチドが明らかになったが、それは痕跡量でしかなかった。その後の時点では、明確なポリペプチドバンドを検出することはできなかった。
非複合体化ポリペプチドがマウスの血清中では非常に短い半減期を有することがわかる。同じポリペプチドであるが抗体複合体化した形態で与えたマウスは、長期間にわたって血清中にこれらのポリペプチドの存在を示す。注射の24時間後に、これらのマウスの血清中で、ポリペプチドを決定することができる。
実施例12
共有結合で連結されたジゴキシゲニン-抗体複合体およびジゴキシゲニン結合性IgGの血清中半減期
共有結合的複合体化が、非共有結合で連結されたハプテン複合体に照らして、PK特性をさらに改良するかどうかを分析するために、抗ジゴキシゲニン抗体-ジゴキシゲニン-Cy5複合体および共有結合で連結された［抗ジゴキシゲニン抗体-Cys］-［ジゴキシゲニン-Cys-Cy5］コンジュゲートのPKパラメータをインビボで決定した。そこで、ジゴキシゲニン-Cy5をその蛍光（A650）を使って決定し、対応する抗体を、ヒト化抗体を特異的に検出するELISA法によって決定した。ハプテンとカップリングしたペプチドの低分子量「代用物」としてジゴキシゲニン-Cy5を適用した。なぜなら、その蛍光特性により、血清における容易かつ正確な検出が可能になるからである。
ビオチン-Cy5またはビオチン-Cys-Cy5について説明したものと同じ方法で（実施例16参照）、ジゴキシゲニン-Cy5、または抗体複合体化ジゴキシゲニン-Cy5、もしくはさらに抗体-Cys連結ジゴキシゲニン-Cy5を雌NRMIマウスに静脈内注射した後、0.08時間、2時間、4時間および24時間の時点で血液を収集した。注射の5分後（t＝0.08時間）に両マウスに検出されたCy5媒介蛍光値を100％値に設定し、その後の時点で測定される蛍光値をそれとの比較で表した。
これらの実験の結果は、ジゴキシゲニン-Cy5の場合、注射の2時間後に検出できたのは、適用した蛍光（5分値）の10％未満であったことを実証している。それより後の時点、それぞれ注射の4時間後および24時間後では、Cy5媒介シグナルは検出できなかった（図14参照）。非複合体化化合物とは対照的に、抗体複合体化化合物は、はるかに高いレベルで検出することができ、遅い時点でも検出することができた（図14）。これは、抗体複合体化が小さな化合物ジゴキシゲニン-Cy5の血清中半減期を著しく増加させることを示している。さらにまた、共有結合で連結されたペイロードは、非共有結合で連結された複合体と比較して、より大きなPK延長を示す。ジゴキシゲニン-Cy5レベルと抗体レベルとを直接比較することによって、時間の経過に伴う抗体からのペイロードの喪失が示され、Cy5レベルは抗体レベルより速く減少していた。対照的に、共有結合で連結されたジゴキシゲニンコンジュゲートは、ほとんど同一なCy5血清中半減期とIgG血清中半減期とを示した（図14）。これは、ジスルフィド連結ペイロードが抗体に安定につながれたままであり、一方、非共有結合的複合体は時間の経過と共に解離することを示している。
実施例13
共有結合で連結されたハプテン-抗体複合体と、ハプテン結合部位を介して付着しているだけの複合体との、血清中半減期および曝露レベル
共有結合的複合体化が非共有結合で連結されたハプテン複合体のPK特性を改良するかどうかを分析するために、インビボでの抗ビオチン抗体とビオチン-Cy5との複合体のPK、および共有結合で連結されたコンジュゲート［抗ビオチン-抗体-Cys］-［ビオチン-Cys-Cy5］のPKを決定した。Cy5の存在は、毛細管中のCy5の蛍光を明らかにする動物の眼の光学的イメージングによって非侵襲的に決定した。注射の10分後に本発明者らがマウスの眼に検出したCy5媒介蛍光値を100％値と設定し、その後の時点で測定される蛍光値を、それとの比較で表した。これらの実験の結果を図15に示す。非複合体化ビオチン-Cy5は単独では低い血清中半減期および低い曝露レベルを有する。共有結合で連結されていない抗体複合体化化合物は、はるかに高いレベルで検出することができ、半減期も延長されていた。さらにまた、共有結合で連結されたペイロードは、非共有結合で連結された複合体と比較して、より大きなPK延長と、より高い血清中レベルとを示した。これは、ハプテン複合体化ジスルフィド連結ペイロードが非共有結合的複合体化ペイロードよりも循環中で安定であり、より高い曝露レベルに達しうることを示している。
実施例14
異なるハプテンに結合する抗体とのペプチドの複合体化および共有結合的コンジュゲーション
ハプテン結合性モジュールを応用してハプテン化化合物（＝ペイロード）をターゲティング媒体にカップリングすることは、ハプテン媒介送達の実現を可能にする技術的可能性の1つである。この概念は、化合物を捕捉しそれらをターゲティングモジュールにつなぐさらなるハプテンまたは他の物体に拡張することができる。例えばポリペプチドの送達または安定化のために、ジゴキシゲニンまたは他のハプテンに結合する単一または二重特異性抗体を応用して、治療用ポリペプチドを安定化し、PK最適化することができる。
ポリペプチド捕捉モジュールとして応用するための前提条件は、（i）ハプテンへの化合物のカップリングがポリペプチドの活性に深刻な妨害を加えないこと、および（ii）ハプテン化化合物への抗体の効果的結合/複合体化が可能であることである。
ハプテン指向的結合は、ハプテン化色素またはハプテン化ポリペプチドと抗ハプテンシステイニル化抗体との効率のよい共有結合的カップリングの前提条件である。
ハプテン化化合物と抗ハプテン抗体との、アフィニティーによって推進される複合体化が、効率のよいジスルフィド結合形成の前提条件であることを示すために、ビオチン-Cys-Cy5をヒト化抗ジゴキシゲニン抗体およびヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH53Cと共にインキュベートした。ビオチン-Cys-Cy5とヒト化抗ビオチン抗体およびヒト化抗ビオチン抗体VH53Cとのインキュベーションを対照反応として行った。
