CN116925229A

CN116925229A - 一种靶向gprc5d的抗体及其应用

Info

Publication number: CN116925229A
Application number: CN202311204175.XA
Authority: CN
Inventors: 谭涛超; 魏巧娥; 刘建伟; 贾向印; 李彤; 谢萌
Original assignee: Nanjing Reindeer Biomedical Co ltd; Nanjing Reindeer Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Reindeer Biomedical Co ltd; Nanjing Reindeer Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-09-19
Filing date: 2023-09-19
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2043-09-19
Also published as: CN116925229B

Abstract

本发明提供了一种靶向GPRC5D的抗体及其应用，包括重链可变区和轻链可变区，LCDR1的氨基酸序列为ENIYSY，LCDR2的氨基酸序列为NAK；LCDR3的氨基酸序列为QHHYGTPYT，HCDR1的氨基酸序列为GFTFSSYG，HCDR2的氨基酸序列为ISNRGTYI，HCDR3的氨基酸序列为ARPRQIGIFDY，或LCDR1的氨基酸序列为QSLLNSGNQKNY，LCDR2的氨基酸序列为GAS；LCDR3的氨基酸序列为QQHYSTPYT，HCDR1的氨基酸序列为GFTFSSYG，HCDR2的氨基酸序列为ISNRGTYI，HCDR3的氨基酸序列为ARPRQIGIFDY。

Description

一种靶向GPRC5D的抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向GPRC5D的抗体及其应用，尤其涉及与人GPRC5D抗原蛋白和细胞膜表面天然状态的GPRC5D抗原特异性结合的抗体。

背景技术

多发性骨髓瘤（multiple myleloma）是一种发生于骨髓的浆细胞肿瘤。该肿瘤会引发高钙血症、贫血、肾功能障碍、骨坏死和骨髓衰竭等病症。目前多发性骨髓瘤是第二大常见血液肿瘤。全球多发性骨髓瘤的发病率和死亡率比为1.8:1.1，亚洲为1.1:0.76，可见多发性骨髓在发病人群的生存率较低。主要原因一是发生人群的年龄中位值偏高在66岁左右，40岁以下人群的发生率在2%左右。二是多发性骨髓瘤在常用的化疗，免疫调节剂以及单抗疗法下几乎无治愈可能性，勉强缓解也伴随着极高的复发率，即复发难治性骨髓瘤（Relapsed/refractory Multiple myeloma（RRMM），五年生存率仅有51%。

近年来在多发性骨髓瘤治疗上，T细胞双特异性抗体疗法bispecific T cellengagers（BiTEs），和继发性T细胞疗法adoptive T cell therapy（ACT）取得了突破性进展。针对多发性骨髓瘤的靶向疗法产品靶点主要有BCMA、CD38、CD138和GPRC5D等。CD38和CD138还会在正常组织的细胞上及造血干细胞上表达，利用靶向疗法清除后副作用较大，往往会对正常器官造成损伤或是自身免疫系统受损，而BCMA和GPRC5D主要表达在浆细胞或骨髓瘤中的浆细胞上，而浆细胞可以依靠人体自身B细胞的不断再生得到弥补。以T细胞双特异性抗体产品为例，BCMA靶点的产品主要有再生元制药公司研发（RegeneronPharmaceuticals, Inc.（REGN））的REGN5458，强生研发的Teclistama，以及安进的AMG420。REGN5458目前已结束临床一期实验（NCT03761108）。19名接受治疗的患者种，42%达到完全缓解（CR）或者严格完全缓解（sCR）；Teclistamab已进入临床二期实验（NCT04557098），临床一期结果显示，总体响应率（ORR）为65%，40%的患者完全缓解（CR）；AMG420的临床一期（NCT03836053）显示，总体响应率（ORR）为71%。

百时美施贵宝（BMS）研发的针对多发性骨髓瘤BCMA靶点的CAR-T产品－bb2121在2021年5月被FDA批准为第一款多发性骨髓瘤上市的CAR-T产品。该产品总体响应率（ORR）为72%，28%患者可达到严格完全缓解（sCR）。尽管该产品为多发性骨髓的治愈带来了希望，但是从公布的数据来看，其完全缓解（CR）的患者中22个月疾病无进展生存期占比也不到50%，可见治疗后期也存在较高的复发率。此外，由于该疗法清除所有的浆细胞，仍然有血细胞减少免疫球蛋白降低等引发的副作用。GPRC5D表达相对BCMA更为特异，仅在骨髓瘤患者的浆细胞中表达，而正常组织几乎不表达，仅在毛囊组织中能检测到明显的RNA和蛋白表达。在敲除GPRC5D的老鼠与正常野生型的表型比较上（包括体重，器官形态学差异，生殖率等），也未发现明显差异，可见GPRC5D缺失对生存和正常器官的代谢并非必需，其清除的副作用较小。进一步发现，BCMA的表达和GPRC5D并没有相关性，两者虽然都同时在浆细胞中表达，但表达谱相对独立。可见对于BCMA CAR-T疗法后期患者中BCMA表达偏低，可用靶向GPRC5D来治疗。

因此，开发能够对GPRC5D表达的细胞发挥临床有效的细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制效应，对GPRC5D不表达的细胞无不良影响的抗体，对研发GPRC5D表达相关的免疫治疗产品，有非常重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种靶向GPRC5D的抗体及其应用。所述抗体特异性良好且亲和力较强，为后续开发GPRC5D CAR-T产品或者抗体药奠定了基础。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3；

其中，LCDR1的氨基酸序列为ENIYSY；LCDR2的氨基酸序列为NAK；LCDR3的氨基酸序列为QHHYGTPYT；HCDR1的氨基酸序列为GFTFSSYG；HCDR2的氨基酸序列为ISNRGTYI；HCDR3的氨基酸序列为ARPRQIGIFDY；

或，LCDR1的氨基酸序列为QSLLNSGNQKNY；LCDR2的氨基酸序列为GAS；LCDR3的氨基酸序列为QQHYSTPYT；HCDR1的氨基酸序列为GFTFSSYG；HCDR2的氨基酸序列为ISNRGTYI；HCDR3的氨基酸序列为ARPRQIGIFDY。

优选地，所述重链可变区包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

优选地，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

优选地，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；

或，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。

优选地，所述抗体为单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:14或SEQID NO:20所示。

第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段。

优选地，编码所述抗体的重链可变区的核酸分子如SEQ ID NO:12所示，编码所述抗体的轻链可变区的核酸分子如SEQ ID NO:13所示；

或，编码所述抗体的重链可变区的核酸分子如SEQ ID NO:18所示；编码所述抗体的轻链可变区的核酸分子如SEQ ID NO:19所示。

优选地，编码所述单链抗体的核酸分子如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:17所示。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有第二方面所述的核酸分子。

在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第二方面所述的核酸分子或上述的表达载体。

优选地，所述宿主细胞包括细菌、真菌或哺乳动物细胞。

第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，或者第三方面所述的表达载体，以及药学上可接受的载体。

第五方面，本发明提供一种用于检测GPRC5D的试剂，所述试剂包括第一方面所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，或者第三方面所述的表达载体。

第六方面，本发明提供第一方面所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的药物组合物或第五方面所述的用于检测GPRC5D的试剂在制备治疗或检测肿瘤的药物中的应用。

优选地，所述肿瘤包括GPRC5D表达为阳性的肿瘤；

优选地，所述GPRC5D表达为阳性的肿瘤为多发性骨髓瘤。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明中所述靶向GPRC5D的抗体特异性强，具有种属交叉性反应，与细胞系不结合，与无关蛋白不结合。

（2）本发明获得了一种抗体，以高亲和力特异性结合GPRC5D，并且能够阻断GPRC5D与其受体的结合，与异源抗体相比具有更低的免疫原性；在抗体药物（包括单抗、双抗、ADC等）及细胞治疗药物（包括CAR-T、CAR-NK等）的开发上有很好的应用潜力；另外所述全人源的抗体也可以用于检测试剂的开发。

（3）本发明使用了蛋白淘选的方法，能高效的富集结合重组GPRC5D蛋白的抗体，大大降低了后期抗体筛选的难度，提高了效率。

附图说明

图1为本发明从噬菌体抗体库筛选靶向GPRC5D的特异抗体的流程。

图2为所淘选的部分噬菌体单克隆与靶抗原和对照抗原的酶联免疫吸附测定（ELISA）结果。

图3为部分噬菌体单克隆与CHO-K1-GPRC5D和CHO-K1细胞结合的流式细胞分析结果。

图4为所筛选的噬菌体单克隆在噬菌体水平与多种非相关抗原的酶联免疫吸附测定分析结果。

图5为所筛选的噬菌体单克隆在噬菌体水平与多种不同的GPRC5D阳性和阴性细胞系的结合的流式细胞分析结果。

图6为单克隆抗体与人GPRC5D过表达的CHO-K1-GPRC5D细胞系的结合试验结果。

图7为两个单克隆抗体与猴GPRC5D过表达的CHOS-macaque GPRC5D细胞系的结合实验结果。

图8为两个单克隆抗体与鼠GPRC5D过表达的CHOS-mouse GPRC5D细胞系的结合实验结果。

图9为两个单克隆抗体与GPTC5D阳性的NCI.H929肿瘤细胞系的结合实验结果。

图10为两个单克隆抗体与GPTC5D阳性的MM1.S肿瘤细胞系的结合实验结果。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

抗体指由浆细胞（效应B细胞）分泌、被机体免疫系统用来中和外来物质（多肽、病毒、细菌等）的免疫球蛋白。该外来物质相应地称作抗原。抗体分子的基本结构是由2个相同重链和2个相同轻链组成的4聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区（V）和位于羧基端的恒定区（C）。一条重链和一条轻链的可变区相互作用形成了抗原结合部位（Fv）。在可变区中，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比可变区内的其它区域（骨架区，FR）更易变化，称为高变区（HVR），高变区实际上是抗体与抗原结合的关键部位。由于这些高变区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区（complementarity-determining region，CDR）。重链和轻链均具有三个互补决定区，分别称为HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3。

单链抗体（single chain fragment variable，scFv），是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠，来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段，因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。

“单域抗体（single domain antibody，sdAb）”，或者也称为“VHH抗体”，指具有抗原结合能力，包括重链可变区而无轻链的抗体分子。从结构上看，单域抗体也可以认为是抗体分子的一种抗原结合片段。其首先在骆驼科动物中被发现，随后，研究人员通过抗体库（例如噬菌体展示文库）筛选发现了更多的具有抗原结合能力的单域抗体。单域抗体相对于普通抗体分子（例如，经典四聚体抗体分子）或其抗原结合片段具有一些优势，例如包括但不限于：分子量更小，使用于人体时易于到达普通抗体分子难以到达的组织或部位，或者，能够接触到蛋白或多肽中普通抗体分子难以接触到的抗原表位；更加稳定，能够耐受例如温度和pH的变化以及变性剂和蛋白酶的作用。

“嵌合抗体受体（chimeric antigen recessive，CAR）”，也称为嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体，为一种工程化的膜蛋白受体分子，其可将期望的特异性赋予免疫效应细胞，例如与细胞表面蛋白（如肿瘤抗原）结合的能力。嵌合抗原受体通常由胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域构成。通常，抗原结合结构域为一段scFv或sdAb序列，负责识别和结合特定的抗原。该抗原结合结构域可以为单特异性的，即仅对一种抗原具有特异性结合能力；也可以为多特异性的（例如双特异性的），即对多种抗原具有特异性结合能力。在本文提供的一些实例中，该胞外抗原结合结构域对GPRC5D有特异性结合能力。胞内信号结构域通常包括免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM），例如来源于CD3ζ分子的信号传导结构域，负责激活免疫效应细胞，产生杀伤作用。另外，嵌合抗原受体还可在氨基端包括负责新生蛋白在细胞内定位的信号肽，以及在抗原结合结构域和跨膜结构域之间包括铰链区。胞内信号传导结构域还可包括来源于例如4-1BB或CD28分子的共刺激结构域。相应地，将表达CAR的T细胞简称为CAR-T。CAR-T利用其细胞表面表达的CAR识别靶细胞，被靶细胞激活后以非MHC限制性方式产生对靶细胞的杀伤作用。在一个实例中，利用CAR-T细胞对受试者（如癌症患者）进行治疗的大体过程为：从受试者采集外周血单个核细胞（PBMC），分离并培养T细胞，通过慢病毒转导方式导入CAR编码核酸序列，继续培养并收集CAR⁺细胞，以及将CAR⁺细胞回输给该受试者。本领域技术人员已知，在一些情况下，可以利用NK细胞替代T细胞来进行该过程。因此，在提及CAR-T时，视情况也可涵盖表达CAR的NK细胞。

GPRC5D是G蛋白偶联受体C5家族亚型D，属于一种孤儿受体，为7次跨膜蛋白。孤儿受体（Orphan Receptor）是指与其它已确认的受体结构明显相似，但其内源配体还未发现的受体。GPRC5D在原代多发性骨髓瘤细胞表面高表达，而在正常组织的表达仅限于毛囊区域，有研究表明65%的多发性骨髓瘤患者GPRC5D有超过50%的表达阈值，凭借这一特点，GPRC5D成为了治疗MM的潜在靶标。

研究概述：

本发明应用小鼠免疫并建立噬菌体抗体库的方案筛选抗GPRC5D特异抗体，并通过ELISA和FACS实验来评估这些抗体在噬菌体水平和GPRC5D病毒样颗粒（GPRC5D-VLP）结合的特异性；筛选序列制备成抗体后，通过FACS测定抗体与多个GPRC5D阳性细胞结合的亲和力。最终，我们获得了2个特异性良好且亲和力较强的抗体克隆。

小鼠免疫抗体库，经过重组GPRC5D蛋白/细胞（CHO-K1-GPRC5D）淘选，总共挑选了188个单克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术（FACS）检测初筛，其中18个克隆特异结合GPRC5D-VLP蛋白和GPRC5D表达阳性细胞CHO-K1-GPRC5D，而不结合对照蛋白VLP和GPRC5D表达阴性细胞CHO-K1。测序后得到了2种不同的单克隆序列。随后，我们将这2种抗体与多种GPRC5D阳性（CHO-K1-GPRC5D，MM1S）和阴性细胞系（CHO-K1，Jurkat）进行流式细胞分析（FACS）鉴定，与多种非相关抗原（VLP，BAFFR-his-Bio，IL10-Bio，SA）和GPRC5D蛋白（GPRC5D-VLP）进行酶联免疫吸附（ELISA）鉴定，这2个克隆在多种细胞系和多种蛋白抗原上都表现出良好的结合力和特异性，然后将这2个克隆表达为IgG形式的抗体，通过流式细胞术分析这些克隆与不同细胞的结合，这2个克隆的结合能力相当，且均较对照的结合能力强，这些克隆的获得为后续开发GPRC5D CAR-T产品或者抗体药奠定了基础。

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 通过亲和淘选从噬菌体抗体库富集靶向GPRC5D蛋白的特异抗体克隆

采用合适的负淘选和正淘选策略从噬菌体抗体库中富集所需的特异性抗体克隆。

（1）噬菌体抗体库的构建

采用GPRC5D-VLP蛋白和/或GPRC5D过表达细胞CHO-K1-GPRC5D免疫BaLb/C小鼠，获取小鼠脾脏，提取RNA后建立噬菌体抗体免疫库。选择6-8周龄BaLb/C小鼠，以GPRC5D-VLP蛋白、CHO-K1-GPRC5D单独免疫或联合免疫的方案对小鼠免疫。免疫方案如下：

1）GPRC5D-VLP蛋白免疫：首次免疫50 μg/只，之后25 μg/只，最后冲击免疫50 μg/只，免疫体积100 μL/只/次；初次免疫采用肌肉免疫，二免采用皮下免疫，两种免疫方式交替进行；间隔一周免疫一次，共计免疫四次。

2）CHO-K1-GPRC5D细胞免疫：免疫剂量为CHO-K1-GPRC5D细胞1.5×10⁷/只，免疫体积100 μL/只/次；均采用腹腔免疫；间隔一周免疫一次，共计免疫5次。

3）CHO-K1-GPRC5细胞与GPRC5D-VLP蛋白联合免疫：首次免疫采用GPRC5D-VLP蛋白皮下免疫，50 μg/只，免疫体积100 μL/只/次；二免用细胞腹腔免疫，免疫剂量1.5×10⁷/只；每隔一周免疫一次，两种免疫方式交替进行；冲击免疫采用CHO-GPRC5D-VLP蛋白，腹腔免疫；共计免疫5次。末次免疫均采用腹腔免疫，免疫后3天，取小鼠脾脏，提取组织RNA后逆转录成cDNA，分别扩增重链可变区和轻链可变区，扩增回收目的片段经限制性内切酶酶切后，分步连接至建库载体，构建噬菌体抗体库。

（2）GPRC5D蛋白/细胞淘选

以GPRC5D-VLP作为正淘选蛋白，以VLP蛋白作为负淘选蛋白进行多轮淘选，获得富集目的抗体克隆的噬菌体池。实验步骤简述如下：

1）包被抗原：将抗原GPRC5D-VLP用干净的包被缓冲液（PBS缓冲液）稀释到10 μg/mL，每孔加入100 μL工作液，每个淘选6个孔，4℃过夜结合；将抗原VLP蛋白用干净的包被缓冲液（PBS缓冲液）稀释到10 μg/mL，每孔加入100 μL工作液，每个淘选6个孔，4℃过夜结合;负淘抗原标记为负板，正淘抗原为正板。2）封闭：将抗原倒扣掉，并在吸水纸拍去孔内残液，加入250 μL 3%BSA-PBS封闭，室温封闭2小时。3）加入噬菌体文库（含5×10¹²个噬菌体颗粒）和和对照抗原VLP一起孵育，以便扣除非特异结合VLP的噬菌体抗体克隆。4）孵育后将上清转移到结合了靶抗原GPRC5D-VLP的正板中，继续孵育，使噬菌体和靶抗原结合。5）用洗涤液洗涤磁珠，将未结合的噬菌体洗去。6）用洗脱液将阳性噬菌体从靶抗原上洗脱下来，加入中和液中和。7）以洗脱后的噬菌体重新感染宿主菌XL1-blue，扩增回收的噬菌体。留少量样品梯度稀释，感染宿主菌，涂氨苄抗性平板，计算回收噬菌体数量。8）重复步骤1）至6），通常需要进行2轮淘选。

以GPRC5D表达阴性的CHO-K1细胞作为负淘选细胞，以GPRC5D表达阳性的CHO-K1-GPRC5D细胞作为正淘选细胞进行多轮淘选，以获得富集了目的抗体克隆的噬菌体池。实验步骤如下所示：

1）将经蛋白淘选后富集了特异性克隆的噬菌体池（含5×10¹¹个噬菌体颗粒）与1×10⁷个负淘选细胞CHO-K1混匀，在旋转混合仪上，室温孵育2小时。让与负淘细胞系结合的抗体克隆与这些细胞充分结合。2）以1500 rpm离心5分钟，沉淀细胞，将上清转移到新管中，与1×10⁷个CHO-K1-GPRC5D细胞（GPRC5D阳性细胞）混匀，在旋转混合仪上，室温结合2小时。3）用PBS洗涤细胞6次，每次吸弃上清，重悬后1500 rpm离心5分钟，以去除未结合的噬菌体。4）用洗脱液将阳性噬菌体从靶抗原上洗脱下来，加入中和液中和。5）用洗脱后的噬菌体重新感染宿主菌，扩增回收的噬菌体。留少量样品梯度稀释，感染宿主菌，涂氨苄抗性平板，计算回收噬菌体数量。6）重复步骤1）至5），通常需要进行2轮淘选，直到观察到噬菌体的回收率（洗脱噬菌体数/投入噬菌体数）有明显上升。富集好的噬菌体池可用于进行随后的单克隆挑选以及ELISA/FACS筛选。本实施例主要材料如表1所示：

表1

其中，所用试剂如下：封闭液：PBS+3%牛血清白蛋白；漂洗液：PBS+0.1%吐温20；洗脱液：0.2 M甘氨酸，pH2.2；中和液：1 M Tris，pH9.1。

实验结果如下所示：使用不同的抗体库，通过2轮蛋白和2轮细胞交替淘选的方法从噬菌体抗体库中富集可以同时结合GPRC5D蛋白和细胞表面天然状态的GPRC5D的特异性抗体克隆。表2显示了利用重组GPRC5D蛋白和CHO-K1-GPRC5D/ CHO-K1细胞系联合淘选的结果。从回收率来看，所有4个淘选都得到了富集，可以用于下一步挑选单克隆。

表2

实施例2 采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术（FACS）从经富集的噬菌体池筛选特异性克隆

目的和原理：通过亲和淘选步骤富集的噬菌体池中包含各种性质的噬菌体抗体：特异克隆、非特异克隆、以及阴性克隆。为了获得特异克隆，需要从中分离单克隆，包装成单克隆的噬菌体，并通过酶联免疫检测（ELISA）和流式细胞术（FACS）对大量单克隆进行初筛，从中挑选到同时特异结合GPRC5-VLP蛋白和GPRC5D阳性细胞系CHO-K1-GPRC5D的单克隆。特异的单克隆再进一步通过DNA测序确定其中包含的唯一的抗体序列。

在ELISA初筛中，只结合GPRC5D-VLP而不结合对照抗原VLP的被认定为特异克隆。FACS初筛使用GPRC5D高表达的阳性细胞系CHO-K1-GPRC5D和GPRC5D阴性的细胞系CHO-K1来进行，只结合细胞CHO-K1-GPRC5D且不结合CHO-K1细胞的被认定为特异克隆。通过ELISA和FACS两种初筛，可以获得既能结合重组表达的GPRC5D蛋白，又能识别细胞表面天然状态GPRC5D分子的候选抗体，供随后进一步筛选。

ELISA初筛实验步骤如下所示：

1）用深孔96孔板培养和包装单克隆噬菌体。2）将GPRC5D-VLP用PBS稀释到10 μg/mL，以100 μL/孔加入到高结合酶标板中，4℃过夜包被。3）弃掉包被液，每孔加入250 μL封闭液，室温封闭2小时。4）250 μL漂洗液洗板2次。5）加入100 μL步骤1）培养好的噬菌体上清到包被好靶抗原的孔，室温结合2小时。6）250 μL漂洗液洗板4次。7）加入1:2000稀释的Anti-M13 Bacteriophage Coat Protein g8p antibody（抗m13噬菌体外壳蛋白g8p抗体）一抗，100 μL/孔，室温孵育45分钟。8）250 μL漂洗液洗板4次。9）加入1:2000稀释的HRPDonkey anti-mouse IgG（HRP标记的驴抗小鼠IgG），100 μL/孔，室温孵育45分钟。10）250 μL漂洗液洗板6次。11）加入100 μL TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）显色底物，显色10分钟。12）加入100 μL 2 M H₂SO₄终止反应，在酶标仪上读取结果。

FACS初筛实验简要步骤：

1）用深孔96孔板培养和包装单克隆噬菌体。2）CHO-K1-GPRC5D和CHO-K1细胞用PBS洗2次，用PBS重悬成1×10⁷/mL浓度，以50 μL分装到96孔深孔板中。3）每孔加入50 μL包装好的单克隆噬菌体，混匀后，4℃结合2小时。4）200 μL PBS洗涤2次。5）加入1:2000稀释的Anti-M13 Bacteriophage Coat Protein g8p antibody（抗m13噬菌体外壳蛋白g8p抗体）一抗，100 μL/孔，吹打混匀后，室温孵育45分钟。6）200 μL PBS洗涤2次。7）加入1:300稀释的FITC horse anti mouse-IgG（H+L）（FITC标记山羊抗小鼠IgG），100 μL/孔，吹打混匀后，室温孵育45分钟。8）200 μL PBS洗涤2次；最后用200 μL PBS重悬细胞。9）在流式细胞仪上检测样品FITC通道的荧光强度，分析结果。本实施例的主要材料如表3所示：

表3

其中，所用试剂如下：封闭液：PBS+3%牛血清白蛋白；漂洗液：PBS+0.1%吐温20；可溶型单组分TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物溶液，天根，PA-107-02。

实验结果：从富集后的噬菌体抗体池随机挑选单克隆，包装成噬菌体后，通过噬菌体ELISA检测单克隆噬菌体与GPRC5D-VLP蛋白、对照蛋白VLP的结合，找到GPRC5D特异的噬菌体抗体克隆。部分克隆的ELISA结果如图2所示。图中，A9为阴性对照噬菌体抗体克隆（Negative phage control），A10为只加一抗和二抗的阴性抗体对照（Anti-M13 phagemouse/anti-mouse HRP Ab），A11为只加二抗的阴性抗体对照（anti-mouse HRP Ab），A12为检测抗原标签的阳性抗体对照（anti-his tag HRP Ab），A13为只加二抗的阴性抗体对照（anti-human IgG HRP Ab），A14为靶抗原的阳性抗体对照（Positive Benchamrk1）。

从图中可知，A1、A2、A4、A7和A8号克隆与靶抗原GPRC5D（GPRC5D-VLP）结合较强，且不与对照抗原VLP结合，特异性良好。A3、A5和A6号克隆与靶抗原和对照抗原都结合，不符合特异性结合要求。阴性对照噬菌体抗体克隆与靶抗原和对照抗原都不结合，只加一抗和二抗的阴性抗体对照（Anti-M13 phage mouse/anti-mouse HRP Ab）、只加二抗的阴性抗体对照（anti-mouse HRP Ab）和只加二抗的阴性抗体对照（anti-human IgG HRP Ab），它们与靶抗原和对照抗原都不结合；检测抗原标签的阳性抗体对照（anti-his tag HRP Ab）与his标签的抗原结合，说明包被的抗原已经结合到板子上。靶抗原的阳性抗体（PositiveBenchamrk1）与靶抗原结合，与对照抗原不结合。

与ELISA相对应的抗体克隆的FACS初筛结果如图3所示。其中A1、A2、A3、A4、A5、A6和A7克隆结合CHO-K1-GPRC5D，不结合CHO-K1细胞，是特异克隆；A8号克隆与2种细胞都不结合，是阴性克隆；阴性对照噬菌体抗体克隆（Negative phage control）与靶抗原和对照抗原都不结合，靶抗原的阳性抗体（Positive Benchamrk1 Ab）与高表达细胞系CHO-K1-GPRC5D结合，与对照阴性细胞CHO-K1不结合。

通过ELISA检测和FACS初筛，总共获得18个ELISA和FACS双阳性且特异性良好的克隆，随后将获得的18个双阳性且特异性良好的克隆测序，测序后得到了2种不同的单克隆序列，然后将这2个不同序列的单克隆进一步通过多细胞系的FACS鉴定和多种抗原的ELISA鉴定检测候选克隆的结合特异性。

实施例3 在噬菌体水平通过ELISA和FACS进一步鉴定单克隆特异性

实验目的和原理：用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性，只结合靶抗原，而不结合任何无关的抗原；另一方面，不同的细胞系上同一抗原的氨基酸序列会有差异（异构体或突变体）或结合的配体不一样，也需要考察抗体能否与各种靶蛋白阳性的细胞都结合。为了进一步分析这些单克隆的特异性和普适性，寻找最佳的候选克隆，本实施例通过酶联免疫检测（ELISA）和流式细胞术进一步评估初筛克隆的特异性。

采用多种非相关抗原通过ELISA进一步鉴定单克隆特异性。在这个实验中，采用靶抗原GPRC5D-VLP抗原和多种GPRC5D不相关抗原与这些单克隆噬菌体抗体进行反应，分析这些克隆是否与其它GPRC5D不相关抗原有任何非特异的结合。通过这个实验，获得了若干具有优良特异性的克隆。实验方法：与ELISA初筛相同。本实施例的主要样品和试剂如表4所示：

表4

其余试剂与ELISA初筛相同。

实验结果：用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性。为了进一步分析这些单克隆抗体的特异性，将实施例2获得的多个克隆在多种抗原应用酶联免疫吸附（ELISA）进行了鉴定。结果显示在图4中，1为克隆62，2为克隆104克隆，3为阴性对照噬菌体抗体克隆（Negative phage control），4为只加一抗和二抗的阴性抗体对照（Anti-M13 phagemouse/anti-mouse HRP Ab），5为靶抗原（GPRC5D-VLP）的阳性抗体对照（PositiveBenchmark1 Ab），6为只加二抗的阴性抗体对照（Anti-human IgG HRP Ab），7为检测抗原标签的阳性抗体对照（anti-his HRP Ab）。

Negative phage control为阴性对照噬菌体抗体克隆，与靶抗原和对照抗原都不结合，Anti-M13 phage mouse/anti-mouse HRP Ab为只加一抗和二抗的阴性抗体对照，它们与靶抗原和对照抗原都不结合，Positive Benchmark1 Ab为靶抗原（GPRC5D-VLP）的阳性抗体对照，与靶抗原结合，与对照抗原不结合。Anti-human IgG HRP Ab为只加二抗的阴性抗体对照，anti-his HRP Ab为检测抗原标签的阳性抗体对照，与his标签的抗原结合，说明包被的抗原已经结合到板子上。克隆62、克隆104克隆与GPRC5D抗原都结合，与4种非相关抗原都不结合，说明克隆62、克隆104能够结合GPRC5D抗原且特异性良好。

在噬菌体水平采用多种细胞系通过FACS进一步鉴定单克隆特异性。在这个实验中，采用多种GPRC5D阳性的细胞系和多种GPRC5D阴性的细胞系与这些单克隆噬菌体抗体进行反应，分析这些克隆是否可以结合不同的细胞系上的GPRC5D抗原，以及是否与其它不表达GPRC5D的细胞系有任何非特异的结合。通过这个实验，我们获得了若干具有优良特异性的克隆。实验方法：与FACS初筛相同。

主要样品和试剂包括：CHO-K1-GPRC5D细胞系，GPRC5D阳性细胞系；MM1.S细胞系，GPRC5D阳性细胞系；CHO-K1细胞系，GPRC5D阴性细胞系；Jurkat细胞系，GPRC5D阴性细胞系；其余试剂与FACS初筛相同。

实验结果：用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性。为了进一步分析这些单克隆抗体的特异性，将实施例2获得的克隆在更多的抗原和细胞系上应用酶联免疫吸附和流式细胞术进行了鉴定。结果显示在图5中，包括，阴性对照噬菌体抗体克隆（Negativephage Control），只加二抗的阴性对照（APC anti-human IgG Ab），靶抗原的阳性抗体（Positive Benchamrk1 Ab），不加抗体的阴性对照（cell only）。克隆62、克隆104与2种GPRC5D阳性细胞系CHO-K1-GPRC5D和MM1S都结合，与2种GPRC5D阴性细胞系CHO-K1和Jurkat都不结合，特异性良好；靶抗原的阳性抗体与高表达细胞系CHO-K1-GPRC5D结合，与对照阴性细胞CHO-K1不结合；只加二抗的阴性对照与两种细胞系都不结合。

实施例4 通过FACS检测单克隆抗体与高表达细胞系的结合能力

GPRC5D抗体分子与抗原间的亲和力大小可能对CAR-T或者抗体药在患者体内发挥杀伤作用及存续时间有着重要影响。本实施例采用了流式细胞术方法分析抗体分子的半数有效浓度（Ec50），为研发过程提供重要的信息。流式细胞术实验步骤如下所示：

（1）不同浓度抗体的准备：使用PBS将抗GPRC5D IgG（分别由克隆62、克隆104表达）从300 nM，依次5倍稀释，稀释至0.00384 nM共8个浓度，准备检测抗体与过表达细胞系CHO-K1-HuGPRC5D和肿瘤阳性细胞NCI-H929、MM.1S的结合能力、种属交叉CHOS-macaque GPRC5D（CHOS-猿GPRC5D）、CHOS-mouse GPRC5D（CHOS-鼠GPRC5D）。（2）将细胞用PBS洗2次，用PBS重悬成1×10⁷/mL浓度，以50 μL分装到96孔深孔板中。（3）每孔加入50 μL稀释好的抗GPRC5DIgG，混匀后，4℃结合2小时。（4）200 μL PBS洗涤2次。（5）加入1:300稀释的Fluorescein（FITC）AffiniPure Goat Anti-Human IgG（荧光素(FITC)亲和纯山羊抗人IgG），100 μL/孔，吹打混匀后，室温孵育45分钟。（6）200 μL PBS洗涤2次；最后用200 μL PBS重悬细胞。（7）在流式细胞仪上检测样品FITC通道的荧光强度。（8）通过使用Graphpad Prism软件（棱镜科研绘图工具）分析结合常数。

本实施例中所使用的主要样品和试剂如下所示：CHO-K1-HuGPRC5D细胞系（GPRC5D阳性细胞系）；NCI-H929细胞系（GPRC5D阳性细胞系）；MM.1S细胞系（GPRC5D阳性细胞系）；CHOS-macaque GPRC5D（macaque GPRC5D阳性细胞系）；CHOS-mouse GPRC5D（mouse GPRC5D阳性细胞系）；Fluorescein（FITC）AffiniPure Goat Anti-Human IgG，Fcγ fragmentspecific（荧光素(FITC)亲和纯山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性），简称Fluorescein（FITC）AffiniPure Goat Anti-Human IgG。

亲和力系指单个分子与其配体结合的强度，通常可以通过FACS检测与阳性细胞系的结合能力来评估两分子间相互作用的强度并对此进行排序。Ec50值越小，抗体对其靶标的亲和力越大。如图6、图7、图8、图9和图10所示，图6-10为筛选得到的噬菌体单克隆表达为蛋白抗体后与阳性细胞系的结合的流式分析结果，图6为mAb 62、mAb 104和PositiveBenchmark（靶抗原（GPRC5D-VLP）的阳性抗体对照）与人GPRC5D过表达的CHO-K1-GPRC5D细胞系的结合试验结果，图7为与猴GPRC5D过表达的CHOS-macaque GPRC5D细胞系的结合实验结果，图8为与鼠GPRC5D过表达的CHOS-mouse GPRC5D细胞系的结合实验结果，图9为与GPTC5D阳性的NCI.H929肿瘤细胞系的结合实验结果，图10为与GPTC5D阳性的MM1.S肿瘤细胞系的结合实验结果。

综合5种不同细胞的结合数据，mAb 62和mAb 104具有人猴交叉活性，无鼠交叉活性，mAb 62和mAb 104的结合能力相当，都较对照的亲和力高，结果如表5和表6所示。

表5

表6

综上，本发明应用小鼠免疫并建立噬菌体抗体库的方案筛选抗GPRC5D特异抗体，并通过ELISA和FACS实验来评估这些抗体在噬菌体水平和GPRC5D病毒样颗粒（GPRC5D-VLP）结合的特异性；筛选序列制备成抗体后，通过FACS测定抗体与多个GPRC5D阳性细胞结合的亲和力。最终，获得了2个特异性良好且亲和力较强的抗体克隆，所述为后续开发GPRC5DCAR-T产品或者抗体药奠定了基础。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3；

2.根据权利要求1所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；

5.根据权利要求1所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20所示。

6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-5中任一项所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，编码所述抗体的重链可变区的核酸分子如SEQ ID NO:12所示，编码所述抗体的轻链可变区的核酸分子如SEQ ID NO:13所示；

8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求6或7所述的核酸分子。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-5中任一项所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，或，权利要求8所述的表达载体，以及药学上可接受的载体。

10.一种用于检测GPRC5D的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1-5中任一项所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，或，权利要求8所述的表达载体。

11.权利要求1-5中任一项所述的靶向GPRC5D的抗体或其抗原结合片段、权利要求6或7所述的核酸分子、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的药物组合物或权利要求10所述的用于检测GPRC5D的试剂在制备治疗或检测肿瘤的药物中的应用。