KR102278429B1 - 공유 연결된 폴리펩티드 독소-항체 콘쥬게이트 - Google Patents

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Abstract

본원에는 합텐화된 폴리펩티드 독소 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트로서, 디술피드 결합이 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후의 시스테인 잔기와 항체의 CDR2 (CDR2 는 Kabat 에 따라 결정됨) 내의 시스테인 잔기 사이에서 형성되는 콘쥬게이트가 보고되어 있다.

Description

공유 연결된 폴리펩티드 독소-항체 콘쥬게이트 {COVALENTLY LINKED POLYPEPTIDE TOXIN-ANTIBODY CONJUGATES}
본원에는 복합체의 성분이 단일 결합을 통해 서로 공유 연결되는, 폴리펩티드 독소 및 항체를 포함하는 복합체가 보고된다. 또한 상기 공유 복합체의 제조 방법 및 이의 용도가 보고된다.
현재 이용가능한 합텐-기반 전달 플랫폼의 제약은 합텐과 전달 비히클 사이의 비-공유 연결이다. 전달 비히클과 페이로드 (payload) 사이의 안정한 연결이 요망되는 적용에서, 비-공유 전달 비히클-페이로드 복합체는, 비-공유 연결된 페이로드가 전달 비히클로부터 해리될 수 있기 때문에 부적합할 수 있다.
이것은 예를 들어, 종양에 표적할 것이고, 표적화된 전달 비히클로부터의 페이로드의 미성숙한 방출의 경우, 부작용 (즉, 비-특이적 독성) 을 야기하는 독성 페이로드에 대해 특정 문제를 야기할 수 있다.
상기 단점을 해결하기 위해 상이한 접근법이 보고되어 있다. 그러나, 이들 기술 중 어느 것도 표적을 벗어난 (off-target) 활성 없이 독성 페이로드, 특히 독성 폴리펩티드를 가능하게 하는 강력하고 보편적인 플렛폼을 제공하지 않는다.
하나의 접근법은 페이로드를 페이로드를 안정화시키는 개체에 융합하는 것이다. 이러한 개체의 예는 인간 혈청 알부민 또는 인간 면역글로불린 Fc-영역이다. 이러한 접근법은 자연 발생적 아미노산 잔기로 구성되고 이들의 생물학적 활성을 잃지 않으면서 이들의 C- 또는 N-말단에서의 변형을 용인하는 많은 선형 폴리펩티드에 적용가능하다. 시클릭, 스테이플식 (stapled) 이며, 비-자연적 아미노산 잔기, 또는 추가적인 변형을 함유하는 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생성될 수 없다. 그러나, 이러한 폴리펩티드는 프로테아제 안정성, 활성 및 특이성에 있어서 '정상' 선형 펩티드에 비해 종종 우수하기 때문에, 치료적 적용에 바람직한 선택이 될 수 있다. 그러나 이들 융합에는 표적화된 전달이 빠져 있다.
시클릭, 스테이플식이거나 비-자연적 구조를 함유하는 것들에게 또한 적용될 수 있는 치료적 폴리펩티드의 PK/안정성 및 생물물리학적 거동을 향상시키기 위한 한 접근법은 예를 들어 페길화 (PEGylation) 또는 헤실화 (HESylation) 에 의한, 중합체에 대한 화학적 또는 효소적 콘쥬게이션이다. 그러나, 이러한 변형은 종종 폴리펩티드의 생물학적 활성의 상당한 감소를 야기하고, 특정 상황 하에서는 안정성 및 독성 문제에 대한 이유일 수 있다. 또한 이들 변형은 표적화 개체가 빠져 있다.
치료적 폴리펩티드의 안정화 또는 PK 조정을 위한 대부분의 기존 화학적 커플링 기술의 주요 단점은 그 복잡성에 있다. 화학적 커플링 단계 외에 상기 방법은 많은 경우 불확실한 화학량론을 갖고/갖거나 비규정된 위치에서의 PK-조정 개체와 연결되는 폴리펩티드 변이체의 혼합물을 초래한다. 부가적으로 현재 사용되는 폴리펩티드 변형-기술은 종종 치료적 폴리펩티드의 강하게 감소된 또는 심지어 완전한 소실을 초래한다. 또한, 화학적 콘쥬게이트의 약물학적 특성 및/또는 가능한 분해 경로를 예측하기가 어렵다.
문헌 Metz, S., et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 8194-8424) 에서는 표적화된 페이로드 전달을 위한 이특이적 디곡시게닌-결합 항체를 보고한다. 비-공유 항체 복합체 형성을 통한 합텐화된 펩티드의 PK 변형은 문헌 Hoffmann, E., et al. (J. Contr. Rel. 171 (2013) 48-56) 에 의해 보고된다. WO 2012/093068 에는 펩티드에 콘쥬게이션된 항-dig 항체 및 디곡시게닌의 복합체의 약학 조성물이 보고되어 있다. ley 항원 발현 종양 세포에 대항하는 재조합 면역독소의 비교: 친화성, 크기, 및 안정성의 영향은 Bera et al. 에 의해 보고된다 (Bioconjug. Chem. 9 (1998) 736-743). Lee H Pai et al. 등은 모노클로날 항체 B3 로 만들어진 면역독소 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소의 다양한 형태의 항-종양 활성을 보고한다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 3358-3362).
US 5,804,371 에는 합텐-표지된 펩티드 및 면역학적 검출 방법에서의 이들의 용도가 보고되어 있다. 디곡시게닌-표지된 펩티드 (Bradykinin: 브래디키닌) 및 염증이 생긴 조직에서의 브래디키닌의 화학발광효소 면역어세이에 대한 이의 적용이 Decarie A., et al. 에 의해 보고된다 (Peptides 15 (1994) 511-518).
WO 2004/065569 에는 다-작용성 항체가 보고되어 있다.
WO 2014/006124 에는 공유 연결된 항원-항체 콘쥬게이트가 보고되어 있다.
합텐화된 폴리펩티드 독소와 항-합텐 항체 사이의 공유 결합의 형성에 의해, 폴리펩티드 독소의 안정화 및 PK-특성 개선이 달성될 수 있다는 것으로 밝혀졌다. 상기 공유 결합은 항-합텐 항체의 가변 영역 내에 도입된 제 1 시스테인 잔기 (인공 항체 시스테인 잔기) 와 폴리펩티드 독소 내에 도입된 또는 존재하는 제 2 시스테인 잔기 ((인공) 폴리펩티드 시스테인 잔기) 사이에 형성된다.
인공 항체 시스테인 잔기는 항-합텐 항체의 CDR 중 하나 내에 위치하지만, 항-합텐 항체의 합텐 결합 특성을 간섭하지 않는다. (인공) 폴리펩티드 시스테인 잔기는 합텐화된 폴리펩티드 독소의 합텐이 항-합텐 항체에 의해 결합되는 경우 인공 항체 시스테인 잔기와 가까운 근접성으로 (가까운 공간적 거리) 에 있다. 이것은 합텐화된 폴리펩티드 독소와 항-합텐 항체 사이의 공유 결합의 형성을 허용한다.
(인공) 폴리펩티드 시스테인 잔기가 폴리펩티드 독소의 아미노산 서열 내에 포함될 수 있고, 따라서, 시스테인 잔기를 폴리펩티드 독소와 합텐을 연결하는 링커 내에 도입하는 것과는 대조적으로, 폴리펩티드 독소 그 자체의 코딩 영역 내에 있다는 것이 밝혀졌다.
재조합 제조 후 인공 항체 시스테인 잔기 및 (인공) 폴리펩티드 시스테인 잔기 둘 다가 또다른 시스테인 잔기 또는 글루타티온과 디술피드 내에서 적어도 부분적으로 "블록킹" 되는 것으로 예상된다. 그럼에도 불구하고 그리고 매우 놀랍게도 재조합으로 제조된 인공 시스테인-함유 항-합텐 항체 및 (인공) 시스테인-함유 합텐화된 폴리펩티드 독소의 혼합물이 부가적인 시약 없이 요구되는 경우, 안정한 디술피드 결합이 자발적 위치지정된 산화환원-셔플링 반응에 의해 형성되는 것이 발견된다. 공유 항체-폴리펩티드 독소 콘쥬게이트는 순환 내에서 비-공유 복합체보다 더욱 안정하다는 장점이 있는 결합 및 전달 특이성 (표적화) 뿐 아니라 폴리펩티드 독소 작용성 (즉, 종양 세포에 대항하는 세포독성 활성) 에 있어서 완전히 작용적이다. 항체와 폴리펩티드 독소를 연결하는 디술피드 결합이 세포 내부에서 분할되고, 따라서 폴리펩티드 독소가 공유 복합체로부터 세포 내부에서 특이적으로 방출되는 것이 발견되었다.
본원에 보고되는 바와 같은 하나의 양상은 합텐화된 폴리펩티드와 항-합텐 항체의 (공유) 콘쥬게이트이고, 디술피드 결합이 폴리펩티드의 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후의 시스테인 잔기와 항체의 CDR2 (CDR2 는 Kabat 에 따라 측정됨) 내의 시스테인 잔기 사이에서 형성된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드 독소이다.
하나의 구현예에서 시스테인 잔기는 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후의 1 내지 3 개의 잔기이다. 본 구현예에서, 시스테인 잔기는 라이신 잔기 (N) 에 대해 위치 N-3, N-2, N-1, N+1, N+2 또는 N+3 중 하나에 있다.
하나의 구현예에서 시스테인 잔기는 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 (즉, 라이신 잔기에 대해 위치 N-2 에서) 또는 후 (즉, 라이신 잔기에 대해 위치 N+2 에서) 의 2 개의 잔기이다.
하나의 구현예에서 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기는 폴리펩티드의 10 개의 N-말단 아미노산 잔기 내에 있다.
하나의 구현예에서 폴리펩티드는 그의 아미노산 서열 내에 정확하게 1 개의 라이신 잔기를 포함한다.
본원에 보고되는 바와 같은 하나의 양상은 합텐화된 폴리펩티드 독소 및 항-합텐 항체의 (공유) 콘쥬게이트이고, 디술피드 결합이 폴리펩티드 독소의 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후의 1 내지 3 개의 잔기인 시스테인 잔기와 항체의 CDR2 (CDR2 는 Kabat 에 따라 측정됨) 내의 시스테인 잔기 사이에서 형성된다.
본원에 보고되는 바와 같은 하나의 양상은, 폴리펩티드가 그의 아미노산 서열 내에 정확하게 하나의 라이신 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 (공유) 콘쥬게이트이고, 디술피드 결합이 폴리펩티드 내의 시스테인 잔기와 항체의 CDR2 (CDR2 는 Kabat 에 따라 측정됨) 내의 시스테인 잔기 사이에서 형성된다.
하나의 바람직한 구현예에서 폴리펩티드는 폴리펩티드 독소이다.
하나의 구현예에서 디술피드 결합의 일부인 폴리펩티드 내의 시스테인 잔기는, 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후에 있다.
하나의 구현예에서 시스테인 잔기는 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후의 1 내지 3 개의 잔기에 있다. 본 구현예에서, 시스테인 잔기는 라이신 잔기 (N) 에 대해, 위치 N-3, N-2, N-1, N+1, N+2 또는 N+3 중 하나에 있다.
하나의 구현예에서 시스테인 잔기는 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 (즉, 라이신 잔기에 대해 위치 N-2 에서) 또는 후 (즉, 라이신 잔기에 대해 위치 N+2 에서) 의 2 개의 잔기이다.
하나의 구현예에서 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기는 폴리펩티드의 10 개의 N-말단 아미노산 잔기 내에 있다.
임의의 합텐은, 그 사이에 디술피드 결합이 형성되는 폴리펩티드 내의 시스테인 잔기 ((인공) 폴리펩티드 시스테인 잔기) 및 항체의 CDR2 내의 시스테인 잔기 (인공 항체 시스테인 잔기) 의 올바른 공간적 방향을 허용하는 링커와의 유도체화시 본원에 보고되는 콘쥬게이트 및 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서 항-합텐 항체는 합텐화된 폴리펩티드의 합텐에 특이적으로 결합한다 (항-합텐 항체).
하나의 구현예에서 CDR2 는 중쇄 CDR2 이다.
하나의 구현예에서 합텐화된 폴리펩티드는 합텐, 링커 및 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 구현예에서 폴리펩티드는 페이로드에 추가로 콘쥬게이션된다.
하나의 구현예에서 폴리펩티드는 폴리펩티드 독소이다. 하나의 구현예에서 폴리펩티드 독소는 PE25 이다.
하나의 구현예에서 항체의 중쇄 CDR2 내의 시스테인 잔기는 Kabat 의 중쇄 가변 도메인 번호지정에 따라, 위치 52, 또는 위치 52a, 또는 위치 52b, 또는 위치 52c, 또는 위치 52d, 또는 위치 53 에 있다.
하나의 구현예에서 항체의 중쇄 CDR2 내의 시스테인 잔기는 Kabat 의 중쇄 가변 도메인 번호지정에 따라, 위치 52a, 또는 위치 52b, 또는 위치 52c, 또는 위치 53 에 있다.
하나의 구현예에서 항체의 중쇄 CDR2 내의 시스테인 잔기는 Kabat 의 중쇄 가변 도메인 번호지정에 따라 위치 52b 또는 위치 53 에 있다.
하나의 구현예에서 항체는 비-합텐 항원에 대한 제 1 결합 특이성 및 합텐에 대한 제 2 결합 특이성을 포함하는 이특이적 항체이다.
하나의 구현예에서 비-합텐 항원은 세포 표면 항원이다. 하나의 구현예에서 세포 표면 항원은 종양 연관 항원이다.
하나의 구현예에서 이특이적 항체는 전체 길이 항체이다. 하나의 구현예에서 이특이적 항체 중 하나의 중쇄는 홀 돌연변이를 포함하고, 각각의 다른 사슬은 놉 돌연변이를 포함한다.
하나의 구현예에서 이특이적 항체는 각각의 C-말단에서 scFv 또는 scFab 가 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 융합된 전체 길이 항체이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서 항체는 인간화된 또는 인간 항체이다.
하나의 구현예에서 항체의 불변 영역은 IgG1 서브클래스 또는 IgG4 서브클래스의 것이다.
하나의 구현예에서 항체는 Kabat 의 EU 인덱스에 따른 번호지정으로 위치 234 및 235 에는 알라닌 및 위치 329 에는 글리신을 가진 IgG1 서브클래스의 불변 영역을 갖는다.
하나의 구현예에서 항체는 Kabat 의 EU 인덱스에 따른 번호지정으로 위치 228 에는 프롤린, 위치 235 에 글루탐산 및 위치 329 에 글리신을 가진 IgG4 클래스의 불변 영역을 갖는다.
하나의 구현예에서 콘쥬게이트는 중쇄 CDR2 당 정확하게 하나의 디술피드 결합을 포함한다.
하나의 구현예에서 디술피드 결합은 산화환원 활성제의 첨가 없이 형성된다.
하나의 구현예에서 항원 또는 합텐은 링커를 통해 폴리펩티드에 콘쥬게이션된다. 하나의 구현예에서 링커는 비-펩티드 링커이다. 하나의 구현예에서 링커는 카르복시메틸-링커 또는 카프로산 링커이다.
하나의 구현예에서 합텐은 비오틴, 또는 테오필린, 또는 디곡시게닌, 또는 카르보란, 또는 플루오레세인, 또는 브로모데옥시우리딘이다. 하나의 구현예에서 합텐은 비오틴 또는 디곡시게닌이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 본원에 보고된 콘쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형이다.
본원에 보고된 콘쥬게이트는 의약으로서 사용하기 위한 것이다.
본원에 보고된 콘쥬게이트는 암의 치료를 위한 것이다.
본원에 보고된 콘쥬게이트는 바이러스 질환의 치료를 위한 것이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 의약의 제조에서의 본원에 보고된 콘쥬게이트의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 폴리펩티드의 안정성을 증가시키기 위한 본원에 보고된 콘쥬게이트의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 폴리펩티드의 표적을 벗어난 (off-target) 독성 효과를 감소 또는 제거하기 위한 본원에 보고된 콘쥬게이트의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 폴리펩티드의 활성을 증가시키기 위한 본원에 보고된 콘쥬게이트의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 폴리펩티드의 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 본원에 보고된 콘쥬게이트의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 질환의 치료에서의 본원에 보고된 콘쥬게이트의 용도이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 본원에 보고된 유효량의 콘쥬게이트를 개인에게 투여하는 것을 포함하는 질환을 가진 개인의 치료 방법이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 본원에 보고된 유효량의 콘쥬게이트를 개인에게 투여하는 것을 포함하는 개인에서의 질환의 치료 방법이다.
하나의 구현예에서 질환은 암이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 인공 항체 시스테인 잔기를 포함하는 항체 및 (인공) 폴리펩티드 시스테인 잔기를 포함하는 합텐화된 폴리펩티드의 조합을 포함하는 본원에 보고된 콘쥬게이트의 제조 방법이며, 이에 의한 인공 항체 시스테인 잔기의 알파 탄소 원자는 링커가 융합된 폴리펩티드 독소의 원자로부터 약 10 내지 11 Å 떨어져 있다.
본원에 보고된 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는, 본원에 보고된 콘쥬게이트의 제조 방법이다:
- 합텐에 특이적으로 결합하고 CDR2 내에 인공 항체 시스테인 잔기를 갖는 항체를, (인공) 폴리펩티드 시스테인 잔기를 포함하는 합텐화된 폴리펩티드와 용액에서 조합하는 단계, 및
- 상기 용액으로부터 콘쥬게이트를 회수하는 단계.
본원에 보고된 하나의 양상은 표적 세포에 대한 합텐화된 화합물의 표적화된 전달을 위한 이특이적 항체로서, 이특이적 항체는 합텐화된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 부위 및 세포의 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 부위를 포함한다.
하나의 구현예에서 디술피드 결합은 폴리펩티드의 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후의 시스테인 잔기와 항체의 CDR2 (CDR2 는 Kabat 에 따라 측정됨) 내의 시스테인 잔기 사이에 형성된다.
하나의 구현예에서 시스테인 잔기는 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후의 1 내지 3 개의 잔기 사이에 있다. 본 구현예에서, 시스테인 잔기는 라이신 잔기에 대해 위치 N-3, N-2, N-1, N+1, N+2 또는 N+3 중 하나에 있다.
하나의 구현예에서 시스테인 잔기는 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 (즉, 라이신 잔기에 대해 위치 N-2 에) 또는 후 (즉, 라이신 잔기에 대해 위치 N+2 에) 의 2 개의 잔기이다.
하나의 구현예에서 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기는 폴리펩티드의 10 개의 N-말단 아미노산 잔기 내에 있다.
하나의 구현예에서 폴리펩티드는 그의 아미노산 서열 내에 정확하게 하나의 라이신 잔기를 포함한다.
도 1: 도입된 VH53C 돌연변이가 있는 및 없는 재조합 인간화 항-비오틴 항체의 결합의 비교. 결합 특성을 BIAcore T100 또는 BIAcore 3000 기기를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술에 의해 분석하였다. a) 인간화 항-비오틴 항체. 비오틴화된 siRNA 의 인간화 항-비오틴 항체에 대한 결합, KD= 624 pM; b) 인간화된 Cys53 돌연변이화된 항-비오틴 항체. 비오틴화된 siRNA 의 결합, KD = 643 pM; siRNA 농도: 0.14, 0.41, 1.23, 3.70, 11.1, 33.3, 및 100 nM; 항-비오틴 항체 농도: 2nM; 센서 칩 CM3; 항-인간 IgG Fc 항체를 통한 항체의 결합
Figure 112016075559978-pct00001

도 2: 합텐에서 뿐 아니라 항체에서의 적절한 위치에서의 SH 관능기 도입으로, 항체 및 합텐이 그 사이에 공유 결합을 형성하여 콘쥬게이트가 생성될 수 있다.
도 3: SDS-PAGE 자체-형광 밴드 패턴의 모식도 (SDS-PAGE 겔의 추가 염색 없음):
A: 환원 또는 비-환원 조건 하 모두에서 항체와 합텐-형광단 콘쥬게이트 사이에 공유 결합이 형성되지 않는 경우 유리 합텐-형광단 콘쥬게이트의 분자량에서 1 개의 자체-형광 밴드가 검출될 수 있다.
B: 비-환원 조건 하에 항체와 합텐-형광단 콘쥬게이트 사이에 공유 결합이 형성되는 경우 항체 및 합텐-형광단 콘쥬게이트의 조합된 분자량에서 1 개의 자체-형광 밴드가 검출될 수 있다. 환원 조건 하에 항체 및 합텐-형광단 콘쥬게이트 (합텐화된 화합물) 의 콘쥬게이트에서의 디술피드 브릿지가 절단되고, 유리 합텐-형광단 콘쥬게이트의 분자량에서 1 개의 자체-형광 밴드가 검출될 수 있다.
도 4: 산화환원 활성제: 산화제 (글루타티온 디술피드, GSSG) 및 환원제 (디티오에리트리톨, DTE) 의 존재 하에서의 합텐-결합 Cys-돌연변이화 항체와 합텐-Cys-형광 표지 콘쥬게이트 (합텐화된 화합물) 와의 콘쥬게이트 형성: 항체 복합체화 및 규정된 위치에서의 후속적 공유 연결이 SDS PAGE 분석에서 형광 신호에 의해 검출된다. 비-환원 (상부 이미지) 및 환원 (하부 이미지) SDS-PAGE 분석을 실시예 11 에서 기재한 바와 같이 수행하였다. 공유적으로 항체 연결된 합텐은 비-환원 조건 하에 적절한 위치에서 큰 크기의 단백질 결합 신호로서 검출가능하다. 이들 신호는 환원시 단백질로부터 분리되며 환원 조건 하에 소 개체로서 관찰가능하다.
좌측: 형광 이미지
우측: 쿠마시 블루 염색
시리즈 1: 52bC 돌연변이를 갖는 항-디곡시게닌 항체
시리즈 2: 위치 52b 에서 야생형 잔기를 갖는 항-디곡시게닌 항체
(A) 3 mM DTE 및 10 mM GSSG 로의 공유 커플링;
(B) 0.3 mM DTE 및 1 mM GSSG 로의 공유 커플링;
(C) 0.03 mM DTE 및 0.1 mM GSSG 로의 공유 커플링.
도 5: 산화제 (글루타티온 디술피드, GSSG) 단독 존재 하 환원제의 부재 또는 둘 모두의 부재 하 합텐-결합 Cys 돌연변이화 항체와 합텐-Cys-형광 표지 콘쥬게이트와의 복합체 형성: 항체 복합체화 및 규정된 위치에서의 후속적 공유 연결이 SDS PAGE 분석에서 형광 신호에 의해 검출된다. 비-환원 (상부 이미지) 및 환원 (하부 이미지) SDS-PAGE 분석을 실시예 12 에서 기재한 바와 같이 수행하였다. 공유적으로 항체 연결된 합텐은 비-환원 조건 하에 적절한 위치에서 큰 크기의 단백질 결합 신호로서 검출가능하다. 이들 신호는 환원시 단백질로부터 분리되며 환원 조건 하에 소 개체로서 관찰가능하다.
좌측: 형광 이미지
우측: 쿠마시 블루 염색
시리즈 1: 52bC 돌연변이를 갖는 항-디곡시게닌 항체
시리즈 2: 위치 52b 에서 야생형 잔기를 갖는 항-디곡시게닌 항체
(A) 첨가제 없음
(B) 1 mM GSSG 로의 공유 커플링;
(C) 0.1 mM GSSG 로의 공유 커플링.
도 6: 바이오시티나미드와의 복합체 내의 쥣과 항-비오틴 항체의 X-선 구조. 바이오시티나미드와 상호작용하는 아미노산 잔기를 막대 표시로 나타낸다.
도 7: 비-복합체화된 항원/합텐과 비교한 공유 콘쥬게이트 및 비-공유 복합체로의 생체 내 혈액 PK 연구의 결과; 비오틴-Cy5 비-공유 복합체 (도 7A) 및 공유 (SS-브릿지연결) 콘쥬게이트 (도 8B) 뿐 아니라 비-복합체화 비오틴-Ser-Cy5 (별표) 의 Cy5-매개 형광의 상대적 잔류 형광 (%, 흑색 마크) 을 나타낸다; t = 0.08 시간 시점에서의 형광 신호를 100% 로 설정하였고; 부가적으로, 마우스 혈청 샘플에서의 인간 IgG 의 상대적 잔류량을 나타낸다 (흰색 마크); t = 0.08 시간에서의 IgG 혈청 농도 (mg/ml) 를 100% 로 설정하였다.
도 8: 마우스 혈청 중의 디곡시게닌화 PYY 폴리펩티드의 양을 측정하는 웨스턴 블롯.
도 9: 항-합텐 항체와의 합텐화된 화합물의 친화성-유도 복합체화의 분석.
항체 복합체화 및 규정된 위치에서의 후속적 공유 연결은 실시예 19 에서 기재된 바와 같이 실행한 SDS PAGE 분석에서 형광 신호에 의해 나타내어진다.
좌측: 비-환원 (겔의 좌측면) 샘플 및 환원 (겔의 우측면) 샘플로의 형광 이미지.
우측: 쿠마시 블루 염색.
1: 인간화 항-디곡시게닌 항체 + 비오틴-Cys-Cy5
2: 인간화 항-디곡시게닌 항체 VH52bC + 비오틴-Cys-Cy5
3: 인간화 항-비오틴 항체 + 비오틴-Cys-Cy5
4: 인간화 항-비오틴 항체 VH53C + 비오틴-Cys-Cy5
백색 화살표는 과량의 (비커플링된) 비오틴-Cys-Cy5 를 나타내는데, 이러한 경우 콘쥬게이션 반응이 친화성-유래되지 않기 때문에 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 가 사용되는 경우 유의하게 더 높다.
도 10: 합텐-매개 위치-지정 유도 공유 페이로드 커플링을 위해 위치 52b 에서 부가적인 시스테인과 Dig-결합 항체를 형성하기에 필요한, Fab 영역 내 시스테인 위치 및 디술피드 패턴. (A) 기능적인 Fab 단편을 형성하기에 필요한 VH 및 CH1 도메인, 및 VL 및 CL 도메인에서의 시스테인 및 디술피드 패턴. (B) 합텐-매개 위치-지정 유도 공유 페이로드 커플링을 위해 위치 52b 에서 부가적인 시스테인을 갖는 기능적 Fab 단편을 형성하는데 필요한 VH 및 CH1 도메인, 및 VL 및 CL 도메인에서의 시스테인 및 디술피드 패턴. (C&D) 잘못 폴딩된 비기능적 항체를 초래할 수 있는 VH52b 변이체의 VH 도메인 내에 잘못된 디술피드 결합을 형성할 가능성. E) 잘못 폴딩된 비기능적 항체를 초래할 수 있는 VH52b 변이체의 Fv 영역 내 가능한 잘못된 도메인간 디술피드 결합에 대한 예.
도 11: 합텐-매개 위치-지정 유도 공유 페이로드 커플링을 위해 위치 52b 에서 부가적인 시스테인을 갖는 Dig-결합 디술피드-안정화 단일 사슬 Fv 를 형성하는데 필요한 시스테인 위치 및 디술피드 패턴. (A) 기능적 scFv, dsscFv 및 52b 돌연변이화 dsscFv 를 형성하는데 필요한 VH 및 VL 도메인에서의 시스테인. (B) 기능적 scFv, dsscFv 및 52b 돌연변이화 dsscFv 를 생성시키기 위해 형성되어야 하는 디술피드 결합의 올바른 패턴. (C) 잘못 폴딩된 비기능적 scFv 를 초래할 수 잇는 잘못된 디술피드 결합을 형성할 가능성. (D) 잘못 폴딩된 비기능적 dsscFv 를 초래할 수 있는 잘못된 디술피드 결합을 형성할 가능성. (E) 잘못 폴딩된 비기능적 52b 돌연변이화 dsscFv 를 초래할 수 있는 잘못된 디술피드 결합을 형성할 가능성.
도 12: 공유 커플링된 페이로드에 대한 전달 비히클로서 LeY-Dig 이특이적 항체 유도체의 조성물.
도 13: 공유 커플링된 페이로드의 표적화 전달을 위한 이특이적 항-합텐 항체 유도체의 발현 및 정제.
(A) 웨스턴 블롯 분석을 위해서, 세포 배양물 상청액을 SDS PAGE (NuPAGE 4-12% 비스-트리스 겔 (1.0mm x 12웰) (Invitrogen; 카탈로그 번호 NP0322) 에 적용하고 단백질을 이후 Immobilon 트랜스퍼 멤브레인 (Immobilon-P), PVDF (공극 크기: 0.45㎛) 에 옮겼다. 항체 유도체를 1:1000 희석된 항-인간 카파 경쇄-알칼리성 포스파타아제 항체 (염소에서 생성) (친화성 정제됨) (Sigma (카탈로그 번호 A3813)) 및 1:1000 희석된 항-인간 IgG (Fc 특이적)-알칼리성 포스파타아제 항체 (염소에서 생성) (Sigma (카탈로그 번호 A9544)) 에 의해 검출하였다. 기질 BCIP/NBT-Blue 액체 기질 (Sigma 카탈로그 번호 B3804) 을 웨스턴 블롯의 현상을 위해 적용하였다. 라인 1 - 분자량 마커; 라인 2 & 3 - 미변형된 중쇄를 갖는 대조군 항체; 라인 4 - 연장된 H-사슬을 갖는 LeY-Dig(52bC) 이특이적 항체.
(B) SDS-PAGE 분석 (NuPAGE 4-12% 비스-트리스 겔 및 후속적 쿠마시 브릴리언트 블루 염색은 단백질 제제의 순도를 입증하고, 계산된 분자량에 상응하는 명백한 분자 크기를 갖는 IgG 와 관련된 폴리펩티드 사슬을 가시화시킨다. 라인 1 - 분자량 마커; 라인 2 - 환원된 연장된 H-사슬을 갖는 LeY-Dig(52bC) 이특이적 항체, 라인 3 - 비-환원된 연장된 중쇄를 갖는 LeY-Dig(52bC) 이특이적 항체;
(C) 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200) 는 단백질 A 정제 후 LeY-Dig(52bC) 이특이적 항체 유도체의 단백질 제제 중 응집물의 균질성 및 결핍을 입증한다.
도 14: Dig-Cy5 비-공유 복합체 및 공유 (디술피드-브릿지연결) 콘쥬게이트체 뿐 아니라 비-복합체화 Dig-Cy5 의 Cy5-매개 형광의 상대적 잔류 형광 강도 (%); t = 0.08 시간 시점에서의 형광 신호를 100% 로 설정하고; 부가적으로, 마우스 혈청 샘플 중 인간 IgG 의 상대적 잔류량을 나타내고; t = 0.08 시간에서의 IgG 혈청 농도 (mg/ml) 를 100% 로 설정하였다.
도 15: 비-침습적 눈 이미지화에 의해 측정된, 비-공유 복합체 및 공유 (디술피드-브릿지연결) 콘쥬게이트의 비오틴-Cy5 뿐 아니라 비-복합체화 비오틴-Cy5 의 Cy5-매개 형광의 생체내-유사 조건 하 약동학; 흑색 다이아몬드형: 비오틴-Cy5, 흑색 사각형: 비오틴-Cy5+항-비오틴 항체 (복합체); 삼각형: Cy5-비오틴-항-비오틴 항체 콘쥬게이트.
도 16: a) 테오필린-Cys-Cy5 의 조성물, 구조 및 분자량; b) 크기 배제 크로마토그래피는 정제된 테오필린-결합 항체 변이체의 순도 및 균질성을 입증하고; 피크 # 2 는 정제된 생성물을 나타내고, 피크 # 1 의 결핍은 이러한 제제가 응집물을 갖지 않는다는 것을 나타내고; c) 비-환원 (좌측 라인) 및 환원 (우측 라인) SDS PAGE 에 의해 입증된 바와 같은 테오필린-결합 항체와 테오필린-Cys-Cy5 사이의 공유 복합체의 형성; Cy5 는, 테오필린-Cys-Cy5 및 cys-돌연변이화된 항체를 함유하는 샘플에서만 비-환원 조건 하에 H-사슬에 커플링되는 것으로 보이며, 이들 공유 콘쥬게이트는 환원시 붕해된다 (우측 라인); 라인 1: 분자량 마커; 2-4 비-환원 - 2: 항-테오필린 항체 (Cys-돌연변이 없음) + 테오필린-Cys-Cy5 (복합체); 3: 항-테오필린 항체-cys_55 + 테오필린-Cys-Cy5 (콘쥬게이트); 4: 항-테오필린 항체-cys_54 + 테오필린-Cys-Cy5 (접합체); 5-7 환원 - 5: 항-테오필린 항체 (Cys-돌연변이 없음) + 테오필린-Cys-Cy5 (복합체); 6: 항-테오필린 항체-cys_55 + 테오필린-Cys-Cy5 (콘쥬게이트); 7: 항-테오필린 항체-cys_54 + 테오필린-Cys-Cy5 (콘쥬게이트).
도 17: 비오틴-결합 항체와 비오틴-Cys-Cy5 사이의 공유 복합체 형성이 비-환원 및 환원 SDS PAGE 에 의해 입증된다; 37℃ 에서 1 시간 동안 쥐과 혈청에서 커플링 반응을 수행하였다. Cy5 는, 비오틴-Cys-Cy5 및 Cys-돌연변이화 항체를 함유하는 샘플에서만 비-환원 조건 하에 H-사슬에 커플링되는 것으로 보이며; 이들 공유 콘쥬게이트는 환원시 붕해된다 (우측 라인); 라인 1: 분자량 마커; 2-3 비-환원 - 2: 항-비오틴 항체 (Cys 돌연변이 없음) + 비오틴-Cys-Cy5 (복합체); 3: 항-비오틴 항체-Cys + 비오틴-Cys-Cy5 (콘쥬게이트); 4-5 환원 - 5: 항-비오틴 항체 (Cys 돌연변이 없음) + 비오틴-Cys-Cy5 (복합체); 6: 항-비오틴 항체-Cys + 비오틴-Cys-Cy5 (콘쥬게이트).
도 18: 비-침습적 눈 이미지화에 의해 측정된, 비-공유 복합체 및 공유 (디술피드-브릿지연결) 콘쥬게이트의 비오틴-Cy5 뿐 아니라 비-복합체화 비오틴-Cy5 의 Cy5-매개 형광의 생체 내 약동학; 흑색 다이아몬드형: 비오틴-Cy5, 흑색 원형: 항-비오틴 항체 투여 24 시간 후에 투여된 비오틴-Cy5 (생체 내 복합체 형성); 흑색 사각형: 항-비오틴 항체-Cys 투여 24 시간 후 투여된 비오틴-Cys-Cy5 (생체 내 콘쥬게이트 형성).
도 19: 쥐과 항-비오틴 항체-Fab-단편의 단백질 구조를 바이오시티나미드와의 복합체 중 측정하였다: 복합체화 합텐은 아미노산의 음하전된 클러스터에 근접하게 위치하고; 그의 카르복실기에서 페이로드 커플링을 위해 유도체화되는 (합텐으로서의) 비오틴은, 상기 위치에 전하 반발이 없기 때문에 (COOH 기의 결핍으로 인함) 양호한 효능으로 결합하며; 반대로, 유리 (정상) 비오틴은 그의 카르복실기가 이러한 음전하 클러스터에 근접하게 있을 수 있기 때문에 항체에 효율적으로 결합할 수 없고, 따라서 반발된다.
도 20: (A) 폴리펩티드 독소의 표적화된 전달을 위한 항-합텐 이특이적 항체의 도식; 합텐에 결합하고 중쇄 (CH3 도메인의 C-말단) 에 재조합적으로 융합되는 디술피드-안정화된 scFv, 대안적으로 이것은 Fab 단편의 C-말단에 또는 재조합 결합 모듈의 다른 위치에 융합되는 것이 가능하다. 이특이적 항체 인코딩 서열은 유전자 합성 (Geneart, Germany) 에 의해 생성되고, 발현 벡터 내로 서브클로닝되고, 기재된 바와 같이 제조 및 정제된다 (Metz, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 8194-8199). 19-11 개의 항체의 인간화 dsscFv (Metz et al. 및 27209 WO) 를 디곡시게닌-결합 개체로서 사용하였다; VH 및 VL 을 IgG 의 Fab 분지 내로 도입하고, Fab-포맷 서열이 LeY-결합 항체 B3 으로부터 유래하였다 (참고, Metz et al.).
(B) 이특이적 항체의 발현 및 정제: 이특이적 항체 제제의 순도 및 균질성을 입증하는 SEC 프로파일 및 SDS-PAGE; 일시적 발현을 위해, Fab-Fv 융합의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 플라스미드를 무-혈청 배지에서 배양된 HEK293 세포 내로 공동-트랜스펙션하고, 상청액을 트랜스펙션 후 7 일에 원심분리 및 0.22 μm 여과에 의해 정화시켰고, 이특이적 항체를 단백질 A (IgG-Fv) 에 이어 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl (pH 6.0) 로 평형화된 SEC (Superdex200 HiLoad 26/60, GE Healthcare) 에 의해 정제하였고, 단백질 농도를 280 nm 에서의 광학 밀도 (백그라운드로서 320 nm) 에 의해 측정하고, 정제된 단백질의 균질성을 SDS-PAGE 에 의해 확인하였다.
도 21: (A): 슈도모나스 외독소 (Pseudomonas exotoxin: PE) 의 변이체; PE 및 PE 변이체의 도메인 조성, 및 위치-지정 디곡시게닌화를 위한 신규 변이체 PE25 (NLys-PE25SQΔ) 의 생성; PE25 는 라이신 측쇄의 일차 아미노기에서 Dig-NHS 로 디곡시게닌화된다; 단백질의 N-말단은 또한 NHS-매개된 디곡시게닌-콘쥬게이션에 대한 표적일 수 있고; PE25 (NLysPE25SQΔ) 는 PE (pdb 1IKQ_A) 의 아미노산 274-284 (도메인 II 프로세싱 부위) 이후, 아미노산 394-612 (도메인 III) 에 융합된 아미노산 서열 (N-말단) NH2-MLQGTKLMAEE (SEQ ID NO: 193) 를 함유하고; 부가적으로, 위치 406, 432, 467, 490, 513, 548, 590, 592 는 LR8M 독소 유도체 내에서와 같이 돌연변이되었다 (Hansen, J.K. et al., J. Immunotherapy 33 (2010) 297-304), 위치 606 에서의 라이신이 글루타민으로 돌연변이되었고 PE 의 마지막 아미노산 (라이신 613) 이 검출되었다; 아미노-말단 서열은 S-PE25 에서 Lys 잔기의 Ser 로의 교환, NCK-PE25 에서 Gly 잔기의 Cys 로의 교환, 및 NKC-PE25 에서 Met 잔기의 Cys 로의 교환에 의해 변경되었다; 상기 변이체에 대한 코딩 서열은 유전자 합성 (Geneart, Germany) 또는 돌연변이생성에 의해 생성되고, E. 콜라이 (E. coli) 에서의 유도 발현에 대한 벡터 내로 삽입되었다.
(B): 슈도모나스 외독소 변이체의 발현 및 정제: 단백질은 주변세포질 내로 분비되게 되고, 이전에 기재된 바와 같은 기술을 적용하여 정제되었다 (Debinski, W. and Pastan, I., Cancer Res. 52 (1992) 5379-5385; Debinski, W. and Pastan, I., Bioconjug. Chem. 5 (1994) 40-46); 수확된 박테리아로부터의 삼투압 쇼크를 통해 발생된 주변세포질 제제를 폴리펩티드 독소를 포획하기 위해 Q-Sepharose 에 로딩하였다; 폴리펩티드 독소를 염 구배로 용리하고, 낮은 수준의 응집물 및 보다 작은 단백질 오염물을 가진 단량체성 폴리펩티드 독소를 수득하기 위해 SEC 에 적용하였다; SEC 를 수행하고, 독소 분획을 PBS 에 저장하였다. 정제된 단백질의 균질성을 SEC 및 SDS-PAGE 에 의해 확인하였다.
