CN117447596A - 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117447596A CN117447596A CN202311022817.4A CN202311022817A CN117447596A CN 117447596 A CN117447596 A CN 117447596A CN 202311022817 A CN202311022817 A CN 202311022817A CN 117447596 A CN117447596 A CN 117447596A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- antibody
- chain variable
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 50
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 115
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 71
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 58
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 58
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 58
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 24
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 8
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 claims 5
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 53
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 19
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 33
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 33
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 24
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 23
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 21
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 15
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 15
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 15
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 11
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 6
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 6
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 3
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 2
- 239000002146 L01XE16 - Crizotinib Substances 0.000 description 2
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 229920002534 Polyethylene Glycol 1450 Polymers 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000009464 antigen specific memory response Effects 0.000 description 2
- 229960003005 axitinib Drugs 0.000 description 2
- RITAVMQDGBJQJZ-FMIVXFBMSA-N axitinib Chemical compound CNC(=O)C1=CC=CC=C1SC1=CC=C(C(\C=C\C=2N=CC=CC=2)=NN2)C2=C1 RITAVMQDGBJQJZ-FMIVXFBMSA-N 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 229960001602 ceritinib Drugs 0.000 description 2
- VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N ceritinib Chemical compound CC=1C=C(NC=2N=C(NC=3C(=CC=CC=3)S(=O)(=O)C(C)C)C(Cl)=CN=2)C(OC(C)C)=CC=1C1CCNCC1 VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229960005061 crizotinib Drugs 0.000 description 2
- KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N crizotinib Chemical compound O([C@H](C)C=1C(=C(F)C=CC=1Cl)Cl)C(C(=NC=1)N)=CC=1C(=C1)C=NN1C1CCNCC1 KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 2
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 2
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 2
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- -1 therapeutic Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229960004066 trametinib Drugs 0.000 description 2
- LIRYPHYGHXZJBZ-UHFFFAOYSA-N trametinib Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC(N2C(N(C3CC3)C(=O)C3=C(NC=4C(=CC(I)=CC=4)F)N(C)C(=O)C(C)=C32)=O)=C1 LIRYPHYGHXZJBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010006143 Brain stem glioma Diseases 0.000 description 1
- 101100463133 Caenorhabditis elegans pdl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007953 Central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N Dasatinib Chemical compound C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1Cl ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010013457 Dissociation Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 201000001342 Fallopian tube cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013452 Fallopian tube neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000224466 Giardia Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010062904 Hormone-refractory prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000002147 L01XE04 - Sunitinib Substances 0.000 description 1
- 239000002067 L01XE06 - Dasatinib Substances 0.000 description 1
- 239000002145 L01XE14 - Bosutinib Substances 0.000 description 1
- 239000002176 L01XE26 - Cabozantinib Substances 0.000 description 1
- 239000002177 L01XE27 - Ibrutinib Substances 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052178 Lymphocytic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 description 1
- 208000002030 Merkel cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010029266 Neuroendocrine carcinoma of the skin Diseases 0.000 description 1
- 206010052399 Neuroendocrine tumour Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108091007744 Programmed cell death receptors Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 108010010056 Terlipressin Proteins 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000006593 Urologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001611 alectinib Drugs 0.000 description 1
- KDGFLJKFZUIJMX-UHFFFAOYSA-N alectinib Chemical compound CCC1=CC=2C(=O)C(C3=CC=C(C=C3N3)C#N)=C3C(C)(C)C=2C=C1N(CC1)CCC1N1CCOCC1 KDGFLJKFZUIJMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 229950002916 avelumab Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003736 bosutinib Drugs 0.000 description 1
- UBPYILGKFZZVDX-UHFFFAOYSA-N bosutinib Chemical compound C1=C(Cl)C(OC)=CC(NC=2C3=CC(OC)=C(OCCCN4CCN(C)CC4)C=C3N=CC=2C#N)=C1Cl UBPYILGKFZZVDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012410 cDNA cloning technique Methods 0.000 description 1
- 229960001292 cabozantinib Drugs 0.000 description 1
- ONIQOQHATWINJY-UHFFFAOYSA-N cabozantinib Chemical compound C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC=CC=1OC(C=C1)=CC=C1NC(=O)C1(C(=O)NC=2C=CC(F)=CC=2)CC1 ONIQOQHATWINJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000009060 clear cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000017763 cutaneous neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960002448 dasatinib Drugs 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- ICFXZZFWRWNZMA-UHFFFAOYSA-N diethylpropion hydrochloride Chemical compound [Cl-].CC[NH+](CC)C(C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ICFXZZFWRWNZMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 229950009791 durvalumab Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 201000006592 giardiasis Diseases 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001507 ibrutinib Drugs 0.000 description 1
- XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N ibrutinib Chemical compound C1=2C(N)=NC=NC=2N([C@H]2CN(CCC2)C(=O)C=C)N=C1C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N 0.000 description 1
- 229950007440 icotinib Drugs 0.000 description 1
- QQLKULDARVNMAL-UHFFFAOYSA-N icotinib Chemical compound C#CC1=CC=CC(NC=2C3=CC=4OCCOCCOCCOC=4C=C3N=CN=2)=C1 QQLKULDARVNMAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229960003784 lenvatinib Drugs 0.000 description 1
- WOSKHXYHFSIKNG-UHFFFAOYSA-N lenvatinib Chemical compound C=12C=C(C(N)=O)C(OC)=CC2=NC=CC=1OC(C=C1Cl)=CC=C1NC(=O)NC1CC1 WOSKHXYHFSIKNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 208000006178 malignant mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 208000020984 malignant renal pelvis neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 description 1
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000016065 neuroendocrine neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 201000002740 oral squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 208000016800 primary central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000007444 renal pelvis carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229960001796 sunitinib Drugs 0.000 description 1
- WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N sunitinib Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC(F)=CC=C3NC\2=O)=C1C WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940066453 tecentriq Drugs 0.000 description 1
- BENFXAYNYRLAIU-QSVFAHTRSA-N terlipressin Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CN)CSSC1 BENFXAYNYRLAIU-QSVFAHTRSA-N 0.000 description 1
- 229960003813 terlipressin Drugs 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 206010046885 vaginal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013139 vaginal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 201000005102 vulva cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了以高亲和力与PD‑1特异性结合的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。还提供了编码本发明抗体的核酸分子、用于表达本发明抗体的表达载体、宿主细胞和方法，以及包含本发明抗体的药用组合物。本发明的另一方面涉及使用抗PD‑1抗体调控免疫应答的方法，提供它们用于增强T细胞功能从而上调细胞介导的免疫应答的用途，以及治疗各种疾病，包括感染和肿瘤免疫的方法。
Description
本申请是申请日为2020年9月26日、申请号为201910916750.6、发明名称为“一种靶向PD-1的单克隆抗体及其应用”的中国专利申请的分案申请。本申请要求提交于2019年6月30日、申请号为201910582195.8的中国专利申请的优先权，本申请将二者的全部内容并入作为参考。
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体而言，涉及针对人PD-1的单克隆抗体及其在疾病治疗中的应用。
背景技术
程序性死亡受体1(PD-1)是在T细胞、B细胞及骨髓细胞上表达的免疫抑制性受体。PD-1(由基因Pdcd1编码)与CTLA-4同属于CD28家族受体，其与CTLA-4有23％氨基酸序列同源性(Okazaki,T.&Honjo,T.Trends Immunol.27,195–201(2006))。PD-1蛋白是55kDa的I型跨膜蛋白，含有一个胞外IgV区、跨膜区及胞内区，胞内区包含接近膜的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和远离膜的基于酪氨酸的转换基序(ITSM)(Thomas，M.L.(1995)J Exp Med181：1953-6；Vivier，E和Daeron，M(1997)Immunol Today18：286-91)。虽然与CTLA-4结构类似，但PD-1缺少结合B7-1和B7-2所必需的MYPPPY基序。现已鉴定了PD-1的两种配体，PD-L1和PD-L2，其显示出在结合PD-1后下调T细胞活化。PD-L1和PD-L2都是B7同源物，其与PD-1结合，但不与其它CD28家族成员结合。PD-L1在B细胞、T细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)上表达，但也在外周细胞(例如微血管内皮细胞)和非淋巴器官(如心脏、肺等)中表达。PD-L2仅在活化的巨噬细胞和DC中存在。另外，PD-L1和PD-L2也常常在多种肿瘤细胞中表达，通过免疫组织化学评估活组织检查业已在人的很多原发性肿瘤中发现PD-1(在肿瘤浸润淋巴细胞上)和/或PD-L1(在肿瘤细胞上)。这样的组织包括肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌和胰腺癌以及头颈肿瘤。近年来研究表明阻断PD-1与其配体之间的相互作用可阻断T细胞内的负性调节信号，恢复肿瘤特异性CD8+T细胞的杀伤活性，这表明肿瘤细胞可利用PD-1/PD-L1通路逃逸免疫监视，阻断该通路有助于免疫系统清除肿瘤细胞。Molecular andBiochemical Aspects of the PD-1Checkpoint Pathway,Vassiliki A.Boussiotis,NEJMn engl j med375；18nejm.org November 3,2016中详细综述了PD-1及相关研究。
目前已经公开非常多的关于PD-1/PD-L1抗体相关专利，例如PCT国际申请PCT/JP2006/309606公开了以高亲和力与PD-1特异性结合的分离的单克隆抗体，该专利据信与百时美施贵宝的Opdivo相关。PCT国际申请PCT/US2008/007463披露了一种针对人程序性死亡受体PD-1的抗体，该专利据信与Merck公司的Keytruda相关。其他与PD-1/PD-L1抗体相关的专利可参考PCT/US2009/067104，PCT/CN2014/091090，PCT/CN2016/102238，PCT/CN2013/083467和CN201310258289.2等，在此全部引入作为参考。
目前，全球PD-1/PD-L1技术领域研究热点集中在四大领域：(1)联合免疫治疗，(2)联合小分子靶向药物治疗，(3)疗效预测生物标志物的检测，(4)在治疗各种高发肿瘤中的应用。其中联合小分子靶向药物和联合其他免疫检查点治疗方案的文献最多，适应症主要集中在非小细胞肺癌、膀胱癌、头颈癌、前列腺癌、胰腺癌和恶性黑色素瘤等欧美人群高发肿瘤。除用于治疗肿瘤外，抗PD-1抗体还可用于慢性病毒性感染。最近，有研究显示PD-1在来自HIV感染的个体的T细胞中高度表达。
自2014年9月以来，PD-1/PD-L1抗体已经被美国FDA正式批准用于恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、Merkel细胞癌以及所有微卫星高度不稳定(MSI-H)的实体瘤。此外，在结直肠癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤、神经内分泌肿瘤、恶性间皮瘤、非霍奇金淋巴瘤等其他多种实体瘤临床试验中，显示出了初步的、鼓舞人心的疗效。
已经批准上市的PD-1/PD-L1抗体药物
目前已批准上市的PD-1/PD-L1的药物有9种，其中6款PD-1抗体为百时美施贵宝的Opdivo、默沙东的Keytruda，赛诺菲(Sanofi)和再生元(Regeneron)联合开发的Libtayo、君实生物开发的特瑞普利单抗、信达生物开发的信迪利单抗和江苏恒瑞开发的卡瑞利珠单抗，3款PD-L1抗体为罗氏的Tecentriq、阿斯利康的Imfinzi以及默克的Bavencio。这几款药物批准的适应症如上表所示。
在中国，6款PD-1抗体除Libtayo外其余5款均获批准上市，药物之间的激烈竞争使得我国肿瘤患者在使用PD-1抗体药物的平均治疗费用低于欧美国家的费用。例如进口药物Opdivo在我国的治疗肺癌适应症一年费用大约48万元，而君实生物在国内国内首家批准用于治疗晚期黑色素瘤的特瑞普利单抗将治疗费用降到约18万元。
即使如此，动辄几十万的药物治疗费用对于全国居民人均可支配收入28228元(2018年国家统计局数字)的国内患者人群依然是非常大的负担。尽管目前已有多种PD-1抗体已上市或正在研究中，但是提供一种与人PD-1具有更高亲和力和特异性结合的PD-1抗体，具有更好的疗效和更低价格的抗PD-1抗体仍然是临床上所急需的。
发明概述
本发明提供了以高亲和力与PD-1特异性结合的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。还提供了编码本发明抗体的核酸分子、用于表达本发明抗体的表达载体、宿主细胞和方法，以及包含本发明抗体的药用组合物。
本发明的另一方面涉及使用抗PD-1抗体调控免疫应答的方法，提供它们用于增强T细胞功能从而上调细胞介导的免疫应答的用途，以及治疗各种疾病，包括感染(例如急性的和慢性的)和肿瘤免疫的方法。
在一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：13所示一致的氨基酸序列；
(b)重链可变区CDR2，其包含与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：14所示一致的氨基酸序列；
(c)重链可变区CDR3，其包含与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：15所示一致的氨基酸序列；
(d)轻链可变区CDR1，其包含与选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：16所示一致的氨基酸序列；
(e)轻链可变区CDR2，其包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、或SEQ ID NO：17所示一致的氨基酸序列；和
(f)轻链可变区CDR3，其包含与选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：18所示一致的氨基酸序列；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其重链可变区和轻链可变区的CDR序列同源性至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列一致，以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列一致；或
(b)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列一致，以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列一致；或
(c)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列一致，以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列一致；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
在又一个实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链和轻链可变区序列：
(a)重链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：27所示一致的氨基酸序列；
