JP4890715B2

JP4890715B2 - ｐ７５／ＡＩＲＭ１の結合による診断及び治療法

Info

Publication number: JP4890715B2
Application number: JP2001545846A
Authority: JP
Inventors: ビアッソーニ，ロベルト; モレッタ，アレッサンドロ; モレッタ，ロレンツォ; クリスティーナミンガーリ，マリア
Original assignee: ウニベルシタデリィストゥディディジェノバ，ディパルティメントディメディチナスペリメンターレ
Priority date: 1999-12-16
Filing date: 2000-12-11
Publication date: 2012-03-07
Anticipated expiration: 2020-12-11
Also published as: IT1307826B1; EP1238282A2; ITFI990254A0; ITFI990254A1; US7384631B2; WO2001044808A3; ATE426812T1; US20030077285A1; WO2001044808A2; EP1238282B1; DE60041883D1; DK1238282T3; AU3009301A; JP2003517482A

Description

【０００１】
本発明は細胞増殖、特に細胞増殖障害（白血病など）、細胞増殖をモニタリングし細胞増殖状態を確定し種々の成熟段階で正常細胞と異常細胞（白血性骨髄単球細胞など）を識別する方法、診断と治療の方法、並びにそうした方法に使用するリガンドを含めた試薬に関する。本発明は、新たに特性を解明されクローニングされた細胞表面受容体ｐ７５／ＡＩＲＭ１に対して特異的なリガンド類の同定、種々の分化段階の骨髄性細胞表面でのｐ７５／ＡＩＲＭ１の発現を示す実験結果、それに細胞増殖の阻害と細胞アポトーシスの誘発のための該受容体に対応するリガンドの使用に、部分的に依拠する。
【０００２】
正常な造血は多段階の過程であり、そこでの細胞分化は種々の増殖因子に、また特定の転写因子の発現に、依存する。この造血過程は種々の細胞分化段階の認識を可能にする細胞表面マーカーの逐次発現を特徴とする。たとえばＣＤ３４表面マーカーを発現する細胞は多分化能の造血胚芽細胞を含むが、ＣＤ３３はそうした造血胚芽細胞表面には存在しない。他方、ＣＤ３３は骨髄単球前駆細胞表面で、並びに骨髄性及び単球細胞表面で発現するが、成熟顆粒球表面では消失する。
【０００３】
ＣＤ３３は骨髄性白血病とリンパ性白血病の識別に有用なマーカーであるが、その機能はほとんどわかっていない。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面で発現するＮＫ細胞機能調節能をもつ抑制性受容体が本発明者の所属する研究所で同定され、特性を解明された（Ｆａｌｃｏ他「ＪｏｕｒｎａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ」ｖｏｌ．９０，Ｎｏ．６，１９９９年９月２０日、第７９３〜８０２頁）。この受容体はｐ７５／ＡＩＲＭ１（７５ｋＤａｄｈｅｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｒｅｃｅｐｔｏｒｍｏｌｅｃｕｌｅ１、７５ｋＤの接着抑制受容体分子１）と命名されたが、その完全なアミノ酸配列とそれをコードするヌクレオチド配列はＦａｌｃｏ他の図５に示されている。同資料は本書で言及する他の諸々の公開資料と共に、参照指示により本書に組み込まれる。
【０００４】
ＣＤ３３骨髄性細胞抗原とｐ７５／ＡＩＲＭ１は互いにアミノ酸配列同一性を共有する。ＣＤ３３は造血細胞で選択的に発現することが判明している。また、ＣＤ３３は骨髄性細胞の分化研究及び白血病の類型化と段階確定のための重要なマーカーである。最近、ＣＤ３３に特異的なモノクローナル抗体が急性前骨髄単球性白血病の治療に利用された（Ｃａｒｏｎ他「Ｃａｎｃｅｒ」７３，１０４９−５６，１９９４；「Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．」１，６３−７０，１９９５ａｎｄｉｂｄｅｍ４，１４２１−２８，１９８８）。
【０００５】
抗体分子などのようなリガンドの使用は骨髄性細胞の特定の分化段階の識別を可能にすることが本発明者により思いがけず立証された。もっと重要なのは、前記受容体が骨髄性細胞の分化でＣＤ３３よりも遅く発現するため、たとえば、白血病特に、慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）と急性骨髄白血病（ＡＭＬ）の診断治療にきわめて有用なことである。ｐ７５／ＡＩＲＭ１受容体の同定は、骨髄性細胞の種々の成熟段階のより厳密な定義を可能にする。これは白血病の正確な類型化に有用であろうから、その予後及び治療処置に役立つと期待される。
【０００６】
