JPH06500780A - ホモ接合免疫グロブリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ホモ接合免疫グロブリン 艮１里！ 本出願は、１９９０年８月３１日に出願した出願番号票０７１５７５．７２５号 の−ＭＥＮ続出願である。

及−Ω！量 モノクローナル抗体は、潜在的に最小の副作用で絶妙の特異的免疫治療荊として 大いに約束されている。このため、モノクローナル抗体は、種々の用途、例えば 腫瘍、感染性疾患および自己免疫不全の処置、免疫系の＠御等のために開発が進 められている。残念ながら、研究開発から臨床処方に成功裡に移行できる品質を 有するモノクローナル抗体は少ない。

モノクローナル抗体の治療および診断上の有用性は、所望の抗原に単に結合する ことに加えて幾つかの因子に起因する。抗体は十分な結合親和力、その対応する エピトープに対する抗体結合の固有の強度の尺度を有する必要がある。また高い レベルの結合力を有する必要もあり、これは抗体−抗原複合体の全体的安定性を 反映し、抗体（および抗原）の価および相互作用成分の幾何学的配置に基くもの である。興なる抗体の親和力および結合力は広範に変動し得る。

多くの場合、！！択されるモノクローナル抗体は、所望のエフェクタ機能を効率 的に開始すべく、その適切なアイソタイプまたはサブクラスのものでなければな らない、このような機能には、補体の固定、エフェクタマクロファージまたは多 形核白血球に対する結合、または特定の治慶用逮に要求され得る他の性質が包含 される。またアイソタイプは、抗体の生物学的分布、半減期、胎盤を横切る経路 および他の特性にも影響と与える。

一般に、ＩｇＧ抗体は大半の治療的使用についてｆｇＭ抗体より好適たり得る。

ＩｇＭと比較した場合、ＩｇＧは典型的にはより長い生体内半減期を有し、胎盤 を横切って胎児へと至ることができ、また薬学的組成物として処方された場合、 より長い保存寿命を有し得る。ＩｇＧ分子は単量体であるが、唯２つの抗原結合 部位を有し、これため比較し得るＩｇＭ抗体（５価であり、１０の抗原結合部位 を有する）より結合力が非常に低い。

従来の技術では、所望の抗原結合可変性、親和力、結合力およびエフェクタ機能 を有するモノクローナル抗体を同定するのは多くの場合非常に困難であった。

組換えＤＮＡ技術が開発され、多数の抗体生産融合または形質転換細胞を単純に 検索する予測不能で多大の手間がかかる方法が排除された。所望の結合特異性を 育する抗体の抗原結合可変（または超可変）領域をコードする遺伝子が、所望の エフェクタ機能を媒介する抗体定常領域をコードする遺伝子の次にクローン化さ れた０例えば、米国特許第４．８１６．３９７号、ヨーロッパ特許庁公開ＥＰＩ ７３．４９４号および２３９．４００号並びにＰＣＴ公１＊ＷＯ３９１０７１４ ２号を豐照することができる。この種の手順も非常に手間がかかり得て、実験的 有効性は限定されたものでしかなかった。このような手順をもってしても、組換 えｒｇＧ抗体では生物学的に重要なエフェクタｍ能を開始する十分な結合力を有 さず、ＩｇＭ分子では所望の治療活性は有するものの前記したようにＩｇＭに随 伴する一般的欠点を被るという事態になお直面することとなろう。

ＩｇＧ抗体の結合力は、分子の価を２より大きく増加させることにより改良し得 る。抗体と抗原との閏の相互作用が多くなると、結果的に結合はより強固となり 、抗体−抗厘相互作用、治療的使用のための一般に重要な属性を安定化し得る。

高い結合力（多価付着を介する）で所望のエフェクタ機能を有するＩｇＧ抗体は 、低い結合力の比較し得る抗体より極めて好適たり得るが、今日に至るまでこの ような特性を育する抗体は記載されていない。

よって、当業界で必要とされるものは、所望のエフェクタ機能を有しながら■ｇ ｅｔ用いる作業に固有の多数の困難を回避する高い結合力のｒｇＧ抗体を生産す る手段である。非常に驚くべきことに、本発明はこの点および他の関連する要求 を満たすものである。

見五〇！豊 ホモ接合抗体は、対応する凝抗体単量体と比較した場合、増加した治療有効性を 有する。この活性は、就中、より高い結合力および増加したエフェクタ機能の相 互伴用により得るものである。よって、同一の抗原、更に詳しくは同一の抗原決 定基に結合する抗体を１合成化学釣線合により架ＩＩ結合を介して互いに共有結 合で結合させ、この種のホモ接合ｔＩＥを製造する。一般に、ホモ接合体は、典 型的にはＩｇＧクラスの少なくと６２〜３の抗体分子からなる。抗体は好ましく はモノクローナル抗体とし、多様な種のいずれとすることもできる。ヒトに対す る投与のためには、抗体は通常はヒトまたはネズミ起源のものとするか、ヒトの 定常領域を有するものとし得る。

よって、薬学的に許容し得るキャリヤと、実質的に同一の抗原決定基に結合し。

合成的共有結合により互いに化学的に結合させた少なくとも２つのＩｇＧ抗体分 子とからなる薬学的組成物が提供される。ホモ接合抗体およびその薬学的組成物 を抗原関連疾患の処置方法で治療的に使用し１例えばイー・コリまたはグループ Ｂ連鎖球菌によるような５染に対する像層、胸部および他の腫瘍を含む腫瘍の生 育の阻止、免疫応答の制御等を行うことができる。ＩｇＧ抗体のホモ接合体は胎 盤を通過することができるため、このｉ＊＊物を使用して子宮内の胎児を処置す ることができる。

他の関連する観点では、この発明は、抗原関連疾患の処置のために患者に対して モノクローナル抗体を治療的に投与する方法の実質的改良を提供する。この改良 は、疾患に関連した抗原の同一の抗原決定基に結合する少なくとも２つのｒｇＧ 抗体分子を有する共有結合により架橋結合したホモ接合モノクローナル抗体を患 者に投与することからなる。好適な態様では、抗体はジスルフィド結合含分して 架橋結合する。

区亘＠ｉ監欠翫里 図１は、Ｘ軸に沿う保持時間およびｙ軸に沿うＡ２８ｏにより、ＩｇＧホモ接合 体混合物のＦＰＬＣの様子のクロマトグラムを示し、Ａ、ＢおよびＣと印を付け たピークはそれぞれ三量体、二量体および単量体画分を表す。

口２は、モノクローナル抗体Ｄ３、グループＢ適値球菌の一部の炭水化物に結合 するヒトＩｇＧモノクローナル抗体の初発単量体と比較したホモ接合体（二量体 または三量体）のＥＩＡにおける増加した結合活性を示す。

口３は、モノクローナル抗体５Ｅ１−Ｇ、イー・コリＫｌの莢膜炭水化物に結合 するヒトＩｇＧモノクローナル抗体の初発車量体と比較したホモ接合＃（二量体 または三量体）の増加した結合活性を示す。

図４は、ＢＲ６４、ヒト胸部腫瘍関連抗原に結合するネズミＩｇＧモノクローナ ル抗体の初発単量体と比較したホモ接合体（二量体）のＥ　Ｉ　Ａにおける増加 した結合活性を示す。

図５は、腫瘍細胞系統に対するホモ接合キメラＢＲ９６抗体の比較結合活性を示 し、この場合口５Ａは、ヒト胸部腫瘍細胞系統Ｈ３７６０Ｂに対する結合活性を 示し、図５Ｂは、ヒト肺腫瘍細胞系統Ｈ２７０７に対する結合活性を示し、図５ ０は、ヒト肺腫瘍細胞系統Ｈ２９８７に対する結合活性を示し、図５Ｄは、ヒ） ｌｉｇ腫瘍細胞系統Ｈ３３９６に対する結合活性を示す。

図６は、初ＱＩｇＧ単量体と比較し、ヒトモノクローナル抗体Ｄ３のホモ接合体 の二量体および三量体によるグループＢ連Ｍ球菌に対する増加したオプソニン活 性を示す。

図７は、Ｄ３３量体抗体による活性と比較し、グループＢＭＷ球薗株Ｍ９４およ び■３３４に対するモノクローナル抗体Ｄ３ホモ接合体による増強されたオプソ ニン食細胞作用を示す。