(b)轻链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：29所示一致的氨基酸序列；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其重链可变区与选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性；其轻链可变区与选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列一致；以及轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列一致；或
(b)重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列一致；以及轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列一致；或
(c)重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列一致；以及轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列一致；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
在另一实施方案中，所述抗体为包含人或鼠恒定区的全长抗体。又一方面，所述人恒定区选自由IgGl、IgG2、IgG3、IgG4组成的组。在又一个具体方面中，所述人恒定区是IgG4。又一方面，所述鼠恒定区选自由IgGl、IgG2A、IgG2B、IgG3组成的组。在又一个具体方面中，所述抗体具有降低的或最小的效应子功能。在又一个具体方面中，所述最小的效应子功能由去糖基化(glycosylation)产生。
在另一实施方案中，本发明抗体或抗体片段为嵌合抗体或嵌合抗体片段。
在另一实施方案中，本发明抗体或抗体片段为人抗体或人抗体片段。
在另一实施方案中，本发明抗体或抗体片段为人源化抗体或人源化抗体片段。
在另一实施方案中，本发明抗体片段为Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv或F(ab’)2抗体片段。
在另一实施方案中，本发明抗体片段为双抗体。
本发明还包括包含上述结合人PD-1的抗体或抗体片段中的任一种的双特异性抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链，其序列与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列一致；以及
(b)轻链，其序列与SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列一致；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
在本发明特别优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链，其序列与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列一致；以及
(b)轻链，其序列与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列一致；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
本发明提供了编码所述抗体或抗体片段的分离的多核苷酸。在一些实施方案中，编码抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、或SEQ ID NO:37所示，编码抗体轻链的核苷酸序列如SEQID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:43所示。
本发明提供了包含所述分离的多核苷酸的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞。
本发明提供了药物组合物，包含所述抗体或抗体片段以及可药用载体。
本发明提供了提高免疫细胞活性的方法，包括使免疫细胞与所述抗体或抗体片段接触。
本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的抗体或抗体片段给予需要治疗的受试者。在又一方面，本发明提供了调控受试者中免疫应答的方法，其包括给受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答得到调控。优选的是，本发明的抗体增强、刺激或增加受试者中的免疫应答。
在一些实施方案中，其中所述疾病为癌症或感染性疾病。在一些实施方案中，所述方法包括对受试者联合应用其他药物或疗法。
本发明提供了所述抗体或抗体片段在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病为癌症或感染性疾病。在一方面，本发明提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合部分。在该方法中优选使用本发明的抗体，虽然其它抗PD-1抗体也能够替代(或与本发明的抗PD-1抗体联合)使用。例如，在抑制肿瘤生长的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗PD-1抗体。
在另一方面，本发明提供了治疗受试者中传染病的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合部分。在该方法中优选使用本发明的抗体，虽然其它抗PD-1抗体也能够替代(或与本发明的抗PD-1抗体联合)使用。例如，在治疗传染病的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，利用本发明所述的抗体在抑制肿瘤细胞生长时其亲和力更高，阻断效果更好，细胞杀伤活力更高。其亲和力比现有治疗性单抗的亲和力高出大约10倍，体外阻断PD-L1/PD-1的相互作用非常有效。与美国公司(BMS)的已上市产品Opdivo(Nivolumab)相比，其阻断效果和体外杀伤活性均有所提高，在抑制肿瘤细胞生长方面本发明的单抗效果更加优异。
附图说明
图1：ELISA方法测定雌性Balb/c小鼠的血清效价。横轴表示稀释倍数，纵轴表示测定的OD值，UM1-1/UM1-2/UM1-3/UM1-4代表不同的小鼠。
图2：流式细胞法测定鼠源PD-1单克隆抗体的阻断活性。横轴表示抗体浓度，纵轴表示阻断率，UM1-45/UM1-47/UM1-51/UM1-56/UM1-63/UM1-69代表不同的鼠源PD-1单克隆抗体。
图3：ProteinA亲和法分离纯化人源化PD-1单克隆抗体。横轴表示流动相体积，纵轴表示紫外吸光值。图3-2为图3-1的局部放大图。
图4：SDS-PAGE检测抗体的分子量。图4-1SDS-PAGE(还原)，图4-2SDS-PAGE(非还原)
图5：超高效液相分子排阻色谱UPLC-SEC检测抗体的纯度。横轴表示时间，纵轴表示吸光度。
图6：Octet Red96测定亲和力。横轴表示时间，纵轴表示结合高度。
图7：流式细胞法测定人源化PD-1单克隆抗体(hUM1-30)阻断活性。
图8：SPC肺癌模型鼠检测消除肿瘤效果。横轴为天数，纵轴为肿瘤体积。
图9：SPC肺癌模型鼠生存曲线。横轴为天数，纵轴为生存百分率。
图10：每只SPC肺癌模型鼠给予阳性对照抗体Opdivo治疗效果。横轴为天数，纵轴为肿瘤体积。
图11：每只SPC肺癌模型鼠给予人源化PD-1单克隆抗体(hUM1-30)治疗效果。横轴为天数，纵轴为肿瘤体积。
图12：每只SPC肺癌模型鼠给予阴性对照抗体huIgG治疗效果。横轴为天数，纵轴为肿瘤体积。
发明详述
在一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体，其与PD-1特异性结合。在某些实施方式中，本发明的抗体展现出一种或多种优良的功能特性，诸如与人PD-1高亲和力结合，抑制一种或多种PD-1配体(例如PD-L1和/或PD-L2)结合的能力，刺激抗原特异性记忆应答的能力，刺激抗体应答的能力和/或抑制体内肿瘤细胞生长的能力。
本发明提供了例如分离的抗体、制备此类抗体的方法及含有本发明的抗体分子的药用组合物。
在另一方面，本发明涉及使用抗PD-1抗体抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法。如本文所证明的，抗PD-1抗体能够抑制体内肿瘤细胞生长。本发明还涉及使用所述抗体调节免疫应答以及治疗诸如癌症或传染病的疾病，或者刺激保护性自身免疫应答或刺激抗原特异性免疫应答(例如通过共施用抗PD-1和目标抗原)的方法。
为使本发明更易于理解，首先定义某些术语。别的定义将在整个详述中阐明。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内，这些技术在本领域的技术文献和通用教科书中有充分解释，诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)等。
术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-1”可互换使用，包括人PD-1的变体、同种型(isoform)、物种同系物，及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可以根据GenBank编号U64863查到。
“抗体”是指表现出所需生物学活性(例如抑制配体与其受体的结合或通过抑制配体诱导的受体信号转导)的抗体的任何形式。因此，“抗体”以其最广泛的意义来使用，并明确包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
“抗体片段”和“抗体结合片段”意即抗体的抗原结合片段及抗体类似物，包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(linear antibody)；单链抗体分子，例如scFv、单抗体；纳米抗体；结构域抗体(Nanobody)；和由抗体片段形成的多特异性抗体等。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽另外在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。
“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗体片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。
“嵌合抗体”意图指可变区序列源自一种物种而恒定区序列源自另一种物种的抗体，诸如可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人抗体的抗体。
非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式为含有最小限度的来源于非人类免疫球蛋白序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的高变区残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)高变区的残基置换，非人类物种例如有小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含不在受体抗体或供体抗体中存在的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体包含至少一个且通常为两个可变结构域的几乎全部，其中全部或几乎全部超变环对应于非人类免疫球蛋白的超变环，全部或几乎全部FR区为人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还任选包含至少部分免疫球蛋白(通常为人免疫球蛋白)恒定区(Fc)。
“分离的”抗体为业已被鉴定并与其天然环境组分相分离的抗体(例如与PD-1特异性结合的分离的抗体基本没有与PD-1以外的其它抗原特异性结合的抗体)，其天然环境的污染组分是会干扰所述抗体的诊断性或治疗性应用的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将所述抗体纯化到超过95％纯度，更优选超过99％纯度，其由Lowry法测定。分离的抗体通常由至少一个纯化步骤制备。
“分离的”核酸分子为被鉴定并与至少一种污染性核酸分子(通常在抗体核酸的天然来源中与其缔合)分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于其天然存在的形式或环境。
术语“单克隆抗体””或“单克隆抗体组合物”在用于本文时指单一分子组合物的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。用于本发明的单克隆抗体可通过由Kohler等(1975，Nature 256：495)首先阐述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法制备。本文单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体或人源化。
本文所用术语“免疫细胞”包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括：淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。
本文所用序列“变体”是指在一个或多个氨基酸残基处不同于所示的序列但保留所得到的分子的生物学活性的序列。
本文所用术语“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
当用“给予”和“治疗”提及动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液时，是指将外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受治疗者、细胞、组织、器官或生物液接触。“给予”和“治疗”可指例如治疗方法、药动学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。治疗细胞包括让试剂与细胞接触以及让试剂与流液接触，其中所述流液与细胞接触。“给予”和“治疗”还意味着例如通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过其他细胞对细胞进行体外和离体治疗。
“有效量”包括足以改善或防止医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以使得可以诊断或促进诊断的量。对具体受治疗者的有效量可视多种因素而变化，例如待治疗的疾病、患者的整体健康状况、给药的方法途径和剂量及副作用的严重性。有效量可为避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