0.13mgのビオチン-Cys-Cy5を濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。0.7mgの各抗体を、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、6.7mg/ml（約46μM）の濃度で使用した。ビオチン-Cys-Cy5と抗体とを2.5:1のモル比（Ac-ビオチン-Cys-Cy5対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られた複合体/コンジュゲートを、SDS-PAGEとそれに続くポリアクリルアミドゲル内でのCy5関連蛍光の検出とによって、さらに分析した。15μgの複合体/コンジュゲートを4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）と混合し、95℃で5分インキュベートした。Cy5関連蛍光は、LumiImager Flデバイス（Roche）を使って645nmの励起波長で記録した。
非還元試料は、ヒト化抗ビオチン抗体VH53Cについて、共有結合部位特異的ジスルフィド結合形成を示し（図36、レーン4）、CDR2中にシステインを持たないヒト化抗ビオチン抗体を使用した場合は、極めて低いバックグラウンド蛍光シグナルであった（図36、レーン3）。ビオチン-Cys-Cy5は、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCにも共有結合的にカップリングしたが（図36、レーン2）、その効率は著しく低く、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体を使用した場合は低いバックグラウンドシグナルであった（図36、レーン1）。これは、ゲルの底部に検出される過剰なビオチンCys-Cy5（矢印）から推論することができる。ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCの場合は、ヒト化抗ビオチン抗体VH53C（レーン4）の場合よりも著しく多い、カップリングしていないビオチン-Cys-Cy5を検出することができる（レーン2）。試料を還元すると、Cy5関連蛍光は抗体重鎖および抗体軽鎖付近に検出できなくなることから、共有結合による連結が実際にはジスルフィド架橋によって形成されていることが示される。各ゲルのクーマシー染色は、各レーン中のタンパク質の総量が等しかったことを示している。
実施例15
ハプテン指向的結合は、ハプテン化色素またはハプテン化ポリペプチドと抗ハプテンシステイニル化抗体との効率のよい共有結合的カップリングの前提条件である
ハプテン化化合物と抗ハプテン抗体との、アフィニティーによって推進される複合体化が、効率のよいジスルフィド結合形成の前提条件であることを示すために、非ハプテン化ペプチドAc-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）（Biosynthan 1763.1、SEQ ID NO:178）をヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCおよびヒト化抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートした。1.4mgのAc-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）を濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。2mgの各抗体を、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、11〜13mg/ml（約75〜89μM）の濃度で使用した。Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）と抗体とを2.1:1のモル比（Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2対抗体））で混合した。ペプチドは、撹拌子を使って溶液を500rpmで撹拌しながら、3回に分けて加えた。各添加の間に、試料を200rpmで5分インキュベートした。最終回分の添加後に、試料を室温および200rpmで1時間インキュベートした。
その結果得られた複合体/コンジュゲートは、Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCコンジュゲートの場合は97％が単量体型IgG様分子、3％が二量体型可溶性凝集体であり、Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体複合体の場合は100％が単量体型であると、サイズ排除クロマトグラフィーによって判明した。さらにまた、結果として得られた複合体/コンジュゲートを質量分析によって分析した。Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCコンジュゲートの場合、検出された分子種のうちの17％は2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、51％は1つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、そして32％はペプチドがカップリングしていない抗体と同定された。Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体複合体の場合、抗体の100％がカップリングしていなかった。
実施例16
共有結合的ペイロードカップリングのためのシステイン突然変異を持つ適正にフォールディングされた機能的ハプテン結合抗体の形成に要求されるジスルフィドパターン