図８は、初発ＩｇＧ単量体と比較し、ヒトモノクローナル抗体５Ｅ１−Ｇの二１ 体および三１体ホモ接合体のイー・コリに１に対する増加したオプソニン活性を 示す。

図９は、抗体単量体と比較し、イー・コリに１の株Ｈ１６およびＡ１４に対する モノクローナル抗体５Ｅ１−Ｇのホモ接合体により与えられる増強されたオプソ ニン食細胞作用を示す。

図１０は、初発ＩｇＧ単量体と比較し、モノクローナル抗体ＢＲ６４の二量体ホ モ１１合体による陶ｇ蹴瘍４１１ｍ系統Ｈ３６３０に対する増加した補体依存性 細胞毒性を示す。

図１１は、ｍｇ！瘍細胞系統Ｈ３３９６に対するＢＲ９６ホモ接合体および単量 体モノクローナル抗体により示されるＭ胞壽性を示す。

図１２は、抗体の異なる製炭でモノクローナル抗＃Ｄ３のホモ接合体および対照 単量体により与えられる生体内保護を示す。

−虱乙ｉ盈Ωｈ！ 本発明は、！！択された抗原に対するモノクローナル抗体のホモ接合体、および この種のホモ接合体を！Ｉｌ製する方法を提供するものである。抗体分子を化学 的に結合させることにより、増加した僅および２以上のＦｃ１ｌ域を有するホモ 接合体を！Ｉｌｌ製する。この手段により、就中、結合結合力の増加、補体固定 、細胞活性化。

オプソニ〉・食細胞作用等を含む多様な効果を達成することができる。よって、 この発明は、恐らく生体内での使用が制限された抗体を、所望の始原活性へと０ 裏に更に導き得る特性を有する抗体に変換する能力を与えるものである。ｆＲえ ば、ホモ接合体は、低い結合結合力のＩｇＧ単量体をより高い結合力でエフェク タ機能を更に促進し得るものに変換するよう働くことができ、これは恐ら〈従来 は達成し得なかったものである。

ホモ接合体により、同一の抗原決定基に結合することによって抗体ホモ二量体、 ホモ二量体等を形成する２または３以上の抗体分子の共有会合または結合を！昧 する。ホモ接合体は、抗原上の同一の抗原決定基（エピトープ）に結合する２ま たは３以上の興なるモノクローナル抗＃（すなわち、興なる永続化細胞系統によ り生産されたもの）からＩｌ災することができる。ホモ接合体を含むモノクロー ナル抗体は、異なるもの（別個の細胞系統により生産されたもの）とすることが できるが、好ましくは同一、すなわち同一のｓｉＷ＆系統から得られたものとし 、よって実質的に同一の抗原結合袴異性を儂えるモノクローナル抗体の比較的均 一なツ製物を構成する。同一または実質的に同一のエピトープに結合するという ことにより、抗原に対する結合について互いに相互または非相互毀合を行うこと のできるモノクローナル抗体に言及することを京味する。当業者であれば、ラジ オイムノアブセイまたは酵素免疫検定のような競合的免疫検定を如珂にして行う かを知得しようが、これは一般には例えば米国特許第３．８１７．８３７号、ハ ルロウとレーン、「抗体、冥ＩＩ室マニュアル」、コールド・スプリング・ハー バ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−、ＮＹ（１９８８）−およびデ 仁　「先進免疫化ＴＪ第２版、ウイレイーリス・パブリクーシヲンズ、ＮＹ（１ ９９０）に記；されており、それぞれをｔ考によりここに取入れる。

ホモ接合体に使用するモノクローナル抗のＦｃ領域、または抗ｌ結合持異性に実 質的に影響を与えない免疫グロブリン分子の池の性状を変化させて所望のエフェ クタ機能分与えることができる０例えば、ＮツのＶ易性等のために、プロティン Ａ結含のためのＦＣドメインをその能力分有さない分子に置換することは望まし いものたり得る。減少した免疫原性、増加または減少した補体活性化、ＩＩｉ胞 受客受容体結合化速度の調節、胎盤および消化管移行、抗体依存性細胞毒性への 寄与能力および免疫制御の他の凹点のために他の置換を行うことができる。多数 の抗体機能は定常領域の１！！たは複数のドメインに局在している。バウル、「 基礎免疫学」、ラベン・プレス、ニューヨーク、ＮＹ、１９８４を９照すること ができ、を考によりここに取入れる。広範な種類の技術が組換え免疫グロブリン を製造するのに利用可能であり、例えば米国特許第４．８１６．３９７号、ヨー ロッパ特許庁公開ＥＰ１７３．４９４号および２３９．４００号およびＰＣＴ公 開ＷＯ３９１０７１４２号があり、それぞれを参考によりここに取入れる。よっ て、ホモ接合免疫グロブリンは、全ゆる重曹およびそのサブクラスとすることが できる。軽鎖はにまたはλとすることができる。

本発明で特に好適なのは、γ重鎖を有する抗体のホモ接合体であり、ホモ接合さ れた多価ＩｇＧ分子を形成するものとする。ＩｇＧサブクラスの１．２．３およ び４（ヒト）および１．２ａ、２ｂおよび３（ネズミ）の内、ヒトサブクラス１ および３並びにネズミサブクラス１．２ａおよび２ｂが、最大の補体固定、単球 、マクロファージおよび多形核ａｙｓに対する結合、および胎盤を横切る能力が 要求される用途のために一般に好適である。ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体の エフェクタ機能は、ここに記載するホモ接合手順によっても実質的に増加させる ことができる。

ある種の状況下では　Ｘ図する使用に応じて、α、μ、εまたはδ型重曹を有す る抗体も、ここに記載するようなホモ接合に用いることも企図する。

ホモ接合体で使用する抗体の結合親鵬力は変動し得るが、一般には少なくともく とも１０−８〜１０　’Ｍまたはそれ以上とし得ろ、二の種の抗体から罠製され るホモ接合体の結合力は、一般には少なくとも約１０−６Ｍ〜１０’Ｍ、好まし くは少なくとも約１０−８〜ＬＯ”Ｍまたはそれ以上ヒすべきである。

親和力および結合力を決定する手段は、ディ、「先進免疫化学」、前記に記載さ れているように公知である。ホモ接合体は結合力の定量的な増加と有り得るが、 一般にホモ接合体は、例えばユニに記載するように、また当業者に上り一般りこ 知得されるように、抗原結合領域および他の！！能検定により明らかとなるもの として、結合力およびエフェクタ！ｌｔの質的増加も有する。

ホモ接合免疫グロブリンは、モノクローナル抗体を！ＩＩ！Ｌ得る全ゆる’Ｉま なはその組合せとすることができる。所望の抗原結合特異性のネズミモノクロー ナル筐体を生産するのは一般に比較的容易であるが、所望の特異性で所望の定常 領域特性を有するヒトモノクローナル抗＃分生産するのは逼かに困難であった。

ヒトモノクローナル抗体は、多くの用途、特に！者の免疫系により外来物として それが認譜されることを最小とするようなヒトの生体内診断および治療のために 好適である。

ネズミおよびヒト免疫グロブリンを最も普通に製造するが、ｆ！！の種、凹えば ウサギ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ−トリ等に由来するモノクローナル抗体また はその一部を用いる二とができる。モノクローナル抗体技術および遺伝子工学技 術は十分に進歩しているため、１つの種の抗体配列は他の種のものと亙換し得る ことを理解すべきである。よって、二こで使用するように、「ヒト」抗体は、例 えば実質的にヒト起源ではあるが、幾分かの非ヒトおよび、／または非免疫グロ ブリン配列も含み得るものを指す、同様に、免疫グロブリンに言及する場合、ユ ニでｔＸ＃について同義的に使用するように、慢っがの非免疫グｎプリン配列が 、抗！に結合する能力を保持しつつ分子中に存在り得ろことが理解されよう、免 疫グロブリンは、全体の免竺グロブリンおよびその結合断片の両者を指す。

ホモ接合に使用する抗体は、実質的にモノ特異性、すなわちポリクローナル抗血 清から得られる実質的に均一な抗体の比較的純粋な調製物とすることができ。

またはモノクローナル抗体とすることができる。所望の抗原またはそのエピトー プに結合するモノクローナル抗体は、これらを分泌する確立された細胞系統がら 得られる。抗体生産細胞系統は、当業者に周知の従来の敵合、ウィルス形質転換 または他の永続化技術を使用し、幾つかの種のＢ細胞から単離することができる 。