本発明の好ましい態様は多様な側面において、ＱＡ７９−ｐ７５／ＡＩＲＭ１受容体に対して特異的なＱＡ７９モノローナル抗体（ｍＡｂ）の結合特性をもつ抗体分子類を使用する［ＱＡ７９産生ハイブリドーマはＤＩＭＥＳ（ＤｉｐａｒｔｉｍｅｎｔｏｄｉＭｅｄｉｃｉｎａＳｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ，ＳｅｚｉｏｎｅｄｉＰａｔｏｌｏｇｉａＧｅｎｅｒａｌｅ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔａＤｅｇｌｉＳｔｕｄｉＤｉＧｅｎｏｖａ，Ｖｉａ２，１６１３２ＧＥＮＯＶＡ，Ｉｔａｌｉａ−本出願人）のＡｌｅｓｓａｎｄｒｏＭｏｒｒｅｔａ教授が本出願人の代理としてＩｎｔｅｒｌａｂＣｅｌｌＬｉｎｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＣｅｎｔｒｏｄｉＢｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅＡｖａｎｚａｔｅ（ＣＢＡ），ＳｅｒｖｉｚｉｏＢｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ，Ｌ．ｇｏＲ．Ｂｅｎｚｉ１０，１６１３２ＧＥＮＯＶＡ，Ｉｔａｌｉａに対し１９９９年１２月１０日に寄託し、寄託番号ＩＣＬＣＮｏ．ＰＤ９９００３を付与されている］。ＱＡ７９ｍＡｂの生成については以下で詳述する。
【０００７】
リガンド（抗体分子など）使用のもう１つの重要な効果は、ＱＡ７９などのような抗体がｐ７５／ＡＩＲＭ１受容体分子と相互作用を起こすと、骨髄性細胞が増殖を停止させられ、またプログラム細胞死すなわちアポトーシスが誘発されるという事実によって立証される。この効果はすでに正常及び白血病骨髄性細胞の両方で、インビトロで裏付けられており、白血病細胞（たとえば化学療法後の残存白血病細胞）の一掃を目的とした治療的介入のための重要な分子的土台となる。
【０００８】
本発明は多様な側面において、ｐ７５／ＡＩＲＭ１に対応する特異的リガンド類の使用により正常及び白血病骨髄性細胞を識別する方法、そうしたリガンド類、及びその診断治療面への使用に関する。
【０００９】
本発明の実施に有用なリガンド類は一般に抗体分子であり、マウスモノクローナル抗体又はその「ヒト化」モノクローナル抗体、あるいは可溶性組換え分子等のような断片（単鎖Ｆｖ、すなわち、ｓｃＦｖ抗体分子など）であろう。さらに他の有用なリガンド類として、ｐ７５／ＡＩＲＭ１受容体分子を認識すること及び／又はそれと特異的に結合することができる他の諸々の分子（たとえば、ペプチドや医薬製剤など）がある。
【００１０】
抗体分子は天然分子か部分もしくは完全な合成分子の免疫グロブリンである。抗体分子の例は免疫グロブリンの各種アイソタイプ又はそのサブクラス、それにＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ及び二重特異性抗体などのような抗原結合ドメインを含む断片である。抗体は様々な方法で修飾することができるので、用語「抗体分子」は免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチドを、天然分子か部分もしくは完全な合成分子かを問わず包含するものとする。よって、別のポリペプチドと融合させた免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むキメラ分子も包含される。特異的結合メンバーは抗体配列の他に別のアミノ酸を含めて、たとえば折り畳まれたドメインなどのようなペプチド又はポリペプチドを形成するように、又は抗原結合能に加えてもう１つの機能的特性を抗体分子に付与するようにしてもよい。本発明の特異的結合メンバーは検出可能な標識を含んでもよいし、毒素又は酵素と（たとえばペプチジル結合又はリンカーを介して）複合体を形成してもよい。本発明では、抗体分子などのようなリガンドをたとえば抗白血病の見地から、細胞障害作用を増強しうる放射性同位体、毒素、エミトキシン又は他の化合物を含む複合体の一部として提供してもよい。
【００１１】
キメラ抗体のクローニングと発現についてはＥＰ−Ａ−０１２０６９４号、ＥＰ− Ａ−０１２５０２３号及びＥＰ−Ａ−０４５１２１６号に記載されている。
【００１２】
「抗原結合ドメイン」は、抗体分子のうち、抗原の一部又は全体と特異的に結合しかつ抗原の一部又は全体に対して相補的である区域を含む部分をいう。抗原が大きい場合には、抗体は抗原の特定部分に結合するだけであろうが、抗体が結合するその特定抗原部分をエピトープという。抗原結合ドメインは１以上の抗体可変領域（たとえば、ＶＨ領域からなるいわゆるＦｄ抗体フラグメント）に由来しよう。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）と抗体Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００１３】
結合相手に対して「特異的」なリガンドは一般に、その特異的結合相手以外の分子に対しては有意の結合を示さないであろう。この用語はまた、たとえば多数の抗原に含まれる特定のエピトープに対して抗原結合ドメインが特異的である場合にも適用されるが、その場合、抗原結合ドメインを含む特異的結合メンバーは該エピトープををもつ種々の抗原に結合することができよう。
用語「含む」は一般に「包含する」、すなわち１以上の特徴又は構成要素の存在を許容するという意味で使用される。
【００１４】