共有結合的化合物/ペイロードカップリング用のハプテン結合性モジュールは、ハプテン化化合物/ペイロードの共有結合による取り付けを可能にする余分なシステインを含有するIgGなどの「標準的」抗体で構成されうる。本明細書において報告する方法では、抗体機能性の基礎になる構造と配列を持つ折りたたまれたドメイン内に、必要な官能性（システイン）を導入する。抗体のドメイン内およびドメイン間に所定のジスルフィド結合が正しく形成されることは、正しい構造と機能性の形成および維持にとって不可欠である。図10Aには、無修飾抗体のFabなどといった機能的結合アームを形成するために要求されるジスルフィドパターンを示し、図10（B）には、VH52cB/VH53C突然変異型抗体誘導体の構造と機能性を維持するために必要なジスルフィドパターンを示す。適正なジスルフィドパターンを維持するには、VHドメインに導入された追加のシステインが占有されていない状態でなければならず、隣接するシステインと干渉したり、反応したりしてはならない。図10（C）および図10（D）は、追加システイン残基の付加によって、そのような分子の生合成中に、VHドメイン内に不正なジスルフィドが形成される可能性が生じることを示している。VH52bC/VH53Cという位置がVHドメイン内にある（そして他のシステインに非常に近接している）という事実は、不正なジスルフィドが重鎖の生合成中に形成されてしまうリスクを増大させる。別の潜在的問題は、VHドメインとVLドメインが分泌経路内で1つのFvフラグメントにアセンブルされてしまうことである。分泌経路は、酸化還元シャフリング条件と、ジスルフィド形成酵素およびジスルフィドシャフリング酵素とを伴う。したがって、VH52bC/VH53C突然変異を加えることによって不正なジスルフィドが導入される潜在的可能性は、軽鎖のジスルフィドにも「拡がり」うる（例示的に図10（E）に示す）。これは、不適正にフォールディングされた非機能的分子の取得/生成リスクを、さらに高めることになる。したがって、これらのリスクにもかかわらず、ハプテン化化合物/ペイロードに共有結合的につながる能力を有するVH52bC/VH53C突然変異を含有する均一な機能的抗体誘導体が良好な量で発現し、得られたことは、極めて驚くべきことである。
実施例17
共有結合的カップリング用のシステイン突然変異を持つ抗ハプテンジスルフィド安定化一本鎖Fvフラグメントの組成および生成
共有結合的化合物/ペイロードカップリングのためのハプテン結合性モジュールは、「IgGなどの「標準的」抗体からなりうる。あるいは、それらは組換えFvもしくはFabフラグメント、またはそれらの誘導体などの修飾された実体であってもよい。一本鎖Fvフラグメントは、完全長抗体に代わる代替物として、小さなモジュールサイズが必要とされる応用例や、二重特異性または多重特異性抗体誘導体を生成させるために追加の結合モジュールが望まれる応用例ではとりわけ、よく応用されている。生成させた抗ハプテンFv誘導実体の一例は、ジゴキシゲニン化化合物/ペイロードに結合しそれを共有結合でつなぐジスルフィド安定化一本鎖Fvである。抗ジゴキシゲニン抗体のVHドメインとVLドメインをフレキシブルなGlyおよびSerリッチリンカーで互いにつなぐことによって、Dig結合特異性を持つジスルフィド安定化一本鎖Fvを生成させた。これらのVHドメインおよびVLドメインは、VHの位置44およびVLの位置100（Kabatらに従う位置）にさらにシステイン突然変異を内包していた。これらの追加システインはVHとVLの間に安定な分子間ジスルフィド結合を形成する。これは、以前に述べられているように（例えばReiter, Y., et al, Nature Biotechnology 14（1996）1239-1245）、scFvを安定化する。
これに加えて、別のシステインを、Kabatナンバリングに従うVHの位置52bまたは位置53にそれぞれ導入することで、Fvフラグメントに共有結合的連結機能を付加した。
しかし、そのような突然変異をジスルフィド安定化Fvに導入することは、完全長抗体にそれらを入れることより、はるかに難易度が高い。一本鎖Fvフラグメントは、安定化実体およびヘテロ二量体化促進実体としての定常ドメインを欠いているので、本質的に、完全長IgGまたはFabフラグメントより不安定である。安定性は、VH44-VL100ジスルフィドなどの追加のシステイン突然変異をFvに入れることによって付与することができる。しかしこの安定化原理は、ジスルフィドが正しいシステイン間に正しい位置で形成された場合にのみ機能する。したがって、所定のドメイン内ジスルフィド（VH中に1つとVL中に1つ）に加えて、単一の所定の正しいドメイン間ジスルフィドを形成させる必要がある。非適合システイン間のジスルフィド接続は、ミスフォールディングされた不安定で非機能的な実体を生成させることになる。ジスルフィド安定化Fvフラグメントが6つのシステインを含有することを考慮すると、理論的には21の異なるジスルフィド接続が形成されうるが、3つの所定のジスルフィドの正しい組み合わせだけが、機能的な安定化dsscFvを形成することになる。この問題は、別の遊離システインをVHドメインに付加すれば、さらに困難になる。望ましい安定化dsscFvは2つの所定のドメイン内ジスルフィド（VH中とVL中に1つずつ）と1つの所定のドメイン間ジスルフィド（VHとVLの間）を含有し、そのうえ、ハプテン化化合物/ペイロードカップリング用に1つの遊離システインを（VHの位置52b/53に）含有する。共有結合的カップリング用に余分なシステイン突然変異を持つジスルフィド安定化Fvフラグメントが7つのシステインを含有することを考慮すると、理論的には数多くの異なるジスルフィド接続が形成しうるが、3つの所定のジスルフィドの正しい組み合わせと、VH52b/VH53の厳密な遊離システイン位置だけが、機能的で安定化された共有結合的カップリング能を有するdsscFvをもたらすことになる。