CN110343180A

CN110343180A - 抗ctla-4抗体及其应用

Info

Publication number: CN110343180A
Application number: CN201910677706.4A
Authority: CN
Inventors: 高新; 潘秀颉; 钱尼良; 徐桂利; 徐勤枝; 刘玉杰; 杨翠马; 李宏杰
Original assignee: Beijing Immune Ark Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Immune Ark Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2019-07-25
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2039-07-25
Also published as: CN110343180B

Abstract

本申请提供了新的抗CTLA‑4的抗体或其抗原结合片段。本申请还提供了所述抗体或其抗原结合片段的相关用途。

Description

抗CTLA-4抗体及其应用

技术领域

本申请涉及抗体领域，更具体地，本申请涉及抗CTLA-4抗体及其应用。

背景技术

近年来，免疫治疗已成为手术、化学治疗及放射治疗外的第四大治疗方式而大量用于黑色素瘤、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的治疗。在抗肿瘤免疫中，T细胞是对抗肿瘤细胞的主要效应细胞。肿瘤相关抗原通过抗原提呈过程，被T细胞表面的T细胞受体(T cellreceptor，TCR)识别(第一信号)，在CD4或CD8的帮助下激活下游信号通路。然而，单单TCR信号通路无法进行有效活化，T细胞同时还需在众多的共刺激信号分子(第二信号)辅助下激活下游通路，从而使得针对肿瘤的特异性T细胞活化、扩增并杀伤靶细胞，而不对非靶细胞(正常细胞)产生反应，以保证反应的特异性。另一方面，在免疫反应中，T细胞及免疫反应环境中存在共抑制信号分子(即免疫检查点分子)，精细调节T细胞反应的强度和质量，以最大程度发挥免疫反应而最大限度减少对于周围正常组织的损伤。然而肿瘤细胞可以利用T细胞的免疫检查点机制，通过分泌抑制性细胞因子/表面分子等方式诱导共抑制分子及其相关配体的异常上调，从而抑制T细胞激活，逃避免疫杀伤，其中CTLA-4是作用最广泛、效应最强的免疫检查点之一，通过与其配基CD80/CD86结合，CTLA-4可阻断最重要的共刺激分子CD28辅助T细胞的活化作用，从而在淋巴器官及肿瘤微环境中促使T细胞抗肿瘤功能的丧失。因此，阻断CTLA-4的抑制作用是增强T细胞激活的最为有效的策略之一，也是第一个上市的免疫检查点抑制抗体类药物Ipilimumab的设计初衷。

然而，Ipilimumab(商标名称为Yervoy，百事美施贵宝公司)可致广泛的免疫相关不良反应，包括腹泻、皮疹、肠炎等，甚至发生严重致命性自身免疫反应，因而限制了该药物的临床应用。免疫相关不良反应也是靶向CTLA-4类免疫检查点抑制药物未能广泛上市的主要原因。Ipilimumab发生免疫相关不良反应的主要原因是其与CTLA-4的亲和力高，无论CTLA-4高表达还是低表达的T细胞，均被该药物广泛阻断与其配基的结合，致使机体多个非肿瘤部位也可产生免疫增强作用，从而引发免疫毒性。

已有文献及我们的研究均表明，CTLA-4在肿瘤中的调节性T淋巴细胞(Treg)上高表达，明显高于肿瘤以外其他器官中的Treg上的表达水平，而且，CTLA-4在Treg细胞表面的表达水平，也明显高于非Treg细胞。因此，抑制或清除肿瘤内的Treg细胞，能够诱导并增强抗肿瘤免疫效应。

发明内容

本申请设计筛选了亲和力适中、能够结合CTLA-4，而不阻断其与配基作用的单克隆抗体，通过结合于高表达CTLA-4的Treg细胞，在抗体介导细胞毒(ADCC)作用下，特异性清除肿瘤中的Treg细胞，而对于其它组织中低表达CTLA-4的T细胞不产生影响，不干扰正常组织中Treg细胞的免疫平衡功能，从而在发挥抗肿瘤效应的同时，能够减少免疫反应相关毒性。

第一方面，本申请提供了特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分，其包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中所述HCDR1序列为SFGMH(SEQ ID NO:1)，所述HCDR2序列为YISSGSSTIYYADTVKG(SEQ ID NO:2)，所述HCDR3序列为SSSLLRLRDWYFDV(SEQID NO:3)。

在可选的实施方案中，上述抗原结合部分选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段或单域抗体。

在一些实施方案中，所述特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分还包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其中所述LCDR1序列为KASQSVSNDVA(SEQ ID NO:4)，所述LCDR2序列为YASNRYT(SEQ ID NO:5)，所述LCDR3序列为QQDYISPPT(SEQ ID NO:6)。

在一些实施方案中，所述CTLA-4为灵长类CTLA-4。

在一些实施方案中，所述特异性结合CTL-4的抗体为单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述特异性结合CTLA-4的抗体为鼠源化抗体。

在一些实施方案中，所述特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分以1×10^-9至1×10^-8M的KD特异性结合CTLA-4。

在一些实施方案中，所述特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分不阻断CTLA-4与其配基CD80和/或CD86的结合。

在一些实施方案中，所述特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分能够刺激T细胞的活化及增殖。

第二方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面所述的特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分或其重链或轻链。

第三方面，本申请提供了表达载体，其包含第二方面所述的核酸分子。

第四方面，本申请提供了宿主细胞，其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表达载体。

第五方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种其他活性成分。在一些实施方案中，所述活性成分为化疗剂、PD-1结合拮抗剂等。

第六方面，本申请提供了疫苗，其包含第一方面所述的特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分，以及任选的免疫佐剂。