用語「単離（された、した）」は、本発明の抗体分子などのようなリガンド、又はそうした結合メンバーをコードする核酸が、一般に本発明に従って使用される際の状態をいう。これは、当のリガンド又は核酸が、自然の環境あるいはそれらがインビトロ又はインビボの組換えＤＮＡ技術により調製される場合にはその調製される環境（例：細胞培養）で、自然状態で結合している物質、たとえば、他のポリペプチド又は核酸を含まない又は実質的に含まないことを意味する。リガンド又は核酸は希釈液又はアジュバントと調合されることもあろうが、それでもなお実際目的上は「単離された」状態にあるとされよう。たとえば、リガンドは免疫検定でマイクロタイタープレートのコートに使用する場合にはゼラチンまたは他の担体と混合するのが普通であろうし、診断又は治療に使用する場合には医薬として許容しうる担体又は希釈液と混合されよう。
【００１５】
本発明では、好ましい抗体分子リガンドはＩｎｔｅｒｌａｂＣｅｌｌＬｉｎｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能な寄託番号ＩＣＬＣＮｏ．ＰＤ９９００３（その寄託の詳細は前述のとおりである）から入手できるＱＡ７９抗体の抗原結合ドメインを含む。これはマウスモノクローナル抗体であり、当業者はごく普通の実験手法により寄託ハイブリドーマ細胞から該抗体のＬ及びＨ鎖コード配列を単離することが十分に可能である。これらを組換え発現系にそのまま使用すれば該抗体を産生させることができよう。さらに、ＱＡ７９ＨＶ及びＬＶ可変領域をコードする核酸を使用すればｓｃＦｖ、Ｆｖ及びＦａｂ抗体などのような抗体分子をコードする配列を簡単に構築することができるので、当業者は自由に使える多様な既定技術のうちの任意のものに依拠した組換え発現によりこれらの分子を産生させることができる。
【００１６】
本発明はさらなる側面として、開示の寄託ハイブリドーマから得られるＱＡ７９抗体分子のＶＨ及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列を含むＶＨ及び／又はＶＬ領域を含んだ任意の特異的結合メンバー又はリガンドを提供する。そうした特異的結合メンバー又はリガンドは全抗体でも、ｓｃＦｖ、Ｆｖ又はＦａｂ抗体分子でもよい。
【００１７】
本発明の抗体分子リガンドは抗体定常領域又はその部分を含んでもよい。たとえば、ＶＬ領域はそのＣ−末端側でＣκ又はＣλ鎖、好ましくは、Ｃλ鎖を含む抗体Ｌ鎖定常領域と結合されていてもよい。同様に、ＶＨ領域はそのＣ末端側で任意の抗体アイソタイプ、たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、並びにサブクラスのアイソタイプ、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ４に由来する免疫グロブリンＨ鎖の全体または部分と結合されていてもよい。
【００１８】
本発明はさらなる側面において、次の工程を含むモノクローナル抗体生成及び単離法を提供する：
ａ）次の表面表現型をもつヒトＮＫ細胞クローンに由来する細胞でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫すること：ＣＤ３^-、ＣＤ１６⁺、ＣＤ５６⁺、ＮＫｐ４６⁺、ＮＫｐ４４⁺、ｐ１４０⁺、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ⁺；
ｂ）マウス脾細胞を単離し、それをマウス（たとえばＰ３Ｖ１）骨髄腫細胞系と融合して、ハイブリッド細胞を準備すること；
ｃ）該ハイブリッド細胞を３７℃組織培養器中、５％のＣＯ₂存在下で増殖させること；
ｄ）細胞を限界希釈法でクローニングし所望のモノクローナル抗体を同定及び単離すること；
ｅ）ハイブリッド上清を精製し、硫酸アンモニウム（４０％）と陰イオン交換クロマトグラフィーで濃縮すること。
【００１９】
さらに、当業者にはＱＡ７９マウスモノクローナル抗体又は他の非ヒト抗体分子をヒト化することが、ＣＤＲ配列をヒト・フレームワーク中に移入し、該ヒト・フレームワーク配列にＣＤＲ配列への影響が、したがって該抗体の抗原結合特性（特異性、親和性など）への影響が広く知られている標準残基を含む、多分いくつかの周知の残基に必要な１以上の変更を施すという方法によって十分な可能であるので、本発明は別の側面としてさらに、ＱＡ７９ＶＨ領域の１以上のＣＤＲ、好ましくは１、２及び３の３つのＣＤＲのすべてを含むヒト化抗体ＶＨ領域を提供する；さらにＱＡ７９ＶＬ領域の１以上のＣＤＲ好ましくは１、２及び３の３つのＣＤＲのすべてを含むヒト化抗体ＶＬ領域を提供する；またさらにＱＡ７９ＶＨ領域の１以上のＣＤＲ、好ましくは１、２及び３の３つのＣＤＲのすべてを含む抗体ＶＨ領域とＱＡ７９ＶＬ領域の１以上のＣＤＲ、好ましくは１、２及び３の３つのＣＤＲのすべてを含む抗体ＶＬ領域とを含むヒト化抗体分子を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、ｐ７５／ＡＩＲＭ１との結合をめぐってＱＡ７９抗体分子、特に任意の（ただし必ずしもそうではないが）、ｐ７５／ＡＩＲＭ１抗原と結合するだけでなくＱＡ７９のＣＤＲを含んだ可変領域を含みもする抗体分子、と競合する特異的結合メンバー又はリガンドにも及ぶ。結合メンバー間の競合に関してはインビトロ検定を、たとえば、１個の結合メンバー（例：抗体分子）を特異的レポーター分子で標識し、それを他の単数又は複数の無標識結合メンバー（例：単数又は複数の抗体分子）の存在下で検出できるようにすることにより、同じエピトープ又は重複エピトープに結合するリガンドの同定を可能にするという方法で容易に行うことができる。