本发明的各个方面将在下述分部中进一步详细描述。
抗PD-1抗体
本发明抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，所述抗体与PD-1特异性结合。优选的是，本发明的抗体以高亲和力，例如以1×10-9M或更小的KD与PD-1结合。评估抗体对PD-1的结合能力的标准测定法是本领域公知的，包括例如ELISA、Western印迹和RIA。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法来评估，诸如通过Biacore或Octet分析。实施例中详细描述了适于评估任何上述特征的测定法。
在一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：13所示一致的氨基酸序列；
(b)重链可变区CDR2，其包含与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：14所示一致的氨基酸序列；
(c)重链可变区CDR3，其包含与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：15所示一致的氨基酸序列；
(d)轻链可变区CDR1，其包含与选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：16所示一致的氨基酸序列；
(e)轻链可变区CDR2，其包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、或SEQ ID NO：17所示一致的氨基酸序列；和
(f)轻链可变区CDR3，其包含与选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：18所示一致的氨基酸序列；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其重链可变区和轻链可变区的CDR序列同源性至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在本发明工程改造抗体的方法的某些实施方式中，可以向整个或部分抗PD-1抗体编码序列中随机或者有选择的引入突变，所产生的经修饰的抗PD-1抗体可如本文所述的进行结合活性和/或其它功能特性的筛选。本领域已经记载了突变的方法。例如，Short的PCT公开文本WO02/09278中描述了通过饱和诱变、合成的连接装配或其组合来创造和筛选抗体突变的方法。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列一致，以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列一致；或
(b)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列一致，以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列一致；或
(c)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列一致，以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列一致；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
在本发明另一实施方案中，通过免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0-Ag14)在聚乙二醇(PEG1450，Roche)融合剂作用下进行融合，获得杂交瘤细胞，经高通量转染和筛选系统筛选到能与PD-1阳性表达细胞结合的PD-1抗体。挑选出的阳性克隆再经过3遍以上有限稀释法进行亚克隆选择，确保是单一来源的阳性克隆。其中，特别优选的3株阳性克隆UM1-51、UM1-56和UM1-69经测序，所表达的抗体CDR区序列如下表所示:
在又一个实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链和轻链可变区序列：
(a)重链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：27所示一致的氨基酸序列；
(b)轻链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：29所示一致的氨基酸序列；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其重链可变区与选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性；其轻链可变区与选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)与上述序列的VH和VL区具有高(即90％或更高)同源性的抗体通过保守序列修饰获得，包括氨基酸的取代、添加和缺失等。术语“保守序列修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变编码可变区序列的核酸分子。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区域外的一个或多个氨基酸残基，并使用本文所述的功能测定法对改变后的抗体测试保留的功能。优选的定点诱变或PCR介导的诱变位点位于重链可变区CDR1-CDR3和轻链可变区CDR1-CDR3之外的位点。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列一致；以及轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列一致；或
(b)重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列一致；以及轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列一致；或
(c)重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列一致；以及轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列一致；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
在另一实施方案中，所述抗体为包含人或鼠恒定区的全长抗体。又一方面，所述人恒定区选自由IgGl、IgG2、IgG3、IgG4组成的组。在又一个具体方面中，所述人恒定区是IgG4。又一方面，所述鼠恒定区选自由IgGl、IgG2A、IgG2B、IgG3组成的组。在又一个具体方面中，所述抗体具有降低的或最小的效应子功能。在又一个具体方面中，所述最小的效应子功能由去糖基化(glycosylation)产生。
在另一实施方案中，本发明抗体或抗体片段为嵌合抗体或嵌合抗体片段。
在另一实施方案中，本发明抗体或抗体片段为人抗体或人抗体片段。
在另一实施方案中，本发明抗体或抗体片段为人源化抗体或人源化抗体片段。
在另一实施方案中，本发明抗体片段为Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv或F(ab’)2抗体片段。
在另一实施方案中，本发明抗体片段为双抗体。
本发明还包括包含上述结合人PD-1的抗体或抗体片段中的任一种的双特异性抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链，其序列与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列一致；以及
(b)轻链，其序列与SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列一致；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
在优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体，其重链(HC)与选自SEQID NO：34、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性；其轻链(LC)与选自SEQ ID NO：40、SEQID NO：42或SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性。与上述序列的重链和轻链具有高(即90％或更高)同源性的抗体可以通过诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码重链和轻链氨基酸的核酸分子，然后使用本文所述的功能测定法对所编码的改变后的抗体测试所保留的功能获得。优选的定点诱变或PCR介导的诱变位点位于重链可变区CDR1-CDR3和轻链可变区CDR1-CDR3之外的位点。
在特别优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链，其序列与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列一致；以及
(b)轻链，其序列与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列一致；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
优选的，其中所述抗体或其抗原结合部分优选与人PD-1或猕猴PD-1特异性结合，更优选的与人PD-1特异性结合。本发明的抗PD-1抗体优选展现出一种或多种下列特征：
(a)以1×10-9M或更小的KD与人PD-1结合；
(b)抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；
(c)刺激抗原特异性记忆应答；
(d)刺激抗体应答；
(e)抑制体内肿瘤细胞生长。
优选的是，所述抗体以1×10-10M或更小的KD与人PD-1结合，更优选以1×10-11M或更小的KD与人PD-1结合。在本发明另一优选实施方案中，所述抗体(hUM1-30)以3.34×10- 12M与人PD-1结合，作为比较，在平行测定中BMS公司已上市抗体Opdivo以2.58×10-11M与人PD-1结合。显示优选抗体hUM1-30与PD-1的亲和力比Opdivo的高1个数量级。在SPC肺癌模型鼠试验中，抗体hUM1-30对比商品化的Opdivo能更好地消除肿瘤。
本发明的抗体可展现出上述特征的任意组合，诸如两个、三个、四个、或五个上述特征。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及编码本发明抗体的核酸分子。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，而且可以含有或不含内含子序列。在一优选的实施方式中，核酸是cDNA分子。
可以使用标准分子生物学技术来获得本发明的核酸。对于由杂交瘤表达的抗体，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码杂交瘤所制备的抗体轻链和重链的cDNAs。对于从免疫球蛋白基因库(例如使用噬菌体展示技术)中获得的抗体，可以从文库中回收编码抗体的核酸。
本发明优选的核酸分子是那些编码本发明中所示抗PD-1抗体CDR区、可变区或者全长抗体的氨基酸序列的核酸分子。在获得编码本发明所述的抗PD-1抗体的VH和VL区段的DNA片段后，进一步通过标准重组DNA技术操作这些DNA片段，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作的连接至编码另一蛋白质，诸如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。术语“可操作的连接”在用于本文时意图表示连接两DNA片段从而使得这两个DNA片段所编码的氨基酸序列保持在同一读码框中。
通过将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可以将编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等人(1991)，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选为IgG4恒定区。为获得Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA可操作的连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
通过将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL另一DNA分子可以将编码VL区的分离的DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等人(1991)，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选为κ恒定区。
为创造scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作的连接至编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，从而使得VH和VL序列可以表达成相邻的单链蛋白质，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人(1990)Nature 348：552-554)。
本发明提供了编码所述抗体或抗体片段的分离的多核苷酸。在一些实施方案中，编码抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、或SEQ ID NO:37所示，编码抗体轻链的核苷酸序列如SEQID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:43所示。
表达载体及宿主细胞
本发明提供了包含所述分离的多核苷酸的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞。