在一些实施方案中，第五方面所述的药物组合物或第六方面所述的疫苗用于治疗CTLA-4相关的疾病，例如肿瘤。

第七方面，本申请提供了第一方面所述的特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分，第二方面所述的核酸分子，第三方面所述的表达载体，第四方面所述的宿主细胞，或者第五方面所述的药物组合物在制备用于抑制Treg功能、杀死表达CTLA-4的细胞、引发T细胞介导的反应、和/或有效抑制肿瘤生长的药物中的用途。

第八方面，本申请提供了第一方面所述的特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分，第二方面所述的核酸分子，第三方面所述的表达载体，第四方面所述的宿主细胞，或者第五方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗CTLA-4相关的疾病，例如肿瘤的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述肿瘤选自实体瘤及其转移瘤。在具体的实施方案中，所述肿瘤选自以下中的一种或多种：结肠癌、黑色素瘤、间皮质瘤、肾细胞癌和淋巴瘤。

第九方面，本申请提供了检测试剂或者试剂盒，其包含第一方面所述的特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分。

在其他方面，本申请提供了预防和/或治疗CTLA-4相关的疾病，例如肿瘤的方法，其包括给予有需要的个体第一方面所述的特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分，第二方面所述的核酸分子，第三方面所述的表达载体，第四方面所述的宿主细胞，第五方面所述的药物组合物，或第六方面所述的疫苗。任选地，所述方法还包括联合施用其他的治疗剂，例如化疗剂、PD-1结合拮抗剂等。

本申请的特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分能够特异性与CTLA-4结合，具有以下的一种或多种效应：不影响T细胞表面CTLA-4与其配基CD80和/或CD86的结合，刺激T细胞的增殖活化，诱导CTLA-4介导的抗肿瘤免疫应答，和/或抑制肿瘤生长等。

附图的简要说明

图1显示了通过流式筛选不阻断人CTLA-4与人CD80结合的单克隆杂交瘤上清，图中显示的是30个单克隆杂交瘤上清中有8个克隆不具有阻断作用。

图2显示了通过流式筛选不阻断人CTLA-4与人CD80结合的单克隆杂交瘤纯化抗体，其中5E3不具有阻断作用。

图3显示了抗CTLA-4单克隆抗体对MC38荷瘤的CTLA-4人源化小鼠的肿瘤、脾脏及外周血中Treg及Treg表面CTLA-4表达的作用。

图4显示了抗CTLA-4单克隆抗体对MC38荷瘤的CTLA-4人源化小鼠的肿瘤体积变化的作用。

图5显示了抗CTLA-4单克隆抗体实验结束后MC38荷瘤的CTLA-4人源化小鼠肿瘤的解剖照片。

图6显示了抗CTLA-4单克隆抗体实验结束后MC38荷瘤的CTLA-4人源化小鼠肿瘤重量统计结果。

图7显示了抗CTLA-4单克隆抗体及对照抗体与PD-1抗体联用后对CTLA-4人源化小鼠血红蛋白、红细胞及血小板的毒性作用。

图8显示了抗CTLA-4单克隆抗体及对照抗体与PD-1抗体联用后CTLA-4人源化小鼠骨髓红系细胞的流式分析图。

图9显示了抗CTLA-4单克隆抗体及对照抗体与PD-1抗体联用后CTLA-4人源化小鼠骨髓红系细胞的分期的统计结果。

图10显示了抗CTLA-4单克隆抗体及对照抗体与PD-1抗体联用后CTLA-4人源化小鼠脾脏中T细胞的分析统计结果。

图11显示了抗CTLA-4单克隆抗体及对照抗体与PD-1抗体联用后CTLA-4人源化小鼠肺脏病理结果。

图12显示了抗CTLA-4单克隆抗体及对照抗体与PD-1抗体联用后CTLA-4人源化小鼠肝脏病理结果，箭头标识淋巴细胞浸润。

图13显示了抗CTLA-4单克隆抗体及对照抗体与PD-1抗体联用后CTLA-4人源化小鼠心脏病理结果，箭头标识心内膜下心梗，三角标识淋巴细胞浸润。

序列说明

SEQ ID NO:1为编号为5E3的单克隆抗体的HCDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2为编号为5E3的单克隆抗体的HCDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3为编号为5E3的单克隆抗体的HCDR3的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4为编号为5E3的单克隆抗体的LCDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5为编号为5E3的单克隆抗体的LCDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6编号为5E3的单克隆抗体的LCDR3的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7为编号为5E3的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8为编号为5E3的单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列。

具体实施方式

本申请提供了能特异性结合CTLA-4的新型抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分。本申请的抗体或其抗原结合部分能结合靶细胞表面的CTLA-4分子、并且不阻断CTLA-4与其配基CD80和/或CD86的结合。本申请还提供了编码该抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含核酸分子的表达载体、包含核酸分子或表达载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法以及所述抗体或其抗原结合片段的医学和生物学应用，例如预防或治疗CTLA-4相关疾病或病症。

除非另外指明，本发明的实施将采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。

除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

如本文所用的，术语“抗体”指包含四条多肽链，即通过双硫键互连的两条重链(H)及两条轻链(L)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(缩写为VH)及重链恒定区(缩写为CH)。重链恒定区包含三个域，即CH1、CH2及CH3。各轻链包含轻链可变区(缩写为VL)及轻链恒定区(缩写为CL)。轻链恒定区包含一个域(CL1)。VH及VL区可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其中穿插有称为构架区(FR)的保守区。在一些实施方案中，从N-末端至C-末端，轻链与重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3与FR4。

