CN115925945A - 抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抗TIGIT人源化抗体或其抗原结合片段及其应用。该抗体或其抗原结合片段具有很好的结合活性和阻断活性,抗肿瘤效果显著,有效延长小鼠生存期,显著降低健康人PBMC和肿瘤浸润淋巴细胞中Treg细胞比例,稳定性好,成药性好,能够广泛用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病。
Description
本申请要求申请日为2021年9月24日的中国专利申请(申请号:202111123523.1,发明名称:抗TIGIT人源化抗体或其抗原结合片段及其应用)的优先权,该中国专利申请的全部内容通过引用整体结合到本申请。
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体而言,涉及抗TIGIT人源化抗体或其抗原结合片段及其应用。
背景技术
TIGIT(T cell Ig and ITIM domain,也称为WUCAM,Vstm3,VSIG9)是含ITT结构域(免疫球蛋白酪氨酸尾部基序结构域)及ITIM结构域(免疫受体酪氨酸抑制基序结构域)的T细胞和NK细胞共有的抑制性受体,属于I型跨膜蛋白,包括IgV胞外段以及免疫球蛋白酪氨酸尾巴样磷酸化片段。该基因在2008年由Genentech公司的研究组发现。该研究组通过在基因组中搜索符合特定条件(①表达在免疫细胞上;②属于I型跨膜蛋白;③胞外带有免疫球蛋白结构域;④胞内带有免疫调节结构域)的基因而寻找到这个基因。通过序列比对,发现这个蛋白隶属于一个较大的PVR蛋白家族,其成员包括与TIGIT竞争配体的活化型受体CD226和CD96,以及它们的配体PVR,等等。2012年,TIGIT分子的晶体结构通过X射线衍射得到解析,研究发现免疫细胞上表达的TIGIT首先形成同一细胞上的顺式同源二聚体,然后该二聚体各通过一侧的一个TIGIT分子结合一个PVR分子,并且发现预先形成的同源二聚体对于TIGIT-PVR相互作用是必须的,因为如果预先将TIGIT-TIGIT结合界面的氨基酸进行突变,则TIGIT-PVR的相互作用会被破坏。
TIGIT分子较为保守,人类TIGIT分子与猴、小鼠的TIGIT分别具有88%、58%的序列同源性。TIGIT在免疫细胞如T细胞,NK细胞和树突细胞表面表达,与癌细胞表面的PVR(脊髓灰质炎病毒受体,CD155)结合,抑制免疫细胞的活性。TIGIT的主要配体为CD155(Necl-5,PVR脊髓灰质炎病毒受体)以及CD112(PVRL2,Nectin-2)。其中又以与CD155的结合亲和力最高(3.15nM,Kd),两个TIGIT分子与两个CD155分子形成四聚体“锁钥结构”(TIGIT的Try113与CD155的AX6G,以及CD155的Phe128和TIGIT的AX6G分别形成“钥-锁”)。这两个配体同时也是CD226(DNAM-1)的配体,CD226与TIGIT竞争,刺激T细胞活性。配体与TIGIT之间的相互作用打败了CD226,使免疫活性受到抑制,肿瘤细胞上调CD155和CD122以逃避免疫介导的破坏作用。
因此,对TIGIT具有特异性的拮抗性抗体可抑制CD155和CD112诱导的T细胞反应且增强抗肿瘤免疫,开发能够特异性结合TIGIT的抗体对预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是开发与TIGIT蛋白高亲和力和特异性结合的抗人TIGIT抗体,并进行人源化改造,以降低抗体免疫源性风险,同时保持抗体的功能活性。
本发明提供了抗TIGIT人源化抗体或其抗原结合片段,所述抗体包含轻链CDR区和重链CDR区,轻链CDR区由LCDR1、LCDR2、LCDR3组成,重链CDR区由HCDR1、HCDR2、HCDR3组成,LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:29~31或SEQ ID NO:32~34,HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:35~37或SEQ ID NO:38~40,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5~15或SEQ ID NO:21~28任一所示。
本发明还提供了核酸,所述核酸编码所述抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了载体,所述载体包含所述核酸。
本发明还提供了细胞,所述细胞携带所述核酸、含有所述载体或表达所述抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了生产所述抗体或其抗原结合片段的方法,包括:在培养基中培养所述细胞;以及从培养基中或从所培养的细胞中回收如此产生的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了药物组合物,所述组合物含有所述抗体或其抗原结合片段、或所述核酸、或所述载体或所述细胞。
本发明还提供了所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述载体、所述细胞、所述药物组合物在制备用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病的药物中的应用。
本发明还提供了用作药物的前面任一所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物;在一些技术方案中,所述药物用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病。
本发明还提供一种预防或治疗疾病的方法,所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的前面任一所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物;在一些技术方案中,所述疾病为免疫性疾病、或肿瘤相关疾病。
上述抗TIGIT人源化抗体与TIGIT具有较高的亲和力,且具有多方面的功能特性,可单独或与其它试剂组合用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是不同亚型anti-TIGIT抗体减少Balb/c小鼠中CT26结肠癌的平均肿瘤体积结果图。
图2是不同亚型anti-TIGIT抗体对Balb/c小鼠生存期的影响结果图。
图3是TIGIT-5鼠单抗、3TIGIT-16鼠单抗减少hTIGIT knock in小鼠中CT26结肠癌的平均肿瘤体积结果图。
图4是TIGIT-5鼠单抗、3TIGIT-16鼠单抗对hTIGIT knock in小鼠生存期的影响结果图。
图5是hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体减少hTIGIT knock in小鼠中CT26结肠癌的平均肿瘤体积结果图。
图6是mIgG2a亚型的抗TIGIT人源化抗体减少hTIGIT knock in小鼠中CT26结肠癌的平均肿瘤体积结果图。
图7是mIgG2a亚型的抗TIGIT人源化抗体对hTIGIT knock in小鼠生存期的影响结果图。
图8a是单管染色结果图;图8b是分析步骤图;图8c是CD4+/CD8+T细胞的比值图;图8d是Treg细胞的比值图;图8e是以人外周血单个核细胞为靶细胞的ADCC结果图。
图9是更多样品的检测结果图。
图10a是抗TIGIT人源化抗体对肿瘤细胞模型小鼠组织中T细胞的影响结果图;图10b是对抗TIGIT人源化抗体肿瘤细胞模型小鼠组织中CD3+T细胞和CD4+T细胞的影响结果图。
图11a是抗TIGIT人源化抗体的SEC-HPLC检测酸结果图;图11b是抗TIGIT人源化抗体的SEC-HPLC检测碱处理结果图;图11c是抗TIGIT人源化抗体的CE-SDS-NR检测酸结果图;图11d是抗TIGIT人源化抗体的CE-SDS-NR检测碱处理结果图;图11e是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测酸处理后酸性峰变化结果图;图11f是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测酸处理后主峰变化结果图;图11g是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测酸处理后碱峰变化结果图;图11h是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测碱处理后酸性峰变化结果图;图11i是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测碱处理后主峰变化结果图;图11j是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测碱处理后碱峰变化结果图。
图12a是抗TIGIT人源化抗体的SEC-HPLC检测反复冻融处理结果图;图12b是抗TIGIT人源化抗体的CE-SDS-NR检测反复冻融处理结果图;图12c是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测反复冻融处理后酸性峰变化结果图;图12d是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测反复冻融处理后主峰变化结果图;图12e是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测反复冻融处理后碱性峰变化结果图。