(C): PE25, S-PE25, NKC-PE25 및 NCK PE25 의 N-말단 서열: N-말단 메티오닌은 ATG 출발 코돈에 의해 인코딩되고, E. 콜라이에서의 전사 후 프로세싱에 의해 제거될 수 있기 때문에 괄호로 표시된다. 합텐과 커플링되게 되는 라이신 잔기는 강조표시 (굵은 글씨) 되고, 상기 라이신 전 또는 후의 부가적인 시스테인은 굵게 밑줄쳐있다.
도 22: (A): 항체 및 독소의 복합체화 및 공유 연결: NKC-PE25 를 포함하는 공유 복합체의 환원된 및 비-환원된 샘플을 SDS-PAGE (NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (1.0mm x 10well) 을 통해 분리하고 쿠마시 블루 염색에 의해 가시화시키거나, Immobilon PVDF Transfer 멤브레인 (Immobilon-P), 공극 크기: 0.45μm (중간 및 우측 패널) 에 대해 웨스턴 블롯에 적용하였다. 폴리클로날 항-PE 항체 (항-슈도모나스 외독소 A, 1:1000 로 희석된 토끼에서 생성된 항체 (Sigma, Cat. No. P2318) 에 이어, 1:1000 희석된 염소에서 생성된 항체인 항-토끼 IgG (전체 분자)-알칼리성 포스파타아제 콘쥬게이트 (Sigma, Cat. No. A3687)) 로의 웨스턴 블롯 분석을 중간 패널에 제시한다. 쥐과 모노클로날 항-디곡시게닌 항체 MAK<DIG>M-19-11_IgG (마우스에서 생성된 항체, Roche) 에 이어, 1:1000 희석된 염소에서 생성된 항체인 항-마우스 IgG (Fc-영역 특이적)-알칼리성 포스파타아제 콘쥬게이트 (Sigma, Cat. No. A7434)) 를 우측 패널에 제시한다. 두 블롯을 기질 BCIP/NBT-Blue Liquid Substrate 로 현상하였다.
(B): 항-디곡시게닌 항체 및 디곡시게닌화 폴리펩티드 독소의 복합체화 및 공유 연결: 디곡시게닌-결합 Fv 와 복합체를 형성한 디곡시게닌화 PE25 (Dig-PE25) 의 성분의 모델을 디곡시게닌-스페이서::항-디곡시게닌 항체 구조 (PDB_3RA7, 1) 의 구조적 모델을 PE25 의 것과 (PDB_1K2N 및 1IKQ, 링커의 두번째 부분은 1ikq 로부터 취해짐) 을 연결함으로써 생성하였다; PE25 의 단일형 라이신에 대해 아미노 카프로산 스페이서를 통해 부착된 적합한 크기의 디곡시게닌은 두 구조를 연결한다; 또한 제시되는 것은 항-디곡시게닌 항체의 추가의 시스테인 VH 와 NKC-PE25 또는 NCK PE25 내의 시스테인 사이의 공유 연결의 가능한 배열을 나타내는 구조 모델이다.
도 23: 이특이적 항체-매개 표적화된 독소 전달: 세포증식 (BrdU) 어세이를 종양 세포에 대항하는 독성 효과를 분석하기 위해 수행하였다; LeY 를 발현하는 MCF-7 세포를 독소 단독 (상부 패널) 또는 IgG-Fv 포맷으로의 비히클-독소 복합체 (하부 패널) 에 48 시간 동안 노출시켰다.
도 24: 세포 표적화 이특이적 항체는 표적 세포 내에서 합텐-위치화 디술피드 연결된 페이로드를 방출한다. 공초점 현미경은 MCF-7 세포에 대한 및 MCF-7 세포 내로의 디술피드-콘쥬게이션 비오틴-Cys-Cy5-페이로드의 bsAb-표적화된 전달을 밝혔다. bsAb 는 Alexa 표지된 huFc-결합 항체에 의해, Bio-Cys-Cy5 페이로드는 그의 형광에 의해 검출된다. bsAb 및 페이로드의 공동-위치화는 혼합된 색상 (3) 으로 표시되고, 단리된 bsAb 는 색상 1 (1) 로 나타나고, 항체가 없는 비오틴은 색상 2 (2) 로 나타낸다. 이미지 (LeY-발현 MCF7 세포에 대한 LeY-bsAb 적용 후 6 시간) 는 bsAb 비히클이 2 차 항체에 의한 검출을 위해 여전히 충분하게 미손상된 시점에서 복합체로부터의 비오틴의 분리를 밝힌다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
본원의 목적을 위해 "수용체 인간 프레임워크" 는 하기 정의되는 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래되는 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크 "로부터 유래되는" 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 아미노산 서열 변경을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변경의 수는 10 개 이하, 9 개 이하, 8 개 이하, 7 개 이하, 6 개 이하, 5 개 이하, 4 개 이하, 3 개 이하, 또는 2 개 이하이다. 일부 구현예에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 일치한다.
용어 "아미노산" 은 자연적으로 발생하는, 즉 직접적으로 또는 전구체의 형태로 핵산에 의해 인코딩될 수 있는, 또는 비-자연적으로 발생하는, 카르복시 α-아미노산의 기를 나타낸다. 개별적인 자연 발생적 아미노산은 3 개의 뉴클레오티드로 이루어지는 핵산 (그래서, 코돈 또는 염기-3쌍 으로 불림) 에 의해 인코딩된다. 각각의 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 인코딩된다. 이것은 "유전적 코드의 퇴행" 으로서 알려져 있다. 본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "아미노산" 은 알라닌 (3 글자 코드: ala, 1 글자 코드: A), 아르기닌 (Arg, R), 아스파라긴 (Asn, N), 아스파르트산 (Asp, D), 시스테인 (Cys, C), 글루타민 (Gln, Q), 글루탐산 (Glu, E), 글리신 (Gly, G), 히스티딘 (His, H), 이소류신 (Ile, I), 류신 (Leu, L), 라이신 (Lys, K), 메티오닌 (Met, M), 페닐알라닌 (Phe, F), 프롤린 (Pro, P), 세린 (Ser, S), 트레오닌 (Thr, T), 트립토판 (Trp, W), 티로신 (Tyr, Y), 및 발린 (Val, V) 을 포함하는 자연 발생적 카르복시 α-아미노산을 나타낸다. 비-자연 발생적 아미노산의 예는 Aad (알파-아미노아디프산), Abu (아미노부티르산), Ach (알파-아미노시클로헥산-카르복시산), Acp (알파-아미노시클로펜탄-카르복시산), Acpc (1-아미노시클로프로판-1-카르복시산), Aib (알파-아미노이소부티르산), Aic (2-아미노인단-2-카르복시산; 또한 2-2-Aic 로 호칭됨), 1-1-Aic (1-아미노인단-1-카르복시산), (2-아미노인단-2-카르복시산), 알릴글라이신 (AllylGly), 알로이소류신 (알로-Ile), Asu (알파-아미노수베르산, 2-아미노옥탄이산), Bip (4-페닐-페닐알라닌-카르복시산), BnHP ((2S,4R)-4-히드록시프롤린), Cha (베타-시클로헥실알라닌), Cit (시트룰린), 시클로헥실글라이신 (Chg), 시클로펜틸알라닌, 베타-시클로프로필 알라닌, Dab (1,4-디아미노부티르산), Dap (1,3-디아미노프로피온산), p (3,3-디페닐알라닌-카르복시산), 3,3-디페닐알라닌, 디-N-프로필글라이신 (Dpg), 2-푸릴알라닌, 호모시클로헥실알라닌 (HoCha), 호모시트룰린 (HoCit), 호모시클로류신, 호모류신 (HoLeu), 호모아르기닌 (HoArg), 호모세린 (HoSer), 히드록시프롤린, Lys(Ac), (1) Nal (1-나프틸 알라닌), (2) Nal (2-나프틸 알라닌), 4-MeO-Apc (1-아미노-4-(4-메톡시페닐)-시클로헥산-1-카르복시산), 노르-류신 (Nle), Nva (노르발린), 오마틴 (Omathine), 3-Pal (알파-아미노-3-피리딜알라닌-카르복시산), 4-Pal (알파-아미노-4-피리딜알라닌-카르복시산), 3,4,5,F3-Phe (3,4,5-트리플루오로-페닐알라닌), 2,3,4,5,6,F5-Phe (2,3,4,5,6-펜타플루오로-페닐알라닌), Pqa (4-옥소-6-(1-피페라지닐)-3(4H)-퀴나졸린-아세트산 (CAS 889958-08-1)), 피리딜알라닌, 퀴놀릴알라닌, 사르코신 (Sar), 티아졸릴알라닌, 티에닐알라닌, Tic (알파-아미노-1,2,3,4,테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복시산), Tic(OH), Tle (tert부틸글라이신), 및 Tyr(Me) 을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "항체" 는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 요망되는 항원결합 활성을 나타내도록, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
용어 "항체 단편" 은 미손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 미손상 항체의 일부를 포함하는 미손상 항체 이외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이적 항체가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "비오틴", 축약형 "BI" 는, 5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜탄산을 나타낸다. 비오틴은 또한 비타민 H 또는 조효소 R 로도 알려져 있다.
용어 "이특이적 항체" 는 2 개의 상이한 (항원/합텐) 결합 특이성을 갖는 항체를 나타낸다. 본원에 보고된 하나의 구현예에서 이특이적 항체는 2 개의 상이한 항원, 즉, 합텐 및 비-합텐 항원에 특이적이다.
용어 "키메라성" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다.
항체의 "클래스" 는 이의 중쇄에 의해 소유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 5 가지 주요 클래스의 항체가 있고: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 이들 중 여러 개는 또다시 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 불린다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드 독소" 는 세포 작용을 억제하거나 방지하고/거나 세포 사멸 또는 붕괴를 일으키는 성분을 말한다. 폴리펩티드 독소에는 제한 없이, s include, 효소 및 이의 단편 예컨대 핵산분해성 효소; 독소 예컨대, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 (이의 단편 및/또는 변이체를 포함), 세포독소 (예를 들어, 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소, 리신, 아브린, 디프테리아 (디프테리아) 독소 등), 효소, 성장 인자, 전사 인자.
용어 "디곡시게닌", 축약형 "DIG" 는, 3-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-3,12,14-트리히드록시-10,13-디메틸-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-테트라데카히드로-시클로펜타[a]-페난트렌-17-일]-2H-푸란-5-온 (CAS 번호 1672-46-4) 을 나타낸다. 디곡시게닌 (DIG) 은 오로지 식물 디기탈리스 푸르푸레아 (Digitalis purpurea), 디기탈리스 오리엔탈리스 (Digitalis orientalis) 및 디기탈리스 라나타 (Digitalis lanata (foxgloves)) 의 꽃 및 잎에서만 발견되는 스테로이드이다 (Polya, G., Biochemical targets of plant bioactive compounds, CRC Press, New York (2003) p. 847).
용어 "효과기 작용" 은 항체의 Fc-영역에 기인하는 상기 생물학적 활성을 말하고, 이것은 항체 클래스마다 상이하다. 항체 효과기 작용의 예에는: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체) 의 하향 조절; 및 B-세포 활성화가 포함된다.
작용제, 예를 들어, 약학 제형의 용어 "유효량" 은 요망되는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해, 효과적인 양, 투여량 및 필요한 시간 기간을 말한다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편 (각각 단일 항원-결합 부위를 가짐) 및 잔여 "Fc" 단편 (그 명칭이 용이하게 결정화시키는 이의 능력을 반영함) 으로 지칭되는 2 개의 동일한 항원-결합 단편을 생성시킨다. 펩신 처리로, 2 개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교 결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편이 산출된다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1) 을 함유한다. Fab' 단편은 Fab 단편과, 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기를 첨가함으로써 상이하다. Fab'-SH 는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들) 이 적어도 하나의 유리 티올 기를 갖는 Fab' 에 대한 본원에 지정이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 제조되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
"Fv" 는 완전한 항원-인지 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 영역은 단단한, 비-공유 연합으로의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 상기 배열에서 각각의 가변 도메인의 3 개의 과가변 영역은 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 규정하기 위해 상호작용한다. 집합적으로, 6 개의 과가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 오직 3 개의 과가변 영역을 포함하는 Fv 의 절반) 은, 비록 전체 결합 부위보다는 낮은 친화성이지만, 항원을 인지하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
용어 "Fc-영역" 은 본원에서 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 규정하는데 사용된다. 상기 용어는 고유의 서열 Fc-영역 및 변이체 Fc-영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 으로부터, 또는 Pro230 으로부터, 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 명시되지 않는 경우, Fc-영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 번호지정은 문헌 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 에 기재되는 바와 같이, 또한 EU 인덱스로 불리는 EU 번호지정 시스템에 따른다.
용어 "플루오레세인", 축약형 "FLUO" 는 6-히드록시-9-(2-카르복시페닐)-(3H)-잔텐-3-온, 대안적으로는 2-(6-히드록시-3-옥소-(3H)-잔텐-9-일)-벤조산을 나타낸다. 플루오레세인은 또한 레소르시놀프탈레인, C.I. 45350, solvent yellow 94, D & C yellow no. 7, angiofluor, Japan yellow 201, 또는 솝 옐로우 (soap yellow) 로서 알려져 있다.
용어 "프레임워크", 축약형 "FR" 은 과가변 영역 (HVR) 잔기 이외의, 경쇄 및 경쇄 가변 도메인 아미노산 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 VH (또는 VL) 내에서 일반적으로 하기 서열: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4 로 나타난다.
용어 "인공 시스테인 잔기" 는 모체 항체 또는 폴리펩티드 독소 내로 조작되고, 티올 작용기 (SH) 를 갖고, 분자내 디술피드 브릿지 내에 쌍을 이루지 않은, 시스테인 아미노산 잔기를 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 유리 시스테인 아미노산은 분자간 디술피드 브릿지로서, 예를 들어 글루타티온과 쌍을 이룰 수 있다.
용어 "전체 길이 항체" 는 고유의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다. 고유의 IgG 항체는 디술피드-결합된 2 개의 동일한 경쇄 및 2 개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. N- 에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VH) 뒤에, 3 개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3) 을 갖는다. 유사하게, N- 에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VL) 뒤에, 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반해, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 불리는 2 가지 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
"전체 길이 항체" 는 VL 및 VH 도메인, 뿐 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3 을 포함하는 항체이다. 불변 도메인은 고유의 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 고유의 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 전체 길이 항체는 항체의 Fc 불변 영역 (고유의 서열 Fc-영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc-영역) 에 기인하는 상기 생물학적 활성을 말하는 "효과기 작용" 을 하나 이상 가질 수 있다. 항체 효과기 작용의 예에는: C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 및 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체) 의 하향 조절 및 BCR 이 포함된다.
용어 "합텐" 은 단백질과 같은 큰 담체에 부착될 때에만 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 소분자를 나타낸다. 예시적 합텐은 아닐린, o-, m- 및 p-아미노벤조산, 퀴논, 히스타민-숙시닐-글리신 (HSG), 히드랄라진, 할로탄, 인듐-DTPA, 플루오레세인, 비오틴, 디곡시게닌, 테오필린 및 디니트로페놀, 및 브로모데옥시우리딘이다. 하나의 구현예에서 합텐은 비오틴 또는 디곡시게닌 또는 테오필린 또는 카르보란 또는 브로모데옥시우리딘이다.
용어 "합텐화된 폴리펩티드 독소" 는 폴리펩티드 독소에 공유 연결되는 합텐으로 이루어지는 분자를 나타낸다. 활성화된 합텐 변이체는 종종 이러한 콘쥬게이트의 형성을 위한 출발 물질로서 사용된다. 하나의 구현예에서 합텐은 디곡시게닌이며 링커를 통해 폴리펩티드 독소에 콘쥬게이션된다 (하나의 구현예에서는 이의 3-히드록시기를 통해). 하나의 구현예에서 링커는 a) 하나 이상의 (하나의 구현예에서는 3 내지 6 개) 메틸렌-카르복시-메틸기 (-CH2-C(O)-), 및/또는 b) 1 내지 10 개 (하나의 구현예에서는 1 내지 5 개) 아미노산 잔기 (하나의 구현예에서는 글리신, 세린, 글루타메이트, β-알라닌, γ-아미노부티르산, ε-아미노카프로산 또는 라이신으로부터 선택됨), 및/또는 c) 하나 이상의 (하나의 구현예에서는 1 또는 2 개), 구조식 NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH (식 중, n 은 2 또는 3 이고, x 는 1 내지 10, 하나의 구현예에서는 1 내지 7 임) 를 갖는 화합물을 포함한다. 상기 마지막 요소는 (적어도 부분적으로는) 화학식 -NH-[(CH2)nO]xCH2-CH2-C(O)- 의 링커 (부분) 를 생성시킨다. 이러한 화합물의 하나의 예는 예를 들어 12-아미노-4,7,10-트리옥사도데칸산 (TEG (트리에틸렌글리콜) 링커를 생성시킴) 이다. 상기 링커는 전하를 함유하고/하거나 수소 가교를 형성할 수 있기 때문에, 안정화 및 가용화 효과를 갖는다. 또한 이것은 항-합텐 항체의 합텐-콘쥬게이트 폴리펩티드 독소에 대한 결합을 입체적으로 촉진시킬 수 있다. 하나의 구현예에서 링커는 폴리펩티드 독소의 아미노산의 측쇄에 위치한다 (예를 들어 아미노기를 통해 라이신 측쇄에 콘쥬게이션됨). 하나의 구현예에서 링커는 폴리펩티드 독소의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 위치한다. 폴리펩티드 상의 링커의 위치는 전형적으로, 폴리펩티드 독소의 생물학적 활성이 영향을 받지 않는 영역에서 선택된다. 따라서, 링커의 정확한 부착 위치는 생물학적 활성을 담당하고 있는 관련 구조 요소 및 폴리펩티드 독소에 따라 좌우된다. 합텐이 부착되는 폴리펩티드 독소의 생물학적 활성은 시험관 내 어세이로 시험될 수 있다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양" 은 상호교환적으로 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포를, 이러한 세포의 자손을 포함하여 말한다. 숙주 세포에는 일차 형질전환된 세포 및 계대 수와 관계 없이 그로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 가 포함된다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지는 않을 수 있고, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체" 는 인간 또는 인간 세포에 의해 제조된 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 것과 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 항체이다. 상기 인간 항체의 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체는 제외한다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라성 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 하나 이상의, 및 전형적으로 2 개의, 가변 도메인을 포함할 것이며, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화된 형태" 는, 인간화를 겪은 항체를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "과가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열 내에서 과가변성이고 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 및/또는 구조적으로 정의된 루프 ("과가변 루프") 를 형성하고, 및/또는 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉부") 를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역 각각을 말한다. 일반적으로, 항체는 6 개의 HVR 을 포함한다; VH 내에 3 개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3 개 (L1, L2, L3).
본원의 HVR 은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) 에서 발생하는 과가변 루프 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3) 에서 발생하는 CDR (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3) 에서 발생하는 항원 접촉부 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3) 를 포함하는, 상기 (a), (b), 및/또는 (c) 의 조합.
"개인" 또는 "대상" 은 포유류이다. 포유류는 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 개인 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 자연적인 환경의 성분으로부터 단리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어, 전기영동적 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 측정되는 바와 같이 95 % 또는 99 % 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 측정 방법의 리뷰를 위해, 예를 들어, Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87 을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연적인 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산은 통상 핵산 분자를 함유하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함하나, 핵산 분자는 염색체 외적으로 또는 그의 자연적인 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종의 항체의 집단로부터 수득된 항체, 즉, 집단에 포함되는 개별적인 항체가, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이를 함유하는 또는 모노클로날 항체 제제의 생성 동안 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고, 동일한 에피토프와 일치하는 및/또는 결합하는 것을 말하고, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정소 (에피토프) 에 대항하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정소에 대항하여 지정된다. 따라서, 수식어 "모노클로날" 은 항체의 실질적으로 동종의 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 좌의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자도입 동물의 사용 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있고, 모노클로날 항체의 제조를 위한 이러한 방법 및 기타 예시적인 방법은 본원에 기재된다.
용어 "일특이적 항체" 는 각각 동일한 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 결합 부위를 갖는, 즉 동일한 항원 또는 합텐에 결합하는 항체를 나타낸다.
"노출된 항체" 는 이종 부분 (예를 들어, 세포독성 부분) 또는 방사능표지에 콘쥬게이션되지 않은 항체를 말한다. 노출된 항체는 약학 제형에 존재할 수 있다.
용어 "패키지 삽입물" 은 치료 제품의 사용과 관련된 지시, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 사용금지사유에 대한 정보 및/또는 주의사항을 담고 있는, 치료 제품의 상업적 패키지에 관례상 포함되는 지침을 말하기 위해 사용된다.
"모체 항체" 는 하나 이상의 아미노산 잔기가 하나 이상의 시스테인 잔기에 의해 대체된 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 모체 항체는 고유의 또는 야생형 서열을 포함할 수 있다. 모체 항체는 항체의 다른 고유의, 야생형, 또는 개질된 형태에 비해 미리-존재하는 아미노산 서열 개질 (예컨대 부가, 결실 및/또는 치환) 을 가질 수 있다. 모체 항체는 합텐에 특이적으로 결합한다. 모체 항체는 또한 관심의 표적 항원, 예를 들어, 생물학적으로 중요한 폴리펩티드에 대해 부가적으로 지정될 수 있다. 비-폴리펩티드 항원에 대해 지정되는 항체가 또한 고려된다.
용어 "fMLP" 는 N-포르밀메티오닌, 류신 및 페닐알라닌으로 이루어지는 트리펩티드를 나타낸다. 하나의 구현예에서 효과기 부분은 fMLP 또는 이의 유도체이다.
참조 폴리펩티드 서열과 관련하는 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 일치성" 은, 서열을 나란히 정렬시키고, 필요에 따라, 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 일치성을 달성하고, 임의의 보존적 치환을 서열 일치성의 일부로서 고려하지 않은 후, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 일치성을 측정하기 위한 목적의 정렬은 당업계 내에 있는 각종 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교할 전체 길이의 서열에 대하여 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적상, % 아미노산 서열 일치성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2 를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램의 저작자는 Genentech, Inc. 이었고, 소스 코드는 사용자 문서와 함께 미국 저작권청 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559) 에 제출되었는데, 여기서, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 South San Francisco, California 의 Genentech, Inc. 로부터 공개적으로 입수가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D 를 포함한 UNIX 운영 체제 상에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 다르지 않다.
ALIGN-2 를 아미노산 서열 비교에 이용하는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, 이와의 또는 이에 대항하는 주어진 아미노산 서열 A 의 % 아미노산 서열 일치성 (이것은 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, 이와의 또는 이에 대항하는 특정 % 아미노산 서열 일치성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A 로서 대체하여 표현될 수 있다) 은 하기와 같이 계산된다:
100 × 분수 X/Y
여기서, X 는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 에 의해 그 프로그램의 A 와 B 의 정렬에서 동일한 매치 (match) 로서 채점된 아미노산 잔기의 수이고, Y 는 B 내의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A 의 길이가 아미노산 서열 B 의 길이와 동일하지 않은 경우, B 에 대한 A 의 % 아미노산 서열 일치성은 A 에 대한 B 의 % 아미노산 서열 일치성과 동일하지 않은 것으로 인식될 것이다. 구체적으로 달리 명시되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 % 아미노산 서열 일치성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 직전 단락에서 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형" 은 그곳에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 그러한 형태로 있고, 제형이 투여될 대상에 대해 용납할 수 없게 독성인 부가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용가능한 담체" 는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의 약학 제형 내의 성분을 말한다. 약학적으로 허용가능한 담체에는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
"폴리펩티드" 는 자연적 또는 합성적으로 생성되는, 펩티드 결합에 의해 연결되는 아미노산으로 이루어지는 중합체이다. 약 20 개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 "펩티드" 로 지칭될 수 있는 한편, 100 개 초과의 아미노산 잔기의 하나의 폴리펩티드 또는 둘 이상의 폴리펩티드로 이루어지는 분자는 "단백질" 로 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 비-아미노산 성분, 예컨대 탄소화물 기, 금속 이온 또는 카르복실산 에스테르를 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 첨가될 수 있으며, 세포 유형에 따라 가변적일 수 있다. 폴리펩티드는 그의 아미노산 백본 구조 또는 이를 인코딩하는 핵산에 있어서 본원에서 정의된다. 탄수화물 기와 같은 부가물은 일반적으로 명시되지 않으나, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드는 적어도 3 개의 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 아미노산 잔기는 항-합텐 항체에 대한 디술피드 결합의 형성을 위한 시스테인 잔기이고, 하나의 아미노산 잔기는 합텐에 대한 콘쥬게이션을 위한 라이신 잔기이다. 합텐화된 폴리펩티드 중의 폴리펩티드의 세번째 아미노산 잔기는 i) 페이로드에 대한 콘쥬게이션을 위한 단일 아미노산 잔기 또는 ii) 폴리펩티드이다. 또한 폴리펩티드 그 자체가 생물학적 활성을 가진 더 큰 폴리펩티드의 일부, 예컨대 예를 들어 폴리펩티드 독소의 일부인 것을 포함한다.
모든 폴리펩티드 서열은 일반적으로 허용된 관례에 따라 작성되며, 알파-N-말단 아미노산 잔기가 좌측에 있고 알파-C-말단 아미노산 잔기가 우측에 있다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "N-말단" 은 폴리펩티드 내 아미노산의 유리 알파-아미노기를 의미하고, 용어 "C-말단" 은 폴리펩티드 내 아미노산의 유리 α-카르복실산 말단을 의미한다. 기를 갖는 N-말단화되는 폴리펩티드는 N-말단 아미노산 잔기의 알파-아미노 질소 상에 기를 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 기를 갖는 N-말단화되는 아미노산은 알파-아미노 질소 상에 기를 갖는 아미노산을 의미한다.
"D" 접두사 (예를 들어 D-Ala 또는 N-Me-D-Ile) 로 다르게 나타내지 않는 한, 또는 소문자 포맷으로 작성되지 않는 한 (예를 들어 a, i, 1 (Ala, Ile, Leu 의 D 버전)), 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 기재된 폴리펩티드 내 아미노산 및 아미노아실 잔기의 알파-탄소의 화학량론은 자연적이거나 "L" 형태이다. 칸-인골드-프레로그 (Cahn-Ingold-Prelog) "R" 및 "S" 지명은 폴리펩티드의 N-말단에서의 특정 아실 치환기에서의 키랄 중심의 화학량론을 구체화하는데 사용된다. 지명 "R,S" 는 2 개 에난티오머 형태의 라세미 혼합물을 나타내는 것을 의미한다. 상기 명명법은 [Cahn, R.S., et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 5 (1966) 385-415] 에서 기재된 것을 따른다.
용어 "단일-사슬 Fv", 축약형 "scFv" 는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 나타내며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 하나의 구현예에서, Fv 폴리펩티드는 scFv 가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv 의 검토를 위해서, [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (Eds), Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 을 참고한다.
용어 "테오필린", 축약형 "THEO" 는 1,3-디메틸-7H-퓨린-2,6-디온을 나타낸다. 테오필린은 또한 디메틸잔틴으로서 공지된다.
용어 "치료" (및 이의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하기") 는 치료되는 개인의 자연적 경과를 변형하기 위한 시도로의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상적 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 원하는 치료 효과에는, 제한 없이, 질환의 발병 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 소멸, 전이 방지, 질환 전개 속도 감소, 질환 상태의 개량 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후가 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추는데 사용된다.
용어 "x-원자가", 예를 들어, "1-원자가" 또는 "2-원자가" 또는 "3-원자가" 또는 "4-원자가" 는, 항체 분자 내의 결합 부위의 구체적인 수, 즉 "x" 의 존재를 나타낸다. 이와 같이, 용어 "2-원자가", "4-원자가", 및 "6-원자가" 는 항체 분자 내에 각각, 2 개의 결합 부위, 4 개의 결합 부위, 및 6 개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 본원에 보고되는 바와 같은 이특이적 항체는 적어도 "2-원자가" 이고, "3-원자가" 또는 "다원자가" (예를 들어, "4-원자가" 또는 "6-원자가") 일 수 있다. 하나의 구현예에서 본원에 보고되는 이특이적 항체는 2-원자가, 3-원자가, 또는 4-원자가이다. 하나의 구현예에서 이특이적 항체는 2-원자가이다. 하나의 구현예에서 이특이적 항체는 3-원자가이다. 하나의 구현예에서 이특이적 항체는 4-원자가이다.
특정 양상 및 구현예에서, 본원에 보고되는 항체는 2 개 이상의 결합 부위를 갖고, 이특이적이다. 즉, 항체는 심지어 2 개 초과의 결합 부위가 있는 경우에도 이특이적일 수 있다 (즉, 항체는 3-원자가 또는 다원자가임). 용어 이특이적 항체에는 예를 들어, 다원자가 단일 사슬 항체, 디아바디 및 트리아바디 뿐 아니라, 이에 대한 추가의 항원-결합 부위 (예를 들어, 단일 사슬 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab, 또는 (Fab)2,) 가 하나 이상의 펩티드-링커를 통해 연결되는, 전체 길이 항체의 불변 도메인 구조를 갖는 항체가 포함된다. 항체는 단일 종으로부터의 전체 길이일 수 있거나, 또는 키메라화 또는 인간화될 수 있다. 2 개 초과의 항원 결합 부위를 갖는 항체의 경우, 일부 결합 부위는 단백질이 2 개의 상이한 항원에 대해 2 결합 부위를 갖는다면, 일치할 수 있다. 즉, 첫번째 결합 부위는 합텐에 대해 특이적인 반면, 두번째 결합 부위는 비-합텐 항원에 대해 특이적이고, 그 역도 성립한다.
용어 "가변 영역" 이란, 항체를 이의 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 고유의 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (HVR) 을 포함한다 (예를 들어, 문헌 Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 페이지 91 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크린하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628) 을 참조한다.
용어 "벡터" 는 이에 연결된 또다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐 아니라 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 도입된 벡터를 포함한다. 특정한 벡터는 이들이 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 로서 언급된다.
II. 본원에 보고된 콘쥬게이트
슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 A 사슬 (PE) 은 613 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 66 kDa 폴리펩티드이다. 이것은 3 가지 기능적 도메인: 진핵 세포에 결합하는 N-말단 수용체-결합 도메인인 도메인 I, 내재화를 담당하고 단백질가수분해적으로 프로세싱되는 II 가 되는 도메인 II, 및 C-말단이고 프로세싱 후 세포질 내로 분비되는 도메인 III 으로 증축된다. 도메인 III ADP-리보실레이트 eEF2 는 단백질 합성의 억제 및 후속 세포 사멸을 야기한다.
PE 의 상이한 절단된 변이체의 조성물은 도 21A 에 제시된다. 절단된 변이체 NLysPE38 에서 세포 결합 도메인 I 및 도메인 IB 가 결실된다. 상기 분자는 그 자체가 매우 낮은 세포독성 효능을 갖는다. NLysPE38 은 그의 N-말단 (Nlys) 에 가깝게 라이신 잔기를 함유하는데, 이것은 NHS-화학에 의해 화학적으로 개질될 수 있다. 최근에 - 디술피드 안정화된 Fv-융합 (dsscFv-융합) 의 문맥 내에서 - 대부분의 도메인 II 는 또한 프로세싱 부위가 유지된다면 효능을 손실하지 않으면서 결실될 수 있다는 것이 제시되었다. 이러한 융합 단백질 내의 절단된 독소 변이체의 크기는 대략 25 kDa 이었다. 절단된 독소 변이체는 여전히 도메인 III 내에 라이신 잔기를 함유한다. 절단된 독소 변이체 NlysPE40QQR 에서 도메인 III 의 라이신은 예를 들어, 절단된 독소 변이체를 화학적으로 콘쥬게이션시킬 때, NHS 와 같은 아민-개질 시약에 의한 도메인 III 의 불활성화의 위험을 감소시키기 위해, 글루타민 및/또는 아르기닌으로 대체되었다. 본원에서 신규한 절단된 PE 변이체 NLysPE25SQΔ 가 보고되는데, 여기서 도메인 I 및 IB 뿐 아니라 도메인 II 의 대부분이 결실되고 (CD22-LR8M 의 독소 부분), 도메인 III 에서 세린 또는 글루타민 교환을 위해 라이신을 함유한다. 부가적으로, 이것은 결실된 C-말단 라이신을 갖고, 아미노-말단 N-Lys 연장을 가진다. NLysPE25SQΔ 는 그의 N-말단에 오로지 하나의 라이신을 함유하는 다소 작은 독소 부분이다. 상기 라이신의 일차 아민 (및 N-말단의 것) 은 독소의 다른 위치에는 영향을 주지 않고 NHS-시약에 의해 개질될 수 있다.
이특이적 항체에 커플링하는 합텐 매개 공유를 위해 추가의 시스테인을 함유하는 독소 변이체를 생성하기 위해, 시스테인을 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기의 전 또는 후에서 NLysPE25SQΔ 내에 위치시켰다.
하나의 양상에서 본 발명은 합텐화된 폴리펩티드 및 합텐에 특이적으로 결합하는 항-합텐 항체를 포함하는 공유 콘쥬게이트가 폴리펩티드 내의 시스테인 잔기 및 항체의 가변 도메인, 특히 항체의 CDR2 내의 시스테인 잔기 (CDR2 는 Kabat 에 따른 중쇄 가변 도메인 번호지정에 따라 결정됨) 사이에 적합하게 위치하는 디술피드 결합의 형성에 의해 수득될 수 있다는 발견에 기초한다.
특정 구현예에서, 항원은 합텐이다. 하나의 구현예에서 합텐은 비오틴, 또는 디곡시게닌, 또는 플루오레세인, 또는 테오필린, 또는 카르보란이다.
하나의 구현예에서 합텐화된 폴리펩티드는 합텐, 링커 및 폴리펩티드 독소를 포함하는 콘쥬게이트이다. 하나의 구현예에서 합텐은 비오틴, 또는 디곡시게닌, 또는 플루오레세인, 또는 테오필린, 또는 카르보란, 또는 브로모데옥시우리딘이다. 하나의 구현예에서 폴리펩티드는 폴리펩티드 독소이다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 공유 콘쥬게이트는 폴리펩티드에 양성 생물물리학적 행동 및 개선된 PK 특성을 부여할 수 있다. 게다가, 이특이적 항체가 사용되는 경우, 콘쥬게이트는 이특이적 항체의 제 2 결합 특이성에 의해 인지되는 항원을 전시하는 세포에 대해 폴리펩티드를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 콘쥬게이트는 하나의 항-합텐 결합 특이성 및 하나의 (비-합텐) 항원 결합 특이성으로 구성된다. 항체 분자 대 합텐화된 폴리펩티드 분자의 화학량론적 비는 이특이적 항체의 포맷에 따라 다르고, 1:1, 1:2, 2:1, 2:2, 2:4 및 4:2 (항체 : 합텐화된 폴리펩티드) 일 수 있다.
폴리펩티드가 합텐에 콘쥬게이션되고, 뿐만 아니라 항-합텐 항체에 콘쥬게이션됨에도 불구하고 양호한 생물학적 활성을 보유하는 것이 바람직하다. (이특이적 표적화 모듈의 경우) 이특이적 항체의 세포 표면 표적화 결합 부위가 공유적으로 콘쥬게이션된 합텐화된 폴리펩티드의 존재 하에서 그의 결합 특이성 및 친화성을 보유하는 것이 또한 바람직하다.
항-합텐 항체와 합텐화된 폴리펩티드 사이의 공유 콘쥬게이트의 형성을 위해 두 화합물은 반응기의 도입에 의해 개질되어야만 한다. 항-합텐 항체에 의한 합텐의 결합 시, 2 개의 반응기는 공유 결합의 형성을 허용하도록 가까워진다. 하나의 구현예에서 개질은 각각의 화합물 중의 티올 작용기의 도입이다. 하나의 구현예에서 티올 화합물은 시스테인 잔기이다.
돌연변이되어야만 하는 위치는 하기 2 가지 요건을 부수적으로 충족시켜야만 한다: (i) 커플링 위치는 지정 커플링에 대한 합텐 위치화 효과를 이용하기 위해 결합 영역에 근접해야만 함, 및 (ii) 돌연변이 및 커플링 위치는 합텐 결합 그 자체가 영향을 받지 않는 방식으로 위치해야만 함. 적합한 위치를 찾기 위한 상기 요건은 요건 (i) 이 결합 부위와 가까운 위치에 의해 최상으로 제공되는 반면, 요건 (ii) 는 결합 부위로부터 먼 위치에 의해 가장 안전하게 달성되기 때문에 서로 사실상 '모순' 적이다.
상기 사실상 배제되는 요건에도 불구하고, 항-합텐 항체 내의 위치는 합텐 위치화에 영향을 주지 않고, 그럼에도 불구하고 지시된 공유 커플링을 동시에 허용하는 식으로 돌연변이될 수 있는 것으로 확인되었다.
첫번째 위치는 중쇄 가변 도메인의 Kabat 번호지정에 따라, 각각 위치 VH52b 또는 위치 VH53 에 위치한다. 항체가 간헐적 잔기를 갖지 않는, 짧은 VH CDR2 를 갖는 경우, 예컨대 52a, 52c, 52c, 및 52d, 위치는 53 (항체 중쇄 가변 도메인에 대해 Kabat 의 번호지정 도식 및 법칙에 따른 번호지정 및 배열) 이다. 항체가 잔기 52a 및 52b, 및 임의로 52c 및 52d 등으로서, 추가의 잔기를 포함하는 긴 VH CDR2 를 갖는 경우, 위치는 52b (항체 중쇄 가변 도메인에 대해 Kabat 의 번호지정 도식 및 법칙에 따른 번호지정 및 배열) 이다.
두번째 위치는 Kabat 번호지정에 따라, 위치 VH28 에 위치한다.
예를 들어, 항-디곡시게닌 항체 구조에서, 합텐은 소수성 잔기에 의해 형성되는 깊은 포켓 내에 결합된다. 형광 디곡시게닌-Cy5 콘쥬게이트가 본 결정학적 연구에서 사용되었고, 형광단 뿐 아니라, 디곡시게닌과 Cy5 사이의 링커는 높은 유연성 및 결정 내의 산출되는 정렬순서로 인해 구조 내에서 볼 수 없었다. 그러나, 링커 및 Cy5 는 중쇄의 CDR2 의 방향 내로 향하는 디곡시게닌의 O32 에 부착된다. Kabat 에 따른 위치 52b 에서의 아미노산 잔기의 Cα 에 대한 디곡시게닌의 O32 사이의 거리는 약 10.5 Å 이다.
이 위치가 "보편적" 위치인, 즉, 해당 위치가 임의의 (항-합텐) 항체에 적용가능하고, 따라서 신규한 (항-합텐) 항체가 결정 구조를 제공하고 합텐-위치화된 공유 커플링을 가능하게 하는 적합한 위치를 측정함으로써 개질되어야만 하는 매번 스트레치로부터 출발할 필요가 없다는 것을 밝혔다.