适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。为表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增或使用表达目标抗体的杂交瘤的cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入到表达载体中，从而使得基因与转录和翻译调控序列可操作的连接。
选择适合所用表达宿主细胞的表达载体和表达调控序列。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到不同的载体中，或者更通常的，将两个基因插入到同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入到表达载体中。可以使用本文所述抗体的轻链和重链可变区来创造任何抗体同种型的全长抗体基因，其通过将它们插入已编码期望同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，从而使得VH区段与载体中的CH区段可操作的连接，VK区段与载体中的CL区段可操作的连接。或者，重组表达载体可以编码信号肽，其利于宿主细胞中抗体链的分泌。可将抗体链基因克隆到载体中以使信号肽与抗体链基因的氨基末端连接于同一读码框中。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因，本发明的重组表达载体还携带调控序列，诸如源自巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子，其调控抗体链基因在宿主细胞中的表达。术语“调控序列”意图包括启动子、增强子和其它表达调控元件(例如聚腺苷酸化信号)，其调控抗体链基因的转录或翻译。此类调控序列记载于例如Goeddel，Gene Expression Technology.Methodsin Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。
为表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。各种形式的术语“转染”意图涵盖多种通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖苷转染等。虽然理论上在原核或真核宿主细胞中都有可能表达本发明的抗体，但是最优选在真核细胞中(最优选在哺乳动物宿主细胞中)表达抗体。用于表达本发明重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞等，优选CHO细胞。
当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段足以使宿主细胞中抗体表达的时间生产抗体，或者更优选的是，将抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养物的培养液中回收抗体。
药物组合物
本发明提供了药物组合物，包含所述的抗PD-1抗体和药学可接受的载体。
一方面，本发明提供了一种药用组合物，其包含一种或一组本发明的抗PD-1单克隆抗体或其抗原结合部分，与药学可接受载体配制在一起。药剂学可接受载体包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等生理学相容的载体。优选的是，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。
药物组合物在生产和贮存条件下通常必须是无菌的和稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或冻干粉针等剂型。本发明药物组合物的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓/脊柱或其它胃肠外施用路径，例如通过注射或输注。
本发明的抗体的给药剂量的范围为大约0.0001-100mg/kg，更加通常的为0.01-5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。例示性的治疗方案要求每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3-6个月一次。对于本发明的抗PD-1抗体而言，优选的剂量方案包括经静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其利用下列剂量给药方案之一来给予抗体：(i)每四周一剂达六个剂量，然后每三个月一剂；(ii)每三周一剂；(iii)给予一次3mg/kg体重，随后每三周给予1mg/kg体重。
本发明药用组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，从而获得对于特定患者、组合物和施用模式有效实现期望治疗性应答而对患者是无毒的活性成分量。“治疗有效量”的本发明抗PD-1抗体优选导致疾病症状严重性降低、无疾病症状期的频率和持续时间提高、或对患病所造成的损害或残疾的预防。例如，对于肿瘤的治疗而言，“治疗有效量”优选相对于未治疗受试者抑制细胞生长或肿瘤生长达至少大约20％、更优选达至少大约40％、甚至更优选达至少大约60％、且仍更优选达至少大约80％。可以在动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力，所述动物模型系统可以预测在人肿瘤中的功效。本领域普通技术人员将会能够基于诸如受试者体型大小、受试者症状的严重性、及所选择的特定组合物或施用路径的因素来确定此类量。
本发明的用途和方法
本发明提供了提高免疫细胞活性的方法，包括使免疫细胞与所述抗体或抗体片段接触。
本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的抗体或抗体片段给予需要治疗的受试者。在又一方面，本发明提供了调控受试者中免疫应答的方法，其包括给受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答得到调控。优选的是，本发明的抗体增强、刺激或增加受试者中的免疫应答。术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛、马、鸡、两栖类和爬行类。优选哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛和马。更优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。
本发明的抗体、抗体组合物和方法具有众多体外和体内用途，包括例如检测PD-1或通过阻断PD-1来增强免疫应答。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是人抗体。例如，可以将这些分子施用于体外或离体培养的细胞，或者施用于人受试者，例如在体内，用以在多种情况中增强免疫力。
因此，一方面，本发明提供了调控受试者体内的免疫应答的方法，包括给受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，使得受试者体内的的免疫应答得到调控。优选的是，免疫应答得到增强、刺激或上调。
一方面，本发明涉及使用抗PD-1抗体治疗受试者，使得受试者中肿瘤细胞的生长得到抑制。可以单独使用抗PD-1抗体来抑制癌性肿瘤的生长。或者，可以联合所述其它免疫原性剂、标准癌症治疗、或其它抗体来使用抗PD-1抗体。在一个实施方案中，可以序贯施用治疗性抗体的组合。例如，可以序贯施用抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体，诸如先施用抗CTLA-4后施用抗PD-1，或者先施用抗PD-1后施用抗CTLA-4。
可以使用本发明的抗体来进行治疗的优选癌症的非限制性例子包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素不应性前列腺腺癌)、乳癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。此外，可以使用本发明的方法来治疗的其它癌症的例子包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃肠、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物/肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴(spinal axis)肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏(Kaposi)肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些癌症)、及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症，尤其是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等人，Int.Immunol.17：133-144)。
优选的，为提高临床疗效，本发明的抗PD-1抗体还可以联合替尼类产品用于癌症的治疗。目前替尼类药物有RAF/MEK、ALK、c-Met、JAK等靶点，可以与本发明的抗PD-1抗体联合用于癌症治疗的替尼类药物包括Gefitinib(吉非替尼)，Osimertinib(奥希替尼)，Icotinib(埃克替尼)，Afatinib(阿法替尼)，Erlotinib(厄洛替尼)，Crizotinib(克唑替尼)，Alectinib(阿来替尼盐)，Ceritinib(色瑞替尼)，Trametinib(曲莫替尼)，Cobimetinib(可美替尼)，Axitinib(阿西替尼)，Lenvatinib(乐伐替尼)，Cabozantinib(卡博替尼)，Sunitinib(舒尼替尼)，Bosutinib(伯舒替尼)，Nilotinib(尼洛替尼)，Radotinib(拉多替尼)，Dasatinib(达沙替尼)，Apatinib(阿帕替尼)，Ponatinib(泊那替尼)，Ruxolitinib(芦可替尼)，Neratinib(来那替尼)，Lapatinib(拉帕替尼)，Ibrutinib(依鲁替尼)，Tofacitinib(托法替尼)，Baricitinib(巴瑞克替尼)和Olmutinib(奥莫替尼)等或其组合。优选的替尼类药物有依鲁替尼、厄洛替尼、阿西替尼、卡博替尼和曲美替尼。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗受试者中的传染病的方法，包括给受试者施用抗PD-1抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的传染病得到治疗。抗体介导的PD-1阻断可以单独使用，或作为佐剂，与疫苗联合，以刺激针对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。这种治疗方法可以对它特别有用的病原体的例子包括目前没有有效疫苗的病原体，或常规疫苗并非完全有效的病原体。这些包括但不限于HIV、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒(Influenza)、疱疹(Herpes)、贾第虫病(Giardia)、疟疾(Malaria)、利什曼虫病(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的感染和铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)引起的感染等。
通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。在此将整篇申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和已公开专利申请的内容明确收入本文作为参考。
实施例
一、抗PD-1单抗(鼠源)的产生
1.1免疫小鼠
取8周龄大小的雌性Balb/c小鼠，用hPD-1胞外段融合蛋白(购自abcam，货号为ab221398)与福氏完全佐剂(CFA,Sigma)混合乳化液皮下多点接种免疫，每只小鼠80-100μg蛋白，3周后用蛋白与不完全佐剂(IFA,Sigma)乳化液进行加强免疫，共免疫3次。每次在小鼠免疫2周左右取血清测定抗体效价，血清效价用ELISA方法通过酶标仪SpectraMax i3测定。当血清效价达到足够高时(图1)，用100μg hPD胞外段融合蛋白溶于PBS中，腹腔注射加强免疫一次，3天后取出脾脏进行融合。
1.2制备和筛选杂交瘤
杂交瘤细胞的产生通过免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0-Ag14)在聚乙二醇(PEG1450，SIGMA)融合剂作用下进行融合，融合的细胞悬于含有HAT(SigmaAldrich)选择培养液加入96孔培养板培养11天左右，利用ELISA方法通过SpectraMax i3鉴定培养上清。挑选出的阳性克隆再经过3遍以上有限稀释法进行亚克隆选择，确保是单一来源的阳性克隆。
1.3抗PD-1单抗(鼠源)的纯化
1.2所述亚克隆经常规杂交瘤细胞培养后，培养上清经HiTrap Protein G HP(购自GE Healthcare，货号为29048581)捕获后，以0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱，收集洗脱峰，再以HiTrap Desalting(购自GE Healthcare，货号为29048684)柱脱盐，置换缓冲液为1×PBS(pH7.4)。于-20度保存待用。
二、抗PD-1单抗(鼠源)的特性(阻断活性)
采用高表达PD-L1的人肺癌SPC-A1-PDL1细胞株、经过Alexa Fluor488Microscale Protein Labeling Kit(购自Thermo，货号为A30006)标记的hPD1/Fc ofhuman IgG1和按上述1.3纯化的抗PD-1单抗(鼠源)充分混合，4度孵育20～30分钟，洗涤后，在FACSVerse上机检测，结果如图2所示。图2为通过流式细胞法测定鼠PD-1抗体的阻断活性，其中横轴表示抗体浓度，纵轴表示阻断率，UM1-45/UM1-47/UM1-51/UM1-56/UM1-63/UM1-69代表发明人制备的不同的鼠源PD-1单克隆抗体，结果发现UM1-51、UM1-56和UM1-69阻断效果较好(图2)。
三、抗PD-1抗体(鼠源)的序列测定
