CN117510636B - Gprc5d抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物技术领域，特别涉及GPRC5D抗体及其应用。本申请提供一种GPRC5D抗体，所述GPRC5D抗体包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的VH‑CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的VH‑CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的VH‑CDR3；并且所述轻链可变区的CDR包括氨基酸序列为SEQ ID No:6或SEQ ID NO：11所示的VL‑CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的VL‑CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的VL‑CDR3。本申请发现了一种新的GPRC5D抗体，对膜表面GPRC5D具备良好的结合活性。

Description

GPRC5D抗体及其应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别涉及GPRC5D抗体及其应用。
背景技术
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)家族是人体最庞大的膜蛋白家族，目前已发现有800多个成员，广泛参与体内生理活动的调控，影响机体视/嗅/味觉、行为及情绪反应、免疫系统调节等。GPCR具有保守的结构特征，由7个跨膜结构域分割为胞外N端，胞内C端，3个胞外环和3个胞内环。其配体结合域由N端和跨膜区段共同组成，G蛋白结合域由C端和胞内环组成。通过信号级联反应，GPCRs将胞外的生物信号转导至胞内下游最终靶标，最终实现对众多生理活动的调控(程建昕，唐赟.G蛋白偶联受体的结构与功能研究进展.生命科学.2015；27(4):445-452)。加之其在细胞表面有可成药靶点(胞外N端及胞外环)，使得GPCRs成为药物研发的重要靶点之一(AlexanderS.Hauser,MistyM.Attwood,Mathias Rask-Andersen,Helgi B.&David E.Gloriam.Trends inGPCR drug discovery:new agents,targets and indications.NatureReviews DrugDiscovery，2017)。截至2021年，已经有近500种靶向GPCR的药物获得FDA批准，占所有获批药物的33％。
多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是血液系统的第二大常见恶性肿瘤，为浆细胞肿瘤，表现为骨髓中浆细胞异常增殖，常伴随单克隆免疫球蛋白或轻链的过度生成。MM可引起破坏性骨损伤，肾损伤，贫血和高钙血症等症状，常见于老年患者(Andrew J Cowan,Damian J Green,Mary Kwok,et al.Diagnosis and Management of Multiple Myeloma:AReview.JAMA.2022Feb 1；327(5):464-477)。截至2021年，全球每年约有59万人确诊MM。在中国，由于老龄化的加速，MM患病人数呈快速增长的趋势，患者人数由2016年的6.98万人增至2019年的10.19万人，复合增长率达13.5％。多发性骨髓瘤治疗的最新进展包括引入蛋白酶体抑制剂，免疫调节剂和靶向癌细胞表面抗原的单抗药物，以及自体造血干细胞移植等(PUPH and Peking University Health Science Centre’s unpublished data(haveauthorized).Based on UEBMI and URBMI database,from 2012to 2016in Chinese23provinces)。在最新修订的中国多发性骨髓瘤诊治指南中，增加了达雷妥尤单抗(抗CD38)联合治疗内容，针对难治复发性MM增加了CAR-T疗法(中国多发性骨髓瘤诊治指南(2020年修订).中华内科杂志.2020；59(5))。目前，靶向BCMA的单克隆抗体及CAR-T细胞疗法正在如火如荼地研发中，但对于BCMA低表达或阴性相关的复发病例，此类药物的疗效不容乐观。MM治疗的最新进展带来了更高的反应率，改善了无进展生存期和总生存期，但多发性复发和难治性MM患者的预后仍然严峻，对新治疗靶标的医疗需求仍然存在。在骨髓瘤细胞中表达的新标志物，与诸如整体存活率，国际分期系统(ISS)和细胞遗传学等临床特征相关，可能在临床前测试中充当替代标志物，甚至可能成为潜在的治疗靶标。开发针对其他靶标的免疫疗法可减轻现有免疫疗法的复发性抗原损失，并有效治疗现有靶点表达低或可变的患者。