图13a是抗TIGIT人源化抗体的SEC-HPLC检测高温处理结果图;图13b是抗TIGIT人源化抗体的SEC-HPLC检测4℃对照处理结果图;图13c是抗TIGIT人源化抗体的CE-SDS-NR检测高温处理结果图;图13d是抗TIGIT人源化抗体的CE-SDS-NR检测4℃对照处理结果图;图13e是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测高温处理后酸性峰变化结果图;图13f是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测高温处理后主峰变化结果图;图13g是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测高温处理后碱峰变化结果图;图13h是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测4℃对照处理后酸性峰变化结果图;图13i是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测4℃对照处理后主峰变化结果图;图13j是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测4℃对照处理后碱峰变化结果图。
图14a是hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体316H1L1在压力测试后的体外结合活性图;图14b是hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体15H9L2在压力测试后的体外结合活性图;图14c是hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体15H10L3在压力测试后的体外结合活性图;其中,R0750代表316H1L1,R0771代表15H9L2,R0774代表15H10L3。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
因此,旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述,而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及抗TIGIT人源化抗体或其抗原结合片段,所述抗体包含轻链CDR区和重链CDR区,轻链CDR区由LCDR1、LCDR2、LCDR3组成,重链CDR区由HCDR1、HCDR2、HCDR3组成,LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:29~31或SEQ ID NO:32~34,HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:35~37或SEQ ID NO:38~40,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5~15或SEQ ID NO:21~28任一所示。在一些可选实施方式中,所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:35、SEQID NO:36和SEQ ID NO:37,且所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5~15任一所示;在一些可选实施方式中,所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。在另一些可选实施方式中,所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:32、SEQID NO:33和SEQ ID NO:34,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40,且所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21~28任一所示;在一些可选实施方式中,所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
该抗体或其抗原结合片段的一个重要优点在于其与TIGIT具有较高的体外结合活性和种属交叉结合活性。
该抗体或其抗原结合片段的一个重要优点在于其具有阻断PVR与TIGIT结合的活性。
该抗体或其抗原结合片段的一个重要优点在于其具有显著的抗肿瘤作用。
该抗体或其抗原结合片段的一个重要优点在于其能够降低Treg细胞比例。
因具有上述一个或更多个特性,该抗体或其抗原结合片段可作为抗体药物使用。
在本发明中,术语“抗体或其抗原结合片段”是结合特定抗原的蛋白,其泛指包含互补决定区(CDR区)的一切蛋白及蛋白片段。“抗体”特别指全长抗体。“全长抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体,术语“抗原结合片段”是包含抗体CDR的一部分或全部的物质,其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性,因为其结合至靶抗原,且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。在一些实施方式中,抗原结合片段具有特异性识别并结合TIGIT的作用。
“人源化抗体”是保留非人抗体的反应性,同时在人中具有较低免疫原性的抗体。例如,可以通过保留非人抗体CDR区并用人抗体对应物(即,恒定区以及可变区的框架部分)替换抗体的其余部分构建获得。
在本发明中,术语“特异性结合”或其类似表述是指抗体或其抗原结合片段对预先确定的抗原上的表位的结合。通常,抗体或其抗原结合片段以大约小于10-6M,例如大约小于10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合。KD是指解离速率与结合速率的比率(koff/kon),该量可通过本领域技术人员熟悉的方法测量。
在本发明中,术语“互补性决定区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。有三种重链CDR和三种轻链CDR。此处,取决于情况,术语“CDR”和“CDRs”用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或其抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。
在本发明中,重链的互补决定区用HCDR表示,轻链的互补决定区用LCDR表示。本领域常用的CDR标示方法包括:Kabat编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在他们的“免疫学蛋白质序列”(Sequences of Proteins of Immunological Interest)的汇编中,轻链(λ,κ)可变区和抗体重链的氨基酸序列,以及T细胞受体的可变区(α,β,γ,δ)对齐并编号。在过去的几十年中,序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建,Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明采用Kabat注释标准标示CDR区,但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。
在本发明中,术语“特异性识别”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”或其类似表述是指抗体或其抗原结合片段对预先确定的抗原上的表位的结合。通常,抗体或其抗原结合片段以大约小于10-6M,例如大约小于10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合。
在本发明中,所提供的抗体或其抗原结合片段特异性识别的对象可以为多种属来源的TIGIT,例如人、小鼠、猴(如食蟹猴cynomolgus monkey)。
在一些实施方式中,前面任一所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~4或SEQ ID NO:16~20任一所示。在一些实施方式中,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,或如SEQ ID NO:5~13、15任一所示,并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,或如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4任一所示;或者所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21~28任一所示,且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16~20任一所示;
在一些实施方式中,所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列如下表1所示:
表1
在一些实施方式中,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示,或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
在一些实施方式中,所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区,所述重链恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD中的任一种的恒定区序列。在一些实施方式中,所述重链恒定区序列选自IgG1。
在一些实施方式中,所述轻链恒定区为κ或λ链。在一些实施方式中,所述轻链恒定区序列选自κ链。
在一些实施方式中,所述重链恒定区和轻链恒定区的种属来源选自牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人中的任一种。在一些实施方式中,所述重链恒定区和轻链恒定区的种属来源为人。