例えば、ヒトモノクローナル抗体は、エプスタイン・バー・ウィルス（ＥＢＶ） 形質転換、ハイブリドーマ融合技術またはこれらの組合せを使用して生成するこ とができる１例えば、コズボルら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、 ＵＳＡ　７９：６６５１（１９８２）、および米国特許第４．４６４．４６５号 および４．６２４．９２１号を９照することができ、これらを誉考によりここに 取入れる。モノクローナル抗体により、興なる抗原結合特異性を有する抗体を生 産するａｍから分離されたクローン性永続化細胞系統を意味する。よって、この 種のモノクローナル抗体は、ｆｌ！！のモノクローナル抗体から製造単離され、 したがって（他の抗体に対して）実質的に純粋な形態であり、Ｒａｍ供給源とし て働く勅物種からの血清中に通常存在するより一般に高い濃度である。

よって、この発明は、ここに例示する特定のホモ接合体の抗原結合特異性に限定 されるものではなく、寧ろこれは種々の抗原関連疾患、特にモノクローナル抗体 を治療的に投与されていたものの処置に使用することができることを理解すべき である。抗原関連疾患により、その発症が外来抗原（例えば細菌、ウィルス、腫 瘍または腫瘍関連抗原）または（自己免疫疾患としての）自己抗原の臨床的存在 と一致する疾患を意味する。広範な種類のモノクローナル抗体が技術・特許文献 に記載されているが、それらの多くはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク ション、１２３０１バークローン・ドライブ、パークビル、ＭＤ２０８５２（そ のカタログ、ｒａｔＩｉ！系統およびハイプリドーマのＡＴＣＣカタログＪ、第 ６版（１９８８）を誉考によりここに取入れるンのようなｍ胞答託Ｓ関から誰で も入手することができる。モノクローナル抗体の代表的な例は１例えば米国特許 第４．５９６，７６９号、４．６８９．２９９号、４．７５３．８９４号、４， ８３４．９７５号、４．８３４．９７６号、４，９２５．８００号および４，９ ５８．００９号に記載されており、そのそれぞれを９考によりここに取入れる。

ここに記載する方法は、このような１ｉＡｌ１２！系統から得られる免疫グロブ リンに由来する新規な架橋結合ホモ接合体を製造する能力を与えるものである。

化学的に結合させたホモ接合免疫グロブリンは、架橋結合剤を用いることによる ような周知の実験室手順を使用して抗体の化学的接合により製遺し得る。化学的 に結合するということにより、免疫グロブリン分子を、共有結合により互いに合 成的に結合させる（すなわち１ｇＢ胞によりそのまま生産させない）こと分！昧 する。接合の好適な方法は、免疫グロブリン分子閘に少なくとも１つの共有結合 分形成させることである。

免疫グロブリン分子は、全ゆる種々の周知の化学結合手順により互いに複合化ま たは化学的に結合させる。Ｆｃ領域またはＦａｂ領域は、結合の部位として働く ことができる。この結合は直接的たり得て、この場合は合成結合基を含む結合を 含み、または間接的であり、この場合は介在部分２例えば蛋白質またはペプチド 、例えば血漿アルブミンまたは他のスペーサ分子を有する結合を意味する６例り ば、この結合はへテロニ官能価またはホモニ官能価架橋結合剤、例えばカーポジ イミド、グルタルアルデヒド、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジジチオ）プ ロピオネート（ＳＰＤＰ）および誘導体、ビス−マレイミド、４−　（Ｎ〜マレ イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）−個々の分 子と反応性の晶による外生の架Ｗ結合荊を用いない’ＪｉＷＩ結合、例えば炭水 化物、ジスルフィド、カルボキシルまたはアミノ基によるものとすることができ 、元の蛋白質の酸化または還元を介し、蒙なは酵素辱の処置による。１！＃分子 を化学的に架臂結合する方法は一般に当業界で公知であり、多数のへテロおよび ホモニ官ｒ優荊が１例えば米国特許第４．３５５．０２３号、４．６５７．８５ ３号、４゜６７６．９８０号、４．９２５．９２１号および４．９７０．１５６ 号およびハルロウとレーン、「抗体、実験室マニュアル」、コールド・スプリン グ・ハーバ−・プレス、１９８８．コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹおよ びｒ免疫技術カタログとハンドブック」、ビエルセ・ケミカル社（１９８９）に 記載されており、そのそれぞれの特許および刊行物を９考によりここに取入れる 。一般に、この種の合成架橋結合は、分子の抗原結合領域および所望のエフェク タ機能のいずれにも実質的に影響を与えないものとすべきである。

ホモ接合免疫グロブリンの検出および精製は種々の技術によって行うことができ 、中でら液体およびアフィニティクロマトグラフィ、勾配遠心およびゲル電気泳 動が含まれる。ホモ接合体の増加した活性は、定量的抗厘結合検定、抗＃競合実 験、オアソニン食Ｍｌ胞検定１Ｍ体依存性ｍ胞壽性検定壽により渕定することか て′きる。これらの技術は当業者に馴染みのあるものであり、例えばハルロウと レーン、前記に記ｔされている。

増加しｆＳ結合能力を傳えるホモ接合抗体調製物は、抗原関連疾患としてここに 言及する広範な種類の状況の処１および診断に有用たり得る。ホモ接合体は、未 接合単量体抗体と比較し、！ｌ著に改良された治療および診断特性分与え得る。

ホモ接合体の増加した結合力により、ある種の場合に、先に非保護または弱く保 護されたＩｇＧ抗体を例えば感染または腫瘍に対して保護性に変換するか、また は特定の抗原に対する宿主の免疫応答を強化あるいは制御することにより免疫変 調剤として作用させることが今や可能である。抗原または抗原の特定のエピトー プに対するＩｇＭ抗体が保護性であり、単量体ＩｇＧ抗体が非保護性または弱い 保護性である場合、ここに記載する方法を使用して製造したホモ接合体は、感染 。

ｍ胞殺傷等に対して票著な保護を与えるのに十分な結合力を与えることができる 。

例えばｊｇＧ二量体または三量体ホモ接合体は、ｒｇＭのようなある種の多価抗 体に認められ得る治療性で抗惑Ｑ性の質を有することができると共に、胎盤を横 切り、マクロファージおよびＰＭＮに結合するその能力や、オプンニン化を媒介 するのに補体に対する要求がないことのようなＩｇＧ車量体に固有の質をも有す る。ＩｇＧホモ接合体は、ＩｇＧに典型的に随伴する他の属性、例えば精製の容 易性、増加した安定性、増加した保存寿命および増加した生体内半減期を有する ことができる。

ホモ接合体調製物は、勿論ホモ接合体の抗原結合領域の特定の特異性に依存して 、細菌やウィルス抗原のようなある範囲の標的に対して有用たり得るにも拘らず 、これらは哺乳動物細胞の殺傷が必要な場合に特に有用なものとなる０例えば、 ホモ接合体は、特定の厘ｇ＆関連抗原（例えば胸部または肺腫瘍関連抗原）を示 すガン細胞の処置、特定の自己免疫疾患を伴う抗原を発現するウィルスまたはｍ 薗または細胞に感染した哺乳動物細胞の阻害または殺傷に使用することができる 。

またホモ接合体は、骨髄からの選択されたｌＷＮを除去するのに、または移植受 容体の免疫抑制等にも使用することができる。

勿論、本発明は、１１Ｍ性であるか、または他のこの種の機能的属性を生体内で 示す抗体ホモ接合体に限定されないことが理解される。ｆｌ！の場合の低い親和 力および／または低い結合力の２価単量体では恐らく実現し得ない一連の診断手 頃も増加した結合力によって可能となるためである。

胸部または＊＊＊瘍のような腫瘍分阻害し一免疫変調剤として作用し、または病 原体による攻撃に対して保護する得られる抗体の能力は１例えば当業者に知得し 得るように、広範な種類の試験管内および生体内の系で測定することができる。

