CN116444667A - 一种靶向gdf15的全人源抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种靶向GDF15的全人源抗体及其应用，所述靶向GDF15的全人源抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO.1所示的HCDR1，SEQ ID NO.2所示的HCDR2，SEQ ID NO.3所示的HCDR3，所述轻链可变区包括SEQ ID NO.4所示的LCDR1，LCDR2，SEQ ID NO.5所示的LCDR3，所述LCDR2的氨基酸序列为INN。所述靶向GDF15的全人源抗体以高亲和力特异性结合GDF15，且能够阻断GDF15与其受体GPRAL的结合，与异源抗体相比，具有更低的免疫原性，在抗体药物的开发上有很好的应用潜力。

Description

一种靶向GDF15的全人源抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向GDF15的全人源抗体及其应用，尤其涉及与人GDF15抗原蛋白特异性结合的全人源抗体。

背景技术

生长分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF15）是一种内分泌激素，是转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）超家族成员，其受体是胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）家族受体α样（GDNF-family receptor α-like，GFRAL）蛋白，GDF15通过与GFRAL-转染重排（rearranged during transfection，RET）异源二聚体受体结合而发挥作用。GFRAL受体复合物仅在后脑中表达，GDF15与之结合激活该受体后可导致食物摄入减少和体重减轻，因此GDF15被称为“厌食激素”，GFRAL基因敲除后，重组GDF15将不再发挥厌食和代谢获益作用。此外，高脂饮食引起的肥胖和胰岛素抵抗在GFRAL基因敲除小鼠中更加严重，提示该受体在代谢中具有稳态作用。

美国Amgen公司研发的GDF15类似物融合蛋白AMG-171，临床前研究表明，给予GDF15 Fc融合蛋白（AMG-171）治疗后，小鼠、大鼠和肥胖食蟹猴的食物摄入减少并伴体重减轻，胃排空延迟，食物偏爱发生改变，改善了其代谢状况。美国强生公司研发的GFRAL激动剂JNJ-9090，其作用机制旨在通过促进产热、脂解作用以及氧化代谢发挥抗肥胖作用。丹麦诺和诺德公司开发的NN-9215 （LA-GDF15）为长效GDF15类似物。上述三家公司所选适应症均为肥胖症，期望通过抑制食欲达到减重目的，目前正在进行I期临床试验，处于招募受试者的阶段。

GDF15可引起厌食的作用为抗肥胖和厌食综合征的治疗开启了新方向，尤其是癌症患者的厌食以及由此导致的恶液质。内源性GDF15升高与能量平衡紊乱、癌症进展、化疗诱发的厌食症和晨吐有关，GDF15通过引起恶心和/或通过催吐神经回路，以及厌恶性的内脏不适状态诱发厌食症和体重减轻。美国辉瑞公司开发了GDF15抗体，发现其可减轻铂类化学疗法引起的呕吐、厌食以及小鼠和非人灵长类动物的体重减轻，提示GDF15抗体可阻断铂类药物化疗的不良反应，减轻癌症恶液质，将为癌症患者解除痛苦，提高生活质量和生存希望；美国NGM公司的研究证实，GDF15抗体3P10介导的GDF15-GFRAL活性抑制可逆转荷瘤小鼠的癌症恶液质。GDF15-GFRAL的拮抗作用可能会成为厌食-恶病质综合征的一种有效的治疗策略，GDF15/GFRAL/RET途径正逐渐成为药物研发中较为活跃的领域。美国辉瑞公司开发的PF-06946860以及美国AVEO公司研发的AV-380均为GDF15单克隆抗体，主要针对厌食症开展临床研究，旨在通过药物干预达到改善肿瘤患者化疗过程中的厌食反应，最终改善恶液质状态。

目前GDF15在实体瘤肿瘤微环境中具体作用机制尚不清楚，但阻断GDF15可以增强某些免疫细胞的活性。德国CataLYm公司研发的CTL-002为靶向GDF15人源化、铰链稳定的IgG4单克隆抗体。它可增强免疫细胞有效进入寒冷肿瘤微环境的能力，用于中和肿瘤产生的GDF15，将“冷”肿瘤变成“热”肿瘤，CTL-002有望减轻GDF15对免疫刺激性LFA-1/ICAM-1相互作用的抑制，增强免疫细胞向肿瘤的浸润，改善树突状细胞对T细胞的启动作用，并改善T细胞和自然杀伤细胞对肿瘤的杀伤作用，从而克服肿瘤的逃避免疫。CTL-002的适应症为治疗实体瘤，目前处于I期临床试验阶段。美国NGM公司研发的NGM-120为GFRAL蛋白的一种单克隆抗体拮抗剂，NGM-120与GFRAL结合，抑制GDF15的信号传导。所选适应症为转移性胰腺癌和实体瘤（联合治疗、无法手术/无法切除、转移性疾病、复发、二线治疗或更高治疗），目前处于I期临床试验阶段。