如本文所用的，术语抗体的“抗原结合部分”是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区段。抗原结合部分可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术从完整抗体分子制备，所述标准技术包括蛋白水解消化或重组遗传工程化技术等。抗原结合部分的非限制性实例包括：Fab片段、F(ab')₂片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)分子、单域抗体、dAb片段及由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的CDR)。术语“抗原结合部分”也包括其它工程化的分子，如双抗体、三抗体、四抗体及微型抗体等。例如，本文中所述Fd片段指由VH与CH1结构域组成的抗体片段；Fv片段由抗体的单臂中VL与VH结构域组成；dAb片段(Ward et al.，Nature 1989；341：544-546)由VH结构域组成。

本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义，例如参见Kabat et al.,“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，National Institutes of Health,Bethesda，MD.(1991)；Al-Lazikani et al.，J Mol Biol 273:927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。在本文中，重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为HCDR1、HCDR2及HCDR3；轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为LCDR1、LCDR2及LCDR3。

对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。

如本文所用的，术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合于两种或更多种与其序列相关的抗原。例如，本发明的抗体可特异性结合于人类与非人类(例如小鼠或非人类灵长动物)的CTLA-4。

如本文所用的，术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(参见，美国专利号4,816,567；和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。

如本文所用的，术语“鼠源化抗体”是指其中所有恒定结构域序列均为小鼠序列的任何抗体。此类抗体可通过杂交瘤产生。

如本文所用的，术语“嵌合抗体”是指包含来自两种或多种不同抗体的区段的抗体。在一些实施方案中，一个或多个CDR衍生自小鼠抗CTLA-4抗体。在另一些实施方案中，所有CDR均衍生自小鼠抗CTLA-4抗体。

可额外用于抗体方法中的合适的技术包括基于CTLA-4的亲和纯化、非变性凝胶纯化、HPLC或RP-HPLC、分子排阻、在蛋白A柱上纯化、或这些技术的任何组合。可使用ELISA测定法测定CTLA-4抗体同种型，例如可使用鼠Ig吸附的抗人Ig鉴定人Ig。

可通过本领域已知的多种标准的蛋白纯化或重组表达技术中的任何一种来产生适于产生抗体的CTLA-4。适于产生免疫应答的CTLA-4的形式包括CTLA-4子序列(例如免疫原性片段)。另外的CTLA-4的形式包括CTLA-4表达细胞、含有CTLA-4的制品或细胞提取物或级分、部分纯化的CTLA-4。

如本文所用的，术语“同一性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同一性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。本文所述的“至少80％同一性”是指同一性为80％至100％任一值，例如85％、90％、95％、99％等。

如本文所用的，术语“CTLA-4相关疾病”包括与CTLA-4信号通路相关的疾病和/或症状。示例性CTLA-4相关疾病或病症包括肿瘤，例如结肠癌、黑色素瘤、间皮质瘤、肾细胞癌、淋巴瘤、晚期实体瘤以及上述的转移瘤。

第一方面，本申请提供了特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分，其包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区，其中HCDR1序列为SFGMH(SEQ ID NO:1)，HCDR2序列为YISSGSSTIYYADTVKG(SEQ ID NO:2)，HCDR3序列为SSSLLRLRDWYFDV(SEQ ID NO:3)。

在可选的实施方案中，所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段或单域抗体。

本文公开的抗体或其抗原结合部分在包含重链可变区的基础上还可以进一步包含轻链可变区，该轻链可变区含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中LCDR1序列为KASQSVSNDVA(SEQ ID NO:4)，LCDR2序列为YASNRYT(SEQ ID NO:5)，LCDR3序列为QQDYISPPT(SEQ ID NO:6)。

在一些具体的实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分的重链可变区与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少80％的同一性，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。在一些具体的实施方案中，上述抗体重链可变区由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。

在一些具体的实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合部分的轻链可变区与SEQ ID NO:8的序列具有至少80％的同一性，例如具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。在一些具体的实施方案中，所述抗体轻链可变区由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，本文公开的抗体的重链可变区或轻链可变区可以在上述所列举的各自对应的具体氨基酸序列的基础上取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且得到的变体仍保持结合CTLA-4的活性。

在某些实施方案中，上述氨基酸取代、缺失或添加的数目为1-30个或1-30个之间的任一数值，优选为1-20个，更优选为1-10个。在优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在更优选的实施方案中，序列变体与原氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。在具体的实施方案中，所述氨基酸取代为保守性取代。

本文公开的抗体或其抗原结合部分能够特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分显示物种与分子选择性。在一些具体的实施方案中，抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分特异性结合灵长类CTLA-4，或者与灵长类CTLA-4具有高度同一性的物种的CTLA-4。在一些具体的实施方案中，抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分特异性结合人CTLA-4。在一些具体的实施方案中，抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分特异性结合猴CTLA-4。在一些更具体的实施方案中，抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分特异性结合猕猴或恒河猴CTLA-4。在一些其它的实施方案中，抗CTLA-4抗体不与小鼠、大鼠、狗或兔CTLA-4结合。

如本文所用的，术语“KD”指平衡解离常数，其系自kd对ka的比率(亦即kd/ka)获得且以摩尔浓度(M)表示。可使用业内充分确立的方法测定抗体的KD值。测定抗体的KD的优选方法系通过使用表面等离子共振，优选使用生物传感器系统(例如SPR系统)或流式细胞术及Scatchard分析。

如本文所用的，术语对IgG抗体的“高亲和力”系指抗体对于靶抗原具有10^-8M或更小，优选10^-9M或更小，且更优选10^-10M或更小的KD。然而，对于其他抗体同型，“高亲和力”结合可能是变化的。举例而言，对于IgM同型的“高亲和力”结合系指抗体具有10^-7M或更小，优选10^-8M或更小的KD。

如本文所用的，术语“抑制CTLA-4配基与CTLA-4结合”的抗体是指抑制CTLA-4配基CD80和/或CD86与CTLA-4的结合，例如在使用瞬转人CTLA-4的293T细胞的结合测定中抑制CD80和/或CD86与CTLA-4的结合的抗体，在本领域公认的方法(例如本文所述基于FACS的结合测定)中，一定抗体浓度下能够部分或全部阻断0.4μg/ml的CTLA-4配基CD80与CTLA-4的结合。