在一些实施方式中,所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:45~48任一所示,所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50所示。在一些实施方式中,所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示,所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。在一些实施方式中,所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示,所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示。
在一些实施方式中,所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:48所示。在一些实施方式中,所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示。
在一些实施方式中,前面任一项所述抗体,其重链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO:53所示,轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。在一些实施方式中,前面任一项所述抗体,其重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示,轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。在一些实施方式中,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示,且轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示;和所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,且重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:53或SEQ IDNO:45所示。在一些实施方式中,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示,且轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示;和所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示,且重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:45所示。在一些实施方式中,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,且轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示;和所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:13所示,且重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:45所示。在一些实施方式中,所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示,且轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示。
在一些实施方式中,所述抗原结合片段为F(ab’)2、Fab、scFv以及双特异抗体中的任一种。
在本发明中,术语“F(ab’)2”含有两条轻链和两条含有CH1与CH2结构域之间的恒定区的部分的重链,以便在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段从而由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
在本发明中,术语“双特异性抗体”是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体,并且可通过多种方法产生,包括,但不限于杂交瘤的融合或Fab’片段的连接。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位,所述表位存在于相同或不同的蛋白质靶标上。
本发明还涉及核酸,所述核酸编码所述抗体或其抗原结合片段。
在本发明中,核酸通常是RNA或DNA,核酸分子可以是单链或双链的,但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时,核酸是“有效连接的”。例如,如果启动子或增强子影响编码序列的转录,那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。当其连入载体时优选采用DNA。此外,鉴于抗体为膜蛋白,所以核酸通常带有信号肽序列。
在一些实施方式中,所述核酸包括:编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一核酸,和/或编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二核酸。
本发明还涉及载体,所述载体包含所述核酸。
在本发明中,术语“载体(vector)”是可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
本发明还涉及细胞,所述细胞携带所述核酸、含有所述载体或表达所述抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及生产所述抗体或其抗原结合片段的方法,包括:在培养基中培养所述细胞;以及从培养基中或从所培养的细胞中回收如此产生的抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及药物组合物,所述组合物含有所述抗体或其抗原结合片段、或所述核酸、或所述载体或所述细胞。
在本发明中,术语“药物组合物”是以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在,并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。
在一些实施方式中,所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在本发明中,术语“药学可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等,用来延长抗体的保存限期或效力。
本发明还涉及所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述载体、所述细胞、所述药物组合物在制备用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病的药物中的应用。
本发明还提供了用作药物的前面任一所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物;在一些技术方案中,所述药物用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病。
本发明还提供一种预防或治疗疾病的方法,所述方法,包括向有需要的个体施用治疗有效量的前面任一所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物;在一些技术方案中,所述疾病为免疫性疾病、或肿瘤相关疾病;
在一些实施方式中,前面任一项所述疾病为与人TIGIT相关的疾病,更优选是T细胞功能障碍性疾病。
在一些实施方式中,本发明还提供用于检测或测定人TIGIT的试剂,所述试剂包含前面任一项所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。
本发明具有以下有益效果:
本发明抗人TIGIT的人源化抗体的结合活性和阻断活性好,抗肿瘤效果显著,有效延长小鼠生存期,显著降低健康人PBMC和肿瘤浸润淋巴细胞中Treg细胞比例,稳定性好,成药性好,能够广泛用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1抗人TIGIT抗体人源化
专利申请号为202011324100.1的中国专利申请中的TIGIT-5鼠单抗(VL、VH序列如SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42所示)和3TIGIT-16鼠单抗(VL、VH序列如SEQ ID NO:43、SEQID NO:44所示)对CHO-hTIGIT、健康人PBMC、cynoTIGIT的结合亲和力好,阻断CHO-hTIGIT、CHO-hPVR与hPVR-hFc的结合,阻断肿瘤细胞、CHO-CD112与TIGIT的结合,与人TIGIT重组蛋白的结合动力学常数均在pM级别,并且有较好的活化NK92-hTIGIT杀伤U2-OS能力;因此,本实施例对上述TIGIT-5鼠单抗和3TIGIT-16鼠单抗进行人源化,具体方法如下:
通过互补决定区移植(CDR-grafting)的方法进行人源化改造。首先,使用MOE(Molecular Operating Environment)软件对TIGIT-5鼠单抗、3TIGIT-16鼠单抗的Fv区进行抗体同源建模。根据模型结构,分析能影响抗原结合区域构象稳定的关键组成氨基酸残基。随后,检索人免疫球蛋白数据库,搜索人种系抗体库中与TIGIT-5、3TIGIT-16同源性高的人IGVH、IGVK序列作为人源化改造模板。分别将TIGIT-5、3TIGIT-16与匹配的人IGVH、IGVK序列进行比对,重点分析原始鼠单抗上能影响抗原结合区域构象稳定的关键组成氨基酸残基与人IGVH、IGVK序列不一致的位点,并在模型中观察是否能进行人源化的替换。根据不同的人源化替换程度,基于一条母本序列可以同时产生多条人源化后的序列。
对于TIGIT-5鼠单抗,人源化后的VL序列(VL1-VL4)如下表2-1所示,人源化后的VH序列(VH1-VH11)如下表2-2所示:
表2-1
表2-2
对于3TIGIT-16鼠单抗,人源化后的VL序列(VL5-VL9)如下表3所示,人源化后的VH序列(VH12-VH19)如下表4所示:
表3
表4
