ITFI990254A1 - Metodo diagnostico per il riconoscimento di cellule mieloidi normali e leucemiche, lignadi utilizzati in detto metodo e formulazioni ad uso - Google Patents
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Descrizione della Domanda di Brevetto di Invenzione dal titolo
Metodo diagnostico per il riconoscimento di cellule mieloidi normali e leucemiche, ligandi utilizzati in detto metodo e formulazioni ad uso diagnostico e terapeutico contenenti detti ligandi.
Campo dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce ad un metodo diagnostico che consente l'identificazione di cellule mieloidi normali e leucemiche in differenti stadi maturativi per mezzo di ligandi specifici per un particolare recettore recentemente caratterizzato, ai ligandi utilizzati in detto metodo come pure alle formulazioni contenenti detti ligandi utili sia a scopo diagnostico che terapeutico.
Stato dell'arte
E’ noto che la normale emopoiesi è un processo multistadio in cui lo sviluppo cellulare dipende dagli effetti di vari fattori di crescita e dall’espressione di determinati fattori di trascrizione. Il processo, nel suo insieme, è caratterizzato dall'espressione in sequenza di marcatori di membrana cellulare che permettono il riconoscimento dei vari stadi di differenziamento cellulare. Per esempio, le cellule che esprimono il marcatore CD34 includono le cellule germinali emopoietiche pluripotenti
Claims (10)
- mentre il CD33 è assente in tali cellule germinali ma è invece presente nei precursori mielomonocitici e continua ad essere espresso sia nelle cellule mieloidi che in quelle monocitiche mentre scompare nei granulociti maturi. Benché il CD33 sia un utile marcatore qualora si voglia distinguere le leucemie mieloidi da quelle linfoidi, poco si sa della sua attività funzionale. Nella rivista «The Journal Experimental Medicine Voi. 90, N°6, 20 Settembre 1999, pp. 793-802», qui riportato come riferimento, è stato identificato e descritto, da parte degli inventori di questa domanda di brevetto, un recettore con funzione inibitoria presente sulle cellule NK di cui è descritta la capacità di regolazione sulle funzioni delle cellule NK. Di tale recettore, denominato p75/AIRM1 , è stata descritta la sequenza nucleotidica qui riportata per completezza in TABELLA 1. D'altra parte, è pure noto che l'antigene delle cellule mieloidi CD33, che presenta una parziale omologia di sequenza aminoacidica con ii recettore suddetto, è espresso selettivamente dalle cellule emopoietiche in cui rappresenta un marcatore importante per lo studio della differenziazione mieloide e per la tipizzazione delle leucemie. Va inoltre ricordato che un anticorpo monoclonale anti-CD33 è stato recentemente utilizzato nella terapia di leucemie acute promielocitiche [vedi Caron et al.: Cancer 73, 1049-56 (1994); Clin, Cancer Res. 1 , 63-70 (1995) e ibidem 4, 1421-28 (1998)]. Descrizione dettagliata dell'invenzione E' stato ora sorprendentemente dimostrato dai proponenti che l'uso di ligandi, ed in particolare dell'anticorpo monoclonale QA79 [depositato presso l’Interlab Cell Line Collection (ICLC) con il n° PD99003], di cui è descritto qui di seguito l'isolamento, capaci di interagire con il recettore p75/AIRM1, consente di identificare particolari stadi di differenziazione delle cellule mieloidi. Infatti tale recettore viene espresso in uno stadio differenziativo delle cellule mieloidi più tardivo rispetto al CD33, presentando quindi un notevole interesse diagnostico e terapeutico. Infatti, alla luce di quanto sopra riferito, è evidente come, grazie all'identificazione del recettore p75/AIRM1 sia possibile definire con maggiore precisione stadi maturativi delle cellule mieloidi. Questo permette inoltre una tipizzazione più accurata delle leucemie, con possibili riflessi di tipo prognostico e terapeutico. Un effetto ancora più importante mediato dall'anticorpo monoclonale QA79 in seguito all'interazione con il recettore p75/AIRM1 è l’induzione di un arresto proliferativo e morte delle cellule leucemiche trattate con l’anticorpo stesso. Questo effetto è stato documentato "in vitro” sia su cellule mieloidi normali che leucemiche e fornisce un'importante base molecolare per uh possibile intervento terapeutico atto ad eliminare cellule leucemiche (per esempio cellule leucemiche residue dopo un trattamento chemioterapico). La