ＩｇＧとして非ｆｆｌ展性または弱い保護性としたホモ接合抗体を使用するイー 　コリに１に対するｇＡＭについての例示的な手順は、以下の実ｆｉｌＱＩＩＩ に示す。

モノクローナル抗体の新規なホモ接合体およびこれから！ｌＩ製される薬学的組 成物は、抗原関連疾患の予防および／または治療的処１のための投与に特に有用 である。好ましくは、薬学的組成物は非経口的に、すなわち皮下、筋肉内または 静脈内で、または経口的に投与することができる。よって、この発明は非経口的 投与のための組ＩＥ物を提供するものであり、これは許容し得るキャリヤ、好ま しくは水性キャリヤに溶解したホモ接合モノクローナル抗体調製物の溶液または ホモ接合および単量体抗体のカクテルからなる０種々の水性キャリヤを使用する ことができ、例えば水、１１Ｉｌｌ液、０．４％塩原溶液、０．３％グリシン等 がある。これらの組成物は、従来の間知の殺菌技術により殺菌することができる ０組成物は。

生理的条件を近似するのに必要なものとして藁学的に許容し得る補助物質を含有 することができ１例えばｐＨ１ｌ整および［Ｗ剤　Ｓ性調製剤等、例えば酢酸ナ トリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等 がある。これらの処方物中の抗体の濃度は広範に変度させることができ、すなわ ち約０．５％未満−通常は少なくとも約１％以上で１５または２０重量％までと じ２主として流体容積、粘度等により選択し得て、ａ択した特定の投与の様式、 処置する状況、例えば感染性疾患、例えばグループＢ１１１［球菌またはイー・ コリ感染。

腫瘍２例えば胸部カルシノーマ等、および処！する対象、すなわち成人、子供ま たは新生児によるものとする。

よって、成人の感染を処！する静脈内注射のための典型的な薬学的組成物は、２ ５０ｍ１の殺菌リンゲル液、約１００ｍｇ＝１０ｇの抗体を含むものとして作成 し得る。非経口的または経口的投与化合物を！ＩＩＩ！する実際の方法は当業者 に公知または自明たり得て、更に詳しくは例えば「レミントンの薬物斜字」、第 １６版、マｌり　パブリジング　カンパニー、イーストン、ＰＡ（１９８２）に 記載されており、これを９考によりここに取入れる。

本ホモ接合抗体またはそのカクテルを含む組成物は、予防および／または治療処 置のために投与することができる。治療的用途では、既に疾患にＮ患した患者に 対して、疾患およびその合併症を治療または少なくとも部分的に抑えるのに十分 な量で組成物を投与する。これを達成するのに適切な量を、「治療的に有効な投 与量」として特定する。この使用に有効な量は、疾患の重罵性、すなわち感染、 腫瘍等、患者の年齢および患者の免疫系の一般的状態に依尊し得る。一般に、こ の量は投与量当り体重キログラム当り約０．１〜約５０ｍｇの抗体の範囲とし得 るが、患者当りキログラム当り５〜２５ｍｇの抗体の投与量をより普通に使用す る０本発明の材料は重罵な疾患状態、すなわち生命が脅かされているか潜在的に 生命が脅かされている状況で一般に用いることができることを銘記する必要があ る。このような場合、例えばこの発明により可能となったアレルギー性ホモ接合 抗体またはキメラホモ接合抗体を投与することにより達成し得る外生物質の最小 化およびより低い「外来物質」拒絶の可能性の観点から、処置担当医が実質的に 過剰のこれらの抗体を投与することが可能であり、また望ましいと考えることが できる。

予防的用途では、本抗体またはそのカクテルを含む組成物を、今だ疾患状態にな い患者に投与して患者の耐性を増強する。このような量を「予防的に有効な投与 量」として特定する。この使用では、正確な量はやはり患者の健康状態および免 疫性の一般的レベルに依存するが、一般にキログラム当り０．１〜２５ｍｇの範 囲、特にキログラム当り０．５〜２．５ｍｇとする。好適な予防的使用は、母親 を介する感染からの危険性に対する胎児または新生児の処置のためのものである 。処置が胎盤を介する通過に依存する場合、投与量については妊娠女性の血液か ら胎児へと通過し得る抗体の百分率を反映する調整が必要たり得る。

組成物の単一または多重投与を、処置担当医により選択された投与量レベルおよ びパターンにより実施することができる。いずれの場合も、薬学的処方物は、患 者を処置するのに十分なホモ接合抗体の品質を与えるものとすべきである。

この発明のホモ接合抗体は、試験管内においても履つかの用ｉＩ！＝見出すこと ができる。Ｐ！４として２以下の実施例■のホモ接合１ｇＧ抗体は、ワクチン調 製等のため、グルーテＢ連鰻球菌またはイー・コリに１の存在分検出するのに使 用することができる。

試験管内診断目的のためには、抗体はラベルまたは非ラベルとすることができる 。非ラベルのホモ接合抗体は凝篤検定に特定の用途を見出すことができ、または これらはＦｃ領域に特異的な抗体のようなホモ接合抗体と反応性の他のラベルし た抗体（第２抗体）と組合せて使用することができる。また、抗体を直接ラベル することができる。広範な種類のラベル分用いることができ、ｆＮえば放射能核 種１粒子（例えば金、フェリチン、磁性粒子、赤血球細胞）、穀粉、酵素、酵素 基質、酵素共同因子、酵素阻害剤、リガンド（特にハプテン）等がある。多数の 種類の免疫検定が利用可能であり、当業者に公知であって１例えば競合およびサ ンドイッチ検定があり、例えば米国特許第４．３７６．１１０号（賛考によりこ こに取入れる）およびハルロウとレーン、前記に記載されている。

選択された抗原の存在に対する保護または検出で対象抗体と共に使用するために キットも供給することができる。よって１本発明の対象抗体組成物は、通常は単 独または付加的抗体との組合せとして容器中にて凍結乾燥形態で提供することが できる。ラベルまたはＳＳと接合し得るか、または非接合の抗体は、綬衡躬、例 えばトリス、リン酸、炭酸等、安定化剤、殺生物荊、不活性蛋白質、例えば血清 アルブミン苓、および使用の指示一式と共にキット内に含むものとする。一般に 、これらの材料は、活性抗体の量に基いて約５重量％未満で専在し１通常は抗体 濃度に基いて少なくとも約０．００１重量％の合計量で存在し得る。多くの場合 、活性構成成分を希釈する不活性増量剤または賦形剤を含むのが望ましく、この 場合、賦形剤は全組成物の約１〜９９％で存在し得る。ホモ接合抗体と結合し得 る第２抗体を検定で用いる場合、これは別の瓶中に存在するものとする。第２抗 体は典型的にはラベルと接合させ、ｌｉ！記した抗体処方と顕像する様式で処方 する。

説明として以下の実施例を示すが限定するものではない。

罠！伍エ モノクローナル　ホモ　４　の この実施例は、選択された腫瘍および細菌抗原に対する幾つかの代表的なモノク ローナル抗体のホモ接合体を調製する手段を示すものである。その後、後続する 実施例に記載する機能検定でホモ接合体を試験した。

以下のモノクローナル抗体のホモ接合体を調製した：モノクローナル抗＃Ｄ３゜ グループＢ連鎖球菌のグループＢ炭水化物に結合するヒトＩ　ｇ　Ｇ　１抗体、 ５Ｅ１−Ｇ、イー・コリに１の莢震炭水化物に結合するヒトＩｇＧ１モノクロー ナル抗体、ＢＲ６４，大腸、胸部、卵巣および肺カルシノーマを含むヒトカルシ ノーマ関連抗原に結合するネズミ■ｇＧ１モノクローナル抗体、ＢＲ６４は、ア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１．バークローン・ド ライブ、ロックビル、Ｍ、ＤにＡＴＣＣ番号ＨＢ９８９５として寄託されている 。＊＊＊にＡＴＣＣ番号Ｈ８１００３６としてアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクションに答託されているＢＲ９６は、ヒト肺および胸部腫瘍関連抗原に 結合する工ｇＧヒトーネズミキメラＩｇＧモノクローナル抗体である。