さらに別の難問は、追加の遊離システイン（VH52b/VH53）が天然のシステインではなくジスルフィド安定化のために導入された突然変異であるVH44システインに近接しているという事実にある。VH44Cは、正しいドメイン間ジスルフィドを形成させるために必要であり、理論に拘泥するわけではないが、このジスルフィドはおそらくVHとVLの独立したフォールディングとアセンブリ後に形成されるのであろう。VH44CとVH52bC/VH53Cとが近接していることは、ドメイン内ジスルフィドが正しく形成されないリスクを悪化させる。しかし、ジゴキシゲニンに結合し、同時にジゴキシゲニン化ペイロードに共有結合でつながる能力を有する機能的ジスルフィド安定化一本鎖Fvモジュールを生産できることがわかった。正しいジスルフィドと正しい位置にある遊離システインとを含有するジスルフィド安定化一本鎖Fv分子の組成を、望ましくない不正にフォールディングした分子と比較して、図11に示す。VH52bC突然変異Fv抗体誘導体を持つこのDig結合性dsscFvの軽鎖可変領域および修飾重鎖可変領域を、SEQ ID NO:190（VH）に示し、対応するVLをSEQ ID NO:189に示す。二重特異性抗体誘導体を生成させるためのモジュールとしてのそのようなdsscFvの生成の成功については、実施例23（以下）、ならびに図13(A)、図13(B)、および図13(C)で述べる。
実施例18
共有結合でカップリングされた化合物/ペイロードの標的送達のための二重特異性抗ハプテン抗体誘導体の組成、発現および精製
共有結合的化合物/ペイロードカップリングのためのハプテン結合性抗体モジュールを含有する二重特異性抗体を生成させた。これらの抗体は、他の抗原へのターゲティングを可能にする結合モジュールをさらに含有している。そのような二重特異性抗体の応用例としては、ターゲティング抗原を保持する細胞または組織へのハプテン化化合物/ペイロードの特異的ターゲティングが挙げられる。生成させたそのような分子の一例は、腫瘍関連糖質抗原LeYを認識する結合領域を持つと同時に、ジゴキシゲニン化化合物/ペイロードに結合し、それらを共有結合でつなぐジスルフィド安定化Fvも持つ、二重特異性抗体である。そこで、ジスルフィド安定化一本鎖Fvを、フレキシブルなGlyおよびSerリッチコネクターペプチドで、LeY抗体のCH3ドメインのC末端につなぐことで、2つのLeY結合アームとさらに2つのジゴキシゲニン結合実体を持つ四価分子を得た。このジゴキシゲニン結合性実体は、以前に述べられたVH44-VL100ジスルフィド結合を内包していた（Reiter, Y., et al, Nature Biotechnology 14（1996）1239-1245）。ジゴキシゲニン結合性実体は、さらに、共有結合的カップリング用のVH52bC突然変異を含んでいた。このLeY-Dig抗体誘導体の軽鎖および修飾重鎖をコードする配列を、SEQ ID NO:191およびSEQ ID NO:192に示す。共有結合でカップリングされた化合物/ペイロード用の送達媒体としてのLeY-Dig二重特異性抗体誘導体の構成を、図12に略図で示す。
分子生物学的技法によって二重特異性分子を生成させ、培養細胞からの分泌によって発現させ、次に上記と同じ方法で培養上清から精製した。図13（A）は、細胞培養上清中に、抗体L鎖およびH鎖を検出するウェスタンブロット分析で可視化される、このLeY-Dig（52bC）二重特異性抗体の修飾H鎖およびL鎖が存在することを示している。図13（B）は、還元剤の存在下でのSDS-PAGE後のこれらの抗体の均一性を実証している。SDS-PAGEをクーマシーブリリアントブルーで染色すると、計算上の分子量に類似する見掛けの分子サイズを持つIgGに関係するポリペプチド鎖が可視化される。図13（C）は、プロテインA精製後のLeY-Dig（52bC）二重特異性抗体のSECプロファイルを示しており、タンパク質調製物が均一であって凝集体を含まないことを実証している。このように、ターゲティングモジュールとハプテン化化合物/ペイロードの共有結合的カップリングのためのモジュールとを含む二重特異性抗体を精製させ、均一な状態にまで精製することができる。
実施例19
ビオシチンアミドとの複合体を形成しているマウス抗ビオチン抗体FabフラグメントのX線構造決定
ビオシチンアミドとの複合体を形成しているマウス抗ビオチン抗体Fabフラグメントのタンパク質構造を決定した。そのために、Fabフラグメントの結晶を、0.8Mコハク酸中で成長させ、次に、抗体結晶にビオシチジンアミドを装填した（結晶化溶液で10mMの作業濃度に希釈し、結晶化液滴中の結晶に適用した）。結晶を2μlの10mMビオシチジンアミド溶液で3回洗浄し、最後にビオシチジンアミドと共に21℃で16時間インキュベートし、凍結保護物質として15％グリセロールを使って採取し、液体窒素中で瞬間凍結した。処理した回折像は、2.5Åの分解能でタンパク質構造を与えた。ビオチン結合性可変領域の構造および電荷組成を図19に示す。ビオチンは、CDR領域からのアミノ酸で構成される荷電領域に挟まれた表面ポケット中に結合する。複合体化ハプテンは負に荷電したアミノ酸クラスターに近接して配置される。ハプテンとして、そのカルボキシル基がペイロードカップリング用に誘導体化されているビオチンは、（COOH基を欠くため）この位置での電荷反発がないので、効率よく結合する。これに対して、遊離の（通常の）ビオチンは、そのカルボキシル基がこの負荷電クラスターに近接し、それゆえに反発を受けることになるので、抗体に効率よく結合することができない。
実施例20
抗ハプテン二重特異性抗体