【００２１】
競合検定には、抗原のペプチド断片を、特に着目のエピトープを含むペプチドが使用されよう。使用するペプチドはエピトープ配列に加えて１以上のアミノ酸をどちら側かに有してもよい。そうしたペプチドは「本質的に」特定の配列「からなる」と言えよう。本発明の特異的結合メンバー又はリガンドは、それらの抗原との結合が所与の配列を有する又は含むペプチドによって阻害されるものでもよい。これについての検定には、いずれかの配列に加えて１以上のアミノ酸を有するペプチドが使用されよう。
【００２２】
特定のペプチドに結合する特異的結合メンバーは、たとえばファージ提示ライブラリーから、該ペプチドによる、又は組換え技術を用いて得られたｐ７５／ＡＩＲＭ１の細胞外ドメインによる、スクリーニングで単離してよい。ｐ７５／ＡＩＲＭ１に対するヒト抗体はそうしたライブラリーから得てもよいし、好ましければ、ｐ７５／ＡＩＲＭ１への結合をめぐってＱＡ７９抗体と競合するようなヒト抗体を得てもよい。ただしｐ７５／ＡＩＲＭ１の他の領域またはエピトープに結合する抗体たとえばヒト抗体は本発明の様々な側面及び態様によって提供されるし、またそうした側面及び態様に有用である。
【００２３】
本発明のリガンドにはＱＡ７９ＶＨ及びＶＬ領域の変異型を用いてもよいが、そうした変異型は配列改変又は突然変異及びスクリーニング法を用いて得ることができる。その種の方法もまた本発明により提供される。
【００２４】
ＱＡ７９ＶＨ及び／又はＶＬ領域の可変領域アミノ酸配列変異型は１以上の、おそらく約２０未満、約１５未満、約１０未満、又は約５未満の、４、３、２又は１のアミノ酸配列改変（１アミノ酸残基の追加、欠失、置換及び／又は挿入）を含んでもよい。改変は１以上のフレームワーク領域で、及び／又は１以上のＣＤＲで行われよう。
【００２５】
本発明の抗体分子及び他リガンドは検出可能又は機能性標識を付加してもよい。検出可能標識には¹³¹Ｉ又は⁹⁹Ｔｃなどのような放射性標識があるが、それらは抗体イメージング技術の分野で公知の通常の化学を用いて本発明の抗体に付加してよい。西洋ワサビペルオキシダーゼなどのような酵素もまた標識になる。さらに、ビオチンなどのような、同系統の特異的検出可能部分、たとえば、標識アビジンと結合することによって検出される化学部分もまた標識になる。抗体分子又は他のリガンドを標識するための他のアプローチについては以下で、インビトロ又はインビボで実施される種々の検定法たとえば診断検定法に使用されるリガンドの追加的な説明と併せて、さらに検討する。
【００２６】
本発明の抗体分子を作製するための好都合な方法は好適なコード化核酸からの組換え発現を用いることになるので、本発明はさらなる側面において、本発明の抗体ＶＨ可変領域及び／又はＶＬ可変領域をコードする、一般に単離された、核酸を提供する。
【００２７】
本発明は別の側面において、本発明のＱＡ７９抗体分子又は他の抗体分子のＶＨＣＤＲ３配列をコードする、一般に単離された、核酸を提供する。たとえば、ＱＡ７９を用いてヒト化抗体分子又は他のＣＤＲ融合抗体分子を生成する際にはＶＨＣＤＲ３配列だけが移入されよう。他のＣＤＲは結合特性の決定因としての重要性が薄いためである。たとえば、１個の本来完全なヒト・フレームワーク中に、又は多様な一群の本来完全なヒト・フレームワーク中に、ＱＡ７９ＶＨＣＤＲ３を移植し、そこから所望の（ｐ７５／ＡＩＲＭ１に対する特異性などを含む）特性を備えた抗体分子を選択するようにしてもよい。
【００２８】
本発明の核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。本発明はまた、前述の核酸又はポリヌクレオチドを１以上含む構築体を、プラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形で提供する。
【００２９】
本発明はまた前述の構築体を１以上含む組換え宿主細胞を提供する。発現は、該核酸を含有する組換え宿主細胞を適正条件下で培養することによって都合よく実現されよう。発現によって産生された産物は、好適な技術を用いて単離及び／又は精製され、次いで適宜使用されることになろう。
【００３０】
多種多様な宿主細胞を使用したポリペプチドのクローニング／発現系が周知である。好適な宿主細胞は細菌、哺乳類、酵母菌及びバキュロウィルスなどの細胞である。技術的に利用可能な異種ポリペプチド発現用の哺乳類細胞系にはＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒ卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）細胞、ＨｅＬａ細胞、幼ハムスター腎細胞等々がある。好ましい慣用の細菌宿主はＥ．ｃｏｌｉである。
【００３１】