如本文所用的，术语“抑制”或“阻断”(例如，在提及细胞上CTLA-4配基与CTLA-4的结合的抑制/阻断时)可互换使用，且涵盖部分的和完全的抑制/阻断。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体将CD80和/或CD86与CTLA-4的结合抑制不超过20％，例如约10％、5％或1％。

如本文所用的，术语“核酸分子”意在包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cDNA。

在一些更具体的实施方案中，本文公开的抗体为抗人CTLA-4单克隆抗体。CTLA-4抗体类型与亚型可由本领域已知的任何方式确定。通常，抗体类型与亚型可使用特异于特定抗体类型与亚型的抗体确定。

在一些实施方案中，抗CTLA-4活化型单克隆抗体可通过以下至少一种机制抑制或根除肿瘤：增强活化肿瘤特异性CD4⁺与CD8⁺淋巴细胞，抑制瘤内Treg细胞，并增强肿瘤杀伤性记忆细胞等。

在一些实施方案中，本文公开的抗体可有效抑制瘤内Treg细胞，并激活肿瘤杀伤性T细胞(例如激活hCTLA-4KI鼠体内特异性T细胞)。

在一些实施方案中，特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分能够杀死表达CTLA-4的细胞，例如表达高水平CTLA-4的细胞。

在一些实施方案中，本文公开的抗体可以抑制肿瘤的生长。例如，在一些具体的实施方案中，本文公开的抗体可以抑制hCTLA-4KI鼠的MC38皮下移植瘤的生长。在一些具体的实施方案中，上述抗体抑制肿瘤生长至少达80％、85％或90％。在一些实施方案中，在荷瘤个体接受本文公开的抗体处理后14天即可检测到抑制肿瘤生长的情形。在另一些实施方案中，在初次接受抗体处理后6天即可检测到抑制肿瘤生长的情形。

本申请还提供了编码本文公开的抗体或其抗原结合部分的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体、包含所述核酸分子或表达载体的宿主细胞、以及制备和纯化该抗体的方法。

在一些实施方案中，编码所述抗体或其抗原结合部分的核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述表达载体转化过的宿主细胞识别。

在一些实施方案中，任何合适的表达载体都可以用于本申请。例如，表达载体可以包括但不限于pQK1、pTT5、pUC57、pDR1、pcDNA3.1(+)、pDHFF及pCHO 1.0中的任一种。表达载体中可以包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

在一些实施方案中，可用的宿主细胞为含有上述表达载体或核酸分子的细胞，可以是真核细胞，例如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本申请的抗体或其抗原结合部分的表达，包括但不限于HEK 293细胞、COS细胞、CHO细胞、NS0细胞、sf9细胞及sf21细胞等，均可适用于本发明。宿主细胞也可以为含有上述表达载体的原核细胞，例如可以为DH5α、BL21(DE3)或TG1等。

在一些实施方案中，本文公开的抗CTLA-4单克隆抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养宿主细胞，从而表达抗CTLA-4单克隆抗体；分离和纯化表达的抗CTLA-4单克隆抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

在一些实施方案中，可以利用亲和层析的方法对本文公开的抗CTLA-4抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的抗CTLA-4抗体。

在一些实施方案中，动物接种CTLA-4抗原后，可自动物体内得到抗体和/或产生抗体的细胞。产生抗体的永生化细胞系可由经免疫的动物体中分离出的细胞制备。免疫接种后，处死动物，取淋巴结和/或脾脏B细胞进行永生化处理，经过致癌性化合物及诱变化合物处理，与永生化细胞(例如骨髓瘤细胞)融合，去除肿瘤抑制基因的活性。若使用骨髓瘤细胞进行融合时，该骨髓瘤细胞最好不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性细胞系)。使用CTLA-4、其部分或表达CTLA-4的细胞筛选永生化细胞。在优选的实施方案中，初次筛选是利用酶联免疫分析法(ELISA)进行。选取产生抗CTLA-4抗体的细胞例如杂交瘤进行克隆，再进一步筛选所需的特性，包括生长良好、抗体产量高以及具有所需抗体特性等。杂交瘤的筛选、克隆及扩增方法是本领域普通技术人员熟知的。在一些实施方案中，经免疫接种的动物为非人类动物，其中脾脏B细胞与来自与该非人类动物相同物种的骨髓瘤细胞系融合。在一些实施方案中，该经免疫接种的动物为Balb/c小鼠且骨髓瘤细胞系为非分泌性小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。

本申请提供了药物组合物，其包含本文公开的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。本文公开的上述抗CTLA-4抗体(例如抗人CTLA-4单克隆抗体)可以和药学上可接受的载体一起配制成药物制剂，从而更稳定地发挥疗效。在一些实施方案中，这些制剂可以保证本文公开的抗CTLA-4抗体(例如抗人CTLA-4单克隆抗体)的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱酰胺或氧化)。在一些实施方案中，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下至少一年保存稳定。在一些实施方案中，对于冻干制剂，在30℃下至少六个月保持稳定。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种其他活性成分。在一些实施方案中，所述活性成分为抗肿瘤药物。

本申请提供了疫苗，其包含第一方面所述的特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分，以及任选的免疫佐剂。所述免疫佐剂包括但不限于：1)生物性佐剂，例如细菌或其产物(如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-l、白细胞介素-2、干扰素-γ等；2)无机佐剂，例如氢氧化铝、明矾、磷酸铝等；3)人工合成佐剂，例如双链多聚肌苷酸、胞苷酸、双链多聚腺苷酸；4)油剂，例如花生油乳化佐剂、矿物油、植物油、羊毛脂等；5)弗氏佐剂，例如弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂。