presente invenzione si riferisce pertanto ad un metodo per la identificazione di cellule mieloidi normali o leucemiche grazie al’uso di ligandi specifici per il recettore p75/AIRM1, a detti ligandi ed al loro uso diagnostico o terapeutico. Per ligandi, secondo la presente invenzione, si intendono gli anticorpi monoclonali di topo o gli anticorpi "umanizzati" da questi derivati, i loro frammenti quali le molecole ricombinanti solubili "single chain Fv" (ScFv), qualsiasi altra molecola capace di riconoscere e/o legarsi specificamente al recettore p75/AIRM1 , compresi peptidi e/o formulazioni farmaceutiche. Parte sperimentale a) Preparazione del'anticorpo monoclonale (mAb) QA79. L'anticorpo monoclonale QA79 (lgG1 ) è stato ottenuto immunizzando un topo BALB/c di 5 settimane di età con cellule di un clone NK (clone LM5 con fenotipo di membrana: CD3-, CD16+, CD56+, NKp46+, NKp44+, p140+, CD94/NKG2A+). In particolare, l'immunizzazione è stata effettuata mediante 4 iniezioni intraperitoneali a cadenza settimanale, una quinta a distanza di tre giorni e sacrificio dell’animale a tre giorni di distanza dall'ultimo trattamento. Ogni trattamento prevedeva l'inoculazione di 7 milioni di cellule NK. Gli splenociti murini successivamente isolati dalla milza del topo immunizzato sono stati "fusi" con una linea cellulare di mieloma murino (chiamata P3V1) per ottenere un ibrido cellulare. Più precisamente, 15 milioni di splenociti e lo stesso numero di cellule della lìnea P3V1 sono state trattate con 0,4 mi PEG 1500 (Glicol polietilenico MW 1500) aggiungendolo lentamente (goccia a goccia) e tenendo le cellule in sospensione. Successivamente, vengono aggiunti, sempre goccia a goccia e lentamente, 5 mi di terreno di coltura (RPMI) preriscaldato a 37°C e 43 ml di RPMI addizionato di Siero fetale bovino (FCS) ad una concentrazione finale del 10%. Le cellule così risospese vengono poi trasferite (0,5ml/pozzetto) in piastre per colture cellulari da 24 pozzetti contenenti 0,5ml di in RPMl 10% FCS ed antibiotici (terreno completo) su cui erano stati fatti aderire macrofagi murini. Tali cellule vengono coltivate in un incubatore per colture cellulari a 37°C in presenza di C02 (5%). Il giorno successivo, ad ogni singolo pozzetto si aggiunge 1 ml di mezzo di coltura completo addizionato con Ipoxantina 13.6 mg/l, aminopterina 0.238 mg/l e 2 desossitimidina 0.238 mg/l (HAT: agenti selettivi che permettono la crescita solo delle cellule ibride). Nei successivi 10 giorni, il mezzo di coltura completo ed addizionato di HAT viene sostituito ogni 3 giorni e successivamente a cadenza settimanale. Successivamente, i sovranatanti di coltura degli ibridi sono stati analizzati 1 ) in immunofluorescenza indiretta per valutare l’isotipo e la reattività cellulare dell'anticorpo prodotto 2) in test funzionali di citotossicità per valutare il possibile effetto funzionale del recettore riconosciuto dall’anticorpo prodotto dall’ibrido in oggetto. Gli ibridi di interesse sono stati clonati per diluizione limite in modo da ottenere un clone producente un solo anticorpo (nella fattispecie l’anticorpo monoclonale definito QA79). Per ottenere quantità rilevanti di mAb, topi Balb/c vengono inoculati intraperitoneo (i.p.) dopo due trattamenti con pristano a distanza di sette giorni. Ad una settimana dal secondo trattamento, vengono iniettate i.p. circa sei milioni di cellule dell'ibrido clonato QA79. Dopo dieci giorni viene prelevato il liquido ascitico ed il topo viene sacrificato. L'ascite è poi trattata con ammonio solfato (concentrazione finale 40%) ed il precipitato contenente il mAb QA79 è risospeso e purificato tramite cromatografia a scambio anionico. b) Metodologia per indurre un arresto proliferativo e morte di cellule mieloidi normali e leucemiche mediante l'uso dell'anticorpo monoclonale QA79 specifico per il recettore p75/AIRM1. Cellule CD34+ (purificate da sangue di cordone ombelicale) sono state coltivate in piastre per colture cellulari da 96 pozzetti a fondo piatto, a 20000 cellule per pozzetto, in presenza di terreno completo addizionato con I fattori di crescita emopoietici GM-CSF (100ng/ml) e SCF (50ng/ml). Cellule leucemiche purificate da pazienti con leucemia mieloide cronica (CML) sono state coltivate, in piastre per colture cellulari da 6 pozzetti, a 0.5 milioni di cellule per pozzetto, in presenza di terreno