CN105873616B - 共价连接的多肽毒素-抗体缀合物 - Google Patents

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Abstract

本文报告了半抗原化多肽毒素和抗半抗原抗体的缀合物，其中在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后的半胱氨酸残基和抗体的CDR2中的半胱氨酸残基之间形成二硫键，其中CDR2根据Kabat来确定。

Description

共价连接的多肽毒素-抗体缀合物
本文报告了包含多肽毒素和抗体的复合物，其中，该复合物的组分经由单键彼此共价连接。还报告了用于产生该共价复合物的方法及其用途。
发明背景
目前可用的基于半抗原的递送平台的局限性是半抗原和递送载体之间的非共价连接。在期望递送载体和有效载荷之间稳定连接的应用中，非共价的递送载体-有效载荷复合物可能是不合适的，因为非共价连接的有效载荷可能从递送载体解离。
对于将靶向例如肿瘤的毒性有效载荷来说，这可能造成特殊问题，并且，在该有效载荷从被靶向的递送载体过早释放的情况下，其产生不利影响(即，非特异性毒性)。
已报告了用于解决这些缺点的不同方法。然而，这些技术中没有一个提供了允许递送毒性有效载荷(特别是毒性多肽)而没有脱靶活性的健壮和通用的平台。
一种方法是将有效载荷融合至稳定该有效载荷的实体。这类实体的例子是人血清白蛋白或人免疫球蛋白Fc区。该方法适用于由天然存在的氨基酸残基所组成并且容许在其C-末端或N-末端进行修饰而不丧失其生物学活性的许多线性多肽。那些环状的、装订的、包含非天然氨基酸残基或额外修饰的多肽不能作为融合多肽重组产生。然而，这类多肽对于治疗性应用来说可能是期望的选择，因为它们在蛋白酶稳定性、活性和特异性方面经常优于“普通的”线性肽。但是这些融合无法实现靶向递送。
改善治疗性多肽的PK/稳定性和生物物理特性的一种方法(其也可以应用于那些环状的、装订的或包含非天然结构的治疗性多肽)是化学或酶促缀合至聚合物，例如，通过PEG化或HES化。然而，这类修饰经常导致多肽的生物学活性显著降低，并且在某些情况下，可能成为安全或毒性问题的原因。这些修饰同样无法实现靶向实体。
用于治疗性多肽的稳定化或PK调节的大多数现有化学偶联技术的主要缺点在于它们的复杂性。除化学偶联步骤之外，在许多情况下，这些方法产生多肽衍生物的混合物，这些多肽衍生物以不确定的化学计量和/或在不明确的位置连接至PK调节实体。此外，目前使用的多肽修饰技术常常导致治疗性多肽的生物学活性大大降低或甚至完全丧失。此外，难以预测化学缀合物的药理特性和/或可能的降解途径。
Metz,S.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)8194-8424)报告了双特异性的结合洋地黄毒苷的抗体，用于靶向递送有效载荷。Hoffmann,E.等人报告了经由非共价抗体复合进行半抗原化肽的PK调节(J.Contr.Rel.171(2013)48-56)。在WO 2012/093068中，报告了抗dig抗体和缀合至肽的洋地黄毒苷的复合物的药物组合物。Bera等人报告了针对表达ley抗原的肿瘤细胞的重组免疫毒素的比较：亲和力、大小和稳定性的影响(Bioconjug.Chem.9(1998)736-743)。Lee H Pai等人报告了由单克隆抗体B3和多种形式的假单胞菌外毒素构成的免疫毒素的抗肿瘤活性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)3358-3362)。
US 5,804,371报告了半抗原标记的肽和它们在免疫学检测方法中的用途。Decarie A.等人(Peptides 15(1994)511-518)报告了洋地黄毒苷标记的肽(缓激肽)及其在发炎组织中缓激肽的化学发光酶免疫测定中的应用。
在WO 2004/065569中报告了多功能抗体。
在WO 2014/006124中报告了共价连接的抗原-抗体缀合物。
发明概述
已经发现，通过在半抗原化多肽毒素和抗半抗原抗体之间形成共价键，可以实现所述多肽毒素的稳定化和PK性能改善。该共价键在向所述抗半抗原抗体的可变区引入的第一半胱氨酸残基(人工抗体半胱氨酸残基)和存在于所述多肽毒素中或向所述多肽毒素引入的第二半胱氨酸残基((人工)多肽半胱氨酸残基)之间形成。
人工抗体半胱氨酸残基位于抗半抗原抗体的CDR之一中，但不干扰所述抗半抗原抗体的半抗原结合特性。当半抗原化多肽毒素的半抗原被抗半抗原抗体结合时，(人工)多肽半胱氨酸残基与人工抗体半胱氨酸残基靠近(紧密的空间距离)。这允许半抗原化多肽毒素和抗半抗原抗体之间的共价键的形成。
已经发现，(人工)多肽半胱氨酸残基可以包含在多肽毒素的氨基酸序列中，并且因此位于多肽毒素本身的编码区中，而与将半胱氨酸残基引入到连接多肽毒素和半抗原的接头中相反。
据预期，在重组产生之后，人工抗体半胱氨酸残基和(人工)多肽半胱氨酸残基在与另一个半胱氨酸残基或谷胱甘肽的二硫化物中被至少部分地‘封闭’。然而，非常令人惊讶地，已经发现，一旦将重组产生的人工含半胱氨酸抗半抗原抗体和(人工)含半胱氨酸半抗原化多肽毒素混合，无需额外的试剂，稳定的二硫键通过自发定位的氧化还原改组反应形成。共价的抗体-多肽毒素缀合物在结合和递送特异性(靶向)以及多肽毒素功能性(即，针对肿瘤细胞的细胞毒活性)方面功能完善，同时优点在于在循环中比非共价复合物更稳定。已经发现，连接抗体和多肽毒素的二硫键在细胞内切割，并且因此，多肽毒素从共价复合物特异性释放于细胞内。
如本文所报告的一个方面是半抗原化多肽和抗半抗原抗体的(共价)缀合物，其中在所述多肽的用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后的半胱氨酸残基和抗体的CDR2中的半胱氨酸残基之间形成二硫键，其中所述CDR2根据Kabat来确定。
在一个优选的实施方案中，所述多肽是多肽毒素。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后1至3个残基之间。在这个实施方案中，所述半胱氨酸残基在相对于所述赖氨酸残基(N)的N-3、N-2、N-1、N+1、N+2或N+3位置之一处。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前两个残基(即，在相对于所述赖氨酸残基N-2位置处)或之后两个残基(即，在相对于所述赖氨酸残基N+2位置处)。
在一个实施方案中，用于半抗原缀合的赖氨酸残基在所述多肽的10个N-末端氨基酸残基之内。
在一个实施方案中，所述多肽在其氨基酸序列中确切地包含一个赖氨酸残基。
如本文所报告的一个方面是半抗原化多肽毒素和抗半抗原抗体的(共价)缀合物，其中在所述多肽毒素的用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后1至3个残基之间的半胱氨酸残基和抗体的CDR2中的半胱氨酸残基之间形成二硫键，其中所述CDR2根据Kabat来确定。
如本文所报告的一个方面是半抗原化多肽和抗半抗原抗体的(共价)缀合物，由此在所述多肽中的半胱氨酸残基和抗体的CDR2中的半胱氨酸残基之间形成二硫键，其中所述CDR2根据Kabat来确定，其特征在于，所述多肽在其氨基酸序列中确切地包含一个赖氨酸残基。
在一个优选的实施方案中，所述多肽是多肽毒素。
在一个实施方案中，多肽中的半胱氨酸残基(其是二硫键的一部分)在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后1至3个残基之间。在这个实施方案中，所述半胱氨酸残基在相对于所述赖氨酸残基(N)的N-3、N-2、N-1、N+1、N+2或N+3位置之一处。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前两个残基(即，在相对于所述赖氨酸残基N-2位置处)或之后两个残基(即，在相对于所述赖氨酸残基N+2位置处)。
在一个实施方案中，用于半抗原缀合的赖氨酸残基在所述多肽的10个N-末端氨基酸残基之内。
一旦使用以下接头衍生化，则任何半抗原可以用于如本文所报告的缀合物和方法中，所述接头允许多肽中的半胱氨酸残基((人工)多肽半胱氨酸残基)和抗体的CDR2中的半胱氨酸残基(人工抗体半胱氨酸残基)的正确空间定向，在所述两种半胱氨酸残基之间形成二硫键。
在一个实施方案中，所述抗半抗原抗体与所述半抗原化多肽的半抗原特异性结合(抗半抗原抗体)。
在一个实施方案中，所述CDR2是重链CDR2。
在一个实施方案中，半抗原化多肽包含半抗原、接头和多肽。在一个实施方案中，所述多肽还与有效载荷缀合。
在一个实施方案中，该多肽是多肽毒素。在一个实施方案中，所述多肽毒素是PE25。
在一个实施方案中，抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在根据Kabat的重链可变结构域编号法的位置52、或位置52a、或位置52b、或位置52c、或位置52d、或位置53处。
在一个实施方案中，抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在根据Kabat的重链可变结构域编号的位置52a、或位置52b、或位置52c、或位置53处。
在一个实施方案中，抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在根据Kabat的重链可变结构域编号的位置52b处或位置53处。
在一个实施方案中，该抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含针对非半抗原的抗原的第一结合特异性和针对半抗原的第二结合特异性。
在一个实施方案中，非半抗原的抗原是细胞表面抗原。在一个实施方案中，所述细胞表面抗原是肿瘤相关抗原。
在一个实施方案中，双特异性抗体是全长抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体的一条重链包含孔穴(hole)突变并且相应的另一条链包含隆突(knob)突变。
在一个实施方案中，双特异性抗体是全长抗体，在所述全长抗体的每个C-末端直接或经由肽接头融合有scFv或scFab。
在所有方面的一个实施方案中，该抗体是人源化抗体或人抗体。
在一个实施方案中，该抗体的恒定区是IgG1亚类或IgG4亚类。
在一个实施方案中，抗体具有IgG1亚类的恒定区，其中根据Kabat的EU索引编号，所述恒定区在位置234和235处具有丙氨酸并且在位置329处具有甘氨酸。
在一个实施方案中，抗体具有IgG4类的恒定区，其中根据Kabat的EU索引编号，所述恒定区具有在位置228处的脯氨酸、在位置235处的谷氨酸和在位置329处的甘氨酸。
在一个实施方案中，缀合物确切地包含一个共价键每个重链CDR2。
在一个实施方案中，二硫键在不添加氧化还原活性剂的情况下形成。
在一个实施方案中，抗原或半抗原经由接头与多肽缀合。在一个实施方案中，该接头是非肽接头。在一个实施方案中，该接头是羧甲基接头或己酸接头。
在一个实施方案中，半抗原是生物素、或茶碱、或洋地黄毒苷、或碳硼烷、或荧光素、或溴脱氧尿苷。在一个实施方案中，半抗原是生物素或洋地黄毒苷。
如本文所报告的一个方面是一种药物制剂，其包含如本文所报告的缀合物，以及可药用载体。
用作药物的如本文所报告的缀合物。
用于治疗癌症的如本文所报告的缀合物。
用于治疗病毒性疾病的如本文所报告的缀合物。
如本文所报告的一个方面是如本文所报告的缀合物在制造药物中的用途。
如本文所报告的一个方面是如本文所报告的缀合物增加多肽的稳定性的用途。
如本文所报告的一个方面是如本文所报告的缀合物减少或消除多肽的脱靶毒性作用的用途。
如本文所报告的一个方面是如本文所报告的缀合物增加多肽的活性的用途。
如本文所报告的一个方面是如本文所报告的缀合物增加多肽的体内半寿期的用途。
如本文所报告的一个方面是如本文所报告的缀合物在治疗疾病中的用途。
如本文所报告的一个方面是一种治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文所报告的缀合物。
如本文所报告的一个方面是一种治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文所报告的缀合物。
在一个实施方案中，该疾病是癌症。
如本文所报告的一个方面是一种产生如本文所报告的缀合物的方法，所述方法包括组合包含人工抗体半胱氨酸残基的抗体和包含(人工)多肽半胱氨酸残基的半抗原化多肽，由此所述人工抗体半胱氨酸残基的α碳原子与融合接头的多肽毒素的原子相距约10至11埃。
如本文所报告的一个方面是一种产生如本文所报告的缀合物的方法，所述方法包括以下步骤
-在溶液中将特异性结合至半抗原并且在CDR2中具有人工抗体半胱氨酸残基的抗体与包含(人工)多肽半胱氨酸残基的半抗原化多肽组合，和
-从所述溶液回收所述缀合物。
如本文所报告的一个方面是一种用于靶向递送半抗原化化合物至靶细胞的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含与半抗原化多肽特异性结合的第一结合位点和与所述细胞的细胞表面标记物特异性结合的第二结合特异性。
在一个实施方案中，在所述多肽的用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后的半胱氨酸残基和抗体的CDR2中的半胱氨酸残基之间形成二硫键，其中所述CDR2根据Kabat来确定。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后1至3个残基之间。在这个实施方案中，所述半胱氨酸残基在相对于所述赖氨酸残基N-3、N-2、N-1、N+1、N+2或N+3位置之一处。
在一个实施方案中，所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前两个残基(即，在相对于所述赖氨酸残基N-2位置处)或之后两个残基(即，在相对于所述赖氨酸残基N+2位置处)。
在一个实施方案中，用于半抗原缀合的赖氨酸残基在所述多肽的10个N-末端氨基酸残基之内。
在一个实施方案中，所述多肽在其氨基酸序列中确切地包含一个赖氨酸残基。
附图说明
图1:具有和不具有引入的VH53C突变的重组人源化抗生物素抗体的结合的比较。使用BIAcore T100或BIAcore 3000仪通过表面等离子体共振(SPR)技术分析结合特性。a)人源化抗生物素抗体。生物素化siRNA与人源化抗生物素抗体的结合，KD＝624pM；b)Cys53突变的人源化抗生物素抗体。生物素化siRNA的结合，KD＝643pM；siRNA浓度：0.14、0.41、1.23、3.70、11.1、33.3和100nM；抗生物素抗体浓度：2nM；传感芯片CM3；经由抗人IgG Fc抗体的抗体结合
ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
人源化抗生物素抗体VH53C 2.2*10<sup>7</sup> 0.01 6.4*10<sup>-10</sup>
人源化抗生物素抗体 2.0*10<sup>7</sup> 0.01 6.2*10<sup>-10</sup>
图2:在半抗原以及抗体中适当的位置处引入SH官能团允许该抗体和该半抗原之间形成共价键，从而产生缀合物。
图3:SDS-PAGE自身荧光条带样式的示意图(在SDS-PAGE凝胶不进一步染色的情况下)：
A：如果在还原或非还原条件下在抗体和半抗原-荧光团缀合物之间均不形成共价键，则可以在游离半抗原-荧光团缀合物的分子量处检测到一条自身荧光条带(self-fluorescent band)。
B：如果在非还原条件下在抗体和半抗原-荧光团缀合物之间形成共价键，则可以在抗体和半抗原-荧光团缀合物的合并分子量处检测到一条自身荧光条带。在还原条件下，抗体和半抗原-荧光团缀合物(半抗原化的化合物)的缀合物中的二硫桥被切割，并且，可以在游离半抗原-荧光团缀合物的分子量处检测到一条自身荧光条带。
图4:在氧化还原活性剂：氧化剂(谷胱甘肽二硫化物，GSSG)和还原剂(二硫赤藓糖醇，DTE)存在下结合半抗原的Cys突变的抗体与半抗原-Cys-荧光标记缀合物(半抗原化的化合物)形成缀合物：在SDS PAGE分析中通过荧光信号检测到限定位置处的抗体复合和后续的共价连接。非还原性(上图)和还原性(下图)SDS-PAGE分析如实施例11中所述进行。在非还原条件下，抗体共价连接的半抗原可作为更大尺寸的蛋白质结合信号在适宜位置处检测到。在还原后，这些信号脱离蛋白质并且在还原条件下作为小实体可见。
左：荧光图像
右：考马斯蓝染色
系列1：具有52bC突变的抗洋地黄毒苷抗体
系列2：在位置52b处具有野生型残基的抗洋地黄毒苷抗体
(A)用3mM DTE和10mM GSSG共价偶联；
(B)用0.3mM DTE和1mM GSSG共价偶联；
(C)用0.03mM DTE和0.1mM GSSG共价偶联。
图5:在仅氧化剂(谷胱甘肽二硫化物，GSSG)存在但还原剂不存在或二者均不存在的情况下，结合半抗原的Cys突变的抗体与半抗原-Cys-荧光标记缀合物形成复合物：在SDSPAGE分析中通过荧光信号检测到限定位置处的抗体复合和后续的共价连接。非还原性(上图)和还原性(下图)SDS-PAGE分析如实施例12中所述进行。在非还原条件下，抗体共价连接的半抗原可作为更大尺寸的蛋白质结合信号在适宜位置处检测到。在还原后，这些信号脱离蛋白质并且在还原条件下作为小实体可见。
左：荧光图像
右：考马斯蓝染色
系列1：具有52bC突变的抗洋地黄毒苷抗体
系列2：在位置52b处具有野生型残基的抗洋地黄毒苷抗体
(A)无添加物
(B)用1mM GSSG共价偶联；
(C)用0.1mM GSSG共价偶联。
图6:与生物胞素酰胺(biocytinamid)复合的鼠抗生物素抗体的X射线结构。在棍棒图(stick representation)中显示与生物胞素酰胺相互作用的氨基酸残基。
图7:与非复合的抗原/半抗原相比采用共价缀合物和非共价复合物的体内血液PK研究结果；显示生物素-Cy5非共价复合物(图7A)和共价(SS桥接)缀合物(图8B)的Cy5-介导荧光的相对剩余荧光强度(％，实心标记)，以及非复合的生物素-Ser-Cy5(星号)的相对剩余荧光强度；将时间点t＝0.08小时处的荧光信号设定为100％；另外，显示小鼠血清样品中人IgG的相对剩余量(空心标记)；将t＝0.08小时处的IgG血清浓度(mg/ml)设定为100％。
图8:确定小鼠血清中洋地黄毒苷化PYY多肽的量的蛋白质印迹。
图9:半抗原化化合物与抗半抗原抗体的亲和力驱动复合的分析。
在SDS PAGE分析中由荧光信号指引在限定位置处的抗体复合和后续的共价连接，所述SDS PAGE分析如实施例19中所述实施。
左：采用非还原样品(凝胶左侧)和还原样品(凝胶右侧)的荧光图像。
右：考马斯蓝染色。
1：人源化抗洋地黄毒苷抗体+生物素-Cys-Cy5
2：人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC+生物素-Cys-Cy5
3：人源化抗生物素抗体+生物素-Cys-Cy5
4：人源化抗生物素抗体VH53C+生物素-Cys-Cy5
白色箭头标示过量(未偶联的)生物素-Cys-Cy5，当使用抗洋地黄毒苷抗体VH52bC时，所述过量的生物素-Cys-Cy5是显著更高，因为在这种情况下缀合反应不是亲和力驱动的。
图10:形成结合Dig的抗体所要求的、Fab区内部的半胱氨酸位置和二硫化物样式，所述抗体在位置52b处具有用于半抗原介导的定点的定向共价有效载荷偶联的额外半胱氨酸。(A)形成功能性Fab片段所要求的、VH结构域和CH1结构域中以及VL结构域和CL结构域中的半胱氨酸和二硫键样式。(B)形成功能性Fab片段所要求的、VH结构域和CH1结构域中以及VL结构域和CL结构域中的半胱氨酸和二硫化物样式，所述功能性Fab片段在位置52b处具有用于半抗原介导的定点的定向共价有效载荷偶联的额外半胱氨酸。(C和D)VH52b变体的VH结构域内部形成不正确二硫键(这将产生错误折叠的无功能抗体)的潜力。(E)VH52b变体的Fv区内部的潜在不正确结构域间二硫键(这将产生错误折叠的无功能抗体)的例子。
图11:形成结合Dig的二硫化物稳定化的单链Fv所要求的半胱氨酸位置和二硫化物样式，所述单链Fv在位置52b处具有用于半抗原介导的定点的定向共价有效载荷偶联的额外半胱氨酸。(A)形成功能性scFv、dsscFv和52b突变型dsscFv所要求的、VH结构域和VL结构域中的半胱氨酸。(B)为了产生功能性scFv、dsscFv和52b突变型dsscFv所必须形成的正确二硫键样式。(C)形成不正确二硫键(这将产生错误折叠的无功能scFv)的潜力。(D)形成不正确二硫键(这将产生错误折叠的无功能dsscFv)的潜力。(E)形成不正确二硫键(这将产生错误折叠的无功能52b突变型dsscFv)的潜力。
图12:作为共价偶联的有效载荷的递送载体的LeY-Dig双特异性抗体衍生物的组成。
图13:用于靶向递送共价偶联的有效载荷的双特异性抗半抗原抗体衍生物的表达和纯化。
(A)对于蛋白质印迹分析，对细胞培养上清液进行SDS PAGE(NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶)(1.0mm×12孔)(Invitrogen；目录号NP0322)并且随后将蛋白质转移至Immobilon转移膜(Immobilon-P)，孔径0.45μm的PVDF。通过1:1000稀释的在山羊中产生的抗人κ轻链-碱性磷酸酶抗体(亲和纯化)，Sigma(目录号A3813)和1:1000稀释的在山羊中产生的抗人IgG(Fc特异性的)-碱性磷酸酶抗体(Sigma，目录号A9544)检测抗体衍生物。施加底物BCIP/NBT-蓝色液态底物(Sigma，目录号B3804)用于蛋白质印迹显色。泳道1–分子量标记；泳道2和3-具有未修饰重链的对照抗体；泳道4-具有延长的H链的LeY-Dig(52bC)双特异性抗体。
(B)SDS-PAGE分析(NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶)和随后用考马斯亮蓝染色展示蛋白质制备物的纯度，并且显现与IgG相关的多肽链，其具有对应于其计算分子量的表观分子大小。泳道1–分子量标记；泳道2-具有延长的H链的还原LeY-Dig(52bC)双特异性抗体；泳道3-具有延长的重链的非还原LeY-Dig(52bC)双特异性抗体；
(C)尺寸排阻层析(Superdex 200)展示在蛋白A纯化后LeY-Dig(52bC)双特异性抗体衍生物的蛋白质制备物中的均一性及缺少聚集物。
图14:Dig-Cy5非共价复合物和共价(二硫化物桥接)缀合物的，以及非复合的Dig-Cy5的Cy5-介导荧光的相对剩余荧光强度(％)；将时间点t＝0.08h处的荧光信号设定为100％；另外，显示小鼠血清样品中人IgG的相对剩余量；将t＝0.08h处的IgG血清浓度(mg/ml)设定为100％。
图15:体内样条件下由非侵入性眼成像法确定的非共价复合物和共价(二硫化物桥接)缀合物的生物素-Cy5以及非复合的生物素-Cy5的Cy5介导荧光的药物代谢动力学；实心菱形：生物素-Cy5；实心正方形：生物素-Cy5+抗生物素抗体(复合物)；三角形：Cy5-生物素-抗生物素抗体缀合物。
图16:a)茶碱-Cys-Cy5的组成、结构和分子量；b)尺寸排阻层析展示结合茶碱的纯化的抗体变体的纯度和均一性；峰#2显示纯化的产物，缺少峰#1表明这类制备物不含聚集物；c)如通过非还原性SDS PAGE(左侧泳道)和还原性SDS PAGE(右侧泳道)展示的、在结合茶碱的抗体和茶碱-Cys-Cy5之间共价复合物的形成；Cy5似乎仅在含有茶碱-Cys-Cy5和Cys突变的抗体的样品中在非还原条件下与H链偶联，这些共价缀合物在还原时崩解(右侧泳道)；泳道1：分子量标记；泳道2-4非还原条件-泳道2：抗茶碱抗体(无Cys-突变)+茶碱-Cys-Cy5(复合物)；泳道3：抗茶碱抗体-cys_55+茶碱-Cys-Cy5(缀合物)；泳道4：抗茶碱抗体-cys_54+茶碱-Cys-Cy5(缀合物)；泳道5-7还原条件-泳道5：抗茶碱抗体(无Cys-突变)+茶碱-Cys-Cy5(复合物)；泳道6：抗茶碱抗体-cys_55+茶碱-Cys-Cy5(缀合物)；泳道7：抗茶碱抗体-cys_54+茶碱-Cys-Cy5(缀合物)。
图17:通过非还原性SDS PAGE和还原性SDS PAGE展示在结合生物素的抗体和生物素-Cys-Cy5之间共价复合物的形成；偶联反应在37℃于鼠血清中进行1小时。Cy5似乎仅在含有生物素-Cys-Cy5和Cys突变的抗体的样品中在非还原条件下与H链偶联；这些共价缀合物在还原时崩解(右侧泳道)；泳道1：分子量标记；泳道2-3非还原条件-泳道2：抗生物素抗体(无Cys突变)+生物素-Cys-Cy5(复合物)；泳道3：抗生物素抗体-Cys+生物素-Cys-Cy5(缀合物)；泳道4-5还原条件-泳道5：抗生物素抗体(无Cys突变)+生物素-Cys-Cy5(复合物)；泳道6：抗生物素抗体-Cys+生物素-Cys-Cy5(缀合物)。
图18:由非侵入性眼成像法确定的非共价复合物和共价(二硫化物桥接)缀合物的生物素-Cy5以及非复合的生物素-Cy5的Cy5介导荧光的体内药物代谢动力学；实心菱形：生物素-Cy5，实心圆圈：在施用抗生物素抗体后24小时施用的生物素-Cy5(体内复合物形成)；实心正方形：在施用抗生物素抗体-Cys后24小时施用的生物素-Cys-Cy5(体内缀合物形成)。
图19:测定了与生物胞素酰胺复合的鼠抗生物素抗体-Fab片段的蛋白结构：复合的半抗原紧邻于带负电荷的氨基酸簇安置；在其羧基处经衍生化用于有效载荷偶联的作为半抗原的生物素以良好效力结合，因为在这个位置不存在电荷排斥作用(归因于缺少COOH基)；与之相反，游离(正常)生物素不能与抗体有效结合，因为其羧基将紧邻于这个负电荷簇，并且因此被排斥。
图20:(A)用于靶向递送多肽毒素的抗半抗原双特异性抗体的示意图；结合半抗原的二硫化物稳定化scFv被重组融合至重链(CH3结构域的C-末端)，备选地，它也可以融合至Fab片段的C-末端或者融合至重组结合模块的其他位置。通过基因合成产生编码双特异性抗体的序列(Geneart,Germany)，亚克隆到表达载体中，并如所描述的那样产生和纯化(Metz,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)8194-8199)。19-11抗体的人源化dsscFv(Metz等人和27209WO)被用作洋地黄毒苷结合实体；将VH和VL引入到IgG的Fab臂中，并且，从结合LeY的抗体B3衍生Fab-样式序列(参见Metz等人)。
(B)双特异性抗体的表达和纯化：证明了双特异性抗体制备物的纯度和均一性的SEC谱和SDS-PAGE；为了瞬时表达，将编码Fab-Fv融合物的轻链和重链的质粒共转染到在无血清培养基中培养的HEK293细胞中，在转染后7天，通过离心和0.22μm过滤澄清上清液，通过蛋白A(IgG-Fv)然后通过用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的SEC(Superdex200HiLoad 26/60,GE Healthcare)纯化双特异性抗体，以320nm处的光密度作为背景，通过280nm处的光密度确定蛋白质浓度，通过SDS-PAGE证实纯化的蛋白质的均一性。
图21:(A)：假单胞菌外毒素(PE)的衍生物；PE和PE变体的结构域组成，以及产生用于定点洋地黄毒苷化的新的变体PE25(NLys-PE25SQΔ)；用Dig-NHS使PE25在赖氨酸侧链的伯氨基处洋地黄毒苷化；蛋白质的N-末端也可以是用于NHS-介导的洋地黄毒苷缀合的目标；PE25(NLysPE25SQΔ)含有氨基酸序列(N-末端)NH2-MLQGTKLMAEE(SEQ ID NO:193)，该序列与氨基酸274-284(结构域II加工位点)融合，然后是PE的氨基酸394-612(结构域III)(pdb 1IKQ_A)；此外，位置406,432、467、490、513、548、590、592如在LR8M毒素衍生物(Hansen,J.K.等人,J.Immunotherapy 33(2010)297-304)中那样进行突变，位置606处的赖氨酸被突变成谷氨酰胺，并且，PE的最后一个氨基酸(赖氨酸613)被删除；通过以下交换来改变氨基末端序列，在S-PE25中，将Lys残基交换为Ser，在NCK-PE25中，将Gly残基交换为Cys，并且，在NKC-PE25中，将Met残基交换为Cys；通过基因合成(Geneart,Germany)或诱变产生关于这些衍生物的编码序列，并且插入到载体中用于在大肠杆菌中诱导表达。
(B)：假单胞菌外毒素衍生物的表达和纯化：蛋白质分泌到周质中，并且应用先前描述的技术(Debinski,W.和Pastan,I.,Cancer Res.52(1992)5379-5385；Debinski,W.和Pastan,I.,Bioconjug.Chem.5(1994)40-46)进行纯化；将通过渗透休克从收获的细菌产生的周质制备物加载至Q-琼脂糖凝胶以捕获多肽毒素；用盐梯度洗脱多肽毒素，进行SEC以获得具有低水平的聚集物和较小蛋白质污染物的单体多肽毒素；进行SEC，并且将毒素级分贮存在PBS中。通过SEC和SDS-PAGE证实纯化的蛋白质的均一性。
(C)：PE25、S-PE25、NKC-PE25和NCK PE25的N-末端序列：N-末端的甲硫氨酸由ATG起始密码子编码，该甲硫氨酸在括号中指示，因为它可能通过大肠杆菌中的翻译后加工被去除。与半抗原偶联的赖氨酸残基突出显示(粗体)，并且，在该赖氨酸之前或之后的额外半胱氨酸为带下划线的粗体。
图22:(A)：抗体和毒素的复合和共价连接：通过SDS-PAGE(NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶)(1.0mm×10孔)分离包含NKC-PE25的共价复合物的还原和非还原样品，并且，通过考马斯蓝染色可视化或进行蛋白质印迹至Immobilon PVDF转移膜(Immobilon-P)，孔径：0.45μm(中图和右图)。在中图中显示采用多克隆抗PE抗体(抗假单胞菌外毒素A，抗体在兔中产生(Sigma，目录号P2318)，1:1000稀释，随后是抗兔IgG(完整分子)-碱性磷酸酶缀合物，抗体在山羊中产生(Sigma，目录号A3687)，1:1000稀释)的蛋白质印迹分析。在右图中显示采用鼠单克隆抗洋地黄毒苷抗体MAK<DIG>M-19-11_IgG(抗体在小鼠中产生(Roche)，随后是抗小鼠IgG(Fc区特异性的)-碱性磷酸酶缀合物，抗体在山羊中产生(Sigma，目录号A7434)，1:1000稀释)的蛋白质印迹分析。两种印迹均使用底物BCIP/NBT-蓝色液态底物进行显色。
(B)抗洋地黄毒苷抗体和洋地黄毒苷化多肽毒素的复合和共价连接：通过连接洋地黄毒苷-间隔物::抗洋地黄毒苷抗体结构(PDB_3RA7,1)的结构模型与PE25(PDB_1K2N和1IKQ，接头的第二部分取自1ikq)的结构模型，产生与结合洋地黄毒苷的Fv复合的洋地黄毒苷化PE25(Dig-PE25)的组分的模型；经由氨基己酸间隔物与PE25的单个赖氨酸附着的适当大小的洋地黄毒苷连接两个结构；还显示了这样的结构模型，该结构模型显示抗洋地黄毒苷抗体的额外半胱氨酸VH和NKC-PE25或NCK PE25中的半胱氨酸之间的共价连接的可能构型。
图23:双特异性抗体介导的靶向毒素递送：进行细胞增殖(BrdU)测定法，以分析对肿瘤细胞的毒性作用；将表达LeY的MCF-7细胞暴露于单独的毒素(上图)或IgG-Fv形式中的载体-毒素复合物(下图)48小时。
图24:靶向细胞的双特异性抗体在靶细胞内部释放半抗原定位的二硫化物连接的有效载荷。共聚焦显微镜显示了将二硫化物缀合的生物素-Cys-Cy5-有效载荷bsAb-靶向递送至和递送入MCF-7细胞。通过Alexa标记的结合huFc的抗体检测bsAb，通过其荧光检测Bio-Cys-Cy5有效载荷。通过混合色指示bsAb和有效载荷的共定位(3)，分离的bsAb以颜色1(1)出现，并且，无抗体的生物素以颜色2(2)出现。图像(将LeY-bsAb施用至表达LeY的MCF7细胞后6小时)显示，在bsAb载体仍然足够完整从而被二抗检测的时间点，生物素与复合物分离。
发明的详细说明
I.定义
出于本文目的，“受体人类框架”是这样的框架，其包含从如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人类框架可以包含其相同氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或者2或更少。在一些实施方案中，VL受体人类框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
术语“氨基酸”指天然存在(即，可以由核酸直接或以前体形式编码)的或非天然存在的一组羧基α-氨基酸。各个天然存在的氨基酸由组成自三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)的核酸编码。每种氨基酸由至少一个密码子编码。这被称为“遗传密码的简并性”。如本申请中使用的术语“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。非天然存在氨基酸的例子包括，但不限于，Aad(α-氨基己二酸)、Abu(氨基丁酸)、Ach(α-氨基环己烷-羧酸)、Acp(α-氨基环戊烷-羧酸)、Acpc(1-氨基环丙烷-1-羧酸)、Aib(α-氨基异丁酸)、Aic(2-氨基茚满-2-羧酸；也称为2-2-Aic)、1-1-Aic(1-氨基茚满-1-羧酸)、(2-氨基茚满-2-羧酸)、烯丙基甘氨酸(allylGly)、别异亮氨酸(allo-Ile)、Asu(α-氨基辛二酸、2-氨基辛二酸)、Bip(4-苯基-苯丙氨酸-羧酸)、BnHP((2S,4R)-4-羟脯氨酸)、Cha(β-环丙基丙氨酸)、Cit(瓜氨酸)、环己基甘氨酸(Chg)、环戊基丙氨酸、β-环己基丙氨酸、Dab(1,4-二氨基丁酸)、Dap(1,3-二氨基丙酸)、p(3,3-双苯基丙氨酸-羧酸)、3,3-双苯基丙氨酸、二-正丙基甘氨酸(Dpg)、2-呋喃基丙氨酸、高环己基丙氨酸(HoCha)、高瓜氨酸(HoCit)、高环亮氨酸、高亮氨酸(HoLeu)、高精氨酸(HoArg)、高丝氨酸(HoSer)、羟脯氨酸、Lys(Ac)、(1)Nal(1-萘基丙氨酸)、(2)Nal(2-萘基丙氨酸)、4-MeO-Apc(1-氨基-4-(4-甲氧苯基)-环己烷-1-羧酸)、正亮氨酸(Nle)、Nva(正缬氨酸)、Omathine、3-Pal(α-氨基-3-吡啶基丙氨酸-羧酸)、4-Pal(α-氨基-4-吡啶基丙氨酸-羧酸)、3,4,5,F3-Phe(3,4,5-三氟苯丙氨酸)、2,3,4,5,6,F5-Phe(2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸)、Pqa(4-氧代-6-(1-哌嗪基)-3(4H)-喹唑啉-乙酸(CAS889958-08-1))、吡啶基丙氨酸、喹啉基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、噻唑基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、Tic(α-氨基-1,2,3,4,-四氢异喹啉-3-羧酸)、Tic(OH)、Tle(叔丁基甘氨酸)和Tyr(Me)。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖各种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
术语“抗体片段”指除完整抗体之外包含完整抗体的一部分的分子，所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“生物素”，简写为“BI”，指5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酸。生物素也被称为维生素H或辅酶R。
术语“双特异性抗体”指具有两种不同(抗原/半抗原)结合特异性的抗体。在一个实施方案中，如本文所报告的双特异性抗体特异于两种不同的抗原，即，半抗原和非半抗原的抗原。
术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。
抗体的“类”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
如本文所使用的术语“多肽毒素”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。多肽毒素包括，但不限于，酶及其片段如溶核酶；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；细胞毒素(例如假单胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素等)、酶、生长因子、转录因子。
术语“洋地黄毒苷”，简写为“DIG”，指3-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-3,12,14-三羟基-10,13-二甲基-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-十四氢-环戊[a]-菲-17-基]-2H-呋喃-5-酮(CAS编号1672-46-4)。洋地黄毒苷(DIG)是一种仅专有地发现于植物洋地黄(Digitalis purpurea)、东方毛地黄(Digitalis orientalis)和狭叶毛地黄(Digitalis lanata)(毛地黄)的花和叶中的类固醇(Polya,G.,Biochemical targets ofplant bioactive compounds,CRC Press,New York(2003)第847页)。
术语“效应子功能”指归因于抗体Fc区的那些生物学活性，这些活性随抗体类别变动。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；以及B细胞活化。