本申请还提供了在肿瘤免疫领域预防和/或治疗CTLA-4相关的疾病，例如肿瘤的方法，其包括给予个体抗CTLA-4抗体、或者包含抗CTLA-4抗体(例如抗人CTLA-4单克隆抗体)的药物组合物或疫苗。在一些实施方案中，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体地说，本文公开的抗CTLA-4抗体能够有效地预防和/或治疗肿瘤，可以作为抗肿瘤药物使用。

在一些实施方案中，可以将本申请的抗CTLA-4抗体、或者包含抗CTLA-4抗体(例如抗人CTLA-4单克隆抗体)的药物组合物或疫苗与其他的治疗剂(例如化疗剂、PD-1结合拮抗剂等)联合施用。

本申请还提供了抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分，或者包含所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分的药物组合物在制备用于预防和/或治疗CTLA-4相关的疾病，例如肿瘤的药物中的用途。

在一些实施方案中，本文公开的肿瘤可以为结肠癌、黑色素瘤、间皮质瘤、肾细胞癌、淋巴瘤、晚期实体瘤或其转移瘤等。

本文公开的抗人CTLA-4抗体及包含所述抗人CTLA-4抗体的药物组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因个体的年龄和体重、疾病特性和严重性以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和综合情况，总给药量不能超过一定范围。

抗体或包含所述抗体的药物组合物的施用剂量和频率可根据对疾病进行预防或治疗而变化。在预防性应用中，向尚未处于疾病状态的患者施用含有本申请的抗体或其混合物的组合物以增强患者抵抗力，此量定义为“预防性有效剂量”。在此用途中，具体的剂量又视患者健康状况及全身免疫性而定。通常以相对不频繁的间隔施用相对较低剂量较长时间。在治疗性应用中，有时需要以相对较短间隔施用相对较高剂量直至疾病进展减缓或终止为止，且优选直至患者显示疾病症状部分或完全改善为止。此后，可向患者施用预防性方案。本领域普通技术人员可以容易地根据实际需要掌握具体的剂量和频率。

本申请还提供了包含本文公开的抗体或其抗原结合部分的检测试剂或试剂盒。

如本文所用的，术语“免疫反应”指脊椎动物内针对外来作用剂的生物反应，该反应保护生物体抵抗此类作用剂及由其引起的疾病。免疫反应系由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)及由此类细胞中的任一者或由肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子及补体)的作用介导，其导致选择性靶向、结合、损害、破坏和/或自脊椎动物身体消除侵入病原体、经病原体感染的细胞或组织、癌性或其他异常细胞或在自体免疫或病理炎症的情形下正常人类细胞或组织。免疫反应包括T细胞(例如效应T细胞)或Th细胞(例如CD4⁺或CD8⁺T细胞)的活化或抑制或Treg细胞的抑制。

如本文所用的，术语“T细胞介导的反应”系指由T细胞(包括效应T细胞(例如，CD8⁺细胞)及辅助T细胞(例如，CD4⁺细胞))介导的反应。T细胞介导的反应包括T细胞细胞毒性及增殖。

如本文所用的，术语“癌症”指以体内异常细胞不受控生长为特点的一大类疾病。失调的细胞分裂可形成侵袭相邻组织且可经由淋巴系统或血流转移至身体的远处部分的恶性肿瘤或细胞。

如本文所用的，术语“抑制肿瘤的生长”包括肿瘤生长的任何可测量的减少，例如肿瘤生长抑制至少约10％，例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约99％或100％。

如本文所用的，术语“治疗”指对受试者实施的任何类型的介入或方法或向其施用活性剂，其中目的是逆转、缓和、改善、抑制或缓解或预防症状、并发症、病况或与疾病相关的生物化学标记的进展、发展、严重程度或复发。预防指对未患疾病的受试者施用，以防止疾病发生或使其影响(若存在)最小化。

本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分或步骤。

应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。

上述公开内容从总体上描述了本申请，以下实施例是对本申请作进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域具有普通技术的人员来说是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如参见Sambrook,J.,Fritsch,EF.and Maniais，T.(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

本发明公开了特异性结合哺乳动物(人、灵长类动物等)CTLA-4的抗体，且该抗体或抗体部分被用于抑制/清除Treg，刺激T细胞的活化及增殖等。本发明提供此类蛋白质在治疗、筛选和检测等方面的应用，如在癌症治疗中的用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本领域技术人员能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。

除非特别指明，本说明书中的实验方法和技术为本领域常规的方法和技术。

实施例

在实施例中，人CTLA-4蛋白(hCTLA-4)购自Speed Biosystems，货号为YCP5268，DNA序列为NP_00205.1，蛋白序列为胞外区Ala37-Ser160，C末端含有人IgG1Fc标签，通过SDS-PAGE验证其分子量在50-55kDa；

猴CTLA-4蛋白购自北京义翘神州科技有限公司，货号为90213-C08H；

人CTLA-4膜表达质粒购自北京义翘神州科技有限公司，货号HG11159-UT；

小鼠PD-1抗体购自Bio X Cell公司，克隆号为J43；并且

CTLA-4人源化小鼠购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司。

对于其它没有特别注明厂家的材料和设备等，其通常是可通过商业途径常规获得的。

实施例1.产生抗CTLA-4抗体的杂交瘤的制备

杂交瘤的制备方法如下：

1.取8-10周大的Balb/c小鼠，经腹膜内接种人CTLA-4蛋白(100μg/剂/只)。在3-8周内，重复此剂量5-7次。进行融合前4天，为小鼠注射最后一剂人CTLA-4蛋白。