Kabat 의 번호지정 도식에 따른 돌연변이 VH52bC 또는 VH53C 각각은 예상치 않게 분석되는 각각의 합텐-결합 항체에 대해 사용될 것이다. 심지어 돌연변이 VH52bC 또는 VH53C 각각은 항체 및 구조가 꽤 다양함에도 불구하고, VH52bC/VH53C 돌연변이가 합텐 (예컨대 예를 들어, 디곡시게닌, 비오틴, 플루오레세인, 테오필린 뿐 아니라, 브로모데옥시우리딘) 에 결합하는 항체에 대한 합텐/합텐화된 화합물의 공유 부착에 사용될 수 있다고 제시된다. 따라서, Kabat 에 따른 번호지정에 따라 (그 잔기는 항체의 중쇄 CDR2 내에 있음) 위치 VH52b/VH53 에서 아미노산 잔기의 시스테인으로의 변화가 다른 (항-합텐) 항체에, 특정 항체 구조의 구조적 디자인 또는 지식의 추가의 필요 없이, 항체의 가변 도메인에 고유한 결합 특성에서의 간섭 없이 적용가능하다는 것이 추가로 밝혀졌다.
본원에 보고된 바와 같이 개질된 항체는 이들의 모체 (즉, 야생형) 항-합텐 항체의 합텐 결합 역량을 보유한다. 따라서, 인공 항체 시스테인 잔기를 포함하는 항-합텐 항체는 합텐에 결합, 하나의 구현예에서 특이적으로 결합한다.
용어 "~ 에 결합하는 항체" 는 항체가 그의 항원과 특이적 방식으로 복합체를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 특이적 결합은 시험관 내 어세이, 예컨대 플라즈몬 공명 어세이 (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 에서 검출될 수 있다. 복합체 형성의 친화성은 용어 ka (복합체를 형성하는 화합물의 연합에 대한 속도 상수), kD (해리 상수, 복합체의 해리), 및 KD (kD/ka) 로 정의된다. 결합하는 또는 특이적으로 결합하는 것은 약 10-8 M 이하, 하나의 구현예에서 약 10-8 M 내지 약 10-13 M, 하나의 구현예에서 약 10-9 M 내지 약 10-13 M 의 결합 친화성 (KD) 을 의미한다. 따라서, 본원에 보고되는 복합체를 형성하기 위해 합텐에 결합하는 항체는 약 10-8 mol/l 이하, 하나의 구현예에서 약 10-8 mol/l 내지 약 10-13 mol/l, 하나의 구현예에서 약 10-9 mol/l 내지 10-13 mol/l 의 결합 친화성 (KD) 으로 합텐에 특이적으로 결합한다.
시스테인-개질된 항-합텐 항체와 합텐에 콘쥬게이션된 시스테인-개질된 폴리펩티드 사이의 공유 결합의 형성은 형성된 결합이 디술피드 결합인 경우, 환원제 및/또는 산화제를 첨가할 필요성 없이, 합텐에 대한 항체의 결합시 일어난다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 2 개의 화합물 사이의 디술피드 브릿지가 비-공유 복합체의 형성 시 자발적으로 형성된다. 따라서, 본원에 보고된 공유 복합체의 형성 방법은 단순히 2 개의 화합물의 혼합을 필요로 한다. 디술피드 결합의 형성을 위한 유일한 전제조건은 서로에 대한 2 개 화합물의 적합한 방향이다.
항-합텐 항체를 함유하는 인공 항체 시스테인 잔기는 인공 폴리펩티드 시스테인 잔기를 포함하는 합텐화된 폴리펩티드와 부위-특이적으로 및 효과적으로 커플링될 수 있다.
각각 위치 VH52b 및 VH53 (Kabat 번호지정 도식에 따름) 에서의 아미노산 잔기 시스테인 잔기로의 대체는 항-디곡시게닌 항체-VH52bC 에 대해 SEQ ID NO: 20 및 28, 항-테오필린 항체-VH53C 에 대해 SEQ ID NO: 84 및 92, 항-비오틴 항체-VH53C 에 대해 SEQ ID NO: 52 및 60, 및 항-플루오레세인 항체-VH52bC 에 대해 SEQ ID NO: 108 에 나열된 중쇄 가변 영역 서열을 가진 항체 유도체를 산출하였다.
위치 VH28 (Kabat 번호지정 도식에 따름) 에서의 중쇄 가변 도메인 아미노산 잔기의 시스테인 잔기로의 대체는 각각 SEQ ID NO: 116, 124, 132, 140, 148, 156, 및 164 에 나열된 중쇄 가변 영역 서열을 가진 항체 유도체를 산출하였다.
하나의 구현예에서 항-디곡시게닌 항체는 (a) SEQ ID NO: 09 또는 25 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 10 또는 26 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 11 또는 27 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 13 또는 29 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 14 또는 30 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 15 또는 31 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 항-비오틴 항체는 (a) SEQ ID NO: 41 또는 57 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 42 또는 58 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 43 또는 59 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 45 또는 61 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 46 또는 62 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 47 또는 64 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 항-플루오레세인 항체는 (a) SEQ ID NO: 105 또는 113 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 106 또는 114 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 107 또는 115 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 109 또는 117 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 110 또는 118 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 111 또는 119 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 항-테오필린 항체는 (a) SEQ ID NO: 73 또는 89 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 74 또는 90 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 75 또는 91 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 77 또는 93 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 78 또는 94 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 79 또는 95 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 항-디곡시게닌 항체는 (a) (i) SEQ ID NO: 09 또는 25 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 10 또는 26 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 (iii) SEQ ID NO: 11 또는 27 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 (b) (i) SEQ ID NO: 13 또는 29 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ii)SEQ ID NO: 14 또는 30 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (c) SEQ ID NO: 15 또는 31 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 항-비오틴 항체는 (a) (i) SEQ ID NO: 41 또는 57 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 42 또는 58 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 (iii) SEQ ID NO: 43 또는 59 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 (b) (i) SEQ ID NO: 45 또는 61 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 46 또는 6242 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (c) SEQ ID NO: 47 또는 63 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 항-플루오레세인 항체는 (a) (i) SEQ ID NO: 105 또는 113 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 106 또는 114 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 (iii) SEQ ID NO: 107 또는 115 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 (b) (i) SEQ ID NO: 109 또는 117 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 110 또는 118 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (c) SEQ ID NO: 111 또는 119 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 항-테오필린 항체는 (a) (i) SEQ ID NO: 73 또는 89 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 74 또는 90 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 (iii) SEQ ID NO: 75 또는 91 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 (b) (i) SEQ ID NO: 77 또는 93 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 78 또는 94 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (c) SEQ ID NO: 79 또는 95 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 항-디곡시게닌 항체, 및/또는 항-비오틴 항체, 및/또는 항-테오필린 항체는 인간화 항체이다.
하나의 구현예에서 항-디곡시게닌 항체는 상기 구현예 중 임의의 하나에서와 같은 CDR 을 포함하고, 수용기 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 일치 프레임워크를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서 항-비오틴 항체는 상기 구현예 중 임의의 하나에서와 같은 CDR 을 포함하고, 수용기 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 일치 프레임워크를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서 항-테오필린 항체는 상기 구현예 중 임의의 하나에서와 같은 CDR 을 포함하고, 수용기 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 일치 프레임워크를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서 항-디곡시게닌 항체는 SEQ ID NO: 04 또는 12 또는 20 또는 28 의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 일치성을 갖는 VH 서열은 참고 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-디곡시게닌 항체는 디곡시게닌에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 01 또는 09 또는 17 또는 25 에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 (즉, FR 내에서) 영역에서 일어난다. 임의로, 항-디곡시게닌 항체는 해당 서열의 전사-후 개질을 포함하여 SEQ ID NO: 01 또는 09 또는 17 또는 25 에 VH 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 항-디곡시게닌 항체는 SEQ ID NO: 08 또는 16 또는 24 또는 32 의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함하는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 일치성을 갖는 VL 서열은 참고 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-디곡시게닌 항체는 디곡시게닌에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 08 또는 16 또는 24 또는 32 에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 (즉, FR 내에서) 영역에서 일어난다. 임의로, 항-디곡시게닌 항체는 해당 서열의 전사-후 개질을 포함하여 SEQ ID NO: 08 또는 16 또는 24 또는 32 에 VL 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 항-비오틴 항체는 SEQ ID NO: 36 또는 44 또는 52 또는 60 의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 일치성을 갖는 VH 서열은 참고 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-비오틴 항체는 비오틴에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 36 또는 44 또는 52 또는 60 에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 (즉, FR 내에서) 영역에서 일어난다. 임의로, 항-비오틴 항체는 해당 서열의 전사-후 개질을 포함하여 SEQ ID NO: 36 또는 44 또는 52 또는 60 에 VH 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 항-플루오레세인 항체는 SEQ ID NO: 108 또는 116 의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 일치성을 갖는 VH 서열은 참고 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-플루오레세인 항체는 플루오레세인에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 108 또는 116 에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 (즉, FR 내에서) 영역에서 일어난다. 임의로, 항-플루오레세인 항체는 해당 서열의 전사-후 개질을 포함하여 SEQ ID NO: 108 또는 116 에 VH 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 항-테오필린 항체는 SEQ ID NO: 68 또는 76 또는 84 또는 92 의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 일치성을 갖는 VH 서열은 참고 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-테오필린 항체는 테오필린에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 68 또는 76 또는 84 또는 92 에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 (즉, FR 내에서) 영역에서 일어난다. 임의로, 항-테오필린 항체는 해당 서열의 전사-후 개질을 포함하여 68 또는 76 또는 84 또는 92 에 VH 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 항-디곡시게닌 항체는 상기 제공되는 구현예 중 임의의 것과 같은 VH, 및 상기 제공되는 구현예 중 임의의 것과 같은 VL 을 포함하는 것을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 항체는 각각, SEQ ID NO: 04 또는 12 또는 20 또는 28, 및 SEQ ID NO: 08 또는 16 또는 24 또는 32 내에 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 전사-후 개질을 포함).
하나의 구현예에서 항-비오틴 항체는 상기 제공되는 구현예 중 임의의 것과 같은 VH, 및 상기 제공되는 구현예 중 임의의 것과 같은 VL 을 포함하는 것을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 항체는 각각, SEQ ID NO: 36 또는 44 또는 52 또는 60, 및 SEQ ID NO: 40 또는 48 또는 56 또는 64 내에 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 전사-후 개질을 포함).
하나의 구현예에서 항-플루오레세인 항체는 상기 제공되는 구현예 중 임의의 것과 같은 VH, 및 상기 제공되는 구현예 중 임의의 것과 같은 VL 을 포함하는 것을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 항체는 각각, SEQ ID NO: 108 또는 116, 및 SEQ ID NO: 112 또는 120 내에 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 전사-후 개질을 포함).
하나의 구현예에서 항-테오필린 항체는 상기 제공되는 구현예 중 임의의 것과 같은 VH, 및 상기 제공되는 구현예 중 임의의 것과 같은 VL 을 포함하는 것을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 항체는 각각, SEQ ID NO: 68 또는 76 또는 84 또는 92, and SEQ ID NO: 72 또는 80 또는 88 또는 96 내에 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 전사-후 개질을 포함).
개질 지점으로서 확인된 추가의 위치는 Kabat 번호지정에 따라 위치 VH28 이다.
Kabat 에 따라 위치 VH28 에서의 아미노산의 시스테인으로의 대체는 항-디곡시게닌 항체-VH28C 에 대해 SEQ ID NO: 124 및 132, 항-테오필린 항체-VH28C 에 대해 SEQ ID NO: 156 및 164, 항-비오틴 항체-VH28C 에 대해 SEQ ID NO: 140 및 148, 및 항-플루오레세인 항체-VH28C 에 대해 SEQ ID NO: 116 으로서 나열된 중쇄 가변 영역 서열을 가진 항체 유도체를 발생시켰다.
ESI-MS 분석은 합텐화된 치료적 펩티드의 공유 항체 콘쥬게이션이 비-복합체화된 항체 또는 비-복합체화된 펩티드보다 큰 정의된 크기의 콘쥬게이트를 산출한다는 것을 입증한다.
표 1: TIC 표
Figure 112016075559978-pct00002
Figure 112016075559978-pct00003
Figure 112016075559978-pct00004

항체 친화성
특정 구현예에서, 본원에 보고한 바와 같은 항체 그 자체 또는 본원에 보고한 바와 같은 복합체로의 항체는 ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예를 들어 약 10-8 M 이하, 예를 들어 약 10-8 M 내지 약 10-13 M, 예를 들어 약 10-9 M 내지 약 10-13 M) 의 해리 상수 (Kd) 를 갖는다.
하나의 구현예에서, Kd 는 하기 어세이에 의해 기재된 바와 같은 관심 항체의 Fab 형태 및 이의 항원으로 수행된 방사성표지 항원 결합 어세이 (RIA) 에 의해 측정된다. 항원에 대한 FAB 의 용액 결합 친화성은 미표지된 항원의 적정 연속물의 존재 하 (125I)-표지 항원의 최소 농도로 Fab 를 평형화시킨 후, 항-Fab 항체-코팅 플레이트로 결합 항원을 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, Chen, Y. et al., J.　Mol. Biol. 293 (1999) 865-881 참고). 어세이 조건을 확립하기 위해서, MICROTITER® 멀티-웰 플레이트 (Thermo Scientific) 를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 ㎍/ml 의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs) 로 밤새 코팅한 후, 2 내지 5 시간 동안 실온 (대략 23℃) 에서 PBS 중 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 블로킹하였다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620) 에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab (예를 들어, Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599 에서의 항-VEGF 항체, Fab-12 의 평가와 일치) 의 연속 희석물과 혼합한다. 이후 관심 Fab 를 밤새 인큐베이션하나; 인큐베이션은 평형에 도달하는지를 확실히 하기 위해 더 긴 기간 (예를 들어, 약 65 시간) 동안 지속될 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서 (예를 들어 1 시간 동안) 인큐베이션을 위해 포획 플레이트에 옮긴다. 용액을 이후 제거하고 플레이트를 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®) 로 8 회 세척한다. 플레이트가 건조되었을 때, 150 ㎕/웰의 섬광체 (MICROSCINT-20TM; Packard) 를 첨가하고, 상기 플레이트를 TOPCOUNTTM 감마 카운터 (Packard) 에서 10 분 동안 계수한다. 경쟁적 결합 어세이에서 사용하기 위해 20% 이하의 최대 결합을 제공하는 각각의 Fab 농도를 선택한다.
또다른 구현예에 따르면, Kd 는 ~10 반응 단위 (Response Unit: RU) 에서 고정된 항원 CM5 칩을 이용하여 25 ℃ 에서, BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 어세이를 사용하여 측정된다. 간략하게는, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.) 을 공급처의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 를 이용하여 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8 를 이용하여 5 μg/mL (약 0.2 μM) 로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속에서 주입하여 대략 10 반응 단위 (Response Unit: RU) 의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원 주입 후, 비-반응된 그룹을 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 동역학 측정을 위해, Fab 의 2 배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM) 을 25 ℃ 에서 대략 25 ㎕/분의 유속으로 0.05 % 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20™) 계면활성제 (PBST) 중의 PBS 에 주입한다. 연합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff) 는 연합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순한 1-대-1 Langmuir 결합 모델 (BIACORE® Evaluation Software version 3.2) 을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd) 는 koff/kon 비로서 계산된다. 예를 들어, 문헌, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881 을 참조한다. 온-속도 (on-rate) 가 상기 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 106 M-1 s-1 을 초과하는 경우, 온-속도는 분광계, 예컨대 정지-흐름 장치 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-AMINCO ™ 분광광도계 (ThermoSpectronic) 에서 측정된 바와 같은 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중의 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태) 의 25 ℃ 에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스 (band-pass)) 의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용함으로써 측정될 수 있다.
항체 단편
특정 구현예에서, 본원에 보고된 콘쥬게이트 중의 결합 특이성은 항체 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기에 기재된 기타 단편을 포함한다. 특정 항체 단편의 검토를 위해서는, [Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134] 를 참고한다. scFv 단편의 검토를 위해서는, 예를 들어 [Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315] 를 참고하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458 을 참고한다. 구조 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하며 증가한 생체 내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해서는 US 5,869,046 을 참고한다.
디아바디는 2-원자가 또는 이특이적일 수 있는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 을 참고한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134) 에 기재되어있다.
단일-도메인 항체는 항체의 전부 또는 일부의 중쇄 가변 도메인 또는 전부 또는 일부의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, US 6,248,516 참고).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 미손상 항체의 단백질가수분해성 소화 뿐 아니라 재조합 숙주 세포의 생성 (예를 들어 대장균 또는 파지) 을 비제한적으로 포함하는 각종 기술에 의해 만들어질 수 있다.
키메라 및 인간화 항체
특정 구현예에서, 본원에 보고된 콘쥬게이트 중의 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 US 4,816,567; 및 Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855) 에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유래한 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모체 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 변화된 "클래스 전환" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성이 감소되는 한편, 모체 비-인간 항체의 특이성 및 친화성은 유지한다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 이의 일부) 이 비-인간 항체에서 유래되고 FR (또는 이의 일부) 이 인간 항체 서열에서 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로는 또한 적어도 일부의 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화 항체에서의 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예를 들어 HVR 잔기가 유래되는 항체) 로부터의 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성이 복구되거나 향상된다.
인간화 항체 및 이의 생성 방법은 예를 들어 Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 에서 검토되며, 예를 들어 Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; 미국 특허 번호. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (SDR (a-CDR) 그래프팅 기재); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 ("재표면처리 (resurfacing)" 기재); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 and Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근방식) 에서 추가 기재된다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 하기를 포함한다: "최상-피트 (best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308 참고); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열에서 유래한 프레임워크 영역 (예를 들어, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632 참고); 인간 성숙 (체세포적으로 돌연변이화됨) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포 프레임워크 영역 (예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 참고); 및 스크리닝 FR 라이브러리에서 유래한 프레임워크 영역 (예를 들어, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 및 Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618) 참고).
인간 항체
특정 구현예에서, 본원에 보고되는 바와 같은 콘쥬게이트 중의 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 및 Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459 에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 접종에 대해 반응하여 미손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 미손상 항체를 생성하기 위해 개질된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내생 면역글로불린 유전자좌를 대체하는, 또는 염색체외적으로 존재하는 또는 동물의 염색체 내에 무작위로 통합된 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 유전자도입 마우스에서, 내생 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 유전자도입 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 리뷰를 위해, 문헌 Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125 를 참조한다. 또한 예를 들어, XENOMOUSE™ 기술을 기재하고 있는 US 6,075,181 및 US 6,150,584; HUMAB® 기술을 기재하고 있는 US 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 기재하고 있는 US 7,041,870, 및, VELOCIMOUSE® 기술을 기재하고 있는 US 2007/0061900 을 참조한다. 이러한 동물에 의해 발생된 미손상 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과의 조합에 의해 추가로 개질될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 기재되어 있다 (예를 들어, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; 및 Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 발생된 인간 항체는 또한 문헌 Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562 에 기재되어 있다. 부가적인 방법에는 예를 들어, US 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재함) 및 Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (인간-인간 하이브리도마를 기재함) 에 기재된 것들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology) 은 또한 문헌 Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 및 Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191 에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이러한 가변 도메인 서열은 이후 요망되는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.
라이브러리-유도 항체
본원에 보고되는 콘쥬게이트 중의 항체는 원하는 활성(들) 을 가진 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 요망되는 결합 특성을 갖는 항체에 대한 이러한 라이브러리를 스크리닝 하기 위해 다양한 방법이 당업계에 공지된다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌 Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 에 리뷰되고, 예를 들어, 문헌 McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; 및 Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132 에 추가로 기재된다.
특정한 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 개별적으로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이들은 이후 문헌 Winter, G., et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455 에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝할 수 있다. 파지는 전형적으로 단일-사슬 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 높은-친화성 항체를 제공한다. 대안적으로는, 고유의 레퍼토리가 항체의 단일 공급원을 문헌 Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734 에 의해 기재되는 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가-항원에 제공하기 위해 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 고유의 라이브러리는 또한 문헌 Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 에 의해 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 비-재배열된 V-유전자 분절을 클로닝하고, 고도의 가변 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관 내 재배열을 달성하기 위해 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써 종합적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공개문헌은, 예를 들어: US 5,750,373, 및 US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936, 및 US 2009/0002360 을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 고려된다.
항체 포맷
상기 개략적으로 나타낸 항체 및 항체 단편은 여러 방식으로 조합되어 상이한 항체 포맷을 생성시킬 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 scFv 항체 단편은 완전한 항체의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 융합될 수 있다. 특히 각각의 중쇄 C-말단 또는 각각의 경쇄 C-말단에 scFv 항체 단편이 융합될 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 항체 Fab 단편은 완전한 항체의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 융합될 수 있다. 특히 각각의 중쇄 C-말단 또는 각각의 경쇄 C-말단에 항체 Fab 단편이 융합될 수 있다.
예를 들어, 하나의 scFv 및 하나의 항체 Fab 단편은 항체 Fc-영역의 N-말단에 융합될 수 있다.
예를 들어 하나의 scFv 또는 항체 Fab 단편은 항체 Fc-영역의 N-말단에 융합될 수 있고, 하나의 scFv 또는 항체 Fab 단편은 항체 Fc-영역의 각각의 다른 사슬의 C-말단에 융합될 수 있다.
다중특이적 항체
예를 들어 IgG 항체 포맷 및 단일 사슬 도메인의 융합에 의해, 광범위한 재조합 항체 포맷, 예를 들어 4-원자가 이특이적 항체가 개발되었다 (예를 들어 Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO 2001/077342; 및 Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234 참고).
또한, 항체 코어 구조 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 가 더 이상 유지되지 않는 여러 기타 포맷, 예컨대 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, 미니바디, 여러 단일 사슬 포맷 (scFv, 비스-scFv) (둘 이상의 항원에 결합할 수 있음) 이 개발되었다 (Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature　Biotech. 25 (2007) 1290-1297).
모든 이러한 포맷은 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 를 추가의 결합 단백질 (예를 들어 scFv) 에 융합시키거나 예를 들어 2 개의 Fab 단편 또는 scFv 를 융합시키는데 링커를 사용한다 (Fischer, N. and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). 자연 발생적 항체에 대한 높은 정도의 유사성을 유지함으로써, Fc 수용체 결합을 통해 매개되는 효과기 기능, 예를 들어 보체-의존적 세포독성 (CDC) 또는 항체 의존적 세포 세포독성 (ADCC) 을 보유하는 것이 필요할 수 있다는 것에 주의해야 한다.
WO　2007/024715 에서는 조작된 다가 및 다중특이적 결합 단백질로서 이중 가변 도메인 면역글로불린을 보고하고있다. 생물학적 활성 항체 이량체의 제조 방법은 US　6,897,044 에 보고되어있다. 펩티드 링커를 통해 서로 연결되는 4 개 이상의 가변 도메인을 갖는 다원자가 FV 항체 구성물은 US 7,129,330 에 보고되어있다. 이량체 및 다량체 항원 결합 구조는 US 2005/0079170 에 보고되어있다. 구조를 연결시켜 서로 공유적으로 결합된 3 또는 4 개의 Fab 단편을 포함하는 3가 또는 4가 단일특이적 항원-결합 단백질 (단백질은 자연적 면역글로불린이 아님) 은 US 6,511,663 에 보고되어있다. WO 2006/020258 에서 원핵세포 및 진핵세포에서 효율적으로 발현될 수 있으며 치료적 및 진단적 방법에서 유용한 4가 이특이적 항체가 보고되어있다. 2 개 유형의 폴리펩티드 이량체를 포함하는 혼합물로부터의 하나 이상의 사슬간 디술피드 연결을 통해 연결되지 않는 이량체로부터 하나 이상의 사슬간 디술피드 연결을 통해 연결되는 이량체를 분리하거나 바람직하게 합성하는 방법은 US 2005/0163782 에 보고되어있다. 이특이적 4가 수용체는 US 5,959,083 에 보고되어있다. 3 개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체는 WO 2001/077342 에 보고되어있다.
다중특이적 및 다가 항원-결합 폴리펩티드는 WO 1997/001580 에 보고되어있다. WO 1992/004053 은 통상, 합성적 가교에 의해 공유 연결되는 동일한 항원 결정인자에 결합하는 IgG 클래스의 모노클로날 항체로부터 제조된 동종콘쥬게이트를 보고하고 있다. 항원에 대한 높은 결합활성을 갖는 올리고머성 모노클로날 항체가 WO 1991/06305 에 보고되어 있으며, 함께 연합된 둘 이상의 면역글로불린 단량체를 갖는 통상 IgG 클래스의 올리고머가 분비되어 4가 또는 6가 IgG 분자를 형성한다. 양-유래 항체 및 조작된 항체 구성물이 US 6,350,860 에 보고되어있는데, 이는 인터페론 감마 활성이 병원성인 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. US 2005/0100543 에서 이특이적 항체의 다가 운반체인 표적성 구성물이 보고되는데, 즉 표적성 구성물의 각각의 분자는 둘 이상의 이특이적 항체의 운반체로서 역할할 수 있다. 유전자 조작된 이특이적 4가 항체가 WO 1995/009917 에 보고되어있다. WO 2007/109254 에서 안정화된 scFv 로 이루어지거나 이를 포함하는 안정화된 결합 분자가 보고되어있다.
특정 구현예에서, 본원에 보고된 항체 또는 본원에 보고한 바와 같은 콘쥬게이트 중의 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 합텐에 대한 것이고 다른 것은 임의의 다른 (비-합텐) 항원에 대한 것이다. 이특이적 항체는 또한 세포에 대해 세포독성제를 국부화시키는데 사용될 수 있다. 이특이적 항체는 전체 길이 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 비제한적으로, 상이한 특이성을 갖는 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현 (Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659 참고), 및 "놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168) 을 포함한다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이형이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 조종 효과의 조작 (WO 2009/089004); 둘 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83 참고); 이특이적 항체 생성을 위한 류신 지퍼 사용 (예를 들어, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 참고); 이특이적 항체 단편 생성을 위한 "디아바디" 기술 사용 (예를 들어, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참고); 및 단일-사슬 Fv (sFv) 이량체 사용 (예를 들어 Gruber, M et al., J.　Immunol. 152 (1994) 5368-5374 참고); 및 삼중특이적 항체 제조 (예를 들어, Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69 에 기재된 바와 같음) 에 의해 생성될 수 있다.
하나의 구현예에서 이특이적 항체의 중쇄의 CH3 도메인은 예를 들어, WO 96/027011, WO 98/050431, Ridgway J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621, Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681 에서 여러 예를 사용해 상세히 기재되는 "놉-인투-홀" 기술에 의해 변경된다. 본 방법에서 2 개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 상기 2 개의 CH3 도메인을 함유하는 양쪽 중쇄의 이종이량체화를 증가시키기 위해 변형되다. 2 개의 CH3 도메인 (2 개의 중쇄의) 각각은 "놉" 일 수 있는 반면, 나머지는 "홀" 이다. 디술피드 다리의 도입은 이종이량체를 추가로 안정화시키고 (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681, Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) 수율을 증가시킨다.
모든 양상의 하나의 바람직한 구현예에서 이특이적 항체는 하기를 특징으로 한다:
- 하나의 중쇄의 CH3 도메인 및 다른 중쇄의 CH3 도메인 각각은 항체 CH3 도메인 사이의 본래 계면을 포함하는 계면에서 만나며,
이 때 상기 계면은 이특이적 항체의 형성을 촉진하기 위해 변경되고, 변형은 하기를 특징으로 함:
a) 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변경되어,
이특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 본래 계면과 만나는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 본래 계면 내에
아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이에 의해 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내의 공동 내에 위치를 잡을 수 있는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에 돌출부를 생성하도록 하고,
b) 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경되어,
이특이적 항체 내의 제 1 CH3 도메인의 본래 계면과 만나는 제 2 CH3 도메인의 본래 계면 내에
아미노산 잔기는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이에 의해 제 1 CH3 도메인의 계면 내의 돌출부가 위치를 잡을 수 있는 제 2 CH3 도메인의 계면 내에 공동을 생성하도록 함.
따라서, 본원에 보고되는 항체는 하나의 바람직한 구현예에서 하기를 특징으로 한다:
- 상기 전체 길이 항체의 제 1 중쇄의 CH3 도메인 및 상기 전체 길이 항체의 제 2 중쇄의 CH3 도메인 각각은 항체 CH3 도메인 사이의 본래 계면 내에 변형을 포함하는 계면에서 만나며,
이 때
i) 제 1 중쇄의 CH3 도메인 내에
아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이에 의해 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에 공동 내에 위치를 잡을 수 있는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에 돌출부를 생성하도록 하고,
ii) 제 2 중쇄의 CH3 도메인 내에
아미노산 잔기는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이에 의해 제 1 CH3 도메인의 계면 내에 돌출부가 위치를 잡을 수 있는 제 2 CH3 도메인의 계면 내에 공동을 생성하도록 함.
하나의 구현예에서 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 양쪽 CH3 도메인은 각각의 CH3 도메인의 상응하는 위치 내에 아미노산으로서 시스테인 (C) 을 도입함으로써 양쪽 CH3 도메인 사이의 디술피드 다리가 형성될 수 있도록 추가로 변경된다.
하나의 구현예에서, 이특이적 항체는 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내의 T366W 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내의 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. CH3 도메인 사이의 부가적인 사슬간 디술피드 다리가 또한, 예를 들어, "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내에 Y349C 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내에 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 도입함으로써 사용될 수 있다 (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681) (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 번호지정: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
하나의 구현예에서 이특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인의 하나 내에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인의 다른 것 내에 E356C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서 이특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인의 하나 내에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인의 다른 것 내에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이 (사슬간 디술피드 다리를 형성하는 하나의 CH3 도메인 내에 부가적인 Y349C 돌연변이 및 다른 CH3 도메인 내에 부가적인 E356C 또는 S354C 돌연변이) 를 포함한다 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 번호지정; (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). EP 1 870 459 A1 에 의해 기재된 추가의 놉-인-홀 기술이 대안적으로 또는 부가적으로 사용될 수 있다. 따라서 이특이적 항체에 대한 또다른 예는 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내의 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내의 D399K, E357K 돌연변이이다 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 번호지정; (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
또다른 구현예에서 이특이적 항체는 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내의 T366W 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내의 T366S, L368A, Y407V 돌연변이 및 부가적으로 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내의 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내의 D399K, E357K 돌연변이를 포함한다.
하나의 구현예에서 이특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인의 하나 내에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인의 다른 것 내에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함하거나, 이특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인의 하나 내에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인의 다른 것 내에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이 및 부가적으로 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내에 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내에 D399K, E357K 돌연변이를 포함한다. CH3 도메인 내의 이러한 놉 (knob) 및 홀 (hole) 돌연변이는 전형적으로 SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, 또는 SEQ ID NO: 172 (인간 IgG1 서브클래스 동종이인자형 (백인 및 아프리카계 미국인 또는 돌연변이체 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G), SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, 또는 SEQ ID NO: 175 (인간 IgG4 서브클래스 또는 돌연변이체 S228P, L235E, 및 S228P/L235E/P329G) 의 인간 중쇄 불변 영역에서 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 의 EU 인덱스에 따른 번호지정).
하나의 구현예에서 이특이적 항체는 CH3 도메인 내에 이러한 "놉" 및 "홀" 돌연변이 (예를 들어, 2 개의 CH3 도메인 돌연변이 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 것에 S354C, T366S, L368A, Y407V) 를 추가로 포함하는 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 의 EU 인덱스에 따른 번호지정) SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, 또는 SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, 또는 SEQ ID NO: 175 의 인간 중쇄 불변 영역을 포함한다.
"문어 항체" 를 포함하여, 3 개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 가진 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576 참조).
본원의 항체 또는 단편에는 또한 합텐 뿐 아니라, 또다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "Dual Acting Fab" 또는 "DAF" 가 포함된다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
본원의 항체 또는 단편에는 또한 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, 및 WO 2010/145793 에 기재된 다중특이적 항체가 포함된다.
하나의 구현예에서 이특이적 항체의 제 1 결합 특이성은 합텐에 대한 것이고, 제 2 결합 특이성은 비-합텐 항원에 대한 것이다. 하나의 구현예에서 비-합텐 항원은 백혈구 마커, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD11a,b,c, CD13, CD14, CD18, CD19, CD22, CD23, CD27 및 이의 리간드, CD28 및 이의 리간드 B7.1, B7.2, B7.3, CD29 및 이의 리간드, CD30 및 이의 리간드, CD40 및 이의 리간드 gp39, CD44, CD45 및 이소형, CD56, CD58, CD69, CD72, CTLA-4, LFA-1 및 TCR; 조직적합 항원, MHC 클래스 I 또는 II, Lewis Y 항원, SLex, SLey, SLea, 및 SLeb; 인테그린, VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5, VLA-6, αVβ3, 및 LFA-1, Mac-1, 및 pl50,95, αVβ1, gpIIbIIIa, αR β3, α6β4, αVβ 5, αVβ6, 및 αV 62 7; 셀렉틴, L-셀렉틴, P-셀렉틴, 및 E-셀렉틴 및 이들의 반대 수용체 VCAM-1, ICAM-1, ICAM-2, 및 LFA-3; 인터류킨, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, 및 IL-15 로부터 선택되고; 인터류킨 수용체는 IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-11R, IL-12R, IL-13R, IL-14R, 및 IL-15R 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 케모카인은 PF4, RANTES, MIP1α, MCP1, NAP-2, Groα, Groβ, 및 IL-8 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 성장 인자는 TNFalpha, TGFbeta, TSH, VEGF/VPF, VEGFA, VEGFB, VEGF111, VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206, PTHrP, EGF 패밀리, PDGF 패밀리, 엔도텔린, Fibrosin (FSF-1), 인간 라미닌, 및 가스트린 방출 펩티드 (GRP), PLGF, HGH, HGHR 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 성장 인자 수용체는 TNFalphaR, RGFbetaR, TSHR, VEGFR/VPFR, EGFR, PTHrPR, PDGFR 패밀리, EPO-R, GCSF-R 및 기타 조혈 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 인터페론 수용체는 IFNCαR, IFNβR, 및 IFNλR 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Ig 및 이의 수용체는 IgE, FcγRI, 및 FcγRII 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 종양 항원은 her2-neu, 뮤신, CEA 및 엔도시알린으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 알레르겐은 집먼지 진드기 항원, lol p1 (grass) 항원, 및 우루시올로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 바이러스 폴리펩티드는 CMV 당단백질 B, H, 및 gCIII, HIV-1 외피 당단백질, RSV 외피 당단백질, HSV 외피 당단백질, HPV 외피 당단백질, Hepatitis 패밀리 표면 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 독소는 슈도모나스 (pseudomonas) 내독소 및 오스테오폰틴 (osteopontin)/우로폰틴 (uropontin), 뱀독, 거미독, 및 벌독 고노톡신으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 혈액 인자는 보체 C3b, 보체 C4a, 보체 C4b-9, Rh 인자, 피브리노겐, 피브린, 및 미엘린 연관 성장 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 효소는 콜레스테롤 에스테르 전이 폴리펩티드, 멤브레인 결합된 매트릭스 메탈로프로테아제, 및 글루탐산 디카르복실라아제 (GAD) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체이 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 요망될 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적합한 개질을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 개질에는 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 그 내로의 삽입 및/또는 그의 치환이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 구성물에 도착하도록 제조될 수 있고, 단, 최종 구성물은 원하는 특징, 예를 들어, 항원-결합을 보유한다.
a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이생성을 위한 관심의 부위에는 HVR 및 FR 이 포함된다. 아미노산 치환은 관심의 항체 내로 도입되고 생성물을 요망되는 활성, 예를 들어, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC 에 대해 스크리닝할 수 있다.
표 2
Figure 112016075559978-pct00005

아미노산은 공통의 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 일원을 또다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다.
하나의 유형의 치환 변이체는 모체 항체 (예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체) 의 하나 이상의 과가변 영역 잔기의 치환을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구에 대해 선택된 산출되는 변이체(들) 은 모체 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성) 에 개질 (예를 들어, 개선) 이 있을 것이고/거나 실질적으로 보유된 모체 항체의 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체이며, 이것은 예를 들어, 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙 기술, 예컨대 본원에 기재된 것들을 사용하여 통상적으로 생성될 수 있다. 간략하게는, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에 전시되고, 특정 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성) 에 대해 스크리닝된다.
예를 들어, 항체 친화성을 개선하기 위해 HVR 에서 변경 (예를 들어, 치환) 이 일어날 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟 (hotspot)" 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기 (예를 들어, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) (산출되는 변이체 VH 또는 VL 은 결합 친화성에 대해 시험됨) 내에 일어날 수 있다. 2 차 라이브러리를 구축하고 재선택함에 의한 친화성 성숙은 예를 들어, 문헌 Hoogenboom, H.R. et al.. Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 에 기재되어 있다. 친화성 성숙의 일부 구현예에서, 다양성을 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이생성) 에 의해 성숙에 대해 선택된 가변 유전자 내로 도입한다. 이후 2 차 라이브러리가 제작된다. 라이브러리는 이후 요망되는 친화성을 가진 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하기 위한 또다른 방법은 여러 개의 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6 개의 잔기) 가 랜덤화되는 HVR-지정 접근법을 수반한다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는 예를 들어, 알라닌 스캔 돌연변이생성 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 확인될 수 있다. 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 이 특히 종종 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 그러한 변형이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는다면 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공되는 바와 같은 보존적 치환) 이 HVR 에서 일어날 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR 의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR 은 비변형되거나, 1 개, 2 개 또는 3 개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이생성에 표적할 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 문헌 Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085 에 기재되는 바와 같이 "알라닌 스캔 돌연변이생성" 이라고 불린다. 본 방법에서, 표적 잔기의 잔기 또는 그룹 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu) 을 확인하고 중성 또는 음전하 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌) 에 의해 대체되어 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 결정한다. 추가의 치환이 초기 치환에 대한 기능적인 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉 점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조가 사용될 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환에 대한 후보자로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 요망되는 특성을 함유하는 지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입에는 하나의 잔기에서 100 개 또는 그 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 까지의 길이의 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합 뿐 아니라, 단일 또는 복합 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 가진 항체가 포함된다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들어, ADEPT 의 경우) 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단의 융합이 포함된다.
b) 글리코실화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 본원에 보고된 콘쥬게이트에 포함되는 항체는 항체가 글리코실화되는 범위를 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 제작되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc-영역을 포함하는 경우, 그곳에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성되는 고유의 항체는 전형적으로 Fc-영역의 CH2 도메인의 Asn297 에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분지형, 2-안테나 올리고당을 포함한다. 예를 들어, 문헌 Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32 를 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산 뿐 아니라, 2-안테나 올리고당 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc 에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 내의 올리고당의 개질은 특정의 개선된 특성을 가진 항체 변이체를 제작하기 위해 일어날 수 있다.
하나의 구현예에서, Fc-영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체 내의 푸코오스의 양은 1 % 내지 80 %, 1 % 내지 65 %, 5 % 내지 65 % 또는 20 % 내지 40 % 일 수 있다. 푸코오스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546 에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 측정된 바와 같은 Asn 297 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노오스 구조) 에 부착된 모든 당구조의 합에 대해, Asn297 에서 당 사슬 내의 푸코오스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297 은 Fc-영역 내 약 위치 297 (Fc-영역 잔기의 EU 번호지정) 에 위치한 아스파라긴 잔기를 말하나, 항체 내의 미미한 서열 변화로 인해 Asn297 은 또한 위치 297 의 약 ± 3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉, 위치 294 와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621 을 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코오스-결핍" 항체 변이체와 관련된 공개문헌의 예에는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622 이 포함된다. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스페라아제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y.et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; 및 WO 2003/085107 참조) 가 포함된다.