次の手順に従ってマレイミドブチルロキシスクシンイミドおよびイミノチオラン を使用してそれぞれの抗体のホモ接合体を調製した。結合緩衝液（０，１ＭＮａ ２ＨＰｏ４−２塩基、７水和物、０．１ＭＮａＣ１，ｐＨ７，５）に対して抗体 （１ｍｇ／ｍｌ）を−夜透析した。混合しつつ添加した２−イミノチオラン−Ｍ ＣＩ（ビニル七・ケミカル社、５０μｍ　（０，５ｍｇ）の２−アミノチオラン 溶液（結合［衡液中１０ｍｇ／ｍ＋）を用いて１ミリリツトルの抗体を千オール 化した。Ｎ−γ−マレイミドブチリロキシースクシンイミド（ＧＭＢＳ）（カル ビオケム、う・ジララ、ＣＡ）、５μｍ（１４μｇ）のＧＭＢＳ溶液（３６０μ ｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ＞中の１ｍｇ＞を用いて抗体（１ｍｌ）の第２ 画分を処理した。抗体のそれぞれ処理した画分を室温で１時間インキュベートし 、その後結合纜新液で予備平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマシア）により 抗体を流した０合計２．６ｍｌの排除体積の後、元の容積の２倍で抗体を気めた 。

抗体のチオール化およびＧＭＧＳ処理画分をその後混合し、室温で５時間インキ ュベートした。１μｍの２５ｍＭβ−メルカプトエタノール（５６０μｌ結合綬 ＩＩ液液中１μｍ）を添加し、室温で１５分間インキュベートすることにより反 応物を減勢した。ＤＭＦ中で１ｍｇ／ｍｌとしたｌｌμｌ　（ｌｌμｇ＞Ｎ−ｘ チルマレイミド（シグマ・ケミカル社、セントルイス）を添加することによりβ −ＭＥを停止させた。ホモ接合体調製物をリンｍ５ｉｕ衝塩票溶液（ＰＢＳ）中 で一夜透析し、セファロース−６およびセファロース−１２ＦＰＬＣカラム（フ ァルマシア、アブサラ、スウェーデン）を使用する寸法排除クロマトグラフィに より分離した。モノクローナル抗体Ｄ３．５Ｅ１−ＧおよびＢＲ６４についての ＦＰＬＣカラムのクロマトグラムを図１に示す。

Ｋ良医土工 五１１皇止ニ藍皇盪ユ ３価および５価モノクローナル抗体ホモ接合体の抗原に結合する能力を、２価Ｉ ｇＧ単量体抗体の結合活性と比較した。抗ＧＢＳホモ接合体の結合は、ポリＬ− リジン（ＰＬＬ）を使用してマイクロタイタ壁に結合したＧＢＳ株（ｌ３３４） に対して測定した０等量蛋白質源度の未処理抗体Ｄ３３量体を−ＦＰＬＣ分画Ｉ ｇＧ二量体および三量体ホモ接合体と比較した。ビオチンラベル抗ヒトγ鎖特異 的抗体を用いて結合を検定した。結果を図２に示すが、この場合二量体または三 量体ホモ接合体調製物の相対的結合活性は、初発ＩｇＧ単量体より有意に大きか った。

抗イー・コリに１抗体ホモ接合体の結合を測定するため、ポリＬ−リジンを使用 してイー・コリ株Ｈ１６をマイクロタイタ穴に結合させた。未処理抗体５Ｅ１− Ｇを、前記したように１ＩｉＩｌシたＩｇＧ二量体および三量体のホモ接合体と 比較した。ＩＦ量の蛋白質濃度の抗体をイー・コリと反応させた。ビオチンラベ ルした抗ヒトγｇ？９興的抗体を用いて結合を検定した。結果を図３に示すが、 この場合二量体および三量体ホモ接合体調製物の相対的結合活性は、初発ＩｇＧ 単量体より有意に大きかった。

抗胸部腫瘍抗体、ＢＲ６４およびそのホモ接合体の結合を測定するため、胸部腫 瘍細胞系統一　３３９６をマイクロタイタ壁に付着させて生育させた。未処理抗 体ＢＲ６４をＴｇＧ二量体および三量体のホモ接合体と比較した０等量蛋白質源 度の抗体を胸部腫４Ｉ！！胞と反応させた。ビオチンラベルした抗ネズミγｉｉ ＊興的抗体を用いて結合を検定した。結果を図４に示すが、この場合二量体およ び三量体ホモ接合＃、調製物の相対的結合活性は、初発ＩｇＧ単量体より有意に 大きかった。

抗胸部および肺腫瘍抗体の結合を測定するため、ヒト−マウスキメラＢＲ９６お よびそのホモ接合体、２つの胸部細胞系統（Ｈ３３９６およびＨ３７６０Ｂ）お よび２つの肺細胞系統（Ｈ２９８７およびＨ２７０７）を標的として使用した。

以下のように新たにトリプシン処理した＃！１ＩＩｌとＰＬＬを使用してマイク ロタイタブレートに付着させ、ＥＬＩＳＡを行った。ＰＢＳ中で１μｇ／ｍ１と したＰＬＬを、７５μｍ／穴のＰＬＬ溶液を室温で１時閉インキュベートするこ とによりイムロン（Ｉｍｍｕ　ｔｏｎ）９６穴マイクロタイタブレートに吸着さ せた。カルシノーマ細胞系統（１５％ＦＣ５を用いてＩＭＤＭ中で培養）をトリ プシン処理し、２回洗浄し、２ｘｌＯ”Ｉｔ胞／ｍｌでＰＢＳに再懸濁した。Ｐ ＬＬ処理ＥＬＩＳＡプレートを塩類溶液／ツイーンにより３回洗浄した（全ての 洗浄工程は重力流洗浄装置を用いて行った）、１１胞懸濁物を１００μｍ７穴〈 約２０．０００細胞／穴）で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その 後塩類溶液／ツイーンによりプレートを３回洗浄した。試料希釈剤（５％無脂肪 粉乳、１００μｍ／Ｌフオーム（Ｆｏａｍ）Ａ、ＰＢＳ中の０．０１％ｗ／ｖチ メロサール）中で抗体を希釈した後、ＥＬＩＳＡプレートに添加しく１００μｌ ／穴）、室温で１時閏インキュベートした。インキュベートの後、塩類溶液／ツ イーンを用いてプレートを３回洗浄し、試料希釈剤中で希釈したペルオキシダー ゼ接合ヤギ抗ヒトまたはマウスＩｇＧ（タイ）を第２段階試菖として使用しく１ ００μｌ／穴）、室温で１特賞インキュベートした。その後プレートを塩類溶液 ／ツイーンにより５回洗浄し、Ｉ！衝基剤中で１　：　１００に希釈したテトラ メチルベンジジンＣＴＭＢ）クロモゲン（ＴＭＢ）を添加しく１００μｍ／穴） 、プレートを２０分間インキュベートした。１００μｌ／穴の３ＮのＨ２ＳＯ４ により反応を停止し、二重波長、４５０／６３０ｎｍでプレートを読取った。

はぼ等量の蛋白質濃度の抗体を使用し、未処理モノクローナル抗体ＢＲ９６をホ モ接合ＢＲ９６ＩｇＧ二量体と比較した。試験した腫瘍細胞系統のそれぞれにつ いて［３５Ａ　−Ｄに示す結果は、主として二量体のホモ接合体：ｌｌ製物によ る４つのａｌｌ細Ｗａ系統に対する相対的結合活性は、初発ｉｇＧＢＲ９６単量 体による場合より大きかったことを示す。

Ｘ嵐旦土上土 ホモ　合体の増　しｔ−−内 生体内の有効性を示すものとして−ＣＢＳに対するモノクローナル抗体ホモ接合 体を試験管内オプンニン食ａｍ検定で試験した。イー・コリに１に対するホモ接 合体を、後記する２つの種類のオプソニン化検定で機能活性につし）て試験した 。

補体依存性細胞毒性検定で試験管内機能についてＢＲ６４のホモ接合体を試験し 、補体非依存性！ｌ！Ｉｌ！毒性検定でＢＲ９６のホモ接合体を試験した。

Ｄ３のホモ　４体によるＣＢＳのオプソニンＣＢＳについてのオプンニン食ｍｙ ｍ検定を次のように行った。５０μｌの一夜ブロス培費物で１０ｍ１のトリプシ ン分解大亘プロス（ＴＢＳ）に接種することにより細菌を調製した。チューブを 振盪機上で３７℃で３時閉インキュベートし。