根据杂交瘤制备技术(Kohler和Milstein，1975)及《分子克隆实验指南》(第3版)【Molecular Cloning，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译】中cDNA文库制备及其基因鉴定和DNA测序等章节操作。对UM1-51、UM1-56和UM1-69杂交瘤细胞提取总RNA，合成cDNA后进行测序。
首先利用RNA纯化试剂盒(RAeasy Mini Kit，Qiagen 74104，QIAshredder，Qiagen79654)从杂交瘤细胞提取和纯化总RNA。然后用试剂盒(SMARter RACE cDNAAmplification Kit,Clontech)并按公司试剂操作手册将RNA反转录合成第一链cDNA链。利用5’RACE技术，用试剂盒提供的通用引物UPM(universal primer)作为上游引物，和根据小鼠IgG1重链可变区和轻链κ链基因序列设计的基因特异引物GSP(gene specific primer)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板进行PCR扩增。然后将PCR产物分别连接到T载体(Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit，Invitrogen K2875-J10)。挑选克隆进行序列测定和分析，分别得到抗体的轻链和重链可变区序列，再根据重链可变区序列和小鼠IgG1序列设计引物，通过PCR获得重链全长序列，利用IGBLAST分析工具(KABAT)对序列进行分析，确定轻、重链CDR区域，如下表所示。
相对应的，UM1-51抗体的重链可变区序列(UM1-51-mVH)为：
编码UM1-51-mVH的DNA序列为：
gaggtgaagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaattgtcttgtgcagcctctggattcactttcagtagttatggaatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggtggtagtgacatctactatccagacagtgtcagggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaacctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccttatattactgtgcaagacaaaagggtacgacctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgaa(Seq ID No：20)
UM1-51抗体的轻链可变区序列(UM1-51-mVK)为：
编码UM1-51-mVK的DNA序列为：
gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctaggacagagggccaccatctcctgcagagccagcgaaagtgttgataattctggcattagttttatgaactggttacaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatcgattacaccagcaggctgcacagcggggtccctgccagatttagtgccagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctatggaggaagatgatattgcaatgtatttctgtcagcagggcaacaccctgccccccaccttcggtggaggcacaaagttggaaataaaa(Seq ID No：22)
UM1-56抗体的重链可变区序列(UM1-56-mVH)为：
编码UM1-56-mVH的DNA序列为：
gaggtgaagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctaaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtacctatggcatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggtggtcgttacacctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaacctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccttgtattactgtgcaagacaaaagggtacgacctggtttgctcactggggccaagggactctggtcactgtctctgca(Seq ID No：24)
UM1-56抗体的轻链可变区序列(UM1-56-mVK)为：
编码UM1-56-mVK的DNA序列为：
gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggtcaccatctcctgcagagccagcgaaagtgttgatgataatggcattagttttatgaactggttccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatcgatgctgcatccaaccaaggatccggggtccctgccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctatggaggaggatgatactgcaatgtatttctgtcagcaaagtaaggaggttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaataaaa(Seq ID No：26)
UM1-69抗体的重链可变区序列(UM1-59-mVH)为：
编码UM1-69-mVH的DNA序列为：
gaggtgaagctggtggagtctggtggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcatgtgcagcctctggattcgctttcagtagctatggcgtgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggtggtcgtgacacctactattcagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagagcaacctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccttatattattgtgcaagacaaaagggtacgacctggtttgctgactggggccaagggactctggtcactgtctctgca(Seq ID No：28)
UM1-69抗体的轻链可变区序列(UM1-69-mVK)为：
编码UM1-69-mVK的DNA序列为：
gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatctcctgcagggccagcgagagcgccgacagctacggcaacagcttcatgcactggttacaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatcgatagggccagcaacctggagagcggggtccctgccaggtttagtgccagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctatggaggaggatgatactgcaatgtatttctgtcagcagagcaacgaggaccccctgaccttcggtggaggcaccaagctggagataaaa(Seq ID No：30)
四、抗PD-1抗体(鼠源)的人源化
为了使抗体能够更好的应用于临床病人治疗，需要对抗体序列进行人源化改造，使其保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质(如降低其在人体中的免疫原性)。为了达到这一目的，根据优选的方法，通过用母体和人源化序列的三维模型分析母体序列及各种概念上的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型一般是可利用的，并为本领域技术人员所熟悉。几乎所有鼠抗体都可通过CDR嫁接来人源化，从而保持抗原结合性。相关的技术文献可以参考Sims等，1987，J.Immunol.，151：2296；Chothia等，1987，J.Mol.Biol.，196：901；Presta等，1993，J.Immnol.，151：2623；Carter等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285；Lo Benny K.C.等，载于Antibody Engineering：Methods and Protocols(抗体工程：方法和方案)，第248卷，Humana Press，New Jersey，2004。
在前述工作基础上，优选对UM1-56抗体进行人源化改造。首先将抗体重链恒定区换为人IgG4恒定区序列，同时把抗体轻链恒定区换成人的κ链恒定区，得到人鼠嵌合的母本抗体(Chimeric Ab)。在确认母本抗体的功能活性后对重链可变区和轻链可变区序列进行人源化改造，在CDR移植的基础上进行FR区关键氨基酸的回复突变。对于不能确定是否影响抗原和抗体结合的FR间氨基酸进行兼并合成，构建一系列IgG突变体。经过基于抗体亲和力和表达水平的筛选后，共得到3个重链变异体(重链UM1-56-H1，UM1-56-H2和UM1-56-H3)和3个轻链变异体序列(轻链UM1-56K-2，UM1-56K-6和UM1-56K-8)。将1个母本和6个变异体序列分别采用合适酶切位点使用常规分子克隆技术克隆到pcDNA3.1表达载体中，轻链或重链序列5’端携带Kozak序列及人IL-2信号肽：MYRMQLLSCIALSLALVTNS(Seq ID No：31)，其相应的核苷酸序列为：atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacgaattcg(SeqID No：32)。上述轻链及重链表达载体经两两组合，共9种轻链重链组合，9种组合的轻重链表达载体分别共瞬时转染ExpiCHO-S(Invitrogen)细胞可得到9个人源化抗体，纯化后的抗体经ELISA筛选后优选出4个人源化抗体，经流式细胞法按实施例二中方法进一步优选出hUM1-30(重链序列Seq IDNo：34，轻链序列Seq ID No：40)为最优人源化抗体(图7)。优化后的3个重链变异体和3个轻链变异体的DNA序列和氨基酸序列如下所示：
1.重链1(UM1-56H-1)
(1)重链UM1-56H-1DNA序列：
gaggtgcagttggtggagagcgggggggggctggtgcagcctggaggaagtttgaggttgagctgtgccgcaagcgggttcacatttagcacatatgga
atgagctgggtgaggcaggcacccggaaagggattggagtgggtgagtacaatctccggcggaggaaggtacacatactaccccgatagtgtgaaggg
ccggttcacaatctccagggacaacagcaagaacaccttgtacctgcagatgaacagcctgagggcagaagacaccgctgtgtactactgcgccaggca
gaaggggacaacctggtttgctcactggggccagggaaccctggtgaccgtgagctccgctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgc
tccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgacca
gcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctac
acctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcc
tggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccag
gaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccg
tgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaa
accatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctg
cctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactc
cgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa(Seq ID No：33)
(2)重链UM1-56H-1蛋白质序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMSWVRQAPGKGLEWVSTISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYL
QMNSLRAEDTAVYYCARQKGTTWFAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS
NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(Seq ID No：34)
2.重链2(UM1-56H-2)
(3)重链UM1-56H-2DNA序列：
gaggtgaagttggtggagagcgggggggggctggtgcagcctggaggaagtttgaggttgagctgtgccgcaagcgggttcacatttagcacatatgga
atgagctgggtgaggcaggcacccggaaagggattggagtgggtgagtacaatctccggcggaggaaggtacacatactaccccgatagtgtgaaggg
ccggttcacaatctccagggacaacagcaagaacaccttgtacctgcagatgaacagcctgagggcagaagacaccgctgtgtactactgcgccaggca