二重特異性抗体は、LeYなどの腫瘍関連細胞表面抗原を認識すると同時に、例えばジゴキシゲニン（Dig）などのハプテンに結合する。図20Aに、以前に記述された完全長IgG由来フォーマットに基づいて、二重特異性抗体の組成を示す（Metz et al 前記、WO 2012/093068参照）。細胞表面抗原結合機能はIgG部分の2つのFabアームにあり、重鎖のC末端に組換え法で融合された2つの追加scFvは、ハプテン結合活性を有する。scFvモジュールは、Fvを安定化し、凝集を低減するために、追加の安定化鎖間ジスルフィド結合を保持している（VHCys44→VLCys100）。加えて、抗ハプテン抗体は、二重特異性抗ハプテン抗体とポリペプチド毒素との間で共有結合であるジスルフィド結合の形成が可能になるように、それぞれの抗体のCDR2の実際の長さに依存して、Kabatナンバリングに従う位置VH52bまたはVH53に人為的システイン残基を有する。
LeYとDigに結合するDig-VH Cys含有二重特異性抗体のL鎖およびH鎖の配列を、SEQ ID NO:198およびSEQ ID NO:199に示す。
以前に記載されているように（Metz et al 前記, WO 2012/093068参照）、二重特異性抗体を懸濁状態のHEK293細胞において一過性に生産し、培養上清から精製した。軽鎖および重鎖をコードするプラスミド、またはFab-Fv融合物のプラスミドを、HEK293懸濁細胞に同時トランスフェクトし、それを無血清培地で培養した。トランスフェクションの7日後に遠心分離と0.22μm濾過によって上清を清澄化した。二重特異性抗体を、プロテインと、それに続くpH6.0の20mMヒスチジン、140mM NaClで平衡化したSEC（Superdex200 HiLoad 26/60, GE Healthcare）とによって精製した。タンパク質濃度は、320nmをバックグラウンドとする280nmにおける光学密度によって決定し、精製タンパク質の均一性をSDS-PAGEによって確認した。
その結果得られた、この研究において適用された二重特異性抗体調整物の組成、純度および均一性（SECおよびSDS PAGE）を、図20Bに示す。
実施例21
二重特異性抗ハプテン抗体における正しいジスルフィドおよびアクセス可能なシステインの取得
ポリペプチド毒素との共有結合的カップリング用のハプテン結合モジュールは、ハプテン化ポリペプチド毒素とのジスルフィド結合を形成させるために1つまたは複数の追加のシステイン残基を含有するIgGなどの「標準的」抗体で構成される。本明細書において報告する方法では、抗体機能性の基礎になる構造と配列を持つ折りたたまれたドメイン内に、必要な官能性（システイン）を導入する。抗体のドメイン内およびドメイン間に所定のジスルフィド結合が正しく形成されることは、正しい構造と機能性の形成および維持にとって不可欠である。図10（A）には、無修飾抗体のFabなどといった機能的結合アームを形成するために要求されるジスルフィドパターンを示し、図10（B）には、VH52cB/VH53C突然変異型抗体誘導体の構造と機能性を維持するために必要なジスルフィドパターンを示す。適正なジスルフィドパターンを維持するには、VHドメインに導入された追加のシステインが鎖内ジスルフィド結合で占有されていない状態でなければならず、隣接するシステインと干渉したり、反応したりしてはならない。図10（C）および図10（D）は、人為的システイン残基の付加によって、そのような分子の生合成中に、VHドメイン内に不正なジスルフィドが形成される可能性が生じることを示している。VH52bC/VH53Cの位置がVHドメイン内、実際にはCDR2中にある（そして他のシステインに非常に近接している）という事実は、不正なジスルフィドが重鎖の生合成中に形成されてしまうリスクを悪化させる。もう1つの潜在的問題は、VHドメインとVLドメインが分泌経路内で1つのFvフラグメントにアセンブルされてしまうことである。分泌経路は、酸化還元シャフリング条件と、ジスルフィド形成酵素およびジスルフィドシャフリング酵素とを伴う。したがって、VH52bC/VH53C突然変異の付加によって不正なジスルフィドが導入される潜在的可能性は、軽鎖のジスルフィドにも「拡がり」うる（例示的に図10（E）に示す）。これは、不適正にフォールディングされた非機能的分子の取得/生成リスクを、さらに高めることになる。したがって、これらのリスクにもかかわらず、機能的であってハプテン化ポリペプチド毒素に共有結合的につながる能力を有する、VH52bC/VH53C突然変異を含有する均一な機能的抗体誘導体が良好な量で発現し、得られたことは、極めて驚くべきことである。
正しい遊離システインを維持しつつ正しいジスルフィドを組み立てるという課題は、二重特異性抗体の生成ではさらに難しくなる。共有結合的カップリング用のシステイン突然変異を持つ抗ハプテンジスルフィド安定化一本鎖Fvフラグメントを生成させるために、共有結合的ポリペプチド毒素カップリングのためのハプテン結合モジュールは、IgGなどの「標準的」抗体からなりうる。あるいは、それらはFvフラグメントまたはFabフラグメントなどの抗体フラグメント、またはそれらの誘導体であってもよい。一本鎖Fvフラグメントは、完全長抗体に代わる代替物として、小さなモジュールサイズが必要とされる応用例や、二重特異性または多重特異性抗体誘導体を生成させるために追加の結合モジュールが望まれる応用例ではとりわけ、よく応用されている。生成させた抗ハプテンFv由来実体の一例は、ジゴキシゲニン化ポリペプチド毒素に結合しそれを共有結合でつなぐジスルフィド安定化一本鎖Fvである。抗ジゴキシゲニン抗体のVHドメインとVLドメインをフレキシブルなGSリンカーで互いにつなぐことにより、ジゴキシゲニン結合特異性を持つジスルフィド安定化一本鎖Fvを生成させた。これらのVHドメインおよびVLドメインは、VHの位置44およびVLの位置100（Kabatらに従う位置）にさらにシステイン突然変異を内包していた。これらの追加システインはVHとVLの間に安定な分子間ジスルフィド結合を形成する。これは、以前に述べられているように（例えばReiter, Y., et al, Nature Biotechnology 14（1996）1239-1245）、scFvを安定化する。