MM的一种潜在靶标抗原是孤儿G蛋白偶联受体，C类5组D组成员(GPRC5D)。GPRC5D是人类G蛋白偶联受体的新亚型，与RAIG1、2、3(视黄酸诱导的基因1、2、3)共同组成了GPRCs的C5亚家族。早期的工作发现GPRC5D在两种组织表达：毛囊以及来自MM患者的骨髓。系统研究发现在肾脏，胰腺，小肠，脾脏和睾丸中发现了高和中等水平的GPRC5D mRNA表达，而在肺，结肠，前列腺，胸腺和白细胞中发现了低水平的表达(Smith EL,Harrington K,etal.GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma withrationally designed CAR T cells.Sci Transl Med.2019,11(485))。同时在产生坚硬角蛋白的分化细胞也发现有GPRC5D mRNA的表达。MM患者骨髓中发现GPRC5D高表达。mRNA表达与骨髓浆细胞计数，b2-微球蛋白血浆水平，ISS，细胞遗传学[缺失13q14和t(4；14)]和OS的相关性将GPRC5D确立为一种新的预后标志物。上皮细胞瘤过表达，组织低表达，T辅助细胞和CT表位的存在以及细胞膜的表达，显示GPRC5D相比BCMA具有更好的特异性。同时研究表明，GPRC5D与MM明星靶标BCMA互为独立表达，在即使发生了BCMA逃逸的模型中，也能很好的清除肿瘤并延长存活期。综上所述，GPRC5D是潜在的新型癌抗原，将成为MM治疗的下一个热门靶点。
以GPRC5D为开发靶标的相关研究和企业布局较少。最为领先的是由强生开发的靶向GPRC5D×CD3的双特异性T细胞衔接抗体(BiTE)Talquetamab(JNJ-64407564)，目前正处于II期临床，其次是处于临床I期的由优瑞科和MSKCC联合研发的GPRC5D CAR-T。Talquetamab的II临床数据实现了69％的ORR。根据其披露的临床前数据，Talquetamab的GPRC5D靶向端亲和力较弱，为该靶点抗体分子的开发提供了空间(Kodandaram P,SuzanneEdavettal,Mark Mendonca,et al.AT-cell-redirecting bispecific G-protein-coupled receptor class 5member D x CD3 antibody to treat multiplemyeloma.Blood.2020Apr 9；135(15):1232-1242)。
与其他GPCRs家族成员一致，GPRC5D具有七个跨膜区段，并在细胞膜中表达。定位在染色体12p13.3上的GPRC5D基因包含三个外显子，跨度约为9.6kb。GPRC5D蛋白总长345个氨基酸，胞外N端占27个氨基酸，三个胞外环分别占9、22和15个氨基酸。胞外区过短导致GPRC5D的免疫原性低，为使用过表达细胞进行免疫和筛选带来难度。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供GPRC5D抗体及其应用，用于解决现有技术中的问题。本发明采用GPRC5D高表达细胞及GPRC5D蛋白进行联合免疫，并在初筛阶段就对抗体与GPRC5D在细胞水平的结合进行考察并作为筛选依据，筛选出特异性结合细胞表面GPRC5D的高亲和力抗体。该抗体有希望用于GPRC5D表达的肿瘤的治疗。
为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种GPRC5D抗体，所述GPRC5D抗体包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQID NO：3所示的VH-CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的VH-CDR2和氨基酸序列如SEQ IDNO：5所示的VH-CDR3；和/或
所述轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11所示的VL-CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的VL-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的VL-CDR3。
本申请第二方面提供一种核苷酸分子，编码前述的GPRC5D抗体。
本申请第三方面提供一种表达载体，含有前述的核苷酸分子。
本申请第四方面提供一种宿主细胞，含有前述的表达载体或基因组中整合有前述的核苷酸分子。
本申请第五方面提供一种制备前述GPRC5D抗体的方法，其包括，在允许所述抗体表达的条件下，培养前述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。
本申请第六方面提供一种药物组合物，含有前述的GPRC5D抗体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本申请第七方面提供一种试剂盒，含有前述的GPRC5D抗体。
本申请第八方面提供前述的GPRC5D抗体、前述的核苷酸分子、前述的表达载体、前述的宿主细胞、或前述的药物组合物在制备具备至少以下一种功效的产品中的用途：
a1)结合膜表面的GPRC5D；
a2)杀伤表达GPRC5D的细胞；
a3)治疗表达GPRC5D的肿瘤。
与现有技术相比，本申请的有益效果为：
1、本申请发现了一种新的GPRC5D抗体，对膜表面GPRC5D具备良好的结合活性，并显著强于对标抗体J&J-10B2。
2、本申请的抗体对膜表面猴源GPRC5D有较好的交叉结合活性。
3、本申请的抗体能有效诱导效应细胞对表达GPRC5D的肿瘤细胞的杀伤，并杀伤效果显著强于J&J-10B2。
4、本申请的抗体与人源GPRC5D的结合亲和力显著强于J&J-10B2。
5、本申请的抗体能有效诱导补体对表达GPRC5D的细胞的杀伤，其CDC杀伤效果显著强于J&J-10B2。
附图说明
图1A为D65227-303的正筛荧光成像图。
图1B为D65227-303的反筛荧光成像图。
图2为嵌合抗体GB7013-1L01M对HEK293T-hGPRC5D，HEK293T和CHOS的结合情况。