gaaggggacaacctggtttgctcactggggccagggaaccctggtgaccgtgagctccgctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgc
tccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgacca
gcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctac
acctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcc
tggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccag
gaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccg
tgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaa
accatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctg
cctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactc
cgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa(Seq ID No：35)
(4)重链UM1-56H-2蛋白质序列：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMSWVRQAPGKGLEWVSTISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYL
QMNSLRAEDTAVYYCARQKGTTWFAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS
NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(Seq ID No：36)
3.重链3(UM1-56-H3)
(5)重链UM1-56-H3DNA序列：
gaggtgcagttggtggagagcgggggggggctggtgcagcctggaggaagtttgaggttgagctgtgccgcaagcgggttcacatttagcacatatggaatgagctgggtgaggcaggcacccggaaagggattggagtgggtgagtacaatctctggcggaggaaggtacacatactacgccgatagtgtgaagggccggttcacaatctccagggacaacagcaagaacaccttgtacctgcagatgaacagcctgagggcagaagacaccgctgtgtactactgcgccaggcagaaggggacaacctggtttgctcactggggccagggaaccctggtgaccgtgagctccgctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa(Seq ID No：37)
(6)重链UM1-56-H3蛋白质序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMSWVRQAPGKGLEWVSTISGGGRYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQKGTTWFAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SeqID No：38)
4.轻链1(UM1-56K-2)
(1)轻链UM1-56K-2DNA序列：
gacattcagatgacccagagcccctcctccctctccgcctccgtgggagacagagttaccatcacctgcagggcctccgaatccgtggacgacaacggaatctccttcatgaactggtttcagcagaaacccggcaaggcccccaagctgctcatctacgctgcaagcaaccagggctccggcgtcccctcccgtttttccggctccgggtccggcaccgacttcaccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagtccaaggaggtcccctggaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaagacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(Seq ID No：39)
(2)轻链UM1-56K-2蛋白质序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDDNGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(Seq ID No：40)
5.轻链2(UM1-56K-6)
(3)轻链UM1-56K-6DNA序列：
gacattcagatgacccagagcccctcctccctctccgcctccgtgggagacagagttaccatcacctgcagggcctccgaatccgtggacgacaacggaatctccttcatgaactggtttcagcagaaacccggcaaggcccccaagctgctcatctacgctgcaagcaaccagggctccggcgtcccctcccgtttttccggctccgggtccggcaccgacttcaccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacttcgccacctacttctgccagcagtccaaggaggtcccctggaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaagacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(Seq ID No：41)
(4)轻链UM1-56K-6蛋白质序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDDNGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(Seq ID No：42)
6.轻链3(UM1-56K-8)
(5)轻链UM1-56K-8DNA序列
gacattcagatgacccagagcccctcctccctctccgcctccgtgggagacagagttaccatcacctgcagggcctccgaatccgtggacgacaacggaatctccttcatgaactggtttcagcagaaacccggcaaggcccccaagctgctcatcaacgctgcaagcaaccagggctccggcgtcccctcccgtttttccggctccgggtccggcaccgacttcaccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacttcgccacctacttctgccagcagtccaaggaggtcccctggaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaagacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(Seq ID No：43)
(6)轻链UM1-56K-8蛋白质序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDDNGISFMNWFQQKPGKAPKLLINAASNQGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSKEVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(Seq ID No：44)
五、人源化抗体的特性和功能
5.1人源化抗体的表达和纯化
实施例四制备得到分别含有抗体轻链(Seq ID No：39)和重链(Seq ID No：33)DNA序列的pcDNA3.1质粒，将其转化大肠杆菌DH5α，测序验证正确后保存甘油菌于-80度。取甘油菌平板划线，过夜培养后挑单菌落接种至3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，再次接种至150mL LB液体培养基中(添加终浓度100μg/mL氨苄青霉素)，于37℃过夜培养；使用天根无内毒素质粒大提试剂盒，分别提取抗体轻重链质粒(具体操作过程详见说明书)，测定质粒浓度后，于-20℃保存，待转染。
ExpiCHO-S细胞用30mL ExpiCHO expression medium(含0.5％Anti-clumpingAgent)于37℃，135rpm，8％CO2条件下培养，细胞密度为4-6X 106个细胞/mL时，以5X105个细胞/mL接种密度传代；连续传代2至3次后，可取部分传代细胞，台盼蓝染色法计数，进行转染。用ExpiFectamine CHO Transfection Kit瞬时转染试剂盒；取1.5X 108个细胞离心，弃上清，加入25.5mL新鲜的ExpiCHO expression medium重悬细胞；取20μg抗体质粒(轻链质粒10μg，重链质粒10μg)，溶于1mL预冷的OptiPRO SFM无血清培养基中，轻轻混匀；取80μL转染试剂，加入920μL预冷的OptiPRO SFM无血清培养基，轻轻混匀；将转染试剂溶液与质粒溶液混合，室温静置1-5min后加入ExpiCHO-S细胞培养液中；采用Standard培养模式，转染后18-22h，添加150μL Enhancer和6mL Feed；待细胞活率降至75％时，收获细胞；将离心后获得的细胞上清0.22μm滤器过滤后在AKTAavant上将细胞培养上清上样，过ProA预装柱(GEHitrap ProteinA HP 1ml)。分离条件：上样结束后用PBS缓冲液洗柱，用0.1M甘氨酸(pH3.5)洗脱，0.1M甘氨酸(pH2.0)再生(图3)。
将纯化后蛋白hUM1-30(2ml左右)吸入截留分子量为30kD的超滤离心管，加入约15ml PBS缓冲液，4000×g离心5min*2次，4000×g离心10min*3次。将收集的蛋白用2ml注射器吸出，0.22μm过滤，分装，-80C保存。根据DNA测序和蛋白N端测序结果，纯化获得的抗体hUM1-30的轻链氨基酸序列如Seq ID No：40所示，重链氨基酸序列如Seq ID No：34所示。
5.2SDS-PAGE检测抗体的分子量
1、配制6％或12％分离胶、5％浓缩胶；
2、样品处理：取样品6ul，分别加入1.5ul 5*还原loading buffer和1.5ul 5*非还原loading buffer，95℃金属浴煮3min；
3、上样：每孔加入5ul处理后的样品。60V电泳跑浓缩胶，120V跑分离胶至样品分离。考马斯亮蓝染色40min。用脱色液脱色至条带清晰，用凝胶成像仪拍照保存。
图4-1为hUM1-30还原条件下条带为重链50KD左右，轻链25KD左右，没有其他杂带。图4-2为非还原条件下显示主条带分子量在150kD左右。
5.3UPLC-SEC检测抗体的纯度
配置100mM磷酸钠缓冲溶液调节pH至6.80，0.1mL/min平衡色谱柱(Waters,BEHSEC 200 4.6*150mm)至压力波动<10psi,然后将流速调至0.4mL/min。样品经0.22um滤膜过滤，过滤后加到相应的样品盘位置，每个样至少20uL。基线平稳后，选定相应仪器磷酸钠100mM，，进样体积2uL,时间7min，点击运行。进样结束后，低流速(小于0.2mL/min)冲洗色谱柱至少10个柱体积，保存于20％甲醇溶液中。
hUM1-30抗体纯化如图5所示,主峰占96.70％。
5.4Octet测定亲和力
将待测抗体配成50nM倍半稀释的6个浓度，同时设置一个Buffer空白孔和50nM抗原(Human PD1/PDCD1 Protein Biotinylated,Sinobiological，Cat.No.10377-H03H-B)空白孔；将5ug/ml抗原固定在SA传感器上，固化高度约0.6nm；按照设定好的程序；(Baseline:120s；Loading:60s；Baseline:120s；Association:300s；Dissoc iation:1800s)在OctetRed96仪器(Fortebio公司)上测定待测抗体的亲和力。用Octet Red96配套软件拟合计算亲和力数据(图6)。
| 抗体 | KD(M) | Kon(1/Ms) | Kdis(1/s) | Full R2 |
| Opdivo | 2.58E-11 | 1.56E+06 | 4.02E-05 | 0.9965 |
| hUM1-30 | 3.34E-12 | 1.63E+06 | 5.43E-06 | 0.9974 |
hUM1-30的亲和力为3.34*E-12M，Opdivo的亲和力为2.58*E-11M，hUM1-30的解离系数为5.43*E-06(1/s)，Opdivo的解离系数为4.02*E-05(1/s)。显示hUM1-30具有更低的解离速率，亲和力比Opdivo高1个数量级。
5.5流式检测测定阻断活性
贴壁培养表达PD-L1的人肺癌细胞株SPC-A1-PDL1至合适细胞密度，吸弃培养基，用PBS清洗两次，加入0.2-0.5ml 0.25％胰酶-EDTA放置细胞培养箱中消化1-2min，不可消化时间过长，用RPMI-1640(10％FBS)终止消化，细胞计数，每管1～5*10^5个cells。离心机2000rpm离心，3分钟，吸弃上层培养基，加入适量1*PBS重悬细胞，再次2000rpm离心，3分钟，重复2次。加不同浓度的待测抗体和荧光标记的PD1(Dimeric)混合物；并设置同型、阳性对照每管加100ng的hPD-1/hFc-FITC和不同浓度的待检抗PD-1抗体(0ng、50ng、100ng、200ng、400ng、800ng、1600ng和3200ng)，混匀，一管同型对照，4度放置20～30Min。1*PBS洗涤1～3次，加适量1*PBS调整细胞浓度，上机检测(结果如图7所示)。数据显示随着抗体浓度的增加，PD-1与PD-L1的结合被阻断的更多，加入hUM1-30至1.6ug可以阻断PD-1与PDL1的结合。
5.6肺癌模型鼠检测消除肿瘤效果