好適なベクターはプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を適宜含む、然るべき調節配列を含有するように選択又は構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミド、ウィルス、たとえばファージ、ベクター、又はファージミドでよい。詳しくは、たとえば「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」２版Ｓａｍｂｒｏｏｋ他１９８９ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ．を参照。核酸の操作、たとえば、核酸構築体の調製、突然変異誘発、配列解析、細胞中へのＤＮＡの導入と遺伝子の発現、及びタンパク質の解析のための多数の公知技術及びプロトコールは「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」２版Ａｕｓｕｂｅｌ他編ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９２に詳しく記載されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他とＡｕｓｕｂｅｌ他の開示内容は参照指示により本書に組み込まれる。
【００３２】
そこで、本発明は更なる側面において本書で開示したような核酸を含有する宿主細胞を提供する。なお更なる側面において、本発明はそうした核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。この核酸導入には任意の利用可能技術を使用してよい。真核細胞なら、リン酸カルシウム形質転換法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気穿孔法、リポフェクション法、レトロウィルス又は他のウィルス、たとえば、ワクシニアウィルス、又は昆虫細胞の場合にはバキュロウィルスなど、を使用した形質導入法などの技術が好適であろう。細菌細胞なら、塩化カルシウム法、電気穿孔法、ファージ利用トランスフェクション法などが適切な技術であろう。
【００３３】
核酸導入後は、遺伝子発現に好適な条件下での宿主細胞の培養などにより核酸からの発現を引き起こす又は許容することになろう。
一態様では、本発明の核酸は宿主細胞のゲノム（たとえば、染色体）中に一体化される。この一体化は、ゲノムとの組換えを促進するような配列を標準技術で封入することにより、促進してもよい。
【００３４】
本発明はまた、前述の特異的発現メンバー又はリガンドを発現させるために前述のベクターを発現系に使用することを含む方法を提供する。
本発明は更なる側面において、本発明のリガンドをコードする核酸からの発現を引き起こすことを含む該リガンドの産生法を提供するが、該方法はコードされたポリペプチド産物の産生に好適な条件下で宿主細胞を培養することを含んでもよい。産生法は該産物の単離及び／又は精製工程を含んでもよい。
【００３５】
産生法は該産物を、医薬として許容しうる賦形剤などのような１以上の追加成分を含む組成物へと調合することを含んでもよい。
本発明のいくつかの態様では、本発明の抗体分子などのようなリガンドを、人間又は動物を、好ましくは人間を対象とする診断又は治療法に使用する。
【００３６】
そこで、本発明は更なる側面において、本発明の特異的結合メンバー又はリガンド、かかる特異的結合メンバー又はリガンドを含む医薬組成物の投与を含む治療法、及びかかる特異的結合メンバー又はリガンドの、投与用薬剤の製造（たとえば該特異的結合メンバーの医薬として許容しうる賦形剤との調合を含む薬剤又は医薬組成物の製法）への使用を提供する。
【００３７】
本発明の組成物は個人に投与されよう。投与量は好ましくは「治療有効量」、すなわち患者に対して効能を示すに足る量とする。かかる効能は少なくとも、１以上の症状の改善であろう。実際の投与量、投与の割合及び時間的経過は治療対象の疾患の性質と重篤度に左右されよう。治療法の処方たとえば用量等の決定は一般開業医及び他の医師の責任に属する。抗体の適正用量は技術上周知であり、たとえばＬｅｄｅｒｍａｎｎＪ．Ａ．他（１９９１）「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ」４７：６５９−６６４；ＢａｇｓｈａｗｅＫ．Ｄ．他（１９９１）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＩｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓａｎｄＲａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」４：９１５−９２２を参照。
【００３８】
組成物は単独で投与しても、治療の対象となる状態に応じて他治療と組み合せて同時に又は順次に投与してもよい。
【００３９】
本発明の抗体は治療を必要とする患者に、任意の好適な経路を通じて、通常は血流中に又は治療対象部位、たとえば、腫瘍中に直接、注射して投与する。厳密な用量は多数の因子に左右されようが、そうした因子には抗体が診断用又か治療用かの区別、対象部位の大きさと場所、抗体の正確な性質（全抗体か断片かの区別など）、抗体に付加された任意の検出可能な標識又は他の分子の性質などが含まれる。一般的な抗体の用量は全身性投与の場合で０．５ｍｇ〜１００ｇ、局所投与の場合で１０μｇ〜１ｍｇの範囲内であろう。一般に、抗体は全抗体、たとえば、ＩｇＧ４アイソタイプであろう。これは成人患者の場合の１回の治療に関する用量であり、幼児、小児の場合には適宜調整することになろうし、また他の形式の抗体の場合にも適宜加減することになろう。治療は医師の裁量により毎日、週２回、週１回又は月１回の頻度で繰り返されよう。