これに加えて、もう1つのシステインを、Kabatナンバリングに従うVHの位置52bまたは位置53にそれぞれ導入することで、Fvフラグメントに共有結合的連結機能を付加した。しかし、そのような突然変異をジスルフィド安定化Fvフラグメントに導入することは、完全長抗体にそれらを入れることより、はるかに難易度が高い。一本鎖Fvフラグメントは、安定化実体およびヘテロ二量体化促進実体としての定常ドメインを欠いているので、本質的に、完全長IgGまたはFabフラグメントより不安定である。安定性は、VH44-VL100ジスルフィドなどの追加のシステイン突然変異をFvに入れることによって付与することができる。しかしこの安定化原理は、ジスルフィドが正しいシステイン間に正しい位置で形成された場合にのみ機能する。したがって、所定のドメイン内ジスルフィド（VH中に1つとVL中に1つ）に加えて、単一の所定の正しいドメイン間ジスルフィドを形成させる必要がある。非適合システイン間のジスルフィド接続は、ミスフォールディングされた不安定で非機能的な実体を生成させることになる。ジスルフィド安定化Fvフラグメントが6つのシステインを含有することを考慮すると、理論的には21の異なるジスルフィド接続が形成されうるが、3つの所定のジスルフィドの正しい組み合わせだけが、機能的な安定化一本鎖ジスルフィド安定化Fvフラグメント（dsscFv）を形成することになる。この課題は、もう1つの遊離システインをVHドメインに付加すれば、さらに困難になる。望ましいジスルフィド安定化Fvフラグメント（dsscFv）は2つの所定のドメイン内ジスルフィド（VH中とVL中に1つずつ）と1つの所定のドメイン間ジスルフィド（VHとVLの間）を含有し、そのうえ、ハプテン化化合物/ペイロードカップリング用に1つの遊離システインを（VHの位置52b/53に）含有する。共有結合的カップリング用に追加のシステイン突然変異を持つジスルフィド安定化Fvフラグメントが7つのシステインを含有することを考慮すると、理論的には数多くの異なるジスルフィド接続が形成しうるが、3つの所定のジスルフィドの正しい組み合わせと、VH52b/VH53の厳密な遊離システイン位置だけが、機能的で安定化された共有結合的カップリング能を有するdsscFvをもたらすことになる。さらにもう1つの難問は、追加の遊離システイン（VH52b/VH53）が天然のシステインではなくジスルフィド安定化のために導入された突然変異であるVH44システインに近接しているという事実にある。VH44Cは、正しいドメイン間ジスルフィドを形成させるために必要である。この理論に拘泥するわけではないが、このジスルフィドはおそらくVHとVLの独立したフォールディングとアセンブリ後に形成されるのであろう。VH44CとVH52bC/VH53Cとが近接していることは、ドメイン内ジスルフィドが正しく形成されないリスクを悪化させる。しかし、ジゴキシゲニンに結合し、同時にジゴキシゲニン化ポリペプチド毒素に共有結合でつながる能力を有する機能的ジスルフィド安定化一本鎖Fvモジュールを生産できることがわかった。正しいジスルフィドと正しい位置にある遊離システインとを含有するジスルフィド安定化一本鎖Fv分子の組成を、望ましくない不正にフォールディングした分子と比較して、図11に示す。
実施例22
ハプテン化シュードモナス外毒素誘導体
シュードモナス外毒素は、そのN末端ドメインIで真核細胞に結合し、内部移行し、ドメインII中で加水分解的にプロセシングされて、C末端ドメインIIIを細胞質中に放出する、66kDaタンパク質である。ドメインIIIはeEF2をADPリボシル化し、それがタンパク質合成の阻害とそれに続く細胞死を引き起こす。切断型変異体を、本明細書においてポリペプチド毒素として使用するものを含めて、図21に示す。分子NLysPE38では細胞結合ドメインIとドメインIBとが欠失している（Weldon, J.E. and Pastan, I., FEBS Journal 278（2011）4683-4700; Debinski, W. and Pastan, I., Cancer Res. 52（1992）5379-5385）。この分子は、単独では、細胞傷害能が非常に低い。NLysPE38はそのN末端近くにリジン残基（N-Lys）を含み、これを、NHSケミストリーで化学修飾することができる。dsscFv融合物に関して、プロセシング部位が保たれている限り、ドメインIIの大部分も、効力を失うことなく欠失させうることが、最近示された（Weldon, J.E. and Pastan, I., FEBS Journal 278（2011）4683-4700; Hansen, J.K., et al., J. Immunother. 33（2010）297-304; Pastan, I., et al., Leukemia & Lymphoma 52（2011）Supp. 2:87-90）。そのような融合タンパク質内での毒素のサイズは約25kDaである。切断型毒素はドメインIII中にまだリジン残基を含有している。以前に記載された毒素NlysPE38QQRでは、NHSなどのアミン修飾試薬によってドメインIIIが不活化されるリスクを低減するために、ドメインIIIのリジンがグルタミンまたはアルギニンで置き換えられている（Debinski, W. and Pastan, I., Cancer Res. 52（1992）5379-5385; Debinski, W. and Pastan, I., Bioconjug. Chem. 5（1994）40-46）。本明細書では、ドメインIおよびIBと共にドメインIIの大部分が欠失しており（CD22-LR8M（Pastan, I., et al., Leukemia & Lymphoma 52（2011）Supp.2:87-90）の毒素部分）、かつドメインIII中のリジンがセリンまたはグルタミンに交換されている（NlysPE40QQR類似の突然変異）、新しいポリペプチド毒素変異体NLysPE25SQΔを報告する。