术语，活性剂(例如，药物制剂)的“有效量”，指的是，以必要的剂量并持续必要的时间段的、有效地实现期望的治疗结果或预防结果的量。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点，和残余“Fc”片段，该片段的名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的F(ab')2片段。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段因在重链CH1结构域的羧基末端处附加了几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab'-SH在本文中是指这样的Fab'，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带至少一个游离巯基。F(ab')2抗体片段最初作为成对的Fab'片段产生，所述成对的Fab'片段在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种构造中每个可变结构域的3个高变区相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总体上，这6个高变区向抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含特异于抗原的3个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，虽然以比整个结合位点更低的亲和力进行。
本文中的术语“Fc区”用来定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链C-末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat,E.A.等人,免疫相关的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest),第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所述的EU编号体系，也称作EU索引。
术语“荧光素”，简写为“FLUO”，指6-羟-9-(2-羧苯基)-(3H)-呫吨-3-酮，备选地2-(6-羟-3-氧代-(3H)-呫吨-9-基)-苯甲酸。荧光素又称作二酚酞、C.I.45350、溶剂黄94，D&C黄第7号、angiofluor、日本黄201、或皂黄。
术语“框架”，简写为“FR”，指除高变区(HVR)残基之外的重链及轻链可变结构域氨基酸残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“人工半胱氨酸残基”指这样的半胱氨酸氨基酸残基，其已经被工程化至亲本抗体或多肽毒素中，其具有巯基官能团(SH)，并且不在分子内二硫桥中配对。然而，游离半胱氨酸氨基酸可以配对为分子间二硫桥，例如与谷胱甘肽配对。
术语“全长抗体”指这样的抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链。天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N-末端至C-末端，每条重链具有可变区(VH)，也称作可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N-末端至C-末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称作可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。
“全长抗体”是包含VL结构域和VH结构域以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。全长抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，所述效应子功能指归因于抗体Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；以及下调细胞表面受体如B细胞受体和BCR。
术语“半抗原”指仅当附接至大载体(如，蛋白质)时才可以激发免疫应答的小分子。示例性半抗原是苯胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸和对氨基苯甲酸、醌、组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)、肼苯哒嗪、氟烷、铟-DTPA、荧光素、生物素、洋地黄毒苷、茶碱和二硝基酚、以及溴脱氧尿苷。在一个实施方案中，半抗原是生物素或洋地黄毒苷或茶碱或碳硼烷或溴脱氧尿苷。
术语“半抗原化多肽毒素”指由半抗原组成的分子，所述半抗原与多肽毒素共价连接。经常使用活化的半抗原衍生物作为用于形成这类缀合物的起始物质。在一个实施方案中，半抗原是洋地黄毒苷并且它经由接头(在一个实施方案中经由其3-羟基)与该多肽毒素缀合。在一个实施方案中，接头包含a)一个或多个(在一个实施方案中3至6个)亚甲基-羧基-甲基(-CH2-C(O)-)，和/或b)1至10个(在一个实施方案中1至5个)氨基酸残基(在一个实施方案中，所述氨基酸残基选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸盐，β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸或赖氨酸)，和/或c)一种或多种(在一个实施方案中一种或两种)具有结构式NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH的化合物，其中n是2或3并且x是1至10，在一个实施方案中x是1至7。末尾单元(至少部分地)产生式-NH-[(CH2)nO]xCH2-CH2-C(O)-的接头(部分)。这类化合物的一个例子例如是12-氨基-4,7,10-三氧杂十二烷酸(产生TEG(三乙二醇)接头)。接头具有稳定及增溶作用，原因在于它含有电荷或/和可以形成氢桥。此外，它可以在空间上促进抗半抗原抗体与半抗原缀合的多肽毒素结合。在一个实施方案中，接头位于多肽毒素的氨基酸的侧链处(例如经由氨基与赖氨酸侧链缀合)。在一个实施方案中，接头位于多肽毒素的氨基末端处或羧基末端处。接头在多肽上的位置一般选择在不影响多肽毒素的生物学活性的区域处。因此，接头的确切附接位置取决于多肽毒素和负责生物学活性的相关结构要素。可以在体外测定法中检验与半抗原附接的多肽毒素的生物学活性。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从中衍生的子代，而无论传代次数是多少。在核酸含量方面，子代与亲本细胞可以不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括这样的突变体子代，所述突变体子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的子代相同的功能或生物学活性。
“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的或衍生自利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且通常2个可变结构域中的基本上全部，其中HVR中的全部或基本上全部(例如，CDR)与非人抗体中的那些对应，并且FR中的全部或基本上全部与人抗体中的那些对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”(例如，非人抗体)指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。
本文中的HVR包括
(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat,E.A.等人,免疫相关的蛋白质序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；
(c)出现在第27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)氨基酸残基处的抗原触点(MacCallum等人.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
“个体”或“对象”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类(如，猴))、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或对象是人。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman,S.等人,J.Chrom.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括在细胞内所含的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，组成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然发生的突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对照，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生将要根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
术语“单特异性抗体”指具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点的每一个具有相同的结合特异性，即，与相同的抗原或半抗原结合。
“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
术语“包装说明书”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包含的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。
“亲本抗体”是包含这样的氨基酸序列的抗体，来自该氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基被替换为一个或多个半胱氨酸残基。亲本抗体可以包含天然或野生型序列。相对于抗体的其他天然形式、野生型形式或修饰形式，亲本抗体可以具有预先存在的氨基酸序列修饰(如，添加、缺失和/或置换)。亲本抗体与半抗原特异性结合。亲本抗体还可以额外地针对感兴趣的靶抗原，例如生物学上重要的多肽。针对非多肽抗原的抗体也在考虑之内。
术语“fMLP”指由N-甲酰甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸组成的三肽。在一个实施方案中，效应子部分是fMLP或其衍生物。
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”被定义为：对齐序列并根据需要引入空位以实现最大百分比的序列同一性并且不将任何保守置换考虑为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性的目的，可以按本领域技术范围内的多种方式实现比对，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的序列的整个长度范围内的最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局，Washington D.C.,20559，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序可以从Genentech公司,South SanFrancisco,California公开获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当被编译成在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在ALIGN-2被用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与、同或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(这可以备选地描述为与、同或针对给定氨基酸序列B具有或包含某％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别声明，否则本文所用的所有％氨基酸序列同一性值如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这样的形式，以允许其中所含的活性成分的生物学活性有效，并且不含有对将被施用该制剂的对象造成不可接受毒性的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除活性成分之外对对象无毒的成分。可药用载体包括，但不限于，缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。
“多肽”是由肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论是天然产生或合成产生。小于约20个氨基酸残基的多肽可以称作“肽”，而由两条或更多条多肽组成或包含超过100个氨基酸残基的一条多肽的分子可以称作“蛋白质”。多肽还可以包含非氨基酸组分，如糖基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以由在其中表达多肽的细胞添加并且可以随细胞类型变动。多肽在本文中根据它们的氨基酸主链结构或编码它们的核酸限定。附加物(如，糖基团)通常不予指定，但仍然可以存在。如在本发明中使用的多肽包含至少三个氨基酸残基。一个氨基酸残基是半胱氨酸残基，用于形成与抗半抗原抗体连接的二硫键，并且，一个氨基酸残基是赖氨酸残基，用于与半抗原缀合。半抗原化多肽中的多肽的第三个氨基酸残基是i)用于与有效载荷缀合的单个氨基酸残基或ii)多肽。还包括这样的多肽，所述多肽本身是具有生物学活性的较大的多肽的一部分，如，举例来说，所述多肽是多肽毒素的一部分。
所有多肽序列根据普遍接受的惯例书写，因而α-N-末端氨基酸残基在左侧并且α-C-末端氨基酸残基在右侧。如本文所使用的，术语“N-末端”指多肽中氨基酸的游离α-氨基，并且术语“C-末端”指多肽中氨基酸的游离α-羧酸末端。N-末端以某个基团终止的多肽指在N-末端氨基酸残基的α-氨基氮上携带基团的多肽。N-末端以某个基团终止的氨基酸指在α-氨基氮上携带基团的氨基酸。
除非通过“D”前缀另外指明(例如，D-Ala或N-Me-D-Ile)或者以小写字母样式书写(例如a、i、1(D形式的Ala、Ile、Leu))，否则本说明书和所附权利要求书中描述的多肽中的氨基酸和氨酰基残基的α-碳的立体化学是天然构型或“L”构型。Cahn-Ingold-Prelog“R”和“S”命名用来规定在多肽的N-末端处某些酰基取代基中的手性中心的立体化学。命名“R,S”意在指示两种对映异构形式的外消旋混合物。这种命名法遵循Cahn,R.S.等人,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.5(1966)385-415中描述的命名法。
术语“单链Fv”，简写为“scFv”，指包含抗体VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。在一个实施方案中，Fv多肽还包含在VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头允许scFv形成用于抗原结合的期望结构。关于scFv的综述，参见Plueckthun收录于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编著),Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“茶碱”，简写为“THEO”，指1,3-二甲基-7H-嘌呤-2,6-二酮。茶碱又称作二甲基黄嘌呤。
术语“治疗”(和其语法变型如“治疗”或“治疗”)指意欲改变正在治疗的个体的自然进程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学进程期间进行。想要的治疗效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发，缓解症状，减轻疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，降低病情进展速率，改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“×价”，例如“单价”或“二价”或“三价”或“四价”，指抗体分子中存在指定数目的结合位点，即“×”个。就这一点而论，术语“二价”、“四价”和“六价”指抗体分子中分别存在2个结合位点、4个结合位点和6个结合位点。如本文所报告的双特异性抗体至少是“二价的”并且可以是“三价”或“多价的”(例如“四价”或“六价”)。在一个实施方案中，如本文所报告的双特异性抗体是二价、三价或四价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是二价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是三价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是四价的。
在某些方面和实施方案中，如本文所报告的抗体具有两个或更多个结合位点并且是双特异性的。即，这些抗体可以是双特异性的，甚至在存在多于两个结合位点的情况下(即，该抗体是三价或多价的)也是如此。术语双特异性抗体包括，例如，多价单链抗体、双抗体和三抗体(triabodies)，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，其中通过一个或多个肽接头与其他抗原结合位点(例如，单链Fv、VH结构域和/或VL结构域、Fab或(Fab)2)连接。抗体可以是来自单一物种的全长抗体或经嵌合化或人源化。对于具有多于两个抗原结合位点的抗体，一些结合位点可以是相同的，只要该蛋白质具有针对两种不同抗原的结合位点即可。即，在第一结合位点特异于半抗原的情况下，第二结合位点特异于非半抗原的抗原，并且反之亦然。
术语“可变区”指抗体重链或轻链的参与抗体结合其抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt,T.J.等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域文库。参见，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628。
术语“载体”指能够增殖与之连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入宿主细胞的基因组中的载体，其中已经向所述细胞中引入所述载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
II.如本文所报告的缀合物
假单胞菌外毒素A链(PE)是由613个氨基酸残基组成的66kDa的多肽。它由三个功能结构域构成：结构域I，N-末端受体结合结构域，其与真核细胞结合，结构域II，其负责内化，并且变成蛋白水解加工的II，以及结构域III，其是C-末端，并且在加工后释放到细胞质中。结构域III使eEF2发生ADP-核糖基化，这导致蛋白质合成的抑制和随后的细胞死亡。
PE的不同截短变体的组成示于图21A。在截短变体NLysPE38中，细胞结合结构域I和结构域IB被删除。该分子本身具有非常低的细胞毒性效力。NLysPE38含有接近于其N-末端的赖氨酸残基(Nlys)，其可以通过NHS-化学进行化学修饰。最近已经表明，在二硫化物稳定化的Fv-融合物(dsscFv-融合物)的情况下，大部分结构域II也可以删除而不会损失效力，只要加工位点保留。这类融合蛋白内部的截短毒素变体的大小约为25kDa。截短毒素变体在结构域III中仍然含有赖氨酸残基。在截短毒素变体NlysPE40QQR中，结构域III的赖氨酸已被替换为谷氨酰胺和/或精氨酸以减小胺修饰试剂如NHS(例如当化学缀合所述截短毒素变体时)使结构域III失活的风险。本文报告了新的截短PE变体NLysPE25SQΔ，其中结构域I和IB以及大部分结构域II已被删除(CD22-LR8M的毒素部分)，并且，其在结构域III中含有赖氨酸至丝氨酸或谷氨酰胺的交换。此外，其C-末端赖氨酸被删除，并且携带氨基末端N-Lys延伸。NLysPE25SQΔ是一个相当小的毒素部分，该毒素部分仅含有一个位于其N-末端处的赖氨酸。该赖氨酸的伯胺(和N-末端的伯胺)可以由NHS-试剂修饰而不影响该毒素的其他位置。
为了产生含有额外半胱氨酸(其用于半抗原介导的与双特异性抗体共价偶联)的毒素衍生物，将半胱氨酸放入NLysPE25SQΔ中用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后。
在一个方面，本发明基于如下发现：可以通过在多肽中适当安置的半胱氨酸残基和抗体的可变结构域中的(尤其是抗体的CDR2中的)半胱氨酸残基之间形成二硫键获得包含半抗原化多肽和与半抗原特异性结合的抗半抗原抗体的共价缀合物，其中所述CDR2根据Kabat的重链可变结构域编号法来确定。
在某些实施方案中，该抗原是半抗原。在一个实施方案中，该半抗原是生物素、或洋地黄毒苷、或荧光素、或茶碱、或碳硼烷。
在一个实施方案中，该半抗原化多肽是包含半抗原、接头和多肽毒素的缀合物。在一个实施方案中，该半抗原是生物素、或洋地黄毒苷、或荧光素、或茶碱、或碳硼烷、或溴脱氧尿苷。在一个实施方案中，该多肽是多肽毒素。
半抗原化多肽和抗半抗原抗体的共价缀合物可以向该多肽赋予良好的生物物理行为和改进的PK特性。另外，在使用双特异性抗体的情况下，该缀合物可以用于将该多肽靶向至细胞，其中所述细胞展示被双特异性抗体的第二结合特异性识别的抗原。这类缀合物由一种抗半抗原结合特异性和一种(非半抗原的)抗原结合特异性组成。抗体分子与半抗原化多肽分子的化学计量比取决于双特异性抗体的样式并且可以是1:1、1:2、2:1、2:2、2:4和4:2(抗体:半抗原化多肽)。
期望的是多肽保留良好的生物学活性，尽管与半抗原缀合以及与抗半抗原抗体缀合。还期望的是(在双特异性靶向模块的情况下)，在共价缀合的半抗原化多肽存在下，双特异性抗体的细胞表面靶结合位点保留其结合特异性和亲和力。
为了在抗半抗原抗体和半抗原化多肽之间形成共价缀合物，两种化合物都必须通过引入反应基团而被修饰。一旦抗半抗原抗体结合半抗原，则使得两个反应基团紧邻，从而允许共价键形成。在一个实施方案中，该修饰是在每种化合物中引入巯基功能性。在一个实施方案中，该巯基化合物是半胱氨酸残基。
待突变的位置必须同时满足两个要求：(i)偶联位置应当靠近结合区以利用半抗原定位效应用于定向偶联，和(ii)突变位置和偶联位置必须以不影响半抗原结合本身的方式安置。关于找到合适位置的这些要求事实上是彼此‘矛盾’的，因为要求(i)由接近于结合位点的位置最佳满足，然而，要求(ii)由远离结合位点的位置最安全地实现。
尽管有这些实际上排他性的要求，仍然能够在抗半抗原抗体中鉴定到可以在不影响半抗原安置的情况下突变，并且然而同时允许定向共价偶联的位置。
根据重链可变结构域的Kabat编号法，第一位置分别位于位置VH52b处或位置VH53处。如果抗体具有不含有居间残基(如52a、52c、52c和52d)的短VH CDR2，则该位置是53(根据Kabat的抗体重链可变结构域编号方案和规则编号和对齐)。如果抗体具有包含残基52a和52b并且还任选包含残基如52c和52d等的长VH CDR2，则该位置是52b(根据Kabat的抗体重链可变结构域编号方案和规则编号和对齐)。
根据Kabat编号法，第二位置是位于位置VH28处。
例如，在抗洋地黄毒苷抗体结构中，半抗原结合于疏水性残基形成的深口袋中。在这项结晶学研究中使用荧光洋地黄毒苷-Cy5缀合物，其中荧光团以及洋地黄毒苷和Cy5之间的接头在结构中不可见，原因在于高度灵活性和所致的晶体中无序性。然而，接头和Cy5附着于指向重链CDR2方向的洋地黄毒苷的O32。洋地黄毒苷的O32与根据Kabat的位置52b中氨基酸残基的Cα之间的距离约为
Figure BDA0001038570250000311
已经发现该位置是“通用”位置，即，该位置适用于任何(抗半抗原)抗体，并且因此，不需要每次从零开始不得不通过提供晶体结构和确定能够进行半抗原定位的共价偶联的适宜位置来修饰新(抗半抗原)抗体。
根据Kabat编号方案，突变VH52bC或VH53C分别可以出乎意料地用于每种所分析的结合半抗原的抗体。尽管抗体及其结合袋的结构相当多样，仍已经显示VH52bC/VH53C突变可以用于半抗原/半抗原化化合物与结合半抗原(如，举例来说，洋地黄毒苷、生物素、荧光素、茶碱以及溴脱氧尿苷)的抗体共价附着。因此，已经进一步发现，在无需进一步结构设计或知晓具体抗体结构并且不干扰抗体可变结构域内在结合特性的情况下，将根据Kabat编号法的位置VH52b/VH53处的氨基酸残基(该残基位于抗体的重链CDR2内部)变成半胱氨酸适用于其他(抗半抗原)抗体。
如本文所报告的修饰的抗体保留其亲本(即野生型)抗半抗原抗体的半抗原结合能力。因此，包含人工抗体半胱氨酸残基的抗半抗原抗体结合，在一个实施方案中特异性结合半抗原。
术语“与……结合的抗体”指抗体可以与其抗原以特异性方式形成复合物。这种特异性结合可以在体外测定法中(如，在等离子体共振测定法(BIAcore,GE-HealthcareUppsala,Sweden)中)检测。复合物形成的亲和力由术语ka(化合物缔合以形成复合物的速率常数)、kD(解离常数，复合物的解离)和KD(kD/ka)定义。结合或特异性结合意指约10-8M或更小、在一个实施方案中约10-8M至约10-13M、在一个实施方案中约10-9M至约10-13M的结合亲和力(KD)。因此，与半抗原结合以形成如本文所报告的复合物的抗体以约10-8mol/l或更小、在一个实施方案中以约10-8mol/l至约10-13mol/l、在一个实施方案中以约10-9mol/l至10- 13mol/l的结合亲和力(KD)与半抗原特异性结合。
已经发现，当抗体与半抗原结合时，在半胱氨酸修饰的抗半抗原抗体和半胱氨酸修饰的与半抗原缀合的多肽之间发生共价键形成，而不要求添加还原剂和/或氧化剂如果形成的键是二硫键。因此，当形成非共价复合物时，两种化合物之间的二硫桥自发地形成。因此，一种用于形成如本文所报告的共价复合物的方法仅需要混合这两种化合物。形成二硫键的唯一先决条件是两种化合物相对于彼此的正确取向。
含有人工抗体半胱氨酸残基的抗半抗原抗体可以位点特异地和有效地与包含人工多肽半胱氨酸残基的半抗原化多肽偶联。
将在位置VH52b和VH53(根据Kabat编号方案)处的氨基酸残基分别替换为半胱氨酸残基，产生了具有列于SEQ ID NO:20和28(关于抗洋地黄毒苷抗体-VH52bC)、列于SEQ IDNO:84和92(关于抗茶碱抗体-VH53C)、列于SEQ ID NO:52和60(关于抗生物素抗体-VH53C)以及列于SEQ ID NO:108(关于抗荧光素抗体-VH52bC)的重链可变区序列的抗体衍生物。
将在位置VH28(根据Kabat编号方案)处的重链可变结构域氨基酸残基替换为半胱氨酸残基，产生了具有分别列于SEQ ID NO:116、124、132、140、148、156和164的重链可变区序列的抗体衍生物。
在一个实施方案中，抗洋地黄毒苷抗体特征在于包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:09或25的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:10或26的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:11或27的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:13或29的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:14或30的氨基酸序列的轻链CDR2，以及(f)包含SEQ ID NO:15或31的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，抗生物素抗体特征在于包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:41或57的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:42或58的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:43或59的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQID NO:45或61的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:46或62的氨基酸序列的轻链CDR2，以及(f)包含SEQ ID NO:47或64的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，抗荧光素抗体特征在于包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:105或113的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:106或114的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:107或115的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:109或117的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:110或118的氨基酸序列的轻链CDR2，以及(f)包含SEQ ID NO:111或119的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，抗茶碱抗体特征在于包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:73或89的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:74或90的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:75或91的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQID NO:77或93的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:78或94的氨基酸序列的轻链CDR2，以及(f)包含SEQ ID NO:79或95的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，抗洋地黄毒苷抗体特征在于包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(i)包含SEQ ID NO:09或25的氨基酸序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:10或26的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)包含SEQ ID NO:11或27的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VLCDR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO:13或29的氨基酸序列的轻链CDR1、(ii)包含SEQID NO:14或30的氨基酸序列的轻链CDR2和(c)包含SEQ ID NO:15或31的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，抗生物素抗体特征在于包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(i)包含SEQ ID NO:41或57的氨基酸序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:42或58的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)包含SEQ ID NO:43或59的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO:45或61的氨基酸序列的轻链CDR1、(ii)包含SEQ IDNO:46或6242的氨基酸序列的轻链CDR2和(c)包含SEQ ID NO:47或63的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，抗荧光素抗体特征在于包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(i)包含SEQ ID NO:105或113的氨基酸序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:106或114的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)包含SEQ ID NO:107或115的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO:109或117的氨基酸序列的轻链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:110或118的氨基酸序列的轻链CDR2和(c)包含SEQ ID NO:111或119的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，抗茶碱抗体特征在于包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(i)包含SEQ ID NO:73或89的氨基酸序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:74或90的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)包含SEQ ID NO:75或91的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO:77或93的氨基酸序列的轻链CDR1、(ii)包含SEQ IDNO:78或94的氨基酸序列的轻链CDR2和(c)包含SEQ ID NO:79或95的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，抗洋地黄毒苷抗体和/或抗生物素抗体和/或抗茶碱抗体是人源化抗体。
在一个实施方案中，抗洋地黄毒苷抗体包含如上述实施方案的任一个中的CDR，并且还包含受体人类框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施方案中，抗生物素抗体包含如上述实施方案的任一个中的CDR，并且还包含受体人类框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施方案中，抗茶碱抗体包含如上述实施方案的任一个中的CDR，并且还包含受体人类框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施方案中，抗洋地黄毒苷抗体特征在于包含与SEQ ID NO:04或12或20或28的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:01或09或17或25中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。任选地，抗洋地黄毒苷抗体包含SEQ ID NO:01或09或17或25中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，抗洋地黄毒苷抗体特征在于包含与SEQ ID NO:08或16或24或32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:08或16或24或32中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。任选地，抗洋地黄毒苷抗体包含SEQ ID NO:08或16或24或32中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，抗生物素抗体特征在于包含与SEQ ID NO:36或44或52或60的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗生物素抗体保留与生物素结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:36或44或52或60中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。任选地，抗生物素抗体包含SEQ ID NO:36或44或52或60中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，抗荧光素抗体特征在于包含与SEQ ID NO:108或116的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗荧光素抗体保留与荧光素结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:108或116中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。任选地，抗荧光素抗体包含SEQ ID NO:108或116中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，抗茶碱抗体特征在于包含与SEQ ID NO:68或76或84或92的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗茶碱抗体保留与茶碱结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:68或76或84或92中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。任选地，抗茶碱抗体包含SEQ ID NO:68或76或84或92中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，抗洋地黄毒苷抗体特征在于包含如上文提供的实施方案的任一个中的VH和如上文提供的实施方案的任一个中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:04或12或20或28和SEQ ID NO:08或16或24或32中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，抗生物素抗体特征在于包含如上文提供的实施方案的任一个中的VH和如上文提供的实施方案的任一个中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:36或44或52或60和SEQ ID NO:40或48或56或64中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，抗荧光素抗体特征在于包含如上文提供的实施方案的任一个中的VH和如上文提供的实施方案的任一个中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:108或116和SEQ ID NO:112或120中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在一个实施方案中，抗茶碱抗体特征在于包含如上文提供的实施方案的任一个中的VH和如上文提供的实施方案的任一个中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQID NO:68或76或84或92和SEQ ID NO:72或80或88或96中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