【００４０】
本発明の特異的結合メンバー、リガンド及び抗体分子は投与時には通常、特異的結合メンバー、リガンド又は抗体分子に加えて１以上の成分を含む医薬組成物の形で投与されよう。
【００４１】
よって、本発明の、本発明に基づく使用のための医薬組成物は活性成分に加えて医薬として許容しうる賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は技術上周知の他の原料を含むことになろう。そうした原料は無害で、しかも活性成分の薬効を妨げないものでなければならない。担体又は他の原料の厳密な性質は投与法に左右されようが、投与法は経口投与でも、又は静脈注射などの注射による投与でもよい。
【００４２】
経口投与用医薬組成物の剤型は錠剤、カプセル剤又は液剤などであろう。錠剤はゼラチン又はアジュバントなどの固形担体を含もう。液剤は一般に液体担体、たとえば、水や石油、動植物油、鉱油又は合成油などを含む。生理的食塩水、デキストロース又は他の多糖溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのようなグリコール類を含んでもよい。
【００４３】
静脈注射又は患部への注射では、活性成分は発熱源を含まず、好適なｐＨ、等張性及び安定性を備えた非経口投与上許容しうる溶液の形をとろう。当業者には、たとえば、塩化ナトリウム液、リンガー液、乳酸化リンガー液などのような等張基剤を使用して適当な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤及び／又は他添加剤を加えてもよい。
【００４４】
組成物は単独で投与しても、治療の対象となる状態に応じて他の治療と組み合せて同時に又は順次に投与してもよい。他の治療には適当量の鎮痛薬、たとえば、非ステロイド系抗炎症剤（アスピリン、パラセタモール、イブプロフェン又はケトプロフェンなど）又はアヘン剤（モルヒネなど）、あるいは抗嘔吐剤の投与が含まれよう。
【００４５】
本発明は、本発明の特異的結合メンバー又はリガンドの抗原との結合を引き起こさせる又は許すことを含む方法を提供する。前述のように、そうした結合はインビボで、たとえば特異的結合メンバー又はリガンド（あるいは特異的結合メンバー又はリガンドをコードする核酸）の投与後に起こることもあれば、インビトロで、たとえばＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、免疫細胞化学法、免疫沈降法、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの中で起こることもあろう。
【００４６】
特異的結合メンバーの抗原との結合では結合量を求めることもあろう。定量化は、診断上重要な試料中の抗原量と関連付けられよう。
【００４７】
試料上の抗体の反応性は適宜任意の手段により求められよう。放射線免疫検定（ＲＩＡ）は可能な手段の１つである。放射性標識抗原を非標識抗原（試料）と混合し、抗体と結合させる。結合抗原を物理的に未結合抗原から分離し、抗体に結合した放射性抗原の量を求める。試料中に存在する抗原の量が多ければ多いほど、抗体と結合する放射性抗原の量は少ないであう。非放射性抗原による競合結合検定もまた可能であり、これにはレポーター分子に連結した抗原又は類縁物質を使用する。レポーター分子は孤立した吸収及び発光スペクトル特性をもつ蛍光色素、リン光体又はレーザー色素であろう。好適な蛍光色素はフルオロセイン、ローダミン、フィコエリトリン及びＴｅｘａｓＲｅｄなどである。好適な発色性色素はジアミノベンジジンなどである。
【００４８】
レポーターとしては他に、検出可能なシグナルを直接又は間接に視覚的に観察される、電子的に検出される、又は他の方法で記録されるようにする着色、磁性又は常磁性の、生物又は化学活性物質であるラテックスビーズなどのような巨大分子コロイド粒子又は粒子状物質がある。これらの分子はたとえば色を顕現又は変化させ、あるいは電気的性質を変化させるような反応を触媒する酵素でもよい。分子的に励起可能であって、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的な吸収又は発光スペクトルをもたらすものでもよい。また、バイオセンサーに使用される化学種を含む場合もある。ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジン及びアルカリ性ホスファターゼ検出系を使用してよい。
【００４９】
個別の抗体−レポーター複合体が生成するシグナルは、（正常及び試験）試料中の該当抗体結合に関する定量可能な絶対又は相対データを導き出すために使用されよう。
【００５０】