その時点で１．５ｍｌの培養物を１０．ＯＯＯＸｇで１分間遠心分離し、使用し た培養培地を廃棄し、０゜１％ゼラチンおよび５ｍＭＨＥＰＥＳ　（ＨＢＳＳ／ ゲル）を含む３．５ｍｌのハングのバランス塩溶液にベレットを懸濁した。Ｏ， Ｄ。

（「多形核および単核食細胞による食作用およびＩ！胞円内殺傷試験管内測定」 、「実験免疫学のハンドブック」中４第２巻、ディ・エム・ウエイラ編、第２１ １゜ブラックウェル・サイアンテイフイブク・パブリゲーションズ、オックスフ ォード、３６．１−３６．２４　（１９７３））により、幾つかの改変を加えて ヒト好中球を単層した。ＰＢＳにより１：２に希釈した５ｍｌのへ／＜リン化血 液力ｌらの淡黄褐色の被覆をリンパ球分離培地分用いて下敷し、遠心分離した。

赤血球細胞（ＲＢＣ）ベレットとＲＰＭＩ　１６４０培地で１回洗浄し、等容量 の３７℃のＰＢＳに再懸濁した。２５ｍ１のこの懸濁物を２５ｍ１の２％デキス トラン（３７’ＣＰＢＳ中）に添加し、内容物分穏やかに、ただし完全に端から 端まで混合した。

３７℃で２０分間インキュベートしてＲＢＣを沈降させた後、上澄（好中球を含 む）を除去し、４℃のＰＢＳで２回、ＨＢＳＳ／ゲルで１回洗浄し、これに懸濁 して５×１０　好中球／′ｍ１とした。ＣＢＳと共に使用する補体供給源のため 。

検定で使用する生物に応じて、生きた細菌を用いてヒト血清を３度吸着させた（ ブジョルンソン、ニー・ビーとミカエル・ジエイ　ジー、Ｊ、Ｉｎｆ、Ｄｉｓ１ ３０補遺：５１１９−５１２６　（１９７４））。

検定のため、１．５ｍｌの殺菌したポリプロピレンミクロ遠心チューブに、ＨＥ ＰＥＳによるＨＢＳＳ／ゲル中の１０％ウシ胎児血清中の２５０μｌ抗体（試験 ホモ接合体または皐量体）調製物および１００μＩＩＩ菌懸濁物（約３×１０４ 纒菌／ｍｌ）を添加した。３７℃で３０分後、７５μｌ補体、５０μ！好中球（ ５×１０７ｍｌ）および２５μ１ＨＢＳＳ／ゲルを含む１５０μｌを添加した。

混合物を振盪機上で３７℃で６０分間インキュベートした後、氷水スラリーに配 置した。１０分後、それぞれのチューブからの２０μｌを、３ｍｌの固化した０ ゜５％のトリプシン分解大豆プロスアガロースを含む１００ｍｍのベトリ皿に添 加し、その後３７℃でインキュベートした。１８時ＩＷｌ後、コロニーを摘出し 、それぞれの条件についてコロニー形成単位（ＣＦＵ）としてデータを記載した 。

Ｄ３のホモ接合体についての結果をｚ６に示すが、この場合初発ＩｇＧ単量体と 比較して、試験したＧＢＳ株をオプンニン化するに際し、二量体および三量体が 必要としたのはナノグラム蛋白質基準で逼かに少ない抗体だった。

生体内の有効性を更に示すものとして、ＣＢＳのグループＢ炭水化物に対する付 加的なモノクローナル抗体を用いて調製したホモ接合体（Ｄ３．ラフら、Ｊ。

Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１６３：３４６　（１９９１）およびＰＣＴ特許公開Ｗ Ｏ９１１０６３０５に一般に記載されたように製造したが、これらそれぞれを９ 考によりここに取入れる）を、２つのＧＢＳ株、Ｍ９４およびｌ３３４に対する 試験管内オプソニン食紺胞検定で試験した。検定の結果を図７に示すが、この場 合、抗ＧＢＳ　Ｄ３ホモ接合体は、ＧＢＳヒト臨床単離物の増加したオプソニン 化を結果的に与えることが明らかである。この場合も、これらの結果は、親Ｉｇ Ｇ単量体モノクローナル抗体と比較して、ホモ接合体は抗体の生体内保護活性を 有意に増加させ得ることを示唆する。

５Ｅ１−Ｇホモ　４体によるイー　コリに１のオプソニンヒト好中球を単層する ため、ヘパリン化したヒト血液（５ｍｌ）をポリスチレンチューブ中の３．０ｍ ｌの七ノーポリ分析培地（ＭＰＲＭ、フロー　ラプス〉上に層状化し、室温で３ ００Ｘｇで３０分間遠心分離した。遠心分離の後、３つのａｔ胞層が明らかとな り、中間層が好中球を含有するものであった。血清および頂Ｍ細胞層と除去して 廃棄し、好中球と集め、予備加温したＰＢＳを含む５０ｍ１チユーブに添加した 。好中球を室温で３００Ｘｇで１０分間遠心分離し、上澄を廃棄し、０．５％ゼ ラチンを含有する１０ｍ１の組織培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０）を用いて！Ｉ ＩＩ胞ベレブトを再懸濁し、ａｍ濃度を５Ｘ１０６細胞／ｍｌに調整した。

検定は次のように行った。発光計チューブ（ＬＫＢヌクレア）に対し、ビー・ア エルギノサ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）鞭毛に対する適切な試１１！（５ Ｅ１−Ｇ）または対照ＩｇＧモノクローナル抗体を含む１００μｌ、１００μｌ の対数期細菌懸濁物（ＯＤ６６ｏ−０，０２）および１００μｌの希釈細菌吸着 ヒト血清補体、最終濃度３．３％を添加した。使用の直前に補体を解凍し、５μ ｌの２ＭＣａＣ＋２　／　ｍ　ｌを受容させた。連続読取りサイクルで２４チユ ーブを扱える予備加温したＬＫＢ発光発光子ューブを配置した。チューブを加温 し周期的に混合した３０分の後、１００μｌの好中球（５Ｘ１０６／ｍｌ）およ びバンクのバランス塩溶液中の６００μｌの１０　’Ｍルミノールを添加した。

２４のサンプルチューブについて一８０分に対応する２５連続サイクルについて の計数期間を開始した。

化学発光強度と２ 試験抗体を含むチューブについてのｍＶ値シグナル　ノイズ冒□ 陰性の抗体を含むチューブの平均 を用いてミリボルト＜ｍｖ＞とじて示した。

検定の結果を図８に示すが、この場合初発ＩｇＧ単量体と比較し、ホモ接合体は イー・コリ生体の増加したオプソニン化分結果的に与えることは明らかである。

５Ｅ１−Ｇのホモ二量体およびホモ二量体は、５Ｅ１−Ｇ　ｒｇＧの単量体形態 より有意にオプソニン性である。オプンニン食細胞作用は動物を保護する生体内 能力の典型的な予知基準であるため（例えば、を考によりここに取入れる米国特 許第４．９７０．０７０号＝ｅ照することができる）、これらの結果は、二量体 および二量体ホモ接合体は、親ｒｇＧＨ量体抗体と比較した場合、抗体の生体内 保護活性を有！に増加させ得ることを示唆する。

試験管内有効性、したがって生体内活性の更なる確認として、イー・コリに１に 対するモノクローナル抗体ホモ接合体を、２つの更なるイー・コリに１株、ＨＩ ３およびＡ１４に対する前記したような試験管内オプソニン食細胞検定で試験し た９図９に示すように、抗イー・コリに１ホモ接合体はヒト臨床単離物の増加し たオプソニン化を結果的に与え、主として二量体のホモ接合体調製物は、抗イー ・コリに１モノクローナル抗体の生体内保護活性を有意に増加させ得ることを示 唆する。