将不同的人源化VL、VH进行组合又可以产生不同的人源化抗体分子。不同组合方式主要考虑的是人源化程度高低及人源化后抗体活性维持之间的平衡。简单而言,将人源化程度最高的VL、VH进行配对,可以得到人源化程度最高的抗体分子,这意味着可能较低的免疫原性,但是人源化程度高可能会导致改造后分子的活性降低(影响母本抗体活性的关键氨基酸残基被替换为人源化的氨基酸,导致改造后抗体的抗原结合区域发生变化)。反之,将人源化程度最低的VL、VH进行配对,可以得到与母本抗体更一致的功能活性(因为大部分的关键氨基酸残基都被保留),但是人源化程度也较低,可能会面临较高免疫原性的风险。这是一个平衡的过程,在制备人源化抗体过程中需要进行多种VL、VH组合表达制备,并进一步通过体内、外的功能试验进行验证,最终筛选合适的人源化抗体分子。
对于TIGIT-5鼠单抗,人源化后得到的抗TIGIT人源化抗体的氨基酸序列如下表5所示:
表5TIGIT-5鼠单抗人源化后得到的抗TIGIT人源化抗体的氨基酸序列
对于3TIGIT-16鼠单抗,人源化后得到的抗TIGIT人源化抗体的氨基酸序列如下表6所示:
表6 3TIGIT-16鼠单抗人源化后得到的抗TIGIT人源化抗体的氨基酸序列
以上抗TIGIT人源化抗体的可变区构建完整抗体所用恒定区的氨基端序列如下表7所示:
表7.抗体恒定区序列
上述表5和表6中所列的具体编号的人源化抗体(例如R0774(也标识为15H10L3)),其重链恒定区为含K214R/D356E/L358M突变的hIgG1(氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示),轻链恒定区为Hu-CL-κ(氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示)。示例性地,人源化抗体:R0774(也标识为15H10L3)的全长氨基酸序列为:
R0774重链氨基酸序列(SEQ ID NO:51):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
R0774轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:52):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例2抗TIGIT人源化抗体制备
利用常规方法进行抗体的制备,表达上清采用ProA亲和层析纯化。过程如下:
使用AKTA avant 150层析设备,用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)平衡层析柱(如MabSelectSuRe LX,GE),加载样品至层析柱,使目标蛋白吸附在层析柱上而其他杂质穿透分离。完成上样后使用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)再次冲洗层析柱,随后使用洗脱缓冲液(20mM NaAc,pH=3.4)洗脱目标蛋白,收集管中预先加入中和缓冲液(1M Tris,pH8.0),中和缓冲液的加入体积根据洗脱样品的预估含量而定,一般加入10%洗脱体积量。
样品使用Biotek-Epoch-Take-3进行浓度测定,利用A280方法检测抗体浓度,即以消光系数E.C.=1.37,光程=0.05mm(Take-3板不同孔光程有细微差异,会自动校正),通过设备检测样品吸光值,按照Lambert-Beer law计算抗TIGIT人源化抗体的浓度。样品浓度过低则需要进行超滤浓缩,使用超滤浓缩管(Ultra-15Centrifugal FilterDevices,30kD)按照说明书提供的通用操作方法,将样品浓度浓缩至>0.5mg/ml;收集浓缩端样品,0.22um无菌针头滤器除菌过滤(科百特,PES,0.22um,直径13mm)后分装冻存备用。
抗TIGIT人源化抗体的人源化程度和纯度结果如表8和表9所示,结果显示:本实施例制备的抗TIGIT人源化抗体的人源化程度、滴度和纯度结果都很好。
表8
备注:表8中,其中纯度列中,最左侧的值为聚体百分比,最右侧的值为碎片百分比,中间的值为抗体单体百分比,“-”表示值为0%,例如“1.85%/98.15%/-”,其表明抗体溶液中,聚体百分比为1.85%,抗体单体纯度百分比98.15%,碎片百分比为0%;
表9
备注:表9中,其中纯度列中,最左侧的值为聚体百分比,最右侧的值为碎片百分比,中间的值为抗体单体百分比,例如“4.54%/94.62%/0.84%”,其表示抗体溶液中,聚体百分比为4.54%,抗体单体纯度百分比94.62%,碎片百分比为0.84%”;
实施例3抗TIGIT人源化抗体验证
对以上得到的抗TIGIT人源化抗体进行体外结合活性、种属交叉结合活性和阻断活性检测,方法如下:
(1)体外结合活性检测:
为了验证抗TIGIT人源化抗体结合CHO-hTIGIT能力,将待检测的重组表达全长人TIGIT的CHO工程细胞CHO-hTIGIT细胞进行细胞计数,300g离心5min,FCM buffer重悬,调整细胞密度至4E+06个/mL备用。使用FCM buffer将待测样品(包括阳性对照组、TIGIT-5鼠单抗(R0435)、3TIGIT-16鼠单抗(R0518)、抗TIGIT人源化抗体;其中R0300-CH2a来源于专利WO2017053748(A2)中tiragolumab,R0300-CH2a是将Fc区替换为mIgG1的Fc区)稀释至20μg/mL,然后使用FCM buffer进行3倍系列稀释12个浓度点。按照实验设计分别96孔V型板每孔加入50μL抗体和50μL细胞(每株细胞加入到96孔V型板中的量为2E+05个/孔),冰上避光孵育30min。离心(300g/5min),弃上清,加入200μL FCM buffer洗涤一次,离心(300g/5min),弃上清。加入二抗(PE Goat anti-mouse IgG,1:500稀释)至96孔V型板(按照100μL/孔),冰上避光孵育30min。离心(300g/5min),弃上清,加入200μL FCM buffer洗涤一次,离心(300g/5min),弃上清。加入100μL 1×PBS重悬,上机检测。
(2)种属交叉结合活性检测:
为了验证抗TIGIT人源化抗体与猴TIGIT结合能力,专门进行以下实验:将待检测的重组表达全长cynoTIGIT的CHO工程细胞CHO-cynoTIGIT细胞进行细胞计数,300g离心5min,FCM buffer重悬,调整细胞密度至4E+06个/mL备用。使用FCM buffer将待测样品(包括阳性对照组R0300-CH2a、R0435、R0518、抗TIGIT人源化抗体)稀释至20μg/mL,然后使用FCM buffer进行3倍系列稀释12个浓度点。按照实验设计分别96孔V型板每孔加入50μL抗体和50μL细胞(每株细胞加入到96孔V型板中的量为2E+05个/孔),冰上避光孵育30min。离心(300g/5min),弃上清,加入200μL FCM buffer洗涤一次,离心(300g/5min),弃上清。加入二抗(PE Goat anti-mouse IgG,1:500稀释)至96孔V型板(按照100μL/孔),冰上避光孵育30min。离心(300g/5min),弃上清,加入200μL FCM buffer洗涤一次,离心(300g/5min),弃上清。加入100μL1×PBS重悬,上机检测。
(3)阻断活性检测:
为了验证抗TIGIT人源化抗体能够阻断CHO-hTIGIT与hPVR-hFc结合能力,专门进行以下实验:将待检测的重组表达全长人TIGIT的CHO工程细胞CHO-hTIGIT细胞进行细胞计数,300g离心5min,FCM buffer重悬,调整细胞密度至4E+06个/mL备用。使用FCM buffer将待测样品(包括阳性对照组R0300-CH2a、R0435、R0518、抗TIGIT人源化抗体)稀释至20μg/mL,然后使用FCM buffer进行3倍系列稀释12个浓度点;使用FCM buffer将配体蛋白hPVR-hFc稀释至20μg/mL。按照实验设计分别96孔V型板每孔加入50μL抗体和50μL细胞(每株细胞加入到96孔V型板中的量为2E+05个/孔),冰上避光孵育30min。加入配体蛋白至96孔V型板(按照50μL/孔),冰上避光孵育30min。离心(300g/5min),弃上清,加入200μL FCM buffer洗涤一次,离心(300g/5min),弃上清。加入二抗(PE anti-human IgG Fc,1:500稀释)至96孔V型板(按照100μL/孔),冰上避光孵育30min。离心(300g/5min),弃上清,加入200μL FCMbuffer洗涤一次,离心(300g/5min),弃上清。加入100μL1×PBS重悬,上机检测。
抗TIGIT人源化抗体的体外结合活性、种属交叉结合活性和阻断活性检测结果如表10和表11所示,结果显示:大部分抗TIGIT人源化抗体均能维持与母本相似的体外结合活性、种属交叉结合活性和阻断活性。
表10
注:N/A:活性很弱,无法计算。
表11
注:N/A:活性很弱,无法计算。
实施例4抗TIGIT人源化抗体的体内功能评估
1、不同亚型anti-TIGIT抗体对CT26小鼠结肠癌的体内抗肿瘤药效评价
(1)实验目的:在CT26小鼠结肠癌皮下移植瘤模型中比较不同亚型anti-TIGIT抗体R0226(mIgG2a)【R0226是来源于Oncomed,OMP-313R12,WO2016191643(A2)】,R0564(mIgG1)【R0564是R0226的mIgG1亚型】,R0565(mIgG2a DLE)【R0565是R0226的mIgG2a-DLE亚型】的抗肿瘤作用,同时设置同型对照组R0513(Isotype-mIgG2a)。
(2)实验材料:Balb/c小鼠,雌性,6-8周(来源:北京维通利华实验技术有限公司,合格证号:1100112011045713);CT26细胞(上海细胞库,目录号TCM37);RPMI 1640培养基(Gibco,11875085),FBS(Gibco,10091-148),0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco,25200056),青霉素-链霉素(Gibco,15140122),DMSO(Sigma,D2650),DPBS(Hyclone,SH30028.02)。
(3)仪器设备:电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司,JA12002),游标卡尺(上海美耐特实业有限公司,MNT-150T),显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司,BDS200),医用离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司,L530R),数显恒温水浴锅(普瑞斯机械有限公司,HH-S),二氧化碳培养箱(日本松下健康医疗器械株式会社,MCO-18AC),生物安全柜(广州千江实验科技有限公司,ACZ-451),细胞技术器(上海睿钰生物,IC1000)。
(4)实验方法
1)细胞培养:将小鼠结肠癌细胞(CT26)培养在含有10%胎牛血清(FBS)、与1%青霉素-链霉素(1:1)的RPMI 1640培养基中。
2)接种:收集对数生长期的CT26细胞,预冷的DPBS洗两次,调节细胞浓度为1×106/mL。取雌性Balb/c小鼠,皮下接种CT26细胞,接种体积为0.1mL/小鼠,即1×105/小鼠。
3)给药:接种当天记为第0天(D0),当平均瘤体积达到60-80mm3,即可对小鼠按瘤体积随机分组,第13天(D13),将小鼠按瘤体积随机分为4组,每组8只,开始给药(CT26肿瘤模型给药剂量,方式以及频率如表12所示)。
表12
注:给药体积按动物体重调整(10L/g);如给药期间体重下降超过15%,给药方案将做调整。另外,表中,i.p.表示腹腔注射,Q3D*4表示每3天给药1次,共给药4次。
4)观察记录:
D13开始测量肿瘤体积并记录小鼠体重,之后每周2次记录体重并用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。以公式:(1/2)×长径×(短径)2计算肿瘤体积。每只小鼠达到实验终点时(体重下降20%或肿瘤体积超过2000mm3达到仁慈终点),CO2窒息法处死小鼠,记录生存曲线。
5)数据计算、统计与分析:
两组之间比较可用独立样本T检验。3组以上比较应用One-Way ANOVA。如果F值显示有显著性差异,可进行多组间的事后分析。数据使用Prism GraphPad处理,当p<0.05表示统计学显著性差异。肿瘤体积V=0.5a×b2,a和b分别为肿瘤的长短径。肿瘤生长抑制TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100,Ti为第i天治疗组的平均瘤体积,T0为治疗开始时治疗组的平均瘤体积,Vi为第i天溶剂对照组的平均瘤体积,V0为治疗开始时溶剂对照组的平均瘤体积。
(5)实验结果
不同亚型anti-TIGIT抗体减少Balb/c小鼠中CT26结肠癌的平均肿瘤体积结果如表13和图1所示,不同亚型anti-TIGIT抗体对Balb/c小鼠生存期的影响结果如图2所示,结果显示:anti-TIGIT抗体mIgG2a亚型R0226(TGI=88.5%)、mIgG2a DLE亚型R0565(TGI=91.7%)的生存期及抗肿瘤作用明显优于mIgG1亚型R0564(TGI=44.6%)。
表13
注:表13中,Isotype代表同型对照组R0513(Isotype-mIgG2a),R0226代表R0226(mIgG2a),R0564代表R0564(mIgG1),R0565代表R0565(mIgG2a DLE)。
2、TIGIT-5鼠单抗、3TIGIT-16鼠单抗对CT26小鼠结肠癌的体内抗肿瘤药效评价
(1)实验目的:在CT26小鼠结肠癌皮下移植瘤模型中研究mIgG2a亚型的TIGIT-5鼠单抗(R0435)、3TIGIT-16鼠单抗(R0518)的药效,同时设置同型对照组(R0513)和阳性对照组(R0300-CH2a)。
(2)实验材料:hTIGIT Knock in小鼠,雌性,6-8周(Balb/c背景,来源:江苏集萃药康生物科技股份有限公司,合格证号:202008518);CT26细胞(上海细胞库);RPMI 1640培养基(Gibco,11875085),FBS(Gibco,10091-148),0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco,25200056),青霉素-链霉素(Gibco,15140122),DMSO(Sigma,D2650),DPBS(Hyclone,SH30028.02)。
(3)仪器设备:电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司,JA12002),游标卡尺(上海美耐特实业有限公司,MNT-150T),显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司,BDS200),医用离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司,L530R),数显恒温水浴锅(普瑞斯机械有限公司,HH-S),二氧化碳培养箱(日本松下健康医疗器械株式会社,MCO-18AC),生物安全柜(广州千江实验科技有限公司,ACZ-451),细胞计数器(上海睿钰生物,IC1000)。
(4)实验方法
1)细胞培养:将小鼠结肠癌细胞(CT26)培养在含有10%胎牛血清(FBS)、与1%青霉素-链霉素(1:1)的RPMI 1640培养基中。
2)接种:收集对数生长期的CT26细胞,预冷的DPBS洗两次,调节细胞浓度为2×106/mL。取雌性hTIGIT小鼠,皮下接种CT26细胞,接种体积为0.1mL/小鼠,即2×105/小鼠。
3)给药:接种当天记为第0天(D0),当平均瘤体积达到60-80mm3,即可对小鼠按瘤体积随机分组,第8天(D8),将小鼠按瘤体积随机分为4组,每组9只,开始给药(CT26肿瘤模型给药剂量,方式以及频率如表14所示)。
表14
组别 | 剂量(mg/kg) | 给药体积(μL/g) | 给药途径 | 给药频率 |
Isotype-m | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
R0300-CH2a | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
R0435 | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
R0518 | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
注:表14中,给药体积按动物体重调整(10L/g);如给药期间体重下降超过15%,给药方案将做调整。Isotype-m代表同型对照组(R0513)。另外,表中,i.p.表示腹腔注射,Q3D*4表示每3天给药1次,共给药4次。
4)观察记录:
D8开始测量肿瘤体积并记录小鼠体重,之后每周2次记录体重并用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。以公式:(1/2)×长径×(短径)2计算肿瘤体积。每只小鼠达到实验终点时(体重下降15%或肿瘤体积超过2000mm3达到仁慈终点),CO2窒息法处死小鼠,记录生存曲线。
5)数据计算、统计与分析:
两组之间比较可用独立样本T检验。3组以上比较应用One-Way ANOVA。如果F值显示有显著性差异,可进行多组间的事后分析。数据使用Prism GraphPad处理,当p<0.05表示统计学显著性差异。肿瘤体积V=0.5a×b2,a和b分别为肿瘤的长短径。肿瘤生长抑制TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100,Ti为第i天治疗组的平均瘤体积,T0为治疗开始时治疗组的平均瘤体积,Vi为第i天溶剂对照组的平均瘤体积,V0为治疗开始时溶剂对照组的平均瘤体积。
(5)实验结果
TIGIT-5鼠单抗、3TIGIT-16鼠单抗减少hTIGIT knock in小鼠中CT26结肠癌的平均肿瘤体积结果如表15和图3所示,TIGIT-5鼠单抗、3TIGIT-16鼠单抗对hTIGIT knock in小鼠生存期的影响结果如图4所示,结果显示:与同型对照组相比,3TIGIT-16鼠单抗(R0518)对hTIGIT knock in小鼠CT26模型肿瘤生长有显著的抑瘤作用(TGI=93.8%),且R0518显著延长小鼠生存期;TIGIT-5鼠单抗(R0435)的抗肿瘤作用与阳性对照组R0300-CH2a相当(TGI分别为76.5%,86.7%)。
表15
注:表15中,Isotype代表同型对照组(R0513)。
3、抗TIGIT人源化抗体(hIgG1亚型)对CT26小鼠结肠癌的体内抗肿瘤药效评价
(1)实验目的:在CT26小鼠结肠癌皮下移植瘤模型中研究hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体(15H9L2,15H10L3,316H1L1)的药效,同时设置hIgG1亚型的同型阴性对照组(R0536)和阳性对照组(R0300-hIgG1,是重链含K214R突变的Tiragolumab突变体)。
(2)实验材料:hTIGIT Knock in小鼠,雌性,6-8周(Balb/c背景,来源:江苏集萃药康生物科技股份有限公司,合格证号:202102514);CT26细胞(上海细胞库);RPMI 1640培养基(Gibco,11875085),FBS(Gibco,10091-148),0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco,25200056),青霉素-链霉素(Gibco,15140122),DMSO(Sigma,D2650),DPBS(Hyclone,SH30028.02)。
(3)仪器设备:电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司,JA12002),游标卡尺(上海美耐特实业有限公司,MNT-150T),显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司,BDS200),医用离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司,L530R),数显恒温水浴锅(普瑞斯机械有限公司,HH-S),二氧化碳培养箱(日本松下健康医疗器械株式会社,MCO-18AC),生物安全柜(广州千江实验科技有限公司,ACZ-451),细胞技术器(上海睿钰生物,IC1000)。