加えて、この変異体は、C末端リジンも欠失しており、（NlysPE38の）アミノ末端リジン伸長部を持っている。これにより、NLysPE25SQΔは、そのN末端に唯一のリジンを含有するかなり小さな毒素部分になる。このリジンの1級アミン（およびN末端の1級アミン）は、毒素の他の位置に影響を及ぼすことなくNHS試薬で修飾することができる。NLysPE25SQΔ（PE25）を大腸菌で生産し、アニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによってペリプラズムから精製することで、NLysPE38について以前に記述されているように、凝集体およびサイズの小さい不純物を除去した（Debinski, W. and Pastan, I., Cancer Res. 52（1992）5379-5385; Debinski, W. and Pastan, I.,Bioconjug. Chem. 5（1994）40-46）。凝集体を含まない均一な調製物を良好な収率で得ることができた（＞1g/L培養、図21BにSDS-PAGE分析）。NLysPE25SQΔをジゴキシゲニン化するために、活性エステルであるジゴキシゲニン-NHSを、リジンの1級アミノ基を修飾するために適用した。タンパク質のN末端もNHS媒介ジゴキシゲニンコンジュゲーションのターゲットとして役立ちうる。以後の二重特異性抗体-ポリペプチド毒素共有結合的複合体形成が、これら2つの嵩高いパートナー間の立体障害によって妨害されることを避けるために、短いがフレキシブルなリンカーをジゴキシゲニンとNHSとの間、すなわちジゴキシゲニンとポリペプチド毒素との間に置いた。本明細書の残りの部分では、NLysPE25SQΔをPE25と名付ける。
二重特異性抗体へのハプテン媒介共有結合的カップリングのための追加のシステインを含有するポリペプチド毒素誘導体を生成させるために、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の前または後のいずれかにシステインを工学的にPE25に組み入れた。これらのPE誘導体を、PE25と同じ方法で生産し、精製した。ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の前に人為的ポリペプチドシステイン残基を有するPE25変異体をNCK-PE25と名付け、ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の後に人為的ポリペプチドシステイン残基を有するPE25変異体をNKC-PE25と名付ける。PE25、NCK-PE25およびNKC-PE25の配列の比較を図21Cに示す。
PE25の配列をSEQ ID NO:194に示す。リジンがセリンで置き換えられているS-PE25誘導体の配列をSEQ ID NO:195に示す。NKC-PE25の配列をSEQ ID NO:196に示す。NCK-PE25の配列をSEQ ID NO:197に示す。
実施例23
ターゲティング媒体への毒素の共有結合的連結
PE25誘導体をジゴキシゲニン-カルボキシメチル-NHSエステルと反応させた（DE3836656, Metz et al.,前記）。次に、反応物をPD10カラムに通すことにより、小さな未反応化合物と反応生成物（NHS）とを、ジゴキシゲニン化25kDaポリペプチド毒素から分離した後、滅菌濾過した。抗体カップリングに先だって、ジゴキシゲニン化ポリペプチド毒素をDTEで還元し、次に再びPD10カラムに通すことによって、還元剤を除去した。次に、ジゴキシゲニン化ポリペプチド毒素を抗ジゴキシゲニン二重特異性抗体と共に、緩衝水溶液中、10〜30mg/ml（二重特異性抗体）の濃度で、室温で10分間インキュベートすることにより、二重特異性抗体とジゴキシゲニン化ポリペプチド毒素とを含有する複合体を生成させた。IgG-Fv融合物中の抗ジゴキシゲニン部分の二価性ゆえに、ジゴキシゲニン化ポリペプチド毒素を、2:1（ポリペプチド毒素対二重特異性抗体）のモル比で適用した。生成した複合体を（遊離毒素を全て除去するために）プロテインAクロマトグラフィーで精製した後、それ以上修飾することなく、分析およびアッセイに使用した。非還元SDS-PAGE分析および還元SDS-PAGE分析と、その後のウェスタンブロット分析による毒素部分の検出とにより（図22）、ジスルフィド連結二重特異性抗体ポリペプチド毒素複合体の形成が実証された。激しい変性条件下（SDS;煮沸）では、非還元条件において、毒素は、共有結合で連結された毒素を持つ重鎖に相当する高分子量バンドに現れる。したがって、毒素は安定であり、二重特異性抗体に共有結合で連結されている。還元条件下では、毒素は抗体から分離され、その小さな分子量に応じて移動する。このことは、ウェスタンブロット分析においてポリペプチド毒素を抗PE抗体と抗ジゴキシゲニン抗体で検出することによって実証することができた。これにより、安定二重特異性抗体とポリペプチド毒素との連結が、工学的に設計されたジスルフィドの特異的形成によることも確認される。ジゴキシゲニン結合性抗体部分と複合体化し安定にジスルフィド結合したジゴキシゲニン化-PE25、NCK-PE25およびNKC-PE25の構成要素の相対的サイズでのモデルおよび組成を図22Bおよび図22Cに示す。
実施例24
共有結合的複合体媒介ポリペプチド毒素送達