GDF15-GFRAL通路阻断抗体，可能在改善肿瘤患者恶液质及调节肿瘤微环境免疫细胞活性发挥重要作用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种靶向GDF15的全人源抗体及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种靶向GDF15的全人源抗体，所述靶向GDF15的全人源抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3；

所述HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列，所述HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列，所述HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的序列；

所述LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的序列，所述LCDR2的氨基酸序列为INN，所述LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的序列。

SEQ ID NO.1：GYTFTNYG。

SEQ ID NO.2：ISAYNGYT。

SEQ ID NO.3：ARDDAINGGDY。

SEQ ID NO.4：SSNIGINT。

SEQ ID NO.5：AAWDDSLNAYV。

所述靶向GDF15的全人源抗体以高亲和力特异性结合GDF15，且能够阻断GDF15与其受体GPRAL的结合，与异源抗体相比，具有更低的免疫原性，在抗体药物的开发上有很好的应用潜力。

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。

SEQ ID NO.6：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGINWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTDYAQKLQGRVSMTTDTSTSTVYMELRSLRSDDTAVYYCARDDAINGGDYWGQGTLVTVSS。

SEQ ID NO.7：

SYVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINTVNWYQQLPGTAPKLLIYINNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNAYVFGSGTKVTVL。

优选地，所述靶向GDF15的全人源抗体包括单链抗体。

优选地，所述单链抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。

SEQ ID NO.8：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGINWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTDYAQKLQGRVSMTTDTSTSTVYMELRSLRSDDTAVYYCARDDAINGGDYWGQGTLVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSELSYVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINTVNWYQQLPGTAPKLLIYINNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNAYVFGSGTKVTVL。

优选地，所述靶向GDF15的全人源抗体阻断GDF15与其受体GPRAL的结合。

第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的靶向GDF15的全人源抗体。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11中任一项所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述重链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列、所述轻链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列、所述单链抗体的核苷酸序列包括SEQ ID NO.11所示的序列。

SEQ ID NO.9：

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTACACCTTTACCAACTATGGTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTTACACAGACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCTCCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGGAGTCTGCGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACGACGCCATAAATGGGGGAGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA。

SEQ ID NO.10：

TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGGAGCAGCTCCAACATCGGAATTAATACTGTGAACTGGTACCAGCAACTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATTTATATTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGTCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGCGTATGTCTTCGGAAGTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA。

SEQ ID NO.11：

CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTACACCTTTACCAACTATGGTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTTACACAGACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCTCCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGGAGTCTGCGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACGACGCCATAAATGGGGGAGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAACTAGTGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCGAGCTCTCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGGAGCAGCTCCAACATCGGAATTAATACTGTGAACTGGTACCAGCAACTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATTTATATTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGTCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGCGTATGTCTTCGGAAGTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有第二方面所述的核酸分子。

第四方面，本发明提供一种根据第一方面所述的靶向GDF15的全人源抗体或者第三方面所述的表达载体在制备抗体药物、检测试剂中的应用。

本发明所述的靶向GDF15的全人源抗体、含有该抗体编码基因的表达载体、宿主细胞在抗体药物（包括单抗、双抗、ADC等）、细胞治疗药物（包括CAR-T、CAR-NK等）及检测试剂的开发上具有很好的应用潜力。

优选地，所述抗体药物包括单抗、双抗或抗体偶联药物。

优选地，所述抗体药物、细胞治疗药物用于治疗GDF15相关疾病。

优选地，所述GDF15相关疾病包括厌食症和/或实体瘤。

第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的靶向GDF15的全人源抗体或者第三方面所述的表达载体，以及药学上可接受的载体。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明中所述靶向GDF15的抗体特异性强，具有种属交叉性反应，与细胞系不结合，与无关蛋白不结合；

（2）本发明获得了一种全人源的抗体，以高亲和力特异性结合GDF15，并且能够阻断GDF15与其受体GPRAL的结合，与异源抗体相比具有更低的免疫原性；在抗体药物（包括单抗、双抗、ADC等）及细胞治疗药物（包括CAR-T、CAR-NK等）的开发上有很好的应用潜力；另外所述全人源的抗体也可以用于检测试剂的开发；

（3）本发明使用了蛋白淘选的方法，能高效的富集结合重组GDF15蛋白的抗体，大大降低了后期抗体筛选的难度，提高了效率。

附图说明

图1是本发明从噬菌体抗体库筛选靶向GDF15的特异抗体的大体流程。

图2是实施例2中所淘选的部分噬菌体单克隆与靶抗原和对照抗原的酶联免疫吸附测定（ELISA）结果。

图3是实施例3中所筛选的噬菌体单克隆与多种GDF15抗原蛋白和非相关抗原的酶联免疫吸附测定分析结果。

图4是实施例4中所筛选的噬菌体单克隆在phage水平与GDF15阴性细胞系结合的流式细胞分析结果。

图5是实施例5中所筛选的噬菌体单克隆在蛋白水平与阻断GDF15与其受体GFRAL结合的活性。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