(4)实验方法
1)细胞培养:将小鼠结肠癌细胞(CT26)培养在含有10%胎牛血清(FBS)、与1%青霉素-链霉素(1:1)的RPMI 1640培养基中。
2)接种:收集对数生长期的CT26细胞,预冷的DPBS洗两次,调节细胞浓度为2×106/mL。取雌性hTIGIT小鼠,皮下接种CT26细胞,接种体积为0.1mL/小鼠,即2×105/小鼠。
3)给药:接种当天记为第0天(D0),第11天(D11),将小鼠按瘤体积随机分为5组,每组8只,开始给药(给药方案如表16所示)。
表16
组别 | 剂量(mg/kg) | 给药体积(μL/g) | 给药途径 | 给药频率 |
Isotype-hIgG1 | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
R0300-hIgG1 | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
15H9L2-hIgG1 | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
15H10L3-hIgG1 | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
316H1L1-hIgG1 | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
注:表16中,给药体积按动物体重调整(10L/g);如给药期间体重下降超过15%,给药方案将做调整。Isotype-hIgG1代表同型对照组(R0536)。另外,表中,i.p.表示腹腔注射,Q3D*4表示每3天给药1次,共给药4次。
4)观察记录:
D11开始测量肿瘤体积并记录小鼠体重,之后每周2次记录体重并用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。以公式:(1/2)×长径×(短径)2计算肿瘤体积。
5)数据计算、统计与分析:
两组之间比较可用独立样本T检验。3组以上比较应用One-Way ANOVA。如果F值显示有显著性差异,可进行多组间的事后分析。数据使用Prism GraphPad处理,当p<0.05表示统计学显著性差异。肿瘤体积V=0.5a×b2,a和b分别为肿瘤的长短径。肿瘤生长抑制TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100,Ti为第i天治疗组的平均瘤体积,T0为治疗开始时治疗组的平均瘤体积,Vi为第i天溶剂对照组的平均瘤体积,V0为治疗开始时溶剂对照组的平均瘤体积。
(5)实验结果
hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体减少hTIGIT knock in小鼠中CT26结肠癌的平均肿瘤体积结果如表17和图5所示,结果显示:与同型对照组相比,hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体15H9L2、15H10L3对hTIGIT knock in小鼠CT26模型肿瘤生长有显著的抑瘤作用TGI分别为56.38%,62.83%;316H1L1的抗肿瘤作用与阳性对照组R0300相当,TGI分别为36.26%,34.79%。
表17
注:表17中,Isotype代表同型对照组(R0536),R0300代表阳性对照R0300-hIgG1,15H9L2代表15H9L2-hIgG1,15H10L3代表15H10L3-hIgG1,316H1L1代表316H1L1-hIgG1。
4、抗TIGIT人源化抗体(mIgG2a亚型)对CT26小鼠结肠癌的体内抗肿瘤药效评价
(1)实验目的:在CT26小鼠结肠癌皮下移植瘤模型中研究mIgG2a亚型的抗TIGIT人源化抗体(15H9L2,15H10L3,316H1L1)的药效,同时设置同型阴性对照组(R0513)和阳性对照组(R0300-mIgG2a,是重链恒定区被mIgG2a替换的Tiragolumab突变体)。
(2)实验材料:hTIGIT Knock in小鼠,雌性,6-8周(Balb/c背景,来源:江苏集萃药康生物科技股份有限公司,合格证号:202102514);CT26细胞(上海细胞库);RPMI 1640培养基(Gibco,11875085),FBS(Gibco,10091-148),0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco,25200056),青霉素-链霉素(Gibco,15140122),DMSO(Sigma,D2650),DPBS(Hyclone,SH30028.02)。
(3)仪器设备:电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司,JA12002),游标卡尺(上海美耐特实业有限公司,MNT-150T),显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司,BDS200),医用离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司,L530R),数显恒温水浴锅(普瑞斯机械有限公司,HH-S),二氧化碳培养箱(日本松下健康医疗器械株式会社,MCO-18AC),生物安全柜(广州千江实验科技有限公司,ACZ-451),细胞计数器(上海睿钰生物,IC1000)。
(4)实验方法
1)细胞培养:将小鼠结肠癌细胞(CT26)培养在含有10%胎牛血清(FBS)、与1%青霉素-链霉素(1:1)的RPMI 1640培养基中。
2)接种:收集对数生长期的CT26细胞,预冷的DPBS洗两次,调节细胞浓度为2×106/mL。取雌性hTIGIT小鼠,皮下接种CT26细胞,接种体积为0.1mL/小鼠,即2×105/小鼠。
3)给药:接种当天记为第0天(D0),第8天(D8),将小鼠按瘤体积随机分为5组,每组8只,开始给药(给药方案如表18所示)。
表18
组别 | 剂量(mg/kg) | 给药体积(μL/g) | 给药途径 | 给药频率 |
Isotype-mIgG2a | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
R0300-mIgG2a | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
15H9L2-mIgG2a | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
15H10L3-mIgG2a | 10 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
316H1L1-mIgG2a | 110 | 10 | i.p. | Q3D*4 |
注:表18中,给药体积按动物体重调整(10L/g);如给药期间体重下降超过15%,给药方案将做调整。Isotype代表同型对照组(R0513)。另外,表中,i.p.表示腹腔注射,Q3D*4表示每3天给药1次,共给药4次。
4)观察记录:
D8开始测量肿瘤体积并记录小鼠体重,之后每周2次记录体重并用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。以公式:(1/2)×长径×(短径)2计算肿瘤体积。每只小鼠达到实验终点时(体重下降15%或肿瘤体积超过2000mm3达到仁慈终点),CO2窒息法处死小鼠,记录生存曲线。
5)数据计算、统计与分析:
两组之间比较可用独立样本T检验。3组以上比较应用One-Way ANOVA。如果F值显示有显著性差异,可进行多组间的事后分析。数据使用Prism GraphPad处理,当p<0.05表示统计学显著性差异。肿瘤体积V=0.5a×b2,a和b分别为肿瘤的长短径。肿瘤生长抑制TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100,Ti为第i天治疗组的平均瘤体积,T0为治疗开始时治疗组的平均瘤体积,Vi为第i天溶剂对照组的平均瘤体积,V0为治疗开始时溶剂对照组的平均瘤体积。
mIgG2a亚型的抗TIGIT人源化抗体减少hTIGIT knock in小鼠中CT26结肠癌的平均肿瘤体积结果如表19和图6所示,mIgG2a亚型的抗TIGIT人源化抗体对hTIGIT knock in小鼠生存期的影响结果如图7所示,结果显示:与同型对照组相比,mIgG2a亚型的抗TIGIT人源化抗体15H10L3对hTIGIT knock in小鼠CT26模型肿瘤生长有显著的抑瘤作用,TGI为83.95%;316H1L1的抗肿瘤作用与阳性对照组R0300相当,TGI分别为76.89%、75.68%。
表19
注:表19中,Isotype代表同型对照组(R0513);R0300代表阳性对照R0300-mIgG2a,15H9L2代表15H9L2-mIgG2a,15H10L3代表15H10L3-mIgG2a,316H1L1代表316H1L1-mIgG2a。
实施例5抗TIGIT人源化抗体敲除Treg细胞功能
1、抗TIGIT人源化抗体对健康人PBMC中T细胞的影响
以健康人PBMC为靶细胞,研究hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体(15H9L2,15H10L3,316H1L1)对健康人PBMC中CD8+T细胞、Treg细胞的影响,并设置阳性对照组(R0300-hIgG1,是重链含K214R突变的Tiragolumab突变体)。具体方法如下:
新鲜血液分离PBMC,用10%FBS+x-vivo培养基调整细胞密度至5E5个/mL,置于培养箱中过夜。PBMC细胞计数:donor-167 8.44E+05个/mL,81.15%,取细胞20mL,donor-2345.53E+05个/mL,78.38%,取细胞20mL;NK92-CD16-5细胞计数:P11 2.21E+05个/mL,96.05%,取细胞33mL;400g,5min离心后去上清,将细胞用10%FBS+x-vivo培养基(含1000IU/mL的IL-2)洗涤1次;加10%FBS+x-vivo培养基(含1000IU/mL的IL-2)重悬,细胞计数(PBMC-donor167:2.27E+06个/mL,90.84%,5mL;PBMC-donor234:2.06E+06个/mL,92.19%,4mL;NK92-CD16-5:3.93E+06个/mL,97.08%,1.5mL),分别调整细胞密度至2E+06个/mL;抗体稀释(全部用含1000IU/mL的IL-2的10%FBS+x-vivo培养基进行稀释);按照实验设计将NK92-CD16-5细胞、PBMC细胞、抗TIGIT人源化抗体和SEB分别以50μL/孔的体积加入到对应的96孔U型板中,空白组补上相应体积的10%FBS+x-vivo培养基(含1000IU/mL的IL-2),每孔的总体积为200μL;继续在培养箱中培养40h。
40h后,取出细胞板,将细胞转移至V型板中,用3%BSA buffer洗涤1次;将推荐量的各种一抗混合并加入细胞中,轻轻混合(按说明书推荐量)。2-8℃避光孵育30分钟;补加入100ul 3%BSA buffer洗涤细胞:350g离心5min,弃上清。加入200ul/孔3%BSA buffer,350g离心5min,弃上清。每孔加入200μL Foxp3固定/破膜工作溶液。使细胞完全重悬于添加的溶液中,2-8℃避光孵育60min。400g离心5min。弃上清。加入200μL1×破膜液,400g离心5min,弃上清,重复一次。在剩余体积中重悬沉淀,用1×破膜液将体积调节至约100μL。不洗涤,加入推荐量的直接偶联抗体(Foxp3)以检测细胞内抗原,并在室温下孵育30min,避光。每孔加入200μL1×破膜液,在室温下400g离心5min。弃上清并重复一次。将染色细胞重悬于300μL的PBS中。过200目纱网,转移至1.5mL离心管中。上机,通过流式细胞术分析。
图8a是单管染色结果图;图8b是分析步骤图;图8c是CD4+/CD8+T细胞的比值图;图8d是Treg细胞的比值图;图8e是以人外周血单个核细胞为靶细胞的ADCC结果图;结果显示:hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体15H9L2、15H10L3都能够有效降低Treg细胞比例,而hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体316H1L1与阳性对照组R0300相当,有较弱敲除Treg细胞的功能,同时hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体对CD8+T细胞比例无显著影响。
然后,按照上述方法,对更多样品进行了检测。
更多样品的检测结果如图9所示,结果显示:hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体15H9L2、15H10L3敲除Treg细胞功能较强,而hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体316H1L在敲除Treg细胞功能上虽然与阳性对照组R0300无显著差异,但经过316H1L处理过的细胞,Treg细胞比例更低;相比于阳性对照组,hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体均能够降低Treg细胞比例。
2、抗TIGIT人源化抗体对肿瘤细胞模型小鼠组织中T细胞的影响
(1)实验目的:在CT26小鼠结肠癌皮下移植瘤模型中研究mIgG2a亚型的抗TIGIT人源化抗体15H9L2-mIgG2a的作用机制,同时设置同型对照组(R0513)和阳性对照组(R0300-mIgG2a)。
(2)实验材料:如表20所示。
表20
(3)实验方法
1)细胞培养:将小鼠结肠癌细胞(CT26)培养在含有10%胎牛血清(FBS)、与1%青霉素-链霉素(1:1)的RPMI 1640培养基中。
2)接种:收集对数生长期的CT26细胞,预冷的DPBS洗两次,调节细胞浓度为2×106/mL。取雌性hTIGIT小鼠,皮下接种CT26细胞,接种体积为0.1mL/小鼠,即2×105/小鼠。
3)给药:接种当天记为第0天(D0),第8天(D8)肿瘤体积60-80mm3挑选40只用于体内药效研究,剩余15只,肿瘤体积长到300-500mm3时,将小鼠按瘤体积随机分为3组,每组3只,开始给药(给药方案如表21所示)。
第2次给药后的第二天,安乐死小鼠,解剖取肿瘤和脾脏,经处理后分析脾脏及肿瘤细胞中淋巴细胞。
表21
组别 | 剂量(mg/kg) | 给药体积(μL/g) | 给药途径 | 给药频率 |
Isotype-mIgG2a | 10 | 10 | i.p. | Q3D*2 |
R0300-mIgG2a | 10 | 10 | i.p. | Q3D*2 |
15H9L2-mIgG2a | 10 | 10 | i.p. | Q3D*2 |
注:表21中,给药体积按动物体重调整(10L/g);如给药期间体重下降超过15%,给药方案将做调整。Isotype代表同型对照组(R0513)。另外,表中,i.p.表示腹腔注射,Q3D*2表示每3天给药1次,共给药2次。
4)小鼠脾脏和肿瘤淋巴细胞分析
a、肿瘤组织消化:
(1)准备0.04g-1g肿瘤组织,剪碎(尽量剪成小块)成2-4mm。
(2)消化液配制:在5mL离心管中加入2.35mL1640培养基,分别再加入100uL酶D,50uL酶R,12.5uL酶A(若进行TILs分析,建议减少酶R量可至20%,例如:加10uL酶R到2.5ml消化液中)。
(3)将剪碎后肿瘤组织加入配好消化液,37℃消化40min,每隔3-5min吹匀一下。
(4)将cell strainer放在50mL离心管上,取消化好的组织上清,加入细胞筛网;在组织碎片中再加10mL 1640培养基冲洗一下,加入细胞筛网,使其完全滤过。
(5)300g离心7min,去上清,即可得消化后细胞。
(6)CD45+磁珠分离实验步骤:
a)提前配制250mL的分离buffer:
i.50mL PBS+250μL FBS+125μL EDTA(0.8M)冰浴备用;
b)取第一部分消化好的肿瘤细胞计数,取5E7个细胞300g离心10min,弃掉上清;
c)根据肿瘤细胞数量用90μL分离buffer重悬每10e7细胞;
d)再加入每10e7细胞10μL的CD45 Microbeads混匀;
e)4℃-8℃孵育15分钟;
f)每1E7细胞补充1-2mL的分离buffer到试管中,300g×4min离心10min;
g)弃上清后补充500μL的分离buffer重悬细胞(1E8个细胞以内);
h)分离柱准备:加入500ul分离buffer润洗分离株(500ul/MS,3ml/LS);
i)将混匀后的细胞悬液加到分离柱中(吸附于磁铁),等待液体全部自然滴落到离心管中;
j)再次加入500ul分离buffer,清洗3次(3×500ul/MS,3×3ml/LS);
k)再次加入1mL的分离buffer到分离柱中,同时撤掉磁铁,分离柱上加上活塞推出细胞到新的离心管中,还可以再加入1mL的分离buffer到分离柱中,重复上面的过程;
l)将收集到的细胞离心用含1%FBS的PBS洗涤一遍,用流式细胞术染色液重悬,计数;
m)调整细胞密度2E7个/ml,96孔板中每孔加入等量的100μL细胞悬液(可根据细胞数调整)。
b、脾脏处理:
1)用注射器平端研磨脾脏,将滤滤膜放在50mL离心管上,取脾脏悬液加入细胞筛网;再加10mL 1640培养基冲洗一下,加入细胞筛网,使其完全滤过。
2)300g离心7min,去上清,即可得消化后细胞。
3)裂红:将血样静置30min后,加红细胞裂解液1mL(视取血的体积而定),吹打均匀,放置5min,300-400g,离心5min,弃去上清(若肉眼还可见红细胞存在,重复前面步骤至裂红完全)。
4)清洗:用5mL DPBS重悬细胞,计数(使用PBMC模式),取3E6-4E6个细胞转移至96孔板,300-400g,离心5min。
c、荧光染色
1)阻断非特异性Fc介导的相互作用:小鼠细胞染色前,将细胞用0.5-1μg纯化的抗小鼠CD16/CD32/100μL2-25℃预孵育10-20分钟。
2)将推荐量的各种一抗混合并加入细胞中,轻轻混合(按说明书推荐量)。
3)2-8℃或冰上避光孵育30分钟以上。
4)补加入100ul流式细胞术染色液洗涤细胞;在室温下350g离心5分钟,弃上清。
5)200ul/孔,重复第4步。
6)最后一次洗涤后,弃上清轻弹样品以完全离解沉淀。
7)每孔加入200μL Foxp3固定/破膜工作溶液。最好使细胞完全重悬于添加的溶液中;2-8℃或室温避光孵育30-60分钟(小鼠样品可在2-8℃遮光孵育长达18小时)。
8)在室温下400-600g离心样品5分钟。弃上清。
9)每孔加入200μL 1×破膜液,在室温下400-600g离心样品5分钟。弃上清。
10)重复第9步。
11)在剩余体积中重悬沉淀,用1X破膜液将体积调节至约100μL。
12)不洗涤,加入推荐量的直接偶联抗体以检测细胞内抗原,并在室温下孵育30分钟以上。避光。
13)每孔加入200μL1×破膜液,在室温下400-600g离心样品5分钟。弃上清。
14)重复第14步。
15)将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。通过流式细胞术分析。
图10a是抗TIGIT人源化抗体对肿瘤细胞模型小鼠组织中T细胞的影响结果图,图10b是对抗TIGIT人源化抗体肿瘤细胞模型小鼠组织中CD3+T细胞和CD4+T细胞的影响结果图,结果显示:与同型对照组相比,mIgG2a亚型的抗TIGIT人源化抗体15H9L2和阳性对照组R0300均能明显降低肿瘤浸润淋巴细胞中Treg细胞比例,15H9L2比R0300效果更显著。
实施例6抗TIGIT人源化抗体的成药性评估
成药性评估可以通过早期的加压实验、稳定性研究,将潜在风险位点进行放大,如脱酰胺、异构化、氧化等翻译后修饰位点。在该过程中还可以建立压力条件和具体抗体风险位点变化之间的联系,从而尽可能地在早期发现那些对于抗体分子不友好的环境。因为整个制备过程中,抗体分子会经历多种不同的环境条件,比如培养过程的高温、氧化;纯化过程的酸、碱条件;病毒灭火过程中的极端酸性条件;长期保存或者运输过程中的冻融、振荡等条件,早期发现对抗体不稳定的因素,可以为后期的开发提供对应参考策略。对于稳定性非常差的分子,也可以在早期成药性评估过程中进行排除,减少项目后期失败风险,以确保进入到后续临床阶段候选分子的可靠性。以下对hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体(15H9L2,15H10L3,316H1L1)进行成药性评估:
1、抗TIGIT人源化抗体对酸、碱的稳定性评估
首先将样品全部置换到20mmol(PH6.0)醋酸钠缓冲液中,同时将样品浓度调整浓度为3mg/ml。取各样品2.5ml用0.5mol Citrate调节PH至3.5,或取各样品2.5ml用1M Tris-HCl调节PH至9.0,分装于1.5ml EP离心管并编号区分,室温处理0h、4h、22h后立即回调PH至6.0附近,及时送样理化、活性检测,根据理化检测结果挑选部分样品进行质谱分析。
图11a、图11b依次是抗TIGIT人源化抗体的SEC-HPLC检测酸、碱处理结果图;图11c、图11d依次是抗TIGIT人源化抗体的CE-SDS-NR检测酸、碱处理结果图;图11e、图11f、图11g依次是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测酸处理后酸性峰变化、主峰变化、碱峰变化结果图;图11h、图11i、图11j依次是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测碱处理后酸性峰变化、主峰变化、碱峰变化结果图,结果显示:抗TIGIT人源化抗体经过酸(pH3.5)、碱(pH9.0)处理4、22hr后,纯度结果稳定。
2、抗TIGIT人源化抗体对反复冻融的稳定性评估
将样品全部置换到20mmol(PH6.0)醋酸钠缓冲液中,同时将样品浓度调整浓度为3mg/ml。在-80℃与室温环境中经过多次反复冻融后,及时送样理化、活性检测,根据理化检测结果挑选部分样品进行质谱分析。
图12a是抗TIGIT人源化抗体的SEC-HPLC检测反复冻融处理结果图;图12b是抗TIGIT人源化抗体的CE-SDS-NR检测反复冻融处理结果图;图12c、图12d、图12e依次是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测反复冻融处理后酸性峰变化、主峰变化、碱性峰变化结果图,结果显示:抗TIGIT人源化抗体经过5个冻融循环,检测结果稳定。
3、抗TIGIT人源化抗体对高温的稳定性评估
将样品全部置换到20mmol(PH6.0)醋酸钠缓冲液中,同时将样品浓度调整浓度为3mg/ml。将三个抗体样品分两组,第一组4℃对照,第二组37℃恒温培养箱高温放置,按不同时间点取样于1.5ml EP管,并用封口膜封装,在第0、7Day、14Day、28Day送检分析,根据理化检测结果挑选部分样品进行质谱分析。
图13a、图13b依次是抗TIGIT人源化抗体的SEC-HPLC检测高温处理、4℃对照处理结果图;图13c、图13d依次是抗TIGIT人源化抗体的CE-SDS-NR检测高温处理、4℃对照处理结果图;图13e、图13f、图13g依次是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测高温处理后酸性峰变化、主峰变化、碱峰变化结果图;图13h、图13i、图13j依次是抗TIGIT人源化抗体的cIEF检测4℃对照处理后酸性峰变化、主峰变化、碱峰变化结果图,结果显示:抗TIGIT人源化抗体高温处理28天后,检测结果稳定。
4、抗TIGIT人源化抗体在压力测试后的体外结合活性
抗TIGIT人源化抗体经过酸、碱、反复冻融、高温等压力测试,理化性质并没有发现显著变化,表明其良好的理化稳定性。随后我们进一步检测抗TIGIT人源化抗体的体外结合活性,以证明抗TIGIT人源化抗体在压力条件下也能维持良好的活性。
图14a、图14b、图14c依次是hIgG1亚型的抗TIGIT人源化抗体316H1L1、15H9L2、15H10L3在压力测试后的体外结合活性图,结果显示:抗TIGIT人源化抗体经过各种压力条件测试后,仍然保持了良好的抗原结合活性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (13)
1.抗TIGIT人源化抗体或其抗原结合片段,所述抗体包含轻链CDR区和重链CDR区,轻链CDR区由LCDR1、LCDR2和LCDR3组成,重链CDR区由HCDR1、HCDR2和HCDR3组成,LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:29~31或SEQ ID NO:32~34,HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次选自SEQ ID NO:35~37或SEQ ID NO:38~40,其特征在于,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,或如SEQ IDNO:5~13、SEQ ID NO:15或SEQID NO:21~28任一所示。
2.根据权利要求1所述抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,或如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQIDNO:16~20任一所示。
3.根据权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,或如SEQ ID NO:5~13、15任一所示,并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,或如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQIDNO:4任一所示;或者所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21~28任一所示,且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16~20任一所示;
可选的,所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列如下:
4.根据权利要求1-3任一项所述抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,且重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示;或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示,且重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示;或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,且重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区,所述重链恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD中的任一种的恒定区序列;可选的,所述重链恒定区序列选自IgG1;
所述轻链恒定区为κ或λ链;可选的,所述轻链恒定区序列选自κ链;
所述重链恒定区和轻链恒定区的种属来源选自牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人中的任一种。
6.根据权利要求5所述抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示或如SEQ ID NO:45~48任一所示,所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:49所示;可选地,所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO:53所示,且轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示;可选地,所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示,且轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示。
7.根据权利要求1-4任一项所述抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗原结合片段为F(ab’)2、Fab、scFv以及双特异抗体中的任一种。
8.核酸,其特征在于,所述核酸编码权利要求1-7任一项所述抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述核酸包括:编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一核酸,和/或编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二核酸。
9.载体,其特征在于,所述载体包含权利要求8所述核酸。
10.细胞,其特征在于,所述细胞携带权利要求8所述核酸、含有权利要求9所述载体或表达权利要求1-7任一项所述抗体或其抗原结合片段。
11.生产权利要求1-7任一项所述抗体或其抗原结合片段的方法,包括:在培养基中培养权利要求10所述细胞;以及从培养基中或从所培养的细胞中回收产生的抗体或其抗原结合片段。
12.药物组合物,其特征在于,所述组合物含有权利要求1-7任一项所述抗体或其抗原结合片段、或权利要求8所述核酸、或权利要求9所述载体或权利要求10所述细胞;可选地,药物组合物包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
13.权利要求1-7任一项所述抗体或其抗原结合片段、权利要求8所述核酸、权利要求9所述载体、权利要求10所述细胞、权利要求12所述药物组合物在制备用于预防或治疗免疫性疾病、或肿瘤相关疾病的药物中的应用。
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