ポリペプチド毒素を送達するための本明細書において報告する共有結合的コンジュゲートの機能性、特異性および効力を評価するために、MCF-7細胞を、二重特異性抗体とポリペプチド毒素との共有結合的コンジュゲートに曝露した。MCF7はその表面にLeY抗原を発現し、LeYに結合するPE由来のイムノトキシンに対して感受性である（Metz, S., et al.,前記参照）。これらの細胞の生存性および増殖を、代謝活性または細胞増殖を決定するアッセイによって評価した。これらはどちらも当業者には周知の方法である。毒素への曝露後の細胞の生存性を決定するために、細胞表面標的二重特異性抗体-ポリペプチド毒素コンジュゲートを添加した48時間後または72時間後に、Cell Titer Glo（CTG）アッセイを使って、細胞ATP含量（代謝活性を反映する）を決定した。増殖に対するポリペプチド毒素曝露の影響は、細胞表面標的二重特異性抗体-ポリペプチド毒素コンジュゲートを添加した48時間後または72時間後に、BrdU（ブロモデオキシウリジン）取り込み（すなわちDNA合成）アッセイによって測定した。全てのアッセイを96ウェルプレート中、サブコンフルエント培養で、三つ組で行った。図23に示すBrdUアッセイ結果は、MCF-7細胞をPE25誘導体を含有する細胞表面標的二重特異性抗体-ポリペプチド毒素コンジュゲートと共にインキュベートすると、増殖の著しい標的容量依存的低減が見られたことを実証している。
これは、本明細書において報告する細胞表面標的二重特異性抗体-ポリペプチド毒素コンジュゲートが、結合および送達特異性（ターゲティング）ならびにペイロード機能性（例えば腫瘍細胞に対する細胞傷害活性）に関して、完全に機能的であることを、非共有結合的二重特異性抗体-ハプテン化ポリペプチド毒素複合体より安定であるという利点と共に実証している。
実施例25
小胞コンパートメントにおける抗体とハプテン化ポリペプチドとの分離
本明細書において報告する共有結合的複合体は、抗ハプテン結合特異性を含む二重特異性細胞ターゲティング抗体（bsAb）によって、細胞に、そして細胞中に、送達されうる。一部のポリペプチドについては、これらの複合体が、細胞質または他の細胞内コンパートメントに進入することが必要である。それらには、例えばがん治療において適用される細胞傷害性実体などがある。細胞ターゲティングbsAbによって送達されるポリペプチドをターゲット細胞内で放出する必要がある場合もあるだろう。
細胞内放出を決定するために、LeY抗原に結合しかつジスルフィド安定化一本鎖Fv付加物として抗ビオチン結合性実体を保持するLeY-Dig（52bC）二重特異性抗体（実施例18および実施例20参照）を使用した。ビオチン-Cys-Cy5と共にインキュベートすると、共有結合的ジスルフィド-コンジュゲート複合体が生成した。LeY抗原は乳がん細胞上に豊富に存在し、内部移行し、LeY結合性抗体誘導体は細胞（例えばMCF7）に、そしてその細胞中に、ペイロードを送達することが、以前に示されている。bsAbを検出するためのAlexa標識二次抗体とCy5を検出するための蛍光とを使用する共焦点顕微鏡分析により、共有結合的コンジュゲートはMCF7に結合し、MCF7中に内部移行することが示された（図24）。時間が経過すると、例えば適用の6時間後には、抗体からのビオチンの分離を観察することができるので、bsAbとビオチンは細胞中ではつながれたままではない。分離したbsAbは、bsAbストレッチ/ドメインが無傷であることを検出のために要求する二次抗体によって可視化された。したがって、観察された細胞内ペイロード放出は、主に細胞内還元およびハプテン解離によって、その引き金が引かれる。

Claims (12)

  1. ハプテン化ポリペプチド毒素と抗ハプテン抗体とを含むコンジュゲートであって、
    ポリペプチド毒素がリジン残基でハプテンにコンジュゲートされており、
    ハプテン化ポリペプチド毒素が抗ハプテン抗体にジスルフィド結合によってコンジュゲートされており、
    ジスルフィド結合が、
    i）ハプテンコンジュゲーションに使用されるリジン残基の1残基もしくは2残基前または1残基もしくは2残基後のいずれかにあるハプテン化ポリペプチド毒素のシステイン残基
    と、
    ii）該抗体のKabatに従って決定される重鎖CDR2中のシステイン残基
    との間に形成されている、コンジュゲート。
  2. 前記抗体のCDR2中のシステイン残基のアルファ炭素原子が、ハプテンがコンジュゲートされているポリペプチドのリジン残基の原子（ハプテンは、ポリペプチドに直接コンジュゲートされているか、リンカーを介してコンジュゲートされている）から約10〜11オングストローム離れている、請求項1記載のコンジュゲート。
  3. システイン残基がリジン残基の2残基前または2残基後にある、請求項1〜2のいずれか一項記載のコンジュゲート。
  4. リジン残基がポリペプチド毒素のN末端アミノ酸の10残基内にある、請求項1〜3のいずれか一項記載のコンジュゲート。
  5. ポリペプチド毒素がそのアミノ酸配列内に厳密に1つのリジン残基を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のコンジュゲート。
  6. 前記抗体の重鎖CDR2中のシステイン残基が、Kabatの重鎖可変ドメインナンバリングに従う位置52bまたは位置53にある、請求項1〜5のいずれか一項記載のコンジュゲート。
  7. 前記抗体が、非ハプテン抗原に対する第1結合特異性とハプテンに対する第2結合特異性とを含む二重特異性抗体である、請求項1〜6のいずれか一項記載のコンジュゲート。
  8. 酸化還元活性作用物質を添加することなくジスルフィド結合が形成される、請求項1〜7のいずれか一項記載のコンジュゲート。
  9. ハプテンが、ビオチン、またはテオフィリン、またはジゴキシゲニン、またはカルボラン、またはフルオレセイン、またはブロモデオキシウリジンである、請求項1〜8のいずれか一項記載のコンジュゲート。
  10. 請求項1〜9のいずれか一項記載のコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤。
  11. 医薬として使用するための、請求項1〜9のいずれか一項記載のコンジュゲート。
  12. 医薬が、がんを処置するための医薬である、請求項11記載のコンジュゲート。
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