被鉴定为修饰点的又一个位置是根据Kabat编号法的位置VH28。
将在根据Kabat的位置VH28处的氨基酸替换为半胱氨酸，产生了具有如SEQ IDNO:124和132(关于抗洋地黄毒苷抗体-VH28C)、SEQ ID NO:156和164(关于抗茶碱抗体-VH28C)、SEQ ID NO:140和148(关于抗生物素抗体-VH28C)和SEQ ID NO:116(关于抗荧光素抗体-VH28C)列出的重链可变区序列的抗体衍生物。
ESI-MS分析显示半抗原化治疗性肽的共价抗体缀合产生具有确定大小的缀合物，其大于非复合的抗体或非复合的肽。
表1:TIC表
Figure BDA0001038570250000391
1)HC w N-末端焦谷氨酸
2)HC w/o C-末端Lys
3)在糖基化位点处因去糖基化所致的HC w N->D
4)LC w N-末端焦谷氨酸
抗体亲和力
在某些实施方案中，如本文所报告的抗体本身或如本文所报告的复合物中的抗体具有≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如约10-8M或更小，例如从约10-8M至约10-13M，例如，从约10-9M至约10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量Kd，所述测定法用感兴趣抗体的Fab形式和其抗原如以下测定法所述那样进行。通过以下方式测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在未标记抗原的滴定系列存在下用最低浓度的(125I)-标记抗原平衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如，Chen,Y.等人,J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了建立用于测定法的条件，将
Figure BDA0001038570250000403
多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml抗Fab捕获抗体(CappelLabs)包被过夜并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温下(大约23℃)封闭2至5小时。在非吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与感兴趣Fab的连续稀释物(例如，与Presta,L.G.等人,Cancer Res.57(1997)4593-4599中评估抗VEGF抗体Fab-12一致)混合。随后将感兴趣Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续较长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板以便在室温下孵育(例如，1小时)。随后移除溶液并将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20
Figure BDA0001038570250000404
洗涤8次。当平板已经干燥时，添加150μl/孔闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定法中。
根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法，使用
Figure BDA0001038570250000401
-2000或
Figure BDA0001038570250000402
-3000(BIAcore公司,Piscataway,NJ)在25℃采用固定抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)，测量Kd。简而言之，根据供应商的说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE公司)。抗原用pH 4.8的10mM乙酸钠稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速注射以达到大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白。在注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以大约25μl/分钟的流速注入含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0001038570250000411
Figure BDA0001038570250000412
评估软件，版本3.2)，通过同时拟合缔合和解离传感图，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen,Y.等人,J.Mol.Biol.293(1999)865-881。如果通过以上的表面等离子体共振测定法显示缔合速率超过106M-1s-1，则可以使用荧光猝灭技术测定缔合速率，其中在如光谱仪(如配备止流阀(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的增加浓度的抗原存在下，所述荧光猝灭技术在25℃测量在pH 7.2的PBS中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)增加或减少。
抗体片段
在某些实施方案中，如本文所报告的缀合物中的结合特异性是抗体片段。抗体片段包括，但不限于，Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见，例如，Plueckthun,A.,收录于；The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编著),Springer-Verlag,New York(1994),第269-315页；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见US 5,869,046。
双抗体(Diabodies)是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134；以及Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三抗体(Triabodies)和四抗体(tetrabodies)同样描述于Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(20039 129-134)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或者全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis公司,Waltham,MA；参见，例如，US 6,248,516)。
可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及由重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，如本文所报告的缀合物中的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在US 4,816,567；和Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(如，猴)的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类切换”抗体，其中类或亚类已被改变而不同于亲本抗体的类或亚类。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。典型地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR(例如，CDR)(或其部分)衍生自非人抗体并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人类抗体(例如，从中衍生HVR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制造它们的方法综述于，例如Almagro，J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633，并且还描述于，例如Riechmann,I.等人,Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri,S.V.等人,Methods 36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua,W.F.等人,Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；和Osbourn,J.等人,Methods 36(2005)61-68以及Klimka,A.等人,Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述针对FR改组的“导向选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的框架区(参见，例如，Sims,M.J.等人,J.Immunol.151(1993)2296-2308)；从轻链可变区或重链可变区的特定亚组的人抗体共有序列衍生的框架区(参见，例如，Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；以及从筛选FR文库衍生的框架区(参见，例如，Baca,M.等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等人,J.Biol.Chem.271(19969 22611-22618))。
人抗体
在某些实施方案中，如本文所报告的缀合物中的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体总体上在van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374以及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中描述。
可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。还参见，例如，描述XENOMOUSETM技术的US 6,075,181和US 6,150,584；描述
Figure BDA0001038570250000441
技术的US 5,770,429；描述K-M
Figure BDA0001038570250000442
技术的US 7,041,870，以及描述
Figure BDA0001038570250000443
技术的US 2007/0061900。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人恒定区组合。
也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,Marcel Dekker公司,New York(1987),第51-63页；以及Boerner,P.等人,J.Immunol.147(1991)86-95)。在Li,J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562中也描述了经由人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(其描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,J.,Xiandai Mianyixue26(2006)265-268(其描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。在Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20(2005)927-937以及Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology27(2005)185-191中也描述了人杂交瘤技术(三体瘤技术)。
也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。这类可变结构域序列随后可以与期望的人恒定结构域组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
文库衍生的抗体
可以通过针对具有期望的一种或多种活性的抗体筛选组合文库来分离如本文所报告的缀合物中的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库和针对拥有期望的结合特性的抗体筛选这类文库的多种方法。这类方法综述于，例如，Hoogenboom,H.R.等人,Methods in Molecular Biology 178(2001)1-37，并且还描述于，例如，McCafferty,J.等人,Nature 348(1990)552-554；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.,Methods in MolecularBiology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等人,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等人,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；以及Lee,C.V.等人,J.Immunol.Methods 284(2004)119-132。
在某些噬菌体展示方法中，VH基因库和VL基因库分别由聚合酶链式反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，随后可以针对结合抗原的噬菌体筛选所述噬菌体文库，如Winter,G.等人,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆幼稚库以便在不作任何免疫的情况下提供针对广泛的非自身抗原还有自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths,A.D.等人,EMBO J.12(1993)725-734所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区并实现体外重排，合成地产生幼稚文库，如Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括，例如：US 5,750,373，和US 2005/0079574，US 2005/0119455，US 2005/0266000，US 2007/0117126，US 2007/0160598，US 2007/0237764，US2007/0292936，以及US 2009/0002360。
将从人抗体文库分离的抗体或抗体片段视为本文中的人抗体或人抗体片段。
抗体形式
上文概述的抗体和抗体片段可以按多种方式组合以产生不同的抗体形式。
例如，一个或多个scFv抗体片段可以与完整抗体的一条或多条多肽链的C-末端融合。scFv抗体片段尤其可以与每个重链C-末端或与每个轻链C-末端融合。
例如，一个或多个抗体Fab片段可以与完整抗体的一条或多条多肽链的C-末端融合。抗体Fab片段尤其可以与每个重链C-末端或与每个轻链C-末端融合。
例如，一个scFv和一个抗体Fab片段可以与抗体Fc区的N-末端融合。
例如，一个scFv或抗体Fab片段可以与抗体Fc区的N-末端融合并且一个scFv或抗体Fab片段可以与抗体Fc区的相应另一条链的C-末端融合。
多特异性抗体
已经开发了类型广泛的重组抗体形式，例如，由例如IgG抗体形式与单链结构域融合的四价双特异性抗体(参见，例如，Coloma,M.J.等人,Nature Biotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342；以及Morrison,S.L.,Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。
另外，已经开发了其中不再保留抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的几种其他形式，如双抗体、三抗体或四抗体、微型抗体、能够结合两种或更多种抗原的几种单链形式(scFv、双scFv)(Holliger,P.等人,Nature Biotech 23(2005)1126-1136；Fischer,N.,Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；Shen,J.等人,Journal of ImmunologicalMethods 318(2007)65-74；Wu,C.等人,Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。
所有这类形式均使用接头以使抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)与其他结合蛋白(例如，scFv)融合或以使例如两个Fab片段或scFv融合(Fischer,N.和Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14)。应当牢记，人们可能希望通过维持与天然存在的抗体的高程度相似性而保留效应子功能，如，举例来说，补体依赖的细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)，它们通过Fc受体结合介导。
在WO 2007/024715中报告了作为工程化多价和多特异性结合蛋白的双重可变结构域免疫球蛋白。在US 6,897,044中报告了一种用于制备生物学上有活性的抗体二聚体的方法。在US 7,129,330中报告了具有至少四个可变结构域的多价FV抗体构建体，所述可变结构域经由肽接头彼此连接。在US 2005/0079170中报告了二聚的和多聚的结合抗原的结构。在US 6,511,663中报告了包含三个或四个Fab片段(它们通过连接结构彼此共价结合)的三价或四价单特异性抗原结合蛋白，所述蛋白质不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报告了可以在原核细胞和真核细胞中高效表达并且可用于治疗方法和诊断方法中的四价双特异性抗体。在US 2005/0163782中报告了一种这样一种方法，所述方法从包含两种类型的多肽二聚体的混合物中，区别于不经由至少一个链间二硫键连接的二聚体，分离或偏好地合成经由至少一个链间二硫键连接的二聚体。在US 5,959,083中报告了双特异性四价受体。在WO 2001/077342中报告了具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体。
在WO 1997/001580中报告了多特异性和多价的结合抗原的多肽。WO 1992/004053报告了同型缀合物，典型地从与相同抗原决定簇结合并且通过合成性交联共价连接的IgG类单克隆抗体制备。在WO 1991/06305中报告了对抗原具有高亲合力的寡聚单克隆抗体，其中分泌寡聚物(一般为IgG类)，所述寡聚物具有缔合在一起以形成四价或六价IgG分子的两个或更多个免疫球蛋白单体。在US 6,350,860中报告了源自绵羊的抗体和工程化抗体构建体，它们可以用于治疗其中干扰素γ活性致病的疾病。在US 2005/0100543中报告了可靶向构建体，它们是双特异性抗体的多价载体，即，可靶向构建体的每个分子可以充当两个或更多个双特异性抗体的载体。在WO 1995/009917中报告了遗传工程化的双特异性四价抗体。在WO 2007/109254中报告了由稳定化scFv组成或包含稳定化scFv的稳定化结合分子。
在某些实施方案中，本文提供的抗体或如本文所报告的缀合物中的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一针对半抗原并且另一种特异性针对任何其他(非半抗原的)抗原。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位至细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
用于产生多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540，WO 93/08829，以及Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“隆突进入孔穴(knob-in-hole)”工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应，用于产生抗体Fc异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980，和Brennan,M.等人,Science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双抗体(diabody)”技术，用于产生双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber,M等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如描述于，例如，Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69)。
在一个实施方案中，通过“隆突进入孔穴(knob-into-hole)”技术改变双特异性抗体的重链的CH3结构域，该技术以几个例子详述于，例如，WO 96/027011，WO 98/050431，Ridgway J.B.等人,Protein Eng.9(1996)617–621，Merchant,A.M.等人,Nat Biotechnol16(1998)677-681。在这种方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域中的一个可以是“隆突”，而另一个是“孔穴”。二硫桥的引入使异二聚体稳定(Merchant,A.M,等人,Nature Biotech16(1998)677-681，Atwell,S.等人J.Mol.Biol.270(1997)26–35)并增加产量。
在所有方面的一个实施方案中，双特异性抗体特征在于
-一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域各自在包含抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处会合，
其中改变所述界面以促进双特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于
a)改变一条重链的CH3结构域，
从而在一条重链的CH3结构域的初始界面内(该初始界面与双特异性抗体内另一条重链的CH3结构域的初始界面会合)，
将氨基酸残基替换为具有更大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内产生突出，所述突出可放置于另一条重链的CH3结构域的界面内的空穴中
和
b)改变另一条重链的CH3结构域，
从而在第二CH3结构域的初始界面内(该初始界面与双特异性抗体内第一CH3结构域的初始界面会合)
将氨基酸残基替换为具有更小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二CH3结构域的界面内产生空穴，在所述空穴内可放置第一CH3结构域的界面内的突出。
因此，在一个实施方案中，如本文所报告的抗体特征在于
-全长抗体的第一重链的CH3结构域和全长抗体的第二重链的CH3结构域各自在包含改变的界面处会合，所述改变位于抗体CH3结构域之间的初始界面中，
其中i)在第一重链的CH3结构域中
将氨基酸残基替换为具有更大侧链体积的氨基酸残基，因而在一条重链的CH3结构域的界面内产生突出，所述突出可放置于另一条重链的CH3结构域的界面内的空穴中
并且其中ii)在第二重链的CH3结构域中
将氨基酸残基替换为具有更小侧链体积的氨基酸残基，因而在第二CH3结构域的界面内产生空穴，在所述空穴内可放置第一CH3结构域的界面内的突出。
在一个实施方案中，具有更大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)组成的组。
在一个实施方案中，具有更小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)组成的组。
在一个实施方案中，两个CH3结构域均通过以下方式进一步改变：引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域的相应位置中的氨基酸，使得两个CH3结构域之间的二硫桥可以形成。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含位于“隆突链”的CH3结构域中的T366W突变和位于“孔穴链”的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变。也可以使用CH3结构域之间的额外链间二硫键(Merchant,A.M,等人,Nature Biotech 16(1998)677-681)，例如，通过向“隆突链”的CH3结构域引入Y349C突变并向“孔穴链”的CH3结构域引入E356C突变或S354C突变(根据Kabat等人,免疫相关的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的EU索引编号法)。
在一个实施方案中，双特异性抗体在两个CH3结构域之一中包含Y349C、T366W突变并且在两个CH3结构域的另一者中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突变。在一个实施方案中，双特异性抗体在两个CH3结构域之一中包含Y349C、T366W突变并且在两个CH3结构域的另一者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突变(在一个CH3结构域中的额外Y349C突变和另一个CH3结构域中的额外E356C或S354C突变形成链间二硫键)(根据Kabat的EU索引编号法；(Kabat,E.A.等人,免疫相关的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest),第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)))。可以备选地或额外地使用如EP 1870459A1所描述的其他的隆突进入孔穴技术。因此，关于双特异性抗体的另一个例子是在“隆突链”的CH3结构域中的R409D、K370E突变和在“孔穴链”的CH3结构域中的D399K、E357K突变(根据Kabat的EU索引编号法；(Kabat,E.A.等人,免疫相关的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest),第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)))。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含位于“隆突链”的CH3结构域中的T366W突变和位于“孔穴链”的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变以及额外地位于“隆突链”的CH3结构域中的R409D、K370E突变和位于“孔穴链”的CH3结构域中的D399K、E357K突变。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3结构域的另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变，或者双特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3结构域的另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变以及额外地位于“隆突链”的CH3结构域中的R409D、K370E突变和位于“孔穴链”的CH3结构域中的D399K、E357K突变。CH3结构域中的这类隆突突变和孔穴突变典型地用于SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172(人IgG1亚类同种异型(高加索人种和非洲裔美国人或突变体L234A/L235A和L234A/L235A/P329G))、SEQID NO:173、SEQ ID NO:174或SEQ ID NO:175(人IgG4亚类或突变体S228P、L235E和S228P/L235E/P329G)的人重链恒定区中(根据Kabat等人,免疫相关的蛋白质序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991)的EU索引编号法)。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ IDNO:171、或SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、或SEQ ID NO:175的人重链恒定区，还包含CH3结构域中的这类“隆突”突变和“孔穴”突变(例如，在两个CH3结构域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3结构域的另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变)(根据Kabat等人,免疫相关的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的EU索引编号法)。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibody)”(参见，例如US 2006/0025576)。
本文中的抗体或片段还包括“双重作用Fab(Dual Acting Fab)”或“DAF”，其包含与半抗原以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(例如，参见US 2008/0069820)。
本文中的抗体或片段也包括在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793中描述的多特异性抗体。
在一个实施方案中，双特异性抗体的第一结合特异性针对半抗原并且第二结合特异性针对非半抗原的抗原。在一个实施方案中，非半抗原的抗原选自白细胞标记物：CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD18、CD19、CD22、CD23、CD27及其配体、CD28及其配体B7.1、B7.2、B7.3、CD29及其配体、CD30及其配体、CD40及其配体gp39、CD44、CD45和同工型、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA-4、LFA-1和TCR；组织相容性抗原：MHC I类或II类、Lewis Y抗原、SLex、SLey、SLea和SLeb；整合素：VLA-1、VLA-2、VLA-3、VLA-4、VLA-5、VLA-6、αVβ3和LFA-1、Mac-1和pl50,95、αVβ1、gpIIbIIIa、αRβ3、α6β4、αVβ5、αVβ6和αV 62 7；选择素：L-选择素、P-选择素和E-选择素及其反受体VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2和LFA-3；白细胞介素：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14和IL-15；白细胞介素受体选自由IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-14R和IL-15R组成的组；趋化因子选自由PF4、RANTES、MIP1α、MCP1、NAP-2、Groα、Groβ和IL-8组成的组；生长因子选自由TNFα、TGFβ、TSH、VEGF/VPF、VEGFA、VEGFB、VEGF111、VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、PTHrP、EGF家族、PDGF家族、内皮素、纤维化蛋白(FSF-1)、人层粘连蛋白和胃泌素释放肽(GRP)、PLGF、HGH、HGHR组成的组；生长因子受体选自由TNFαR、RGFβR、TSHR、VEGFR/VPFR、EGFR、PTHrPR、PDGFR家族、EPO-R、GCSF-R和其他造血受体组成的组；干扰素受体选自由IFNCαR、IFNβR和IFNλR组成的组；Ig及其受体选自由IgE、FcγRI和FcγRII组成的组；肿瘤抗原选自由her2-neu、黏蛋白、CEA和内皮唾液酸蛋白(endosialin)组成的组；变应原选自由屋尘螨抗原、lol p1(草)抗原和漆酚组成的组；病毒多肽选自由CMV糖蛋白B、H和gCIII、HIV-1包膜糖蛋白、RSV包膜糖蛋白、HSV包膜糖蛋白、HPV包膜糖蛋白、肝炎家族表面抗原(Hepatitis family surface antigen)组成的组；毒素选自由假单胞菌(pseudomonas)内毒素和骨桥蛋白(osteopontin)/尿桥蛋白(uropontin)、蛇毒、蜘蛛毒和蜂毒、芋螺毒素组成的组；血液因子选自由补体C3b、补体C4a、补体C4b-9、Rh因子、纤维蛋白原、纤维蛋白和髓鞘脂相关生长抑制剂组成的组；并且，酶选自由胆固醇酯转移多肽、膜结合型基质金属蛋白酶和谷氨酸脱羧酶(GAD)组成的组。
抗体变体
在某些实施方案中，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适当的修饰或通过肽合成制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列中缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列内的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以实现最终构建体，只要所述最终构建体拥有期望的特征，例如，结合抗原。
a)置换变体、插入变体和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的感兴趣位点包括HVR和FR。可以将氨基酸置换引入感兴趣抗体中并且针对期望的活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
表2.