本発明はまた、競合検定法による抗原レベルの測定を目的とした、特異的結合メンバー又はリガンド、特に前述のＱＡ７９抗体分子、の使用を、すなわち本発明の特異的結合メンバー又はリガンドを競合検定法へと使用することにより試料中の抗原レベルを測定する方法を提供する。この場合、結合抗原と未結合抗原の物理的分離が不要となろう。それには、レポーター分子を特異的結合メンバー又はリガンドに連結させて、結合に物理的又は光学的変化が起こるようにすることが考えられる。該レポーター分子は、検出可能な、そして好ましくは測定可能なシグナルを直接又は間接に生成しよう。レポーター分子の連結は直接結合でも間接結合でも、また共有結合（たとえばペプチド結合による）でも非共有結合でもよい。ペプチド結合による連結は、抗体分子とレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果でもよい。
【００５１】
結合の測定方式は本発明の特徴ではないので、当業者はその好みと一般的な知見に従って適当な方式を選択することができる。
実験に基づく以下の例証と裏付けから、当業者には本発明の更なる側面及び態様が自明であろう。
【００５２】
実験の説明
ｐ７５／ＡＩＲＭ１に対するモノクローナル抗体の単離
５週令のＢＡＬＢ／ｃマウスをＮＫ細胞クローン（表現型ＣＤ３^-、ＣＤ１６⁺、ＣＤ５６⁺、ＮＫｐ４６⁺、ＮＫｐ４４⁺、ｐ１４０⁺、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ⁺を発現するクローンＬＭ５）で免疫することにより、アイソタイプＩｇＧ１のＱＡ７９ｍＡｂを得た。
【００５３】
もっと詳しく説明すると、免疫は週１回の腹腔内注射４回とさらに３日後の第５回注射を用いて行った。さらに３日後、マウスを犠牲にした。免疫化には１回につき７００万個のＮＫ細胞を用いた。細胞ハイブリッドを得るために、免疫マウスから単離したマウス脾細胞をマウス骨髄腫細胞系（Ｐ３Ｖ１）と融合した。１５００万個の脾細胞と同数のＰ３Ｖ１細胞を０．４ｍｌポリエチレングリコールＭＷ１５００（ＰＥＧ１５００）で処理した。処理は、ＰＥＧ１５００をゆっくりと滴下して細胞を終始懸濁状態に保ちながら行った。
【００５４】
次に、５ｍｌの予め３７℃に温めた組織培養の増殖培地（ＲＰＭＩ）と４３ｍｌのウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で補いその最終濃度を１０％とした同じＲＰＭＩとを前と同じ要領でゆっくりと加えた。このＲＰＭＩ細胞懸濁液を、プラスチック接着性のマウスマクロファージの存在下に完全増殖培地（抗生物質と１０％のＦＣＳを加えたＲＰＭＩ０．５ｍｌ）を含有する２４穴の組織培養プレート（０．５ｍｌ／穴）に移し入れた。細胞を３７℃組織培養器中、５％のＣＯ₂の存在下で培養した。翌日、１３．６ｍｇ／ｍｌのヒポキサンチン、０．２３８ｍｇ／ｍｌのアミノプテリン及び０．２３８ｍｇ／ｍｌのデオキシチミジン（ＨＡＴ：ハイブリッド細胞だけが増殖できるようにした選択性物質の配合物）を添加した１ｍｌの完全増殖培地を各穴に加えた。次の１０日間は、欠かさずＨＡＴを添加した増殖培地を３日毎に、またその後は毎週、交換した。
【００５５】
次に、ハイブリッド培養の上清を次の方法で分析した：（１）抗体のアイソタイプと反応性を評価するための間接免疫蛍光法、（２）ハイブリッド細胞が産生する抗体によって認識される受容体の可能な機能を評価するための細胞障害機能検定法。その後、選択されたハイブリッド細胞を限界希釈法でクローニングして、単一抗体（特にＱＡ７９モノクローナル抗体）を産生するハイブリッドクローンを得た。
【００５６】
このＱＡ７９ハイブリドーマは１９９９年１２月１０日にＩｎｔｅｒｌａｂＣｅｌｌＬｉｎｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、ＩＣＬＣＮｏ．ＰＤ９９００３の寄託番号で寄託された。寄託者と受託者の詳細は前述のとおりである。
【００５７】
適正量のｍＡｂを産生させるために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、プリスタンによる２週間の予処置後にハイブリッド細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）接種した。接種は、最終プリスタン処置の１週間後に６００万個のＱＡ７９ハイブリッド細胞をマウスに注射するという形で実施した。１０日後に腹水を採取した。採取後の腹水はリン酸アンモニウム沈殿法（最終濃度４０％）で精製し、ＱＡ７９ｍＢＡを含む沈殿物を再懸濁させ、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。
【００５８】
細胞表面でのＱＡ７９抗体分子の反応性
以前のデータどおり、ｐ７５／ＡＩＲＭ１はＮＫ細胞表面で発現するが、ＣＤ３⁺細胞表面では発現しないことがリンパ系細胞集団を対象にしたＦＡＣＳ解析により判明した。また、ｐ７５／ＡＩＲＭ１はほとんどのＣＤ３３⁺細胞表面で発現するがＣＤ１４⁺細胞表面では発現しないことが骨髄系細胞集団を対象にした解析から判明した。ＣＤ３３は単離ＣＤ３４⁺細胞表面に様々な割合で認められたりまったく認められなかったりしたが、ｐ７５／ＡＩＲＭ１は一貫してＣＤ３４⁺細胞集団中に存在しなかった。これは、骨髄系細胞の発生段階でｐｄ７５／ＡＩＲＭ１のほうがＣＤ３３よりも遅く発現することを示唆する。この点は、ＣＤ３４⁺細胞集団をＳＣＦとＧＭ−ＣＳＦを添加して培養し、ＣＤ３３、ｐ７５／ＡＩＲＭ１両マーカーの発現を調べるという実験により確認された。
【００５９】
ｐ７５／ＡＩＲＭ１受容体分子に対して特異的なＱＡ７９ｍＡｂの使用による正常及び白血病骨髄性細胞へのプログラム細胞死及び細胞増殖阻害の導入