依　ＢＲ６４ホモ　４ 抗置瘍抗厘ホモ接合モノクローナル抗体の増加した機能活性を示すため、試験管 内機能性検定も使用した。ＢＲ６４ホモ接合体を試験するため、１００μＣＬの ５１ＣｒによるｌＸ１０６Ｍ１１１１０．３ｍｌの組織培養培地で３７℃、６％ Ｃ１６４０プラス１５％ウシ胎児血清）中の２Ｘ１０’のラベルしたＩＩＩＷｌ をマイクロタイタブレート穴当り添加した０次に、６７μｍの適切に希釈した試 験単量体（ＢＲ６４）、陰性対照単量体（Ｍａｂ９６−５）またはホモ接合（二 量体）モノクローナル抗体を二連の穴に添加した。最後に、６７μｌの新たに解 凍したヒト血清補体をそれぞれの穴に添加し、プレートをバラフィルムで覆い、 ３７℃で４時閉インキュベートした。インキュベートの後、プレートを４００ｇ で１０分間遠心分離し、それぞれの穴から１００μｌの上澄を除去し、１２Ｘ７ ５ｍｍのポリスチレンチューブに入れた。このチューブとガンマカウンタにて計 数した。

以下の対照をそれぞれの検定で含むものとした：補体毒性　６７　６７　６７ 合計取込み　１３４　６７ 最大放出”　６７　−　−　６７ 抗体単独　６７　−　６７　６７ ＃量はμｌ／穴として表す。

検定におけるインキュベートの前に、これらの穴のみが２０１μｍ未満を含有す るものとする。これらの穴は、後にラベルした標的細胞を溶解するため、６７μ ｍのトリトンＸ−１００を受容するためである。

殺傷百分率（％殺傷）は次の式から計算した・［試験（平均ＣＰＭ）−Ｈｃ′対 照（平均ＣＰＭ）］Ｘ１００　＝　％殺傷 合計取込みロ平均ＣＰＭ−Ｈｃ’対照（平均ＣＰＭ）］ここでＣＰＭは、ガンマ カウンタによる測定から得られた二連のサンプルの平均としての分当りの計数で あり、Ｈａ′は補体毒性対照である。

検定の結果を表１０に示すが、この場合ホモ接合ＢＲ６４は、初発ＩｇＧＢＲ６ ４単量体より８倍大きい標的腫瘍細胞の殺傷を結果的に与えることは明らかであ る。ＣＤＣ検定は、一般に腫瘍に対して動物を保護する生体内能力の予知基準で ある。これらの結果は、神に親ＩｇＧ単量体抗体と比較した場合、ホモ接合体は 腫瘍に対して生体内でこの種の抗体の有用性を有！に増加させ得ることを示唆す る。

メーＢＲ９６ホモ　４　の　た ５Ｘ１０５１１！胞／チユーブの標的腫瘍細胞（Ｈ３３９６）を１００μｌの試 験抗体と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をペレット化し、 適切な濃度のヨウ化プロビジウム（シグマ、１０μｍ／チューブ）と混合した。

ヨウ化１０ビジウムは、死亡したか死亡しつつある細胞の膜のみを透過するＤＮ Ａ反応性色素である。したがって、集団内の蛍光細胞の数を定量することにより 。

死亡細胞の数と決定することができる（ヘルストロムら−Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ 。

５０　：　２１８３−２１９０　（１９９０））、１０分閏のインキュベートの 後２１５％ウシ胎児血清を含有する組織培養培地中で細胞を洗浄し、これに再懸 濁し。

氷上に載置した。蛍光および大きさく小さいものと大きいものは、それぞれ死亡 および生存細胞を表す）に基いて生存および死亡細胞を定量するＥＰＩＣ３蛍光 活性化セルソータにより、細胞を蛍光について分析した。結果（図１１）は、Ｂ Ｒ９６ホモ接合体二量体は、初発単量体より腫瘍細胞の殺傷において劇的により 有効であること分水した。これらの結果は、ホモ接合体は、腫瘍に対するこの種 の抗体の生体内での有用性を有意に増加させ得ることを示唆する。

罠！匹１ｙ ■　Ｇホモ　ム　１　″″ラットおけ イー・コリに１賦　に　る ４８時間齢未満の（その母親に収められた）異系交配ＳＤラット（Ｓｏｒａｇｕ ｅ−Ｏａｗ１６ｙ　ｒａｔ）幼体に約７２のイー・コリに１生体を腹膜内注射し 、２時間後に１または５μｇの５Ｅ１−Ｇの二量体ホモ接合体、または１００μ ｇの単量体５Ｅ１−Ｇ抗体−または対照ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を受容させた。

全ての実験において、症状についてラット幼体を毎日検査し、生＃について記録 した。以下の表■！に示す実験の結果は、５Ｅ１−Ｇ抗体の５μｇの二量体ホモ 接合体は、単量体抗体の２０倍量（１００μｇ）を受容した動物と比較し、有！ により多い動物を死亡から保護したことを示す。

氏上上 イー・コリに１喀　に　るホモ　合体に　る保抗体　投与量　％生存 （ラブド当り）　（ラット当り）　（ラット／Ｗ）　（生存／供試）　ｐ値５Ｅ １−［０８２０ｎ　ｇ　２６　１００％　＜０．００１ＳＥ１−１ｇＧ単量体　 １００μｇ　１５　４０％　＜００１５Ｅ１−＋ｇＧ接合体　５μｇ　１４　７ ８％　＜０．０１ＳＥＴ−ＩｇＧ接合体　１′μｇ　１４　２９％　＜Ｏ，０Ｓ ２１８８　（陰性対照）　１００μｇ　２４　０無抗体対照　−２５０ ８実験群における生存対陰性対照および抗体を受容していない対照における生存 に基く。

Ｘ臣医！ しｆ″−ットのＵへのホモ　ム　の胎　を　断す　゛過ホモ接合ＩｇＧ抗体が胎 盤を通過して胎児に至り、よって引続いて子孫に分娩される能力を単量体抗体の 場合と比較した。幼児ラブドモデルを動物モデルとして使用した。類似するラッ トモデルを、ヒト胎児に至る抗体および他の分子の胎盤を横切る通過を予測する ために使用した。一般にはブランベルら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　Ｂｉｏｌ、１８ ＋２３４−２７６（１９７０）を参照することができる。

その予想される分娩日の２〜３日前、４０μｇの単量体５Ｅ１−Ｇ　ＩｇＧ（単 量体）　（母親１および２）またはホモ接合二量体ＩｇＧ（母親３および４）を 妊娠ラットに静脈注射した。抗体投与の２時間後および分娩の日に母親から、ま た誕生直後の新生児ラットから血液サンプルを藁めた０個々に設計した定量的結 合検定（ＥＬＩＳＡ）を使用し、全ヒトＩｇＧおよびヒトＩｇＧ抗イー・コリに １抗体をそれぞれの血液サンプルにおいて測定した。抗ヒトＩｇＧ特異的酵素ラ ベル二次抗体を使用することにより、ラットＩｇＧは検出されず、注射したヒト ＩｇＧの定量を妨害もしなかった。

胎２＝横切って通過した抗体の量は以下のように測定した。抗ヒトγ鎖抗体を、 炭ｉ！ｌ！衡液分使用してマイクロタイタブレートに付着させた。母親または幼 体からの希釈した血清サンプルを添加した後、ビオチンラベルした抗ヒトγＭ特 異的抗体を用いて結合を検定した。１つの群の母親は接合抗体のみを受容してい たため、幼体血清中に検出された全ゆるヒトＩｇＧは胎盤を横切って通過したホ モ接合体の筈である。

この実験は、単量体およびホモ接合ＩｇＧ抗体は、はぼ同等の効率で胎盤を積切 って通過したことを示した。したがって、本！ｌ！！様の場合、ホモ接合ＩｇＧ モノクローナル抗体は、イー・コリに１によるような生命を脅かされる感染の進 展の可能性が増加した新生児となる危険に際して妊娠したメスに予防的に投与し た場合に有用たり得る。またデータは、これらのホモ接合体を種々の他の感染お よび腫瘍の胎盤を横切る処置に使用することを支持する。