原始残基 示例性置换 优选置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将需要这些分类之一的成员交换为另一个分类。
一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，为进一步研究所选择的产生的一个或多个变体相对于亲本抗体将在某些生物学特性方面具有改变(例如，改善)(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)，和/或，将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以便利地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如，本文所述的那些技术)。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并针对特定的生物学活性(例如，结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如，以改善抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基)(参见，例如，Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)和/或SDR(a-CDR)中做出，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。通过构建次级文库并从中重新选择所实现的亲和力成熟已描述于，例如，Hoogenboom,H.R.等人，收录于Methods in MolecularBiology 178(2002)1-37。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。随后创建次级文库。然后，筛选该文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR定向方法，其中，若干个HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。可以具体鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。尤其经常靶向重链CDR3和轻链CDR3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVR内部发生，只要这类改变不实质地降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在HVR中做出不实质地降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守置换)。这类改变可以是在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者不予改变，或者含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以被靶向用于诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描诱变法”，如Cunningham,B.C.和Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，残基或靶残基组(例如，带电荷残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)被鉴定并且被替换为中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。这类接触残基和邻近残基可以作为用于置换的候选者而被确定靶向或排除。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端的融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括将抗体的N-末端或C-末端与酶(例如，针对ADEPT)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的或包含于如本文所报告的缀合物中的抗体以增加或减少抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创建或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双天线状低聚糖，所述低聚糖通常通过N-连接附接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32。低聚糖可以包括多种糖，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接至双天线状低聚糖结构的“茎”中GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的低聚糖进行修饰以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有糖结构的抗体变体，所述糖结构缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖。例如，这类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的与Asn 297连接的所有糖结构(例如，复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内部Asn297处岩藻糖的平均量，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区内约297位置处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，Asn297也可以位于297位置的上游或下游大约±3个氨基酸附近，即，294和300位置之间，这归因于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，US 2003/0157108；US 2004/0093621。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.等人,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括在蛋白质岩藻糖化方面缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等人,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，特别是在实施例11处)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。
还可以提供具有双分低聚糖的抗体变体，例如，其中与抗体Fc区连接的双天线状低聚糖由GlcNAc对分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子描述于，例如，WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；和US 2005/0123546。还提供低聚糖中至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体描述于，例如，WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO1999/22764。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，因而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。
在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为这样的应用的期望的候选物，在所述应用中，抗体在体内的半寿期是重要的，而某些效应子功能(如，补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞(NK细胞)表达Fc(仅RIII)，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子描述于美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。备选地，可以使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology公司Mountain View,CA)和CytoTox
Figure BDA0001038570250000581
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的有用的效应细胞括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内(例如，在动物模型中，如在Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656公开的动物模型中)评估感兴趣分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见，例如，Gazzano-Santoro,H.等人,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人,Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半寿期的测定(参见，例如，Petkova,S.B.等人,Int.Immunol.18(2006:1759-1769))。
效应子功能降低的抗体包括置换一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(美国专利号6,737,056)的那些。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括将残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了与FcR结合改善或削弱的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312，和Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有提高ADCC的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置298、333和/或334处(残基的EU编号)的置换)的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，其导致改变的(即，改善的或削弱的)C1q结合和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)，例如，描述于美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184。
在US 2005/0014934中描述了半寿期增加和与新生Fc受体(FcRn)的结合改善的抗体，所述新生Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434的置换)的那些(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他例子，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；以及WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能希望产生半胱氨酸工程化抗体，例如，“巯基单抗(thioMAb)”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，被置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，反应性巯基由此被安置在抗体的可及位点处并且可以用于将抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体可以如例如在美国专利号7,521,541中所述产生。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并且易于获得的额外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三氧杂环己烷(poly-1,3,6-trioxane)、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一种聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑确定，包括，但不限于，待改善的抗体特定性质或功能，抗体衍生物是否将在限定的条件下用于治疗，等等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，其中所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并包括但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部分加热至这样的温度，在该温度下，邻近抗体-非蛋白质部分的细胞被杀死。
有效载荷
术语“有效载荷”指其活性期望被递送(入)至细胞中和/或定位于细胞处的任何分子或分子组合。有效载荷包括但不限于标记物、多肽毒素(例如，假单胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素等)、酶、生长因子、转录因子、药物、放射性核素、配体、抗体、脂质体、纳米粒子、病毒粒子、细胞因子等。
半抗原化化合物
如本文所报告的半抗原化多肽还可以缀合(如果多肽本身不是所述分子之一)至治疗剂(药物)、多肽毒素(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团如荧光染料如荧光素或罗丹明、用于成像或放疗金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除率调节剂如聚乙二醇的多种异构体、与第三组分结合的肽、或者另一种碳水化合物或亲脂性剂。缀合可以直接进行或经由间插的接头进行。
a)治疗剂(药物)
半抗原-药物缀合物(ADC，半抗原化药物)的药物部分(D)可以是具有细胞毒作用或细胞抑制作用的任何化合物、部分或基团。药物部分包括：(i)可以充当微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂的化疗剂；(ii)可以以酶促方式发挥作用的多肽毒素；和(iii)放射性同位素。
示例性药物部分包括，但不限于，美坦生类、澳瑞司他汀(auristatin)、多拉司他汀、单端孢霉烯族化合物、CC1065、刺孢霉素和其他烯二炔类抗生素、紫杉烷、蒽环类及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。
多肽毒素包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链(Vitetta等人(1987)Science,238:1098)、相思豆毒素A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-5)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物(WO 93/21232)。
治疗性放射性同位素包括32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212B、212Pb和Lu的放射性同位素。
放射性同位素或其他标记物可以按已知方式掺入(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57；"Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy"Chatal,CRC Press 1989)。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合至复合物的示例性螯合剂(WO 94/11026)。
b)标记物
半抗原化多肽还可以包含半抗原化标记物。能够使用可以与半抗原共价连接的任何标记物部分(参见，例如，Singh等人(2002)Anal.Biochem.304:147-15；Harlow E.和Lane,D.(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Springs HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagentsfor Protein Modification,第2版.CRC Press,Boca Raton,Fla.)。标记物可以发挥以下作用：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以调整第一或第二标记物提供的可检测信号，例如，以产生FRET(荧光共振能量转移)；(iii)通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数影响迁移率，例如，电泳迁移率或细胞通透性，或(iv)提供捕获部分，例如，以调节离子络合。
包含如本文所报告的半抗原化多肽和标记物的缀合物可以用于诊断测定法中，例如，用于检测特定细胞、组织或血清中感兴趣抗原的表达。对于诊断性应用，将使用其中第一结合特异性与靶结合并且第二结合特异性与半抗原化标记物结合的双特异性抗体。半抗原化多肽通常将用可检测部分标记。许多标记物是可用的，它们通常可以划分成以下类别：
(a)放射性同位素(放射性核素)，如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。放射性同位素标记的缀合物在受体靶向的成像实验中是有用的。使用在Current Protocols in Immunology,(1991)第1卷和第2卷,Coligen等人,编著Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs中描述的技术，半抗原化多肽还可以用结合、螯合或以其他方式络合放射性同位素金属的配体试剂标记。可以络合金属离子的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics,Dallas,Tex.)。放射性核素可以通过用如本文所报告的复合物复合进行靶向(Wu等人,Nature Biotechnology 23(9)(2005)1137-1146)。采用放射性核素标记复合物的受体靶成像法可以通过对复合物或相应的治疗性抗体在肿瘤组织中的进行性积累进行检测和定量而提供途径活化的标记(Albert等人(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8:1207-1210)。
适合作为成像实验用标记物的金属-螯合物复合物(US 2010/0111856；US 5,342,606；US 5,428,155；US 5,316,757；US 5,480,990；US 5,462,725；US 5,428,139；US 5,385,893；US 5,739,294；US 5,750,660；US 5,834,456；Hnatowich等人,J.Immunol.Methods 65(1983)147-157；Meares等人,Anal.Biochem.142(1984)68-78；Mirzadeh等人,Bioconjugate Chem.1(1990)59-65；Meares等人,J.Cancer(1990),Suppl.10:21-26；Izard等人,Bioconjugate Chem.3(1992)346-350；Nikula等人,Nucl.Med.Biol.22(1995)387-90；Camera等人,Nucl.Med.Biol.20(1993)955-62；Kukis等人,J.Nucl.Med.39(1998)2105-2110；Verel等人,J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Camera等人,J.Nucl.Med.21(1994)640-646；Ruegg等人,Cancer Res.50(1990)4221-4226；Verel等人,J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Lee等人,Cancer Res.61(2001)4474-4482；Mitchell等人,J.Nucl.Med.44(2003)1105-1112；Kobayashi等人Bioconjugate Chem.10(1999)103-111；Miederer等人,J.Nucl.Med.45(2004)129-137；DeNardo等人,ClinicalCancer Research 4(1998)2483-90；Blend等人,Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals 18(2003)355-363；Nikula等人J.Nucl.Med.40(1999)166-76；Kobayashi等人,J.Nucl.Med.39(1998)829-36；Mardirossian等人,Nucl.Med.Biol.20(1993)65-74；Roselli等人,Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals,14(1999)209-20)。
(b)荧光标记物，如稀土螯合物(铕螯合物)，荧光素型，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明型，包括TAMRA；丹磺酰；丽丝胺；花菁；藻红蛋白；得克萨斯红；及其类似物。荧光标记物可以使用例如在上文的Current Protocols in Immunology中公开的技术与多肽缀合。荧光染料和荧光标记物试剂包括商业上可购自Invitrogen/MolecularProbes(Eugene,Oregon,USA)和Pierce Biotechnology公司(Rockford,Ill.)的那些。
检测标记物如荧光染料和化学发光染料(Briggs等人"Synthesis ofFunctionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and AminoAcids,"J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)提供了可检测信号，并且通常适用于标记，特别具有以下特性：(i)标记的缀合物应当在低背景的同时产生极高信号，从而可以在无细胞和基于细胞的测定法中灵敏地检测到少量缀合物；和(ii)标记的缀合物应当是光稳定的，从而可以观察、监测并记录荧光信号，而没有明显的光漂白。对于涉及标记的缀合物与膜或细胞表面(尤其是活细胞)的细胞表面结合的应用，标记物应当(iii)具有良好的水溶性以实现有效的缀合物浓度和检测灵敏度并且(iv)对活细胞无毒，从而不破坏细胞的正常代谢过程或造成过早细胞死亡。
(c)多种酶-底物标记物是可获得或公开的(参见，例如，US 4,275,149)。酶通常催化生色底物的化学改变，其中可以使用多种技术测量所述化学改变。例如，酶可以催化底物中可以按分光光度形式测量的颜色变化。备选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。化学发光底物因化学反应被电子激发并且可以随后发射可测量(例如，使用化学发光计)的光或馈赠能量至荧光受体。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；US 4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于酶与多肽缀合的技术描述于O'Sullivan等人"Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in EnzymeImmunoassay",收录于Methods in Enzym.(由J.Langone和IT Van Vunakis编著),Academic Press,New York,73(1981)147-166。
酶-底物组合的例子(US 4,275,149；US 4,318,980)包括，例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRP)和作为底物的过氧化氢酶，其中所述过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)和作为生色底物的对硝基苯磷酸酯；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和生色底物(例如，对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶。
如本文所报告的标记的半抗原化多肽可以用于任何已知的测定方法中，如ELISA、竞争性结合测定法、直接和间接夹心测定法、以及免疫沉淀测定法(Zola,MonoclonalAntibodies:A Manual of Techniques(1987)第147-158页,CRC Press公司)。
如本文所报告的标记的半抗原化多肽由生物医学成像和分子成像的多种方法和技术用作成像性生物标记和探针，如：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)MicroCT(计算机断层扫描)；(iii)SPECT(单光子发射计算机断层扫描)；(iv)PET(正电子发射断层扫描)Tinianow,J.等人Nuclear Medicine and Biology,37(3)(2010)289-297；Chen等人,BioconjugateChem.15(2004)41-49；US 2010/0111856；(v)生物发光法；(vi)荧光法；和(vii)超声法。免疫闪烁照相术是一种成像方法，其中将放射性物质标记的缀合物施用至动物或人患者并且拍摄身体内缀合物存在的部位的画面(US 6,528,624)。成像性生物标记物可以客观地测量并且作为正常生物学过程、发病过程或对治疗性干预的药理学反应的指示物进行评价。生物标记物可以具有几个类型：0型标记物是疾病的自然历史标记物并且与已知的临床指标纵向相关，例如，类风湿性关节炎中滑膜炎症的MRI评估；I型标记物根据作用机制捕获干预的效果，即便该机制可能与临床结局不相关；II型标记物充当替代终点，其中生物标记物的变化或来自生物标记物的信号预测出使靶向反应“生效”的临床益处，如通过CT测量的类风湿性关节炎中的骨侵蚀。成像性生物标记物因而可以提供关于以下方面的药效动力学(PD)治疗信息：(i)靶蛋白的表达、(ii)治疗剂与靶蛋白的结合(即选择性)、和(iii)清除率和半寿期药物代谢动力学数据。相对于基于实验室的生物标记物而言，体内成像性生物标记物的优点包括：非侵入性治疗、可定量、全身评估、重复给药和评估(即多个时间点)和从临床前(小动物)至临床(人类)结果的潜在可转换效果。对于一些应用，生物成像法取代了临床前研究中的动物实验或使其数量最小化。
肽标记方法是公知的。参见Haugland(2003)Molecular Probes Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes公司；Brinkley(1992)Bioconjugate Chem.3:2；Garman,(1997)Non-Radioactive Labeling:A PracticalApproach,Academic Press,London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Glazer等人Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology(T.S.Work和E.Work编著)American Elsevier Publishing Co.,NewYork；Lundblad,R.L.和Noyes,C.M.(1984)Chemical Reagents for ProteinModification,第I卷和第II卷,CRC Press,New York；Pfleiderer,G.(1985)"ChemicalModification of Proteins",Modern Methods in Protein Chemistry,H.Tschesche编著,Walter DeGruyter,Berlin and New York；以及Wong(1991)Chemistry of ProteinConjugation and Cross-linking,CRC Press,Boca Raton,Fla.)；DeLeon-Rodriguez等人,Chem.Eur.J.10(2004)1149-1155；Lewis等人,Bioconjugate Chem.12(2001)320-324；Li等人,Bioconjugate Chem.13(2002)110-115；Mier等人Bioconjugate Chem.16(2005)240-237。
抗体缀合物
在如本文所报告的缀合物中的抗体还可以缀合(如果它本身不是所述分子之一)至治疗剂(药物)、多肽毒素(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团如荧光染料如荧光素或罗丹明、用于成像或放疗金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除率调节剂如聚乙二醇的多种异构体、与第三组分结合的肽、或者另一种碳水化合物或亲脂性剂。
免疫缀合物
本发明还提供免疫缀合物，所述缀合物包含如本文所报告的抗体或如本文所报告的与一种或多种细胞毒性剂(如化疗剂或化疗药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素)缀合的缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于类美登素(maytansinoid)(参见US 5,208,020、US 5,416,064和EP 0 425 235B1)；澳瑞司他汀，如单甲基澳瑞司他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US 5,635,483、US 5,780,588和US 7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；刺孢霉素或其衍生物(参见US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001和US 5,877,296；Hinman,L.M.等人,Cancer Res.53(1993)3336-3342；以及Lode,H.N.等人,Cancer Res.58(1998)2925-2928)；蒽环类如柔红霉素或多柔比星(参见Kratz,F.等人,Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.C.等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov,M.Y.等人,Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik,G.M.等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King,H.D.等人,J.Med.Chem.45(2002)4336-4343；以及美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇、拉罗他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯族化合物；以及CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含如本文所述的抗体或如本文所报告的与放射性原子缀合以形成放射缀合物的复合物。多种放射性同位素可用于产生放射缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如TC99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像的自旋标记物(也称作磁共振成像，MRI)，如碘-123(再次的)、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双官能蛋白质偶联剂制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧化物(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta,E.S.等人,Science 238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari,R.V.等人,Cancer Res.52(1992)127-131；美国专利号5,208,020)。
免疫缀合物或ADC在本文中明确考虑，但不限于采用交联剂试剂制备的这类缀合物，所述交联剂试剂包括，但不限于，可商业获得的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，来自Pierce Biotechnology公司,Rockford,IL.,U.S.A)。
半抗原化多肽毒素
在一个实施方案中，如本文所报告的缀合物中的半抗原缀合至细胞毒性剂，如，举例来说，毒素如多柔比星或百日咳毒素。这样的缀合物被表示为半抗原化多肽毒素。缀合可以直接进行或经由介于中间的接头进行。
在一个实施方案中，多肽毒素是蛋白质毒素，其可以以酶促方式发挥作用。蛋白质毒素包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链(Vitetta等人(1987)Science,238:1098)、相思豆毒素A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-5)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物(WO 93/21232)。
可以使用多种双官能蛋白质偶联剂制备半抗原和多肽毒素之间的缀合物，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧化物(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta,E.S.等人,Science 238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari,R.V.等人,Cancer Res.52(1992)127-131；美国专利号5,208,020)。
在一个实施方案中，使用交联剂试剂制备半抗原化多肽毒素，所述交联剂试剂包括，但不限于，可商业获得的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，来自PierceBiotechnology公司,Rockford,IL.,U.S.A)。
接头
术语“接头”指可用于将半抗原与多肽缀合(连接)的双官能或多官能部分。可以使用具有与多肽和与半抗原结合的反应功能性的接头便利地制备半抗原化多肽。
在一个实施方案中，接头具有反应位点，所述反应位点具有与多肽上存在的亲核基团反应的亲电基团。例如半胱氨酸巯基与接头上的亲电基团反应并且与接头形成共价键。有用的亲电基团包括，但不限于，另一个巯基、马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团(参见例如在Klussman等人，Bioconjugate Chemistry 15(4)(2004)765-773的第766页处的缀合方法)。
巯基反应性官能团的例子包括，但不限于，巯基、马来酰亚胺、α-卤代乙酰基、活化酯如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
接头可以包含将半抗原与多肽连接的氨基酸残基。氨基酸残基可以形成二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。氨基酸残基包括天然存在的那些以及非天然存在的氨基酸类似物，如，举例来说，瓜氨酸或β-氨基酸，如，举例来说，β-丙氨酸，或ω-氨基酸如4-氨基-丁酸。
在另一个实施方案中，接头具有反应性官能团，所述反应性官能团具有与半抗原上存在的亲电基团反应的亲核基团。有用的亲电基团包括，但不限于，醛和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子可以与半抗原或多肽上的亲电基团反应并与所述半抗原或多肽形成共价键。接头上有用的亲核基团包括，但不限于，酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼。半抗原上的亲电基团为附接至接头提供了便利位点。
典型地，肽类接头可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可以例如根据肽化学领域公知的液相合成方法制备(E.Schroder和K.Lubke"The Peptides",第1卷(1965)76-136,Academic Press)。
在另一个实施方案中，接头可以用调节溶解度或反应性的基团替换。例如，带电取代基如磺酸盐(SO3 -)或铵或聚合物如PEG，可以增加试剂的水溶解度并且促进接头试剂与半抗原或多肽的偶联反应，或根据所用的合成途经，促进偶联反应。
明确构思了如本文所报告的包含半抗原和多肽的缀合物，但是不限于用以下接头试剂制备的复合物：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，并且包括双马来酰亚胺试剂：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3和BM(PEO)4，它们从Pierce Biotechnology公司可商业获得。双马来酰亚胺试剂允许例如巯基以依次或同时的方式与含巯基的药物部分、标记物或接头中间体附接。除马来酰亚胺之外，与例如巯基反应的其他官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
示例性接头包括具有马来酰亚胺伸张物和对氨基苄基氨甲酰基(PAB)自毁性间隔物的缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂和具有马来酰亚胺伸张物单元和对氨基苄基自毁性间隔物的phe-lys(Mtr)二肽接头试剂。
半胱氨酸巯基是亲核的，并且，通过硫化物交换，能够与接头试剂和半抗原化化合物上的亲电基团反应以形成共价键，包括：(i)活性酯如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸卤；(ii)烷基卤和苄基卤，如卤乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基；和(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物。半抗原化化合物上的亲核基团包括，但不限于：能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应以形成共价键的胺、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼基。
III.核酸
可以通过本领域已知的多种方法来制备编码抗体的氨基酸序列变体的DNA，所述抗体如本文所报告或如包含于如本文所报告的缀合物中。这些方法包括，但不限于，通过定点(或寡核苷酸介导)诱变、PCR诱变和盒诱变早先制备的编码所述多肽的DNA来制备。重组抗体的变体也可以通过限制性片段操作或通过采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR来构建。诱变引物编码一个或多个半胱氨酸密码子替换。标准诱变技术可以用来产生编码此类经修饰工程化抗体的DNA。一般指导可以在Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；和Ausubel等人Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York,N.Y.,1993中找到。
IV.表达和纯化
可以使用重组方法和组合物产生多肽和抗体，例如，如US 4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的多肽和抗体的分离核酸。这类核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)或者多肽的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供一个或多个包含这类核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这类核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用其转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种产生如本文所报告的抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文所提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。
为了重组产生如本文所报告的抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上文所述)分离并插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这类核酸可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核细胞或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,收录于：Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编著),Humana Press,Totowa,NJ(2003),第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，抗体可以从细菌细胞糊状物中以可溶性级分分离并且可以进一步纯化。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。
表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如在例如Graham,F.L.等人,J.Gen Virol.36(1977)59-74中所描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562)；如在例如Mather,J.P.等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所描述的TRI细胞；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其中包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编著),Humana Press,Totowa,NJ(2004),第255-268页。
V.药物制剂
通过以下方式制备包含如本文所报告的缀合物的药物制剂：将具有所需纯度的这类缀合物与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.(编著)(1980))。可药用载体在所用的剂量和浓度上对接受者通常是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂(如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸)；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚(resorcinol)；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(如聚(乙烯吡咯烷酮))；氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其他糖(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(如EDTA)；糖(如蔗糖、甘露糖醇(mannitol)、海藻糖或山梨糖醇(sorbitol))；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(
Figure BDA0001038570250000761
BaxterInternational公司)。在US 2005/0260186和US 2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
在US 6,267,958中描述了示例性冻干抗体制剂。水性抗体制剂包括在US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-醋酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种有效成分，优选地含有这些有效成分，它们具有不会对彼此产生不利影响的互补活性。这类有效成分以对于预期目的有效的量适宜地存在于组合中。
有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或者通过界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳状液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.(编著)(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体或缀合物的固态疏水性聚合物半透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。
要用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可以例如通过借助无菌滤膜过滤容易地实现。
VI.治疗方法和组合物
本文中报告的任何缀合物可以用于治疗方法中。
在一个方面，提供用作药物的如本文所报告的缀合物。在其他方面，提供用于治疗疾病的如本文所报告的缀合物。在某些实施方案中，提供如用于治疗方法中的本文所报告的缀合物。在某些实施方案中，本发明提供如本文所报告的缀合物，其用于治疗个体的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文所报告的缀合物。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文所述。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供如本文所报告的缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗疾病。在又一个实施方案中，该药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向患有疾病的个体施用有效量的药物。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文所述。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供一种用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有这种疾病的个体施用有效量的如本文所报告的缀合物。在一个这样的实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的如下文所述的至少一种额外的治疗剂。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供了包含如本文所报告的任何缀合物的药物制剂，例如，用于上述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含如本文所报告的任何缀合物，以及可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含如本文所报告的任何缀合物和至少一种额外的治疗剂，例如，如下文所述。
如本文所报告的缀合物可以在治疗中单独使用或与其他活性剂组合使用。例如，如本文所报告的缀合物可以与至少一种额外的治疗剂共施用。
上文所示的这类联合治疗涵盖联合施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和独立施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后进行。如本文所报告的缀合物也可以与放射疗法组合使用。
如本文所报告的缀合物(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及(如果希望局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了多种给药方案，包括但不限于单次或在多个时间点多次施用、推注施用和脉冲输注。
如本文所报告的缀合物将以符合良好的医学实践的方式配制、给药和施用。关于这一点，考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、递送药剂的部位、施用方法、施用计划和执业医师已知的其他因素。该缀合物不需要与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药剂的有效量取决于在该制剂中存在的缀合物的量、疾病类型或疗法、以及上文讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量并且采用如本文所述的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，如本文所报告的缀合物的适宜剂量(当单独使用或与一种或多种其他的额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、缀合物的类型、疾病的严重性和过程、缀合物是否出于预防或治疗目的施用、先前的治疗、患者的临床史和对缀合物的反应、以及主治医师的判断。将缀合物适当地按一次或经过一系列治疗施用给患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)缀合物可以是向患者施用的初始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。一个典型的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多，取决于上文提到的因素。对于在几天或更长时间范围内重复施用，取决于病情，治疗通常将持续直至期望的疾病症状抑制作用出现。缀合物的一个示例性剂量的范围将是约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg中的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以间歇地施用，例如，每周或每3周(例如，从而患者接受约2个至约20个剂量的缀合物，或例如约6个剂量的缀合物)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。
应当理解，可以使用本发明的免疫缀合物代替或附加至如本文所报告的抗体或缀合物来实施上述制剂或治疗方法中的任何一种。
VII.制品
在本发明的另一个方面，提供一种制品，所述制品含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症的物质。该制品包括容器和在该容器上或与之相关的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一个活性剂是如本文所报告的抗体或复合物。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗选择的病症。另外，制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含如本文所报告的抗体或复合物；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或以其他方式治疗剂。在本发明的这个实施方案中的制品还可以包含指示组合物可以用于治疗特定病症的包装说明书。备选地或额外地，该制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户观点来看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
VIII.具体实施方案
1.半抗原化多肽和抗半抗原抗体的(共价)缀合物，其中在用于半抗原缀合的多肽赖氨酸残基之前或之后的半胱氨酸残基和抗体的CDR2中的半胱氨酸残基之间形成二硫键，其中所述CDR2根据Kabat来确定。
2.根据项目1所述的缀合物，其中所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后1至3个残基之间。
3.根据项目1至2中任一项所述的缀合物，其中所述多肽是多肽毒素。
4.根据项目1至3中任一项所述的缀合物，其中所述CDR2是重链CDR2。
5.(共价)缀合物，其包含半抗原化多肽毒素和抗半抗原抗体，
其中所述多肽毒素在赖氨酸残基处与半抗原缀合，
其中所述半抗原化多肽毒素通过二硫键与所述抗半抗原抗体缀合，
由此在
i)半抗原化多肽毒素的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后一个或两个残基，和
ii)抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基，其中所述CDR2根据Kabat来确定
之间形成二硫键。
6.根据项目1至5中任一项所述的缀合物，其中所述多肽在其氨基酸序列中确切地包含一个赖氨酸残基。
7.半抗原化多肽和抗半抗原抗体的(共价)缀合物，由此在所述多肽中的半胱氨酸残基和抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基之间形成二硫键，其中所述重链CDR2根据Kabat来确定，其中所述多肽在其氨基酸序列中确切地包含一个赖氨酸残基。