ＣＤ３４⁺臍帯血由来細胞を９６平底穴プレートに２０，０００個／穴の濃度で塗布し、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）とＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した完全増殖培地中で培養した。ＣＭＬ（慢性骨髄白血病）細胞を６平底穴プレートに５０，０００個／穴の最終濃度で塗布し、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）だけを添加した完全増殖倍地中で培養した。両細胞型はまた、それぞれ表示の増殖因子を加えたうえで、ヤギ−抗マウス（１０μｇ／ｍｌ）をコートした９６平底穴プレートにも２０，０００個／穴の濃度でまいた。
【００６０】
飽和量のＱＡ７９（抗ｐ７５）を加えて、又は対照としての他のｍＡｂを加えて、細胞を培養した。種々の間隔（臍帯血由来細胞の場合は４、６及び８日の間隔、ＣＭＬ由来細胞の場合は３、４、５及び７日の間隔）をおいて、細胞を収穫し、計数し、その表面表現型を調べた。増殖検定も上記と同じ間隔をおいて、収穫１６時間前に１μＣｉ／穴の［³Ｈ］チミジンを細胞に適用して実施した。細胞の収穫にはＴｉｔｅｒｔｅｋセルハーベスター５５０を用いた。放射能の測定にはシンチレーションβ−カウンターを用いた。すべての培養は三重に実施した。
【００６１】
対照としてのｍＡｂではなくＱＡ７９ｍＡｂによる抗ｐ７５／ＡＩＲＭ１の活性化は、正常骨髄性細胞とＣＭＬ（慢性骨髄白血病）細胞の両方に対して強い増殖阻害作用を及ぼした。抗ｐ７５／ＡＩＲＭ１抗体はまた、（ＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養すると）高インビトロ増殖速度を示すＡＭＬ（急性骨髄白血病）の細胞試料にも強い阻害作用を及ぼすことが判明した。
患者から単離したＣＭＬ細胞のうち、抗ｐ７５／ＡＩＲＭ１による最大の阻害作用が観察されたのは最高レベルの抗原発現を示す細胞であった。
【００６２】
プログラム細胞死の誘発はアネキシンＶの表面反応性をもとに評価した。これはアポトーシスによる細胞死過程の開始指標である。アネキシンＶの発現は間接免疫蛍光分析及び細胞蛍光分析に特異的ｍＡｂ類を使用して評価した。細胞表面のアネキシンＶとの結合、光散乱特性の変化及びヌクレオソームＤＮＡの断片化はアポトーシスによる細胞死の発生を表示する。

Claims

試料中の骨髄性細胞を、ｐ７５／ＡＩＲＭ１に対する抗体分子と接触させること、及び該ｐ７５／ＡＩＲＭ１に対する抗体分子の結合を確定することを含む、骨髄性細胞の分化段階を確定する方法。
抗体分子が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体分子である請求項１に記載の方法。
抗体分子がＩＣＬＣＮｏ．ＰＤ９９００３として寄託されているハイブリドーマから得られるＱＡ７９抗体の抗原結合部位を有するものである請求項１又は請求項２に記載の方法。
抗体分子が、ＱＡ７９抗体（ＩＣＬＣＮｏ．ＰＤ９９００３として寄託されているハイブリドーマから得られる）に由来しかつｐ７５／ＡＩＲＭ１に結合するヒト化モノクローナル抗体分子、又はｐ７５／ＡＩＲＭ１への結合をめぐってＱＡ７９抗体と競合するｐ７５／ＡＩＲＭ１に対して特異的な単離ヒト抗体である請求項１又は請求項２に記載の方法。
骨髄性細胞をｐ７５／ＡＩＲＭ１に対する抗体分子とインビトロで接触させることを含む、骨髄性細胞の増殖を阻害するため及び／又は骨髄性細胞のアポトーシスを引き起こすための方法。
ヒト骨髄性白血病の治療のための医薬の製造における、ｐ７５／ＡＩＲＭ１に対する抗体分子の使用。
抗体分子が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体分子である請求項６に記載の使用。
抗体分子が、ＩＣＬＣＮｏ．ＰＤ９９００３として寄託されているハイブリドーマから得られるＱＡ７９抗体の結合部位を有する、請求項６又は７に記載の使用。
抗体分子が、ＱＡ７９抗体（ＩＣＬＣＮｏ．ＰＤ９９００３として寄託されているハイブリドーマから得られる）に由来しかつｐ７５／ＡＩＲＭ１に結合するヒト化モノクローナル抗体分子、又はｐ７５／ＡＩＲＭ１への結合をめぐってＱＡ７９抗体と競合するｐ７５／ＡＩＲＭ１に対して特異的な単離ヒト抗体である請求項６又は請求項７に記載の使用。
ヒト骨髄性白血病の治療のための、ｐ７５／ＡＩＲＭ１に対する抗体分子を含んで成る医薬組成物。
抗体分子が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体分子である請求項１０に記載の医薬組成物。
抗体分子がＩＣＬＣＮｏ．ＰＤ９９００３として寄託されているハイブリドーマから得られるＱＡ７９抗体の抗原結合部位を有するものである請求項１０又は請求項１１に記載の医薬組成物。
抗体分子が、ＱＡ７９抗体（ＩＣＬＣＮｏ．ＰＤ９９００３として寄託されているハイブリドーマから得られる）に由来しかつｐ７５／ＡＩＲＭ１に結合するヒト化モノクローナル抗体分子、又はｐ７５／ＡＩＲＭ１への結合をめぐってＱＡ７９抗体と競合するｐ７５／ＡＩＲＭ１に対して特異的な単離ヒト抗体である請求項１０又は請求項１１に記載の医薬組成物。