寒直医！エ ループＢ　に　ホモ　ムモノクローナル　の　を　る゛この実施例は、ホモ接合 モノクローナル抗体Ｄ３の胎盤を横切る通過を示すものである。

イー・コリに１に対するホモ接合モノクローナル抗体について実施例Ｖに一般に 記載したように実験を行った。

以下の表ＩＩＩに示す結果は、単量体およびホモ接合ＩｇＧｔＫ体の両者は胎盤 を横切って通過したことを示した。

表ＩＩＩ：妊娠ラブドからその新生児へのホモ接合抗体の胎盤を横切る通過母１ １２時閏　１．４５±０．４　２．４±０．３ｔｌｉ、３日　０．１４±０．０ ４　０．１１±０．０３（分娩の日） 幼体　分娩の日　０，４１±０．１　０．７０±０．２３ラブド血清中のヒトＩ ｇＧの濃度（μｇ／ｍｌ）よって、ホモ接合ｒｇＧモノクローナル抗体は、グル ープＢ連Ｍ球菌またはイー　コリに１によるような感染の進！！分受けるか既に 有している新生児ラットする可能性のある妊娠したメスに対して予防的または治 療的に投与する際に有用である。また本発明は１種々の他の感染および腫瘍の胎 盤を横切る処１におけるホモ接合体の使用も可能とするものである。

Ｘ良亘ヱエユ ■　Ｇホモ　Δ　ル　いるグループＢ連　・　感染に　る　保−この実施例は、 試験管内オプソニン食細胞検定の結果と一貫し、確認するものとして、生体内で グループＢ連頒球１Ｉｌｓ染に対して保護するＤ３モノクローナル抗体のホモ接 合体の使用を記載するものである。

前記した実施例ＩＶに記載したイー・コリに１保護検討について一般的に記載し たように、４８時間齢未満の（その母親により収められた）異系交配ＳＤう１ト 幼体に対し、２０，４．０．８または０．２μｇの主として二量体ホモ接合体調 製物、８０．２０または４μｇの単量体Ｄ３または対照ＩｇＧの腹農内注射を受 容した２時間後に、約１０００ＢＳ生体を腹膜内注射した。実験では、ラット幼 体を７日閏毎日検査し、７状および生存を記録した０区１２に示す２つの実験（ データをプール、２５動物／群）からの結果は、初発ＩｇＧ単量体に比較して増 加したヒトモノクローナル抗体Ｄ３の二量体ホモ接合体のＣＢＳに対する生体内 保護活性を示す、４μｇと少ないホモ接合二量体が、８０μｇの単量体により与 えられたものとほぼ同様に動物を保護した。

理解を明確にする目的で例示および実施例により本発明分幾分詳細に説明したが 、添付した請求の範囲の範囲内で、ある種の変形および改変分実施し得ることは 明らかであろう。

ホモ接合体混合物のクロマトグラム 抗ＣＢＳ単量体およびホモ接合体の結合活性１０’１０°　１０１１０２１０３ １０４１０５１０６抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ） 抗イー・コリに１単量体およびホモ接合体の結合活性１０’　１０°　１０１１ ０”　１０３１０’　１０５１０６抗体濃度（ｎｇ／ｍｘ） ネズミ抗腫ｉ　（ＢＲ６４）単量体およびホモ接合体の結合活性抗体濃度（ｎｇ ／ｍ＋） ＰＬＬ固定Ｈ３７６、ＯＢ細胞に対するＢＲ９６ホモ接合体のＥＬＩＳＡ結合活 性抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ） ＰＬＬ固定Ｈ２７０７細胞に対する ＢＲ９５ホモ接合体のＥＬＩＳＡ結合活性抗体濃度（ｎｇ／ｍ１） ＰＬＬ固定）！２９８７細胞に対する ＢＲ９６ホモ接合体のＥＬＩＳＡ結合活性抗体濃度（ｎ　ｇ　／　ｍ　＋　） ＰＬＬ固定Ｈ３３９６細胞に対Ｔる ＢＲ９５ホモ接合体のＥＬｒＳＡ結合活性抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ） 抗ＧＢＳ単量体およびホモ接合体のオプソニン活性１０’　１０”１０２１０　 １０　７ｏ　’７０６抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ） オプソニン食細胞検定　Ｄ３１ｇＧホモ接合体（ＨＣ）対グループＢ連鎖球菌株 Ｍ９４ｔｉ５よび１３３４Ｆｉｇｕｒｅ　７ 抗イー・コリに１単量体およびホモ接合体のオプ゛ノニン活性抗体濃度（μｇ／ ｍｌ） オプソニン食細胞検定　５Ｅ１１ｇＧホモ険合体対イー・コリに１株　Ｈ２Ｓお よびＡｌ４１０°１１０°　１０１１０２１０３１０４１０５１０６抗体濃度（ ｎｇ／ｍｌ） Ｆｉｇｕｒｅ　９ 胸部カルシノーマ細胞系統Ｈ３６３０を使用するＢＲ５４ホモ接合体によるＣＤ Ｃ検定 抗体濃度（μｇ／ｍｌ） 細胞系統Ｈ３３９６に対するＢＲ９６による細胞毒性抗体濃度（μｇ／ｍｌ） グループＢ連鎖球菌感染に対するホモ接合体による保護抗体投与量（μｇ／ラッ ト） 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、ＡＵ、 ＣＡ、ＦＩ、ＪＰ、ＫＲ，Ｎ。

（７２）発明者　ラフ　ハワード　ヴイーアメリカ合衆国　ワシントン州　９８ １１９シアトル　イレヴンス　アベニュー　ウェスト　２５５２

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．同一の抗原決定基に結合する少なくとも２つのＩｇＧ抗体を有する共有結合 により架橋結合したホモ接合モノクローナル抗体、および薬学的に許容し得るキ ャリヤからなる薬学的組成物。
2. ２．ホモ接合モノクローナル抗体が２つの抗体分子を有する請求の範囲第１項記 載の薬学的組成物。
3. ３．ホモ接合モノクローナル抗体が３つの抗体分子を有する請求の範囲第１項記 載の薬学的組成物。
4. ４．抗体がジスルフィド結合により架橋結合された請求の範囲第１項記載の薬学 的組成物。
5. ５．抗体がヒトのものである請求の範囲第１項記載の薬学的組成物。
6. ６．抗体分子がネズミのものである請求の範囲第１項記載の薬学的組成物。
7. ７．抗体分子がネズミーヒトのキメラ体である請求の範囲第１項記載の薬学的組 成物。
8. ８．ヒト抗体重鎖がＩｇＧ１である請求の範囲第５項記載の薬学的組成物。
9. ９．イー・コリＫ１による感染に対して保護性である請求の範囲第１項記載の薬 学的組成物。
10. １０．グループＢ連鎖球菌による感染に対して保護性である請求の範囲第１項記 載の薬学的組成物。
11. １１．ホモ接合モノクローナル抗体が腫瘍関連抗原と結合し、胸部腫瘍細胞の生 育を阻害する請求の範囲第１項記載の薬学的組成物。
12. １２．ホモ接合モノクローナル抗体が胎盤を横切ることができる請求の範囲第１ 項記載の薬学的組成物。
13. １３．抗体分子の軽鎖および重鎖の定常領域がヒトのものである請求の範囲第１ 項記載の薬学的組成物。
14. １４．架橋結合抗体が同一の細胞系統から誘導される請求の範囲第１項記載の薬 学的組成物。
15. １５．抗原に関連する疾患を有する患者を処置する方法であって、抗原の同一の 決定基に結合する少なくとも２つの共有結合により架橋結合したＩｇＧ抗体分子 を含む治療的に有効な量のホモ接合モノクローナル抗体を患者に投与することか らなる方法。
16. １６．抗原関連疾患がグループＢ連鎖球菌感染である請求の範囲第１５項記載の 方法。
17. １７．抗原関連疾患がイー・コリＫ１感染である請求の範囲第１５項記載の方法 。
18. １８．ホモ接合モノクローナル抗体を妊娠した患者に投与し、ホモ接合体が胎児 の循環系へと胎盤を通過することのできる請求の範囲第１５項記載の方法。
19. １９．ホモ接合モノクローナル抗体が、抗原関連疾患について胎児を処置するこ とのできる請求の範囲第１８項記載の方法。
20. ２０．抗原関連疾患がグループＢ連鎖球菌またはイー・コリＫ１による感染であ る請求の範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．抗原関連疾患が胸部腫瘍であり、ホモ接合モノクローナル抗体が胸部腫瘍 関連抗原に結合する請求の範囲第１５項記載の方法。
22. ２２．抗原に関連する疾患の処置のためにモノクローナル抗体を治療投与する方 法であって、抗原の同一の抗原決定基に結合する少なくとも２つの共有結合によ り架橋結合したＩｇＧ抗体を含むホモ接合モノクローナル抗体を患者に投与する ことからなることを特徴とするモノクローナル抗体の治療投与方法。