8.根据项目1至7中任一项所述的缀合物，其中所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前两个残基(即，在相对于所述赖氨酸残基N-2位置处)或之后两个残基(即，在相对于所述赖氨酸残基N+2位置处)。
9.根据项目1至8中任一项所述的缀合物，其中用于半抗原缀合的赖氨酸残基在所述多肽的10个N-末端氨基酸残基之内。
10.根据项目1至9中任一项所述的缀合物，其中所述抗半抗原抗体与所述半抗原化多肽的半抗原特异性结合(抗半抗原抗体)。
11.根据项目1至10中任一项所述的缀合物，其中所述半抗原化多肽包含半抗原、接头和多肽。
12.根据项目1至10中任一项所述的缀合物，其中所述多肽经由羧甲基或己酸间隔物与半抗原缀合。
13.根据项目1至12中任一项所述的缀合物，其中抗体的CDR2中的半胱氨酸残基的α碳原子与缀合有半抗原的多肽(其中所述半抗原直接或经由接头缀合至所述多肽)的赖氨酸残基的原子相距约10至11埃。
14.根据项目1至13中任一项所述的缀合物，其中所述多肽还与有效载荷缀合。
15.根据项目1至14中任一项所述的缀合物，其中所述多肽毒素是PE25。
16.根据项目1至14中任一项所述的缀合物，其中所述多肽毒素是人源化(去免疫化)PE25变体。
17.根据项目1至16中任一项所述的缀合物，其中所述抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在根据Kabat的重链可变结构域编号法的位置52、或位置52a、或位置52b、或位置52c、或位置52d、或位置53处。
18.根据项目1至17中任一项所述的缀合物，其中所述抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在根据Kabat的重链可变结构域编号法的位置52a、或位置52b、或位置52c、或位置53处。
19.根据项目1至18中任一项所述的缀合物，其中所述抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在根据Kabat的重链可变结构域编号法的位置52b处或位置53处。
20.根据项目1至19中任一项所述的缀合物，其中所述抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含针对非半抗原的抗原的第一结合特异性和针对半抗原的第二结合特异性。
21.(共价)缀合物，其包含半抗原化多肽毒素和双特异性抗体，
其中所述双特异性抗体包含针对非半抗原的抗原的第一结合特异性和针对半抗原的第二结合特异性，
其中所述多肽毒素在赖氨酸残基处与半抗原缀合，
其中所述半抗原化多肽毒素通过二硫键与所述抗半抗原抗体缀合，
由此在
i)半抗原化多肽毒素的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后两个残基，和
ii)抗体的重链CDR2中的位置52b或53处的半胱氨酸残基，其中所述CDR2根据Kabat来确定
之间形成二硫键。
22.根据项目1至21中任一项所述的缀合物，其中抗体分子对半抗原化多肽分子的化学计量比是1:1或1:2或2:1或2:2或2:4或4:2(抗体:半抗原化多肽)。
23.根据项目1至22中任一项所述的缀合物，其中所述非半抗原的抗原是细胞表面抗原。
24.根据项目23所述的缀合物，其中所述细胞表面抗原是肿瘤相关抗原。
25.根据项目1至24中任一项所述的缀合物，其中所述双特异性抗体是全长抗体。
26.根据项目25所述的缀合物，其中所述双特异性抗体的一条重链包含孔穴突变并且相应的另一条链包含隆突突变。
27.根据项目1至26中任一项所述的缀合物，其中所述双特异性抗体是全长抗体，在所述全长抗体的每个C-末端直接或经由肽接头融合有scFv或scFab。
28.根据项目1至27中任一项所述的缀合物，其中所述抗体是人源化抗体或人抗体。
29.根据项目1至28中任一项所述的缀合物，其中所述抗体的恒定区是IgG1亚类或IgG4亚类。
30.根据项目1至29中任一项所述的缀合物，其中所述抗体具有IgG1亚类的恒定区，所述恒定区在根据Kabat的EU索引编号的位置234和235处具有丙氨酸并且在位置329处具有甘氨酸。
31.根据项目1至29中任一项所述的缀合物，其中所述抗体具有IgG4类的恒定区，所述恒定区具有在根据Kabat的EU索引编号的位置228处的脯氨酸、在位置235处的谷氨酸和在位置329处的甘氨酸。
32.根据项目1至31中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物确切地包含一个二硫键每个重链CDR2。
33.根据项目1至32中任一项所述的缀合物，其中所述二硫键在不添加氧化还原活性剂的情况下形成。
34.根据项目1至33中任一项所述的缀合物，其中所述半抗原经由接头与所述多肽缀合。
35.根据项目34所述的缀合物，其中所述接头是非肽接头。
36.根据项目1至35中任一项所述的缀合物，其中所述半抗原是生物素、或茶碱、或洋地黄毒苷、或碳硼烷、或荧光素、或溴脱氧尿苷。
37.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗洋地黄毒苷抗体特征在于包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:09或25的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:10或26的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:11或27的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:13或29的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQID NO:14或30的氨基酸序列的轻链CDR2，以及(f)包含SEQ ID NO:15或31的氨基酸序列的轻链CDR3。
38.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗生物素抗体特征在于包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:41或57的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:42或58的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:43或59的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:45或61的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQID NO:46或62的氨基酸序列的轻链CDR2，以及(f)包含SEQ ID NO:47或64的氨基酸序列的轻链CDR3。
39.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗荧光素抗体特征在于包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:105或113的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:106或114的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:107或115的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:109或117的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ ID NO:110或118的氨基酸序列的轻链CDR2，以及(f)包含SEQ ID NO:111或119的氨基酸序列的轻链CDR3。
40.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗茶碱抗体特征在于包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:73或89的氨基酸序列的重链CDR1，(b)包含SEQ ID NO:74或90的氨基酸序列的重链CDR2，(c)包含SEQ ID NO:75或91的氨基酸序列的重链CDR3，(d)包含SEQ ID NO:77或93的氨基酸序列的轻链CDR1，(e)包含SEQ IDNO:78或94的氨基酸序列的轻链CDR2，以及(f)包含SEQ ID NO:79或95的氨基酸序列的轻链CDR3。
41.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗洋地黄毒苷抗体特征在于包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(i)包含SEQ ID NO:09或25的氨基酸序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:10或26的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)包含SEQ ID NO:11或27的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO:13或29的氨基酸序列的轻链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:14或30的氨基酸序列的轻链CDR2和(c)包含SEQID NO:15或31的氨基酸序列的轻链CDR3。
42.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗生物素抗体特征在于包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(i)包含SEQ IDNO:41或57的氨基酸序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:42或58的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)包含SEQ ID NO:43或59的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO:45或61的氨基酸序列的轻链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:46或6242的氨基酸序列的轻链CDR2和(c)包含SEQ IDNO:47或63的氨基酸序列的轻链CDR3。
43.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗荧光素抗体特征在于包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(i)包含SEQ IDNO:105或113的氨基酸序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:106或114的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)包含SEQ ID NO:107或115的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO:109或117的氨基酸序列的轻链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:110或118的氨基酸序列的轻链CDR2和(c)包含SEQ ID NO:111或119的氨基酸序列的轻链CDR3。
44.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗茶碱抗体特征在于包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH结构域：(i)包含SEQ IDNO:73或89的氨基酸序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:74或90的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)包含SEQ ID NO:75或91的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VL CDR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO:77或93的氨基酸序列的轻链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:78或94的氨基酸序列的轻链CDR2和(c)包含SEQ IDNO:79或95的氨基酸序列的轻链CDR3。
45.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中抗洋地黄毒苷抗体和/或抗生物素抗体和/或抗茶碱抗体是人源化抗体。
46.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗洋地黄毒苷抗体包含如上述项目的任一项中的CDR，并且还包含受体人类框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
47.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗生物素抗体包含如上述项目的任一项中的CDR，并且还包含受体人类框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
48.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗茶碱抗体包含如上述项目的任一项中的CDR，并且还包含受体人类框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
49.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗洋地黄毒苷抗体特征在于包含与SEQ ID NO:04或12或20或28的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
50.根据项目49所述的缀合物，其中具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。
51.根据项目49至50中任一项所述的缀合物，其中已经在SEQ ID NO:01或09或17或25中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。
52.根据项目49至51中任一项所述的缀合物，其中置换、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。任选地，抗洋地黄毒苷抗体包含在SEQ ID NO:01或09或17或25中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
53.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗洋地黄毒苷抗体特征在于包含与SEQ ID NO:08或16或24或32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。
54.根据项目53所述的缀合物，其中具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。
55.根据项目53至54中任一项所述的缀合物，其中已经在SEQ ID NO:08或16或24或32中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些项目中，置换、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。
56.根据项目53至55中任一项所述的缀合物，其中所述抗洋地黄毒苷抗体包含在SEQ ID NO:08或16或24或32中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
57.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗生物素抗体特征在于包含与SEQ ID NO:36或44或52或60的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
58.根据项目57所述的缀合物，其中具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗生物素抗体保留与生物素结合的能力。
59.根据项目57至58中任一项所述的缀合物，其中已经在SEQ ID NO:36或44或52或60中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。
60.根据项目57至59中任一项所述的缀合物，其中置换、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。
61.根据项目57至60中任一项所述的缀合物，其中所述抗生物素抗体包含在SEQID NO:36或44或52或60中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
62.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗荧光素抗体特征在于包含与SEQ ID NO:108或116的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
63.根据项目62所述的缀合物，其中具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗荧光素抗体保留与荧光素结合的能力。
64.根据项目62至63中任一项所述的缀合物，其中已经在SEQ ID NO:108或116中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。
65.根据项目62至64中任一项所述的缀合物，其中置换、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。
66.根据项目62至65中任一项所述的缀合物，其中所述抗荧光素抗体包含SEQ IDNO:108或116中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
67.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗茶碱抗体特征在于包含与SEQ ID NO:68或76或84或92的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。
68.根据项目67所述的缀合物，其中具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗茶碱抗体保留与茶碱结合的能力。
69.根据项目67至68中任一项所述的缀合物，其中已经在SEQ ID NO:68或76或84或92中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。
70.根据项目67至69中任一项所述的缀合物，其中置换、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。
71.根据项目67至70中任一项所述的缀合物，其中所述抗茶碱抗体包含在SEQ IDNO:68或76或84或92中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
72.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗洋地黄毒苷抗体特征在于包含如上文提供的项目的任一项中的VH和如上文提供的项目的任一项中的VL。
73.根据项目72所述的缀合物，其中所述抗体包含分别在SEQ ID NO:04或12或20或28，和SEQ ID NO:08或16或24或32中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
74.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗生物素抗体特征在于包含如上文提供的项目的任一项中的VH和如上文提供的项目的任一项中的VL。
75.根据项目74所述的缀合物，其中所述抗体包含分别在SEQ ID NO:36或44或52或60，和SEQ ID NO:40或48或56或64中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
76.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗荧光素抗体特征在于包含如上文提供的项目的任一项中的VH，和如上文提供的项目的任一项中的VL。
77.根据项目76所述的缀合物，其中所述抗体包含分别在SEQ ID NO:108或116，和SEQ ID NO:112或120中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
78.根据项目1至36中任一项所述的缀合物，其中所述抗茶碱抗体特征在于包含如上文提供的项目的任一项中的VH，和如上文提供的项目的任一项中的VL。
79.根据项目78所述的缀合物，其中所述抗体包含分别在SEQ ID NO:68或76或84或92，和SEQ ID NO:72或80或88或96中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
80.药物制剂，其包含根据项目1至79中任一项所述的缀合物，以及可药用载体。
81.根据项目1至79中任一项所述的缀合物，其用作药物。
82.根据项目1至79中任一项所述的缀合物，其用于治疗癌症。
83.根据项目1至79中任一项所述的缀合物，其用于治疗病毒性疾病。
84.根据项目1至79中任一项所述的缀合物在制造药物中的用途。
85.根据项目1至79中任一项所述的缀合物增加所述多肽的稳定性的用途。
86.根据项目1至79中任一项所述的缀合物减少或消除所述多肽的脱靶毒性作用的用途。
87.根据项目1至79中任一项所述的缀合物增加所述多肽的活性的用途。
88.根据项目1至79中任一项所述的缀合物增加所述多肽的体内半寿期的用途。
89.根据项目1至79中任一项所述的缀合物在治疗疾病中的用途。
90.治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据项目1至79中任一项所述的缀合物。
91.治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据项目1至79中任一项所述的缀合物。
92.根据项目91所述的方法，其中所述疾病是癌症。
93.产生根据项目1至79中任一项的缀合物的方法，所述方法包括组合包含人工抗体半胱氨酸残基的抗体和包含人工多肽半胱氨酸残基的半抗原化多肽，由此所述人工抗体半胱氨酸残基的α碳原子与融合接头的所述多肽的原子相距约10至11埃。
94.产生根据项目1至79中任一项的缀合物的方法，所述方法包括以下步骤
-在溶液中将特异性结合至半抗原并且在CDR2中具有人工抗体半胱氨酸残基的抗体与包含人工多肽半胱氨酸残基的半抗原化多肽组合，和
-从所述溶液回收所述缀合物。
95.用于靶向递送半抗原化化合物至靶细胞的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含与半抗原化多肽特异性结合的第一结合位点和与所述细胞的细胞表面标记物特异性结合的第二结合特异性。
96.根据项目95所述的双特异性抗体，其中在所述多肽的用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后的半胱氨酸残基和抗体的CDR2中的半胱氨酸残基之间形成二硫键，其中所述CDR2根据Kabat来确定。
97.根据项目95至96中任一项所述的双特异性抗体，其中所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后1至3个残基之间。在这个实施方案中，所述半胱氨酸残基在相对于所述赖氨酸残基N-3、N-2、N-1、N+1、N+2或N+3位置之一处。
98.根据项目95至97中任一项所述的双特异性抗体，其中所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前两个残基(即，在相对于所述赖氨酸残基N-2位置处)或之后两个残基(即，在相对于所述赖氨酸残基N+2位置处)。
99.根据项目95至98中任一项所述的双特异性抗体，其中用于半抗原缀合的赖氨酸残基在所述多肽的10个N-末端氨基酸残基之内。
100.根据项目95至99中任一项所述的双特异性抗体，其中所述多肽在其氨基酸序列中确切地包含一个赖氨酸残基。
本文引用的所有参考文献的公开内容在此通过引用并入本文。
提供以下实施例、附图和序列，以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。应当理解，可以在所阐述的方法中作出修改而不脱离本发明的精神。
实施例
实施例中使用的半抗原化化合物的合成已报告于PCT/EP2013/064100和WO 2012/093068。
实施例1
在洋地黄毒苷存在下鼠抗洋地黄毒苷Fv区的结合区和在生物素存在下鼠抗生物素Fv区的结合区的结晶和X射线结构测定
结合洋地黄毒苷的抗体的Fab片段结构的测定已经在WO 2011/003557和WO 2011/003780中详细描述，还在Metz,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)8194-8199中发表(3RA7)。
测定鼠抗生物素抗体的结构。因此，采用现有技术的熟知方法(木瓜蛋白酶消化法)，通过蛋白酶消化纯化的IgG并随后纯化，产生Fab片段。
为了结晶，将20mM His-HCl，140mM NaCl，pH 6.0中的apo Fab片段(纯化的Fab)浓缩至13mg/ml。通过在蒸气扩散坐滴实验中将0.2μl蛋白质溶液与0.2μL储液混合，在21℃建立结晶液滴。晶体在5天内从0.1M Tris pH 8.5，0.01M氯化钴、20％聚乙烯吡咯烷酮K15显现并且在8天内长成至最终尺寸0.3mm×0.06mm×0.03mm。
收获晶体，同时以15％丙三醇作为低温保护剂，并且随后在液氮中快速冷冻。衍射图用Pilatus 6M检测器在温度100K以Swiss光源的光束线X10SA采集并且用程序XDS(Kabsch,W.,J.Appl.Cryst.26(1993)795-800)处理，并以SCALA(从BRUKER AXS获得)放大，产生达
Figure BDA0001038570250000922
分辨率的数据。这个Fab片段晶体属于单斜晶空间群P21，晶胞尺度
Figure BDA0001038570250000923
和β＝117.53°，并且每个结晶学非对称单元含有4个Fab分子(参见表3)。
通过分子置换以PDB项3PQP作为检索模型，使用来自CCP4软件套件的标准结晶学程序解析结构，以计算电子密度并精细化x射线结构(CCP4,Collaborative ComputationalProject,Acta Crystallogr.D,760-763(1994))。使用COOT(Emsley,P.等人ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.60(2010)486-501)将结构模型重建成电子密度。用REFMAC5(Murshudov,G.N.等人Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.53(1997)240-55)并且用autoBUSTER(Global Phasing公司)对坐标进行精细化。
表3：单斜晶muM33Fab片段apo-晶体的数据采集和结构精细化统计结果
Figure BDA0001038570250000921
Figure BDA0001038570250000931
1括号中的值指最高分辨率库(bins)。
2R融合＝Σ|I-<I>|/ΣI，其中I是强度。
3R结晶＝Σ|Fo-<Fc>|/ΣFo其中Fo是观察的结构因子幅度并且Fc是计算的结构因子幅度。
4Rfree基于精细化期间省略的5％总数据而计算。
5用PROCHECK[Laskowski,R.A.等人,J.Appl.Crystallogr.26,283-291(1993)]计算。
为了使与生物素衍生物复合的Fab片段结晶，用于浸泡实验的Fab片段的apo晶体在筛选后3天内从0.8M琥珀酸衍生并且在5天内长成至最终尺寸0.25mm×0.04mm×0.04mm。将生物胞素酰胺以100mM溶解于水中。随后，将该化合物在结晶溶液中稀释至10mM工作浓度并施加至结晶液滴中的晶体。晶体用2μl 10mM化合物溶液洗涤3次并且在21℃与生物胞素酰胺一起最终孵育16小时。
收获晶体，同时以15％丙三醇作为低温保护剂，并且随后在液氮中快速冷冻。衍射图用Pilatus 6M检测器在温度100K以Swiss光源的光束线X10SA采集并且用程序XDS(Kabsch,W.,J.Appl.Cryst.26(1993)795-800)处理，并以SCALA(从BRUKER AXS获得)放大，产生达
Figure BDA0001038570250000941
Figure BDA0001038570250000942
分辨率的数据。这个Fab片段晶体属于单斜晶空间群P21，晶胞尺度
Figure BDA0001038570250000943
和β＝117.15°，并且每个结晶学非对称单元含有4个Fab分子(参见表4)。
通过分子置换以apo Fab片段的坐标作为检索模型，使用来自CCP4软件套件的标准结晶学程序解析结构，以计算电子密度并精细化x射线结构至分辨率
Figure BDA0001038570250000944
(CCP4)。使用COOT(Emsley,P.,Lohkamp,B.,Scott,W.G.和Cowtan,K.Features)和COOT的改进型(ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.60,486-501(2010))将结构模型重建成电子密度。用REFMAC5(Murshudov,G.N.等人Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.53,240-255(1997))并且用autoBUSTER(Global Phasing公司)对坐标进行精细化。
表4：单斜晶muM33Fab片段生物胞素酰胺(biocytinamid)复合物晶体的数据采集和结构精细化统计结果
Figure BDA0001038570250000945
Figure BDA0001038570250000951
1括号中的值指最高分辨率库(bins)。
2R融合＝Σ|I-<I>|/ΣI，其中I是强度。
3R结晶＝Σ|Fo-<Fc>|/ΣFo其中Fo是观察的结构因子幅度并且Fc是计算的结构因子幅度。
4Rfree基于精细化期间省略的5％总数据计算。
5用PROCHECK[Laskowski,R.A.,MacArthur,M.W.,Moss,D.S.和Thornton,J.M.PROCHECK:a program to check the stereochemical quality of proteinstructure.J.Appl.Crystallogr.26,283-291(1993)]计算。
实验性结构测定的结果示于图6。复合物的晶体形式在非对称单元中含有4个独立的生物胞素酰胺:抗生物素Fab复合物，其中生物胞素酰胺由所有Fab分子类似地结合。生物胞素酰胺在重链CDR1和CDR3以及全部3个轻链CDR形成的袋中结合。配体的结合袋由来自重链的残基ASN29、ASP31、THR32、PHE33、GLN35、TRP99和TRP106以及来自轻链的ASN31、TYR32、LEU33、SER34、TYR49、SER50、PHE91和TYR96限定。生物素头部基团在口袋的一个末端与CDR2和CDR1的残基形成氢键：生物胞素酰胺的N3与Ser50的羟基氧相互作用，而O22与相同残基的主链酰胺氮接触。此外，生物胞素酰胺的O22还与Ser34的羟基氧形成氢键。除此之外，还在生物胞素酰胺和内衬结合袋的芳族侧链之间观察到疏水相互作用。在生物素的(CH2)4脂族尾部末端的酰胺键堆叠到重链CDR1的PHE33上并由键合至PHE33主链酰胺氮和键合至Asp31的额外氢键稳定化。这以这样的方式定位了酰胺氮(所述酰胺氮是连接至活性实体的连接位点)，即跟随于氮后的原子从结合袋向外指向溶剂。
以分辨率
Figure BDA0001038570250000961
实验性测定结合区的结果使得表征配体与其抗体的结合模型成为可能，这是详细建模并通过重组生物素结合模块的蛋白质加工作出进一步改进的先决条件。
实施例2
具有用于共价缀合而引入的功能性的抗半抗原抗体的定义和产生
进行上文描述的抗半抗原抗体的人源化VH序列和VL序列的衍生化以产生允许抗原/半抗原在确定位置与抗体共价偶联的化合物。
实验测定的与洋地黄毒苷结合的抗洋地黄毒苷Fab片段的结构(3RA7)(Metz,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)8194-8199)用于鉴定这样的位置，在所述位置中的改变使得在抗体和其复合的抗原/半抗原之间能够发生定点偶联反应。与生物胞素酰胺结合的抗生物素Fab片段的结构(参见实施例5)用于确认对于结合生物素的抗体片段而言引入的半胱氨酸残基的正确位置并且提供所鉴定的一个或多个位置的普遍适用性的证据。
待突变的位置必须同时满足两个要求：(i)偶联位置应当靠近结合区以利用抗原/半抗原定位效应用于定向偶联，和(ii)突变位置和偶联位置必须以不影响抗原/半抗原结合本身的方式安置。关于找到合适位置的这些要求事实上是彼此‘矛盾’的，因为要求(i)由接近于结合位点的位置最佳满足，然而，要求(ii)由远离结合位点的位置最安全地实现。
尽管有这些实际上排他性的要求，我们仍然能够鉴定到可以在不影响半抗原安置的情况下突变，然而同时允许定向共价偶联半抗原化化合物的位置。
根据Kabat编号法，第一位置位于位置VH52b或VH53处，这取决于相应抗体的CDR2的实际长度。在抗洋地黄毒苷抗体结构中，半抗原结合于疏水性残基形成的深口袋中。在这项结晶学研究中使用荧光洋地黄毒苷-Cy5缀合物，其中荧光团以及洋地黄毒苷和Cy5之间的接头在结构中不可见，原因在于高度灵活性和所致的晶体中无序性。然而，接头和Cy5与指向重链的CDR2方向的洋地黄毒苷的O32连接。在洋地黄毒苷的O32(见上文)与根据Kabat编号法的位置52b中氨基酸残基的Cα之间的距离是
Figure BDA0001038570250000971
将在位置VH52b/VH53处的氨基酸替换为Cys，产生了具有如SEQ ID NO:20和28(关于抗洋地黄毒苷抗体-VH52bC)、SEQ ID NO:84和92(关于抗茶碱抗体-VH53C)、SEQ ID NO:52和60(关于抗生物素抗体-VH53C)和SEQ ID NO:108(关于抗荧光素抗体-VH52bC)列出的重链可变区序列的抗体衍生物。
被鉴定为修饰点的又一个位置是根据Kabat编号法的位置VH28。
因此，我们在Kabat位置VH28处引入半胱氨酸。将在位置VH28处的氨基酸替换为Cys，产生了具有如SEQ ID NO:124和132(关于抗洋地黄毒苷抗体-VH28C)、SEQ ID NO:156和164(关于抗茶碱抗体-VH28C)、SEQ ID NO:140和148(关于抗生物素抗体-VH28C)和SEQID NO:116(关于抗荧光素抗体-VH28C)列出的重链可变区序列的抗体衍生物。
已经发现这些位置中的一个位置是“通用”位置，即，这个位置适用于任何抗体，并且因此，不需要每次从零开始不得不通过提供晶体结构和确定能够进行半抗原定位共价偶联的适宜位置来修饰新抗体。
根据Kabat重链可变区编号法，突变VH52bC或VH53C分别可以用于每种结合半抗原的抗体(抗半抗原抗体)。尽管抗体及其结合袋的结构相当多样，仍已经显示VH52bC/VH53C突变可以用于抗原/半抗原与结合洋地黄毒苷、生物素、荧光素以及茶碱的抗体共价附接
可以表达并用标准蛋白A层析和尺寸排阻层析纯化由这些序列组成的结合实体(参见实施例3)。所产生的分子功能完善，并且按照与其未修饰的亲本分子相同的方式保留针对其同族半抗原的亲和力。通过表面等离子体共振(SPR)实验证明这一点(参见实施例4)。
实施例3
重组抗半抗原抗体的组成、表达和纯化
将鼠和人源化抗半抗原抗体可变区与人源的恒定区组合以形成单特异性或双特异性嵌合抗体或人源化抗体。
产生特异性结合半抗原以及不同的非半抗原靶(例如受体酪氨酸激酶或IGF-1R)的单特异性人源化抗半抗原抗体和双特异性人源化抗半抗原抗体要求(i)为这类分子设计和定义氨基酸和核苷酸序列，(ii)在转染的培养哺乳动物细胞中表达这些分子，和(iii)从转染细胞的上清液纯化这些分子。这些步骤如先前在WO 2012/093068中所描述的那样进行。
通常，为了产生具有(原始)鼠抗半抗原抗体的结合特异性的IgG类的人源化抗体，将人源化VH序列以符合可读框方式与IgG1亚类的人Fc区的CH1-铰链区-CH2-CH3的N-末端融合。类似地，将人源化VL序列以符合可读框方式与人CLκ恒定区的N-末端融合
为了产生含有半抗原结合特异性以及针对其他靶的特异性的双特异性抗体衍生物(抗半抗原抗体)，将scFv或Fab片段以符合可读框方式与前述抗体的重链C末端融合。在许多情况下，通过引入先前已经描述的VH44-VL100二硫键(例如Reiter,Y.等人,Naturebiotechnology 14(1996)1239-1245)进一步稳定所应用的抗半抗原scFv。
表达质粒
在哺乳动物细胞表达载体中分别装配包含用于表达重链和轻链的表达盒的表达质粒。
因而，编码单个元件的基因区段如上文概述那样连接。
可以从中推导出密码子使用的关于人轻链和重链核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等人,免疫相关的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest),第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication No 91-3242中给出。
κ-轻链的转录单元由以下元件组成：
-来自人巨细胞病毒(hCMV)的立即早期增强子和启动子，
-包含Kozak序列的合成性5'-UT，
-包含信号序列内含子的鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-克隆的可变轻链cDNA，其在5'端配置独特的BsmI限制性位点并且在3'端配置剪接供体位点和独特的NotI限制性位点，
-基因组人κ-基因恒定区，包含内含子2小鼠Ig-κ增强子(Picard,D.和Schaffner,W.Nature 307(1984)80-82)，和
-人免疫球蛋白κ-聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列。
γl-重链的转录单元由以下元件组成：
-来自人巨细胞病毒(hCMV)的立即早期增强子和启动子，
-包含Kozak序列的合成性5'-UT，
-包含信号序列内含子的修饰的鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-克隆的单特异性可变重链cDNA或克隆的双特异性融合物scFv-可变重链cDNA，其在5'端配置独特的BsmI限制性位点并且在3'端配置剪接供体位点和独特的NotI限制性位点，
-基因组人γl-重链基因恒定区，包含小鼠Igμ-增强子(Neuberger,M.S.,EMBOJ.2(1983)1373-1378)，和
-人γl-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“polyA”)信号序列。
除了κ-轻链表达盒或γ1-重链表达盒外，这些质粒还含有
-潮霉素抗性基因，
-Epstein-Barr病毒(EBV)的复制起点oriP，
-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性。
重组DNA技术
使用如Sambrook等人,1999(上文)中所述的标准克隆技术进行克隆。全部分子生物学试剂(如果不另外指出的话)均是市售的并且根据制造商的说明书使用。
含有编码序列、突变或其他遗传元件的DNA由Geneart AG,Regensburg合成。
通过在SequiServe(SequiServe GmbH,Germany)进行的双链测序法测定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
Vector NTI Advance套装9.0版用于序列生成、作图、分析、注释和图示。
抗半抗原抗体和衍生物的表达
通过瞬时转染悬浮的人胚肾293(HEK293)细胞表达抗半抗原抗体。为此，在如上文概述的携带原核和真核选择标记的表达载体中构建相应单特异性抗体或双特异性抗体的轻链和重链。将这些质粒在大肠杆菌中扩增、纯化并随后应用于瞬时转染。标准细胞培养技术用于操作细胞，如描述于Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编著),JohnWiley&Sons公司。
将细胞在37℃/8％CO2于适宜的表达培养基中培育。在转染当天，将细胞以密度1-2×106个活细胞/mL接种在新鲜培养基中。对于250ml最终转染体积，在包含1:1摩尔比的250μg重链和轻链质粒DNA的Opti-MEM I培养基(Invitrogen,USA)中制备具有转染试剂的DNA-复合物。在转染后7天通过以14,000g离心30分钟并经无菌滤器(0.22μm)过滤，澄清含有单特异性或双特异性抗体的细胞培养上清液。将上清液贮存在-20℃直至纯化。
为了确定细胞培养上清液中抗体和衍生物的浓度，应用亲和HPLC色谱。为此，将含有与蛋白A结合的单特异性或双特异性抗体或其衍生物的细胞培养上清液施加至包含200mM KH2PO4、100mM柠檬酸钠、pH 7.4的溶液中的Applied Biosystems Poros A/20柱上。从层析材料的洗脱通过施加包含200mM NaCl，100mM柠檬酸，pH 2.5的溶液来进行。使用UltiMate 3000HPLC系统(Dionex)。通过紫外吸光度和峰面积积分对洗脱的蛋白质定量。纯化的IgG1抗体用作标准品。
结合洋地黄毒苷、荧光素、茶碱或生物素的抗半抗原抗体的纯化
在转染后7天收获HEK 293细胞上清液。使用蛋白A-琼脂糖凝胶TM亲和层析(GEHealthcare,Sweden)和Superdex200尺寸排阻层析，通过亲和层析以两个步骤从上清液纯化其中所含的重组抗体(或抗体衍生物)。简而言之，将含有抗体的澄清培养上清液施加在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe蛋白A(5-50ml)柱上。用平衡缓冲液洗去未结合的蛋白质。用50mM柠檬酸盐缓冲液pH 3.2洗脱抗体(或抗体衍生物)。含有蛋白质的级分用0.1ml 2M Tris缓冲液，pH9.0中和。随后，将洗脱的蛋白质级分汇集，用Amicon Ultra离心滤器装置(MWCO：30K，Millipore)浓缩并加载于用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex200HiLoad26/60凝胶过滤柱(GE Healthcare,Sweden)上。根据Pace等人,Protein Science 4(1995)2411-2423，通过使用基于氨基酸序列所计算的摩尔消光系数，以320nm处的OD作为背景校正，在280nm处测量光密度(OD)确定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。将单聚抗体级分汇集、急冻并贮存在-80℃。提供部分样品用于后续的蛋白质分析和表征。
在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过SDS-PAGE并用考马斯亮蓝染色，证实抗体的均一性。根据制造商的说明书使用
Figure BDA0001038570250001011
预制凝胶系统(Invitrogen,USA)(4-20％Tris-甘氨酸凝胶)。
在还原条件下，在SDS-PAGE后，在与计算分子量相似的表观分子大小处鉴定到与IgG相关的多肽链。通过蛋白A分析所有构建体的表达水平。在这类未优化的瞬时表达实验中，平均蛋白质产率在6mg和35mg纯化的蛋白质/升细胞培养上清液之间
实施例4
重组人源化抗生物素抗体与生物素标记的化合物(半抗原化化合物)的结合
为了确定人源化过程和后续引入半胱氨酸突变是否产生保留完整结合活性的衍生物，进行以下实验。
使用Octet QK仪(Fortebio公司)，通过生物双层干涉测量(BLI)技术分析重组抗生物素抗体衍生物的结合特性。该系统是完善的用于研究分子相互作用的系统。BLi技术基于测量从生物传感器尖端和内参的表面反射的白光的干涉图案。分子与生物传感器尖端的结合导致可以测量的干涉图案偏移。为了分析上文描述的人源化过程是否削弱抗生物素抗体与生物素结合的能力，将嵌合形式和人源化形式的抗体的特性就它们与生物素化蛋白质结合的能力直接比较。通过在抗huIgG Fc抗体捕获(AHC)生物传感器上(Fortebio公司)捕获抗生物素抗体进行结合研究。首先，在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中浓度为0.5mg/ml的抗体溶液中孵育生物传感器1分钟。此后，将生物传感器在pH 7.4的1×PBS中孵育1分钟以达到稳定基线。通过在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中含有浓度为0.06mg/ml的生物素化蛋白质的溶液中孵育抗体包被的生物传感器5分钟来测量结合。在pH 7.4的1×PBS中监测解离5分钟。直接比较嵌合抗生物素抗体和人源化抗生物素抗体的所得结合曲线。
与嵌合抗体相比，人源化形式的抗体显示相等或甚至更好的生物素化抗原结合。在Kabat位置VH53处具有Cys突变的人源化抗体也是如此。生物素化的蛋白质显示与生物传感器的残余非特异性结合，生物传感器用不结合生物素的赫赛汀(Herceptin)包被时，这种结合减少。因此，抗生物素抗体的功能保留在其人源化变体中(其由如SEQ ID NO:44和48、SEQ ID NO:60和64中所述的序列限定)。
表面等离子体共振
在
Figure BDA0001038570250001021
T200仪器(GE Healthcare Biosciences AB,Sweden)上在25℃进行表面等离子体共振测量。通过使用GE Healthcare供应的标准胺偶联试剂盒(BR-1000-50)在pH 5.0在CM3芯片(GE Healthcare,BR-1005-36)上偶联来自人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39，GE Healthcare Biosciences AB,Sweden)的约4300共振单位(RU)捕获系统(10μg/ml抗人捕获物(IgG Fc)。用于胺偶联的运行缓冲液是HBS-N(10mM HEPES,pH 7.4,150mMNaCl,GE Healthcare,BR-1006-70)。用于以下结合研究的运行和稀释缓冲液是pH 7.4的PBS-T(包含0.05％Tween 20的10mM磷酸盐缓冲盐水)。通过以流速5μL/分钟注射2nM溶液60秒捕获人源化抗生物素抗体。将生物素化的siRNA用PBS-T稀释为0.14-100nM的浓度(1:3稀释系列)。通过以流速30μl/分钟注射每个浓度180秒，解离时间600秒，测量结合。通过用3MMgCl2溶液以流速5μL/分钟洗涤30秒使表面再生。使用BIA评价软件(GE HealthcareBiosciences AB,Sweden)评价数据。通过扣减从抗人IgG Fc表面获得的响应，校正主体折射率差异。还扣减空白注射(＝双参考)。为了计算KD和动力学参数，使用Langmuir 1:1模型。
通过表面等离子体共振(SPR)对人源化抗生物素抗体SEQ ID NO:44和48和人源化抗生物素抗体VH53C SEQ ID NO:60和64实施动力学结合分析。通过与CM3传感器芯片结合的抗人IgG Fc抗体捕获2nM浓度的抗生物素抗体。在浓度0.41、1.23、3.7、11.1、33.3、100和300nM处记录生物素化siRNA(Mw：13868Da)的结合。一式两份实施测量。人源化抗生物素抗体和人源化抗生物素抗体VH53C的所计算的KD分别是0.633nM和0.654nM。
实施例5
产生半抗原化化合物与抗半抗原抗体的非共价复合物
一般方法：
抗半抗原抗体与半抗原化化合物(＝与有效载荷缀合的半抗原)的复合物的产生应当导致确定的复合物并且应当确保这些复合物中的化合物(＝有效载荷)保留其活性。为了产生半抗原化化合物与相应的抗半抗原抗体的复合物，将半抗原化化合物溶解于H2O中至终浓度为1mg/ml。将抗体在20mM组氨酸缓冲液，140mM NaCl，pH＝6.0中浓缩至终浓度为1mg/ml(4.85μM)。通过上下抽吸将半抗原化的有效载荷和抗体按2:1摩尔比(化合物对抗体)混合并在室温下孵育15分钟。
备选地，将半抗原化化合物溶解于100％DMF中至终浓度为10mg/ml。将抗体在50mMTris-HCl，1mM EDTA，pH＝8.2中浓缩至终浓度为10mg/ml。通过上下抽吸将半抗原化化合物和抗体按2.5:1摩尔比(化合物对抗体)混合并在室温和350rpm下孵育60分钟。
用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的复合物——非共价洋地黄毒苷- Cy5复合物的示例性方法
使用人源化和鼠抗洋地黄毒苷抗体或双特异性抗洋地黄毒苷抗体衍生物作为抗体组分。为了产生洋地黄毒苷化Cy5与抗洋地黄毒苷抗体的复合物，将Cy5-洋地黄毒苷缀合物溶解于PBS中至终浓度为0.5mg/ml。抗体以缓冲液中1mg/ml(约5μM)的浓度使用，所述缓冲液由20mM组氨酸和140mM NaCl，pH 6组成。将洋地黄毒苷化Cy5和抗体按2:1摩尔比(洋地黄毒苷化Cy5对抗体)混合。这个过程产生组合确定的复合物的均一制备物。
可以通过在尺寸排阻柱上确定抗体缔合的荧光团的荧光(650/667nm)监测复合反应。这些实验的结果显示，复合仅在抗体含有洋地黄毒苷结合特异性时发生。无洋地黄毒苷结合特异性的抗体不结合洋地黄毒苷-Cy5缀合物。可以对二价抗洋地黄毒苷抗体观察到增加的信号直至洋地黄毒苷-Cy5缀合物对抗体的比率为2:1。此后，组合物依赖性荧光信号达到平台。
用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的复合物——生物素-Cy5/嵌合抗生 物素抗体(人IgG亚类)复合物的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化(cysteinylated)接头的生物素衍生化-Cy5(生物素-Cys-Cy5)的复合物，将0.16mg生物素-Cys-Cy5溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg抗体以缓冲液中10.1mg/ml(约69μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.2组成。将生物素-Cys-Cy5和抗体以2.5:1摩尔比(生物素-Cys-Cy5对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。如实施例6a中所述，通过SDS-PAGE分析所产生的缀合物。如实施例6a中所述实施荧光的检测。
用于形成生物素化荧光染料和抗生物素抗体缀合物——生物素-Ser-Cy5/人源化 抗生物素抗体的示例性方法：
为了产生在接头内部含有丝氨酸残基的生物素衍生化-Cy5(生物素-Ser-Cy5)的复合物，将0.61mg生物素-Ser-Cy5溶解于20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中至浓度为10mg/ml。18.5mg人源化抗生物素抗体以缓冲液中10mg/ml(约69μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.2组成。将生物素-Ser-Cy5和抗体以2.5:1摩尔比(生物素-Ser-Cy5对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。随后使用Superdex20016/60高载量制备级柱(GE Healthcare)以流速1.5ml/分钟并且以20mM组氨酸，140mMNaCl，pH 6.0作为流动相，对样品进行尺寸排阻层析。收集峰级分并通过SDS-PAGE分析纯度。通过以下方式计算染料对抗体比：(1)在波长280nm(蛋白质)和650nm(Cy5)处测量样品的吸光度；(2)使用以下公式：标记的蛋白质的A650/ε(Cy5)*蛋白质浓度(M)＝摩尔染料/摩尔蛋白质，其中ε(Cy5)＝250000M-1cm-1，复合物的A650＝47.0并且蛋白质浓度是86.67μM。所得的染料对抗体分子的比值是2.17，这表明所有抗体互补位均以生物素-Cy5分子饱和。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物——洋地黄毒苷-PYY(3-36)/抗 洋地黄毒苷抗体复合物的示例性方法
为了产生洋地黄毒苷化多肽与抗洋地黄毒苷抗体的非共价复合物，将鼠杂交瘤衍生的抗体(来自10mM KPO4，70mM NaCl；pH 7.5的冻干物)溶解于12ml水中并针对包含20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0的溶液透析以在11ml缓冲液中产生300mg(2×10-6mol)(c＝27.3mg/ml)。将洋地黄毒苷-PYY(3-36)缀合物(11.57mg，4×10-6mol，2当量)在1小时内以4个2.85mg部分添加并且在室温下孵育另一个小时。在复合反应完成后，在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中，以流速2.5ml/分钟，经由Superdex 20026/60GL柱(320ml)，通过尺寸排阻层析纯化复合物。洗脱的复合物收集于4ml级分中，汇集并经0.2μm滤器除菌以产生浓度为14.3mg/ml的234mg复合物。以相似方式，为了产生人源化抗洋地黄毒苷抗体的复合物，将该抗体在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中调节至浓度为10.6mg/ml(0.93ml中9.81mg，6.5×10-8mol)。将0.57mg＝1.97×10-7mol＝3.03当量的洋地黄毒苷化多肽(DIG-PYY)作为冻干物添加至抗体溶液。将多肽和抗体在室温下孵育1.5小时。在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中，以流速0.5ml/分钟，经由Superose 6 10/300GL柱，通过尺寸排阻层析移除过量的多肽。洗脱的复合物收集于0.5ml级分中、汇集并经0.2μm滤器除菌以产生浓度为1.86mg/ml的4.7mg复合物。.