항체 변이체는, 예를 들어, 항체의 Fc-영역에 부착된 2-안테나 올리고당이 GlcNAc 에 의해 이등분되는 이등분된 올리고당과 함께 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878; US 6,602,684; 및 US 2005/0123546 에 기재된다. Fc-영역에 부착된 올리고당 내에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 가진 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764 에 기재된다.
c) Fc-영역 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 개질이 본원에 제공된 항체의 Fc-영역 내로 도입되어, 이에 의해 Fc-영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc-영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 개질 (예를 들어, 치환) 을 포함하는 인간 Fc-영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-영역) 을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 일부의 효과기 작용을 가지나 모든 효과기 작용을 갖지는 않은 항체 변이체를 고려하고, 이것은 상기 항체 변이체를 생체 내 항체의 반감기가 중요하지만 특정한 효과기 작용 (예컨대 보체 및 ADCC) 이 불필요하거나 유해한 적용을 위한 바람직한 후보자로 만든다. 시험관 내 및/또는 생체 내 세포독성 어세이가 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 어세이는 항체에 FcγR 결합이 결핍되나 (따라서 아마도 ADCC 활성이 결핍), FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 확보하기 위해 수행될 수 있다. ADCC 를 매개하기 위한 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492 의 464 페이지에 있는 표 3 에 요약된다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관 내 어세이의 비-제한적인 예는 US 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; 및 Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502 참조); US 특허 번호 5,821,337 (참조, Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361) 에 기재된다. 대안적으로는, 비-방사능 어세이 방법이 사용될 수 있다 (참조, 예를 들어, 유세포분석을 위한 ACTI™ 비-방사능 세포독성 어세이 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96® 비-방사능 세포독성 어세이 (Promega, Madison, WI). 이러한 어세이에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (Natural Killer: NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심의 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어, 문헌 Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656 에 기재된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. C1q 결합 어세이는 또한 항체가 C1q 에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여된 것을 확인하기 위해 실시될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402 에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 어세이가 수행될 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743 참조). FcRn 결합 및 생체 내 소거/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769 참조).
감소된 효과기 작용을 가진 항체에는 Fc-영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 가진 것이 포함된다 (US 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc-영역 변이체에는 잔기 265 및 297 의 알라닌으로의 치환을 가진 소위 "DANA" Fc-영역 돌연변이체를 포함하는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2 개 이상에서의 치환을 가진 Fc 돌연변이가 포함된다 (US 특허 번호 7,332,581).
FcRs 에 대한 결합이 개선된 또는 소실된 특정 항체 변이체가 기재된다 (예를 들어, US 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 참조).
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC 를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc-영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 번호지정) 에서의 치환을 가진 Fc-영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, US 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 소실된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 을 산출하는, Fc-영역 내의 변경을 일으킨다.
태아에 대한 모체 IgG 의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 증가된 반감기 및 개선된 결합을 가진 항체 (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, 및 Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) 는 US 2005/0014934 에 기재된다. 상기 항체는 Fc-영역의 FcRn 에 대한 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 가진 Fc-영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체에는 Fc-영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어, Fc-영역 잔기 434 의 치환을 가진 것이 포함된다 (US 특허 번호 7,371,826).
또한 Fc-영역 변이체의 다른 예를 다루는 문헌 Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351 을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 구현예에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, "thioMAb" 를 제작하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기가 이에 의해 항체의 접근가능한 부위에 위치하고, 본원에 추가로 기재되는 바와 같이 면역콘쥬게이트를 제작하기 위해, 항체를 다른 부분, 예컨대 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 콘쥬게이션하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상은 시스테인: 경쇄의 V205 (Kabat 번호지정); 중쇄의 A118 (EU 번호지정); 및 중쇄 Fc-영역의 S400 (EU 번호지정) 으로 치환될 수 있다. 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, US 특허 번호 7,521,541 에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 쉽게 이용가능한 부가적인 비-단백질성 부분을 함유하도록 추가로 개질될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 부분은 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예에는 제한 없이, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공-중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물이 포함된다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드가 물 중의 이의 안정성으로 인해 제조에 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량의 것일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 달라질 수 있고, 1 개 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 제한 없이, 개선하고자 하는 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건 하에서 요법에 사용될지의 여부, 등을 포함하여 고려해서 결정될 수 있다.
또다른 구현예에서, 방사능에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비-단백질성 부분의 콘쥬게이트가 제공된다. 하나의 구현예에서, 비-단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다 (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). 방사능은 임의의 파장의 것일 수 있고, 제한 없이, 보통 세포에 유해를 가하지 않지만, 비-단백질성 부분을 항체-비-단백질성 부분과 근접한 세포가 치사되는 온도로 가열하는 파장이 포함된다.
페이로드
용어 "페이로드" 는 그 활성이 세포 (내) 에 전달되는 및/또는 세포에 위치화되는 것이 요망되는 임의의 분자 또는 분자의 조합을 나타낸다. 페이로드에는 제한 없이, 표지, 폴리펩티드 독소 (예를 들어, 슈도모나스 외독소 (Pseudomonas exotoxin), 리신, 아브린, 디프테리아 (디프테리아) 독소 등), 효소, 성장 인자, 전사 인자, 약물, 방사능뉴클라이드, 리간드, 항체, 리포좀, 나노입자, 바이러스 입자, 사이토카인 등이 포함된다.
합텐화된 화합물
본원에 보고되는 합텐화된 폴리펩티드는 폴리펩티드가 그 자체가 분자 중 하나가 아니라면, 치료제 (약물), 폴리펩티드 독소 (예를 들어, 독소 예컨대 독소루비신 또는 백일해 독소), 형광단, 예컨대 형광 염료 예컨대 플루오레세인 또는 로다민, 이미지화 또는 방사능치료용 금속을 위한 킬레이트제, 펩티딜 또는 비-펩티딜 표지 또는 검출 태그, 또는 소거율-조절제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜의 다양한 이성질체, 제 3 성분에 결합하는 펩티드, 또는 또다른 탄수화물 또는 친유성제에 추가로 콘쥬게이션될 수 있다. 콘쥬게이션은 직접적으로 또는 개입 링커를 통해 일어날 수 있다.
a) 치료제 (약물)
합텐-약물 콘쥬게이트 (ADC, 합텐화된 약물) 의 약물 부분 (D) 는 세포독성 또는 세포분열억제 효과를 갖는 임의의 화합물, 부분 또는 기일 수 있다. 약물 부분에는 (i) 미소관 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 DNA 삽입제로서 기능할 수 있는 화학치료제; (ii) 효소적으로 작용할 수 있는 폴리펩티드 독소; 및 (iii) 방사성동위원소가 포함된다.
예시적인 약물 부분에는 제한 없이 마이탄시노이드, 오우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065, 칼리케아미신 및 기타 엔다이인 (enediyne) 항생제, 탁산, 안트라사이클린, 및 이의 입체이성질체, 등배전자체, 유사체 또는 변이체가 포함된다.
폴리펩티드 독소에는 디프테리아-A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래의), 리신 A 사슬 (Vitetta et al (1987) Science, 238:1098), 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP -5), 여주 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 마이토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센 (WO 93/21232) 이 포함된다.
치료적 방사성동위원소에는 32P, 33P, 90Y, 125I, 131I, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212B, 212Pb, 및 Lu 의 방사능활성 동위원소가 포함된다.
방사성동위원소 또는 기타 표지가 공지된 방식으로 도입될 수 있다 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989). 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 복합체에 대한 방사능뉴클라이드의 콘쥬게이션에 대한 예시적 킬레이트제이다 (WO 94/11026).
b) 표지
합텐화된 폴리펩티드는 합텐화된 표지를 추가로 포함할 수 있다. 합텐에 공유 부착될 수 있는 임의의 표지 부분이 사용될 수 있다 (예를 들어, Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Lundblad R. L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, Fla. 참고). 표지는 (i) 검출가능한 신호를 제공하는; (ii) 예를 들어, FRET (형광 공명 에너지 전달) 을 제공하기 위해 제 1 또는 제 2 표지에 의해 제공되는 검출가능한 신호를 변형하도록 제 2 표지와 상호작용하는; (iii) 전하, 소수성, 형상, 또는 다른 물리적 파라미터에 의해, 이동성, 예를 들어, 전기영동 이동성 또는 세포-투과성에 영향을 주는, 또는 (iv) 예를 들어, 이온 복합체화를 조정하기 위한 포획 부분을 제공하는 작용을 할 수 있다.
본원에 보고된 합텐화된 폴리펩티드 및 표지를 포함하는 콘쥬게이트는 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 예를 들어, 관심의 항원의 발현을 검출하기 위해, 진단 어세이에서 유용할 수 있다. 진단 적용을 위해, 제 1 결합 특이성이 표적에 결합하고 제 2 결합 특이성이 합텐화된 표지에 결합하는 이특이적 항체가 사용될 것이다. 합텐화된 폴리펩티드는 전형적으로 검출가능한 부분으로 표지될 것이다. 하기 카테고리로 일반적으로 그룹화될 수 있는 수 많은 표지가 이용가능하다:
(a) 방사성동위원소 (방사능뉴클라이드), 예컨대 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Gn, 86Y, 89Zr, 99TC, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 131Bi. 방사성동위원소 표지된 콘쥬게이트는 수용체 표적화 이미지화 실험에서 유용하다. 합텐화된 폴리펩티드는 문헌 [Current Protocols in Immunology, (1991) Volumes 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs] 에 기재된 기법을 사용하는 방사성동위원소 금속에 결합, 이를 킬레이트 또는 다르게는 복합체를 형성하는 리간드 시약으로 추가로 표지될 수 있다. 금속 이온과 복합체를 형성할 수 있는 킬레이트 리간드에는 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA (Macrocyclics, Dallas, Tex.) 가 포함된다. 방사능뉴클라이드는 본원에 보고된 복합체와 복합체화를 통해 표적될 수 있다 (Wu et al, Nature Biotechnology 23(9) (2005) 1137-1146). 방사능뉴클라이드 표지된 복합체로의 수용체 표적 이미지화는 종양 조직에서 복합체 또는 상응하는 치료 항체의 진행성 축적의 검출 및 정량화에 의한 경로 활성화의 마커를 제공할 수 있다 (Albert et al (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210).
이미지화 실험을 위한 표지로서 적합한 금속-킬레이트 복합체 (US 2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,456; Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares et al, Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65; Meares et al, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard et al, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350; Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera et al, J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg et al, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee et al, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer et al, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137; DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula et al J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20).
(b) 형광 표지 예컨대 희토류 킬레이트 (우로퓸 킬레이트 ), 플루오레세인 유형 - FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시 플루오레세인 포함; 로다민 유형 - TAMRA 포함; 단실; 리사민 (Lissamine); 시아닌; 파이코에리트린; 텍사스 레드 (Texas Red); 및 이의 유사체. 형광 표지는 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, supra] 에 기재된 기법을 사용하여 폴리펩티드에 콘쥬게이션될 수 있다. 형광 염료 및 형광 표지 시약에는 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA) and Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.) 로부터 시판되는 것들이 포함된다.
검출 표지 예컨대 형광 염료 및 화학발광 염료 (Briggs et al "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058) 는 검출가능한 신호를 제공하며, 일반적으로, 특히 하기 특성을 가진 표지화에 대해 이용가능하다: (i) 표지된 콘쥬게이트는 낮은 백그라운드를 갖는 매우 높은 신호를 생성하여 소량의 콘쥬게이트가 무-세포 및 세포-기반 어세이 둘다에서 민감하게 검출될 수 있도록 해야만 하고; (ii) 표지된 콘쥬게이트는 광안정하여 형광 신호가 상당한 광 퇴색 없이 관찰, 모니터링 및 기록될 수 있어야만 한다. 멤브레인 또는 세포 표면, 특히 살아있는 세포에 대한 표지된 콘쥬게이트의 세포 표면 결합을 수반하는 적용의 경우, 표지는 (iii) 효과적인 콘쥬게이트 농도 및 검출 민감성을 달성하도록 양호한 수용성을 가져여만 하고, (iv) 살아있는 세포에 무독성이어서, 세포의 정상 대사 과정을 방해하거나 조기 세포 사멸을 야기하지 않도록 한다.
(c) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하거나 기재된다 (예를 들어, US 4,275,149 참고). 효소는 일반적으로 다양한 기법을 사용하여 측정될 수 있는 색소성 기질의 화학적 변화를 촉매화한다. 예를 들어, 효소는 분광광도로 측정될 수 있는, 기질 내의 색상 변화를 촉매화할 수 있다. 대안적으로는, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경할 수 있다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기되어지고 이후 측정될 수 있는 (예를 들어 화학발광측정기 (chemiluminometer) 를 사용하여) 광을 방출할 수 있거나 또는 형광 수용기에 대해 에너지를 기여한다. 효소 표지의 예에는 루시퍼라아제 (예를 들어, 초파리 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제; US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레에이트 데히드로게나아제, 우레아제, 퍼옥시다아제 예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼리 포스파타아제 (AP), (3-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당 옥시다아제 (예를 들어, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제), 헤테로시클릭 옥시다아제 (예컨대 유리카아제 및 잔틴 옥시다아제), 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등이 포함된다. 효소를 폴리펩티드에 컨쥬게이션하기 위한 기법은 문헌 O'Sullivan et al "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzym. (ed. by J. Langone & IT Van Vunakis), Academic Press, New York, 73 (1981) 147-166 에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예에는 (US 4,275,149; US 4,318,980) 예를 들어, 하기가 포함된다:
(i) 기질로서 수소 퍼옥시다아제를 갖는 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP), 수소 퍼옥시다아제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 히드로클로라이드 (TMB)) 를 산화시킨다;
(ii) 색소 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 갖는 알칼리 포스파타아제 (AP); 및
(iii) (3-D-갈락토시다아제 (색소 기질 (예를 들어, p-니트로 페닐-(3-D-갈락토시다아제) 또는 형광원 기질 4-메틸움벨리페릴-(3-D-갈락토시다아제를 갖는 (3-D-Gal)).
본원에 보고된 표지된 합텐화된 폴리펩티드는 임의의 공지된 어세이 방법, 예컨대 ELISA, 경쟁적 결합 어세이, 직접 및 간접 샌드위치 어세이, 및 면역침전 어세이에서 사용될 수 있다 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (1987) pp. 147-158, CRC Press, Inc.).
본원에 보고된 표지된 합텐화된 폴리펩티드는 생물의학적 및 분자적 이미지화의 다양한 방법 및 기법 예컨대: (i) MRI (자기 공명 이미지화); (ii) MicroCT (컴퓨터 단층촬영); (iii) SPECT (단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영); (iv) PET (양전자 방출 단층촬영) Tinianow, J. et al Nuclear Medicine and Biology, 37(3) (2010) 289-297; Chen et al, Bioconjugate Chem. 15 (2004) 41-49; US 2010/0111856 (v) 생물발광; (vi) 형광; 및 (vii) 초음파에 의해, 이미지화 바이오마커 및 프로브로서 유용하다. 면역신티그래피 (Immunoscintigraphy) 는 방사능활성 성분으로 표지된 콘쥬게이트가 동물 또는 인간 환자에 투여되고, 콘쥬게이트가 국부화되는 신체 내 부위의 사진을 찍는 이미지화 절차이다 (US 6,528,624). 이미지화 바이오마커는 치료적 개입에 대한 정상 생물학적 과정, 병원성 과정, 또는 약물학적 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가될 수 있다. 바이오마커는 여러 유형의 것일 수 있다: 유형 0 마커는 질환의 천연 이력 마커이고, 공지된 임상적 지표, 예를 들어, 류머티스성 관절염에서의 활막 염증의 MRI 측정과 수평적으로 연관된다; 유형 I 마커는 작용 메커니즘 (심지어 상기 메커니즘이 임상적 결과와 연관되지 않을 수 있음에도 불구하고) 에 따른 개입의 영향을 포착하고; 유형 II 마커는 CT 에 의한 류마티스 관절염에 있어서 측정된 골 침식과 같은, 바이오마커가 표적화된 반응을 "인증" 하기 위한 임상적 이득을 예측하는 것에서의 변화 또는 그로부터의 신호인 대리 종말점으로서 기능한다. 따라서 이미지화 바이오마커는 (i) 표적 단백질의 발현, (ii) 표적 단백질에 대한 치료제 결합 (즉, 선택성), 및 (iii) 소거율 및 반감기 약동학적 데이터에 대한 약학동적 (PD) 치료 정보를 제공할 수 있다. 실험실-기반 바이오마커에 대한 생체내 이미지화 바이오마커의 이점은 하기를 포함한다: 비-침습적 치료, 정량가능한, 전신 평가, 반복적 투약 및 평가, 즉 다수 시점, 및 전임상 결과 (소형 동물) 로부터 임상 결과 (인간) 로 잠재적으로 이동가능한 효과. 일부 적용을 위해, 생물이미지는 전임상 연구에서의 동물 실험의 수를 대신하거나 최소화한다.
펩티드 표지 방법은 널리 공지되어있다. Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGruyter, Berlin and New York; and Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); DeLeon-Rodriguez et al, Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155; Lewis et al, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324; Li et al, Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115; Mier et al Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237 을 참고한다.
항체 콘쥬게이트
본원에 보고한 바와 같은 콘쥬게이트 중의 항체는, 그 자체가 분자 중 하나가 아니라면, 치료제 (약물), 폴리펩티드 독소 (예를 들어, 독소 예컨대 독소루비신 또는 백일해 독소), 형광단, 예컨대 형광 염료 예컨대 플루오레세인 또는 로다민, 이미지화 또는 방사능치료용 금속을 위한 킬레이트제, 펩티딜 또는 비-펩티딜 표지 또는 검출 태그, 또는 소거율-조절제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜의 다양한 이성질체, 제 3 성분에 결합하는 펩티드, 또는 또다른 탄수화물 또는 친유성제에 추가로 콘쥬게이션될 수 있다.
면역콘쥬게이트
본 발명은 또한 본원에 보고한 바와 같은 항체, 또는 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소에 콘쥬게이션된 본원에 보고한 바와 같은 콘쥬게이트를 제공한다.
하나의 구현예에서, 면역콘쥬게이트는 항체가 하나 이상의 약물, 예컨대 비제한적으로, 마이탄시노이드 (US　5,208,020, US　5,416,064 및 EP 0 425 235 B1 참고); 오우리스타틴 예컨대 모노메틸 오우리스타틴 약물 부분 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (US　5,635,483, US　5,780,588 및 US　7,498,298 참고); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 이의 유도체 (US 5,712,374, US 5,714,586, US 5,739,116, US 5,767,285, US 5,770,701, US 5,770,710, US 5,773,001 및 US 5,877,296; Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; and Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928 참고); 안트라사이클린 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참고); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 타세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065 에 콘쥬게이션되는 항체-약물 콘쥬게이트 (ADC) 이다.
또다른 구현예에서, 면역콘쥬게이트는, 디프테리아-A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래의), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 마이토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센이 포함되나 이에 제한되지 않는, 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편에 콘쥬게이션된 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또다른 구현예에서, 면역콘쥬게이트는 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 방사성 원자에 콘쥬게이션되어 방사성콘쥬게이트를 형성하는 본원에 보고한 바와 같은 복합체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성콘쥬게이트의 생성에 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성콘쥬게이트가 검출에 사용되는 경우, 이는 신티그래프 연구용 방사성 원자, 예를 들어 TC99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 이미지화 (또한 자기 공명 이미지화, MRI 로도 공지됨) 용 스핀 표지 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 콘쥬게이트는 다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로2,4-디니트로벤젠) 을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 [Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104] 에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 항체에 대한 방사성뉴클레오티드의 콘쥬게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026 을 참고한다. 링커는 세포에서의 세포독성 약물 방출을 촉진시키는 "절단가능 링커" 일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 광 불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; 미국 특허 번호 5,208,020) 를 사용할 수 있다.
본원의 면역콘쥬게이트 또는 ADC 가 명백히 고려되나, 비제한적으로 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (시판됨 (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A 사제)) 를 포함하는 가교-링커 시약으로 제조된 콘쥬게이트에 제한되지는 않는다.
합텐화된 폴리펩티드 독소
본원에 보고된 콘쥬게이트 중의 합텐은 하나의 구현예에서 세포독성제, 예컨대 예를 들어, 독소 예컨대 독소루비신 또는 백일해 독소에 콘쥬게이션된다. 이러한 콘쥬게이트는 합텐화된 폴리펩티드 독소로서 명시된다. 콘쥬게이션은 직접적으로 또는 개입 링커를 통해 일어날 수 있다.
폴리펩티드 독소는 하나의 구현예에서 효소적으로 기능하는 단백질 독소이다. 단백질 독소에는 디프테리아-A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래의), 리신 A 사슬 (Vitetta et al (1987) Science, 238:1098), 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP -5), 여주 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 마이토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센 (WO 93/21232) 이 포함된다.
합텐 및 폴리펩티드 독소의 콘쥬게이트는 다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로2,4-디니트로벤젠) 을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 [Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104] 에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 항체에 대한 방사성뉴클레오티드의 콘쥬게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026 을 참고한다. 링커는 세포에서의 세포독성 약물 방출을 촉진시키는 "절단가능 링커" 일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 광 불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; 미국 특허 번호 5,208,020) 를 사용할 수 있다.
하나의 구현예에서 합텐화된 폴리펩티드 독소는, 비제한적으로 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (시판됨 (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A 사제)) 를 포함하는 가교-링커 시약을 사용하여 제조된다.
링커
용어 "링커" 는 합텐을 폴리펩티드에 콘쥬게이트 (연결) 시키는데 사용될 수 있는 이작용성 또는 다작용성 잔기를 나타낸다. 합텐화된 폴리펩티드는 약물, 폴리펩티드 및 합텐에 대한 결합을 위해 반응성 작용기를 갖는 링커를 사용하여 편리하게 제조될 수 있다.
하나의 구현예에서, 링커는 폴리펩티드 상에 존재하는 친핵성 기에 대해 반응성인 친전자성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 시스테인 티올기는 예를 들어 링커 상의 친전자성 기와 반응성이며 링커에 대해 공유 결합을 형성한다. 유용한 친전자성 기는 비제한적으로, 또 다른 티올, 말레이미드 및 할로아세트아미드 기를 포함한다 (예를 들어 Klussman et al, Bioconjugate Chemistry 15(4) (2004) 765-773 의 p. 766 의 콘쥬게이션 방법 참고).
티올-반응성 작용기의 예는 비제한적으로, 티올, 말레이미드, 알파-할로아세틸, 활성화 에스테르 예컨대 숙신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함한다.
링커는 합텐을 폴리펩티드에 연결시키는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 아미노산 잔기는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드, 데카펩티드, 운데카펩티드 또는 도데카펩티드 단위를 형성할 수 있다. 아미노산 잔기는 자연적으로 발생하는 것들 뿐 아니라 비-자연 발생적 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린 또는 β-아미노산, 예컨대 β-알라닌, 또는 ω-아미노산 예컨대 4-아미노-부티르산을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 링커는 합텐 상에 존재하는 친전자성 기와 반응성인 친핵성 기를 갖는 반응성 작용기를 갖는다. 유용한 친전자성 기는 비제한적으로, 알데하이드 및 케톤 카르보닐기를 포함한다. 링커의 친핵성 기의 헤테로원자는 합텐 또는 폴리펩티드 상의 친핵성 기와 반응할 수 있으며 합텐 또는 폴리펩티드와 공유 결합을 형성할 수 있다. 유용한 링커 상 친핵성 기는 비제한적으로, 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드를 포함한다. 합텐 상 친전자성 기는 링커에 대한 부착을 위한 편리한 부위를 제공한다.
통상, 펩티드-유형 링커는 둘 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성하여 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에서 널리 공지된 액체상 합성 방법에 따라 제조될 수 있다 (E. Schroder and K. Lubke "The Peptides", volume 1 (1965) 76-136),
또 다른 구현예에서, 링커는 조정된 용해도 또는 반응성을 갖는 기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 하전된 치환기 예컨대 술포네이트 (SO3 -) 또는 암모늄 또는 중합체 예컨대 PEG 는 시약의 수용해도를 증가시키고 링커 시약의 합텐 또는 폴리펩티드와의 커플링 반응을 촉진시키거나, 이용한 합성 경로에 따른 커플링 반응을 촉진시킬 수 있다.
본원에 보고한 바와 같은 합텐 또는 폴리펩티드를 포함하는 콘쥬게이트는 하기 링커 시약: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰) 벤조에이트), 및 예컨대 하기 비스-말레이미드 시약: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)3, 및 BM(PEO)4 (이들은 Pierce Biotechnology, Inc. 사에서 시판됨) 으로 제조된 복합체를 비제한적으로, 명백히 고려한다. 비스-말레이미드 시약은 예를 들어 티올기를 티올-함유 약물 모이어티, 표지 또는 링커 중간체에, 순차적 또는 동시적 방식으로 부착시킨다. 예를 들어 티올기와 반응성인 말레이미드 외의 다른 관능기는 요오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디술피드, 피리딜 디술피드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함한다.
예시적 링커는 말레이미드 스트레쳐 (Stretcher) 및 파라-아미노벤질 카르바모일 (PAB) 자체-희생성 (self-immolative) 스페이서를 갖는 발린-시트룰린 (val-cit 또는 vc) 디펩티드 링커 시약, 및 말레이미드 스트레쳐 단위 및 p-아미노 벤질 자체-희생성 스페이서를 갖는 phe-lys(Mtr) 디펩티드 링커 시약을 포함한다.
시스테인 티올기는 친핵성이며 링커 시약 및 합텐화된 화합물, 예컨대: (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기; 및 (iv) 디술피드, 예컨대 피리딜 디술피드 상의 친전자성 기와, 술피드 교환을 통해 공유 결합이 형성되도록 반응할 수 있다. 합텐화된 화합물 상의 친핵성 기는 비제한적으로: 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 링커 잔기 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유 결합이 형성되도록 반응할 수 있는 아릴히드라지드기를 포함한다.
III. 핵산
본원에 보고되는 항체 또는 본원에 보고되는 콘쥬게이트에 포함되는 바와 같은 항체의 아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 DNA 는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은 비제한적으로, 위치-지정 (또는 올리고뉴클레오티드-매개) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 폴리펩티드를 인코딩하는 초기 제조된 DNA 의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함한다. 재조합 항체의 변이체는 또한 제한 단편 조작 또는 합성 올리고뉴클레오티드로의 오버랩 확장 PCR 에 의해 구성될 수 있다. 돌연변이유발 프라이머는 시스테인 코돈 대체물(들) 을 인코딩한다. 표준 돌연변이유발 기술을 사용하여 이러한 변형된 조작 항체를 인코딩하는 DNA 를 생성시킬 수 있다. 일반적 안내를 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 및 Ausubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993 에서 발견할 수 있다.
IV. 발현 및 정제
폴리펩티드 및 항체는 예를 들어, US 4,816,567 에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재되는 폴리펩티드 및 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄) 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다.
하나의 구현예에서, 이러한 헥산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 추가의 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 구현예에서, 숙주 세포는: (1) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이것으로 형질전환되었다). 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 하나의 구현예에서, 상기 제공된 항체를 인코딩하는 헥산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 보고된 항체의 제조 방법이 제공된다.
본원에 보고된 항체의 재조합 제조를 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하고 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포에는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들어, 항체는 특히, 글리코실화 및 Fc 효과기 작용이 필요하지 않은 경우에 박테리아에서 제조될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해서는, 예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523 을 참조한다 (또한 E. coli. 에서의 항체 단편의 발현을 설명하는 문헌 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 참조). 발현 후, 항체는 가용성 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물외에, 사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 그의 글리코실화 경로가 "인간화된" 진균 및 효모 균주를 포함하여 항체-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이고, 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 가진 항체의 생성을 산출한다. 문헌 Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 를 참조한다.
글리코실화 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있는 수많은 배큘로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, US 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 제조하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 설명함) 를 참조한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 조정된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7); 인간 배아 신장 주 (예를 들어, 문헌 Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에 기재된 바와 같은 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어, 문헌 Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주에는 DHFR- CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 가 포함된다. 항체 제조에 적합한 특정의 포유류 숙주 세포주의 리뷰를 위해서는, 예를 들어, 문헌 Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268 을 참조한다.
V. 약학 제형
본원에 보고된 콘쥬게이트를 포함하는 약학 제형은 원하는 순도를 갖는 이러한 콘쥬게이트를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)) 와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 일반적으로 무독성이고, 제한 없이: 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이 포함된다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체에는 추가로 사이질 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 이 포함된다. rhuPH20 을 포함하여, 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP 는 하나 이상의 부가적인 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 US 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형에는 US 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것에 포함되고, 마지막에 기재된 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료하고자 하는 특정 징후에 필수적인 1 개 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로에게 부작용을 주지 않는 상보적 활성을 가진 것들을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도되는 목적에 대해 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980) 에 기재된다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예에는 항체 또는 콘쥬게이트를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 형상을 가진 제품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체 내 투여에 사용하고자 하는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
VI. 치료 방법 및 조성물
본원에 보고된 콘쥬게이트 중 임의의 것이 치료 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, 의약으로서 사용하기 위한 본원에 보고되는 콘쥬게이트가 제공된다. 추가의 양상에서, 질환의 치료에서 사용하기 위한 본원에 보고되는 콘쥬게이트가 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 본원에 보고되는 콘쥬게이트가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 개인에게 유효량의 본원에 보고되는 콘쥬게이트를 투여하는 것을 포함하는, 개인의 치료 방법에서 사용하기 위한 본원에 보고되는 콘쥬게이트를 제공한다. 하나의 이러한 구현예에서, 본 방법은 개인에게, 예를 들어, 하기에 기재되는 바와 같은 유효량의 하나 이상의 부가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "개인" 은 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 의약의 생산 또는 제조에서의 본원에 보고된 콘쥬게이트의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 의약은 질환의 치료를 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 의약은 질환을 가진 개인에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 추가로 개인에게 유효량의 하나 이상의 부가적인 치료제 (예를 들어, 하기 기재되는 바와 같은) 를 투여하는 것을 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "개인" 은 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 질환의 치료 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 방법은 그러한 질환을 가진 개인에게 유효량의 본원에 보고되는 콘쥬게이트를 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 추가로 개인에게 유효량의 하나 이상의 부가적인 치료제 (예를 들어, 하기 기재되는 바와 같은) 를 투여하는 것을 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "개인" 은 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 예를 들어, 상기 치료 방법 중 임의의 것에 사용하기 위한, 본원에 보고된는 콘쥬게이트 중 임의의 것을 포함하는 약학 제형을 제공한다. 하나의 구현예에서, 약학 제형은 본원에 보고되는 콘쥬게이트 중 임의의 것 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또다른 구현예에서, 약학 제형은 본원에 보고되는 콘쥬게이트 중 임의의 것 및 예를 들어, 하기에 기재되는 바와 같은 하나 이상의 부가적인 치료제를 포함한다.
본원에 보고되는 콘쥬게이트는 요법에서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 보고되는 콘쥬게이트는 하나 이상의 부가적인 치료제와 공동-투여될 수 있다.
상기 명시되는 이러한 조합 요법은 조합 투여 (2 가지 이상의 치료제가 동일 또는 분리 제형에 포함됨), 및 분리 투여를 포함하며, 분리 투여의 경우, 본 발명의 항체의 투여는 부가적인 치료제 및/또는 아쥬반트의 투여 전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다. 본원에 보고되는 콘쥬게이트는 또한 방사 요법과 조합으로 사용될 수 있다.
본원에 보고되는 콘쥬게이트 (및 임의의 부가적인 치료제) 는 비경구, 폐내, 및 비강내 및, 국부 치료가 요망되는 경우, 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 부분적으로, 투여가 간략한지 또는 만성인지에 따라, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주입과 같은 주입에 의해 임의의 적합한 경로에 의해 투약될 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 복합 투여, 볼루스 (bolus) 투여, 및 펄스 투입을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
본원에 보고되는 콘쥬게이트는 양호한 의료적 실시와 일관되는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 본 문맥에서 고려 인자에는 치료하고자 하는 특정 장애, 치료하고자 하는 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료인에게 공지된 다른 인자가 포함된다. 콘쥬게이트는 논의의 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제일 필요는 없으나, 임의로 제형화된다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 콘쥬게이트의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 인자에 따라 다르다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투약량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투약량의 약 1 내지 99 % 로, 또는 적합한 것으로 경험적으로/임상적으로 결정된 임의의 투약량 또는 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원에 보고된 콘쥬게이트의 적합한 투약량 (단독으로 또는 하나 이상의 기타 부가적인 치료제와 조합으로 사용되는 경우) 은 치료하고자 하는 질환의 유형, 콘쥬게이트의 유형, 질환의 심각도 및 경과, 콘쥬게이트가 예방적 또는 치료적 목적에 따라 투여되는 지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상적 이력 및 콘쥬게이트에 대한 반응, 및 참여하는 의사의 재량에 따라 다를 것이다. 콘쥬게이트는 1 회로 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 심각도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.5 mg/kg - 10 mg/kg) 의 콘쥬게이트가, 예를 들어, 하나 이상의 개별적 투여에 의한 것인지, 또는 연속 투입에 의한 것인지에 따라, 환자에 대한 투여를 위한 초기 후보 투약량일 수 있다. 하나의 전형적인 일일 투약량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 조건에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 콘쥬게이트의 하나의 예시적인 투약량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 의 하나 이상의 투약량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투약량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 매 3 주 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어, 약 6 투약량의 콘쥬게이트를 수여받는 식으로) 투여될 수 있다. 초기의 높은 적재 투약량 후, 하나 이상의 적은 투약량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약 섭생이 유용할 수 있다. 상기 요법의 진행은 통상의 기술 및 어세이에 의해 쉽게 모니터링된다.
상기 제형 또는 치료 방법 중 임의의 것은 본원에 보고되는 항체 또는 콘쥬게이트 대신에 또는 이것에 더하여 본원의 면역콘쥬게이트를 사용하여 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
VII. 제조품
본 발명의 또다른 양상에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 재료를 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기 및 용기와 연합되거나 용기 위에 있는 라벨 또는 패키지를 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 제형 그 자체 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 유효한 또다른 제형과 조합된 제형을 담고 있고 멸균 접근 포트 (예를 들어 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 가진 바이알일 수 있음) 를 가질 수 있다. 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본원에 보고되는 항체 또는 복합체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용되는 것을 나타낸다. 게다가, 제조품은 (a) 내부에 함유된 조성물이 있는 제 1 용기로서, 상기 조성물은 본원에 보고되는 항체 또는 복합체를 포함하는 제 1 용기; 및 (b) 내부에 함유된 조성물이 있는 제 2 용기로서, 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 그밖의 치료제를 포함하는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 본 구현예에서 제조품은 조성물이 특정 상태를 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 제조품은 추가로 약학적으로-허용가능한 완충제, 예컨대 주사용 세균발육저지수 (BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
VIII. 특정 구현예
1. 합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 (공유) 콘쥬게이트로서, 디술피드 결합이 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 폴리펩티드의 라이신 잔기 전 또는 후의 시스테인 잔기와 항체의 CDR2 (CDR2 는 Kabat 에 따라 측정됨) 내의 시스테인 잔기 사이에서 형성되는 콘쥬게이트.
2. 제 1 항목에 있어서, 시스테인 잔기가 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후의 1 내지 3 개의 잔기 사이에 있는 콘쥬게이트.
3. 제 1 항목 또는 제 2 항목에 있어서, 폴리펩티드가 폴리펩티드 독소인 콘쥬게이트.
4. 제 1 항목 내지 제 3 항목 중 임의의 것에 있어서, CDR2 가 중쇄 CDR2 인 콘쥬게이트.
5. 합텐화된 폴리펩티드 독소 및 항-합텐 항체를 포함하는 (공유) 콘쥬게이트로서,
폴리펩티드 독소는 라이신 잔기에서 합텐에 콘쥬게이션되고,
합텐화된 폴리펩티드 독소는 디술피드 결합에 의해 항-합텐 항체에 콘쥬게이션되어,
i) 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후에 있는 1 개 또는 2 개의 잔기인, 합텐화된 폴리펩티드 독소의 시스테인 잔기와,
ii) 항체의 중쇄 CDR2 내의 시스테인 잔기 (CDR2 는 Kabat 에 따라 결정됨) 사이에서 디술피드 결합이 형성되는 콘쥬게이트.
6. 제 1 항목 내지 제 5 항목 중 임의의 것에 있어서, 폴리펩티드가 그의 아미노산 서열 내에 정확하게 하나의 라이신 잔기를 포함하는 콘쥬게이트.
7. 합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 (공유) 콘쥬게이트로서, 디술피드 결합이 폴리펩티드 내의 시스테인 잔기와 항체의 중쇄 CDR2 (CDR2 는 Kabat 에 따라 측정됨) 내의 시스테인 잔기 사이에서 형성되고, 폴리펩티드가 그의 아미노산 서열 내에 정확하게 하나의 라이신 잔기를 포함하는 콘쥬게이트.
8. 제 1 항목 내지 제 7 항목 중 임의의 것에 있어서, 시스테인 잔기가 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기의 전 (즉, 라이신 잔기에 대해 위치 N-2 에서) 또는 후 (즉, 라이신 잔기에 대해 위치 N+2 에서) 의 2 개의 잔기인 콘쥬게이트.
9. 제 1 항목 내지 제 8 항목 중 임의의 것에 있어서, 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기가 폴리펩티드의 10 개의 N-말단 아미노산 잔기 내에 있는 콘쥬게이트.
10. 제 1 항목 내지 제 9 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-합텐 항체가 합텐화된 폴리펩티드의 합텐에 특이적으로 결합하는 (항-합텐 항체) 콘쥬게이트.
11. 제 1 항목 내지 제 10 항목 중 임의의 것에 있어서, 합텐화된 폴리펩티드가 합텐, 링커 및 폴리펩티드를 포함하는 콘쥬게이트.
12. 제 1 항목 내지 제 10 항목 중 임의의 것에 있어서, 폴리펩티드가 카르복시메틸-기 또는 카프로산 스페이서를 통해 합텐에 콘쥬게이션되는 콘쥬게이트.
13. 제 1 항목 내지 제 12 항목 중 임의의 것에 있어서, 항체의 CDR2 내의 시스테인 잔기의 알파 탄소 원자가 합텐이 콘쥬게이션되는 (합텐은 폴리펩티드에 직접적으로 또는 링커를 통해 콘쥬게이션됨) 폴리펩티드의 라이신 잔기의 원자로부터 약 10 내지 11 옹스트롱 (Angstrom; Å) 떨어져 있는 콘쥬게이트.
14. 제 1 항목 내지 제 13 항목 중 임의의 것에 있어서, 폴리펩티드가 페이로드에 추가로 콘쥬게이션되는 콘쥬게이트.
15. 제 1 항목 내지 제 14 항목 중 임의의 것에 있어서, 폴리펩티드 독소가 PE25 인 콘쥬게이트.
16. 제 1 항목 내지 제 14 항목 중 임의의 것에 있어서, 폴리펩티드 독소가 인간화된 (탈면역화된) PE25 변이체인 콘쥬게이트.
17. 제 1 항목 내지 제 16 항목 중 임의의 것에 있어서, 항체의 중쇄 CDR2 내의 시스테인 잔기가 Kabat 의 중쇄 가변 도메인 번호지정에 따라 위치 52, 또는 위치 52a, 또는 위치 52b, 또는 위치 52c, 또는 위치 52d, 또는 위치 53 에 있는 콘쥬게이트.
18. 제 1 항목 내지 제 17 항목 중 임의의 것에 있어서, 항체의 중쇄 CDR2 내의 시스테인 잔기가 Kabat 의 중쇄 가변 도메인 번호지정에 따라 위치 52a, 또는 위치 52b, 또는 위치 52c, 또는 위치 53 에 있는 콘쥬게이트.
19. 제 1 항목 내지 제 18 항목 중 임의의 것에 있어서, 항체의 중쇄 CDR2 내의 시스테인 잔기가 Kabat 의 중쇄 가변 도메인 번호지정에 따라 위치 52b 또는 위치 53 에 있는 콘쥬게이트.
20. 제 1 항목 내지 제 19 항목 중 임의의 것에 있어서, 항체가 비-합텐 항원에 대한 제 1 결합 특이성 및 합텐에 대한 제 2 결합 특이성을 포함하는 이특이적 항체인 콘쥬게이트.