completo addizionato di solo GM-CSF (100ng/ml). I test di induzione di arresto proliferativo/morte cellulare sono stati eseguiti su ambedue i tipi cellulari in piastre da 96 pozzetti, ai quali erano state legate immunoglobuline di capra (1μg/ml) specifiche per anticorpi di topo. Ai pozzetti così pretrattati erano aggiunte 20000 cellule per pozzetto che venivano coltivate, con il terreno di coltura completo addizionato dei fattori di crescita sopra menzionati. Ai pozzetti di coltura venivano aggiunte concentrazioni saturanti (0.5 μg) del mAb QA79, specifico per il recettore p75/AIRM1, o di altri mAb di controllo. Il fenotipo e la conta numerica delle cellule sono stati effettuati nelle varie condizioni di coltura, a cadenza giornaliera dal quarto all'ottavo giorno. La capacità proliferativa delle cellule mieloidi, a seguito del trattamento con differenti mAbs, è stata inoltre valutata con il test dell'incorporazione della base azotata timidina, marcata con l’isotopo radioattivo dell'idrogeno trizio (3H). In maggior dettaglio, le cellule mieloidi purificate da pazienti con CML, coltivate ed esposte all'effetto dell'anticorpo come descritto sopra, sono state prelevate ad intervalli di tempo di 3,4, 5,7 giorni e coltivate in presenza di 1 μCi/pozzetto di 3H-timidina per 16h .e raccolte mediante filtrazione su "Titertek celi harvester 550". La misura della radioattività incorporata dagli acidi nucleici delle cellule in esame è stata valutata mediante scintillazione liquida per il conteggio di emissioni β. La proliferazione cellulare era fortemente inibita in caso di trattamento delle cellule mieloidi con l'anticorpo QA79, ma non con anticorpi di controllo specifici per altri antigeni di membrana, c) Valutazione della morte indotta dal trattamento delle cellule mieloidi con il mAb QA79. L'induzione della morte cellulare è stata valutata sulla base di reattività di membrana delle cellule con l’annessina V. Questa reattività indica l'inizio di un processo di morte cellulare per apoptosi. L'espressione di annessina V è stata valutata mediante l'uso di anticorpi specifici e tecniche di immunofluorescenza indiretta ed analisi citofluorimetrica.Rivendicazioni 1. Metodo diagnostico per l'identificazione dello stadio differenziativo di cellule mieloidi normali e leucemiche mediante la determinazione della presenza del recettore p75/AIRM1 con opportuni ligandi.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui i ligandi sono: anticorpi monoclonali di topo o anticorpi "umanizzati" da questi derivati, loro frammenti o molecole capaci di riconoscere e/o legarsi specificamente al recettore p75/AIRM1.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 2 in cui detti frammenti sono molecole ricombinanti solubili «single chain Fv».
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 2 in cui le molecole capaci di riconoscere e/o legarsi specificamente al recettore p75/AIRM1 sono peptidi e/o formulazioni farmaceutiche.
- 5. Processo per l’isolamento di un anticorpo monoclonale, come indicato nella rivendicazione 2, in cui: a) si immunizza un topo Balc/c con cellule di un clone NK-umano con fenotipo di membrana: CD3-, CD16+, CD56+, NKp46+, Nkp44+, p140+, CD94/NKG2A+; b) si isolano gli splenociti murini e si fondono con la linea cellulare di mieloma murino P3V1 ; c) le cellule ottenute vengono coltivate in incubatore a 37°C in presenza di C02 5%; d) si clonano le cellule in diluizione limite fino ad ottenere l'anticorpo monoclonale: e) il sovranatante viene concentrato per precipitazione con (NH4)2S04 (40%) e l’anticorpo viene purificato per cromatografia a scambio anionico.
- 6. Anticorpo monoclonale ottenuto secondo il processo descritto nella rivendicazione 5 depositato con il numero PD 99003.
- 7. Metodo secondo la rivendicazione 2 in cui il ligando è l'anticorpo monoclonale secondo la rivendicazione 6.
- 8. Coniugato costituito da un ligando, come definito nella rivendicazione 2 e da un radionuclide, oppure tossina, emitossina o altri composti capaci di potenziarne l’effetto citocida per le cellule leucemiche.
- 9. Uso dei ligandi secondo le rivendicazioni 2 - 4 per la preparazione di formulazioni farmaceutiche per il trattamento di patologie umane.
- 10. Uso secondo la rivendicazione 9 in cui dette patologie sono le leucemie mieloidi.
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