经由尺寸排阻层析中单峰的出现，将所产生的半抗原化多肽-抗半抗原抗体复合物确定为单体IgG样分子。将所产生的复合物确定为单体IgG样分子，每个抗体分子携带两个洋地黄毒苷-PYY衍生物。通过尺寸排阻层析证实这些肽复合物的确定组成，所述尺寸排阻层析还表明不存在蛋白质聚集物。通过SEC-MALS(尺寸排阻层析-多角度光散射法)进一步证实这些双特异性肽复合物的确定组成(和2:1的多肽与蛋白质之比)。对于SEC-MALS分析，以pH 7.4的1×PBS作为流动相，以0.25-0.5ml/分钟的流速将100-500μg相应样品施加至Superdex 200 10/300GL尺寸排阻柱上。用Wyatt MiniDawn TREOS/QELS检测器检测光散射，用Wyatt Optilab rEX-检测器测量折射率。使用软件ASTRA(版本5.3.4.14)分析所得数据。SEC MALLS分析的结果提供关于复合物质量、半径和尺寸的信息。这些数据随后与相应的非复合抗体的那些数据比较。这些实验的结果表明，洋地黄毒苷化-PYY暴露于抗洋地黄毒苷抗体产生了复合物，该复合物含有两个洋地黄毒苷-PYY衍生物/一个抗体分子。因此，洋地黄毒苷化PYY可以在确定的位点(结合区)并以确定的化学计量与抗洋地黄毒苷抗体复合。
通过表面等离子体共振研究表征复合物提供了额外证据：复合反应生成确定和完全复合的分子。抗洋地黄毒苷抗体可以与SPR芯片结合，这导致信号增加。随后，加入洋地黄毒苷-PYY缀合物导致信号进一步增加直至所有结合位点被完全占据。在这些情况下，加入更多的洋地黄毒苷-PYY不会进一步增加信号。这表明复合反应是特异性的并且信号不由洋地黄毒苷化多肽的非特异性粘附引起。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物——Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala- Biot/嵌合抗生物素抗体复合物的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素化PYY-多肽的非共价复合物，将0.19mgAc-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。抗体以缓冲液中10.7mg/ml(约73μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.2组成。将Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot对抗体)混合并在室温和350rpm下孵育60分钟。经由尺寸排阻层析中单峰的出现，将所产生的复合物确定为单体IgG样分子(95％单体)。通过SDS-PAGE和随后的蛋白质印迹分析法进一步分析所产生的复合物。将10μg复合物与4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合并在95℃下孵育5分钟。将样品施加至4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)，后者在200V和120mA下运行35分钟。将聚丙烯酰胺凝胶中分离的分子转移至PVDF膜(0.2μm孔径，Invitrogen)，在25V和160mA下持续40分钟。在室温下，将膜在1×PBST(1×PBS+0.1％Tween20)中的1％(w/v)脱脂乳中封闭1小时。将膜在1×PBST中洗涤3次持续5分钟并随后与按1:2000稀释使用的链霉亲和素-POD缀合物(2900U/mL，Roche)孵育。使用Lumi-Light蛋白质印迹底物(Roche)，实施与膜上生物素结合的链霉亲和素-POD的检测。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物——(Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2- Biot)/嵌合抗生物素抗体复合物的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素化PYY-多肽的非共价复合物，将0.16mgAc-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。抗体以缓冲液中10.7mg/ml(约73μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.2组成。将Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot对抗体)混合并在室温和350rpm下孵育60分钟。经由尺寸排阻层析，将所产生的复合物确定为63％单体IgG样分子和37％二聚体可溶性聚集物。通过SDS-PAGE和随后的蛋白质印迹分析法进一步分析所产生的复合物。将10μg复合物与4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合并在95℃下孵育5分钟。将样品施加至4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)，后者在200V和120mA下运行35分钟。将聚丙烯酰胺凝胶中分离的分子转移至PVDF膜(0.2μm孔径，Invitrogen)，在25V和160mA下持续40分钟。在室温下，将膜在1×PBST(1×PBS+0.1％Tween20)中的1％(w/v)脱脂乳中封闭1小时。将膜在1×PBST中洗涤3次持续5分钟并随后与按1:2000稀释使用的链霉亲和素-POD缀合物(2900U/mL，Roche)孵育。使用Lumi-Light蛋白质印迹底物(Roche)，实施与膜上生物素结合的链霉亲和素-POD的检测。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的复合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5- Fluo)/嵌合抗荧光素抗体复合物的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的荧光素缀合-PYY-多肽的非共价复合物，将0.33mg Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。抗体以缓冲液中9.99mg/ml(约68μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.2组成。将Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)对抗体)混合并在室温和350rpm下孵育60分钟。经由尺寸排阻层析，将所产生的复合物确定为76％单体IgG样分子和24％二聚体可溶性聚集物。通过SDS-PAGE进一步分析所产生的复合物并随后检测聚丙烯酰胺凝胶中荧光素相关的荧光。将8μg复合物与4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合并在95℃下孵育5分钟。使用LumiImager F1装置(Roche)在645nm的激发波长处记录荧光素相关的荧光。
实施例6
在氧化还原剂存在下产生半抗原化染料或多肽与抗半抗原抗体VH52bC/VH53C的确定的共价缀合物
用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——Dig-Cys-Ahx-Cy5/抗 洋地黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法
抗半抗原抗体和含有半胱氨酸接头的半抗原化荧光染料的共价缀合物的产生导致确定的缀合物，其中二硫桥在抗半抗原抗体CDR2中的VH52bC和半抗原和荧光染料之间的接头中的半胱氨酸之间的一个特定位置形成。在氧化还原试剂存在下实施缀合反应。将Dig-Cys-Ahx-Cy5溶解于20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中。通过逐滴加入10％(v/v)乙酸促进溶解。将终浓度调节至0.4mg/ml。使20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中的抗洋地黄毒苷抗体VH52bC达到10mg/ml的浓度。将抗洋地黄毒苷抗体作为对照使用并且按照与抗洋地黄毒苷抗体VH52bC相同的方式处理。将4.7nmol每种抗体与2.5摩尔当量的Dig-Cys-Ahx-Cy5混合。通过每15分钟以4部分(每部分2.9nmol)加入11.7nmol这种物质实现这一点。在这些加入之间，将样品在25℃下孵育，同时温和振摇。在加入最后部分之后，将0.64nmol每种抗体-Dig-Cys-Ahx-Cy5复合物转移至含有以下氧化还原试剂的缓冲液中：3mM DTE(二硫赤藓糖醇)+10mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)、0.3mM DTE+1mM GSSG和0.03mM DTE+0.1mM GSSG。所有样品均在这些条件下孵育15分钟。在孵育后，样品被分成两半(每一半0.34nmol)并被制备用于SDS凝胶电泳。为此，加入4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)。对于每份样品，还通过加入10×NuPAGE样品还原剂(Invitrogen)制备还原形式。将所有样品在70℃下孵育5分钟，然后在4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)上用1×MOPS缓冲液(Invitrogen)电泳。用LumiImager F1装置(Roche)在645nm的激发波长处检测凝胶中的Cy5相关荧光。在检测荧光后，凝胶用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)染色。凝胶示于图4。
当使用无CDR2中半胱氨酸的抗洋地黄毒苷抗体时(泳道2A-C)，显示抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的位点特异性二硫键形成(图8，在上部的凝胶，泳道1A-C)，其具有低的背景荧光信号。对照反应中的背景信号可以由Dig-Cys-Ahx-Cy5与半胱氨酸(其通常参与抗体链间二硫键的形成)的偶联来解释。增加量的氧化还原试剂显著减少连接抗体重链和轻链的二硫键，主要产生3/4抗体(-1×LC)、HC-二聚体(-2×LC)和1/2抗体(1×HC+1×LC)。在凝胶底部，可以检测到未与抗体共价连接的Dig-Cys-Ahx-Cy5的荧光。图8底部的凝胶显示，当还原样品时，在抗体重链和轻链附近不能检测到Cy5相关的荧光，这表明共价键的确由二硫桥形成。每块凝胶的考马斯染料染色显示每条泳道中的蛋白质的总量相等。
用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——Dig-Cys-Cy5/抗洋地 黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法
将Dig-Cys-Cy5溶解于8.3mM HCl，10％(v/v)DMF中至终浓度为3.25mg/ml。使20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中的抗洋地黄毒苷抗体VH52bC抗体达到15mg/ml的浓度。将抗洋地黄毒苷抗体作为对照使用并且按照与抗洋地黄毒苷抗体VH52bC相同的方式处理。在1mM GSH(还原的谷胱甘肽)和5mM GSSG(还原的谷胱甘肽)存在下，将13.3nmol每种抗体与2摩尔当量的Dig-Cys-Cy5在10mg/ml的最终抗体浓度下混合。通过每5分钟以2部分加入26.6nmol这种物质实现这一点。在这些加入之间，将样品在室温下孵育，同时温和搅拌。在加入最后部分之后，将样品在室温下孵育1小时。通过SDS-PAGE评价偶联反应的效率并随后记录Cy5相关的荧光信号。5、10和20μg的各样品被制备用于SDS-PAGE。为此，加入4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)。将所有样品在70℃下孵育5分钟，然后在4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)上用1×MOPS缓冲液(Invitrogen)电泳。用LumiImager F1装置(Roche)在645nm的激发波长处检测凝胶中的Cy5相关荧光。在检测荧光后，凝胶用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)染色。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu- Dig)/人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的洋地黄毒苷衍生化-PYY-多肽的缀合物，将1.4mgPEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg抗体以缓冲液中10mg/ml(约68μM)的浓度使用，所述缓冲液由5mM Tris-HCl，1mM EDTA，1mM GSH，5mM GSSG，pH 8.2组成。将PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)和抗体以2:1摩尔比(PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以100rpm搅拌。通过质谱法分析所产生的缀合物。43％的所检测到的种类被鉴定为与2个多肽分子偶联的抗体，46％是与1个多肽分子偶联的抗体，并且，11％被鉴定为未偶联的抗体。
实施例7
在氧化还原剂不存在下产生半抗原化染料和多肽与抗半抗原抗体VH52bC/VH53C的确定的共价缀合物
为了产生共价性抗半抗原抗体/半抗原化多肽或半抗原化染料二硫键连接的缀合物，需要(i)经由含有合适反应基团(如，举例来说，半胱氨酸、马来酰亚胺)的接头将半抗原(例如，洋地黄毒苷、荧光素、生物素或茶碱)与多肽或染料如此偶联，从而允许多肽暴露在抗体表面上并因此保留其活性，和(ii)产生半抗原化多肽与具有半胱氨酸突变的抗半抗原抗体(＝抗体VH52bC/VH53C)的共价性位点特异性缀合物，其中多肽的生物学活性被保留，以及(iii)在还原剂不存在的情况下实施反应以避免还原抗体链间二硫桥。
一般方法：
产生抗半抗原抗体与半抗原化化合物的缀合物应当产生具有确定化学计量的缀合物并应当确保这些缀合物中的化合物保留其活性。为了产生半抗原化化合物与相应的抗半抗原抗体的缀合物，将半抗原化化合物溶解于100％DMF中至终浓度为10mg/ml。使抗半抗原抗体VH52bC/VH53C在50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH＝8.2中达到10mg/ml的浓度。通过上下抽吸将半抗原化化合物和抗半抗原抗体VH52bC/VH53C按2.5:1摩尔比(化合物对抗体)混合并在室温和350rpm下孵育60分钟。
经由含有半胱氨酸的接头与半抗原缀合的多肽在下文中称作半抗原-Cys-多肽或多肽-Cys-半抗原。该多肽可以具有游离N-末端或加帽的N-末端，例如具有乙酰基(Ac-多肽-Cys-半抗原)或PEG-残基(PEG-多肽-Cys-半抗原)。
经由含有半胱氨酸的接头与半抗原缀合的荧光染料在下文中称作染料-Cys-半抗原或半抗原-Cys-染料。
用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——Dig-Cys-Ahx-Cy5/抗 洋地黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法
样品完全如实施例6a中所述那样制备，不同之处在于将抗体-Dig-Cys-Ahx-Cy5复合物转移至含有或不含氧化还原化合物0.1mM GSSG(氧化的谷胱甘肽)或1mM GSSG的缓冲液。所得的荧光扫描的和考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶示于图5。所有三种条件均显示位点特异性二硫键形成的相似特异性(图5，顶部凝胶，泳道1A-C),具有低水平的背景反应(图5，泳道2A-C)。这证实二硫键的形成可以在不需要还原剂的情况下实现。这显著地稳定抗体/减少抗体分解，因为与实施例6相比，仅检测到残余量的3/4抗体(-1×LC)、HC-二聚体(-2×LC)和1/2抗体(1×HC+1×LC)。
用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——Dig-Cys-Cy5/抗洋地 黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法
样品完全如实施例6b中所述那样制备，不同之处在于13.3nmol的抗体在氧化还原试剂不存在的情况下与2摩尔当量的Dig-Cys-Cy5在10mg/ml的最终抗体浓度下混合。
用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——生物素-Cys-Cy5/嵌合 抗生物素抗体VH53C的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-Cy5的缀合物，将0.16mg生物素-Cys-Cy5溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg抗生物素抗体VH53C以缓冲液中9.7mg/ml(约68μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.2组成。将生物素-Cys-Cy5和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-生物素-Cys-Cy5对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。如实施例6a中所述，通过SDS-PAGE分析所产生的缀合物。如实施例6a中所述实施荧光的检测。
用于形成半抗原化荧光染料和抗半抗原抗体的缀合物——生物素-Cys-Cy5/人源 化抗生物素抗体VH53C的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-Cy5的缀合物，将0.16mg生物素-Cys-Cy5溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg人源化抗生物素抗体VH53C以缓冲液中7.4mg/ml(约51μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.2组成。将生物素-Cys-Cy5和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-生物素-Cys-Cy5对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。如实施例6a中所述，通过SDS-PAGE分析所产生的缀合物。如实施例6a中所述实施荧光的检测。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu- Dig)/人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的洋地黄毒苷衍生化-PYY-多肽的缀合物，将2.4mgAc-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)溶解于20％乙酸酯中至浓度为5mg/ml。10mg人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC(68.4nmol)以缓冲液中19.5mg/ml(约133μM)的浓度使用，所述缓冲液由20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0组成。将Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)和抗体以2:1摩尔比(Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以100rpm搅拌。通过质谱法分析所产生的缀合物。7.4％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，40％是与1个肽分子偶联的抗体，并且，52％被鉴定为未偶联的抗体。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla- Biot)/嵌合抗生物素抗体VH53C的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.19mgAc-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg嵌合抗生物素抗体VH53C以缓冲液中9.7mg/ml(约67μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。87.7％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，12.3％被鉴定为与1个肽分子偶联的抗体。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2- Biot)/嵌合抗生物素抗体VH53C的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.16mgAc-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg嵌合抗生物素抗体VH53C以缓冲液中9.9mg/ml(约68μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。100％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla- Biot)/人源化抗生物素抗体VH53C的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.06mgAc-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。0.8mg人源化抗生物素抗体VH53C以缓冲液中9mg/ml(约62μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。62.2％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，33.9％被鉴定为与1个肽分子偶联的抗体，并且，3.9％被鉴定为未偶联的抗体。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2- Biot)/人源化抗生物素抗体VH53C的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.08mgAc-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。0.8mg人源化抗生物素抗体VH53C以缓冲液中9mg/ml(约62μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。71.4％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，26％被鉴定为与1个肽分子偶联的抗体，并且，2.5％被鉴定为未偶联的抗体。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2- Fluo)/抗荧光素抗体VH52bC的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.33mgAc-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg抗荧光素抗体VH52bC以缓冲液中9.3mg/ml(约63μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。95％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，5％被鉴定为与1个肽分子偶联的抗体。
用于形成半抗原化多肽和抗半抗原抗体的缀合物——Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2- Fluo)/抗荧光素抗体VH28C的示例性方法
为了产生含有半胱氨酸化接头的生物素衍生化-PYY-多肽的缀合物，将0.33mgAc-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。1mg抗荧光素抗体VH28C以缓冲液中9.5mg/ml(约63μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.2组成。将Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo]对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过质谱法分析所产生的缀合物。100％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体。
实施例8
产生共价性茶碱-抗茶碱抗体复合物
为了评价利用茶碱和结合茶碱的抗体作为半抗原识别系统的共价性抗体复合物的形成，总体上应用已经对洋地黄毒苷-Cys-Cy5或生物素-Cys-Cy5描述的合成和纯化技术，产生茶碱-Cys-Cy5作为荧光有效载荷，不同之处在于已经将半抗原交换为茶碱(参见实施例8)。在图16a)中显示已经合成的茶碱-Cys-Cy5衍生物的组成。为了展示共价二硫化物的形成，产生了结合茶碱的抗体，所述抗体在重链可变区的位置54或55处含有设计的Cys(抗茶碱抗体-Cys)。在图16b)中关于Y54C变体示例性地显示这些抗体的纯度。这些抗体衍生物与茶碱-Cys-Cy5复合并且随后在如实施例12中所述的非还原和还原条件下进行SDS-PAGE。在非还原条件下，二硫化物连接的抗茶碱抗体复合的Cy5按照与实施例12中所述相同的方式，通过凝胶内部其H链相关的荧光检测。这在图16c)中描述，该图表明由于按照与使用洋地黄毒苷、荧光素或生物素作为半抗原时观察到的二硫化物相同的方式进行简单的加载反应，在抗体之间已经形成共价复合物。如预期的那样，在还原后，这些复合物解离，即，仅当二硫化物还原时才从H链释放有效载荷(图16c))。
实施例9
在体内样条件下产生共价半抗原-抗体复合物，以及关于体内定向二硫化物的证据
为了评价体内样条件下共价半抗原-抗体复合物的形成，将抗生物素抗体-Cys在鼠血清中与生物素-Cys-Cy5在37℃下孵育60分钟。随后，通过蛋白A从鼠血清捕获抗体。此后，将捕获的抗体在如实施例12中所述的非还原和还原条件下进行SDS-PAGE。二硫化物连接的抗体复合的Cy5按照与实施例12中所述相同的方式，通过凝胶内部其H链相关的荧光检测。图17表明抗体之间的共价复合物在37℃下在血清中(即，在类似于体内条件的条件下)形成。如预期的那样，在还原后，这些复合物解离，即，仅当二硫化物还原时才从H链释放有效载荷(图17)。一旦半抗原定位，则抗体和有效载荷之间的定向二硫键可以形成，甚至在血清存在下也是如此，这样的观察结果出乎意料，因为血清含有高量的蛋白质、肽和其他化合物(它们可以干扰二硫化物形成反应)。一旦半抗原定位，则抗体和有效载荷之间的定向二硫键可以在37℃下在血清中形成，这样的观察结果还打开了在预靶向设定中应用这种PK-调节系统的可能性：分别施加抗体和半抗原-有效载荷，然后体内装配抗体复合物并随后形成二硫化物。
为了进一步评价体内‘预靶向’的潜在应用，通过如实施例18中所述的动物眼的非侵入式光学成像技术在预靶向条件下确定生物素-Cy5的药物代谢动力学。在这些实验中，通过动物眼光学成像(其显示毛细管中的Cy5的荧光)，以非侵入方式确定Cy5的存在。将我们在注射生物素-Cy5后10分钟于小鼠眼中检测到的Cy5介导的荧光值设定为100％值，并且相对该值表示在后续时间点测量的荧光值。在这个实验中，在注射生物素-Cy5并开始眼成像之前24小时施加1mg抗体(抗生物素抗体或抗生物素抗体-Cys(＝抗生物素抗体的Cys-突变体))。对照组不预先注射抗生物素抗体。
这些实验的结果示于图18：向未接受预先注射的抗体的动物注入的生物素-Cy5以低血清半寿期和低暴露水平消除(菱形)。向预先24小时注射抗生物素抗体(无Cys突变)的动物注入的生物素-Cy5的血清水平和半寿期大大增加。这显示该抗体捕获循环中的其抗原(带有效载荷)，并延长抗原(并同样延长缀合的有效载荷中的抗原)的血清半寿期。向预先24小时注射抗生物素抗体-Cys(即，含有如本文所报告用于共价偶联有效载荷的Cys突变的抗体)的动物注入的生物素-Cys-Cy5的相对血清水平和半寿期甚至进一步增加。在这些样品中，相对Cy5水平不仅高于非复合的化合物的那些水平，还高于复合(但是非二硫键结合)的Cy5的水平。因此，半抗原复合的二硫键连接的有效载荷(其在预靶向条件下在体内形成)在循环中更稳定，并且可以达到比非共价复合的有效载荷更高的暴露水平。
实施例10
在缀合物中和在与抗半抗原抗体的复合物中的多肽保留功能性
先前已经显示，作为非共价半抗原-多肽缀合物的部分和在与抗半抗原抗体的复合物中的多肽保留功能性(WO 2011/003557、WO 2011/003780和WO 2012/093068)。为了证明共价二硫化物偶联时偶联的肽同样保留功能性，比较了抗洋地黄毒苷抗体复合的多肽和它们与抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的二硫化物缀合物的生物学活性。
PYY衍生肽的治疗所需的官能团与其同族受体NPY2结合并干扰其同族受体NPY2的信号传导。经由NPY2受体的信号传导参与和/或调节代谢过程。
为了分别评价多肽Dig-PYY与抗洋地黄毒苷抗体的复合或SS-缀合或者多肽Dig-Cys-PYY与抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的缀合是否影响其活性，我们在表达NPY2受体的HEK293细胞中评价其抑制毛喉素刺激的cAMP积累的能力(cAMP测定法)。
下表6显示cAMP-测定法的结果，其中进行所述cAMP-测定法以评估PYY(3-36)、其Y2受体特异性修饰类似物moPYY、其复合抗体的Dig-变体和其二硫化物缀合的Dig-Cys-衍生物的生物学活性。
表6.
Figure BDA0001038570250001181
Figure BDA0001038570250001191
对于cAMP激动剂测定法，使用以下材料：384孔平板；Tropix cAMP-筛选试剂盒；cAMP ELISA系统(Applied Biosystems，目录号T1505；CS 20000)；毛喉素(Calbiochem目录号344270)；细胞：HEK293/hNPY2R；生长培养基：Dulbecco的改良eagle培养基(Dulbecco’smodified eagle medium)(D-MEM，Gibco)；10％胎牛血清(FBS，Gibco)，热灭活；1％青霉素/链霉素(青霉素10000单位/mL：链霉素10000mg/mL，Gibco)；500μg/mL G418(遗传霉素(Geneticin)，Gibco目录号11811-031)；以及铺板培养基：DMEM/F12w/o酚红(Gibco)；10％FBS(Gibco，目录号10082-147)，热灭活；1％青霉素/链霉素(Gibco，目录号15140-122)；500μg/mL G418(遗传霉素，Gibco，目录号11811-031)。
为进行测定法，在第1天，弃去培养基，并将单层细胞用10mL PBS/瓶(T225)洗涤。用PBS倾析后，将5mL VERSENE(Gibco，目录号1504006)用来移除细胞(在37℃下，5分钟)。温和地拍打培养瓶并汇集细胞悬液。将每只培养瓶用10mL铺板培养基冲洗并以1000rpm离心5分钟。汇集悬液并计数。对于HEK293/hNPY2R，将悬液以密度2.0×105细胞/mL重悬于铺板培养基中。使用多点分液器，将50微升细胞(HEK293/hNPY2R–10,000个细胞/孔)转移至384孔平板中。平板在37℃孵育过夜。在第2天，检查细胞是否到75-85％汇合度。使培养基和试剂达到室温。在制备稀释物之前，使二甲基亚砜(DMSO，Sigma，目录号D2650)中的刺激性化合物储液加温至32℃持续5-10分钟。在含有0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，Calbiochem，目录号410957)和0.5mg/mL BSA的DMEM/F12中制备稀释液。刺激培养基中的DMSO终浓度是1.1％，毛喉素浓度为5μM。在纸巾上温和翻转细胞平板拍去细胞培养基。每孔放置50μl刺激培养基(每个浓度一式四份进行)。将平板在室温下孵育30分钟，并且在显微镜下关于毒性检查细胞。在30分钟处理后，弃去刺激培养基并添加50μL/孔测定裂解缓冲液(在Tropix试剂盒中提供)。将平板在37℃孵育45分钟。将20μL裂解物从刺激平板转移至来自Tropix试剂盒的预包被抗体平板(384孔)。添加10μL AP缀合物和20μL抗cAMP抗体。将平板在室温下孵育1小时，同时振摇。随后用洗涤缓冲液洗涤平板5次，每次洗涤70μL/孔。将平板拍干。添加30μL/孔CSPD/Sapphire-II RTU底物/增强溶液并在室温下孵育45分钟(振摇)。在光度计(VICTOR-V)中测量信号持续1秒/孔。
这些测定法的结果(表6)表明，修饰的肽衍生物moPYY比野生型PYY具有可忽略的较低活性。对于野生型PYY，cAMP测定法的IC50值是0.09nM，并且，对于修饰的类似物，是0.14nM。共价二硫化物缀合导致生物学活性轻微降低。对于缀合物，IC50值是5-36nM。令人惊讶地，共价二硫化物缀合物的活性比非共价复合物高2倍，IC50值为10.91nM。
实施例11
较之生物素化Cy5与人源化抗生物素抗体VH53C的共价缀合物，生物素化Cy5与人源化抗生物素抗体的复合物的血清稳定性
所述的肽修饰技术的目的是改善肽的治疗适用性。肽的治疗性应用的主要瓶颈是目前有限的体内稳定性和/或短的血清半寿期和快速清除率。在体内测定荧光团的抗体缀合物的PK参数并且与非共价抗体-荧光团复合物的PK进行比较。因此，(i)将抗生物素抗体VH53C共价缀合至生物素化荧光团Biot-Cys-Cy5，(ii)产生抗生物素抗体与生物素化荧光团Biot-Cy5的非共价复合物，(iii)将共价缀合的和非共价复合的化合物施加至动物，和(iv)通过测定Cy5的荧光(A650)测量化合物在这些动物中随时间的血清浓度，并且通过特异性检测人源化抗体的ELISA方法测量相应抗体在这些动物中随时间的血清浓度。
实验方法
为了分析对小荧光底物的抗体复合的PK参数的影响，对每种物质而言，将13nmol在20mM组氨酸/140mM NaCl，pH 6.0中的Cy5-生物素/人源化抗生物素抗体VH53C-缀合物或相应的与抗体非共价复合的化合物或单独的荧光化合物施加至6只雌性小鼠(品系NRMI)。对于第一组中的小鼠1、2和3，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时、4小时和48小时，并且，对于第二组中的小鼠1、2和3，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时、24小时和72小时。在室温1小时后通过离心(9300×g，3分钟，4℃)获得至少50μl血清样品。血清样品贮存在-80℃。
为了确定化合物在给定时间点在血清中的量，利用Cy5的荧光特性：在室温下使用Cary Eclipse荧光分光光度计(Varian)在120μl石英比色皿中测量血清样品中的Cy5相关荧光。激发波长是640nm，在667nm处测量发射。将血清样品稀释于1×PBS中以达到适宜的发射强度范围。作为相应样品，使用1×PBS中相同稀释的未处理小鼠的血清作为空白探针并且它不显示任何荧光信号。
图7显示使用共价缀合物、非共价复合物和非复合的半抗原-Cy5时分析的结果。数据显示为对注射后5分钟的(峰)血清水平归一化的Cy5-介导荧光的相对(％)水平。对于分子量相当小的化合物，非复合的生物素-Ser-Cy5从血清快速消失。注射后1小时，在血清中施加且5分钟后可检测的荧光中仅6％仍然可检出。在更晚的时间点，注射后2小时、4小时和24小时，Cy5介导的信号不可检出。
在抗体复合的化合物中，注射后4小时，在血清中仍然可检出大约50％的所施加的荧光(5分钟水平设定成100％)。还可以在更晚的时间点检出Cy5-介导的荧光水平，注射后2小时可检出5分钟值的大约22％，并且注射后48小时可检出大约12％并且72小时后仍可检出8％。抗体缀合的化合物显示出比抗体复合的化合物显著更长的体内半寿期。注射后4小时，在血清中仍然可检出大约58％的所施加的荧光(5分钟水平设定成100％)(比抗体复合的化合物高1.16倍)。在24小时后，血清中检出35％(1.6倍)的Cy5-介导荧光，在48小时后检出31％(2.6倍)的Cy5-介导荧光，并且，在72小时后检出26％(3.3倍)的Cy5-介导荧光。实验首个24个小时中复合化合物和缀合化合物的荧光的可比性下降可以解释对于复合物和缀合物而言相似的早期分布。在24小时后，抗体缀合的化合物的体内稳定性是差异的原因。
为了确定血清中人IgG抗体在给定时间点的量，利用以下测定原理：在用抗人κ链单克隆IgG抗体包被的固相(
Figure BDA0001038570250001221
微量滴定板，NUNC-ImmunoTM)上捕获血清样品中的人IgG1抗体。血清样品按1:105和1:106稀释并将100μl这些稀释物加入到孔中。在孵育后，将孔每次用300μl PBS/0.05％Tween 20洗涤3次。通过首先加入100μl浓度为0.25μg/ml的抗人CH1结构域IgG(其在C-末端被洋地黄毒苷化)，实施人IgG抗体的检测。在每次用300μl1×PBS/0.05％Tween 20洗涤3次后，加入100μl浓度为25mU/ml的与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗洋地黄毒苷抗体Fab片段。最后，每孔加入100μl
Figure BDA0001038570250001222
在环境温度下孵育30分钟后，在商用微量滴定板ELISA读数仪(例如Tecan Sunrise)中于405nm和492nm[405/492]处测量消光(OD)。
图7显示在用抗体-生物素-Cy5-复合物和缀合物处理的小鼠中Bio-Cy5血清水平以及人IgG的血清水平。数据显示为对注射后5分钟的(峰)血清水平归一化的人IgG相对(％)水平。抗体-半抗原-复合物和缀合物的相对人IgG血清水平都与针对抗体-半抗原缀合物测量的相对荧光一致。因此，生物素-Cys-Cy5化合物显示出类似于与之缀合的抗体的体内稳定性，这意味抗体-半抗原缀合物在体内保持完整。显然，对于抗体-半抗原复合物来说并非如此，所述抗体-半抗原复合物的Cy5-介导的相对荧光比人IgG相对血清水平下降得更快。这意味复合物在体内随时间推移释放有效载荷。
总之，当被抗半抗原抗体结合时，半抗原化化合物的体内稳定性显著增加。然而，抗体-半抗原复合物在体内不是完全稳定的，因为半抗原-Cy5血清水平的下降比抗体血清水平的下降更快。对于抗体-半抗原-Cy5缀合物来说并非如此，所述抗体-半抗原-Cy5缀合物显示出与正常IgG抗体相似的体内特征。
Dig-肽血清动力学(非共价复合物和共价缀合物的比较)
为了分析对洋地黄毒苷化多肽的抗体复合和抗体缀合的PK参数的影响，对于每种物质，将20mM组氨酸/140mM NaCl pH 6.0中的32.1nmol的多肽或相应的与抗体非共价复合的多肽施加至2只雌性小鼠(品系NRMI)。施用MAK-DIG-PYY的小鼠具有23g和25g体重，并且，施用DIG-PYY的小鼠具有28g和26g体重。对于小鼠1，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时，2小时和24小时，并且，对于小鼠2，在以下时间点后采集约0.1ml血液样品：0.08小时、4小时、24小时。在室温1小时后通过离心(9300×g，3分钟，4℃)获得至少40μl血清样品。血清样品贮存在-80℃。
与Dig-Cy5的检测相比，在给定时间点在血清中的洋地黄毒苷化肽的量难以确定，因为无检测血清样品中多肽的直接手段可用。因此，建立了用于检测血清中的洋地黄毒苷化肽的蛋白质印迹相关测定法。在第一步骤中，在还原性SDS-PAGE上分离血清样品。因为样品制备包括使血清暴露于高浓度的SDS和还原剂，复合的Dig-多肽缀合物可以变为从(完全变性/解折叠的)抗洋地黄毒苷抗体释放，而共价缀合物保持结合。为了介导多肽从非共价抗体复合物释放并通过SDS-PAGE分离单个组分，将2μl各血清样品稀释于18μl 20mM组氨酸/140mM NaCl pH 6.0中，在95℃与6.7μl 4×LDS样品缓冲液和3μl 10×样品还原剂(NuPAGE，Invitrogen)混合5分钟。作为对照，使用2μl未处理的相同品系小鼠的血清。将样品施加至4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGE，Invitrogen)，其中，使用1×MES(Invitrogen)作为运行缓冲液，在200V/120mA运行所述凝胶20分钟。随后，使用XCell Sure
Figure BDA0001038570250001231
Mini-Cell系统(Invitrogen)在25V/130mA运行40分钟，将分离的多肽印迹到PVDF膜(0.22μm孔径，Invitrogen)上。在室温下，将膜在1×PBS+1％Tween20(PBST)中的1％脱脂乳中封闭1小时。随后在膜上用抗洋地黄毒苷抗体检测洋地黄毒苷化多肽。为此，将抗洋地黄毒苷抗体以10ml 1％脱脂乳/PBST中的浓度13μg/ml施加至膜上，在室温下持续2小时。膜在1×PBST中洗涤3×5分钟。在10ml 1％脱脂乳/PBST中，以1:25稀释度应用来自LumiLightPLUS蛋白质印迹试剂盒(Roche)的与POD偶联的抗小鼠IgG Fab片段，在室温下持续1小时。膜用1×PBST洗涤3×5分钟。通过在4ml LumiLight蛋白质印迹底物中在室温下孵育该膜5分钟，实施检测。用LumiImager F1(Roche)检测化学发光，曝光时间20分钟。
这些分析的结果示于图8A和图8B。在不同时间点、在鼠血清中的洋地黄毒苷多肽的存在/量已被确定。已接受抗体复合的肽的小鼠(图8左侧)在最早时间点显示强信号(施用后5分钟)。如对照印迹上的大小和位置所示，这些信号是明确可分配的(clearlyassignable)。在用抗体复合多肽处理的小鼠的血清中，多肽相关的信号在早期时间点最强并随时间降低。然而，在所有时间点以及甚至施用后24小时仍然可检出多肽，信号良好。
在接受非复合的多肽的小鼠中，甚至在最早时间点几乎没有任何可与小多肽相关的信号可检出。图8在右侧显示在正常曝光条件下，印迹上见不到游离多肽。印迹的对比度增强显示在施用后5分钟存在一些多肽，然而仅以痕量存在。在更晚的时间点，不可检出确定的多肽条带。
可以看出，非复合的多肽在小鼠的血清中具有非常短的半寿期。接受相同但处于抗体复合形式的多肽的小鼠显示这些多肽在血清中以增加的时段存在。注射后24小时，在这些小鼠的血清中可以测定出多肽。
实施例12
共价连接的洋地黄毒苷-抗体复合物和结合洋地黄毒苷的IgG的血清半寿期
为了分析共价复合相对于非共价连接的半抗原复合物是否进一步改善PK特性，体内确定抗洋地黄毒苷抗体-洋地黄毒苷-Cy5复合物以及共价连接的[抗洋地黄毒苷抗体-Cys]-[洋地黄毒苷-Cys-Cy5]缀合物的PK参数。因此，利用其荧光(A650)测定洋地黄毒苷-Cy5，并且通过特异性检测人源化抗体的ELISA方法测定相应的抗体。将洋地黄毒苷-Cy5作为半抗原偶联肽的低分子量‘替代物’使用，因为其荧光特性允许在血清中容易和精确的检测。
按照与针对生物素-Cy5或生物素-Cys-Cy5所描述的相同的方式(参见实施例16)，将洋地黄毒苷-Cy5或抗体复合的或另外地抗体-Cys-连接的洋地黄毒苷-Cy5静脉内注射至雌性NRMI小鼠中，随后，在0.08小时、2小时、4小时和24小时采集血液。将注射后5分钟(t＝0.08小时)针对两只小鼠/在两只小鼠中检测的Cy5-介导的荧光值设定为100％值并且将后续时间点处测量的荧光值相对它来表示。
这些实验的结果显示，对于洋地黄毒苷-Cy5，在注射后2小时可检出少于10％的所施加的荧光(5分钟值)。在更晚的时间点，分别在注射后4小时和24小时，不可检出Cy5-介导的信号(参见图14)。与非复合的化合物形成对照，抗体复合的化合物以高得多的水平并且在更晚时间点可检出(图14)。这表明抗体复合显著地增加小化合物洋地黄毒苷-Cy5的血清半寿期。另外，与非共价连接的复合物相比，共价连接的有效载荷显示更大的PK延长。洋地黄毒苷-Cy5水平和抗体水平的直接比较表明随时间有效载荷从抗体丢失，Cy5水平比抗体水平下降更快。与之相反，共价连接的洋地黄毒苷-缀合物显示几乎相同的Cy5和IgG血清半寿期(图14)。这表示二硫化物连接的有效载荷保持与抗体稳定连接，而非共价复合物随时间解离。
实施例13
共价连接的半抗原-抗体复合物和仅通过半抗原结合位点附接的复合物的血清半寿期和暴露水平
为了分析共价复合是否改善非共价连接的半抗原复合物的PK-特性，体内确定抗生物素抗体与生物素-Cy5的复合物的PK以及共价连接的缀合物[抗生物素-抗体-Cys]-[生物素-Cys-Cy5]的PK。通过动物眼光学成像(其显示毛细管中的Cy5的荧光)，以非侵入方式确定Cy5的存在。将我们在注射后10分钟于小鼠眼中检测到的Cy5介导的荧光值设定为100％值，并且相对该值表示在后续时间点测量的荧光值。这些实验的结果示于图15：非复合的生物素-Cy5本身具有低的血清半寿期和低的暴露水平。未共价连接的抗体复合化合物以高得多的水平可检出并具有延长的半寿期。另外，与非共价连接的复合物相比，共价连接的有效载荷显示更大的PK延长和更高的血清水平。这表明，半抗原复合的二硫化物连接的有效载荷在循环中更稳定，并且可以达到比非共价复合的有效载荷更高的暴露水平。
实施例14
肽与结合不同半抗原的抗体复合和共价缀合
应用结合半抗原的模块以偶联半抗原化化合物(＝有效载荷)至靶向载体是借此可以实现半抗原介导的递送的一种技术可能性。可以将该概念扩展至捕获化合物并使它们与靶向模块连接的其他半抗原或其他实体。例如，对于多肽递送或稳定化，可以应用结合洋地黄毒苷或其他半抗原的单特异性或双特异性抗体以稳定治疗性多肽及优化其PK。
作为捕获多肽的模块应用的先决条件是(i)化合物与半抗原的偶联不会严重干扰多肽活性和(ii)抗体与半抗原化化合物的有效结合/复合的可能性。
半抗原定向的结合是半抗原化染料或多肽与抗半抗原的半胱氨酸化抗体有效共价偶联的先决条件。
为了显示亲和力驱动的半抗原化化合物与抗半抗原抗体的复合是有效形成二硫键的先决条件，将生物素-Cys-Cy5与人源化抗洋地黄毒苷抗体和人源化抗洋地黄毒苷抗体VH53C孵育。实施生物素-Cys-Cy5与人源化抗生物素抗体和人源化抗生物素抗体VH53C的孵育作为对照反应。
将0.13mg生物素-Cys-Cy5溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。0.7mg每种抗体以缓冲液中6.7mg/ml(约46μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.2组成。将生物素-Cys-Cy5和抗体以2.5:1摩尔比(Ac-生物素-Cys-Cy5对抗体)混合并在室温下孵育60分钟，以350rpm振摇。通过SDS-PAGE进一步分析所产生的复合物/缀合物并随后检测聚丙烯酰胺凝胶中的Cy5相关荧光。将15μg复合物/缀合物与4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合并在95℃下孵育5分钟。使用LumiImager F1装置(Roche)在645nm的激发波长处记录Cy5相关荧光。
当使用CDR2中无半胱氨酸的人源化抗生物素抗体时(图36，泳道3)，非还原样品显示人源化抗生物素抗体VH53C的共价性位点特异性二硫键形成(图36，泳道4)，其具有非常低的背景荧光信号。当使用人源化抗洋地黄毒苷抗体时(图36，泳道1)，生物素-Cys-Cy5也共价偶联至人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC(图36，泳道2)，其具有低的背景信号，但是效率显著较低。这可以从凝胶底部检测到的过量生物素-Cys-Cy5推断出来(箭头)。在人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC的情况下，可以检测到比人源化抗生物素抗体VH53C(泳道4)显著更多的未偶联的生物素-Cys-Cy5(泳道2)。当还原样品时，在抗体重链和轻链附近不能检测到Cy5相关荧光，这表明共价键的确由二硫桥形成。每块凝胶的考马斯染色显示每条泳道中的蛋白质的总量相等。
实施例15
半抗原定向的结合是半抗原化染料或多肽与抗半抗原的半胱氨酸化抗体有效共价偶联的先决条件
为显示半抗原化化合物与抗半抗原抗体的亲和力驱动的复合是有效形成二硫键的先决条件，将非半抗原化的肽Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)(Biosynthan 1763.1,SEQ IDNO:178)与人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC和人源化抗洋地黄毒苷抗体孵育。将1.4mg Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)溶解于100％DMF中至浓度为10mg/ml。2mg每种抗体以缓冲液中11-13mg/ml(约75-89μM)的浓度使用，所述缓冲液由50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.2组成。将Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)和抗体以2.1:1摩尔比(Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)对抗体)混合。肽以3部分添加，同时用搅拌棒以500rpm搅拌溶液。在每次添加之间，将样品在200rpm下孵育5分钟。在添加最后部分后，将样品在室温和200rpm下孵育1小时。
通过尺寸排阻层析,对于Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC缀合物，所产生的复合物/缀合物确定为97％单体IgG样分子和3％二聚体可溶性聚集物，并且对于Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):人源化抗洋地黄毒苷抗体复合物确定为100％单体。另外，通过质谱法分析所产生的复合物/缀合物。对于Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC缀合物，17％的所检测到的种类被鉴定为与2个肽分子偶联的抗体，51％被鉴定为与1个肽分子偶联的抗体，并且，32％被鉴定为无偶联肽的抗体。对于Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):人源化抗洋地黄毒苷抗体复合物，100％的抗体未偶联。
实施例16
对于形成正确折叠的具有用于共价偶联有效载荷的半胱氨酸突变的结合半抗原的功能抗体所需要的二硫化物样式
用于共价偶联化合物/有效载荷的结合半抗原的模块可以由‘标准’抗体(如，IgG)组成，所述‘标准’抗体含有允许共价附接半抗原化化合物/有效载荷的额外半胱氨酸。如本文所报告的方法在折叠的结构域内部引入所需要的功能性(半胱氨酸)，其结构和序列为抗体功能性提供基础。在抗体结构域内部以及之间正确形成限定的二硫键对于形成并维持正确的结构和功能性来说是必需的。图10(A)显示对于形成有功能的结合臂(如，未修饰抗体的Fab)来说需要的二硫化物样式，并且，图10(B)显示对于维持VH52cB/VH53C突变的抗体衍生物的结构和功能性来说必需的二硫化物样式。为了维持正确的二硫化物样式，在VH结构域中引入的额外半胱氨酸必须未被占据并且必须不干扰相邻的半胱氨酸或与之反应。图10(C)和图10(D)显示，添加额外的半胱氨酸产生以下可能性：在生物合成这类分子期间在VH结构域内部形成不正确的二硫化物。VH52bC/VH53C位置位于VH结构域内部(并相当接近于其他半胱氨酸)的事实加剧了在生物合成重链期间可能形成不正确的二硫化物的风险。另一个潜在问题是VH结构域和VL结构域在分泌途径内部装配成一个Fv片段。分泌途径涉及氧化还原改组条件和二硫化物形成酶和二硫化物改组酶。因此，通过添加VH52bC/VH53C突变引入不正确二硫键的可能性还可能‘扩散’至轻链的二硫键(在图10(E)中示例性地显示)。这进一步增强获得/产生不正确折叠的无功能分子的风险。因此相当令人惊讶的是，尽管有这些风险，仍可以表达并获得大量含有VH52bC/VH53C突变的均一的功能抗体衍生物，并且其能够共价连接至半抗原化化合物/有效载荷。
实施例17
具有用于共价偶联的半胱氨酸突变的抗半抗原二硫化物稳定化的单链Fv片段的组成和产生
用于共价偶联化合物/有效载荷的结合半抗原的模块可以由‘标准’抗体(如，IgG)组成。备选地，它们可以是修饰的实体如重组Fv或Fab片段或其衍生物。经常应用单链Fv片段作为全长抗体的备选物，特别是在其中需要小模块尺寸或其中需要额外的结合模块以产生双特异性或多特异性抗体衍生物的应用中。已经产生的抗半抗原Fv衍生实体的一个例子是结合并共价连接洋地黄毒苷化化合物/有效载荷的二硫化物稳定化的单链Fv。通过经由富含Gly和Ser的柔性接头彼此连接抗洋地黄毒苷抗体VH结构域和VL结构域，产生具有Dig-结合特异性的二硫化物稳定化的单链Fv。这些VH结构域和VL结构域在VH的位置44和VL的位置100(根据Kabat等人的位置)额外携带半胱氨酸突变。这些额外的半胱氨酸在VH和VL之间形成稳定的分子间二硫键。这稳定了scFv，如先前所述(例如Reiter,Y.等人,NatureBiotechnology 14(1996)1239-1245)。
除此之外，还分别在根据Kabat编号法的位置52b或53处将另一个半胱氨酸引入VH中，以向Fv片段添加共价连接功能性。
然而，向二硫化物稳定化的Fv片段中引入这类突变远比将它们安置在全长抗体中更有挑战性。单链Fv片段比全长IgG或Fab片段内在地更不稳定，因为它们缺少恒定结构域作为稳定和强制异源二聚化的实体。可以通过向Fv中安置额外的半胱氨酸突变如VH44-VL100二硫化物赋予稳定性。然而，这种稳定化原理仅当二硫化物在正确位置处在正确的半胱氨酸之间形成时才起作用。因此，除了确定的域内二硫化物(一个在VH中，并且，一个在VL中)之外，需要形成一个单一确定的正确域间二硫化物。非匹配性半胱氨酸之间的二硫化物连接将产生错误折叠的不稳定和无功能的实体。考虑到二硫化物稳定化的Fv片段含有6个半胱氨酸，则理论上可以形成21个不同的二硫化物连接可以形成——但是仅正确组合的3个确定的二硫化物将形成有功能的稳定化的dsscFv。当向VH结构域中添加另一个游离半胱氨酸时，这种困难加剧。所期望的稳定化的dsscFv含有两个确定的域内二硫化物(VH和VL中各一个)、一个确定的域间二硫化物(在VH和VL之间)和此外一个用于半抗原化化合物/有效载荷偶联的游离半胱氨酸(在VH中位置52b/53处)。考虑到具有用于共价偶联的额外半胱氨酸突变的二硫化物稳定化的Fv片段含有7个半胱氨酸，理论上许多不同的二硫化物连接可以形成，但是仅所述3个确定二硫化物的正确组合(其具有在VH52b/VH53处的确切的游离半胱氨酸位置)才将产生有功能的稳定化的能够共价偶联的dsscFv。一个额外的挑战是以下事实：额外的游离半胱氨酸(VH52b/VH53)位于紧靠VH44半胱氨酸的位置，所述VH44半胱氨酸不是天然存在的半胱氨酸，而是引入用于二硫化物稳定化的突变。VH44C对于形成正确的域间二硫化物来说是必需的，并且，不受该理论束缚，这种二硫化物很可能在VH和VL独立折叠和装配后形成。VH44C和VH52bC/VH53C的邻近加剧了域内二硫化物不以正确方式形成的风险。但是已经发现可以产生有功能的二硫化物稳定化的单链Fv模块，所述单链Fv模块结合洋地黄毒苷并同时能够共价连接至洋地黄毒苷化有效载荷。在正确位置含有正确二硫化物和游离半胱氨酸的二硫化物稳定化的单链Fv分子的组成及其与不想要的不正确折叠的分子的比较示于图11。编码具有VH52bC突变Fv抗体衍生物的这种结合Dig的dsscFv的轻链可变区和经修饰的重链可变区的序列在SEQ ID NO:190(VH)下列出并且在SEQ ID NO:189下列出了相应的VL。在实施例23(下文)中以及在图13(A)、图13(B)和图13(C)中描述了成功产生这类dsscFv作为用于产生双特异性抗体衍生物的模块。
实施例18
用于靶向递送共价偶联的化合物/有效载荷的双特异性抗半抗原抗体衍生物的组成、表达和纯化
产生这些双特异性抗体，它们含有用于共价偶联化合物/有效载荷的结合半抗原的抗体模块。这些抗体额外地含有能够靶向其他抗原的结合模块。这类双特异性抗体的应用包括将半抗原化化合物/有效载荷特异性靶向至携带靶抗原的细胞或组织。产生的这类分子的一个例子是双特异性抗体，所述双特异性抗体具有结合区(其识别肿瘤相关糖抗原LeY)并同时具有二硫化物稳定化的Fv(其结合并共价连接洋地黄毒苷化化合物/有效载荷)。因此，二硫化物稳定化的单链Fv通过富含Gly和Ser的柔性连接肽连接至LeY抗体的CH3结构域的C-末端，产生具有两个LeY结合臂和额外地两个结合洋地黄毒苷的实体的四价分子。结合洋地黄毒苷的实体携带先前已经描述的VH44-VL100二硫键(例如Reiter,Y.等人,Nature Biotechnology 14(1996)1239-1245)。结合洋地黄毒苷的实体额外地含有用于共价偶联的VH52bC突变。在SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192下列出编码这种LeY-Dig抗体衍生物的轻链和经修饰的重链的序列。在图12中示意性地显示作为用于共价偶联的化合物/有效载荷的递送载体的LeY-Dig双特异性抗体衍生物的组成。
这些双特异性分子由分子生物学技术产生，通过从培养的细胞分泌来表达，随后按照与上文描述的相同方式从培养上清液纯化。图13(A)显示这种LeY-Dig(52bC)双特异性抗体的经修饰的H-链和L-链在细胞培养上清液中的存在，这在检测抗体L-链和H-链的蛋白质印迹分析中可视化。图13(B)展示在还原剂存在下通过SDS-PAGE纯化后这些抗体的均一性。用考马斯亮蓝对SDS-PAGE染色显现了与IgG相关的多肽链，所述多肽链具有与其计算分子量相似的表观分子大小。图13(C)显示在蛋白A纯化后LeY-Dig(52bC)双特异性抗体的SEC谱，其证明蛋白质制备物的均一性和其中缺少聚集物。因此，可以产生含有靶向模块以及用于共价偶联半抗原化化合物/有效载荷的模块的双特异性抗体并纯化至均匀。