2.进行融合前1天，取普通Balb/c小鼠腹腔内巨噬细胞作为滋养层，接种于96孔板中。

3.取来自经免疫接种的小鼠的脾细胞与非分泌性骨髓瘤SP2/0细胞系融合，将融合后的细胞加入到提前铺有滋养层的96孔板中，对融合的细胞进行HAT选择(Galfre andMilstein,Methods Enzymol 1981；73：3-46)。

4.回收一组均分泌抗CTLA-4特异性抗体的杂交瘤细胞(30株)。初次筛选是利用酶联免疫分析法(ELISA)确定杂交瘤分泌的抗CTLA-4抗体的滴度。

实施例2.候选抗CTLA-4单克隆抗体与人CTLA-4的结合实验

结合实验步骤如下：

1.提前瞬时转染人CTLA-4膜表达质粒于293T细胞中。

2.细胞采用胰酶消化，等体积含2％FBS的1×PBS清洗两遍，850rpm离心5min，弃上清，然后加入含2％FBS的PBS重悬细胞并计数。

3.将细胞稀释至浓度为1×107个细胞/mL，按照10μL/孔加入流式管中。

4.将各单克隆上清100μl加入已有细胞的流式管中。

5.4℃下孵育30min，用3mL含2％FBS的1×PBS洗2次，1000rpm离心5min。

6.弃上清，用100μL含2％FBS的1×PBS重悬细胞，加入APC抗鼠IgG Fc(Biolegend)作为二抗。

7.4℃下孵育30min，用3mL含2％FBS的1×PBS洗1次，1000rpm离心5min。

8.弃上清，用100μL含2％FBS的1×PBS PBS重悬细胞，流式仪(ACEA公司Novocyte)检测获得阳性率。

结果如表1所示，候选抗CTLA-4单克隆抗体除9C6和11H2，其他均与人CTLA-4具有相对较高的结合。

表1流式检测单克隆杂交瘤上清与人CTLA-4结合能力

实施例3.候选抗CTLA-4单克隆抗体与猴CTLA-4的结合实验

结合实验步骤如下：

1.猴CTLA-4蛋白采用碳酸盐缓冲液稀释成1μg/ml，移入96孔酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜。

2.包被后酶标板采用1×PBST清洗3遍，5％脱脂奶粉/TBST 37℃封闭1小时。

3.1×PBST清洗3遍，加入各单克隆细胞上清(50μl或10μl)，37℃反应1小时。

4.1×PBST清洗3遍，加入采用TBST稀释1:5000的HRP标记的抗小鼠IgG 100μl，37℃反应1小时。

5.1×PBST清洗3遍，加入100μl TMB，室温孵育5-30分钟。

6.加入硫酸终止反应，酶标仪450nm波长测定OD值。

结果如表2所示，所有30个克隆均与猴CTLA-4结合。

表2 ELISA检测单克隆杂交瘤上清与猴CTLA-4结合能力

实施例4.抗CTLA-4单克隆抗体针对人CTLA-4配基CD80与人CTLA-4的结合的阻断实验

阻断实验步骤如下：

1.采用含10％低IgG血清(Gibco公司)的RMPI-1640培养基(Gibco公司)培养各杂交瘤细胞两周。

2.收集细胞上清，0.45μm滤器(Millipore公司)过滤。

3.采用MabSelect Sure LX 5ml纯化柱纯化，流速5ml/min。先采用5CV 20mM PB+150mM NaCl平衡液(pH7.4)平衡纯化柱，平衡稳定后上样，上样结束后选择20mM PB+150mMNacl(pH7.4)淋洗，淋洗结束选择50mM柠檬酸(pH4.5)预洗，预洗结束选择50mM柠檬酸(pH3.0)洗脱液洗脱，收集纯化抗体，采用1M Tris-HCl(pH9.0)回调pH至7.0左右。

4.提前瞬时转染人CTLA-4膜表达质粒于293T细胞中。

5.细胞采用胰酶(Gibco公司)消化，含2％FBS的PBS清洗两遍，850rpm离心5min，弃上清，然后加入含2％FBS的PBS重悬细胞并计数。

6.将细胞稀释至浓度为1×10⁷个细胞/mL，按照10μL/孔加入流式管中。

7.将各单克隆上清100μl或纯化抗体4μg加入已有细胞的流式管中。

8.带人IgG1Fc标签的人CD80(北京义翘神州科技有限公司，货号为10698-H02H)稀释成0.002μg/μl，每管加入10μl，同时设置空白组(采用1×PBS替代人CD80)、人CD80组(有人CD80而无抗体)。

9.4℃结合30min，采用3mL含2％FBS的PBS清洗，1000rpm离心5min。

10.弃上清，采用3mL含2％FBS的PBS重复清洗一次，除空白组外，其余样本管均加入1μl浓度为1μg/μL的APC标记抗人IgG抗体(Biolegend产品)。

11.4℃结合30min，用3mL含2％FBS的PBS洗2次，1000rpm离心5min。

12.用250μL含2％FBS的PBS重悬细胞，流式仪检测获得阳性率。

上清结合结果如图1所示，2D3、3D11、3H5、5A11、5D5、5E3、6E12及10C1均不具有阻断人CTLA-4与人CD80结合的能力。纯化抗体如图2所示，5E3纯化抗体不具有阻断人CTLA-4与人CD80结合的能力。

实施例5.抗体的动力学参数测定

使用Fortebio分子相互作用仪(Molecular Devices公司，Octet QK)测定人CTLA-4蛋白与抗CTLA-4单克隆抗体(5E3)结合的动力学参数。

测定方法如下：

1.用ProA传感器(ForteBio公司，Pro A)通过捕获抗体5E3的Fc片段将抗体固定在传感器上。

2.将人CTLA-4蛋白用PBS稀释为3个浓度，分别为500nM、250nM及125nM，采用捕获抗体的传感器去特异性结合稀释后的人CTLA4蛋白3min，解离步骤在1×PBS中，自然状态下解离5min。