21. 합텐화된 폴리펩티드 독소 및 이특이적 항체를 포함하는 (공유) 콘쥬게이트로서,
이특이적 항체가 비-합텐 항원에 대한 제 1 결합 특이성 및 합텐에 대한 제 2 결합 특이성을 포함하고,
폴리펩티드 독소는 라이신 잔기에서 합텐에 콘쥬게이션되고,
합텐화된 폴리펩티드 독소는 디술피드 결합에 의해 항-합텐 항체에 콘쥬게이션되어,
i) 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후에 있는 2 개의 잔기인, 합텐화된 폴리펩티드 독소의 시스테인 잔기와,
ii) 항체의 중쇄 CDR2 내의 위치 52b 또는 53 에서의 시스테인 잔기 (CDR2 는 Kabat 에 따라 결정됨) 사이에서 디술피드 결합이 형성되는 콘쥬게이트.
22. 제 1 항목 내지 제 21 항목 중 임의의 것에 있어서, 항체 분자 대 합텐화된 폴리펩티드 분자의 화학량론적 비가 1:1 또는 1:2 또는 2:1 또는 2:2 또는 2:4 또는 4:2 (항체 : 합텐화된 폴리펩티드) 인 콘쥬게이트.
23. 제 1 항목 내지 제 22 항목 중 임의의 것에 있어서, 비-합텐 항원이 세포 표면 항원인 콘쥬게이트.
24. 제 23 항목에 있어서, 세포 표면 항원이 종양 연관 항원인 콘쥬게이트.
25. 제 1 항목 내지 제 24 항목 중 임의의 것에 있어서, 이특이적 항체가 전체 길이 항체인 콘쥬게이트.
26. 제 25 항목에 있어서, 이특이적 항체 중 하나의 중쇄는 홀 돌연변이를 포함하고, 각각의 다른 사슬은 놉 돌연변이를 포함하는 콘쥬게이트.
27. 제 1 항목 내지 제 26 항목 중 임의의 것에 있어서, 이특이적 항체가 각각의 C-말단에서 scFv 또는 scFab 가 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 융합된 전체 길이 항체인 콘쥬게이트.
28. 제 1 항목 내지 제 27 항목 중 임의의 것에 있어서, 항체가 인간화 또는 인간 항체인 콘쥬게이트.
29. 제 1 항목 내지 제 28 항목 중 임의의 것에 있어서, 항체의 불변 영역이 IgG1 서브클래스 또는 IgG4 서브클래스의 것인 콘쥬게이트.
30. 제 1 항목 내지 제 29 항목 중 임의의 것에 있어서, 항체가 Kabat 의 EU 인덱스에 따른 번호지정으로 위치 234 및 235 에는 알라닌 및 위치 329 에는 글리신을 가진 IgG1 서브클래스의 불변 영역을 갖는 콘쥬게이트.
31. 제 1 항목 내지 제 29 항목 중 임의의 것에 있어서, 항체가 Kabat 의 EU 인덱스에 따른 번호지정으로 위치 228 에는 프롤린, 위치 235 에 글루탐산 및 위치 329 에 글리신을 가진 IgG4 클래스의 불변 영역을 갖는 콘쥬게이트.
32. 제 1 항목 내지 제 31 항목 중 임의의 것에 있어서, 콘쥬게이트가 중쇄 CDR2 당 정확하게 하나의 디술피드 결합을 포함하는 콘쥬게이트.
33. 제 1 항목 내지 제 32 항목 중 임의의 것에 있어서, 디술피드 결합이 산화환원 활성제의 첨가 없이 형성되는 콘쥬게이트.
34. 제 1 항목 내지 제 33 항목 중 임의의 것에 있어서, 합텐이 링커를 통해 폴리펩티드에 콘쥬게이션되는 콘쥬게이트.
35. 제 34 항목에 있어서, 링커가 비-펩티드 링커인 콘쥬게이트.
36. 제 1 항목 내지 제 35 항목 중 임의의 것에 있어서, 합텐이 비오틴, 또는 테오필린, 또는 디곡시게닌, 또는 카르보란, 또는 플루오레세인, 또는 브로모데옥시우리딘인 콘쥬게이트.
37. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-디곡시게닌 항체가 (a) SEQ ID NO: 09 또는 25 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 10 또는 26 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 11 또는 27 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 13 또는 29 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 14 또는 30 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 15 또는 31 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
38. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-비오틴 항체가 (a) SEQ ID NO: 41 또는 57 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 42 또는 58 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 43 또는 59 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 45 또는 61 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 46 또는 62 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 47 또는 64 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
39. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-플루오레세인 항체가 (a) SEQ ID NO: 105 또는 113 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 106 또는 114 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 107 또는 115 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 109 또는 117 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 110 또는 118 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 111 또는 119 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
40. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-테오필린 항체가 (a) SEQ ID NO: 73 또는 89 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 74 또는 90 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 75 또는 91 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 77 또는 93 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 78 또는 94 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 79 또는 95 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
41. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-디곡시게닌 항체가 (a) (i) SEQ ID NO: 09 또는 25 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 10 또는 26 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 (iii) SEQ ID NO: 11 또는 27 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 (b) (i) SEQ ID NO: 13 또는 29 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ii)SEQ ID NO: 14 또는 30 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (c) SEQ ID NO: 15 또는 31 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
42. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-비오틴 항체가 (a) (i) SEQ ID NO: 41 또는 57 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 42 또는 58 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 (iii) SEQ ID NO: 43 또는 59 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 (b) (i) SEQ ID NO: 45 또는 61 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 46 또는 6242 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (c) SEQ ID NO: 47 또는 63 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
43. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-플루오레세인 항체가 (a) (i) SEQ ID NO: 105 또는 113 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 106 또는 114 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 (iii) SEQ ID NO: 107 또는 115 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 (b) (i) SEQ ID NO: 109 또는 117 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 110 또는 118 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (c) SEQ ID NO: 111 또는 119 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
44. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-테오필린 항체가 (a) (i) SEQ ID NO: 73 또는 89 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 74 또는 90 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 (iii) SEQ ID NO: 75 또는 91 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 (b) (i) SEQ ID NO: 77 또는 93 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (ii) SEQ ID NO: 78 또는 94 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (c) SEQ ID NO: 79 또는 95 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 적어도 1 개, 적어도 2 개, 또는 모두 3 개의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
45. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-디곡시게닌 항체, 및/또는 항-비오틴 항체, 및/또는 항-테오필린 항체가 인간화 항체인 콘쥬게이트.
46. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-디곡시게닌 항체가 상기 항목 중 임의의 것에서와 같은 CDR 을 포함하고, 수용기 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 일치 프레임워크를 추가로 포함하는 콘쥬게이트.
47. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-비오틴 항체가 상기 항목 중 임의의 것에서와 같은 CDR 을 포함하고, 수용기 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 일치 프레임워크를 추가로 포함하는 콘쥬게이트.
48. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-테오필린 항체가 상기 항목 중 임의의 것에서와 같은 CDR 을 포함하고, 수용기 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 일치 프레임워크를 추가로 포함하는 콘쥬게이트.
49. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-디곡시게닌 항체가 SEQ ID NO: 04 또는 12 또는 20 또는 28 의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
50. 제 49 항목에 있어서, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 일치성을 갖는 VH 서열은 참고 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-디곡시게닌 항체는 디곡시게닌에 결합하는 능력을 보유하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
51. 제 49 항목 또는 제 50 항목에 있어서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 01 또는 09 또는 17 또는 25 에서 치환, 삽입 및/또는 결실되는 콘쥬게이트.
52. 제 49 항목 내지 제 51 항목 중 임의의 것에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실이 CDR 외부 (즉, FR 내에서) 영역에서 일어나는 콘쥬게이트. 임의로, 항-디곡시게닌 항체는 해당 서열의 전사-후 개질을 포함하여 SEQ ID NO: 01 또는 09 또는 17 또는 25 에 VH 서열을 포함한다.
53. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-디곡시게닌 항체가 SEQ ID NO: 08 또는 16 또는 24 또는 32 의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
54. 제 53 항목에 있어서, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 일치성을 갖는 VL 서열은 참고 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-디곡시게닌 항체는 디곡시게닌에 결합하는 능력을 보유하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
55. 제 53 항목 또는 제 54 항목에 있어서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 08 또는 16 또는 24 또는 32 에서 치환, 삽입 및/또는 결실되는 콘쥬게이트. 특정 항목에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부 (즉, FR 내에서) 영역에서 일어난다.
56. 제 53 항목 내지 제 55 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-디곡시게닌 항체가 해당 서열의 전사-후 개질을 포함하여 SEQ ID NO: 08 또는 16 또는 24 또는 32 에 VL 서열을 포함하는 콘쥬게이트.
57. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-비오틴 항체가 SEQ ID NO: 36 또는 44 또는 52 또는 60 의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
58. 제 57 항목에 있어서, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 일치성을 갖는 VH 서열은 참고 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-비오틴 항체는 비오틴에 결합하는 능력을 보유하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
59. 제 57 항목 또는 제 58 항목에 있어서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 36 또는 44 또는 52 또는 60 에서 치환, 삽입 및/또는 결실되는 콘쥬게이트.
60. 제 57 항목 내지 제 59 항목 중 임의의 것에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실이 CDR 외부 (즉, FR 내에서) 영역에서 일어나는 콘쥬게이트.
61. 제 57 항목 내지 제 60 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-비오틴 항체가 해당 서열의 전사-후 개질을 포함하여 SEQ ID NO: 36 또는 44 또는 52 또는 60 에 VH 서열을 포함하는 콘쥬게이트.
62. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-플루오레세인 항체가 SEQ ID NO: 108 또는 116 의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
63. 제 62 항목에 있어서, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 일치성을 갖는 VH 서열은 참고 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-플루오레세인 항체는 플루오레세인에 결합하는 능력을 보유하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
64. 제 62 항목 또는 제 63 항목에 있어서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 108 또는 116 에서 치환, 삽입 및/또는 결실되는 콘쥬게이트.
65. 제 62 항목 내지 제 64 항목 중 임의의 것에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실이 CDR 외부 (즉, FR 내에서) 영역에서 일어나는 콘쥬게이트.
66. 제 62 항목 내지 제 65 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-플루오레세인 항체가 해당 서열의 전사-후 개질을 포함하여 SEQ ID NO: 108 또는 116 에 VH 서열을 포함하는 콘쥬게이트.
67. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-테오필린 항체가 SEQ ID NO: 68 또는 76 또는 84 또는 92 의 아미노산 서열과 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
68. 제 67 항목에 있어서, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 일치성을 갖는 VH 서열은 참고 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-테오필린 항체는 테오필린에 결합하는 능력을 보유하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
69. 제 67 항목 또는 제 68 항목에 있어서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 68 또는 76 또는 84 또는 92 에서 치환, 삽입 및/또는 결실되는 콘쥬게이트.
70. 제 67 항목 내지 제 69 항목 중 임의의 것에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실이 CDR 외부 (즉, FR 내에서) 영역에서 일어나는 콘쥬게이트.
71. 제 67 항목 내지 제 70 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-테오필린 항체가 해당 서열의 전사-후 개질을 포함하여 SEQ ID NO: 68 또는 76 또는 84 또는 92 에 VH 서열을 포함하는 콘쥬게이트.
72. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-디곡시게닌 항체가 상기 제공된 항목 중 임의의 것에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 항목 중 임의의 것에서와 같은 VL 을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
73. 제 72 항목에 있어서, 항체가 각각, SEQ ID NO: 04 또는 12 또는 20 또는 28, 및 SEQ ID NO: 08 또는 16 또는 24 또는 32 내에 VH 및 VL 서열을 포함하는 (이들 서열의 전사-후 개질을 포함) 콘쥬게이트.
74. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-비오틴 항체가 상기 제공된 항목 중 임의의 것에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 항목 중 임의의 것에서와 같은 VL 을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
75. 제 74 항목에 있어서, 항체가 각각, SEQ ID NO: 36 또는 44 또는 52 또는 60, 및 SEQ ID NO: 40 또는 48 또는 56 또는 64 내에 VH 및 VL 서열을 포함하는 (이들 서열의 전사-후 개질을 포함) 콘쥬게이트.
76. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-플루오레세인 항체가 상기 제공된 항목 중 임의의 것에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 항목 중 임의의 것에서와 같은 VL 을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
77. 제 76 항목에 있어서, 항체가 각각, SEQ ID NO: 108 또는 116, 및 SEQ ID NO: 112 또는 120 내에 VH 및 VL 서열을 포함하는 (이들 서열의 전사-후 개질을 포함) 콘쥬게이트.
78. 제 1 항목 내지 제 36 항목 중 임의의 것에 있어서, 항-테오필린 항체가 상기 제공된 항목 중 임의의 것에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 항목 중 임의의 것에서와 같은 VL 을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
79. 제 78 항목에 있어서, 항체가 각각, SEQ ID NO: 68 또는 76 또는 84 또는 92, 및 SEQ ID NO: 72 또는 80 또는 88 또는 96 내에 VH 및 VL 서열을 포함하는 (이들 서열의 전사-후 개질을 포함) 콘쥬게이트.
80. 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 따른 콘쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형.
81. 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 콘쥬게이트.
82. 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 콘쥬게이트.
83. 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 있어서, 바이러스 질환의 치료에 사용하기 위한 콘쥬게이트.
84. 의약의 제조에서의 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 따른 콘쥬게이트의 용도.
85. 폴리펩티드의 안정성을 증가시키기 위한 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 따른 콘쥬게이트의 용도.
86. 폴리펩티드의 표적을 벗어난 (off-target) 독성 효과를 감소 또는 제거하기 위한 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 따른 콘쥬게이트의 용도.
87. 폴리펩티드의 활성을 증가시키기 위한 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 따른 콘쥬게이트의 용도.
88. 폴리펩티드의 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 따른 콘쥬게이트의 용도.
89. 질환의 치료에서의 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 따른 콘쥬게이트의 용도.
90. 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 따른 유효량의 콘쥬게이트를 개인에게 투여하는 것을 포함하는 질환을 가진 개인의 치료 방법.
91. 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 따른 유효량의 콘쥬게이트를 개인에게 투여하는 것을 포함하는 개인에서의 질환의 치료 방법.
92. 제 91 항목에 있어서, 질환이 암인 방법.
93. 인공 항체 시스테인 잔기를 포함하는 항체 및 인공 폴리펩티드 시스테인 잔기를 포함하는 합텐화된 폴리펩티드의 조합을 포함하고, 인공 항체 시스테인 잔기의 알파 탄소 원자가 링커가 융합되는 폴리펩티드의 원자로부터 약 10 내지 11 옹스트롱 (Angstrom; Å) 떨어져 있는, 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 따른 콘쥬게이트의 제조 방법.
94. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항목 내지 제 79 항목 중 임의의 것에 따른 콘쥬게이트의 제조 방법:
- 합텐에 특이적으로 결합하고 CDR2 내에 인공 항체 시스테인 잔기를 갖는 항체를, 인공 폴리펩티드 시스테인 잔기를 포함하는 합텐화된 폴리펩티드와 용액에서 조합하는 단계, 및
- 상기 용액으로부터 콘쥬게이트를 회수하는 단계.
95. 표적 세포에 대한 합텐화된 화합물의 표적화된 전달을 위한 이특이적 항체로서, 이특이적 항체는 합텐화된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 부위 및 세포의 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 특이성을 포함하는 이특이적 항체.
96. 제 95 항목에 있어서, 디술피드 결합이 폴리펩티드의 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후의 시스테인 잔기와 항체의 CDR2 (CDR2 는 Kabat 에 따라 측정됨) 내의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 이특이적 항체.
97. 제 95 항목 또는 제 96 항목에 있어서, 시스테인 잔기가 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후의 1 내지 3 개의 잔기 사이에 있는 이특이적 항체. 본 구현예에서, 시스테인 잔기는 라이신 잔기에 대해 위치 N-3, N-2, N-1, N+1, N+2 또는 N+3 중 하나에 있다.
98. 제 95 항목 내지 제 97 항목 중 임의의 것에 있어서, 시스테인 잔기가 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 (즉, 라이신 잔기에 대해 위치 N-2 에) 또는 후 (즉, 라이신 잔기에 대해 위치 N+2 에) 의 2 개의 잔기인 이특이적 항체.
99. 제 95 항목 내지 제 98 항목 중 임의의 것에 있어서, 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기가 폴리펩티드의 10 개의 N-말단 아미노산 잔기 내에 있는 이특이적 항체.
100. 제 95 항목 내지 제 99 항목 중 임의의 것에 있어서, 폴리펩티드가 그의 아미노산 서열 내에 정확하게 하나의 라이신 잔기를 포함하는 이특이적 항체.
본원에 언급되는 모든 참고문헌의 설명은 참고로서 본원에 인용된다.
하기 실시예, 도면 및 서열은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 참 범주는 특허청구범위에 언급된다. 본 발명의 취지에서 벗어나지 않고 절차에 대한 변형이 일어날 수 있는 것으로 이해된다.
본 실시예에서 사용되는 합텐화된 화합물의 합성은 PCT/EP2013/064100 및 WO 2012/093068 에 보고되어 있다.
실시예 1
디곡시게닌의 존재 하 쥐과 항-디곡시게닌 Fv 영역의 결합 영역, 및 비오틴의 존재 하 쥐과 항-비오틴 Fv 영역의 결합 영역의 결정화 및 X-선 구조 측정
디곡시게닌-결합 항체의 Fab 단편의 구조의 측정은 WO 2011/003557 및 WO 2011/003780 에 상세히 기재된 바 있으며, 또한 Metz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 8194-8199 에서 공개되었다 (3RA7).
쥐과 항-비오틴 항체의 구조를 측정하였다. 그러므로, Fab 단편을 정제된 IgG 의 프로테아제 소화에 의해 생성시킨 후, 당업계의 공지된 방법 (파파인 소화) 를 적용하여 정제하였다.
20 mM His-HCl 중 apo Fab 단편 (정제된 Fab) 의 결정화를 위해서, 140　mM NaCl, pH 6.0 을 13 mg/ml 로 농축하였다. 결정화 액적을 증기 확산 시팅 드롭 (vapor diffusion sitting drop) 실험에서 0.2 ㎕ 의 단백질 용액을 0.2 ㎕ 의 저장소 용액과 혼합하여 21℃ 에서 셋업하였다. 5 일 이내에 0.1 M Tris pH 8.5, 0.01 M 코발트 클로라이드, 20% 폴리비닐피롤리돈 K15 이 외부로 결정이 나타났고, 8 일 이내에 0.3 mm x 0.06 mm x 0.03 mm 의 최종 크기로 성장하였다.
동결보호제로서 15% 글리세롤로 결정을 수확한 후 액체 N2 중에서 급속 냉동하였다. 회절 이미지를 Pilatus 6M 검출기로 100K 의 온도에서 Swiss Light Source 의 빔 라인 X10SA 에서 수집하고, 프로그램 XDS 로 처리하고 (Kabsch, W., J.　Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800) SCALA (BRUKER AXS 에서 입수) 로 스케일링하여, 2.22Å 해상도에 대한 데이터를 수득하였다. 상기 Fab 단편 결정은 a=90.23Å b=118.45Å c=96.79Å 및 β=117.53°의 셀 면적을 갖는 단사정계 스페이스기 P21 에 속하며 결정학적 비대칭 유닛 당 4 개의 Fab 분자를 포함한다 (표 3 참고).
CCP4 소프트웨어 스위트로부터의 표준 결정학 프로그램을 사용하여 탐색 모델로서 PDB 엔트리 3PQP 로의 분자 대체에 의해 구조를 해독하고, 전자 밀도를 계산하고, x-선 구조를 정밀화하였다 (CCP4, Collaborative Computational Project, Acta Crystallogr. D, 760-763 (1994)). COOT 를 사용하여 구조 모델을 전자 밀도 내로 재구축하였다 (Emsley, P., et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (2010) 486-501). 좌표를 REFMAC5 (Murshudov, G.N., et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-55) 및 autoBUSTER (Global Phasing Ltd.) 로 정밀화하였다.
표 3: 단사정계 muM33 Fab 단편 apo-결정에 대한 데이터 수집 및 구조 정밀화 통계
Figure 112016075559978-pct00006
비오틴-유도체와의 복합체 중 Fab-단편의 결정화를 위해서, 소킹 (soaking) 실험에 사용한 Fab 단편의 apo 결정을 스크리닝 후 3 일 내에 0.8 M 숙신산에서 파생되게 하고, 5 일 내에 0.25 mm x 0.04 mm x 0.04 mm 의 최종 크기로 성장시켰다. 바이오시티나미드를 물 중 100　mM 에서 용해하였다. 이후, 화합물을 결정 용액 중 10 mM 작동 농도로 희석하고 결정 액적 중의 결정에 적용하였다. 결정을 2 ㎕ 의 10 mM 화합물 용액으로 3 회 세척하고, 최종적으로 바이오시티나미드와 함께 21℃ 에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다.
동결보호제로서 15% 글리세롤로 결정을 수확한 후 액체 N2 중에서 급속 냉동하였다. 회절 이미지를 Pilatus 6M 검출기로 100K 의 온도에서 Swiss Light Source 의 빔 라인 X10SA 에서 수집하고, 프로그램 XDS 로 처리하고 (Kabsch, W., J.　Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800) SCALA (BRUKER AXS 에서 입수) 로 스케일링하여, 2.35Å 해상도에 대한 데이터를 수득하였다. 상기 Fab 단편 결정은 a=89.09Å b=119.62Å c=96.18Å 및 β=117.15°의 셀 면적을 갖는 단사정계 스페이스기 P21 에 속하며 결정학적 비대칭 유닛 당 4 개의 Fab 분자를 포함한다 (표 4 참고).
CCP4 소프트웨어 스위트로부터의 표준 결정학 프로그램을 사용하여 탐색 모델로서 apo Fab 단편의 좌표로의 분자 대체에 의해 구조를 해독하고, 전자 밀도를 계산하고, x-선 구조를 2.5Å 의 해상도로 정밀화하였다 (CCP4). COOT 를 사용하여 구조 모델을 전자 밀도 내로 재구축하였다 (Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. & Cowtan, K. Features and development of COOT. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 486-501 (2010)). 좌표를 REFMAC5 (Murshudov, G.N., et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-55) 및 autoBUSTER (Global Phasing Ltd.) 로 정밀화하였다.
표 4: 단사정계 muM33 Fab 단편 바이오시티나미드 복합체 결정에 대한 데이터 수집 및 구조 정밀화 통계
Figure 112016075559978-pct00007

실험적 구조 측정 결과를 도 6 에 나타낸다. 복합체의 결정 형태는 비대칭 단위 내에 4 개의 독립적 바이오시티나미드:항-비오틴 Fab 복합체를 포함하였으며, 바이오시티나미드는 모든 Fab 분자에 의해 유사하게 결합되었다. 비오시티딘아미드는 중쇄의 CDR 1 및 3 및 모든 3 개 경쇄 CDR 에 의해 형성된 포켓 내에서 결합된다. 리간드의 결합 포켓은 중쇄로부터 잔기 ASN29, ASP31, THR32, PHE33, GLN35, TRP99 및 TRP106 에 의해, 그리고 경쇄로부터 ASN31, TYR32, LEU33, SER34, TYR49, SER50, PHE91 및 TYR96 에 의해 규정된다. 비오틴 헤드 기는 포켓의 한 말단에서 CDR2 및 CDR1 의 잔기와 수소 결합을 형성하고: 바이오시티나미드의 N3 는 Ser50 의 히드록실-산소와 상호작용하는 반면, O22 는 동일 잔기의 백본-아미드 질소와 접촉한다. 추가로, 바이오시티나미드의 O22 는 또한 Ser34 의 히드록실-기 산소에 수소-결합된다. 이에 추가로, 소수성 상호작용이 결합 포켓 안으로 놓인 방향족 측쇄와 바이오시티나미드 사이에서 관찰된다. 비오틴의 (CH2)4 지방족 꼬리 말단에서의 아미드 결합은 중쇄 CDR1 의 PHE33 상에 쌓이며 PHE33 의 백본 아미드 질소 및 Asp31 에 대한 부가적인 수소 결합에 의해 안정화된다. 상기 위치는 아미드 질소이며, 이는 질소를 따르는 원자가 결합 포켓으로부터 용매로 벗어나는 방식으로의, 활성 개체에 대한 연결 부위이다.
2.5 Å 의 해상도에서의 결합 영역의 실험적 측정 결과로, 리간드의 그의 항체에 대한 결합 방식을 분석할 수 있는데, 이는 재조합 비오틴 결합 모듈의 단백질 조작을 통한 추가의 향상 및 상세한 모델링에 대한 전제조건이다.
실시예 2
공유 콘쥬게이션을 위한 도입된 기능성을 가진 항-합텐 항체의 정의 및 생성
상기 기재된 항-합텐 항체의 인간화 VH 및 VL 서열의 유도체화를 수행하여, 규정된 위치에서의 항체에 대한 항원/합텐의 공유 커플링을 허용하는 화합물을 생성하였다.
디곡시게닌에 결합된 항-디곡시게닌 Fab-단편의 실험적으로 측정된 구조 (3RA7) (Metz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 8194-8199) 를 사용하여, 항체와 이의 복합체화 항원/합텐 사이에 위치-지정 커플링 반응이 발생할 수 있게 하는 변형이 있는 위치를 확인하였다. 바이오시티나미드에 결합한 항-비오틴 Fab-단편의 구조 (실시예 5 참고) 를 사용하여 비오틴-결합 항체 단편에 대한 도입된 시스테인 잔기의 올바른 위치를 확인하고, 확인된 위치(들) 의 일반적 적용성의 증거물을 제공하였다.
돌연변이되어야만 하는 위치는 하기 2 가지 요건을 동시에 충족시켜야만 한다: (i) 커플링 위치는 지정 커플링에 대한 항원/합텐 위치화 효과를 이용하기 위해 결합 영역에 근접해야만 함, 및 (ii) 돌연변이 및 커플링 위치는 항원/합텐 결합 그 자체가 영향을 받지 않는 방식으로 위치해야만 함. 적합한 위치를 찾기 위한 상기 요건은 요건 (i) 이 결합 부위와 가까운 위치에 의해 최상으로 제공되는 반면, 요건 (ii) 는 결합 부위로부터 먼 위치에 의해 가장 안전하게 달성되기 때문에 서로 사실상 '모순' 적이다.
상기 사실상 배제되는 요건에도 불구하고, 합텐화된 화합물의 합텐 위치화에 영향을 주지 않고, 그럼에도 불구하고 지시된 공유 커플링을 동시에 허용하는 식으로 돌연변이될 수 있는 위치를 확인할 수 있었다.
제 1 위치는 각각의 항체의 CDR2 의 실제 길이에 따라 Kabat 번호지정에 따른 위치 VH52b 또는 VH53 에 존재한다. 항-디곡시게닌 항체 구조에서, 합텐은 소수성 잔기에 의해 형성된 깊은 포켓 내에 결합된다. 형광 디곡시게닌-Cy5 콘쥬게이트가 본 결정학적 연구에서 사용되었고, 형광단 뿐 아니라, 디곡시게닌과 Cy5 사이의 링커는 높은 유연성 및 결정 내의 산출되는 정렬순서로 인해 구조 내에서 볼 수 없었다. 그러나, 링커 및 Cy5 는 중쇄의 CDR2 의 방향 내로 향하는 디곡시게닌의 O32 에 부착된다. Kabat 번호지정에 따른 위치 52b 에서의 아미노산 잔기의 Cα 에 대한 디곡시게닌의 O32 (상기 참고) 사이의 거리는 약 10.5 Å 이다.
위치 VH52b/VH53 에서의 아미노산의 Cys 로의 대체는 항-디곡시게닌 항체-VH52bC 에 대해 SEQ ID NO: 20 및 28, 항-테오필린 항체-VH53C 에 대해 SEQ ID NO: 84 및 92, 항-비오틴 항체-VH53C 에 대해 SEQ ID NO: 52 및 60, 및 항-플루오레세인 항체-VH52bC 에 대해 SEQ ID NO: 108 에 나열된 중쇄 가변 영역 서열을 가진 항체 유도체를 산출하였다.
개질 지점으로서 확인된 추가의 위치는 Kabat 번호지정에 따라 위치 VH28 이다.
그 결과로, Kabat 위치 VH28 에서 시스테인을 도입하였다. VH28 에서의 아미노산의 시스테인으로의 대체는 항-디곡시게닌 항체-VH28C 에 대해 SEQ ID NO: 124 및 132, 항-테오필린 항체-VH28C 에 대해 SEQ ID NO: 156 및 164, 항-비오틴 항체-VH28C 에 대해 SEQ ID NO: 140 및 148, 및 항-플루오레세인 항체-VH28C 에 대해 SEQ ID NO: 116 으로서 나열된 중쇄 가변 영역 서열을 가진 항체 유도체를 발생시켰다.
이들 위치 중 하나가 "보편적" 위치인, 즉, 해당 위치가 임의의 (항-합텐) 항체에 적용가능하고, 따라서 신규한 (항-합텐) 항체가 결정 구조를 제공하고 합텐-위치화된 공유 커플링을 가능하게 하는 적합한 위치를 측정함으로써 개질되어야만 하는 매번 스트레치로부터 출발할 필요가 없다는 것을 밝혔다.
각각 Kabat 중쇄 가변 영역 번호지정에 따른 돌연변이 VH52bC 또는 VH53C 는 각각의 합텐-결합 항체 (항-합텐 항체) 에 사용될 수 있다. 항체 및 그의 결합 포켓의 구조가 꽤 다양하지만, VH52bC/VH53C 돌연변이가 디곡시게닌, 비오틴, 플루오레세인 및 테오필린에 결합하는 항체에 대한 항원/합텐의 공유 결합에 사용될 수 있다는 것이 나타났다.
이들 서열로 구성되는 결합 개체는 표준 단백질 A- 및 크기 배제 크로마토그래피로 발현되고 정제될 수 있다 (실시예 3 참고). 산출된 분자는 완전히 기능적이며 그의 미변형된 모체 분자와 동일한 방식으로 그의 동족 합텐에 대한 친화성을 유지하였다. 이는 표면-플라스몬-공명 (SPR) 실험에 의해 입증되었다 (실시예 4 참고).
실시예 3
재조합 항-합텐 항체의 조성물, 발현 및 정제
쥐과 및 인간화 항-합텐 항체 가변 영역을 인간 기원의 불변 영역과 조합하여 단일특이적 또는 이특이적 키메라 또는 인간화 항체를 형성시켰다.
합텐 뿐 아니라 상이한 비-합텐 표적 (예를 들어 수용체 티로신 키나아제 또는 IGF-1R) 에 특이적으로 결합하는 단일특이적 인간화 항-합텐 항체 및 이특이적 인간화 항-합텐 항체의 생성에는 (i) 이러한 분자에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 디자인 및 정의, (ii) 트랜스펙션된 배양 포유동물 세포에서의 이들 분자의 발현, 및 (iii) 트랜스펙션된 세포의 상청액으로부터의 이들 분자의 정제가 필요하다. 이들 단계를 WO 2012/093068 에서 이미 기재한 바와 같이 수행하였다.
일반적으로, (본래) 쥐과 항-합텐 항체의 결합 특이성을 갖는 IgG 클래스의 인간화 항체를 생성시키기 위해서, 인간화 VH 서열을 프레임 내에서 서브클래스 IgG1 의 인간 Fc-영역의 CH1-힌지-CH2-CH3 의 N-말단에 융합시켰다. 유사하게, 인간화 VL 서열을 프레임 내에서 인간 CL카파 불변 영역의 N-말단에 융합시켰다.
합텐-결합 특이성 뿐 아니라 다른 표적에 대한 특이성을 포함하는 이특이적 항체 유도체를 생성시키기 위해, 항-합텐 항체, scFv 또는 Fab 단편을 프레임 내에서 이전에 기재한 항체의 중쇄의 C-말단에 융합시켰다. 많은 경우, 이전에 기재한 VH44-VL100 디술피드 결합의 도입에 의해, 적용된 항-합텐 scFv 를 추가로 안정화시켰다 (예를 들어 Reiter, Y., et al., Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245).
발현 플라스미드
중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는 발현 플라스미드를 포유동물 세포 발현 벡터 내에서 개별적으로 어셈블리하엿다.
이로써, 개별 요소를 인코딩하는 유전자 분절을 상기 개략적으로 나타낸 바와 같이 연결시켰다.
그로부터 코돈 사용 빈도를 추정할 수 있는 인간 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적 정보가 다음에 제공된다: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242.
κ-경쇄의 전사 단위는 하기 요소로 구성된다:
- 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
- 코작 (Kozak) 서열을 포함하는 합성 5'-UT,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 5' 말단에서의 독특한 BsmI 제한 부위 및 스플라이스 도너 부위 및 3' 말단에서의 독특한 NotI 제한 부위가 배치된 클로닝된 가변 경쇄 cDNA,
- 인트론 2 마우스 Ig-κ 인핸서를 포함하는 게놈 인간 κ-유전자 불변 영역 (Picard, D., and Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82), 및
- 인간 면역글로불린 κ-폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열.
γ1-중쇄의 전사 단위는 하기 요소로 구성된다:
- 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
- 코작 서열을 포함하는 합성 5'-UT,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 변형된 쥐과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 5' 말단에서의 독특한 BsmI 제한 부위 및 스플라이스 도너 부위 및 3' 말단에서의 독특한 NotI 제한 부위가 배치된 클로닝된 단일특이적 가변 중쇄 cDNA 또는 클로닝된 이특이적 융합 scFv-가변 중쇄 cDNA,
- 마우스 Ig μ-인핸서를 포함하는 게놈 인간 γ1-중쇄 유전자 불변 영역 (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), 및
- 인간 γ1-면역글로불린 폴리아데닐화 ("폴리A") 신호 서열.
κ-경쇄 또는 γ1-중쇄 발현 카세트 외에, 이들 플라스미드는 하기를 함유한다:
- 히그로마이신 저항성 유전자,
- 엡스테인-바르 바이러스 (EBV) 의 복제 기원, oriP,
- 상기 플라스미드가 E. 콜라이에서 복제될 수 있게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및
- E. 콜라이에서 암피실린 저항성을 부여하는 β-락타마아제 유전자.
재조합 DNA 기술
[Sambrook et al., 1999 (supra)] 에서 기재된 바와 같은 표준 클로닝 기술을 사용하여 클로닝을 수행하였다. 모든 분자 생물학 시약은 시판되었으며 (다르게 나타내지 않는 경우) 제조사의 지시사항에 따라 사용하였다.
코딩 서열, 돌연변이 또는 추가의 유전적 요소를 포함하는 DNA 를 Geneart AG, Regensburg 에 의해 합성하였다.
DNA 서열을 SequiServe (SequiServe GmbH, Germany) 에서 수행한 이중 가닥 서열분석에 의해 결정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
Vector NTI Advance 스위트 버전 9.0 을 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석화 및 일러스트레이션에 사용하였다.
항-합텐 항체 및 유도체의 발현
현탁액 중 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포의 일시적 트랜스펙션에 의해 항-합텐 항체를 발현시켰다. 이를 위해서, 상응하는 단일특이적 또는 이특이적 항체의 경쇄 및 중쇄를, 상기 나타낸 바와 같이 원핵세포 및 진핵세포 선택 마커를 수반하는 발현 벡터 중에서 구축하였다. 이들 플라스미드를 E. 콜라이에서 증폭하고, 정제하고, 이후 일시적 트랜스펙션에 적용하였다. 표준 세포 배양 기술을 [Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.] 에서 기재된 바와 같이 세포를 취급하는데 사용하였다.
37℃/8% CO2 에서 적절한 발현 배지에서 세포를 배양하였다. 트랜스펙션 일에, 세포를 1-2x106 생존가능 세포/ml 의 밀도로 새 배지에 시딩하였다. 트랜스펙션 시약과의 DNA-복합체를 250 ml 최종 트랜스펙션 부피에 대해 1:1 몰비로, 250 ㎍ 의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA 를 포함하는 Opti-MEM I 배지 (Invitrogen, USA) 중에서 제조하였다. 단일특이적 또는 이특이적 항체 함유 세포 배양물 상청액을 14,000　g 에서 30 분 동안 원심분리하고 멸균 필터 (0.22 ㎛) 를 통해 여과하여, 트랜스펙션 7 일 후 정화시켰다. 상청액을, 정제할 때까지 -20℃ 에서 보관하였다.
세포 배양물 상청액 중 항체 및 유도체의 농도를 측정하기 위해서, 친화성 HPLC 크로마토그래피를 적용하였다. 이를 위해서, 단백질-A 에 결합하는 단일특이적 또는 이특이적 항체 또는 이의 유도체를 함유하는 세포 배양 상청액을, 200 mM KH2PO4, 100 mM 나트륨 시트레이트를 포함하는 용액 중에서 pH 7.4 에서 Applied Biosystems Poros A/20 컬럼에 적용하였다. 200 mM NaCl, 100 mM 시트르산을 포함하는 용액을 pH 2.5 에서 적용하여, 크로마토그래피 물질로부터의 용리를 수행하였다. UltiMate 3000 HPLC 시스템 (Dionex) 을 사용하였다. 용리된 단백질을 UV 흡광 및 피크 면적의 적분에 의해 정량하였다. 정제된 IgG1 항체는 표준으로서 역할하였다.
디곡시게닌, 플루오레세인, 테오필린 또는 비오틴에 결합하는 항-합텐 항체의 정제
트랜스펙션 7 일 후 HEK 293 세포 상청액을 수확하였다. 이에 포함된 재조합 항체 (또는 -유도체) 를 protein A-SepharoseTM 친화성 크로마토그래피 (GE Healthcare, Sweden) 및 Superdex200 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의한 2 단계로 상청액으로부터 정제하였다. 간단히, 항체를 함유하는 정화된 배양 상청액을 PBS 완충액 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형화된 MabSelectSuRe 단백질 A (5-50 ml) 컬럼에 적용하였다. 미결합 단백질을 평형 완충액으로 세척해냈다. 항체 (또는 -유도체) 를 50 mM 시트레이트 완충액, pH 3.2 로 용리하였다. 단백질 함유 분획물을 0.1 ml 2 M Tris 완충액, pH 9.0 으로 중화시켰다. 이후, 용리된 단백질을 풀링 (pool) 하고, Amicon Ultra 원심분리 필터 장치 (MWCO: 30 K, Millipore) 로 농축하고 20　mM 히스티딘, 140 mM NaCl 로 pH 6.0 에서 평형화된 Superdex200 HiLoad 26/60 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare, Sweden) 에 로딩하였다. [Pace et. al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423] 에 따른 아미노산 서열을 기초로 하여 계산한 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정하여 (320 nm 에서의 OD 는 백그라운드 보정으로서 사용함), 정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를 측정하였다. 단량체 항체 분획물을 풀링하고, 순간 동결 (snap-frozen) 시키고 -80℃ 에서 보관하였다. 샘플 일부를 후속적인 단백질 분석 및 특징화에 제공하였다.
항체의 동질성을 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 SDS-PAGE 에 의해 확인하였다. NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 을 제조사의 지시사항에 따라 사용하였다 (4-20% Tris-글리신 겔).
환원 조건 하에, IgG 에 관련된 폴리펩티드 사슬을 계산된 분자량과 유사한 명백한 분자 크기에서 SDS-PAGE 후에 확인하였다. 모든 구성물의 발현 수준을 단백질 A 에 의해 분석하였다. 평균 단백질 수율은 이러한 비-최적화 일시적 발현 실험에서 세포-배양물 상청액 1 리터 당 6 mg 내지 35 mg 의 정제된 단백질이었다.
실시예 4
재조합 인간화 항-비오틴 항체의 비오틴-표지 화합물 (합텐화된 화합물) 에 대한 결합
인간화 절차 및 이후 시스테인 돌연변이의 도입으로 인해 전체 결합 활성을 갖는 유도체가 생성되었는지 여부를 측정하기 위해서, 하기 실험을 수행하였다.