实施例19
与生物胞素酰胺复合的鼠抗生物素抗体Fab片段的X射线结构测定
测定与生物胞素酰胺复合的鼠抗生物素抗体Fab片段的蛋白结构。因此，将Fab片段的晶体在0.8M琥珀酸中生长，随后将抗体晶体载以生物胞素酰胺(在结晶溶液中稀释至10mM工作浓度，以结晶液滴施加至晶体)。将晶体用2μl 10mM生物胞素酰胺溶液洗涤3次并且最后在21℃与生物胞素酰胺孵育16小时，用15％丙三醇作为低温保护剂收获并且在液氮中急冻。处理的衍射图以
Figure BDA0001038570250001321
分辨率产生蛋白结构。在图19中显示结合生物素的可变区的结构和电荷组成：生物素结合入旁侧分布有带电荷区域的表面口袋中，所述带电荷区域由来自CDR区的氨基酸组成。复合的半抗原紧邻于带负电荷的氨基酸簇安置。在其羧基处经衍生化用于有效载荷偶联的作为半抗原的生物素以良好效力结合，因为在这个位置不存在电荷排斥作用(归因于缺少COOH基)。与之相反，游离(正常)生物素不能与抗体有效结合，因为其羧基将紧邻于这个负电荷簇，并且因此被排斥。
实施例20
抗半抗原双特异性抗体
该双特异性抗体识别肿瘤相关的细胞表面抗原(如，LeY)并同时结合半抗原(如，举例来说，洋地黄毒苷(Dig))。图20A显示该双特异性抗体的组成，基于先前描述的全长IgG衍生形式(参见Metz等人，同上，WO 2012/093068)：细胞表面抗原结合功能性位于IgG部分的两个Fab臂中，重组融合至重链C-末端的两个额外的scFv具有半抗原结合活性。该scFv模块携带额外的稳定性链间二硫键以稳定化Fv并减少聚集(VHCys44至VLCys100)。此外，取决于相应抗体的CDR2的实际长度，该抗半抗原抗体在根据Kabat编号法的位置VH52b或VH53处具有人工半胱氨酸残基，以允许双特异性抗半抗原抗体和多肽毒素之间的共价二硫键的形成。
在SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199中列出结合LeY和Dig的含有Dig-VH Cys的双特异性抗体的L-链序列和H-链序列。
如先前所述(参见Metz等人，同上，WO 2012/093068)，在悬浮的HEK293细胞中瞬时产生双特异性抗体，并且从培养上清液中纯化。将编码Fab-Fv融合物的轻链和重链的质粒共转染到在无血清培养基中培养的HEK293悬浮细胞中。在转染后7天，通过离心和0.22μm过滤澄清上清液。通过蛋白然后通过用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的SEC(Superdex200HiLoad 26/60,GE Healthcare)纯化双特异性抗体。以320nm处的光密度作为背景，通过280nm处的光密度确定蛋白质浓度，通过SDS-PAGE证实纯化的蛋白质的均一性。
在该研究中应用的所得的双特异性抗体制备物(SEC和SDS PAGE)的组成、纯度和均一性示于图20B。
实施例21
在双特异性抗半抗原抗体中得到正确的二硫化物和可及的半胱氨酸
用于与多肽毒素共价偶联的结合半抗原的模块由‘标准’抗体(如，IgG)组成，所述‘标准’抗体含有用于与半抗原化多肽毒素形成二硫键的一个或多个额外的半胱氨酸残基。如本文所报告的方法在折叠的结构域内部引入所需要的功能性(半胱氨酸)，所述折叠的结构域的结构和序列为抗体功能性提供基础。在抗体结构域内部以及之间正确形成限定的二硫键对于形成并维持正确的结构和功能性来说是必需的。图10(A)显示对于形成有功能的结合臂(如，未修饰抗体的Fab)来说需要的二硫化物样式，并且，图10(B)显示对于维持VH52cB/VH53C突变的抗体衍生物的结构和功能性来说必需的二硫化物样式。为了维持正确的二硫化物样式，在VH结构域中引入的额外半胱氨酸必须未被链内二硫键占据并且必须不干扰相邻的半胱氨酸或与之反应。图10(C)和图10(D)显示，添加人工半胱氨酸残基产生在生物合成这类分子期间在VH结构域内部形成不正确的二硫化物的可能性。VH52bC/VH53C位置位于VH结构域内部，实际上在CDR2中，(并相当接近于其他半胱氨酸)的事实加剧了在生物合成重链期间可能形成不正确的二硫化物的风险。另一个潜在问题是VH结构域和VL结构域在分泌途径内部装配成一个Fv片段。分泌途径涉及氧化还原改组条件和二硫化物形成酶和二硫键改组酶。因此，通过添加VH52bC/VH53C突变引入不正确二硫化物的可能性还可能‘扩散’至轻链的二硫化物(在图10(E)中示例性地显示)。这进一步增加获得/产生不正确折叠的无功能分子的风险。因此相当令人惊讶的是，尽管有这些风险，仍可以表达并获得大量含有VH52bC/VH53C突变的均一的功能抗体衍生物，其是有功能的并且能够共价连接至半抗原化多肽毒素。
在双特异性抗体的产生中，正确装配二硫化物同时维持正确的游离半胱氨酸的问题进一步加剧。为了产生具有用于共价偶联的半胱氨酸突变的抗半抗原二硫化物稳定化单链Fv片段，用于共价偶联多肽毒素的结合半抗原的模块可以由‘标准’抗体(如，IgG)组成。备选地，它们可以是抗体片段如重组Fv或Fab片段或其衍生物。经常应用单链Fv片段作为全长抗体的备选物，特别是在其中需要小模块尺寸或其中需要额外的结合模块以产生双特异性或多特异性抗体衍生物的应用中。已经产生的抗半抗原Fv衍生实体的一个例子是结合并共价连接洋地黄毒苷化多肽毒素的二硫化物稳定化的单链Fv。通过经由柔性GS-接头彼此连接抗洋地黄毒苷抗体VH结构域和VL结构域，产生具有洋地黄毒苷结合特异性的二硫化物稳定化的单链Fv。这些VH结构域和VL结构域在VH的位置44和VL的位置100(根据Kabat等人的位置)额外携带半胱氨酸突变。这些额外的半胱氨酸在VH和VL之间形成稳定的分子间二硫键。这稳定了scFv，如先前所述(例如Reiter,Y.等人,Nature Biotechnology 14(1996)1239-1245)。
除此之外，还分别在根据Kabat编号法的位置52b或53处将另一个半胱氨酸引入VH中，以向Fv片段添加共价连接功能性。然而，向二硫化物稳定化的Fv片段中引入这类突变远比将它们安置在全长抗体中更有挑战性。单链Fv片段比全长IgG或Fab片段内在地更不稳定，因为它们缺少恒定结构域作为稳定和强制异源二聚化的实体。可以通过向Fv中安置额外的半胱氨酸突变如VH44-VL100二硫化物赋予稳定性。然而，这种稳定化原理仅当二硫化物在正确位置处在正确的半胱氨酸之间形成时才起作用。因此，除了确定的域内二硫化物(一个在VH中，并且，一个在VL中)之外，需要形成一个单一确定的正确域间二硫化物。非匹配性半胱氨酸之间的二硫化物连接将产生错误折叠的不稳定和无功能的实体。考虑到二硫化物稳定化的Fv片段含有6个半胱氨酸，则理论上可以形成21个不同的二硫化物连接可以形成——但是仅正确组合的3个确定二硫化物将形成有功能的稳定的单链二硫化物稳定化Fv片段(dsscFv)。当向VH结构域中添加另一个游离半胱氨酸时，这种困难加剧。所期望的二硫化物稳定化的Fv片段(dsscFv)含有两个确定的域内二硫化物(VH和VL中各一个)、一个确定的域间二硫化物(在VH和VL之间)和此外一个用于半抗原化化合物/有效载荷偶联的游离半胱氨酸(在VH中位置52b/53处)。考虑到具有用于共价偶联的额外半胱氨酸突变的二硫化物稳定化的Fv片段含有7个半胱氨酸，理论上许多不同的二硫化物连接可以形成，但是仅所述3个确定二硫化物的正确组合(其具有在VH52b/VH53处的确切的游离半胱氨酸位置)才将产生有功能的、稳定化的并且能够共价偶联的dsscFv。一个额外的挑战是以下事实：额外的游离半胱氨酸(VH52b/VH53)位于紧靠VH44半胱氨酸的位置，所述VH44半胱氨酸同样不是天然存在的半胱氨酸，而是引入用于二硫化物稳定化的突变。VH44C对于形成正确的域间二硫化物来说是必需的。不受该理论束缚，这种二硫键很可能在VH和VL独立折叠和装配后形成。VH44C和VH52bC/VH53C的邻近加剧了域内二硫化物不以正确方式形成的风险。但是已经发现可以产生二硫化物稳定化的有功能的单链Fv模块，所述单链Fv模块结合洋地黄毒苷并同时能够共价连接至洋地黄毒苷化多肽毒素。在正确位置含有正确二硫化物和游离半胱氨酸的二硫化物稳定化的单链Fv分子的组成及其与不想要的不正确折叠的分子的比较示于图11。
实施例22
半抗原化假单胞菌外毒素衍生物
假单胞菌外毒素是一种66kDa的蛋白质，该蛋白质以其N-末端结构域I与真核细胞结合，内化，在结构域II中发生蛋白水解加工并将C-末端结构域III释放到细胞质中。该结构域使eEF2发生ADP-核糖基化，这导致蛋白质合成的抑制和随后的细胞死亡。在图21中显示截短变体，包括本文中用作多肽毒素的那些：分子NLysPE38删除了细胞结合结构域I和结构域IB(Weldon,J.E.和Pastan,I.,FEBS Journal 278(2011)4683-4700；Debinski,W.和Pastan,I.,Cancer Res.52(1992)5379-5385)。该分子本身具有非常低的细胞毒性效力。NLysPE38含有接近于其N-末端的赖氨酸(N-Lys)，其可以通过NHS-化学进行化学修饰。最近已经表明，在dsscFv-融合物的情况下，大部分结构域II也可以删除而不会损失效力，只要加工位点保留(Weldon,J.E.和Pastan,I.,FEBS Journal 278(2011)4683-4700；Hansen,J.K.等人,J.Immunother.33(2010)297-304；Pastan,I.等人,Leukemia&Lymphoma 52(2011)Supp.2:87-90)。这类融合蛋白内部的毒素的大小约为25kDa。截短的毒素在结构域III中仍然含有赖氨酸残基。先前描述的毒素NlysPE40QQR将结构域III的赖氨酸替换为谷氨酰胺或精氨酸(Debinski,W.和Pastan,I.,Cancer Res.52(1992)5379-5385；Debinski,W.和Pastan,I.,Bioconjug.Chem.5(1994)40-46)，以减小胺修饰试剂如NHS使结构域III失活的风险。本文报告了新的多肽毒素变体NLysPE25SQΔ，其删除了结构域I和IB以及大部分结构域II(CD22-LR8M的毒素部分(Pastan,I.等人,Leukemia&Lymphoma 52(2011)Supp.2:87-90))，并且，其在结构域III中含有赖氨酸至丝氨酸或谷氨酰胺的交换(NlysPE40QQR-类似突变)。此外，删除了C-末端赖氨酸，并且其携带(NlysPE38的)氨基末端赖氨酸延伸。因此，NLysPE25SQΔ是一个相当小的毒素部分，该毒素部分仅含有一个位于其N-末端处的赖氨酸。该赖氨酸的伯胺(和N-末端的伯胺)可以由NHS-试剂修饰而不影响该毒素的其他位置。NLysPE25SQΔ(PE25)在大肠杆菌中产生并且从周质纯化，通过阴离子交换层析和尺寸排阻层析进行所述纯化，以去除聚集物和更小尺寸的杂质如先前关于NLysPE38描述的那样(Debinski,W.和Pastan,I.,Cancer Res.52(1992)5379-5385；Debinski,W.和Pastan,I.,Bioconjug.Chem.5(1994)40-46)。能够以良好的产率获得无聚集物的均一制备物(>1g/L培养物，SDS-PAGE分析，在图21B中)。为了洋地黄毒苷化NLysPE25SQΔ，将活性酯洋地黄毒苷-NHS应用于赖氨酸的伯氨基的修饰。蛋白质的N-末端也可以充当NHS-介导的洋地黄毒苷缀合的目标。为了避免两个大体积搭档之间的空间位阻干扰随后的双特异性抗体-多肽毒素共价复合物形成，将短但柔性的接头置于洋地黄毒苷和NHS之间，即，洋地黄毒苷和多肽毒素之间。在本文的其余部分，NLysPE25SQΔ被称作PE25。
为了产生含有用于半抗原介导的与双特异性抗体共价偶联的额外半胱氨酸的多肽毒素衍生物，将半胱氨酸工程化至PE25中用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后。这些PE衍生物按照与PE25相同的方式产生和纯化。在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前具有人工多肽半胱氨酸残基的PE25变体被称作NCK-PE25，并且，在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之后具有人工多肽半胱氨酸残基的PE25变体被称作NKC-PE25。PE25、NCK-PE25和NKC-PE25的序列的比较示于图21C。
在SEQ ID NO:194中列出PE25的序列。在SEQ ID NO:195中列出将赖氨酸替换为丝氨酸的S-PE25衍生物的序列。在SEQ ID NO:196中列出NKC-PE25的序列。在SEQ ID NO:197中列出NCK-PE25的序列。
实施例23
将毒素共价连接至靶向载体
将PE25衍生物与洋地黄毒苷-羧甲基-NHS酯反应(DE3836656，Metz等人，同上)。随后，使反应物通过PD10柱，从洋地黄毒苷化的25kDa多肽毒素分离未反应的小化合物和反应产物(NHS)，然后进行无菌过滤。在抗体偶联之前，用DTE还原洋地黄毒苷化多肽毒素，接下来随后再次通过PD10柱去除还原剂。随后，通过在浓度10和30mg/ml(双特异性抗体)之间的缓冲水溶液中将洋地黄毒苷化多肽毒素与抗洋地黄毒苷双特异性抗体在室温下孵育10分钟，产生含有双特异性抗体和洋地黄毒苷化多肽毒素的复合物。由于IgG-Fv融合物中的抗洋地黄毒苷部分是二价的，洋地黄毒苷化多肽毒素以2:1摩尔比(多肽毒素对双特异性抗体)施加。通过蛋白A层析纯化所产生的复合物(以去除任何游离毒素)，并且，然后用于分析和测定法，不进行进一步的修饰。非还原性和还原性SDS-PAGE分析和随后通过蛋白质印迹分析检测毒素部分(图22)证明二硫化物连接的双特异性抗体-多肽毒素复合物的形成：在强力变性条件下(SDS；煮沸)，在非还原条件下，毒素出现于代表具有共价连接的毒素的重链的高分子量条带。因此，毒素与双特异性抗体稳定地并且共价地连接。在还原条件下，毒素与抗体发生分离，并且对应于其较小的分子量而迁移。这可以通过在蛋白质印迹分析中用抗PE抗体检测多肽毒素以及通过抗洋地黄毒苷抗体来证明。这也证实了稳定的双特异性抗体与多肽毒素的连接归因于工程化二硫键的特异性形成。在图22B和22C中显示具有相对尺寸的模型，以及与结合洋地黄毒苷的抗体部分复合和稳定地二硫键键合的洋地黄毒苷化的PE25、NCK-PE25和NKC-PE25的组分的组成。
实施例24
共价复合物介导的多肽毒素递送
为了评价如本文所报告的共价缀合物递送多肽毒素的功能性、特异性和效力，将MCF-7细胞暴露于双特异性抗体和多肽毒素的共价缀合物。MCF7在其表面上表达LeY抗原并且对结合LeY的PE衍生的免疫毒素敏感(参见Metz,S.等人，同上)。这些细胞的活力和增殖通过测定代谢活性或细胞增殖的测定法来评估，这两种测定法都是该领域中的专家熟知的方法。为了确定细胞在暴露于毒素时的活力，加入靶向细胞表面的双特异性抗体-多肽毒素缀合物之后48小时或72小时，采用细胞滴度Glo(CTG)测定法确定细胞ATP含量(反映代谢活性)。加入靶向细胞表面的双特异性抗体-多肽毒素缀合物之后48小时或72小时，通过BrdU(溴脱氧尿苷)掺入(即，DNA合成)测定法测量多肽毒素暴露对增殖的影响。在近汇合(subconfluent)培养物上在96孔板中一式三份进行所有测定。图23所示的BrdU测定结果表明，用含有PE25衍生物的靶向细胞表面的双特异性抗体-多肽毒素缀合物孵育MCF-7细胞显示增殖的显著的靶向性的剂量依赖性降低。
这表明，如本文所报告的靶向细胞表面的双特异性抗体-多肽毒素缀合物在结合和递送特异性(靶向)以及有效载荷功能性(例如，针对肿瘤细胞的细胞毒活性)方面功能完善，优点在于比非共价双特异性抗体-半抗原化多肽毒素复合物更稳定。
实施例25
囊泡区室中的抗体和半抗原化多肽的分离
如本文所报告的共价复合物可以通过包含抗半抗原结合特异性的靶向细胞的双特异性抗体(bsAb)递送至和递送入细胞。对于某些多肽来说，这些复合物进入细胞质或其他细胞区室是必需的。这些包括，例如，在癌症治疗中应用的细胞毒性实体。通过靶向细胞的bsAb递送的多肽可能需要在靶细胞内部释放。
为了确定细胞内释放，使用与LeY抗原结合并且携带抗生物素结合实体作为二硫化物稳定化的单链Fv附加物的LeY-Dig(52bC)双特异性抗体(参见实施例18和20)。与生物素-Cys-Cy5一起孵育产生共价二硫化物缀合的复合物。LeY抗原在乳腺癌细胞上丰富，内化，以及结合LeY的抗体衍生物先前已显示将有效载荷递送至和递送入细胞(如，MCF7)。使用Alexa标记的二抗来检测bsAb和使用荧光来检测Cy5的共聚焦显微镜分析显示共价缀合物结合至并内化入MCF7(图24)。可以看出，bsAb和生物素在细胞中不保持连接，因为随时间(例如，施用后6小时)可以观察到生物素与抗体分离。分离的bsAb已经通过二抗可视化，这需要bsAb伸展/结构域是完整的才能对其进行检测。因此，所观察到的细胞内有效载荷释放主要是通过细胞内还原和半抗原解离触发的。
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Claims (38)

1.共价缀合物，其包含半抗原化多肽毒素和抗半抗原抗体，
其中所述多肽毒素在其10个N-末端氨基酸残基之内的赖氨酸残基处与半抗原缀合，
其中所述半抗原化多肽毒素通过二硫键与所述抗半抗原抗体缀合，
由此在
i)半抗原化多肽毒素的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后一个或两个残基，和
ii)抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基，其中所述CDR2根据Kabat来确定，其中所述抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在根据Kabat的重链可变结构域编号法的位置52b处或位置53处，
之间形成二硫键，
其中所述多肽在其氨基酸序列中确切地包含一个赖氨酸残基
其中所述半抗原是生物素、或茶碱、或洋地黄毒苷、或碳硼烷、或荧光素、或溴脱氧尿苷，
其中所述抗洋地黄毒苷抗体包含SEQ ID NO:04和8，或SEQ ID NO:12和16，或SEQ IDNO:20和24，或SEQ ID NO:28和32的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，
其中所述抗生物素抗体包含SEQ ID NO:36和40，或SEQ ID NO:44和48，或SEQ ID NO:52和56，或SEQ ID NO:60和64的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，
其中所述抗荧光素抗体包含SEQ ID NO:108和112，或SEQ ID NO:116和120的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，
其中所述抗茶碱抗体包含SEQ ID NO:68和72，或SEQ ID NO:76和80，或SEQ ID NO:84和88，或SEQ ID NO:92和96的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前两个残基或之后两个残基。
3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述抗半抗原抗体与所述半抗原化多肽的半抗原特异性结合。
4.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述半抗原化多肽包含半抗原、接头和多肽。
5.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述多肽经由羧甲基或己酸间隔物与半抗原缀合。
6.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中抗体的CDR2中的半胱氨酸残基的α碳原子与缀合有半抗原的多肽的赖氨酸残基的原子相距约10至11埃。
7.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述多肽还与有效载荷缀合。
8.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述多肽毒素是PE25。
9.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述多肽毒素是人源化PE25变体。
10.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含针对非半抗原的抗原的第一结合特异性和针对半抗原的第二结合特异性。
11.共价缀合物，其包含半抗原化多肽毒素和双特异性抗体，
其中所述双特异性抗体包含针对非半抗原的抗原的第一结合特异性和针对半抗原的第二结合特异性，
其中所述多肽毒素在其10个N-末端氨基酸残基之内的赖氨酸残基处与半抗原缀合，
其中所述半抗原化多肽毒素通过二硫键与所述抗半抗原抗体缀合，
由此在
i)半抗原化多肽毒素的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后两个残基处，和
ii)抗体的重链CDR2中的位置52b或53处的半胱氨酸残基，其中所述CDR2根据Kabat来确定
之间形成二硫键，
其中所述多肽在其氨基酸序列中确切地包含一个赖氨酸残基，
其中所述半抗原是生物素、或茶碱、或洋地黄毒苷、或碳硼烷、或荧光素、或溴脱氧尿苷，
其中所述抗洋地黄毒苷抗体包含SEQ ID NO:04和8，或SEQ ID NO:12和16，或SEQ IDNO:20和24，或SEQ ID NO:28和32的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，
其中所述抗生物素抗体包含SEQ ID NO:36和40，或SEQ ID NO:44和48，或SEQ ID NO:52和56，或SEQ ID NO:60和64的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，
其中所述抗荧光素抗体包含SEQ ID NO:108和112，或SEQ ID NO:116和120的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，
其中所述抗茶碱抗体包含SEQ ID NO:68和72，或SEQ ID NO:76和80，或SEQ ID NO:84和88，或SEQ ID NO:92和96的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。
12.根据权利要求1、2或11中任一项所述的缀合物，其中抗体分子对半抗原化多肽分子的化学计量比是1:1或1:2或2:1或2:2或2:4或4:2。
13.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中所述非半抗原的抗原是细胞表面抗原。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞表面抗原是肿瘤相关抗原。
15.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中所述双特异性抗体是全长抗体。
16.根据权利要求15所述的缀合物，其中所述双特异性抗体的一条重链包含孔穴突变并且相应的另一条链包含隆突突变。
17.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中所述双特异性抗体是全长抗体，在所述全长抗体的每个C-末端直接或经由肽接头融合有scFv或scFab。
18.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中所述抗体是人源化抗体或人抗体。
19.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中所述抗体的恒定区是IgG1亚类或IgG4亚类。
20.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中所述抗体具有IgG1亚类的恒定区，所述恒定区在根据Kabat的EU索引编号的位置234和235处具有丙氨酸并且在位置329处具有甘氨酸。
21.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中所述抗体具有IgG4类的恒定区，所述恒定区具有在根据Kabat的EU索引编号的位置228处的脯氨酸、在位置235处的谷氨酸和在位置329处的甘氨酸。
22.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中所述缀合物确切地包含每个重链CDR2一个二硫键。
23.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中所述二硫键在不添加氧化还原活性剂的情况下形成。
24.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中所述半抗原经由接头与所述多肽缀合。
25.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述接头是非肽接头。
26.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中抗洋地黄毒苷抗体和/或抗生物素抗体和/或抗茶碱抗体是人源化抗体。
27.根据权利要求1、2或11所述的缀合物，其中所述抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的FR中存在置换、插入或缺失总计1至10个氨基酸，但是抗体依然保留与相应半抗原结合的能力。
28.药物制剂，其包含根据权利要求1至27中任一项所述的缀合物，以及可药用载体。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的缀合物在制造药物中的用途。
30.根据权利要求1至27中任一项所述的缀合物增加所述多肽的稳定性的用途。
31.根据权利要求1至27中任一项所述的缀合物减少或消除所述多肽的脱靶毒性作用的用途。
32.根据权利要求1至27中任一项所述的缀合物增加所述多肽的活性的用途。
33.根据权利要求1至27中任一项所述的缀合物增加所述多肽的体内半寿期的用途。
34.产生根据权利要求1至27中任一项的缀合物的方法，所述方法包括组合包含人工抗体半胱氨酸残基的抗体和包含人工多肽半胱氨酸残基的半抗原化多肽，由此所述人工抗体半胱氨酸残基的α碳原子与融合接头的所述多肽的原子相距约10至11埃。
35.产生根据权利要求1至27中任一项的缀合物的方法，所述方法包括以下步骤
-在溶液中将特异性结合至半抗原并且在CDR2中具有人工抗体半胱氨酸残基的抗体与包含人工多肽半胱氨酸残基的半抗原化多肽组合，和
-从所述溶液回收所述缀合物。
36.用于靶向递送半抗原化化合物至靶细胞的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含与半抗原化多肽特异性结合的第一结合位点和与所述细胞的细胞表面标记物特异性结合的第二结合特异性，
其中在所述多肽的用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后的半胱氨酸残基和抗体的CDR2中的半胱氨酸残基之间形成二硫键，其中所述CDR2根据Kabat来确定，所述CDR2中的半胱氨酸残基在根据Kabat的重链可变结构域编号法的位置52b处或位置53处，
其中所述多肽在其氨基酸序列中确切地包含一个赖氨酸残基，
其中所述半抗原是生物素、或茶碱、或洋地黄毒苷、或碳硼烷、或荧光素、或溴脱氧尿苷。
37.根据权利要求36所述的双特异性抗体，其中所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前或之后1至3个残基之间。
38.根据权利要求36或37所述的双特异性抗体，其中所述半胱氨酸残基在用于半抗原缀合的赖氨酸残基之前两个残基，即，在相对于所述赖氨酸残基N-2位置处，或之后两个残基，即，在相对于所述赖氨酸残基N+2位置处。
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