抗体指由浆细胞（效应B细胞）分泌、被机体免疫系统用来中和外来物质（多肽、病毒、细菌等）的免疫球蛋白。该外来物质相应地称作抗原。抗体分子的基本结构是由2个相同重链和2个相同轻链组成的4聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区（V）和位于羧基端的恒定区（C）。一条重链的可变区（HCVR，也称为VH）和一条轻链的可变区（LCVR，也称为VL）相互作用形成了抗原结合部位（Fv）。在可变区中，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比可变区内的其它区域（骨架区，FR）更易变化，称为高变区（HVR），高变区实际上是抗体与抗原结合的关键部位。由于这些高变区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区（complementarity-determining region，CDR）。重链和轻链均具有三个互补决定区，分别称为HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3。

“单链抗体”（single chain fragment variable，scFv），是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠，来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段，因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。

“鼠源抗体”是由鼠类针对特异抗原产生的抗体，通常指小鼠B淋巴细胞产生的抗体。在大多情况下，所述鼠源抗体为杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。本发明的全人源抗体是从人源噬菌体抗体库筛选获得，其相对于鼠源抗体降低了免疫原性，更利于人体的治疗用途。

本发明所述的“全人源抗体或其单域抗体或抗原结合片段”通常是指能够与靶抗原结合的任何形式的抗原结合分子，例如，所述抗原结合分子可为蛋白质或多肽，包括例如抗体及其抗原结合片段、单链scFv抗体、单域抗体、基于scFv构建的各种融合物和缀合物，例如scFv-Fc抗体、免疫缀合物、抗体药物偶联物（ADC）、多/双特异性抗体。

提及氨基酸或核苷酸序列时，术语“序列一致性（Sequence identity）”（也称为“序列同一性”）指两氨基酸或核苷酸序列（例如查询序列和参照序列）之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对（alignment）并引入缺口（gap）（如果有的话）。如果在某个比对位置，两序列中的氨基酸残基或碱基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的氨基酸残基或碱基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST（可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到），通过使用缺省设置来获得最佳序列比对，并计算出两氨基酸或核苷酸序列之间的序列一致性。在一些实施方案中，本申请所述“至少90%序列一致性”包括但不限于：至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性的情形。

在一些实施方案中，本发明提供的全人源抗体还包括与SEQ ID NO.8所示序列有至少90%序列一致性（例如，至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性）的氨基酸序列。

本领域技术人员可以理解的是，在本文提供的具体序列基础上，可以通过对少数氨基酸进行替换、删除、添加并验证或筛选所得产物与相应抗原GDF15的结合能力或生物学活性，从而获得本发明提供的靶向GDF15抗体的相应变体，这些变体也应包括在本发明的范围内。例如，本发明的全人源抗体或其单链抗体或抗原结合片段在全长或CDR序列上，可以有至少1个且不超过10，或不超过5、4、3、2或1个氨基酸的改变。

本领域技术人员还可以理解的是，在本文提供的具体重链可变区序列基础上，可以通过以GDF15作为抗原筛选抗体轻链库（如人源噬菌体轻链库），从而获得与所述重链可变区匹配并维持GDF15结合能力的轻链可变区。以此方式可获得的抗GDF15抗体分子也包括在本发明的范围内。

在一些实施方案中，本发明的抗原结合分子可以进一步包含转译后修饰。转译后蛋白修饰的示例包括：磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖化、泛素化、糖基化、羰基化、类泛素化、生物素化或加入多肽侧链或疏水基团。因此，经修饰的可溶性多肽可以包含非氨基酸成分，例如类脂、多聚糖或单糖、以及磷酸盐。糖基化的一种优选形式是唾液酸化修饰，将一个或多个唾液酸基团与多肽结合。唾液酸基团改善蛋白质的溶解性和血清半衰期，同时也降低蛋白质可能的免疫遗传性。具体参见Raju et al. Biochemistry. 2001 31; 40(30):8868-76。

提及药物组合物，所使用的“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。

“治疗有效量”指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物的量。本发明抗体的“治疗有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如，典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01 mg至100mg活性成分。本发明的抗体的施用方式包括但不限于注射，例如通过静脉内、肌内、动脉内、皮下、腹膜内等。

“表位”是指受抗原结合蛋白（例如，抗体）约束的分子的部分。表位可以包含该分子的非相邻的部分（例如，多肽中，在该多肽的主要序列上不相邻、但在该多肽的三价和四价结构中彼此足够靠近以被抗原结合蛋白约束的氨基酸残基）。

研究概述

本发明使用全人源噬菌体进行GDF15抗体筛选，直接获得全人源的单克隆抗体。与传统杂交瘤技术相比，省却了困难的鼠源抗体人源化步骤，而且全人源抗体比人源化的鼠源抗体具有更低的免疫原性，在抗体药物，包括单抗、双抗、抗体偶联药物（ADC）等的开发上有很好的应用潜力。另外，本发明提供的高亲和力的特异性抗体，也可以用于检测试剂的开发。

本发明应用大容量噬菌体抗体库筛选全人源的GDF15特异抗体，并通过ELISA和FACS实验来评估这些抗体在phage水平（噬菌体水平）的结合特异性，并将获得的特异性结合克隆序列表达为IgG形式的蛋白，通过ELISA检测GDF15抗体对GDF15与其受体GFRAL结合的阻断活性。最终，本发明获得了若干特异性良好且具有较好阻断活性的全人源抗体克隆。

本发明使用不同的抗体库，经过重组GDF15蛋白淘选，总共挑选了96个单克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）初筛，其中23个克隆特异结合human GDF15-bio-hFc和cynoGDF15-bio-hFc蛋白，而不结合对照蛋白CD39-bio-hFc。测序后得到了4种不同的单克隆序列（即Clone12、Clone 13、Clone 68和Clone 73）。随后，将这4种抗体与阴性细胞系(Jurkat，REH)进行流式细胞分析（FACS）鉴定，与GDF15靶抗原（human GDF15-bio-hFc、cynoGDF15-bio-hFc、mouse GDF15-hFc），非相关蛋白（CD39-bio-hFc，human latent GDF-2，human latent TGF-beta1，SA）进行酶联免疫吸附（ELISA）鉴定，4个克隆在细胞系和多种蛋白抗原上都表现出良好的结合力和特异性。

随后，制备了这些克隆的human IgG4抗体，在蛋白水平通过ELISA检测了GDF15抗体对GDF15与其受体GFRAL结合的阻断活性，并使用Fortebio分析了阻断活性最优的Clone68的亲和力，这个克隆的获得为后续开发全人源的GDF15抗体药奠定了基础。经测序，Clone68的重链可变区包括SEQ ID NO.1所示的HCDR1，SEQ ID NO.2所示的HCDR2，SEQ ID NO.3所示的HCDR3，所述轻链可变区包括SEQ ID NO.4所示的LCDR1，LCDR2，SEQ ID NO.5所示的LCDR3，所述LCDR2的氨基酸序列为INN。Clone 68的重链可变区的氨基酸序列包括SEQ IDNO.6所示的序列，轻链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列；利用Clone 68构建的单链抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。

本发明从噬菌体抗体库筛选靶向GDF15的特异抗体的大体流程如图1所示。

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本发明的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本发明的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本发明的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本发明所涉及发明的精神和范围。相应地，本发明的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

实施例1

通过亲和淘选从噬菌体抗体库富集靶向GDF15蛋白的特异抗体克隆

采用合适的负淘选和正淘选策略从噬菌体抗体库中富集所需的特异性抗体克隆。

1、噬菌体抗体库的构建

构建的噬菌体抗体库包括天然库和半合成库。半合成噬菌体抗体库，与天然库一起使用，解决天然库可能缺乏GDF15高亲和力抗体克隆的问题。

GDF15是人体内正常表达的抗原，对于这类抗原，机体会通过克隆筛选的机制，使那些能表达GDF15抗体的细胞在发育过程中凋亡，导致正常人体内会缺乏这类抗原的高亲和力抗体。克隆筛选是机体正常的自我识别和自我保护机制。但是，最常用的噬菌体抗体库形式是天然库，它是通过直接克隆健康人淋巴细胞中抗体基因的方法构建的，其中很可能缺乏针对GDF15这样人体内正常存在抗原的抗体克隆。出于这方面的考虑，在构建抗体库的时候不仅构建了天然库，同时还构建了半合成抗体库。半合成抗体库由来自天然抗体序列的轻链以及重链FR1-FR3和人工设计的重链CDR3组成，可以大大增加抗体多样性，提高筛选到针对体内正常存在抗原的高亲和力抗体的机会。

2、GDF15蛋白淘选

以靶抗原human GDF15-bio-hFc（KACTUS，GDF-HM215B）作为正淘选蛋白，CD39-bio-hFc（KACTUS，CD9-HM239B）作为负淘选蛋白进行多轮淘选，获得富集目的抗体克隆的噬菌体池（pool）。

实验步骤简述如下：

（1）将SA磁珠先用封闭液封闭2 h，然后再将靶抗原（human GDF15-bio-hFc）与封闭好的SA磁珠结合；

（2）加入噬菌体文库（含5×10¹²个噬菌体颗粒）和一份干净的SA磁珠一起孵育，以便扣除非特异结合SA磁珠的噬菌体抗体克隆；

（3）将扣除非特异性结合SA的噬菌体文库和结合了负淘选抗原CD39-bio-hFc的SA磁珠一起孵育，以便扣除非特异结合hFc的噬菌体抗体克隆；

（4）孵育后将上清转移到结合了靶抗原的SA磁珠中，继续孵育，使噬菌体和靶抗原结合；

（5）用洗涤液洗涤磁珠，将未结合的噬菌体洗去；

（6）用洗脱液将阳性噬菌体从靶抗原上洗脱下来，加入中和液中和；

（7）以洗脱后的噬菌体重新感染宿主菌XL1-blue（TransGen，CD401），扩增回收的噬菌体；留少量样品梯度稀释，感染宿主菌，涂Amp（氨苄）抗性平板，计算回收噬菌体数量；

（8）重复步骤（1）至（7），通常需要进行3轮至4轮淘选，直到观察到噬菌体的回收率（洗脱噬菌体数/投入噬菌体数）有明显上升。

本实施例所使用的主要材料和试剂如下所示：

全人源噬菌体抗体库，包含天然库和半合成库；

辅助噬菌体KO7，Thermo/Invitrogen，18311019；

Biotinylated Human GDF15 Protein (Primary Amine Labeling) ，KACTUS，GDF-HM215B（靶抗原human GDF15-bio-hFc）；

Biotinylated CD39 Protein，hFc Tag，KACTUS，CD9-HM239B（负淘选抗原CD39-bio-hFc）；

BeaverBeads™ Streptavidin，海狸生物，22307-10；

封闭液：PBS+3% BSA；

漂洗液：PBS+0.1% Tween20；

洗脱液：0.2 M Glycine，pH2.2；

中和液：1 M Tris，pH9.1。

富集好的噬菌体池可用于进行随后的单克隆挑选以及ELISA/FACS筛选，使用不同的抗体库，通过2轮蛋白淘选，蛋白淘选实验结果如表1所示，每个淘选都观察到了回收率的显著上升，证明抗体克隆得到了有效富集，可以看到经过2轮淘选，2个抗体库都得到了富集（第2轮回收率比上一轮显著提高）。

表1

实施例2

采用酶联免疫吸附测定（ELISA）从经富集的噬菌体池筛选特异性克隆

通过亲和淘选步骤富集的噬菌体池中包含各种性质的噬菌体抗体：特异克隆、非特异克隆、以及阴性克隆。为了获得特异克隆，需要从中分离单克隆，包装成单克隆的噬菌体，并通过酶联免疫检测（ELISA）对大量单克隆进行初筛，从中挑选到特异结合humanGDF15-bio-hFc蛋白的单克隆。特异的单克隆再进一步通过DNA测序确定其中包含的唯一的抗体序列。

在ELISA初筛中，通过链霉亲和素Streptavidin与生物素Biotin的结合，使得生物素化的靶蛋白（human GDF15-bio-hFc和cyno GDF15-bio-hFc）在反应液中更接近于天然状态的抗原构象。只结合human GDF15-bio-hFc和cyno GDF15-bio-hFc而不结合负抗原CD39-bio-hFc的被认定为特异克隆。通过ELISA初筛，可以获得特异性结合重组表达的humanGDF15-bio-hFc和cyno GDF15-bio-hFc蛋白的候选抗体，供随后进一步筛选。

ELISA初筛实验步骤：

（1）用深孔96孔板培养和包装单克隆噬菌体；

（2）将Strepavidin用PBS稀释到2 μg/mL，以100 μL/孔加入到高结合酶标板中，室温结合2 h；

（3）弃掉包被液，每孔加入250 μL封闭液，4℃封闭过夜；

（4）250 μL漂洗液洗板2次；

（5）将带生物素标签的靶蛋白用PBS稀释至2 μg/mL，以100 μg/孔加入预包被Strepavidin的酶标板中，室温结合1 h；

（6）250 μL漂洗液洗板2次；

（7）加入100 μL步骤（1）培养好的噬菌体上清到包被好靶抗原的孔，室温结合2 h；

（8）250 μL漂洗液洗板4次；

（9）加入1:2000稀释的mouse anti M13一抗（Abcam，ab9225），100 μL/孔，室温孵育45 min；

（10）250 μL漂洗液洗板4次；

（11）加入1:2000稀释的HRP goatanti-mouse IgG（Biolegend，405306），100 μL/孔，室温孵育45 min；

（12）250 μL漂洗液洗板6次；

（13）加入100 μL TMB显色底物，显色10 min；

（14）加入100 μL 2 M H₂SO₄终止反应，在酶标仪上读取结果。

本实施例所使用的主要材料和试剂如下所示：

辅助噬菌体KO7，Thermo/Invitrogen，18311019；

Streptavidin（SA蛋白），Pierce，21125；

Biotinylated Human GDF15 Protein (Primary Amine Labeling) ，KACTUS，GDF-HM215B（靶抗原human GDF15-bio-hFc）；

Biotinylated Cynomolgus GDF15 Protein (Primary Amine Labeling)，KACTUS，GDF-CM215B（靶抗原cyno GDF15-bio-hFc）；

Biotinylated CD39 Protein，hFc Tag，KACTUS，CD9-HM239B（负淘选抗原CD39-bio-hFc）；

High binding ELSIA plate，Costar，#3590；

Corning 96 Well Clear Round Bottom TC-Treated Microplate，Costar，#3799；

封闭液：PBS+3% BSA；

漂洗液：PBS+ 0.1% Tween20；

可溶型单组分TMB底物溶液，Tiangen，PA-107-02；

Anti-M13 Bacteriophage Coat Protein g8p antibody，abcam，ab9225；

HRP Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody，Biolegend，405306；

HRP Donkey anti-human IgG(minimal x-reactivity) Antibody，Biolegend，410902；

Human/Primate GDF-15 antibody，R&D，MAB957-100；

Benchmark antibody 31C4，氨基酸序列来自PF-06946860。

从实施例1获得的富集后的噬菌体抗体池随机挑选单克隆，包装成噬菌体后，通过噬菌体ELISA检测单克隆噬菌体与human GDF15-bio-hFc、cyno GDF15-bio-hFc蛋白、CD39-bio-hFc蛋白的结合，找到human GDF15-bio-hFc和cyno GDF15-bio-hFc蛋白特异结合的噬菌体抗体克隆。所淘选的部分噬菌体单克隆与靶抗原和对照抗原的酶联免疫吸附测定（ELISA）结果如图2所示，图中，A1-A8是随机挑选的7个克隆；Negative control是阴性对照；anti-M13 phage mouse Ab/anti-mouse HRP Ab为不加phage，只加第一抗体（Anti-M13phage mouse Ab）和第二抗体（anti-mouse HRP Ab）的阴性对照；anti-mouse HRP Ab为只加第二抗体（anti-mouse HRP Ab）的阴性对照，Human/Primate GDF-15 Ab/anti-mouseHRP Ab为加入GDF15检测抗体的阳性对照；从图中可知，A1-A4号克隆与靶抗原humanGDF15-bio-hFc和cyno GDF15-bio-hFc结合良好，且不与对照抗原CD39-bio-hFc结合，特异性良好。A5、A6与靶抗原和对照抗原都结合，为非特异性结合克隆；A7和A8克隆与靶抗原和对照蛋白都不结合，为阴性克隆。

通过ELISA检测初筛总共获得23个特异性克隆，该23个克隆经测序后得到4个序列不同的特异性克隆，即Clone 12、Clone 13、Clone 68和Clone73。

实施例3

采用多种抗原通过ELISA鉴定单克隆特异性

用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性，只结合靶抗原，而不结合任何无关的抗原；为了进一步分析这些单克隆的特异性和普适性，寻找最佳的候选克隆，本实施例通过酶联免疫检测（ELISA）进一步评估初筛克隆的特异性。在这个实验中，采用不同物种的GDF15抗原和多种GDF15不相关抗原与这些单克隆噬菌体抗体进行反应，分析这些克隆是否可以结合不同物种的GDF15抗原，以及是否与其它GDF15不相关抗原有任何非特异的结合。通过这个实验，获得了若干具有优良特异性的克隆。

实验方法参照实施例2中ELISA初筛实验步骤。

本实施例所使用的主要样品和试剂如下所示：

Streptavidin（SA蛋白），Pierce，21125；

Biotinylated Human GDF15 Protein (Primary Amine Labeling)，KACTUS，GDF-HM215B（简称human GDF15-bio-hFc）；

Biotinylated Cynomolgus GDF15 Protein (Primary Amine Labeling)，KACTUS，GDF-CM215B（简称cyno GDF15-bio-hFc）；

Biotinylated CD39 Protein，hFc Tag，KACTUS，CD9-HM239B（简称CD39-bio-hFc）；

Moues GDF15 Protein, hFc Tag，KACTUS，GDF-MM215 （简称mouse GDF15-hFc）；

Human Latent GDF-2/BMP-9 Protein，His tag，Acro，GD2-H52H3（简称HumanLatent GDF-2）；

Human Latent GDF-2 / BMP-9 Protein，His Tag，Acro，GD2-H52H3（简称HumanLatent TGF-beta1）；

其余试剂与ELISA初筛相同。

用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性。为了进一步分析这些单克隆抗体的特异性，本实施例将实施例2获得的多个克隆在多种抗原应用酶联免疫吸附（ELISA）进行了鉴定。

结果显示在图3中，图3为所筛选的噬菌体单克隆与多种GDF15抗原蛋白和非相关抗原的酶联免疫吸附测定分析结果。其中，Negative Control为阴性对照噬菌体抗体克隆；anti-M13 phage mouse Ab/anti-mouse HRP Ab为不加phage，只加第一抗体（Anti-M13phage mouse Ab）和第二抗体（anti-mouse HRP Ab）的阴性对照；anti-mouse HRP Ab为只加第二抗体（anti-mouse HRP Ab）的阴性对照，31C4 phage（氨基酸序列来自于PF-06946860）为靶抗原的阳性抗体对照phage，anti-human IgG HRP Ab和anti-his HRP为检测抗原标签的阳性抗体对照。图3中每个测试抗体和对照组对应的柱形图从左至右依次表示与试剂human GDF15-bio-hFc、cyno GDF15-bio-hFc、mouse GDF15-hFc、CD39-bio-hFc、Human Latent GDF-2、Human Latent TGF-beta1、SA的测试结果。Clone 12、Clone 13、Clone 68、Clone73与不同物种的CD7抗原都结合，与非相关抗原CD39-bio-hFc、HumanLatent GDF-2、Human Latent TGF-beta1、SA都不结合，说明这4个克隆能够结合GDF15抗原且特异性良好。

实施例4

采用多个细胞系通过FACS鉴定单克隆特异性

用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性，只结合靶抗原，而不结合任何无关的抗原；另一方面，人体内的细胞上也会表达很多种抗原。为了进一步分析这些单克隆的特异性，寻找最佳的候选克隆，本实施例通过流式细胞术进一步评估实施例2获得的多个克隆的特异性。在这个实验中，采用两种人体内的血液肿瘤细胞系与这些单克隆噬菌体抗体进行反应，分析这些克隆是否与其它不表达GDF15的细胞系有任何非特异的结合。

实验方法：

（1）用深孔96孔板培养和包装单克隆噬菌体；

（2）Jurkat和REH细胞用PBS洗2次，用PBS重悬，细胞浓度为1×10⁷个/mL，以50 μL分装到96孔深孔板中；

（3）每孔加入50 μL包装好的单克隆噬菌体，混匀后，4℃结合2 h；

（4）200 μL PBS洗涤2次；

（5）加入1:2000稀释的mouse anti M13一抗（Abcam，ab9225），100 μL/孔，吹打混匀后，室温孵育45 min；

（6）200 μL PBS洗涤2次；

（7）加入1:300稀释的Fluorescein (FITC) AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，100 μL/孔，吹打混匀后，室温孵育45 min；

（8）200 μL PBS洗涤2次；最后用200 μL PBS重悬细胞；

（9）在流式细胞仪上检测样品FITC通道的荧光强度，分析结果。

本实施例所使用的主要样品和试剂如下所示：

Jurkat细胞系，GDF15阳性细胞系（iaso in-house）；

REH细胞系，GDF15阴性细胞系（iaso in-house）；

Fluorescein (FITC) AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，JacksonImmunoReseach, 115-095-003。

用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性。为了进一步分析这些单克隆抗体的特异性，将实施例2获得的多个克隆在更多的细胞系上应用流式细胞术进行了鉴定。结果如图4所示，图4为所筛选的噬菌体单克隆与多种血液肿瘤细胞系结合的流式细胞分析结果（峰形图），Negative control为阴性对照噬菌体抗体克隆，Positive control为阳性对照抗体Human/Primate GDF-15 antibody染色的结果，Clone12、Clone 13、Clone 68、Clone73与细胞系REH和Jurkat都不结合，特异性好。

实施例5

在蛋白水平通过ELISA分析筛选到的抗体阻断GDF15与其受体GFRAL结合的活性

GDF15通过与细胞表面的受体GFRAL结合，并通过RET胞内域结构活化激活下游通路，减少人或动物摄食，从而引起体重减轻。GDF15与受体GFRAL结合是该通路活化的起始信号，阻断该起始信号，就可以阻断该通路的活化。为了研究抗体阻断GDF15与受体GFRAL结合的活性，本实施例采用竞争ELISA的方法，评估前述实施例获得的特异性经验证的抗体克隆是否具有阻断活性以及阻断活性的强弱。

实验方法：

（1）包被GDF15蛋白：1×PBS稀释GDF15 hFc至1 μg/mL，每孔加入100 μL，4℃孵育过夜；

（2）弃去包被液，每孔300 μL洗涤液，洗涤2次；

（3）每孔加入300 μL封闭液（1%BSA-PBS），4°C封闭2 h；

（4）弃去封闭液，每孔300 μL洗涤液，洗涤2次；

（5）抗体梯度稀释：600 nM起始，5倍梯度稀释，共8个点；

（6）稀释GFRAL His tag至20 nM，加入孔中，每孔50 μL，在将梯度稀释的抗体加入孔中，每孔50 μL，37°C孵育2 h；

（7）弃去孔中液体，每孔300 μL洗涤液，洗涤4次；

（8）1:1000稀释anti-His HRP二抗，加入孔中，每孔100 μL，37°C孵育1 h；

（9）弃去孔中液体，每孔300 μL洗涤液，洗涤4次；

（10）加入TMB显色液，每孔100 μL，室温避光孵育10 min；

（11）加入终止液（2M H₂SO₄），每孔50 μL，终止反应；

（12）读取450 nm吸光度；

（13）以抗体浓度为横坐标，450 nm吸光度为纵坐标，分析数据。

本实施例所使用的主要样品和试剂如下所示：

GDF15 hFc tag，KACTUS，GDF-HM215；

GFRAL His tag，Acrobiosystems，GFA-H52H3；

Human IgG1 Kappa Isotype Control (mAb, carrier free, MALS verified)，Acrobiosystems ，DNP-M2（简称Isotype Control）。

结果如图5所示。Clone 12、68、73有阻断活性，Clone 13无阻断活性；Clone 68、73和Benchmark 31C4阻断GDF15与GFRAL结合的EC50分别为1.4 nM、7.2 nM、1.7 nM，其中Clone 68的阻断能力与31C4相当。

实施例6

抗GDF15 mAbs亲和力的测定

GDF15 mAb与抗原间的亲和力大小可能对抗体药在患者体内发挥杀伤作用及存续时间有着重要影响，为了确定这一重要性质，本实施例采用了Sartorius公司的分子相互作用技术（BLI）对Clone 68进行了测定。该系统所运用的生物膜干涉技术，是一种免标记技术，实时提供高通量的生物分子相互作用信息。该仪器发射白光到传感器表面并收集反射光，不同频率的反射光谱受到生物传感器的光膜层厚度的影响，一些频率的反射光形成了相长干涉（蓝色），而另一些受到了相消干涉（红色）。这些干涉被光谱仪所检测到，并形成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相位位移强度（nm）显示。因此，结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移直接反应出传感器表面生物膜的厚度，从中可以获取生物分子相互作用的高质量的数据，从而进行生物分子间相互作用动力学参数测定（Kon，Kdis和KD），为研发过程提供重要的信息。

实验步骤：

（1）用上样缓冲液（1×PBS，pH7.4，0.01% BSA和0.02% Tween 20）将抗GDF15 IgG（将GDF15的ScFv与human IgG4 Fc融合构成）稀释至10 μg/mL，并在生物传感器上上样；

（2）在60 s平衡阶段后，在多种抗原浓度下监测GDF15抗原的结合动力学。在每个浓度下分别进行至160 s结合和300 s解离；

（3）用10 mM Glycine-HCl，pH1.5洗涤3次使芯片再生；

（4）通过使用1:1结合位点模型（Biacore X-100评估软件）分析结合常数。

亲和力系指单个分子与其配体结合的强度，通常通过平衡解离常数（KD）进行测定和报告，平衡解离常数可用于评估两分子间相互作用的强度并对此进行排序。抗体与其抗原的结合是一个可逆的过程，结合反应的速率与反应物的浓度成正比。KD值越小，抗体对其靶标的亲和力越大。抗GDF15 IgG亲和力测定结果如表2所示：Clone 68可与GDF15抗原结合，且亲和力与对照抗体31C4的亲和力相当。

表2

综上，本发明使用全人源噬菌体库进行抗体筛选，直接获得全人源的单克隆抗体。与传统杂交瘤技术相比，省却了困难的鼠源抗体人源化步骤，而且全人源抗体比人源化的鼠源抗体具有更低的免疫原性，亲和力高，在抗体药物，检测试剂等应用上有更好的潜力。本发明使用了蛋白淘选的方法，能高效的富集结合重组GDF15蛋白的抗体，通过ELISA筛选到了特异性结合不同物种的GDF15抗原的抗体，FACS分析了这些抗体不结合肿瘤细胞系表达的多种复杂抗原，具有较好的特异性，且具有较好的亲和力和阻断活性。其中，Clone 68具有良好的特异性，阻断GDF15与GFRAL结合的能力高于其余克隆，其阻断能力与对照抗体31C4相当，Clone 68的亲和力也与对照抗体31C4相当。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种靶向GDF15的全人源抗体及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种靶向GDF15的全人源抗体，其特征在于，所述靶向GDF15的全人源抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3；

所述HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列，所述HCDR2的氨基酸序列为SEQID NO.2所示的序列，所述HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的序列；

所述LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的序列，所述LCDR2的氨基酸序列为INN，所述LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的序列。

2.根据权利要求1所述的靶向GDF15的全人源抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。

3.根据权利要求1所述的靶向GDF15的全人源抗体，其特征在于，所述靶向GDF15的全人源抗体包括单链抗体；所述单链抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的靶向GDF15的全人源抗体。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括SEQ ID NO.9、SEQID NO.10或SEQ ID NO.11中任一项所示的核苷酸序列。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述的核酸分子。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的靶向GDF15的全人源抗体或者权利要求6所述的表达载体在制备抗体药物、细胞治疗药物、检测试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗体药物包括单抗、双抗或抗体偶联药物。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗体药物或细胞治疗药物用于治疗厌食症和/或实体瘤。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的靶向GDF15的全人源抗体或者权利要求6所述的表达载体，以及药学上可接受的载体。