Octet QK 기기 (Fortebio Inc.) 를 사용하여 생물층 간섭법 (BLI) 기술에 의해 재조합 항-비오틴 항체 유도체의 결합 특성을 분석하였다. 이러한 시스템은 분자 상호작용의 연구를 위해 잘 확립되어있다. BLi-기술은 내부 참조물 및 바이오센서 팁의 표면으로부터 반사된 백색 광의 간섭 패턴의 측정을 기반으로 한다. 분자의 바이오센서 팁에 대한 결합은 간섭 패턴의 이동을 초래하며, 이는 측정될 수 있다. 상기 기재한 인간화 절차가 항-비오틴 항체가 비오틴에 결합하는 능력을 약화시켰는지를 분석하기 위해서, 비오틴화 단백질에 결합하는 능력에 있어서의 키메라 및 인간화 버전 항체의 특성을 직접 비교하였다. 항-huIgG Fc 항체 포획 (anti-huIgG Fc antibody Capture (AHC)) 바이오센서 (Fortebio Inc.) 상에서 항-비오틴 항체를 포획하여, 결합 연구를 수행하였다. 먼저, 바이오센서를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중 0.5　mg/ml 의 농도로 항체 용액 중에서 1 분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 바이오센서를 1 분 동안 1x PBS pH 7.4 에서 인큐베이션하여 안정한 기준선에 도달시켰다. 항체-코팅된 바이오센서를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중 0.06 mg/ml 의 농도로 비오틴화 단백질을 함유하는 용액 중에서 5 분 동안 인큐베이션하여, 결합을 측정하였다. 해리를 5 분 동안 1x PBS pH 7.4 중에서 모니터링하였다. 키메라 및 인간화 항-비오틴 항체에 대한 생성된 결합 곡선을 직접 비교하였다.
인간화 버전 항체는 키메라 항체와 동일하거나 더 양호한 비오틴화 항원에 대한 결합을 나타내었다. 이는 Kabat 위치 VH53 에서의 Cys 돌연변이를 갖는 인간화 항체에 대해서도 마찬가지이다. 비오틴화 단백질은 바이오센서가 비오틴에 결합하지 않는 Herceptin 으로 코팅된 경우, 바이오센서에 대한 감소된 잔여 비특이적 결합을 나타내었다. 따라서, 항-비오틴 항체의 기능성은 이의 인간화 변이체에서 유지되었다 (SEQ ID NO: 44 및 48, SEQ ID NO: 60 및 64 에서 나타낸 바와 같은 서열에 의해 규정됨).
표면 플라스몬 공명
표면 플라스몬 공명 측정을 BIAcore® T200 기기 (GE Healthcare Biosciences AB, Sweden) 에서 25℃ 에서 수행하였다. 대략 4300 공명 단위 (RU) 의 포획 시스템 (인간 항체 포획 키트 (Human Antibody Capture Kit), BR-1008-39, GE Healthcare Biosciences AB, Sweden 로부터의 10 ㎍/ml 항-인간 포획물 (IgG Fc)) 을, GE Healthcare 에 의해 공급받은 표준 아민 커플링 키트 (BR-1000-50) 를 사용하여 pH 5.0 에서 CM3 칩 (GE Healthcare, BR-1005-36) 에 커플링하였다. 아민 커플링에 대한 실행 완충액은 HBS-N (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, GE Healthcare, BR-1006-70) 이었다. 이후 결합 연구에 대한 실행 및 희석 완충액은 PBS-T (0.05% Tween 20 을 포함하는 10 mM 인산완충식염수) pH 7.4 였다. 2 nM 용액을 60 초 동안 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여, 인간화 항-비오틴 항체를 포획하였다. 비오틴화 siRNA 를 0.14 - 100 nM (1:3 연속 희석물) 의 농도로 PBS-T 로 희석하였다. 180 초 동안 30 ㎕/분의 유속, 해리 시간 600 초로 각 농도를 주입하여 결합을 측정하였다. 3 M MgCl2 용액으로 5 ㎕/분의 유속으로 30 초 세척하여 표면을 재생시켰다. BIAevaluation 소프트웨어 (GE Healthcare Biosciences AB, Sweden) 를 사용하여 데이터를 평가하였다. 항-인간 IgG Fc 표면으로부터 수득한 반응을 제하여, 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 블랭크 주입을 또한 제하였다 (= 이중 참조화). KD 및 동역학적 파라미터를 계산하기 위해서 랭뮤어 (Langmuir) 1:1 모델을 사용하였다.
표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의한 동역학적 결합 분석을 인간화 항-비오틴 항체 SEQ ID NO: 44 및 48 및 인간화 항-비오틴 항체 VH53C SEQ ID NO: 60 및 64 에 대해 실행하였다. 2 nM 농도에서의 항-비오틴 항체를, CM3 센서 칩에 결합한 항-인간 IgG Fc 항체에 의해 포획하였다. 비오틴화 siRNA (Mw: 13868 Da) 를 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 100 및 300 nM 의 농도에서 기록하였다. 측정을 이중으로 실행하였다. 인간화 항-비오틴 항체 및 인간화 항-비오틴 항체 VH53C 에 대해 계산된 KD 는 각각 0.633 nM 및 0.654 nM 이었다.
실시예 5
항-합텐 항체와 합텐화된 화합물의 비-공유 복합체의 생성
일반적 방법:
항-합텐 항체와 합텐화된 화합물 (=페이로드에 콘쥬게이션된 합텐) 의 복합체 생성은 규정된 복합체를 생성시킬 것이며 이들 복합체 중의 화합물 (=페이로드) 이 그의 활성을 유지하는 것을 보장할 것이다. 각각의 항-합텐 항체와 합텐화된 화합물의 복합체 생성을 위해서 합텐화된 화합물을 H2O 에 1 mg/ml 의 최종 농도로 용해하였다. 항체를 20 mM 히스티딘 완충액, 140 mM NaCl, pH=6.0 중에서 1 mg/ml (4.85 μM) 의 최종 농도로 농축하였다. 상하 파이펫팅에 의해 합텐화된 페이로드 및 항체를 2:1 몰비 (화합물 대 항체) 로 혼합하고, 15 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
대안적으로, 합텐화된 화합물을 10 mg/ml 의 최종 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 항체를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH=8.2 중에 10 mg/ml 의 최종 농도로 농축하였다. 상하 파이펫팅에 의해 합텐화된 화합물 및 항체를 2.5:1 몰비 (화합물 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온 및 350 rpm 에서 인큐베이션하였다.
합텐화된 형광 염료 및 항-합텐 항체의 복합체 형성에 대한 예시적 방법 - 비-공유 디곡시게닌-Cy5 복합체
인간화 및 쥐과 항-디곡시게닌 항체 또는 이특이적 항-디곡시게닌 항체 유도체를 항체 성분으로서 사용하였다. 디곡시게닌화 Cy5 와 항-디곡시게닌 항체의 복합체 생성을 위해 Cy5-디곡시게닌 콘쥬게이트를 0.5　mg/ml 의 최종 농도로 PBS 에 용해하였다. 항체를 20 mM 히스티딘 및 140 mM NaCl, pH 6 으로 구성된 완충액 중 1 mg/ml (약 5 μM) 의 농도로 사용하였다. 디곡시게닌화 Cy5 및 항체를 2:1 몰비 (디곡시게닌화 Cy5 대 항체) 로 혼합하였다. 이 절차로, 규정된 조성물의 복합체의 균질한 제제가 생성되었다.
크기 배제 컬럼에서 항체-연관 형광단의 형광 (650/667nm) 을 측정하여, 복합체화 반응을 모니터링할 수 있다. 이들 실험 결과는 항체가 디곡시게닌에 대한 결합 특이성을 함유하는 경우에만 복합체화가 발생한다는 것을 입증한다. 디곡시게닌에 대한 결합 특이성을 갖지 않는 항체는 디곡시게닌-Cy5 콘쥬게이트에 결합하지 않는다. 디곡시게닌-Cy5 콘쥬게이트 대 항체의 비가 2:1 일 때까지, 2-원자가 항-디곡시게닌 항체에 대해 신호 증가가 관찰될 수 있다. 따라서, 조성물 의존적 형광 신호는 안정기에 도달한다.
합텐화된 형광 염료 및 항-합텐 항체의 복합체 형성에 대한 예시적 방법 - 비오틴-Cy5 / 키메라 항-비오틴 항체 (인간 IgG 서브클래스) 복합체
시스테인화 링커를 함유하는 비오틴-유도체화-Cy5 (비오틴-Cys-Cy5) 의 복합체의 생성을 위해, 0.16 mg 의 비오틴-Cys-Cy5 를 10 mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 1 mg 의 항체를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 10.1 mg/ml (약 69 μM) 의 농도로 사용하였다. 비오틴-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비 (비오틴-Cys-Cy5 대 항체) 로 혼합하고 60 분 동안 실온에서, 350 rpm 에서 진탕하여 인큐베이션하였다. 산출된 콘쥬게이트를 실시예 6a 에서 기재한 바와 같이 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. 형광 검출을 실시예 6a 에서 기재한 바와 같이 실행하였다.
비오틴화 형광 염료 및 항-비오틴 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - 비오틴-Ser-Cy5/ 인간화 항-비오틴 항체:
링커 내 세린 잔기를 함유하는 비오틴-유도체화-Cy5 (비오틴-Ser-Cy5) 의 복합체 생성을 위해, 0.61 mg 의 비오틴-Ser-Cy5 를 10 mg/ml 의 농도로 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 에 용해하였다. 18.5 mg 의 인간화 항-비오틴 항체를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 10 mg/ml (약 69 μM) 의 농도로 사용하였다. 비오틴-Ser-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비 (비오틴-Ser-Cy5 대 항체) 로 혼합하고 60 분 동안 실온에서, 350 rpm 에서 진탕하여 인큐베이션하였다. 이후 샘플을 1.5 ml/분의 유속으로 Superdex 200 16/60 하이 로드 프렙 그레이드 컬럼 (high load prep grade column) (GE Healthcare) 및 이동상으로서 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 적용하였다. 피크 분획물을 수집하고 순도에 대해서 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. 염료 대 항체 비를 (1) 파장 280 nm (단백질) 및 650 nm (Cy5) 에서의 샘플의 흡광도를 측정하고; (2) 식: 표지된 단백질의 A650/ε(Cy5)*단백질 농도 (M) = 단백질 1 몰 당 염료 몰 수 (이때, ε/Cy5) = 250000 M-1cm-1 이고, 복합체의 A650 = 47.0 이고, 단백질 농도는 86.67 μM 임) 을 사용하여 계산하였다. 염료 대 항체 분자의 산출된 비는 2.17 이었으며, 이는 모든 항체 파라토프가 비오틴-Cy5 분자로 포화되는 것을 제시한다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 복합체 형성에 대한 예시적 방법 - 디곡시게닌-PYY(3-36) / 항-디곡시게닌 항체 복합체
디곡시게닌화 폴리펩티드와 항-디곡시게닌 항체의 비-공유 복합체 생성을 위해 쥐과 하이브리도마-유래 항체 (10 mM KPO4, 70 mM NaCl; pH 7.5 로부터의 동결건조물) 를 12　ml 물에 용해하고, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 을 포함하는 용액에 대하여 투석하여, 11 ml 완충액 (c = 27.3 mg/ml) 중 300 mg (2 x 10-6 mol) 을 산출하였다. 디곡시게닌-PYY(3-36) 콘쥬게이트 (11.57 mg, 4 x 10-6 mol, 2 당량) 를 1 시간 내에 2.85 mg 의 4 회분으로 첨가하고 추가 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 복합체화 반응의 완료 후, 복합체를 2.5 ml/분의 유속으로 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중 Superdex 200 26/60 GL 컬럼 (320 ml) 을 통해 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 용리된 복합체를 4 ml 분획물로 수집하고, 풀링하고 0.2 μm 필터를 통해 멸균하여, 234 mg 의 복합체를 14.3 mg/ml 의 농도로 수득하였다. 유사한 방식으로, 인간화 항-디곡시게닌 항체의 복합체 생성을 위해 항체를 20　mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중 10.6 mg/ml (9.81 mg, 0.93 ml 중 6.5x10-8 mol) 의 농도로 조정하였다. 0.57 mg = 1.97x10-7 mol = 3.03 당량의 디곡시게닌화 폴리펩티드 (DIG-PYY) 를 동결건조물로서 항체 용액에 첨가하였다. 폴리펩티드 및 항체를 1.5 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 과량의 폴리펩티드를 0.5 ml/분의 유속으로 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중 Superose 6 10/300 GL 컬럼을 통해 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 용리된 복합체를 0.5 ml 분획물로 수집하고, 풀링하고, 0.2 μm 필터를 통해 멸균하여, 4.7 mg 의 복합체를 1.86 mg/ml 의 농도로 수득하였다.
산출된 합텐화된 폴리펩티드-항-합텐 항체 복합체를, 크기 배제 크로마토그래피에서의 단일 피크 발생을 통해 단량체 IgG-유사 분자로서 규정하였다. 산출된 복합체를, 항체 분자 당 2 개의 디곡시게닌-PYY 유도체를 운반하는 단량체 IgG-유사 분자로서 규정하였다. 이들 펩티드 복합체의 규정된 조성물을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 확인하였고, 이는 또한 단백질 응집물의 부재를 나타내었다. 이들 이특이적 펩티드 복합체의 규정된 조성물 (및 2:1 폴리펩티드 대 단백질 비) 을 SEC-MALS (크기 배제 크로마토그래피 - 다각도 광산란) 에 의해 추가로 확인하였다. SEC-MALS 분석을 위해, 100-500　㎍ 의 각각의 샘플을 0.25-0.5 ml/분의 유속으로, 이동상으로서 1 x PBS pH 7.4 를 사용하여 Superdex 200 10/300 GL 크기 배제 컬럼에 적용하였다. Wyatt MiniDawn TREOS/QELS 검출기로 광산란을 검출하고, Wyatt Optilab rEX-검출기로 굴절률을 측정하였다. 산출된 데이터를 소프트웨어 ASTRA (버전 5.3.4.14) 를 사용하여 분석하였다. SEC MALLS 분석 결과는 복합체의 질량, 반경 및 크기에 대한 정보를 제공한다. 이들 데이터를 상응하는 비-복합체화 항체의 데이터와 비교하였다. 이들 실험 결과는, 디곡시게닌화-PYY 의 항-디곡시게닌 항체에 대한 노출이 항체 분자 1 개 당 2 개의 디곡시게닌-PYY 유도체를 포함하는 복합체를 생성시킨다는 것을 입증한다. 따라서, 디곡시게닌화 PYY 는 규정된 부위 (결합 영역) 에서 및 규정된 화학량론으로 항-디곡시게닌 항체와 복합체화될 수 있다.
표면 플라스몬 공명 연구에 의한 복합체의 특징분석은, 복합체화 반응이 규정되고 완전히 복합체화된 분자를 생성시켰다는 추가적인 증거를 제공하였다. 항-디곡시게닌 항체는 SPR 칩에 결합할 수 있으며 이는 신호 증가를 초래한다. 디곡시게닌-PYY 콘쥬게이트의 후속적인 첨가는, 모든 결합 부위가 완전히 점유될 때까지 신호를 추가로 증가시킨다. 이러한 조건에서, 더 많은 디곡시게닌-PYY 의 첨가는 신호를 더 증가시키지 않는다. 이는 복합체화 반응이 특이적이며 신호가 디곡시게닌화 폴리펩티드의 비-특이적 접착성으로 인한 것이 아니라는 것을 나타낸다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 복합체 형성에 대한 예시적 방법 - Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot / 키메라 항-비오틴 항체 복합체
시스테인화 링커를 함유하는 비오틴화-PYY-폴리펩티드의 비-공유 복합체 생성을 위해, 0.19 mg 의 Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot 을 10 mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 항체를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 10.7 mg/ml (약 73 μM) 의 농도로 사용하였다. Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온 및 350 rpm 에서 인큐베이션하였다. 산출된 복합체를 크기 배제 크로마토그래피에서 단일 피크 발생을 통해 단량체 IgG-유사 분자로서 규정하였다 (95% 단량체). 산출된 복합체를 SDS-PAGE 및 후속 웨스턴 블롯 (Western Blot) 분석에 의해 추가 분석하였다. 10 ㎍ 의 복합체를 4x LDS 샘플 완충액 (Invitrogen) 과 혼합하고 95℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 4-12% 비스-트리스 폴리아크릴아미드-겔 (NuPAGE, Invitrogen) 에 적용하고 이를 35 분 동안 200V 및 120 mA 에서 실행하였다. 폴리아크릴아미드-겔에서 분리된 분자를 40 분 동안 25V 및 160 mA 에서 PVDF 멤브레인 (0.2 μM 공극 크기, Invitrogen) 에 옮겼다. 멤브레인을 1x PBST (1x PBS + 0.1% Tween20) 중 1% (w/v) 탈지유로 1 시간 동안 실온에서 블로킹하였다. 멤브레인을 1x PBST 중에서 5 분 동안 3 회 세척한 후, 1:2000 희석물로 사용한 스트렙타비딘-POD-콘쥬게이트 (2900 U/ml, Roche) 와 함께 인큐베이션하였다. 멤브레인 상에서 비오틴에 결합한 스트렙타비딘-POD 의 검출을 Lumi-Light 웨스턴 블롯팅 기질 (Roche) 을 사용하여 실행하였다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 복합체 형성에 대한 예시적 방법 - Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot)/ 키메라 항-비오틴 항체 복합체
시스테인화 링커를 함유하는 비오틴화-PYY-폴리펩티드의 비-공유 복합체 생성을 위해, 0.16 mg 의 Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot 를 10 mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 항체를 50 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 10.7 mg/ml (약 73 μM) 의 농도로 사용하였다. Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온 및 350 rpm 에서 인큐베이션하였다. 산출된 복합체를, 크기 배제 크로마토그래피를 통해 63% 단량체 IgG-유사 분자 및 37% 이량체 가용성 응집물로서 규정하였다. 산출된 복합체를 SDS-PAGE 및 후속적 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가 분석하였다. 10 ㎍ 의 복합체를 4x LDS 샘플 완충액 (Invitrogen) 과 혼합하고 95℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 4-12% 비스-트리스 폴리아크릴아미드-겔 (NuPAGE, Invitrogen) 에 적용하여 이를 35 분 동안 200V 및 120 mA 에서 실행하였다. 폴리아크릴아미드-겔에서 분리된 분자를 40 분 동안 25V 및 160 mA 에서 PVDF 멤브레인 (0.2　μm 공극 크기, Invitrogen) 에 옮겼다. 멤브레인을 1x PBST (1x PBS + 0.1% Tween20) 중 1% (w/v) 탈지유 중에서 1 시간 동안 실온에서 블로킹하였다. 멤브레인을 1x PBST 중에서 5 분 동안 3 회 세척한 후, 1:2000 희석물로 사용한 스트렙타비딘-POD-접합체 (2900 U/ml, Roche) 와 함께 인큐베이션하였다. 멤브레인 상에서 비오틴에 결합한 스트렙타비딘-POD 의 검출을 Lumi-Light 웨스턴 블롯팅 기질 (Roche) 을 사용하여 실행하였다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 복합체 형성에 대한 예시적 방법 - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo) / 키메라 항-플루오레세인 항체 복합체
시스테인화 링커를 함유하는 플루오레세인-콘쥬게이션-PYY-폴리펩티드의 비-공유 복합체의 생성을 위해, 0.33 mg 의 Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo 를 10　mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 항체를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 9.99 mg/ml (약 68　μM) 의 농도로 사용하였다. Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo) 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온 및 350 rpm 에서 인큐베이션하였다. 산출된 복합체를 크기 배제 크로마토그래피를 통해 76% 단량체 IgG-유사 분자 및 24% 이량체 가용성 응집물로서 규정하였다. 산출된 복합체를 SDS-PAGE 및 후속적으로, 폴리아크릴아미드-겔에서의 플루오레세인-관련 형광의 검출에 의해 추가 분석하였다. 8 ㎍ 의 복합체를 4x LDS 샘플 완충액 (Invitrogen) 과 혼합하고 95℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 플루오레세인-관련 형광을 645 nm 의 여기 파장에서 LumiImager F1 장비 (Roche) 를 사용하여 기록하였다.
실시예 6
산화환원제의 존재 하 합텐화된 염료 또는 폴리펩티드와 항-합텐 항체 VH52bC/VH53C 의 규정된 공유 콘쥬게이트의 생성
합텐화된 형광 염료 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - Dig-Cys-Ahx-Cy5/항-디곡시게닌 항체 VH52bC
시스테인-링커를 함유하는 합텐화된 형광 염료 및 항-합텐 항체의 공유 콘쥬게이트 생성은, 항-합텐 항체의 CDR2 에서의 VH52bC 와 합텐 및 형광 염료 사이 링커에서의 시스테인 사이의 특정 위치에서 디술피드 브릿지가 형성되는 규정된 콘쥬게이트를 생성시킨다. 콘쥬게이션 반응을 산화환원 시약의 존재 하 실행하였다. Dig-Cys-Ahx-Cy5 를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH　6.0 에 용해하였다. 10% (v/v) 아세트산을 적가하여 가용화를 촉진시켰다. 최종 농도를 0.4 mg/ml 로 조정하였다. 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 를 10 mg/ml 의 농도가 되게 하였다. 항-디곡시게닌 항체를 대조군으로서 사용하고 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 와 동일한 방식으로 처리하였다. 4.7 nmol 의 각각의 항체를 2.5 몰 당량의 Dig-Cys-Ahx-Cy5 와 혼합하였다. 11.7 nmol 의 상기 성분을 4 회분으로 (각각 2.9 nmol) 15 분 마다 첨가하여 이를 수행하였다. 이들 첨가 사이에, 샘플을 부드럽게 진탕하면서 25℃ 에서 인큐베이션하였다. 마지막 분량을 첨가한 후, 0.64 nmol 의 각 항체 - Dig-Cys-Ahx-Cy5 복합체를 다음과 같은 산화환원 시약을 함유하는 완충액에 옮겼다: 3 mM DTE (디티오에리트리톨) + 10 mM GSSG (산화된 글루타티온), 0.3　mM DTE + 1 mM GSSG 및 0.03 mM DTE + 0.1 mM GSSG. 모든 샘플을 이러한 조건에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 반으로 나누고 (각각 0.34 nmol) SDS 겔 전기영동을 위해 준비하였다. 이를 위해, 4x LDS 샘플 완충액 (Invitrogen) 을 첨가하였다. 10x NuPAGE 샘플 환원제 (Invitrogen) 를 첨가하여, 각 샘플에 대해 또한 환원된 버전을 제조하였다. 모든 샘플을 70℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션한 후, 1x MOPS 완충액 (Invitrogen) 과 함께 4-12% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 겔 (NuPAGE, Invitrogen) 상에서 전기영동을 수행하였다. 겔에서의 Cy5-관련 형광을 645 nm 의 여기 파장에서 LumiImager F1 장비 (Roche) 로 검출하였다. 형광 검출 후, 겔을 SimplyBlue SafeStain (Invitrogen) 으로 염색하였다. 겔을 도 4 에 나타낸다.
부위-특이적 디술피드 결합 형성을, CDR2 에서 시스테인이 없는 항-디곡시게닌 항체를 사용한 경우 (라인 2 A-C) 낮은 백그라운드 형광 신호를 갖는 항-디곡시게닌 항체 VH52bC (도 8, 상부 겔, 라인 1 A-C) 에 대해 나타내었다. 대조군 반응에서의 백그라운드 신호를, 항체-사슬간 디술피드 결합의 형성에 보통 수반되는 Dig-Cys-Ahx-Cy5 의 시스테인에 대한 커플링에 의해 설명할 수 있다. 증가량의 산화환원 시약은 항체 중쇄 및 경쇄를 연결하는 디술피드 브릿지를 실질적으로 감소시켜, 주로 ¾ 항체 (- 1x LC), HC-이량체 (- 2x LC) 및 ½ 항체 (1x HC + 1x LC) 를 생성시킨다. 겔의 하부에서, 항체에 공유 연결되지 않은 Dig-Cys-Ahx-Cy5 의 형광을 검출할 수 있다. 도 8 의 하부에서의 겔은, 샘플 환원시, 항체 중쇄 및 경쇄 근처에서 Cy5-관련 형광이 검출가능하지 않다는 것을 나타내는데, 이는 공유 연결이 실제로 디술피드 브릿지에 의해 형성되었다는 것을 나타낸다. 각 겔의 쿠마시 염색은, 각 라인에서의 단백질 총량이 동일하였다는 것을 나타낸다.
합텐화된 형광 염료 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - Dig-Cys-Cy5/ 항-디곡시게닌 항체 VH52bC
Dig-Cys-Cy5 를 3.25 mg/ml 의 최종 농도로 8.3 mM HCl, 10% (v/v) DMF 에 용해하였다. 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 항체가 15　mg/ml 의 농도가 되게 하였다. 항-디곡시게닌 항체를 대조군으로서 사용하고 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 와 동일한 방식으로 처리하였다. 13.3 nmol 의 각 항체를, 1 mM GSH (환원된 글루타티온) 및 5 mM GSSG (환원된 글루타티온) 의 존재 하 10 mg/ml 의 최종 항체 농도로, 2 몰 당량의 Dig-Cys-Cy5 와 혼합하였다. 26.6 nmol 의 이러한 성분을 2 회분으로 5 분 마다 첨가하여 이를 수행하였다. 이러한 첨가 사이에, 샘플을 부드럽게 진탕하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 마지막 분량을 첨가한 후, 샘플을 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 커플링 반응의 효율을 SDS-PAGE 및 후속적인 Cy5-관련 형광 신호 기록에 의해 평가하였다. 5, 10 및 20 ㎍ 의 각 샘플을 SDS-PAGE 를 위해 준비하였다. 이를 위해, 4x LDS 샘플 완충액 (Invitrogen) 을 첨가하였다. 모든 샘플을 70℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션한 후, 1x MOPS 완충액 (Invitrogen) 과 함께 4-12% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 겔 (NuPAGE, Invitrogen) 상에서 전기영동을 수행하였다. 겔에서의 Cy5-관련 형광을 645 nm 의 여기 파장에서 LumiImager F1 장비 (Roche) 로 검출하였다. 형광 검출 후, 겔을 SimplyBlue SafeStain (Invitrogen) 으로 염색하였다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) / 인간화 항-디곡시게닌 항체 VH52bC
시스테인화 링커를 함유하는 디곡시게닌-유도체화-PYY-폴리펩티드의 콘쥬게이트 생성을 위해, 1.4 mg 의 PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) 를 10 mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 1 mg 의 항체를 5 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM GSH, 5 mM GSSG, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 10 mg/ml (약 68 μM) 의 농도로 사용하였다. PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) 및 항체를 2:1 몰비 (PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온에서 100 rpm 에서 교반하여 인큐베이션하였다. 산출된 콘쥬게이트를 질량 분석에 의해 분석하였다. 검출된 종류의 43% 가 2 개 폴리펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 46% 가 1 개 폴리펩티드 분자에 커플링된 항체였고, 11% 가 미커플링된 항체로서 확인되었다.
실시예 7
산화환원제의 부재 하 합텐화된 염료 및 폴리펩티드와 항-합텐 항체 VH52bC/VH53C 의 규정된 공유 콘쥬게이트의 생성
공유 항-합텐 항체/합텐화된 폴리펩티드 또는 합텐화된 염료 디술피드-연결 콘쥬게이트의 생성을 위해, (i) 링커를 함유하는 적합한 반응기 (예컨대 예를 들어 시스테인, 말레이미드) 를 통해 합텐 (예를 들어 디곡시게닌, 플루오레세인, 비오틴 또는 테오필린) 을 폴리펩티드 또는 염료에 커플링시켜, 폴리펩티드가 항체 표면 위로 노출되게 하고, 따라서 그의 활성을 유지시키고, (ii) 폴리펩티드의 생물학적 활성이 유지되는 시스테인 돌연변이를 갖는 항-합텐 항체 (= 항체 VH52bC/VH53C) 와 합텐화된 폴리펩티드의 공유 부위 특이적 콘쥬게이트를 생성시키고, (iii) 환원제의 부재 하에 반응을 실행하여 항체 사슬간 디술피드 브릿지의 환원을 방지하는 것이 필요하다.
일반적 방법:
항-합텐 항체와 합텐화된 화합물의 콘쥬게이트 생성은 규정된 화학량론을 가진 콘쥬게이트를 초래할 것이며 이러한 콘쥬게이트 중 화합물이 이의 활성을 유지하는 것을 보장할 것이다. 각각의 항-합텐 항체와 합텐화된 화합물의 콘쥬게이트 생성을 위해 합텐화된 화합물을 10 mg/ml 의 최종 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 항-합텐 항체 VH52bC/VH53C 가 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH=8.2 중 10 mg/ml 의 농도가 되게 하였다. 상하 파이펫팅에 의해 합텐화된 화합물 및 항-합텐 항체 VH52bC/VH53C 를 2.5:1 몰비 (화합물 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온 및 350 rpm 에서 인큐베이션하였다.
시스테인 함유 링커를 통해 합텐에 콘쥬게이션된 폴리펩티드를 하기에서 합텐-Cys-폴리펩티드 또는 폴리펩티드-Cys-합텐으로 지칭한다. 폴리펩티드는 유리 N-말단, 또는 예를 들어 아세틸기 (Ac-폴리펩티드-Cys-합텐) 또는 PEG-잔기 (PEG-폴리펩티드-Cys-합텐) 로 캡핑된 N-말단을 가질 수 있다.
시스테인 함유 링커를 통해 합텐에 콘쥬게이션된 형광 염료를 하기에서 염료-Cys-합텐 또는 합텐-Cys-염료로 지칭한다.
합텐화된 형광 염료 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - Dig-Cys-Ahx-Cy5/ 항-디곡시게닌 항체 VH52bC
항체-Dig-Cys-Ahx-Cy5 복합체를 산화환원 화합물, 0.1 mM GSSG (산화된 글루타티온) 또는 1 mM GSSG 를 함유하지 않는 완충액에 옮긴 것을 제외하고는, 실시예 6a 에서 기재한 바와 동일하게 샘플을 제조하였다. 산출된 형광-스캔되고 쿠마시 염색된 폴리아크릴아미드 겔을 도 5 에 나타낸다. 모든 3 가지 조건은, 낮은 수준의 백그라운드 반응과 함께 (도 5, 라인 2 A-C) 부위-특이적 디술피드 결합 형성에 대해 유사한 특이성을 나타낸다 (도 5, 상부 겔, 라인 1 A-C). 이는 디술피드 결합 형성이 환원제의 필요 없이 달성될 수 있다는 것을 확인시킨다. 실시예 6 과 비교하여 단지 잔여량의 ¾ 항체 (- 1x LC), HC-이량체 (- 2x LC) 및 ½ 항체 (1x HC + 1x LC) 만이 검출되는 바, 이는 유의하게 항체를 안정화시키고/항체 붕괴를 감소시킨다.
합텐화된 형광 염료 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - Dig-Cys-Cy5/ 항-디곡시게닌 항체 VH52bC
산화환원 시약의 부재 하에 13.3 nmol 의 항체를 2 몰 당량의 Dig-Cys-Cy5 와 10 mg/ml 의 최종 항체 농도로 혼합한 것을 제외하고는, 실시예 6b 에서 기재한 바와 동일하게 샘플을 제조하였다.
합텐화된 형광 염료 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - 비오틴-Cys-Cy5/ 키메라 항-비오틴 항체 VH53C
시스테인화 링커를 함유하는 비오틴-유도체화-Cy5 의 콘쥬게이트 생성을 위해, 0.16 mg 의 비오틴-Cys-Cy5 를 10 mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 1 mg 의 항-비오틴 항체 VH53C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 9.7 mg/ml (약 68 μM) 의 농도로 사용하였다. 비오틴-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-비오틴-Cys-Cy5 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온에서 350 rpm 에서 진탕하여 인큐베이션하였다. 산출된 콘쥬게이트를 실시예 6a 에서 기재한 바와 같이 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. 형광의 검출을 실시예 6a 에서 기재한 바와 같이 실행하였다.
합텐화된 형광 염료 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - 비오틴-Cys-Cy5/ 인간화 항-비오틴 항체 VH53C
시스테인화 링커를 함유하는 비오틴-유도체화-Cy5 의 콘쥬게이트 생성을 위해, 0.16 mg 의 비오틴-Cys-Cy5 를 10 mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 1 mg 의 인간화 항-비오틴 항체 VH53C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 7.4 mg/ml (약 51 μM) 의 농도로 사용하였다. 비오틴-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-비오틴-Cys-Cy5 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온에서 350 rpm 에서 진탕하여 인큐베이션하였다. 산출된 콘쥬게이트를 실시예 6a 에서 기재한 바와 같이 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. 형광의 검출을 실시예 6a 에서 기재한 바와 같이 실행하였다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) / 인간화 항-디곡시게닌 항체 VH52bC
시스테인화 링커를 함유하는 디곡시게닌-유도체화-PYY-폴리펩티드의 콘쥬게이트 생성을 위해, 2.4　mg 의 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) 를 5 mg/ml 의 농도로 20% 아세테이트에 용해하였다. 10 mg 의 인간화 항-디곡시게닌 항체 VH52bC (68.4　nmol) 를 20　mM 히스티딘, 140　mM NaCl, pH 6.0 으로 구성된 완충액 중 19.5　mg/ml (약 133 μM) 의 농도로 사용하였다. Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) 및 항체를 2:1 몰비 (Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온에서 100 rpm 에서 교반하여 인큐베이션하였다. 산출된 콘쥬게이트를 질량 분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종류의 7.4% 가 2 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 40% 가 1 개 펩티드 분자에 커플링된 항체였고, 52% 가 미커플링된 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot) / 키메라 항-비오틴 항체 VH53C
시스테인화 링커를 함유하는 비오틴-유도체화-PYY-폴리펩티드의 콘쥬게이트 생성을 위해, 0.19 mg 의 Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot) 를 10 mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 1 mg 의 키메라 항-비오틴 항체 VH53C 를 50　mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 9.7 mg/ml (약 67 μM) 의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot] 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온에서 350 rpm 에서 진탕하여 인큐베이션하였다. 산출된 콘쥬게이트를 질량 분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종류의 87.7% 가 2 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 12.3% 가 1 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)/키메라 항-비오틴 항체 VH53C
시스테인화 링커를 포함하는 비오틴-유도체화-PYY-폴리펩티드의 콘쥬게이트 생성을 위해, 0.16　mg 의 Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot) 를 10　mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 1　mg 의 키메라 항-비오틴 항체 VH53C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 9.9　mg/ml (약 68 μM) 의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot] 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온에서 350 rpm 에서 진탕하여 인큐베이션하였다. 산출된 콘쥬게이트를 질량 분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종류의 100% 가 2 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot)/인간화 항-비오틴 항체 VH53C
시스테인화 링커를 함유하는 비오틴-유도체화-PYY-폴리펩티드의 콘쥬게이트 생성을 위해, 0.06　mg 의 Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot) 를 10 mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 0.8 mg 의 인간화 항-비오틴 항체 VH53C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 9 mg/ml (약 62 μM) 의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot] 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온에서 350 rpm 에서 진탕하여 혼합하였다. 산출된 콘쥬게이트를 질량 분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종류의 62.2% 가 2 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 33.9% 가 1 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 3.9% 가 미커플링된 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)/인간화 항-비오틴 항체 VH53C
시스테인화 링커를 함유하는 비오틴-유도체화-PYY-폴리펩티드의 콘쥬게이트 생성을 위해, 0.08 mg 의 Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot) 를 10　mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 0.8　mg 의 인간화 항-비오틴 항체 VH53C 를 50　mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액 중 9　mg/ml (약 62 μM) 의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot] 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온에서 350 rpm 에서 진탕하여 인큐베이션하였다. 산출된 콘쥬게이트를 질량 분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종류의 71.4% 가 2 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 26% 가 1 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 2.5% 가 미커플링된 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Fluo)/항-플루오레세인 항체 VH52bC
시스테인화 링커를 함유하는 비오틴-유도체화-PYY-폴리펩티드의 콘쥬게이트 생성을 위해, 0.33 mg 의 Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo 를 10　mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 1 mg 의 항-플루오레세인 항체 VH52bC 를 50　mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 9.3 mg/ml (약 63 μM) 의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo] 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온에서 350 rpm 에서 진탕하여 인큐베이션하였다. 산출된 콘쥬게이트를 질량 분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종류의 95 % 가 2 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 5% 가 1 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체의 콘쥬게이트 형성에 대한 예시적 방법 - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Fluo) / 항-플루오레세인 항체 VH28C
시스테인화 링커를 함유하는 비오틴-유도체화-PYY-폴리펩티드의 콘쥬게이트 생성을 위해, 0.33 mg 의 Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo 를 10 mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 1 mg 의 항-플루오레세인 항체 VH28C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 9.5 mg/ml (약 63 μM) 의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo] 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온에서 350　rpm 에서 진탕하면서 인큐베이션하였다. 산출된 콘쥬게이트를 질량 분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종류의 100% 가 2 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었다.
실시예 8
공유 테오필린-항-테오필린 항체 복합체의 생성
테오필린 및 테오필린-결합 항체를 합텐 인지 시스템으로서 활용하는 공유 항체 복합체 형성을 평가하기 위해서, 합텐을 테오필린에 대해 교체한 것을 제외하고는 디곡시게닌-Cys-Cy5 또는 비오틴-Cys-Cy5 에 대해 기재한 합성 및 정제 기술을 일반적으로 적용하여, 테오필린-Cys-Cy5 를 형광 페이로드로서 생성시켰다 (실시예 8 참고). 합성한 테오필린-Cys-Cy5 유도체의 조성물을 도 16a 에 나타낸다. 공유 디술피드 형성을 입증하기 위해, 테오필린-결합 항체를 생성시켰으며, 이는 중쇄 가변 영역의 위치 54 또는 55 에서 디자인 Cys 를 포함하였다 (항-테오필린 항체-Cys). 이들 항체의 순도를 도 16b 에서 Y54C 변이체에 대해 예시적으로 나타낸다. 이들 항체 유도체를 테오필린-Cys-Cy5 와 복합체화한 후, 실시예 12 에서 기재한 바와 같이 비-환원 및 환원 조건 하에 SDS-PAGE 에 적용하였다. 비-환원 조건 하에, 디술피드-연결 항-테오필린-항체 복합체화 Cy5 를, 실시예 12 에서 기재한 바와 동일한 방식으로 겔 내 이의 H-사슬 연관 형광에 의해 검출하였다. 이를 도 16c 에서 나타내며, 이는 항체 사이의 공유 복합체가 디곡시게닌, 플루오레세인 또는 비오틴을 합텐으로서 사용하는 경우 관찰된 디술피드와 동일한 방식으로 간단한 로딩 반응의 결과로서 형성되었다는 것을 입증한다. 이들 복합체는 환원시 예측된 바와 같이 해리되었다 (즉, 오직 디술피드가 환원된 경우에만 H-사슬로부터 페이로드를 방출하였음 (도 16c)).