图3A为人源化抗体GB7013-1L01M-hu01对天然表达人GPRC5D的肿瘤细胞NCI-H929上的结合曲线。
图3B为人源化抗体GB7013-1L01M-hu01对天然表达人GPRC5D的肿瘤细胞MM.1R上的结合曲线。
图3C为人源化抗体GB7013-1L01M-hu01对过表达细胞HEK293T-hGPRC5D上的结合曲线。
图4为人源化抗体GB7013-1L01M-hu01对过表达细胞(HEK293T-macaca GPRC5D)的结合情况。
图5A为人源化抗体GB7013-1L01M-hu01诱导效应细胞对天然表达人GPRC5D的肿瘤细胞NCI-H929上的ADCC曲线。
图5B为人源化抗体GB7013-1L01M-hu01诱导效应细胞对天然表达人GPRC5D的肿瘤细胞MM.1R上的ADCC曲线。
图6为人源化抗体GB7013-1L01M-hu01诱导对过表达GPRC5D的HEK293T-hGPRC5D细胞的抗体依赖的补体介导的毒杀作用(CDC)。
具体实施方式
为了使本申请的发明目的、技术方案和有益效果更加清晰，下面结合实施例对本申请作进一步说明。应理解，所述实施例只用于解释本申请，并非用于限定申请的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，熟悉此技术的人士可由本说明所揭露的内容容易地了解本申请的其他优点及功效。
本申请的发明人经过大量探索研究，发现了GPRC5D抗体及其应用，在此基础上完成了本申请。
本申请一方面提供一种GPRC5D抗体，包括重链可变区与轻链可变区，重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的VH-CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的VH-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的VH-CDR3；和/或，
轻链可变区的CDR包括氨基酸序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11所示的VL-CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的VL-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的VL-CDR3。
具体序列如下：
本申请提供的GPRC5D抗体中，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列选自如下任一种：
(1)所述重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的VH-CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的VH-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的VH-CDR3；并且，所述轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的VL-CDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO：7所示的VL-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的VL-CDR3；或
(2)所述重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的VH-CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的VH-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的VH-CDR3；并且，所述轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的VL-CDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO：7所示的VL-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的VL-CDR3。
本申请提供的GPRC5D抗体中，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列选自如下任一种：
(1)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2；
(2)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
具体序列如下：
本申请提供的GPRC5D抗体中，GPRC5D抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO：13所示。具体序列如下：
本申请提供的GPRC5D抗体中，GPRC5D抗体为人源化抗体、鼠源化抗体或嵌合抗体。“人源化抗体”是指具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，本申请所提到的人源化抗体是指：对鼠源抗体的框架区及恒定区进行人源化改造后，得到的抗体。“鼠源抗体”是指其中所有结构域序列均为小鼠序列的任何抗体。此类抗体可通过杂交瘤产生。“嵌合抗体”是由鼠源性抗体的可变区基因与人抗体的恒定区基因拼接为嵌合基因，表达形成的抗体分子。
在本申请一具体实施例中，GPRC5D抗体为人源化抗体，即重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，并且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，重链恒定区如SEQ ID NO：12所示，轻链恒定区如SEQ ID NO：13所示。
在本申请一具体实施例中，GPRC5D抗体为嵌合抗体，即重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，并且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，重链恒定区如SEQ ID NO：12所示，轻链恒定区如SEQ ID NO：13所示。
本申请提供的GPRC5D抗体中，抗体为IgG抗体。在一具体实施例中，抗体是IgG1抗体。本申请采用GPRC5D高表达细胞及GPRC5D蛋白进行联合免疫，并在初筛阶段就对抗体与GPRC5D在细胞水平的结合进行考察并作为筛选依据，筛选出特异性结合细胞表面GPRC5D的抗体。该抗体有希望用于GPRC5D表达的肿瘤的治疗。
本申请另一方面提供一种核苷酸分子，编码前述的GPRC5D抗体。本申请的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可以将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成抗体。
本申请另一方面提供一种表达载体，含有前述的核苷酸分子。“载体”指在引入合适的宿主细胞中时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。本发明中的载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
本申请另一方面提供一种宿主细胞，含有前述的表达载体或基因组中整合有前述的核苷酸分子。“宿主细胞”任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。
本申请另一方面提供一种制备前述GPRC5D抗体的方法，其包括，在允许所述抗体表达的条件下，培养前述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。可以使用本领域中公开的技术和本发明所述的技术制备GPRC5D抗体。例如，上述GPRC5D抗体可通过常规基因工程获得分离的单抗，合成上述抗体的基因，构建重组载体后，转染293细胞后重组表达，纯化后制备获得。
本申请另一方面提供一种药物组合物，含有前述的GPRC5D抗体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与溶酶体调节因子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂、抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本申请所提供的药物可以适应于任何形式的给药方式，可以是口服或胃肠外给药，例如，可以是经肺、经鼻、经直肠和/或静脉注射，更具体可以是真皮内、皮下、肌内、关节内、腹膜内、肺部、口腔、舌下含服、经鼻、经皮、阴道、口服或胃肠外给药。
本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、滴剂或糖浆等，再例如，适合于胃肠外给药的制剂形式可以是包括但不限于溶液、悬浮液、可复水的干制剂或喷雾剂等，再例如，适合于直肠给药的通常可以是栓剂。
本申请另一方面提供一种试剂盒，含有前述的GPRC5D抗体。
在一些实施方式中，试剂盒为免疫层析检测试剂盒、酶免检测试剂盒、化学发光试剂盒或免疫比浊检测试剂盒。
在一些实施方式中，试剂盒可以包括测试条或测试卡，来自于所述受试者的所述液体样品放置到所述测试条上，或者ELISA测定板，所述ELISA测定板具有其中可放置来自于单个受试者的液体样品的孔。在一些实施方案中，试剂盒可以包括配置用于流式细胞仪、生物分析仪、生物传感器中的测试装置。
在一些实施方式中，试剂盒中包含的GPRC5D抗体可为液体溶液形式、附着于固体支持物上的形式、或为干燥粉剂。当GPRC5D抗体为一种液体溶液时，该液体溶液可以是水溶液。当GPRC5D抗体是附着于固体支持物上的形式时，优选的固体支持物可以是层析介质如薄膜、测试条、塑料珠或平板、或显微镜载玻片。当GPRC5D抗体为一种干燥粉剂时，通过加入适当溶剂可重构粉剂。
本申请另一方面提供前述的GPRC5D抗体、前述的核苷酸分子、前述的表达载体前述的宿主细胞、或前述的药物组合物在制备具备至少以下一种功效的产品中的用途：
a1)结合膜表面的GPRC5D；
a2)杀伤表达GPRC5D的细胞；
a3)治疗表达GPRC5D的肿瘤。
本申请提供的用途中，膜表面为人源膜表面或猴源膜表面。本申请的抗体为人源化抗体时，可以与人源膜表面GPRC5D有良好的结合活性，同时对猴源膜表面的GPRC5D有较好交叉结合活性。
本申请提供的用途中，杀伤由ADCC或CDC介导。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。本申请的抗体可以诱导效应细胞的抗体依赖的细胞毒杀作用实现对表达GPRC5D的肿瘤细胞的杀伤。
补体依赖的细胞毒性(CDC)，指补体参与的细胞毒作用，其通过特异性抗体(IgG和IgM)与细胞膜表面相应抗原结合，而激活补体经典途径，所形成的膜攻击复合物(MAC)将对靶细胞(癌细胞)发挥裂解效应。本申请的抗体可以诱导补体对表达GPRC5D的细胞的杀伤。在本申请一具体实施例中，补体例如可以为人血清。
本申请提供的用途中，表达GPRC5D的肿瘤选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、淋巴瘤、肺癌、肉瘤、肛门癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤中的一种或多种；优选地，表达GPRC5D的肿瘤选自淋巴瘤或骨髓瘤；更优选地，骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
本申请另一方面提供一种针对表达GPRC5D的肿瘤的治疗方法，为向对象施用有效剂量的前述的GPRC5D抗体、前述的核苷酸分子、前述的表达载体或前述的宿主细胞。
本申请提供的治疗方法中，对象为哺乳动物，例如为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。灵长目动物例如为猴、猿或智人。有效剂量通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗肿瘤的效果。
在一些实施方式中，表达GPRC5D的肿瘤选自淋巴瘤或骨髓瘤；进一步地，骨髓瘤为多发性骨髓瘤。GPRC5D是G蛋白偶联受体家族C组5成员D，属于一种孤儿受体，为7次跨膜蛋白，在多发性骨髓瘤细胞中特异性高表达，本申请的抗体有希望用于GPRC5D表达的肿瘤的治疗。
下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
实施例1：基于单细胞的鼠抗人GPRC5D抗体筛选
通过慢病毒感染的方法(MOI＝3-10，5μg/mL polybrene)在HEK293细胞(ATCC)、CHOS细胞(Invitrogen)上过表达人源GPRC5D(hGPRC5D)。慢病毒由上海吉凯基因医学科技股份有限公司提供，细胞感染72小时后加相应抗生素继续培养2-4周，扩增并冻存，得到HEK293T-hGPRC5D和CHOS-hGPRC5D细胞，以用于后续实验。
为了获得抗人GPRC5D抗体，使用构建的过表达人源GPRC5D的CHOS-hGPRC5D细胞和VLP-GPRC5D蛋白(恺卡，GPR-HM05P)联合免疫Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，品系代码216)；初免佐剂使用完全弗氏佐剂CFA(InvivoGen公司，货号vac-cfa-60)，之后免疫佐剂都使用IFA(InvivoGen公司，货号vac-ifa-60)；免疫途径为皮下多点。多次免疫后取免疫小鼠的脾脏，使用CD138+Plasma Cell Isolation Kit,mouse(Stemcell，18957)分离小鼠浆B细胞，4℃静置备用。
基于单细胞的鼠抗高通量筛选：以CHOS-hGPRC5D为正筛细胞系，CHOS为反筛细胞系，使用Berkeley Lights进行鼠抗筛选。样品buffer如无特殊说明，则均来自试剂盒opto-plasma B Discovery Sample Prep kit，Mouse(BLI，750-02050)。首先将浆B细胞分载入筛选芯片(BLI，750-00060)的小室中：300g，4℃离心5min浆B细胞，去上清，重悬于LoadMedium，调整密度至6E6/mL后上机载入筛选芯片。后将CHOS-hGPRC5D细胞载入芯片的小室上方通道中：取1E7细胞，以10mlLDPBS离心清洗2次，重悬于Load Medium，调整密度至1E8/mL后，加入10μg/mL荧光二抗(DyLight488山羊抗鼠IgG，Abcam，ab97015)，混匀上机载入筛选芯片。最后孵育30分钟，期间每隔5分钟荧光拍照成像，完成鼠抗正筛。洗去CHOS-hGPRC5D细胞，以相同条件载入CHOS细胞并孵育拍照成像，完成鼠抗反筛。根据荧光状态判断小室内的浆B细胞产生的抗体与通道中筛选细胞的结合，再对比正反筛结果，最终确定特异性结合人GPRC5D的阳性小鼠浆B细胞：D65227-303。图1A-B为D65227-303的正反筛荧光成像图。
取一块无核酶96孔PCR板(Axygen，PCR-96M2-HS-C)，每孔加入20ul Mineral Oil(Sigma,M5904)和10μL 2*TCL buffer(Qiagen，1070498)，贴上封板膜(Thermo，AB0558)，200g离心1分钟后室温静置备用。以10μL导出体系导出阳性浆B细胞D65227-303至制备好的PCR板孔中，封板，1000g离心1分钟，保存于-80℃直至扩增测序。
实施例2：鼠抗人源GPRC5D抗体的可变区序列测定
取收集的单B细胞，200g离心30s，使细胞沉至底部。每孔加入10μL AgencourtRNAclean XP beads(Beckman Coulter，A63987)，吹打混匀10次，室温孵育20分钟。孵育完成后转移至磁力架(Borhee，MAG-96-11)上吸附5分钟，在不扰动磁珠的情况下去上清。保持细胞在磁力架上，加入现配80％乙醇(Sigma-Aldrich，E7023-500ML)清洗，30s后去除上清。重复清洗一次，室温放置2分钟，使磁珠干燥。使用opto-plasma B Discovery cDNASynthesis kit(BLI，750-02030)进行单B细胞cDNA库扩增。使用Agencourt DNAclean XPbeads(Beckman Coulter，A63881)进行cDNA纯化，照说明书操作，最后以15μL无核酶水洗脱。取1-2μL cDNA产物，使用Opto Plasma B Discovery Sanger Prep Kit(BLI，750-01004)进行BCR Hc/Lc cDNA扩增。由南京金斯瑞进行Hc/Lc测序。
GB7013-1L01M鼠源抗体(即D65227-303)的VH和VL序列如表1所示。进一步，还使用Kabat等人描述的方法(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，Public Health Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)，确定了GB7013-1L01M鼠源单抗的CDR序列。
表1鼠源抗体的序列信息
实施例3：嵌合抗GPRC5D抗体的重组表达
在抗体基因序列验证后，鼠源抗体的可变区连接人源抗体的恒定区(人源IgG1)，将含有抗体基因的PTT5表达载体转染至哺乳动物细胞293F。收获培养瓶生长的含有抗体克隆的哺乳动物细胞上清液，使用protein A柱纯化，并且使用100mM醋酸pH3.0洗脱抗体蛋白。然后将纯化的抗体蛋白上样到分子排阻层析柱上进一步分离纯化。将对应于单体的抗体蛋白配制于PBS缓冲液中，配制品缓冲液补充有20％甘油。
实施例4：嵌合抗GPRC5D抗体的抗原特异性结合活性评价
将500,000个GPRC5D高表达细胞株(HEK293T-hGPRC5D，上海吉倍生物技术有限公司)，本底细胞(HEK293T，ATCC)和免疫细胞的本底细胞系(CHOS,Invitrogen)分别置于FACSbuffer中待用，使用圆底低吸附96孔板。抗体样本使用FACS buffer进行梯度稀释。细胞板中加入经稀释的抗体，相应阴性对照孔加入FACS buffer，4℃孵育1小时。离心去掉上清后，使用FACS buffer清洗两遍，每孔加入第二抗体(DyLight488山羊抗人IgG，Abcam目录编号ab97003)4℃再孵育0.5小时。染色完成后离心去掉上清，用FACS buffer清洗两次后每孔加入FACS buffer重悬细胞，然后上机器进行读数。使用流式细胞分析仪(BD公司，型号C6)对实验板中细胞进行测定读数。测定时先根据FCS和SSC圈定细胞位置，然后选择第二抗体对应荧光通道和SSC对细胞进行分析，数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标使用平均荧光强度数值，根据曲线拟合出抗GPRC5D抗体的EC50。
嵌合抗体GB7013-1L01M对HEK293T-hGPRC5D，HEK293T和CHOS的结合情况分别如图2所示。结果表明，候选抗体GB7013-1L01M特异性结合膜表面GPRC5D。
实施例5：鼠抗人GPRC5D抗体的人源化
为提高候选抗体与人源抗体的序列的同源性，减少抗体对人的免疫原性，可以对以上实施例提供的鼠源抗体进行人源化设计和制备，使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in AntibodyEngineering:Methods and Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。
具体而言，将鼠源抗体GB7013-1L01M的重链和轻链CDR区分别移植到对应的人源化模板的FR框架上，并对人源化模板的FR区氨基酸残基进行了一系列的回复突变，以使人源化抗体尽可能保留鼠源抗体的抗原结合能力。根据以上方法，本发明人制备获得了鼠源抗体GB7013-1L01M的人源化抗体，命名为GB7013-1L01M-hu01(其重链可变区及轻链可变区分别如SEQ ID NO:9及10所示)。各抗体的重链恒定区均为SEQ ID NO:12，轻链恒定区均为SEQ ID NO:13。
实施例6：人源化抗GPRC5D抗体的抗原结合活性评价
将500,000个GPRC5D天然表达肿瘤细胞(NCI-H929，南京科佰生物；MM.1S，中国科学院细胞库；MM.1R，中国科学院细胞库)或GPRC5D高表达细胞株(HEK293T-hGPRC5D，上海吉倍生物技术有限公司)置于FACS buffer中待用，使用圆底低吸附96孔板。抗体样本使用FACS buffer进行梯度稀释。细胞板中加入经稀释的抗体，相应阴性对照孔加入FACSbuffer，4℃孵育1小时。离心去掉上清后，使用FACS buffer清洗两遍，每孔加入第二抗体(DyLight488山羊抗人IgG，Abcam目录编号ab97003)4℃再孵育0.5小时。染色完成后离心去掉上清，用FACS buffer清洗两次后每孔加入FACS buffer重悬细胞，然后上机器进行读数。使用流式细胞分析仪(BD公司，型号C6)对实验板中细胞进行测定读数。测定时先根据FCS和SSC圈定细胞位置，然后选择第二抗体对应荧光通道和SSC对细胞进行分析，数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标使用平均荧光强度数值，根据曲线拟合出抗GPRC5D抗体的EC50。
人源化抗体GB7013-1L01M-hu01对天然表达人GPRC5D的两种肿瘤细胞(NCI-H929、MM.1R)及过表达细胞(HEK293T-hGPRC5D)的结合情况分别如图3A-3C所示。表2列出了抗体在细胞上结合的EC50和最大结合值倍比(Top MFI FC)。对标单抗J&J-10B2的Fab序列来源于双特异性抗体GCDB72的靶向GPRC5D抗体序列。GCDB72为Johnson&Johnson公司开发的靶向CD3xGPRC5D双特异性抗体，目前已处于临床II期。结果表明，人源化抗体GB7013-1L01M-hu01对膜表面GPRC5D具备良好的结合活性，并显著强于对标抗体J&J-10B2。
表2抗体对GPRC5D阳性细胞的结合
实施例7：人源化抗GPRC5D抗体对猴源GPRC5D的交叉结合活性评价
通过慢病毒感染的方法(MOI＝3-10，5μg/mL polybrene)在HEK293细胞(ATCC)上过表达猴源GPRC5D(macaca GPRC5D，NCBI Reference Sequence:XP_005570249.1)。慢病毒由上海吉凯基因医学科技股份有限公司提供，细胞感染72小时后加相应抗生素继续培养2-4周，扩增并冻存，得到HEK293T-macaca GPRC5D细胞，以用于后续实验。
将500,000个猴源GPRC5D高表达细胞株(HEK293T-macaca GPRC5D，上海吉倍)置于FACS buffer中待用，使用圆底低吸附96孔板。抗体样本使用FACS buffer进行梯度稀释。细胞板中加入经稀释的抗体，相应阴性对照孔加入FACS buffer，4℃孵育1小时。离心去掉上清后，使用FACS buffer清洗两遍，每孔加入第二抗体(DyLight488山羊抗人IgG，Abcam目录编号ab97003)4℃再孵育0.5小时。染色完成后离心去掉上清，用FACS buffer清洗两次后每孔加入FACS buffer重悬细胞，然后上机器进行读数。使用流式细胞分析仪(BD公司，型号C6)对实验板中细胞进行测定读数。测定时先根据FCS和SSC圈定细胞位置，然后选择第二抗体对应荧光通道和SSC对细胞进行分析，数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标使用平均荧光强度数值，根据曲线拟合出EC50。
人源化抗体GB7013-1L01M-hu01对过表达细胞(HEK293T-macaca GPRC5D)的结合情况分别如图4所示。表3列出了抗体在HEK293T-macaca GPRC5D细胞上结合的EC50和最大结合值倍比(Top MFI FC)。结果表明，人源化抗体GB7013-1L01M-hu01对膜表面猴源GPRC5D有较好的同时不弱于人源GPRC5D过表达细胞的交叉结合活性，同时对标抗体J&J-10B2没有相应的交叉结合活性。
表3抗体对猴源GPRC5D过表达细胞的结合
实施例8：抗体诱导ADCC(Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity)作用
靶细胞使用GPRC5D天然表达肿瘤细胞(NCI-H929，南京科佰生物；MM.1R，南京科佰生物)，效应细胞使用in-house构建的稳定转染的CD16受体和NFAT(Nuclear Factor ofActivated T-cells)反应原件的Jurkat-NFAT-Luc-CD16细胞系，实验在96孔平底细胞板中(Corning 3903)进行。梯度稀释的抗体加入靶细胞中，37℃条件下孵育30分钟。每10000个靶细胞加入60000个效应细胞，37℃条件下进行反应6小时，反应结束加入One-GloTM试剂(Promega，E6110)进行荧光显色，细胞板使用Tecan Spark10酶标仪测定发光读数。数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标使用对应孔发光读数，根据曲线拟合出抗GPRC5D抗体的抗体依赖的细胞毒杀作用的EC50。
人源化抗体GB7013-1L01M-hu01诱导效应细胞对天然表达人GPRC5D的两种肿瘤细胞(NCI-H929、MM.1R)的抗体依赖的细胞毒杀作用分别如图5A-5B所示。表4列出了抗体在不同肿瘤细胞ADCC的EC50和最大值(Top Lum)。结果表明，人源化抗体GB7013-1L01M-hu01均能有效诱导效应细胞对表达GPRC5D的肿瘤细胞的杀伤，并杀伤效果显著强于J&J-10B2。
表4抗体对GPRC5D阳性肿瘤细胞ADCC作用
实施例9：人源化抗GPRC5D抗体亲和力分析
首先将链酶亲和素(Kactus，STP-HE001)偶联至CM5芯片(Cytiva，BR-1005-30)，得到CM5-SA芯片。以1x HBS-EP+作为实验缓冲液，将Biotinylated Human GPRC5D VLP(Kactus，GPR-HM05PB)捕获到CM5-SA芯片的2通道，捕获水平大约为1400ru，每个进样循环测定一种浓度的抗体与Biotinylated Human GPRC5D VLP的结合。1通道作为空白参考通道。以30μL/min的流速，将稀释后的GB7013-1L01M-hu01以25-1.5625nM(两倍稀释)的浓度依次进样于1，2通道，结合时间180s，解离时间300-600s。之后用Glycine 2.0以30μL/min的流速注射30s，完成芯片再生。实验温度为25℃。
利用T200的分析软件(版本号：3.2)，采用1：1binding的分析模式对BiotinylatedHuman GPRC5D VLP和GB7013-1L01M-hu01的结合和解离进行分析，其中Ka为结合速率常数，Kd为解离速率常数，KD为亲和力常数，结果见表5。结果表明，GB7013-1L01M-hu01与人源GPRC5D的结合亲和力显著强于J&J-10B2。
表5抗GPRC5D抗体结合亲和力常数
Ka(1/ms) Kd(1/s) KD(M)
GB7013-1L01M-hu01 9.12E+05 1.86E-04 2.04E-10
J&J-10B2 9.15E+05 1.61E-03 1.76E-09
实施例10：抗体诱导CDC(Complement Dependent Cytotoxicity)作用
靶细胞使用GPRC5D过表达细胞HEK293T-hGPRC5D。靶细胞(2×103)与各种不同浓度的抗体和作为补体来源的人血清(TPCS，A515)以2：1：1的体积比例混合，在96孔平底板(Coring，3903)37℃下共同孵育48小时。孵育完成后每孔加入30μL CTG(Promega，PR-G7571)室温进一步孵育15分钟，在多功能酶标仪(Tecan，Spark10)上检测发光读数。使用以下公式计算细胞毒性：细胞毒性百分比＝100×[(Max–data)/(Max–Min)]
其中Data是实验的数值(细胞与抗体和补体一起孵育)，Min是最小细胞毒性即实验的本底数值(细胞与培养基和补体)，而Max是最大细胞毒性(细胞与裂解液和补体共同孵育)。数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标使用对应孔荧光读数，根据曲线拟合出抗GPRC5D抗体的补体依赖的毒杀作用的EC50。
人源化抗体GB7013-1L01M-hu01诱导补体对过表达GPRC5D的HEK-hGPRC5D细胞的补体依赖的毒杀作用如图6所示。表6列出了抗体在不同肿瘤细胞CDC的EC50和最大杀伤(Top％specfic killing)。结果表明，人源化抗体GB7013-1L01M-hu01能有效诱导补体对表达GPRC5D的细胞的杀伤，其CDC杀伤效果显著强于J&J-10B2。
表6抗体对HEK293T-hGPRC5D细胞的CDC作用
综上，本申请采用GPRC5D高表达细胞及GPRC5D蛋白进行联合免疫，并在初筛阶段就对抗体与GPRC5D在细胞水平的结合进行考察并作为筛选依据，筛选出特异性结合细胞表面GPRC5D的抗体。该抗体有希望用于GPRC5D表达的肿瘤的治疗。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本申请的权利要求所涵盖。

Claims (11)

1.一种GPRC5D抗体，所述GPRC5D抗体包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的VH-CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的VH-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的VH-CDR3；和
所述轻链可变区的CDR包括氨基酸序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：11所示的VL-CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的VL-CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的VL-CDR3。
2.如权利要求1所述的GPRC5D抗体，其特征在于，所述重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列选自如下任一种：
(1)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，同时所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；或
(2)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，同时所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
3.如权利要求2所述的GPRC5D抗体，其特征在于，所述GPRC5D抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为人源IgG1重链恒定区，所述轻链恒定区为人源Kappa轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。
4.如权利要求1所述的GPRC5D抗体，其特征在于，所述GPRC5D抗体为人源化抗体、鼠源化抗体或嵌合抗体；和/或，所述抗体为IgG抗体。
5.一种核苷酸分子，编码如权利要求1～4任一项所述的GPRC5D抗体。
6.一种表达载体，含有如权利要求5所述的核苷酸分子。
7.一种宿主细胞，含有如权利要求6所述的表达载体或基因组中整合有如权利要求5所述的核苷酸分子。
8.一种制备权利要求1～4任一项所述GPRC5D抗体的方法，其包括，在允许所述抗体表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。
9.一种药物组合物，含有权利要求1～4任一项所述的GPRC5D抗体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
10.一种试剂盒，含有权利要求1～4任一项所述的GPRC5D抗体。
11.如权利要求1～4任一项所述的GPRC5D抗体、或如权利要求5所述的核苷酸分子、或如权利要求6所述的表达载体、或如权利要求7所述的宿主细胞、或如权利要求9所述的药物组合物在制备治疗多发性骨髓瘤产品中的用途。
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