参数检测结果如表3所示，5E3与人CTLA-4蛋白的亲和力处于亚nM水平。

表3.人CTLA-4蛋白与抗CTLA-4单克隆抗体(5E3)结合的动力学参数

实施例6.抗人CTLA-4单克隆抗体对CTLA-4人源化小鼠高表达CTLA-4细胞的清除作用

细胞培养：将小鼠结直肠癌MC38细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，培养基成分为含有10％FBS的RPMI1640培养基，细胞每隔2天分瓶传代1次。

小鼠接种细胞：将PBS重悬的MC38细胞以1×10⁷个细胞/mL的浓度，0.1mL/只体积接种于CTLA-4人源化小鼠的右侧胁肋部皮下，共转接24只小鼠。当平均肿瘤体积达到大约100mm³时，挑选个体肿瘤体积适中的小鼠入组，将动物按肿瘤体积随机分配到2个组别中，包括对照组(PBS组，10μl/g体重(BW))及抗体组(5E3组)，每组12只，分组当天开始给药，给药剂量为15mg/KgBW体重，腹腔注射，每3天给一次药，共计给药4次。

每次给药结束后24小时，二氧化碳吸入处死各组小鼠中的3只，取外周血、脾脏及肿瘤，脾脏及肿瘤加入5ml PBS，采用组织研磨机(Miltenyi Biotec产品)分散成单个细胞，采用Pacific Blue标记的CD45抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD25抗体(四种抗体均为Biolegend产品)及APC标记的CTLA-4抗体(BD公司产品)标记表面标志物，Foxp3/TranscriptionFactor Staining Buffer Set(eBioscience产品)固定穿透细胞膜，PE标记的Foxp3抗体(购于eBioscience公司)标记Foxp3，流式检测Treg。

结果如图3所示，荷瘤小鼠CTLA-4主要表达于肿瘤局部的Treg细胞上，给予单克隆抗体后，肿瘤内Treg比例下降，Treg表面CTLA-4表达量下降，与对照组相比，给药3次起肿瘤内Treg比例及Treg表面CTLA-4表达量均具有明显的统计学差异，*P<0.05，而外周血及脾脏Treg不受影响。

实施例7.抗人CTLA-4单克隆抗体在CTLA-4人源化小鼠体内的抑瘤实验

小鼠接种细胞：将PBS重悬的MC38细胞以1×10⁷个细胞/mL的浓度，0.1mL/只体积接种于CTLA-4人源化小鼠(北京百奥赛图基因生物技术有限公司)的右侧胁肋部皮下，共转接25只小鼠。当平均肿瘤体积达到大约100mm³时，挑选个体肿瘤体积适中的小鼠入组，将动物按肿瘤体积随机分配到5个组别中，包括溶剂对照组(PBS组，10μl/gBW)、1.5mg/Kg BW5E3组、5mg/Kg BW 5E3组、15mg/Kg BW5E3组及1.5mg/Kg BW Ipilimumab(阳性对照药)组，每组5只，分组当天开始给药，具体给药方案见表4：

表4.抑瘤实验给药方案

注：^a指每3天给药1次。

给药后，对实验动物体重及肿瘤生长状态继续观察。每周测量两次肿瘤体积及动物体重，并记录测量值。肿瘤体积的测量结果如图4所示，其中，对于15mg/Kg BW 5E3组而言，与对照相比时^aP<0.05，与1.5mg/Kg BW 5E3相比时^bP<0.05。可以看出5E3抗体对肿瘤的抑制作用具有一定的剂量依赖关系，而在相同剂量条件下，5E3抗体与阳性对照药疗效类似。

观察记录18天，小鼠二氧化碳麻醉处死后解剖肿瘤，称重后统计分析，肿瘤解剖图如图5所示，数据统计如图6所示，其中，对于15mg/Kg BW 5E3组而言，与对照相比时^aP<0.05，与1.5mg/Kg BW 5E3相比时^bP<0.05。可以看出实验组与对照组相比肿瘤明显缩小，具有明显的统计学差异；而同等剂量下5E3抗体与阳性对照药对肿瘤的作用没有明显的统计学差异。

实施例8.抗人CTLA-4单克隆抗体联合PD-1抗体对CTLA-4人源化小鼠毒性实验

因小鼠对CTLA-4抗体毒性不敏感，结合临床，采用小鼠PD-1抗体联合CTLA-4抗体评价对小鼠的毒性(参见Du X et al.，Cell Res.28(4):433-447(2018))。

出生后10天的CTLA-4人源化小鼠(36只)，按体重分成4组，分别为溶剂对照组(PBS，100μl)、小鼠PD-1抗体组、小鼠PD-1抗体+5E3抗体组及小鼠PD-1抗体+Ipilimumab组。分别于出生后10天、13天、16天、19天及21天给予相应药物，各种抗体均为100μg/只/次。给药结束后继续观察至出生后42天。

实验结束后采集外周血，进行血细胞分析。收集骨髓、脾、心、肝标本。骨髓及脾分散成单个细胞，骨髓采用FITC标记的抗小鼠CD71抗体及APC标记的抗小鼠Ter119抗体分析红系细胞成熟，脾细胞采用Pacific Blue标记的抗小鼠CD45抗体、APC标记的抗小鼠CD3抗体、PE/Cy7标记的抗小鼠CD4抗体、APC/Cy7标记的抗小鼠CD25抗体、PE标记的抗小鼠Foxp3抗体、PerCP标记的抗小鼠CD44抗体、FITC标记的抗小鼠CD62L抗体分析T细胞(PE标记的抗小鼠Foxp3抗体购于eBioscience公司，其余抗体购于Biolegend公司)；心脏及肝脏固定后常规病理切片，常规HE染色后分析组织损伤及淋巴细胞浸润情况。

外周血的结果如图7所示，对于Ipilimumab+PD-1抗体组，外周血血红蛋白(HGB)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)及红细胞分布宽度(RDW)均明显下降，而血小板计数(PLT)及血小板压积(PCT)升高，而5E3抗体+PD-1抗体组无明显改变(与溶剂对照相比时^aP<0.05，与5E3抗体+PD-1抗体组相比时^bP<0.05，与PD-1抗体组相比时^cP<0.05)，表明Ipilimumab+PD-1抗体组可致贫血及血小板增多症，而5E3抗体组外周血未见明显异常。

红系细胞发育流式检测如图8所示，统计分析如图9所示。骨髓中红细胞样细胞发育可用CD71及Ter19作为标志物分为5个阶段：1.CD71⁺Ter119^-，2.FSC-A^hiCD71⁺Ter119⁺，3.FSC-A^miCD71⁺Ter119⁺，4.FSC-A^loCD71⁺Ter119⁺，5.CD71^-Ter119⁺。Ipilimumab+PD-1抗体组给药后红细胞样祖细胞(阶段1)增加，而成熟的红细胞(阶段5)减少，而5E3抗体+PD-1抗体组没有这种作用，提示5E3抗体+PD-1抗体组对红细胞成熟的影响远低于Ipilimumab+PD-1抗体组。

脾脏T细胞分析如图10所示，可以看出，对于5E3抗体+PD-1组及Ipilimumab+PD-1组，脾脏CD4⁺T减少，CD8⁺T增加，CD4/CD8比例下降，而Ipilimumab表现更为明显，其中Ipilimumab+PD-1组中CD4⁺效应记忆性T细胞(Tem)增加，CD4⁺中央记忆性T细胞(Tcm)减少，CD8⁺Tem增加，Treg比例增加，而5E3抗体+PD-1组仅出现脾脏CD8⁺Tcm比例升高，且与单纯PD-1抗体组效应类似。

肺组织病理如图11所示，对于Ipilimumab+PD-1抗体组，肺组织炎性细胞增多，肺泡壁增厚，部分肺泡塌陷，部分肺泡融合成大肺泡，而5E3抗体+PD-1抗体组中的肺泡结构较为清晰，仅有少量炎性细胞浸润；肝组织病理如图12所示，Ipilimumab+PD-1抗体组中的肝静脉出现大量炎性浸润，且肝实质内具有局灶性炎性浸润灶；心脏组织病理如图13所示，Ipilimumab+PD-1抗体组中的心内膜下出现局部坏死(局灶性心梗)及心肌间质炎性细胞浸润，而5E3抗体+PD-1抗体组仅见心肌间质炎性细胞浸润轻度浸润。

上述结果表明，5E3抗体与PD-1抗体联用后，其对机体的免疫及心、肝、肺脏毒性均显著低于Ipilimumab与PD-1抗体联用的毒性。

可以理解，尽管本申请以上述具体形式描述了所涉及的发明，但这些发明并不局限于这些具体形式描述的特定内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请所描述的发明精神的前提下，还可对其中所涉及的发明包含的技术特征进行各种等同变化，这些变化都应该属于本发明的范围之内。

序列表

<110> 北京免疫方舟医药科技有限公司

<120> 抗CTLA-4抗体及其应用

<130> 19C11961CN

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Phe Gly Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Ser Ser Leu Leu Arg Leu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Asp Tyr Ile Ser Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Ser Leu Leu Arg Leu Arg Asp Trp Tyr

115 120 125

Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 8

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Lys Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser

1 5 10 15

Gly Ala Gln Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu

20 25 30

Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser

85 90 95

Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr

100 105 110

Ile Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Claims

1.特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合部分，其包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，其中所述HCDR1序列为SFGMH(SEQ ID NO:1)，所述HCDR2序列为YISSGSSTIYYADTVKG(SEQ ID NO:2)，所述HCDR3序列为SSSLLRLRDWYFDV(SEQ ID NO:3)，优选地，所述抗原结合部分选自：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段或单域抗体。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性的氨基酸序列，或者所述重链可变区的序列如SEQ ID NO:7所示。

3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分，其还包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其中所述LCDR1序列为KASQSVSNDVA(SEQ ID NO:4)，所述LCDR2序列为YASNRYT(SEQ ID NO:5)，所述LCDR3序列为QQDYISPPT(SEQ ID NO:6)。

4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的氨基酸序列，或者所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO:8所示。

5.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述CTLA-4为灵长类CTLA-4；优选地，所述灵长类CTLA-4选自人CTLA-4或猴CTLA-4，任选地，所述抗体或其抗原结合部分以1×10^-9至1×10^-8M的KD特异性结合于CTLA-4；优选地，所述抗体或其抗原结合部分不阻断CTLA-4与其配基CD80和/或CD86的结合。

6.药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体，

任选地，所述药物组合物还包含一种或多种其他活性成分，如化疗剂、PD-1结合拮抗剂。

7.核酸分子，其编码权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或其轻链或重链。

8.表达载体，其包含权利要求7所述的核酸分子。

9.宿主细胞，其包含权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的表达载体。

10.权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求6所述的药物组合物、权利要求7所述的核酸分子，权利要求8所述的表达载体、或者权利要求9所述的宿主细胞在制备用于抑制Treg功能、杀死表达CTLA-4的细胞、引发T细胞介导的反应/提高效应T细胞的功能、和/或有效抑制肿瘤生长的药物中的用途，或者在制备用于预防和/或治疗CTLA-4相关的疾病的药物中的用途，优选地，所述疾病为肿瘤，优选地，所述肿瘤选自实体瘤及其转移瘤，优选选自以下中的一种或多种：结肠癌、黑色素瘤、间皮质瘤、肾细胞癌和淋巴瘤。