실시예 9
생체 내 유사 조건 하에서의 공유 합텐-항체 복합체의 생성, 및 생체 내에서 지시된 디술피드-형성에 대한 증거
생체 내 유사 조건 하에서의 공유 합텐-항체 복합체의 형성을 평가하기 위해, 항-비오틴 항체-Cys 를 쥐과 혈청 중에서 비오틴-Cys-Cy5 와 함께 37℃ 에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 항체를 단백질-A 에 의해 쥐과 혈청으로부터 포획하였다. 그 후, 포획된 항체를 실시예 12 에서 기재한 바와 같이 비-환원 및 환원 조건 하에 SDS-PAGE 처리하였다. 디술피드-연결 항체-복합체화 Cy5 를 실시예 12 에서 기재한 바와 동일한 방식으로 겔 내 이의 H-사슬 연관 형광에 의해 검출하였다. 도 17 은 항체 사이의 공유 복합체가 혈청 중에서 37℃ 에서 형성된다는 것을 입증한다 (즉, 생체 내 조건과 유사한 조건 하). 이들 복합체는 환원시 예측한 바와 같이 해리되며, 즉 페이로드가 오직 디술피드가 환원되는 경우에만 H-사슬로부터 방출된다 (도 17). 혈청의 존재 하에서도, 합텐-위치결정시 항체와 페이로드 사이의 유도된 디술피드 결합이 형성될 수 있다는 관찰은, 혈청이 높은 양의 단백질, 펩티드 및 기타 화합물 (디술피드-형성 반응을 방해할 수 있는) 을 함유하기 때문에, 예기치 않은 것이다. 합텐-위치결정시 항체와 페이로드 사이의 유도된 디술피드 결합이 혈청 중에서 37℃ 에서 형성될 수 있다는 관찰은 또한, 이러한 PK-조정 시스템을 사전-표적화 설정: 항체 및 합텐-페이로드의 개별 적용, 이후 항체 복합체의 생체 내 어셈블리 및 후속적인 디술피드 형성에 적용하는 가능성을 제공한다.
가능한 생체내 '사전-표적화' 적용을 추가로 평가하기 위해서, 비오틴-Cy5 의 약동학을 실시예 18 에서 기재한 바와 같이 동물 눈의 비-침습성 광학 이미지화 기술에 의해 사전-표적화 조건 하에 측정하였다. 이들 실험에서, Cy5 의 존재를 동물 눈의 광학 이미지화에 의해 비-침습적으로 측정하였으며, 이는 모세관 내 Cy5 의 형광을 밝혀내었다. 비오틴-Cy5 주입 10 분 후 마우스의 눈에서 검출한 Cy5-매개 형광 값을 100% 값으로서 설정하고, 후속 시점에서 측정한 형광값을 이에 관하여 표시하였다. 상기 실험에서, 1 mg 항체 (항-비오틴 항체 또는 항-비오틴 항체-Cys (= 항-비오틴 항체의 Cys-돌연변이체)) 를 비오틴-Cy5 주입 및 눈 이미지화 시작 24 시간 전에 적용하였다. 대조군은 항-비오틴 항체로 사전-주입하지 않았다.
이들 실험 결과를 도 18 에 나타낸다: 사전-주입한 항체를 받지 않은 동물에게의 비오틴-Cy5 주입을 제거하였다 (낮은 혈청 반감기 및 낮은 노출 수준 (다이아몬드형)). 항-비오틴 항체 (cys 돌연변이 없음) 의 24 시간 사전-주입과 함께 동물에게 주입한 비오틴-Cy5 의 혈청 수준 및 반감기는 크게 증가하였다. 이는 항체가 순환계에서 이의 항체 (페이로드를 갖는) 를 포획하며, 항원의 (마찬가지로, 콘쥬게이션된 페이로드의) 혈청 반감기를 연장시킨다는 것을 나타낸다. 항-비오틴 항체-cys (즉, 공유 페이로드 커플링을 위해 본원에 보고한 바와 같은 cys 돌연변이를 포함하는 항체) 를 24 시간 사전-주입한 동물에게 주입한 비오틴-Cys-Cy5 의 상대적 혈청 수준 및 반감기는 심지어 추가로 증가하였다. 이들 샘플에서, 상대적 Cy5 수준은 비-복합체화 화합물의 경우보다 더 높을 뿐 아니라, 복합체화된 (그러나 디술피드-결합되지는 않은) Cy5 의 수준보다 더 높았다. 따라서, 합텐-복합체화 디술피드-연결 페이로드 (이는 생체 내 사전-표적화 조건 하에 형성됨) 는 비-공유 복합화 페이로드보다 순환계에서 더 안정하고 더 높은 노출 수준에 도달할 수 있다.
실시예 10
항-합텐 항체와의 콘쥬게이트 및 복합체 중의 폴리펩티드가 기능성을 유지함
비-공유 합텐-폴리펩티드 콘쥬게이트의 일부이며 항-합텐 항체와의 복합체 중의 폴리펩티드가 기능성을 유지한다는 것을 이미 나타낸 바 있다 (WO2011/003557, WO 2011/003780 및 WO 2012/093068). 커플링된 펩티드가 또한 공유 디술피드-커플링시 기능성을 유지하는 것을 입증하기 위해, 항-디곡시게닌 항체 복합체화 폴리펩티드 및 그의 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 와의 디술피드-콘쥬게이트의 생물학적 활성을 비교하였다.
PYY-유래 펩티드의 치료적으로 바람직한 기능성은 이의 동족 수용체 NPY2 의 신호전달을 방해하고 이에 결합하는 것이다. NPY2 수용체를 통한 신호전달은 대사 과정에 포함되고/되거나 이를 조절한다.
폴리펩티드 Dig-PYY 와 항-디곡시게닌 항체의 복합체화 또는 SS-콘쥬게이션, 또는 폴리펩티드 Dig-Cys-PYY 와 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 의 콘쥬게이션이 각각 이의 활성에 영향을 주는지 여부를 평가하기 위해, NPY2 수용체를 발현하는 HEK293 세포에서의 포스콜린 (Forskolin) 자극 cAMP 축적을 저해하는 이의 능력을 평가하였다 (cAMP 어세이).
하기의 표 6 은 PYY(3-36), 이의 Y2수용체 특이적 변형 유사체 moPYY, 이의 항체-복합체화 Dig-변이체 및 이의 디술피드-콘쥬게이션 Dig-Cys-유도체의 생물학적 활성을 평가하는데 수행한 cAMP-어세이 결과를 나타낸다.
Figure 112016075559978-pct00008

cAMP 아고니스트 어세이를 위해, 하기 재료를 사용하였다: 384-웰 플레이트; Tropix cAMP-Screen 키트; cAMP ELISA 시스템 (Applied Biosystems, 카탈로그 번호 T1505; CS 20000); 포스콜린 (Calbiochem 카탈로그 번호 344270); 세포: HEK293/hNPY2R; 성장 배지: 둘베코 개질 이글 배지 (D-MEM, Gibco); 10% 우태 혈청 (FBS, Gibco), 열-불활성화됨; 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Pen 10000 유닛/mL: Strep 10000 mg/mL, Gibco); 500　μg/mL G418 (Geneticin, Gibco 카탈로그 번호 11811-031); 및 플레이팅 배지: DMEM/F12 w/o 페놀 레드 (Gibco); 10% FBS (Gibco, 카탈로그 번호 10082-147), 열-불활성화됨; 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, 카탈로그 번호 15140-122); 500　μg/mL G418 (Geneticin, Gibco, 카탈로그 번호 11811-031).
어세이를 수행하기 위해, 제 1 일에, 배지를 폐기하고, 단일층 세포를 플라스크 (T225) 당 10 mL PBS 로 세척하였다. PBS 로 디켄팅한 후, 5　mL VERSENE (Gibco, 카탈로그 번호 1504006) 을 사용하여 세포를 제거하였다 (37℃ 에서 5 분). 상기 플라스크를 부드럽게 두드리고 세포 현탁액을 풀링하였다. 각각의 플라스크를 10 mL 플레이팅 배지로 헹구고 1000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하였다. 현탁액을 풀링하고 계수하였다. 현탁액을 HEK293/hNPY2R 에 대해 2.0 x 105 세포/mL 의 밀도로 플레이팅 배지에 재현탁하였다. 50 ㎕ 의 세포 (HEK293/hNPY2R - 10,000 세포/웰) 를 Multi-drop 디스펜서를 사용하여 384-웰 플레이트에 옮겼다. 상기 플레이트를 37℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 제 2 일에, 세포를 75-85% 밀집도에 대해 확인하였다. 배지 및 시약을 실온이 되게 하였다. 희석물을 제조하기 전에, 디메틸 술폭시드 (DMSO, Sigma, cat#D2650) 중 자극 화합물의 저장 용액을 32℃ 로 5-10 분 동안 가온하였다. 희석물을 0.5 mg/mL BSA 및 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴을 갖는 DMEM/F12 (IBMX, Calbiochem, 카탈로그 번호 410957) 중에서 제조하였다. 자극 배지 중 최종 DMSO 농도는 1.1% 였고 이때 포스콜린 (Forskolin) 농도는 5 μM 이었다. 페이퍼 타올 상에 세포 플레이트를 부드럽게 뒤집어, 세포 배지를 털어내었다. 웰 당 50 ㎕ 의 자극 배지를 넣었다 (각각의 농도를 4 반복물로 수행하였음). 플레이트를 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 세포를 독성에 대해 현미경으로 확인하였다. 처리 30 분 후, 자극 배지를 폐기하고 50 ㎕/웰의 어세이 용해 완충액 (Assay Lysis Buffer) (Tropix 키트에서 제공됨) 을 첨가하였다. 플레이트를 45 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 20 ㎕ 의 용해물을 자극 플레이트로부터 Tropix 키트로부터의 사전-코팅된 항체 플레이트 (384-웰) 에 옮겼다. 10 ㎕ 의 AP 콘쥬게이트 및 20 ㎕ 의 항-cAMP 항체를 첨가하였다. 플레이트를 1 시간 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 이후 세척 완충액으로, 각 세척에 대해 웰 당 70 ㎕ 으로 5 회 세척하였다. 상기 플레이트를 두드려 건조시켰다. 30 ㎕/웰의 CSPD/Sapphire-II RTU 기질/인핸서 용액을 첨가하고 45 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다 (진탕). 광도계 (Luminometer) (VICTOR-V) 에서 1 초/웰에 대한 신호를 측정하였다.
이들 어세이 결과 (표 6) 는 변형된 펩티드 유도체 moPYY 가 야생형 PYY 보다 무시할만한 더 낮은 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. cAMP 어세이의 IC50 값은 야생형 PYY 에 대해 0.09 nM 이었고 변형된 유사체에 대해 0.14 nM 이었다. 공유 디술피드-콘쥬게이션으로 인해 생물학적 활성에 있어서 약간의 감소가 있었다. IC50 값은 콘쥬게이트에 대해 5-36 nM 이었다. 놀랍게도 공유 디술피드-콘쥬게이트는 비-공유 복합체보다 2 배 더 활성이었다 (IC50 값 10.91 nM).
실시예 11
비오틴화 Cy5 와 인간화 항-비오틴 항체 VH53C 의 공유 콘쥬게이트와 비교한 비오틴화 Cy5 와 인간화 항-비오틴 항체의 복합체의 혈청 안정성
기재한 펩티드 변형 기술의 목적은 펩티드의 치료적 적용성을 향상시키는 것이다. 펩티드의 치료적 적용성의 주요 장애물은 현재 제한된 생체 내 안정성 및/또는 짧은 혈청 반감기 및 빠른 소거율이다. 형광단의 항체 콘쥬게이트의 PK 파라미터를 생체 내에서 측정하고 비-공유 항체-형광단 복합체의 PK 와 비교하였다. 그러므로, (i) 항-비오틴 항체 VH53C 는 비오틴화 형광단 Biot-Cys-Cy5 에 공유 콘쥬게이션되었고, (ii) 항-비오틴 항체와 비오틴화 형광단 Biot-Cy5 의 비-공유 복합체가 생성되었고, (iii) 공유 콘쥬게이션 및 비-공유 복합체화 화합물을 동물에게 적용하였고, (iv) 이들 동물에서의 시간 흐름에 걸친 화합물의 혈청 농도를 Cy5 의 형광 측정 (A650) 에 의해, 그리고 인간화 항체를 특이적으로 검출하는 ELISA 방법에 의해 상응하는 항체에 측정에 의해 측정하였다.
실험 절차
작은 형광 기질의 항체-복합화의 PK 파라미터에 대한 영향을 분석하기 위해, 13 nmol 의 Cy5-비오틴/인간화 항-비오틴 항체 VH53C-콘쥬게이트, 또는 상응하는 항체 비-공유 복합체화 화합물, 또는 형광 화합물 단독을, 20 mM 히스티딘 / 140 mM NaCl, pH 6.0 중에서, 각각의 성분에 대해 6 마리 암컷 마우스 (NRMI 계통) 에 적용하였다. 약 0.1 ml 혈액 샘플을 하기 시점 이후에 수집하였다: 제 1 군에서의 마우스 1, 2 및 3 에 대해 0.08 시간, 4 시간 및 48 시간, 및 제 2 군에서의 마우스 1, 2 및 3 에 대해 0.08 시간, 24 시간 및 72 시간. 50 ㎕ 이상의 혈청 샘플을 실온에서 1 시간 후에 원심분리 (9300 x g, 3 분, 4℃) 에 의해 수득하였다. 혈청 샘플을 -80℃ 에서 보관하였다.
주어진 시점에서의 혈청 중 화합물의 양을 측정하기 위해, Cy5 의 형광 특성을 사용하였다: 혈청 샘플 중 Cy5 관련 형광을 Cary Eclipse 형광 분광광도계 (Varian) 를 사용하여 실온에서 120 ㎕ 석영 큐벳에서 측정하였다. 여기 파장은 640 nm 이고, 방사를 667 nm 에서 측정하였다. 혈청 샘플을 1 x PBS 중에서 희석하여 적절한 범위의 방사 강도에 도달하게 하였다. 각각의 샘플로서 1 x PBS 중에서의 동일 희석물로의 미처리 마우스의 혈액 혈청을 블랭크 프로브로 사용하였으며, 이는 어떠한 형광 신호도 나타내지 않았다.
도 7 은 공유 콘쥬게이트, 비-공유 복합체 및 비-복합체화 합텐-Cy5 를 이용하는 분석의 결과를 나타낸다. 데이터를 주입 5 분 후 (피크) 혈청 수준에 대해 정규화된 Cy5-매개 형광의 상대적 (%) 수준으로서 나타낸다. 다소 작은 분자량의 화합물에 대해서, 비-복합체화 비오틴-Ser-Cy5 는 혈청으로부터 빠르게 사라진다. 주입 1 시간 후, 혈청 중에 적용되고 5 분 후 검출가능한 형광의 단지 6% 만이 아직 검출가능하였다. 이후 시점에서, 주입하고 2 시간, 4 시간 및 24 시간 후, Cy5-매개 신호는 검출가능하지 않았다.
주입 4 시간 후 항체-복합체화 화합물 중에서, 적용된 형광 (5 분 수준을 100% 로 설정) 의 대략 50% 가 혈청 중에서 아직 검출가능하였다. Cy5-매개 형광 수준은 또한 이후 시점에서 검출가능하였는데, 주입 2 시간 후 5 분 값의 22% 가 검출가능하였고 주입 48 시간 후 대략 12% 가 검출가능하였으며 72 시간 후 8% 가 여전히 검출가능하였다. 항체-콘쥬게이션 화합물은 항체-복합체화 화합물보다 유의하게 더 긴 생체 내 반감기를 나타낸다. 주입 4 시간 후, 적용된 형광 (5 분 수준을 100% 로 설정) 의 58% 가 혈청 중에서 아직 검출가능하였다 (항체-복합체화 화합물에 대해 1.16 인자 (factor) 더 높음). 24 시간 후 35% (1.6 인자), 48 후 31% (2.6 인자) 및 72 시간 후 26% (3.3 인자) 의 Cy5-매개 형광이 혈청 중에서 검출되었다. 실험 첫 24 시간 내의 복합체화된 및 콘쥬게이션된 화합물에 대한 형광의 유사한 감소는, 초기 분포가 복합체 및 콘쥬게이트에 대해 유사한 것이 이유가 될 수 있다. 24 시간 후 항체-콘쥬게이션 화합물의 생체 내 안정성의 차이에 있어 이유가 된다.
주어진 시점에서의 혈청 중 인간 IgG 항체의 양을 측정하기 위해, 하기의 어세이 원리를 사용하였다: 혈청 샘플 중 인간 IgG1 항체를 항-인간 카파-사슬 모노클로날 IgG 항체로 코팅된 고체 상 (Maxisorb® 마이크로타이터 플레이트, NUNC-ImmunoTM) 에서 포획하였다. 혈청 샘플을 1:105 및 1:106 로 희석하고 이들 희석물의 100　㎕ 를 웰에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 웰을 300 ㎕ PBS/0.05% Tween 20 으로 각각 3 회 세척하였다. 먼저, 0.25 ㎍/ml 의 농도에서 C-말단에서 디곡시게닌화되는 100 ㎕ 의 항-인간 CH1-도메인 IgG 을 첨가하여 인간 IgG 항체 검출을 실행하였다. 300 ㎕ 의 1 x PBS/0.05% Tween 20 각각으로 3 회 세척한 후, 호스-래디시 퍼옥시다아제 (HRP) 에 콘쥬게이션된 항-디곡시게닌 항체 Fab-단편 100 ㎕ 를 25 mU/ml 의 농도에서 첨가하였다. 마지막으로, 웰 당 100 ㎕ 의 ABTS® 를 첨가하였다. 주위 온도에서 30 분 인큐베이션한 후, 흡광 (OD) 을 시판 마이크로타이터 플레이트 ELISA 판독기 (예를 들어 Tecan Sunrise) 에서 405 nm 및 492 nm [405/492] 에서 측정하였다.
도 7 은 항체-비오틴-Cy5-복합체 및 -콘쥬게이트로 처리한 마우스에서의 인간 IgG 의 혈청 수준 뿐 아니라 Bio-Cy5 혈청 수준을 나타낸다. 데이터는 주입 5 분 후 (피크) 혈청 수준에 대해 정규화된 상대적 (%) 인간 IgG 수준으로서 제시된다. 항체-합텐-복합체 및 -콘쥬게이트 모두의 상대적 인간 IgG 혈청 수준은 항체-합텐 콘쥬게이트에 대해 측정한 상대적 형광과 일치한다. 따라서, 비오틴-Cys-Cy5 화합물은 이에 콘쥬게이션되는 항체와 유사한 생체 내 안정성을 나타내는데, 이것은 항체-합텐 콘쥬게이트가 생체 내에서 미손상으로 남아있다는 것을 의미한다. 이는 명백히, 상대적 Cy5-매개 형광이 상대적 인간 IgG 혈청 수준보다 빠르게 감소하는 항체-합텐 복합체에 대한 경우가 아니다. 이는 복합체가 생체내에서 시간 흐름에 따라 페이로드를 방출한다는 것을 의미한다.
요약하면, 합텐화된 화합물의 생체 내 안정성은 항-합텐 항체에 의해 결합된 경우 유의하게 증가한다. 그러나, 합텐-Cy5 혈청 수준의 감소가 항체 혈청 수준의 감소보다 더 빠르기 때문에 항체-합텐 복합체가 생체 내에서 완전히 안정한 것은 아니다. 이는 정상 IgG 항체와 유사한 생체 내 거동을 나타내는 항체-합텐-Cy5 콘쥬게이트에 대한 경우는 아니다.
Dig-펩티드 혈청 동력학 (비-공유 복합체 및 공유 콘쥬게이트의 비교)
디곡시게닌화 폴리펩티드의 항체-복합체화 및 항체 콘쥬게이션의 PK 파라미터에 대한 영향을 분석하기 위해, 32.1 nmol 의 폴리펩티드, 또는 상응하는 항체 비-공유 복합체화 폴리펩티드를 20 mM 히스티딘 / 140　mM NaCl pH 6.0 중에서 각각의 성분에 대해 2 마리의 암컷 마우스 (NRMI 계통) 에 적용하였다. 마우스의 체중은 MAK-DIG-PYY 에 대해서 23 g 및 25 g, 그리고 DIG-PYY 에 대해서 28　g 및 26　g 이었다. 약 0.1 ml 혈액 샘플을 하기 시점 후 수집하였다: 마우스 1 에 대해 0.08 시간, 2 시간 및 24 시간, 및 마우스 2 에 대해 0.08 시간 4 시간 및 24 시간. 40 ㎕ 이상의 혈청 샘플을 실온에서 1 시간 후 원심분리 (9300 x g, 3 분, 4℃) 에 의해 수득하였다. 혈청 샘플을 -80℃ 에서 보관하였다.
주어진 시점에서의 혈청 중 디곡시게닌화 펩티드의 양을 측정하는 것은 Dig-Cy5 의 검출에 비해 어려운데, 이는 혈청 샘플 중 폴리펩티드를 검출하기 위한 직접적인 수단이 이용가능하지 않았기 때문이었다. 그러므로, 혈청 중 디곡시게닌화 펩티드를 검출하기 위한 웨스턴-블롯 관련 어세이를 성립하였다. 제 1 단계에서, 혈청 샘플을 환원 SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 샘플 제제가 고농도의 SDS 및 환원제에 대한 혈청의 노출을 포함하였기 때문에, 복합체화 Dig-폴리펩티드 콘쥬게이트가 (완전히 변성/미폴딩된) 항-디곡시게닌 항체로부터 방출될 수 있는 반면, 공유 콘쥬게이트는 결합한 채로 남아 있다. 비-공유 항체 복합체로부터의 폴리펩티드 방출을 매개하고 SDS-PAGE 에 의해 개별적 성분을 분리하기 위해, 2 ㎕ 의 각 혈청 샘플을 18 ㎕ 20 mM 히스티딘 / 140 mM NaCl pH 6.0 중에서 희석하고, 6.7 ㎕ 의 4x LDS 샘플 완충액 및 3 ㎕ 의 10x 샘플 환원제 (NuPAGE, Invitrogen) 를 5　분 동안 95℃ 에서 혼합하였다. 대조군으로서, 동일 계통의 미처리 마우스의 혈청 2 ㎕ 를 사용하였다. 샘플을 4-12% 비스-트리스 겔 (NuPAGE, Invitrogen) 에 적용하고 이를 실행 완충액으로서 1xMES (Invitrogen) 를 사용하여 200 V/120 mA 에서 20 분 동안 실행하였다. 이후, 분리된 폴리펩티드를 XCell Sure Lock® Mini-Cell 시스템 (Invitrogen) 을 사용하여 40 분 동안 25 V/130 mA 에서 PVDF 멤브레인 (0.22 μm 공극 크기, Invitrogen) 에 블롯팅하였다. 멤브레인을 1 x PBS + 1% Tween20 (PBST) 중 1% 탈지유로 1 시간 동안 실온에서 블로킹하였다. 디곡시게닌화 폴리펩티드를 이후, 항-디곡시게닌 항체로 멤브레인 상에서 검출하였다. 이를 위해, 항-디곡시게닌 항체를 2 시간 동안 실온에서 10 ml 의 1% 탈지유/PBST 중 13 ㎍/ml 의 농도로 멤브레인에 적용하였다. 멤브레인을 1 x PBST 중에서 3 x 5 분 세척하였다. LumiLightPLUS 웨스턴 블롯팅 키트 (Roche) 로부터의 POD 에 커플링된 항-마우스 IgG Fab-단편을 1 시간 동안 실온에서 10 ml 의 1% 탈지유/PBST 중 1:25 희석물로 적용하였다. 멤브레인을 1 x PBST 로 3 x 5 분 세척하였다. 4 ml LumiLight 웨스턴 블롯팅 기질 중에서 멤브레인을 5　분 동안 실온에서 인큐베이션하여, 검출을 실행하였다. 20 분의 노출 시간으로, LumiImager F1 (Roche) 으로 화학발광을 검출하였다.
이들 분석 결과를 도 8 A 및 B 에서 나타낸다. 상이한 시점에서의 쥐 혈청 중의 디곡시게닌 폴리펩티드의 존재/양을 측정하였다. 항체 복합체화 펩티드를 주입받은 마우스 (도 8 좌측) 는 초기 시점 (투여 5 분 후) 에서 강한 신호를 나타내었다. 이들 신호는 대조군의 블롯 상의 크기 및 위치에 의해 나타낸 바와 같이 명백히 지정가능하였다. 항체-복합체화 폴리펩티드로 처리한 마우스의 혈청에서, 폴리펩티드-연관 신호는 초기 시점에서 가장 강했고 시간 흐름에 따라 감소하였다. 그럼에도 불구하고, 폴리펩티드는 모든 시점 및 심지어 투여 24 시간 후에도 여전히 양호한 신호로 검출가능하였다.
비-복합체화 폴리펩티드를 주입받은 마우스에서, 심지어 초기 시점에서도 소규모 폴리펩티드에 연관가능한 임의의 신호가 거의 검출될 수 없었다. 도 8 은 정상적인 노출 조건 하인 우측에서, 유리 폴리펩티드가 블롯 상에서 보이지 않는다는 것을 나타낸다. 블롯의 대비 강조 (Contrast enhancement) 로, 투여 5 분 후 일부 폴리펩티드의 존재가 밝혀졌으나, 이는 단지 미량이었다. 이후 시점에서, 규정된 폴리펩티드는 검출될 수 없었다.
비-복합체화 폴리펩티드가 마우스의 혈청에서 매우 짧은 반감기를 갖는다는 것을 볼 수 있다. 동일한 폴리펩티드이나 항체 복합체화 형태로 주입받은 마우스는 증가하는 시간 기간 동안 혈청 중에서 이러한 폴리펩티드의 존재를 나타낸다. 주입 24 시간 후, 폴리펩티드는 이들 마우스의 혈청 중에서 측정될 수 있다.
실시예 12
공유 연결된 디곡시게닌-항체 복합체 및 디곡시게닌-결합 IgG 의 혈청 반감기
공유 복합체화가 비-공유 연결된 합텐 복합체를 고려하여 PK-특성을 추가로 향상시키는지를 분석하기 위해서, 항-디곡시게닌 항체-디곡시게닌-Cy5 복합체 뿐 아니라 공유 연결된 [항-디곡시게닌 항체-Cys]-[디곡시게닌-Cys-Cy5] 콘쥬게이트의 PK 파라미터를 생체 내에서 측정하였다. 따라서, 디곡시게닌-Cy5 를 이의 형광 (A650) 을 사용하여 측정하고, 상응하는 항체를 인간화 항체를 특이적으로 검출하는 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 그의 형광 특성이 혈청 중에서 용이하고 정확한 검출을 가능하게 하므로, 디곡시게닌-Cy5 를 합텐-커플링된 펩티드에 대한 저분자량 '대리물' 로서 적용하였다.
비오틴-Cy5 또는 비오틴-Cys-Cy5 (실시예 16 참고) 에 대해 기재한 바와 동일한 방식으로, 디곡시게닌-Cy5 또는 항체-복합체화 또는 부가적으로 항체-cys-연결 디곡시게닌-Cy5 를 암컷 NRMI 마우스에 정맥내 주입한 후, 0.08 시간, 2 시간, 4 시간 및 24 시간에서 혈액을 수집하였다. 주입 5 분 후 (t = 0.08 시간) 마우스 모두에서/모두에 대해 측정된 Cy5-매개 형광값을 100% 값으로서 설정하고 이후 시점에서 측정한 형광값을 이에 관하여 표시하였다.
이들 실험 결과는, 디곡시게닌-Cy5 에 대해 적용된 형광 (5 분 값) 의 10% 미만이 주입 2 시간 후 검출가능하였다는 것을 입증한다. 이후 시점, 각각 주입 4 시간 및 24 시간 후, Cy5-매개 신호는 검출가능하지 않았다 (도 14 참고). 비-복합체화 화합물에 반대로, 항체-복합체화 화합물은 훨씬 더 높은 수준 및 이후 시점에서 검출가능하였다 (도 14). 이는 항체 복합체화가 소 화합물 디곡시게닌-Cy5 의 혈청 반감기를 유의하게 증가시킨다는 것을 나타낸다. 또한, 공유 연결된 페이로드는 비-공유 연결된 복합체에 비해 더 큰 PK 연장을 나타낸다. 디곡시게닌-Cy5 수준 및 항체 수준의 직접적인 비교는, 시간의 흐름에 따라 항체로부터의 페이로드 손실을 나타내었으며, 이때 Cy5 수준은 항체 수준보다 빠르게 감소한다. 이와 반대로, 공유 연결된 디곡시게닌-콘쥬게이트는 거의 동일한 Cy5 및 IgG 혈청 반감기를 나타내었다 (도 14). 이는 디술피드-연결 페이로드가 항체에 안정적으로 결합된 채 남아있는 한편 비-공유 복합체는 시간 흐름에 따라 해리된다는 것을 나타낸다.
실시예 13
공유 연결된 합텐-항체 복합체 및 합텐-결합 부위를 통해서만 부착되는 복합체의 혈청 반감기 및 노출 수준
공유 복합체화가 비-공유 연결된 합텐 복합체의 PK-특성을 개선시키는 지를 분석하기 위해, 항-비오틴 항체와 비오틴-Cy5 의 복합체 뿐 아니라 공유 연결된 콘쥬게이트 [항-비오틴-항체-Cys]-[비오틴-Cys-Cy5] 의 생체내 PK 를 측정하였다. Cy5 의 존재를 동물 눈의 광학적 이미지화에 의해 비-침습식으로 측정하였으며, 이는 모세관 내 Cy5 의 형광을 밝혀내었다. 주입 10 분 후 마우스 눈에서 검출한 Cy5-매개 형광 값을 100% 값으로 설정하고, 이후 시점에서 측정한 형광 값을 이에 관하여 표시하였다. 이들 실험 결과를 도 15 에 나타내며: 비-복합체화 비오틴-Cy5 그 자체는 낮은 혈청 반감기 및 낮은 노출 수준을 갖는다. 공유 연결되지 않은 항체-복합체화 화합물은 훨씬 더 높은 수준에서 및 연장된 반감기로 검출가능하였다. 또한, 공유 연결된 페이로드는 비-공유 연결된 복합체에 비해 더 큰 PK 연장 및 더 높은 혈청 수준을 나타내었다. 이는 합텐-복합체화 디술피드-연결 페이로드가 비-공유 복합체화 페이로드보다 순환계에서 더 안정하며, 더 높은 노출 수준에 도달할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 14
상이한 합텐에 결합하는 항체와의 펩티드-복합체화 및 공유 콘쥬게이션
합텐화된 화합물 (=　페이로드) 을 표적화 비히클에 커플링시키기 위한 합텐 결합 모듈의 적용은, 이에 의해 합텐-매개 전달이 실현될 수 있는 하나의 기술적 가능성이다. 상기 개념은 화합물을 포획하고 이들을 표적화 모듈에 연결시키는 추가의 합텐 또는 기타 개체에 확장될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 전달 또는 안정화를 위해, 디곡시게닌 또는 기타 합텐에 결합하는 모노- 또는 이특이적 항체가 적용되어 치료적 폴리펩티드를 안정화시키고 PK-최적화시킬 수 있다.
폴리펩티드 포획 모듈로서의 적용을 위한 전제 조건은 (i) 합텐에 대한 화합물의 커플링이 폴리펩티드 활성을 심각하게 방해하지 않는 것, 및 (ii) 합텐화 화합물에 대한 항체의 효과적 결합/복합체화의 가능성이다.
합텐-지정 결합은 합텐화 염료 또는 폴리펩티드와 항-합텐 시스테이닐화 항체의 효율적인 공유 커플링을 위한 전제 조건이다.
합텐화된 화합물과 항-합텐 항체의 친화성 유도 복합체화가 효율적 디술피드-결합 형성을 위한 전제 조건임을 나타내기 위해, 비오틴-Cys-Cy5 를 인간화 항-디곡시게닌 항체 및 인간화 항-디곡시게닌 항체 VH53C 와 함께 인큐베이션하였다. 대조군 반응으로서 비오틴-Cys-Cy5 를 인간화 항-비오틴 항체 및 인간화 항-비오틴 항체 VH53C 와 함께 인큐베이션하였다.
0.13 mg 의 비오틴-Cys-Cy5 를 10　mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 0.7 mg 의 각 항체를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 6.7 mg/ml (약 46　μM) 의 농도로 사용하였다. 비오틴-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-비오틴-Cys-Cy5 대 항체) 로 혼합하고, 60 분 동안 실온에서 350 rpm 에서 진탕하여 인큐베이션하였다. 산출된 복합체/콘쥬게이트를 SDS-PAGE 및 후속적인 폴리아크릴아미드-겔 중 Cy5-관련 형광 검출에 의해 추가 분석하였다. 15　㎍ 의 복합체/콘쥬게이트를 4x LDS 샘플 완충액 (Invitrogen) 과 혼합하고 95℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. Cy5-관련 형광을 여기 파장 645　nm 에서 LumiImager F1 장비 (Roche) 를 사용하여 기록하였다.
비-환원 샘플은, CDR2 내에 시스테인을 갖지 않는 인간화 항-비오틴 항체를 사용한 경우 (도 36, 레인 3) 매우 낮은 백그라운드 형광 신호로 인간화 항-비오틴 항체 VH53C 에 대한 공유 부위-특이적 디술피드 결합 형성을 나타낸다 (도 36, 레인 4). 비오틴-Cys-Cy5 는 또한, 인간화 항-디곡시게닌 항체를 사용한 경우 (도　36, 레인 1) 낮은 백그라운드 신호로, 그러나 유의하게 낮은 효율로 인간화 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 에 대해 공유 커플링되었다 (도 36, 레인 2). 이는 겔 하부에서 검출되는 과량의 비오틴-Cys-Cy5 로부터 추론될 수 있다 (화살표). 인간화 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 의 경우 인간화 항-비오틴 항체 VH53C (레인 4) 보다 유의하게 더 미커플링된 비오틴-Cys-Cy5 가 검출될 수 있다 (레인 2). 샘플 환원시, 항체 중쇄 및 경쇄 근처에서 Cy5-관련 형광은 검출가능하지 않은데, 이는 공유 연결이 실제로 디술피드 브릿지에 의해 형성되었다는 것을 나타낸다. 각 겔의 쿠마시 염색은 각 레인에서의 단백질 총량이 동일하였다는 것을 나타낸다.
실시예 15
합텐-유도 결합은 합텐화 염료 또는 폴리펩티드와 항-합텐 시스테이닐화 항체의 효율적인 공유 커플링을 위한 전제 조건임
합텐화된 화합물과 항-합텐 항체의 친화성-유도 복합체화가 효율적인 디술피드-결합 형성을 위한 전제 조건임을 보여주기 위해, 비-합텐화 펩티드 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2) (Biosynthan 1763.1, SEQ ID NO: 178) 를 인간화 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 및 인간화 항-디곡시게닌 항체와 함께 인큐베이션하였다. 1.4 mg 의 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2) 를 10 mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 용해하였다. 2 mg 의 각 항체를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 구성된 완충액 중 11-13 mg/ml (약 75-89　μM) 의 농도로 사용하였다. Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2) 및 항체를 2.1:1 몰비 (Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2) 대 항체) 로 혼합하였다. 용액을 교반 막대를 사용하여 500 rpm 에서 교반하면서 펩티드를 3 회분으로 첨가하였다. 각각의 첨가 사이에, 샘플을 5 분 동안 200 rpm 에서 인큐베이션하였다. 마지막 분량을 첨가한 후, 샘플을 1 시간 동안 RT 및 200 rpm 에서 인큐베이션하였다.
산출된 복합체/콘쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피를 통해, Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2): 인간화 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 콘쥬게이트에 대해 3% 이량체 가용성 응집물 및 97% 단량체 IgG-유사 분자로서, 그리고 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2): 인간화 항-디곡시게닌 항체 복합체에 대해 100% 단량체로서 규정하였다. 또한, 산출된 복합체/콘쥬게이트를 질량 분석법에 의해 분석하였다. Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2): 인간화 항-디곡시게닌 항체 VH52bC 콘쥬게이트에 대해, 검출된 종류의 17% 가 2 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 51% 가 1 개 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 32% 가 커플링된 펩티드를 갖지 않는 항체로서 확인되었다. Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2): 인간화 항-디곡시게닌 항체 복합체에 대해, 항체의 100% 가 미커플링되었다.
실시예 16
공유 페이로드 커플링을 위해 시스테인 돌연변이를 갖는 적절히 폴딩된 기능적 합텐-결합 항체의 형성에 필요한 디술피드 패턴
공유 화합물/페이로드 커플링을 위한 합텐-결합 모듈은 합텐화된 화합물/페이로드의 공유 부착을 가능하게 하는 추가의 시스테인을 함유하는 IgG 와 같은 '표준' 항체로 구성될 수 있다. 본원에 보고된 방법은 필요한 기능성 (시스테인) 을 폴딩된 도메인 내에 도입하는데, 이의 구조 및 서열은 항체 기능성에 대한 기초를 제공한다. 항체의 도메인 내 뿐 아니라 도메인 사이에 규정된 디술피드 결합이 올바르게 형성되는 것은 올바른 구조 및 기능성의 형성 및 유지에 필수적이다. 도 10(A) 는 미변형된 항체의 Fab 와 같은 기능적 결합 분지 (arm) 를 형성하는데 필요한 디술피드 패턴을 나타내고, 도 10(B) 는 VH52cB/VH53C 돌연변이화 항체 유도체의 구조 및 기능성을 유지하는데 필요한 디술피드 패턴을 나타낸다. 적절한 디술피드 패턴을 유지하기 위해, VH 도메인에 도입되었던 부가적인 시스테인이 미점유되어야 하며 이웃 시스테인을 간섭하거나 이와 반응해서는 안된다. 도 10(C) 및 10(D) 는 추가의 시스테인 첨가가 이러한 분자의 생합성 동안 VH 도메인 내 올바르지 않은 디술피드를 형성할 가능성을 생성시킨다는 것을 나타낸다. VH52bC/VH53C 위치가 VH 도메인 내에 위치한다는 (그리고 다른 시스테인에 꽤 가깝다는) 사실은 중쇄의 생합성 동안 올바르지 않은 디술피드가 형성될 수 있는 위험성을 악화시킨다. 또 다른 잠재적 문제점은 VH 및 VL 도메인이 분비 경로 내에서 하나의 Fv 단편으로 어셈블리되는 것이다. 분비 경로는 산화환원-셔플링 조건 및 디술피드 형성 및 셔플링 효소를 포함한다. 따라서, VH52bC/VH53C 돌연변이를 첨가하여 올바르지 않은 디술피드를 도입하는 잠재력이 또한 경쇄의 디술피드에 '확산' 될 수 있다 (예시적으로 도 10(E) 에 나타냄). 이는 부적절하게 폴딩된 비-기능적 분자를 수득하고/생성할 위험성을 더 증강시킨다. 따라서 이러한 위험성에도 불구하고 VH52bC/VH53C 돌연변이를 함유하는 양호한 양의 동종의 기능적 항체 유도체가 발현되고 수득될 수 있으며, 합텐화된 화합물/페이로드에 공유 결합될 수 있다는 것은 상당히 놀라운 것이다.
실시예 17
공유 커플링을 위해 시스테인 돌연변이를 갖는 항-합텐 디술피드-안정화 단일-사슬 Fv 단편의 조성물 및 생성
공유 화합물/페이로드 커플링을 위한 합텐-결합 모듈은 IgG 와 같은 '표준' 항체로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 이들은 변형된 개체 예컨대 재조합 Fv 또는 Fab 단편, 또는 이의 유도체일 수 있다. 단일-사슬 Fv 단편은 종종 전체 길이 항체에 대한 대안으로서, 특히 작은 모듈 크기가 필요하거나, 또는 부가적인 결합 모듈이 이특이적 또는 다중특이적 항체 유도체 생성에 요구되는 적용물에서 적용된다. 생성된 항-합텐 Fv-유래 개체의 한 예는 디곡시게닌화 화합물/페이로드에 결합하고 공유적으로 연결되는 디술피드-안정화 단일-사슬 Fv 이다. 항-디곡시게닌 항체 VH 및 VL 도메인을 유연성 Gly 및 Ser 풍부 링커를 통해 서로 연결시켜, Dig-결합 특이성을 갖는 디술피드-안정화 단일-사슬 Fv 를 생성시켰다. 이들 VH 및 VL 도메인은 VH 의 위치 44 및 VL 의 위치 100 (Kabat et al. 에 따른 위치) 에서의 부가적인 시스테인 돌연변이에 포함된다. 이들 부가적인 시스테인은 VH 와 VL 사이에 안정한 분자간 디술피드 결합을 형성한다. 이는 이전에 기재된 바와 같이 scFv 를 안정화시킨다 (예를 들어 Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245).
이에 추가로, 또 다른 시스테인을 각각 위치 52b 또는 53 (Kabat 번호지정에 따름) 에서의 VH 내에 도입하여, 공유 결합 기능성을 Fv 단편에 부가하였다.
그러나, 이러한 돌연변이를 디술피드-안정화 Fv 단편에 도입하는 것은 이들을 전체 길이 항체에 위치시키는 것보다 한층 더 도전적인 일이다. 단일 사슬 Fv 단편은 본질적으로 전체 길이 IgG 또는 Fab 단편보다 덜 안정한데, 이는 이들이 안정화 및 이형이량체 촉성 개체로서 불변 도메인이 결핍되어있기 때문이다. 안정성은 부가적인 시스테인 돌연변이를 Fv 예컨대 VH44-VL100 디술피드에 위치시킴으로써 부여될 수 있다. 그러나, 이러한 안정화 원리는 디술피드가 올바른 시스테인 사이의 올바른 위치에서 형성되는 경우에만 작용한다. 따라서 규정된 도메인내 디술피드 (VH 에서 하나, 및 VL 에서 하나) 에 추가로, 하나의 단일한 규정된 올바른 도메인간 디술피드가 형성될 필요가 있다. 매치되지 않은 시스테인 사이의 디술피드 연결은 잘못 폴딩된 불안정하고 비-기능적인 개체를 생성시킬 것이다. 디술피드-안정화된 Fv 단편이 6 개 시스테인을 함유한다는 것을 고려하여, 21 개의 상이한 디술피드 연결이 이론적으로 형성될 수 있으나, 오로지 3 개의 규정된 디술피드의 올바른 조합만이 기능적인 안정화된 dsscFv 를 형성할 것이다. 이러한 도전 과제는 또 다른 유리 시스테인을 VH 도메인 내에 첨가시 악화된다. 바람직한 안정화된 dsscFv 는 2 개의 규정된 도메인내 디술피드 (VH 및 VL 에 각각 하나), 1 개의 규정된 도메인간 디술피드 (VH 와 VL 사이), 및 또한 합텐화된 화합물/페이로드 커플링을 위한 1 개의 유리 시스테인 (위치 52b/53 에서의 VH 에) 을 함유한다. 공유 커플링을 위해 추가 시스테인 돌연변이를 갖는 디술피드-안정화된 Fv 단편이 7 개 시스테인을 함유한다는 것을 고려하여, 많은 상이한 디술피드 연결이 이론적으로 형성될 수 있으나, 오로지 VH52b/VH53 에서 정확한 유리 시스테인 위치를 갖는 3 개의 규정된 디술피드의 올바른 조합만이 기능적인 안정화된 공유 커플링 적격 dsscFv 를 생성시킬 것이다. 하나의 부가적인 도전 과제는 부가적인 유리 시스테인 (VH52b/VH53) 이, 자연 발생적 시스테인이 아니라 디술피드 안정화를 위해 도입된 돌연변이인 VH44 시스테인에 근접하게 위치한다는 점이다. VH44C 는 올바른 도메인간 디술피드를 형성하기 위해 필요하며, 이러한 디술피드는 이러한 이론에 속박됨이 없이, VH 및 VL 의 독립적 폴딩 및 어셈블리 후 형성될 가능성이 있다. VH44C 및 VH52bC/VH53C 의 근접성은 도메인내 디술피드가 올바른 방식으로 형성되지 않는 위험성을 악화시킨다. 그러나, 디곡시게닌에 결합하며 동시에 디곡시게닌화 페이로드에 공유 연결될 수 있는 기능적 디술피드 안정화된 단일-사슬 Fv 모듈이 생성될 수 있다는 것이 발견되었다. 올바른 디술피드 및 유리 시스테인을 올바른 위치에 함유하는 디술피드-안정화된 단일-사슬 Fv 분자의 조성물 및 바람직하지 않은 올바르지 않게 폴딩된 분자에 대한 이의 비교를 도 11 에 나타낸다. VH52bC 돌연변이 Fv 항체 유도체를 갖는 상기 Dig-결합 dsscFv 의 경쇄 가변 영역 및 변형된 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 SEQ ID NO: 190 (VH) 에, 그리고 상응하는 VL 을 SEQ ID NO: 189 에 나열한다. 이특이적 항체 유도체 생성을 위한 모듈로서 이러한 dsscFv 의 성공적 생성을 실시예 23 (하기) 에서 뿐 아니라 도 13(A), 도 13(B), 및 도 13(C) 에 기재한다.
실시예 18
공유 커플링된 화합물/페이로드의 표적화 전달을 위한 이특이적 항-합텐 항체 유도체의 조성물, 발현 및 정제
공유 화합물/페이로드 커플링을 위해 합텐-결합 항체 모듈을 함유하는 이특이적 항체를 생성시켰다. 이들 항체는 다른 항원에 대한 표적화를 가능하게 하는 결합 모듈을 추가로 함유한다. 이러한 이특이적 항체에 대한 적용은 합텐화 화합물/페이로드의, 표적화 항원을 운반하는 세포 또는 조직에 대한 특이적 표적화를 포함한다. 생성된 이러한 분자의 한 예는 종양 연관 탄수화물 항원 LeY 를 인지하는 결합 영역, 및 디곡시게닌화 화합물/페이로드에 결합하고 공유 연결되는 디술피드-안정화 Fv 를 동시에 갖는 이특이적 항체이다. 그러므로, 디술피드-안정화 단일 사슬 Fv 는 유연성 Gly 및 Ser 풍부 커넥터 펩티드를 통해 LeY 항체의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되어, 2 개 LeY 결합 분지 및 부가적으로 2 개의 디곡시게닌 결합 개체를 갖는 4원자가 분자가 생성된다. 디곡시게닌-결합 개체는 이전에 기재된 VH44-VL100 디술피드 결합을 포함하였다 (예를 들어, Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245). 디곡시게닌 결합 개체는 추가로 공유 커플링을 위해 VH52bC 돌연변이를 포함하였다. 이러한 LeY-Dig 항체 유도체의 경쇄 및 변형된 중쇄를 인코딩하는 서열을 SEQ　ID　NO: 191 및 SEQ ID NO: 192 에 열거한다. 공유 커플링된 화합물/페이로드를 위한 전달 비히클로서 LeY-Dig 이특이적 항체 유도체의 조성물을 도 12 에서 개략적으로 나타낸다.
이특이적 분자를 상기 기재한 바와 동일한 방식으로 분자 생물학적 기술에 의해 발생시키고, 배양된 세포로부터의 분비에 의해 발현시키고, 이후 배양물 상청액으로부터 정제하였다. 도 13(A) 는 세포 배양물 상청액 중의 상기 LeY-Dig (52bC) 이특이적 항체의 변형된 H-사슬 및 L-사슬의 존재를 보여주며, 이는 항체 L-사슬 및 H 사슬을 검출하는 웨스턴 블롯 분석에서 가시화되었다. 도 13(B) 는 환원제의 존재 하 SDS-PAGE 에 의한 정제 후 이들 항체의 동질성을 입증한다. 쿠마시 브릴리언트 블루로의 SDS-PAGE 염색은 그의 계산된 분자량과 유사한 명백한 분자 크기를 갖는 IgG 와 관련된 폴리펩티드 사슬을 가시화한다. 도 13(C) 는 단백질 A 정제 후 LeY-Dig(52bC) 이특이적 항체의 SEC 프로파일을 보여주는데, 이는 단백질 제제 중의 응집물의 결핍 및 균질성을 입증한다. 따라서, 표적화 모듈 뿐 아니라 합텐화 화합물/페이로드의 공유 커플링을 위한 모듈을 포함하는 이특이적 항체가 생성되고 균질하게 정제될 수 있다.
실시예 19
바이오시티나미드와의 복합체 중 쥐과 항-비오틴 항체-Fab-단편의 X-선 구조 측정
쥐과 항-비오틴 항체 Fab-단편의 단백질 구조를 바이오시티나미드와의 복합체 중에서 측정하였다. 따라서, Fab-단편의 결정을 0.8 M 숙신산 중에서 성장시키고, 이후 비오사이티딘아미드 (결정화 용액 중 10 mM 작동 농도로 희석하고, 결정화 액적으로 결정에 적용됨) 로 항체 결정을 하전시켰다. 결정을 2 ㎕ 의 10 mM 비오사이티딘아미드 용액으로 3 회 세척하고, 최종적으로 16 시간 동안 비오사이티딘아미드와 함께 21℃ 에서 인큐베이션하고, 동결보호제로서 15% 글리세롤로 수확하고, 액체 질소 중에서 급속 냉동하였다. 처리된 회절 이미지로, 2.5Å 분해능에서 단백질 구조가 산출되었다. 비오틴-결합 가변 영역의 구조 및 하전 조성물을 도 19 에 제시한다: 비오틴은 CDR 영역으로부터의 아미노산으로 구성된 하전 영역의 측면에 위치하는 표면 포켓 내에 결합한다. 복합체화된 합텐은 아미노산의 음으로 하전된 클러스터에 근접하게 위치한다. 합텐으로서 이의 카르복실기에서 페이로드 커플링을 위해 유도체화되는 비오틴은 상기 위치에서 전하 반발이 없기 때문에 (COOH 기의 결여로 인함) 양호한 효능으로 결합한다. 반대로, 유리 (정상) 비오틴은 이의 카르복실기가 음전하 클러스터에 근접할 수 있으며 따라서 반발될 수 있기 때문에, 항체에 효율적으로 결합할 수 없다.
실시예 20
항-합텐 이특이적 항체
이특이적 항체는 세포 표면 항원 예컨대 LeY 를 인지하고 동시에 합텐 예컨대 예를 들어 디곡시게닌 (Dig) 에 결합한다. 도 20A 은 이전에 기재된 전체 길이 IgG-유래된 포맷에 근거한, 이특이적 항체의 조성물을 보여준다 (참고 Metz et al supra, WO 2012/093068): 세포 표면 항원 결합 기능성은 IgG 잔기의 2 개의 Fab 분지 내에 위치하고, 중쇄의 C-말단에 재조합적으로 융합된 2 개의 부가적인 scFv 는 합텐 결합 활성을 갖는다. scFv 모듈은 Fv 를 안정화시키고 응집을 감소시키기 위해 부가적인 안정화 사슬간 디술피드 결합을 갖는다 (VHCys44 내지 VLCys100). 부가적으로, 항-합텐 항체는 이특이적 항-합텐 항체와 폴리펩티드 독소 사이의 공유 디술피드 결합의 형성을 가능하게 하기 위해, 각각의 항체의 CDR2 의 실제 길이에 따라 Kabat 번호지정에 따른 위치 VH52b 또는 VH53 에서 인공 시스테인 잔기를 갖는다.
LeY 및 Dig 에 결합하는 Dig-VH Cys-함유 이특이적 항체의 L- 및 H-사슬의 서열은 SEQ ID NO: 198 및 SEQ ID NO: 199 에 나열된다.
이특이적 항체를 현탁액 중의 HEK293 세포 내에서 일시적으로 제조하고, 이전에 기재된 바와 같은 배양 상청액으로부터 정제하였다 (참고 Metz et al supra, WO 2012/093068). Fab-Fv 융합의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 플라스미드를, 무-혈청 배지 중에서 배양된 HEK293 현탁 세포 내로 공동-트랜스펙션하였다. 상청액을 트랜스펙션 후 7 일에 원심분리 및 0.22 μm 여과에 의해 정화시켰다. 이특이적 항체를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl (pH 6.0) 로 평형화된 SEC (Superdex200 HiLoad 26/60, GE Healthcare) 에 의해 정제하였다. 단백질 농도를 280 nm 에서의 광학 밀도 (백그라운드로서 320 nm) 에 의해 측정하고, 정제된 단백질의 균질성을 SDS-PAGE 에 의해 확인하였다.
본 연구에 적용된 산출되는 이특이적 항체 제제의 조성물, 순도 및 균질성 (SEC 및 SDS PAGE) 은 도 20B 에 제시된다.
실시예 21
이특이적 항-합텐 항체 내에서 올바른 디술피드 및 허용가능한 시스테인의 수득
폴리펩티드 독소와의 공유 커플링을 위한 합텐-결합 모듈은 합텐화된 폴리펩티드 독소와 디술피드 결합의 형성을 위해 하나 이상의 추가의 시스테인 잔기를 함유하는 IgG 와 같은 '표준' 항체로 구성된다. 본원에 보고된 방법은 폴딩된 도메인 내에 요구되는 기능성 (시스테인) 을 도입하고, 이의 구조 및 서열이 항체 기능성에 대한 기초를 제공한다. 내부에 규정된 디술피드 결합의 올바른 형성 뿐 아니라 항체의 도메인은 올바른 구조 및 기능성의 형성 및 유지에 필수적이다. 도 10(A) 는 미개질된 항체의 Fab 와 같은 기능적 결합 분지를 형성하는데 필요한 디술피드 패턴을 보여주고, 도 10(B) 은 VH52cB/VH53C 돌연변이된 항체 유도체의 구조 및 기능성을 유지하는데 필수적인 디술피드 패턴을 보여준다. 적합한 디술피드 패턴을 유지하기 위해, VH 도메인 내에 도입되었던 부가적인 시스테인은 사슬내 디술피드 결합으로 미점유되어야만 하고, 이웃하는 시스테인과 간섭하거나 반응하지 않아야만 한다. 도 10(C) 및 10(D) 는 인공 시스테인 잔기의 첨가가 이러한 분자의 생합성 동안 VH 도메인 내에서 올바르지 않은 디술피드를 형성할 가능성을 생성한다는 것을 보여준다. VH52bC/VH53C 위치가 VH 도메인 내에, 사실 상 CDR2 (그리고 다른 시스테인과 꽤 가깝게) 내에 위치한다는 사실은 올바르지 않은 디술피드가 중쇄의 생합성 동안 형성될 수 있다는 위험을 악화시킨다. 또다른 잠재적인 문제는 VH 및 VL 도메인이 하나의 Fv 단편에 대한 분비 경로 내에 어셈블리된다는 것이다. 분비 경로에는 산화환원-셔플링 조건 및 디술피드 형성 및 -셔플링 효소가 수반된다. 그러므로, VH52bC/VH53C 돌연변이의 첨가에 의한 올바르지 않은 디술피드를 도입하기 위한 잠재력은 또한 경쇄의 디술피드로 (도 10(E) 에 예시적으로 제시됨) '퍼질' 수 있다. 이것은 부적합하게 폴딩된 비-기능적 분자를 수득/생성하는 위험을 추가로 향상시킨다. 따라서 - 상기 위험에도 불구하고 - VH52bC/VH53C 돌연변이가 함유하는 양호한 양의 균질한 기능적 항체 유도체가 기능적이고 합텐화된 폴리펩티드 독소에 대해 공유 연결될 수 있는 것이 발현되고 수득될 수 있다는 것은 꽤 놀랍다.
올바른 유리 시스테인을 유지하면서 디술피드의 올바른 어셈블리의 문제는 이특이적 항체의 생성 시 추가로 악화된다. 공유 커플링을 위한 시스테인 돌연변이이 있는 항-합텐 디술피드-안정화된 단일-사슬 Fv 단편의 생성을 위해, 공유 폴리펩티드 독소 커플링을 위한 합텐-결합 모듈은 '표준' 항체 예컨대 IgG 로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 이들은 항체 단편 예컨대 Fv 또는 Fab 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. 단일-사슬 Fv 단편은 종종, 특히 소형 모듈 크기가 요구되는 적용, 또는 부가적인 결합 모듈이 이중- 또는 다중특이적 항체 유도체를 발생시키는데 요구되는 적용에서 전체 길이 항체에 대한 대안으로서 적용된다. 생성되는 항-합텐 Fv-유도된 실체에 대한 하나의 예는 디곡시겐화된 폴리펩티드 독소에 결합하고 공유 연결되는 디술피드-안정화된 단일-사슬 Fv 이다. 디곡시게닌-결합 특이성을 가진 디술피드-안정화된 단일-사슬 Fv 는 항-디곡시게닌 항체 VH 및 VL 도메인을 유연성 GS-링커를 통해 서로에 대해 연결시킴으로써 생성되었다. 상기 VH 및 VL 도메인은 VH 의 위치 44 및 VL 의 위치 100 (Kabat et al. 에 따른 위치) 내에 부가적으로 시스테인 돌연변이를 가지고 있다. 이들 부가적인 시스테인은 VH 과 VL 사이에 안정한 분자내 디술피드 결합을 형성한다. 이것은 이전에 기재된 바와 같이, scFv 를 안정화시킨다 (예를 들어, Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245).
이에 더해, 또다른 시스테인은 Fv 단편에 대해 공유 연결 기능성을 부가하기 위해 Kabat 번호지정에 따라, 각각 위치 52b 또는 53 에서의 VH 내로 도입되었다. 그러나, 이러한 돌연변이를 디술피드-안정화된 Fv 단편 내로 도입하는 것은 이들을 전체 길이 항체 내로 위치시키는 것보다 훨씬 더 도전적이다. 단일-사슬 Fv 단편은 전체 길이 IgGs 또는 Fab 단편보다는 고유적으로 덜 안정한데, 이들이 안정화 및 헤테로이량체화 강요 실체로서 불변 도메인이 결핍되기 때문이다. 안정성은 부가적인 시스테인 돌연변이를 Fv 예컨대 VH44-VL100 디술피드 내에 둠으로써 부여될 수 있다. 그러나, 이들 안정화 원리는 오직 올바른 시스테인 사이의 올바른 위치에서 디술피드가 형성되는 경우에만 작동한다. 따라서, 규정된 도메인내 디술피드 (VH 에서 하나 및 VL 에서 하나) 에 더해, 하나의 단일한 규정된 올바른 도메인간 디술피드가 형성되는 것이 필요하다. 비-매칭 시스테인 사이의 디술피드 연결은 잘못 폴딩된 불안정하고 비-기능적인 실체를 생성할 것이다. 디술피드-안정화된 Fv 단편이 6 개의 시스테인을 함유하는 것을 고려하면, 21 개의 상이한 디술피드 연결이 이론적으로 형성될 수 있으나 - 오로지 3 개의 규정된 디술피드의 올바른 조합이 기능적인 안정화된 단일-사슬 디술피드 안정화된 Fv-단편 (dsscFv) 을 형성할 것이다. 이러한 도전은 VH 도메인 내에 또다른 유리 시스테인의 첨가 시 악화된다. 요구되는 디술피드 안정화된 Fv 단편 (dsscFv) 은 2 개의 규정된 도메인내 디술피드 (VH 및 VL 에서 하나씩 각각), 하나의 규정된 도메인간 디술피드 (VH 와 VL 사이), 및 게다가 합텐화된 화합물/페이로드 커플링을 위해 하나의 유리 시스테인 (위치 52b/53 에서 VH 내) 을 함유한다. 공유 커플링을 위해 추가의 시스테인 돌연변이를 갖는 디술피드-안정화된 Fv 단편이 7 개의 시스테인을 함유하는 것을 고려하면, 많은 상이한 디술피드 연결이 이론적으로 형성될 수 있으나, VH52b/VH53 에서의 정확한 유리 시스테인 위치를 갖는, 오로지 3 개의 규정된 디술피드의 올바른 조합이 기능적인, 안정화된 및 공유 커플링 성분 dsscFv 를 산출할 것이다. 하나의 부가적인 도전은 부가적인 유리 시스테인 (VH52b/VH53) 이, 자연 발생적 시스테인이 아니고 디술피드 안정화를 위해 도입된 돌연변이인 VH44 시스테인과 가깝게 위치한다는 사실이다. VH44C 는 올바른 도메인간 디술피드를 형성하는데 필요하다. 이론에 구애됨 없이, 상기 디술피드 결합은 대부분 VH 및 VL 의 독립적인 폴딩 및 어셈블리 후 형성될 것 같다. VH44C 및 VH52bC/VH53C 의 근접성은 도메인내 디술피드가 올바른 방식으로 형성되지 않을 위험을 악화시킨다. 그러나 디곡시게닌에 결합하고 동시에 디곡시게닌화 폴리펩티드 독소에 공유 연결될 수 있는 기능적인 디술피드 안정화된 단일-사슬 Fv 모듈이 생성될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 올바른 위치에 올바른 디술피드 및 유리 시스테인을 함유하는 디술피드-안정화된 단일-사슬 Fv 분자의 조성물 및 원치 않는 올바르지 않게 폴딩된 분자와의 이의 비교는 도 11 에 제시된다.
실시예 22
합텐화된 슈도모나스 외독소 변이체
슈도모나스 외독소는 그의 N-말단 도메인 I 을 진핵 세포에 결합시키고, 내재화시키고, 도메인 II 에서 단백질가수분해적으로 프로세싱하게 되고 C-말단 도메인 III 을 세포질 내로 방출시키는 66 kDa 단백질이다. 상기 도메인 ADP-리보실레이트 eEF2 는 단백질 합성의 억제 및 후속 세포 사멸을 야기한다. 폴리펩티드 독소로서 본원에 사용되는 것들을 포함하는 절단된 변이체는 도 21 에 제시된다:
분자 NLysPE38 에는 세포 결합 도메인 I 및 도메인 IB 가 결실되어 있다 (Weldon, J.E. and Pastan, I., FEBS Journal 278 (2011) 4683-4700; Debinski, W. and Pastan, I., Cancer Res. 52 (1992) 5379-5385). 상기 분자 그 자체가 매우 낮은 세포독성 효능을 갖는다. NLysPE38 은 그의 N-말단 (Nlys) 에 가깝게 라이신 잔기를 함유하는데, 이것은 NHS-화학에 의해 화학적으로 개질될 수 있다. 최근에 - dsscFv-융합의 문맥 내에서 - 대부분의 도메인 II 는 또한 프로세싱 부위가 유지된다면 효능을 손실하지 않으면서 결실될 수 있다는 것이 제시되었다 (Weldon, J.E. and Pastan, I., FEBS Journal 278 (2011) 4683-4700; Hansen, J.K., et al., J. Immunother. 33 (2010) 297-304; Pastan, I., et al., Leukemia & Lymphoma 52 (2011) Supp. 2:87-90). 이러한 융합 단백질 내의 절단된 독소 변이체의 크기는 대략 25 kDa 이다. 절단된 독소는 여전히 도메인 III 내에 라이신 잔기를 함유한다. 이전에 기재된 독소 NlysPE38QQR 은 NHS 와 같은 아민-개질 시약에 의한 도메인 III 의 불활성화의 위험을 감소시키기 위해, 글루타민 또는 아르기닌에 의해 대체된 도메인 III 의 라이신을 갖는다 (Debinski, W. and Pastan, I., Cancer Res. 52 (1992) 5379-5385; Debinski, W. and Pastan, I., Bioconjug. Chem. 5 (1994) 40-46). 본원에서 신규한 폴리펩티드 독소 변이체 NLysPE25SQΔ 가 보고되는데, 여기서 도메인 I 및 IB 뿐 아니라 도메인 II 의 대부분이 결실되고 (CD22-LR8M 의 독소 부분) (Pastan, I., et al., Leukemia & Lymphoma 52 (2011) Supp. 2:87-90)), 도메인 III 에서 세린 또는 글루타민 교환을 위해 라이신을 함유한다 (NlysPE40QQR-유사 돌연변이). 부가적으로, C-말단 라이신이 결실되고, 이것은 아미노-말단 라이신 연장 (NlysPE38 의) 을 가진다. 이에 의해, NLysPE25SQΔ 는 그의 N-말단에 오로지 하나의 라이신을 함유하는 다소 작은 독소 부분이다. 상기 라이신의 일차 아민 (및 N-말단의 것) 은 독소의 다른 위치에는 영향을 주지 않고 NHS-시약에 의해 개질될 수 있다. NLysPE25SQΔ (PE25) 는 NLysPE38 에 대해 이전에 기재된 바와 같이 E. 콜라이에서 생성되고, 음이온-교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 주변세포질로부터 정제되어 응집물 및 더 작인 크기의 불순물을 제거하였다 (Debinski, W. and Pastan, I., Cancer Res. 52 (1992) 5379-5385; Debinski, W. and Pastan, I., Bioconjug. Chem. 5 (1994) 40-46). 응집물이 없는 균질한 제제가 양호한 수율로 수득될 수 있었다 (>1 g/L 배양물, SDS-PAGE 분석, 도 21B). NLysPE25SQΔ 를 디곡시게닌화시키기 위해, 활성 에스테르 디곡시게닌-NHS 를 라이신의 일차 아미노기의 개질에 대해 적용하였다. 단백질의 N-말단은 또한 NHS-매개된 디곡시게닌-콘쥬게이션에 대한 표적으로서 담당할 수 있다. 2 개의 벌키한 파트너 사이의 입체 방해에 의한 후속적인 이특이적 항체-폴리펩티드 독소 공유 복합체 형성의 간섭을 피하기 위해, 짧으나 유연한 링커가 디곡시게닌과 NHS 사이에, 즉, 디곡시게닌과 폴리펩티드 독소 사이에 위치하였다. 본 문헌의 나머지에서, NLysPE25SQΔ 는 PE25 로 불린다.
이특이적 항체에 대해 합텐 매개 공유 커플링을 위한 추가의 시스테인을 함유하는 폴리펩티드 독소 변이체를 생성하기 위해, 시스테인을 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기의 전 또는 후에서 PE25 내에 조작하였다. 이들 PE 변이체는 PE25 와 동일한 방식으로 제조되고 정제되었다. 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전의 인공 폴리펩티드 시스테인 잔기를 가진 PE25 변이체를 NCK-PE25 로 명명하고, 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 후의 인공 폴리펩티드 시스테인 잔기를 가진 PE25 변이체를 NKC-PE25 로 명명한다. PE25, NCK-PE25 및 NKC-PE25 의 서열 비교를 도 21C 에 제시한다.
PE25 의 서열을 SEQ ID NO: 194 에 나열한다. 세린에 의해 대체된 라이신을 갖는 S-PE25 유도체의 서열을 SEQ ID NO: 195 에 나열한다. NKC-PE25 의 서열을 SEQ ID NO: 196 에 나열한다. NCK-PE25 의 서열을 SEQ ID NO: 197 에 나열한다.
실시예 23
표적화 비히클에 대한 독소의 공유 연결
PE25 변이체가 디곡시게닌-카르복시메틸-NHS 에스테르와 반응하였다 (DE3836656, Metz et al. supra). 작은 비-반응된 화합물 및 반응 생성물 (NHS) 을 이어서, PD10 컬럼을 통한 반응을 통과시킨 후, 멸균 여과에 의해 디곡시게닌화 25 kDa 폴리펩티드 독소로부터 분리하였다. 항체 커플링 전, 디곡시게닌화 폴리펩티드 독소를 DTE 에 이어, PD10 컬럼을 통과하여 다시 통과시킴으로써 환원제의 후속 제거로 감소시켰다. 이후, 이특이적 항체 및 디곡시게닌화 폴리펩티드 독소를 함유하는 복합체를 디곡시게닌화 폴리펩티드 독소를 10 분 동안 실온에서 10 내지 30 mg/ml 의 농도로 완충 수용액 중의 항-디곡시게닌 이특이적 항체 (이특이적 항체) 와 함께 인큐베이션함으로써 생성시켰다. IgG-Fvs 융합 내 항-디곡시게닌 부분의 2-원자가로 인해, 디곡시게닌화 폴리펩티드 독소를 2:1 (폴리펩티드 독소 대 이특이적 항체) 몰비로 적용하였다. 생성된 복합체를 단백질 A 크로마토그래피 (임의의 자유 독소를 제거하기 위해) 에 의해 정제하였고, 이후, 분석 및 어세이를 위해 추가의 변형 없이 사용하였다. 웨스턴 블롯 분석에 의한 독소 부분의 비-환원 및 환원 SDS-PAGE 분석 및 후속 검출 (도 22) 은 디술피드-연결된 이특이적 항체-폴리펩티드 독소 복합체의 형성을 입증하였다: 심하게 변성되는 조건 (SDS; 비등) 하에서, 비-환원된 조건에서, 공유적으로 연결된 독소를 가진 중쇄를 나타내는 고 분자량 밴드로 독소가 나타난다. 따라서, 독소는 이특이적 항체에 안정하게 공유적으로 연결된다. 환원 조건 하에서, 독소는 항체로부터 분리되기 시작하고 이의 더 작은 분자량에 상응하여 이동한다. 이것은 항-PE 항체로의 폴리펩티드 독소를 검출함으로써 뿐 아니라, 웨스턴 블롯 분석에서 항-디곡시게닌 항체에 의해 입증될 수 있었다. 이것은 또한 안정한 이특이적 항체-대-폴리펩티드 독소 연결이 조작된 디술피드 결합의 특이적 형성으로 인한 것임을 확인한다. 디곡시게닌-결합 항체 부분과 복합체를 형성하고 안정하게 디술피드 결합된 디곡시게닌화-PE25, NCK-PE25 및 NKC-PE25 의 성분의 상대적 크기 및 조성물로의 모델을 도 22B 및 C 에 제시한다.
실시예 24
공유 복합체 매개된 폴리펩티드 독소 전달
폴리펩티드 독소를 전달하는 본원에 보고된 공유 콘쥬게이트의 기능성, 특이성 및 효능을 평가하기 위해, MCF-7 세포를 이특이적 항체 및 폴리펩티드 독소의 공유 콘쥬게이트에 노출시켰다. MCF7 은 그의 표면 상에 LeY 항원을 발현하며, LeY 에 결합하는 PE-유래된 면역독소에 민감하다 (see Metz, S., et al. supra). 이들 세포의 생존력 및 증식을 대사 활성 또는 세포 증식을 측정하는 어세이에 의해 평가하였고, 둘다 당업계에 잘 알려진 방법이다. 독소에 노출시 세포의 생존력을 결정하기 위해, 세포 ATP 함량 (대사 활성을 반영함) 을 Cell Titer Glo (CTG) 어세이로, 세포 표면 표적화된 이특이적 항체-폴리펩티드 독소 콘쥬게이트의 첨가 후 48 시간 또는 72 시간에 결정하였다. 증식에 대한 폴리펩티드 독소 노출의 영향을 BrdU (브로모데옥시우리딘) 도입 (즉, DNA 합성) 어세이에 의해, 세포 표면 표적화된 이특이적 항체-폴리펩티드 독소 콘쥬게이트의 첨가 후 48 시간 또는 72 시간에 결정하였다. 모든 어세이를 서브컨플루언트 (subconfluent) 배양 중 96 웰 플레이트에서 삼중으로 수행하였다. 도 23 에서 제시되는 BrdU 어세이 결과는 PE25 유도체를 함유하는 세포 표면 표적화된 이특이적 항체-폴리펩티드 독소 콘쥬게이트로의, MCF-7 세포의 인큐베이션이 증식의 표시된 표적화 용량-의존적 감소를 보여줌을 입증한다.
이것은 본원에 보고된 세포 표면 표적화된 이특이적 항체-폴리펩티드 독소 콘쥬게이트가 결합 및 전달 특이성 (표적화) 및 페이로드 기능성 (예를 들어, 종양 세포에 대한 세포독성 활성) 의 관점에서 완전히 기능적이라는 것을 입증하고, 그 장점은 비-공유 이특이적 항체-합텐화된 폴리펩티드 독소 복합체보다 더욱 안정하다는 것이다.
실시예 25
소포 구획 내의 항체 및 합텐화된 폴리펩티드의 분리
본원에 보고된 공유 복합체는 항-합텐 결합 특이성을 포함하는 이특이적 세포 표적화 항체 (bsAb) 에 의해 세포에 및 세포 내로 전달될 수 있다. 일부 폴리펩티드의 경우, 이들 복합체가 세포질 또는 다른 세포내 구획으로 유입하는 것이 필수적이다. 이것은 예를 들어, 암 요법에 적용되는 세포독성 실체를 포함한다. 세포 표적화 bsAb 에 의해 전달되는 폴리펩티드는 표적 세포 내로 방출될 필요가 있을 수 있다.
세포내 방출을 측정하기 위해 LeY 항원에 결합하고 디술피드-안정화된 단일-사슬 Fv 첨가로서 항-비오틴 결합 실체를 갖는 LeY-Dig(52bC) 이특이적 항체 (실시예 18 및 20 참고) 를 사용하였다. 비오틴-Cys-Cy5 와의 인큐베이션은 공유 디술피드-콘쥬게이션 복합체를 발생시킨다. LeY 항원은 유방암 세포에 풍부하고, 내재화되고, LeY-결합 항체 유도체는 이전에, 페이로드를 세포 (예컨대 MCF7) 에 세포 내에 전달하는 것으로 제시되었다. bsAb 를 검출하기 위한 Alexa-표지된 이차 항체 및 Cy5 를 검출하기 위한 형광을 사용하는 공초점 현미경 분석은 MCF7 에 결합하고 이 내에 내재화하는 공유 콘쥬게이트를 보여주었다 (도 24). 항체로부터 비오틴의 분리가 시간에 따라, 예를 들어 적용 후 6 시간에 관찰될 수 있기 때문에 세포 내에서 bsAb 및 비오틴이 연결되어 남아있지 않다고 볼 수 있다. 분리된 bsAb 는 미손상되는 bsAb 스트레치/도메인이 검출되는 것이 필요한 이차 항체에 의해 가시되었다. 따라서 관찰된 세포내 페이로드 방출은 대부분 세포내 환원 및 합텐 해리에 의해 촉발된다.
SEQUENCE LISTING <110> F. 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<223> S-PE25 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X=Met (can be present or absent due to expression in E.coli) <400> 195 Xaa Leu Gln Gly Thr Ser Leu Met Ala Glu Glu Arg His Arg Gln Pro 1 5 10 15 Arg Gly Trp Glu Gln Leu Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp 20 25 30 Gly Gly Ala Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val 35 40 45 Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Val 50 55 60 Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val 65 70 75 80 Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala 85 90 95 Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln 100 105 110 Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu 115 120 125 Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser 130 135 140 Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile 145 150 155 160 Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu 165 170 175 Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg 180 185 190 Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly 195 200 205 Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Ser Glu Ala Ala Ile Ser 210 215 220 Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Gln Pro Pro Arg Glu Asp 225 230 235 240 Leu <210> 196 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NKC-PE25 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X=Met (can be present or absent due to expression in E.coli) <400> 196 Xaa Leu Gln Gly Thr Lys Leu Cys Ala Glu Glu Arg His Arg Gln Pro 1 5 10 15 Arg Gly Trp Glu Gln Leu Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp 20 25 30 Gly Gly Ala Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val 35 40 45 Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Val 50 55 60 Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val 65 70 75 80 Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala 85 90 95 Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln 100 105 110 Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu 115 120 125 Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser 130 135 140 Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile 145 150 155 160 Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu 165 170 175 Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg 180 185 190 Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly 195 200 205 Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Ser Glu Ala Ala Ile Ser 210 215 220 Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Gln Pro Pro Arg Glu Asp 225 230 235 240 Leu <210> 197 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NCK-PE25 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X=Met (can be present or absent due to expression in E.coli) <400> 197 Xaa Leu Gln Cys Thr Lys Leu Met Ala Glu Glu Arg His Arg Gln Pro 1 5 10 15 Arg Gly Trp Glu Gln Leu Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp 20 25 30 Gly Gly Ala Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val 35 40 45 Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Val 50 55 60 Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val 65 70 75 80 Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala 85 90 95 Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln 100 105 110 Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu 115 120 125 Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser 130 135 140 Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile 145 150 155 160 Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu 165 170 175 Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg 180 185 190 Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly 195 200 205 Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Ser Glu Ala Ala Ile Ser 210 215 220 Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Gln Pro Pro Arg Glu Asp 225 230 235 240 Leu <210> 198 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bispecific antibody LeY-Dig(cys) light-chain <400> 198 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ile Ile 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 199 <211> 725 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bispecific antibody LeY-Dig(cys) heavy-chain <400> 199 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Asn Asp Asp Ser Ser Ala Ala Tyr Ser 65 70 75 80 Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Ala Trp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 465 470 475 480 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu 485 490 495 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met 500 505 510 Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Ser 515 520 525 Ile Asn Ile Cys Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 530 535 540 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 545 550 555 560 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 565 570 575 Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Tyr 580 585 590 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 595 600 605 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 610 615 620 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 625 630 635 640 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 645 650 655 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu 660 665 670 Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 675 680 685 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 690 695 700 Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr 705 710 715 720 Lys Val Glu Ile Lys 725

Claims (12)

  1. 합텐화된 폴리펩티드 및 항-합텐 항체를 포함하는 콘쥬게이트로서,
    폴리펩티드는 라이신 잔기에서 합텐에 콘쥬게이션되고,
    합텐화된 폴리펩티드는 디술피드 결합에 의해 항-합텐 항체에 콘쥬게이션되어,
    i) 합텐-콘쥬게이션에 사용되는 라이신 잔기 전 또는 후에 있는 1 개 또는 2 개의 잔기인, 합텐화된 폴리펩티드의 시스테인 잔기와,
    ii) 항체의 중쇄 CDR2 (CDR2 는 Kabat 에 따라 결정됨) 내의 시스테인 잔기 사이에서 디술피드 결합이 형성되는 콘쥬게이트로서,
    합텐이 비오틴, 또는 테오필린, 또는 디곡시게닌, 또는 플루오레세인이고,
    항-비오틴 항체는 (a) SEQ ID NO: 41 또는 57 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 42 또는 58 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 43 또는 59 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 45 또는 61 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 46 또는 62 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 47 또는 64 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 6 개의 CDR 을 포함하고,
    항-테오필린 항체는 (a) SEQ ID NO: 73 또는 89 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 74 또는 90 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 75 또는 91 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 77 또는 93 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 78 또는 94 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 79 또는 95 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 6 개의 CDR 을 포함하고,
    항-디곡시게닌 항체는 (a) SEQ ID NO: 09 또는 25 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 10 또는 26 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 11 또는 27 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 13 또는 29 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 14 또는 30 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 15 또는 31 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 6 개의 CDR 을 포함하며,
    항-플루오레세인 항체는 (a) SEQ ID NO: 105 또는 113 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) SEQ ID NO: 106 또는 114 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) SEQ ID NO: 107 또는 115 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) SEQ ID NO: 109 또는 117 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) SEQ ID NO: 110 또는 118 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) SEQ ID NO: 111 또는 119 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 으로부터 선택되는 6 개의 CDR 을 포함하는 콘쥬게이트.
  2. 제 1 항에 있어서, 항체의 CDR2 내의 시스테인 잔기의 알파 탄소 원자가 합텐이 콘쥬게이션되는 폴리펩티드의 라이신 잔기의 원자로부터 10 내지 11 옹스트롱 (Angstrom; Å) 떨어져 있는 콘쥬게이트.
  3. 제 1 항에 있어서, 시스테인 잔기가 라이신 잔기 전 또는 후의 2 개의 잔기인 콘쥬게이트.
  4. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 라이신 잔기가 폴리펩티드의 10 개의 N-말단 아미노산 잔기 내에 있는 콘쥬게이트.
  5. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 폴리펩티드가 그의 아미노산 서열 내에 정확하게 하나의 라이신 잔기를 포함하는 콘쥬게이트.
  6. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 항체의 중쇄 CDR2 내의 시스테인 잔기가 Kabat 의 중쇄 가변 도메인 번호지정에 따라 위치 52b 또는 위치 53 에 있는 콘쥬게이트.
  7. 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 콘쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암의 치료를 위한 약학 제형.
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