将高表达PD-L1的人肺癌细胞株SPC-A1-PDL1在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中进行培养，约2-3天传代1次至合适细胞数量，另密度梯度离心法提取健康成人PBMC，提取后进行洗涤、计数，备用。采用4-5周龄雌性免疫缺陷NCG小鼠(购自南京大学-南京生物医药研究院，IVC架子独立供水和供气系统饲养)，将SPC-A1-PDL1细胞消化后与PBMC按合适比例混合后按3x10^7cells/ml的接种密度接种在小鼠上，每只小鼠接种1处在右侧翼下。一般接种后3-5天成瘤，7-9天瘤体可达100-250mm3，入组时测量小鼠体重和瘤体体积，剔除掉瘤体小于80mm3或大于250mm3的小鼠或其它异常状态小鼠，然后将符合要求的小鼠按随机分配方法分配至不同的实验组别中。
入组后，根据组别给予实验抗体(hUM1-30)、阳性对照抗体(Opdivo)及阴性对照抗体(human IgG4，记为hIgG4)，抗体浓度为1mg/ml，腹腔注射，首剂量加大，PD1抗体首剂量为250ug/只，之后按200ug/只/次，每3天给药1次，直至给6次，即q3dx6次；每次给药前测量瘤体体积，每周测2-3次，一般在给药前测试。
经过6次的抗体治疗，如图8所示，hUM1-30组与Opdivo组，hIgG4组相比，肿瘤体积增长得到更显著的抑制。从给药2次到6次，hUM1-30抑制瘤体增殖的能力明显优于Opdivo。从生存曲线看，如图9所示，hUM1-30组具有更好的生存率。具体到个体上，如图10，图11，图12所示，hUM1-30组小鼠瘤体明显被抑制，甚至快消失。而Opdivo只有1只小鼠瘤体被明显抑制，有1只小鼠给药后瘤体反而增殖更快，甚至比阴性对照组hIgG4组更快，出现超进展现象。hUM1-30抗体和Opdivo抗体均能延长模型鼠的生存期(图9)，但延长时间不同，hUM1-30优于Opdivo。
比较而言，hUM1-30对SPC肺癌模型鼠，比商品化的Opdivo能更好地消除肿瘤。
Claims (10)
1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含与选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：13所示一致的氨基酸序列；
(b)重链可变区CDR2，其包含与选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：14所示一致的氨基酸序列；
(c)重链可变区CDR3，其包含与选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：15所示一致的氨基酸序列；
(d)轻链可变区CDR1，其包含与选自SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：16所示一致的氨基酸序列；
(e)轻链可变区CDR2，其包含与选自SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：17所示一致的氨基酸序列；和
(f)轻链可变区CDR3，其包含与选自SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：18所示一致的氨基酸序列；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列一致，以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列一致；或
(b)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列一致，以及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列一致；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链和轻链可变区序列：
(a)重链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：27所示一致的氨基酸序列；
(b)轻链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：29所示一致的氨基酸序列；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列一致；以及轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列一致；或
(b)重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列一致；以及轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列一致；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为包含人或鼠恒定区的全长抗体。
6.一种分离的单克隆抗体，其包含：
(a)重链，其序列与SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列一致；以及
(b)轻链，其序列与SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列一致；
其中所述抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。
7.编码权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分的分离的多核苷酸。
8.药物组合物，其包含权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分以及可药用载体。
9.权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分在制备用于治疗癌症疾病的药物中的用途。
10.权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分在制备用于治疗感染性疾病的药物中的用途。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2019105821958 | 2019-06-30 | ||
| CN201910582195 | 2019-06-30 | ||
| CN201910916750.6A CN112225809B (zh) | 2019-06-30 | 2019-09-26 | 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910916750.6A Division CN112225809B (zh) | 2019-06-30 | 2019-09-26 | 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117447596A true CN117447596A (zh) | 2024-01-26 |
Family
ID=74101108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311022817.4A Pending CN117447596A (zh) | 2019-06-30 | 2019-09-26 | 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117447596A (zh) |
| WO (1) | WO2021000813A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113425856B (zh) * | 2021-07-07 | 2022-01-04 | 浙江康佰裕生物科技有限公司 | 一种含有基因修饰的溶瘤病毒的药物组合物及其在治疗癌症的用途 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112457403B (zh) * | 2013-09-13 | 2022-11-29 | 广州百济神州生物制药有限公司 | 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途 |
| CN105061597B (zh) * | 2015-06-09 | 2016-04-27 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 一种抗pd-1的单克隆抗体及其获得方法 |
| PL3328419T3 (pl) * | 2015-07-30 | 2021-12-27 | Macrogenics, Inc. | Cząsteczki wiążące pd-1 i sposoby ich zastosowania |
| KR20180054824A (ko) * | 2015-09-29 | 2018-05-24 | 셀진 코포레이션 | Pd-1 결합 단백질 및 이의 사용 방법 |
| CN105566496B (zh) * | 2015-11-26 | 2019-04-02 | 大庆东竺明生物技术有限公司 | 阻断人程序性死亡因子1(pd-1)功能的单克隆抗体及其编码基因和应用 |
| CN106928361A (zh) * | 2015-12-31 | 2017-07-07 | 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 | 一种抗人pd-1的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
| CN108546297B (zh) * | 2018-03-29 | 2019-08-02 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 针对pd-1的单克隆抗体及其应用 |
-
2019
- 2019-09-26 CN CN202311022817.4A patent/CN117447596A/zh active Pending
-
2020
- 2020-06-29 WO PCT/CN2020/098698 patent/WO2021000813A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021000813A1 (zh) | 2021-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230064544A1 (en) | Anti-ctla4 monoclonal antibody or its antigen binding fragments, pharmaceutical compositions and uses | |
| CN108779179B (zh) | Cd47抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| JP6432121B2 (ja) | Ｐｄｌ−１抗体、その医薬組成物及びその使用 | |
| TWI771361B (zh) | 人程序性死亡受體pd-1的單株抗體及其片段 | |
| KR102340832B1 (ko) | 항 pd-1 항체 및 그의 용도 | |
| CN106967172B (zh) | 抗ctla4-抗pd-1 双功能抗体、其药物组合物及其用途 | |
| WO2020043184A1 (zh) | 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途 | |
| CN109912717B (zh) | 结合cd40的抗体及其用途 | |
| AU2019264965A1 (en) | Antibodies specific to human Nectin4 | |
| EP3882276A1 (en) | Bispecific antibody, preparation method therefor and application thereof | |
| TW201900679A (zh) | 細胞毒性t淋巴球相關蛋白4 (ctla-4) 之新穎單株抗體 | |
| CN116003625A (zh) | 包含抗TIGIT抗体和TGF-βR的融合蛋白、其药物组合物及用途 | |
| CN112225809B (zh) | 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用 | |
| RU2761638C1 (ru) | Антитела против лиганда программируемой смерти (pd-l1) и их применение | |
| WO2021000813A1 (zh) | 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用 | |
| CN116419970B (zh) | 低毒性抗ox40抗体、其药物组合物及应用 | |
| CN116829591A (zh) | 针对cd112r的抗体及其用途 | |
| CN112969715A (zh) | 一种抗cd47抗原结合蛋白及其应用 | |
| CN114437215B (zh) | 抗人cd38抗体及其制备方法和用途 | |
| WO2023284741A1 (zh) | Pd-1抗体及其用途 | |
| EA042365B1 (ru) | Бифункциональное антитело против ctla4 и против pd-1, его фармацевтическая композиция и их применение | |
| CN110845614A (zh) | 人细胞表面免疫调节分子 | |
| NZ791621A (en) | Anti-CTLA4 and anti-PD-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
| NZ791623A (en) | Anti-CTLA4 and anti-PD-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
| EA042479B1 (ru) | Моноклональное антитело против pd1, его фармацевтическая композиция и их применение |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |