CN112912395A

CN112912395A - 抗gdf15抗体、组合物和使用方法

Info

Publication number: CN112912395A
Application number: CN201980069329.4A
Authority: CN
Inventors: K·C·博蒙特; D·M·布林; J·R·沙博; T·何; K·晓尔斯; J·R·阿普加; M·A·兰伯特
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2018-08-20
Filing date: 2019-08-15
Publication date: 2021-06-04
Also published as: CO2021001893A2; US20220380448A1; JP2021526847A; AU2019323790A1; BR112021003173A2; MX2021001841A; WO2020039321A8; CA3109905A1; WO2020039321A3; PE20211412A1; US20200055930A1; PH12021550337A1; EP3841121A2; TW202021619A; KR20210049840A; IL280963A; SG11202101502YA; JP7155403B2; TWI803682B; JP2022188191A

Abstract

本发明提供了特异性结合至GDF15的抗体及其抗原结合片段，以及所述抗体的方法及用途。

Description

抗GDF15抗体、组合物和使用方法

技术领域

本发明涉及特异性结合生长分化因子15(GDF15)的抗体及其抗原结合片段，以及其组合物、方法和用途，包括本发明的抗GDF15抗体与PD-1轴结合拮抗剂和/或CD40抑制剂的组合治疗癌症的用途。

背景技术

GDF15，也被称为巨噬细胞抑制细胞因子1(MIC-1)、前列腺衍生因子(PDF)、胎盘骨形态发生蛋白(PLAB)、NSAID活化基因1(NAG-1)以及胎盘转化生长因子β(PTGFB)，是形成25kDa二硫化物连接的同型二聚体的12-kDa分泌蛋白，其为转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员。通常，GDF15在组织中弱表达或根本不表达，并且血浆浓度低。在炎症及恶性肿瘤期间上调GDF15表达，从而限制炎症及肿瘤生长。这种提高的表达导致在癌症(例如前列腺、胰腺、结肠直肠以及胃)、心力衰竭、慢性肾脏疾病(CKD)、肌肉减少症以及慢性阻塞性肺病(COPD)中GDF15的循环浓度显著提高(>1-100ng/mL)。

已在临床前模型中证实了GDF15相关的体重损失。在生理学以及病理生理学条件下，外源性GDF15施用降低了食物摄取量和体重。提高的血浆GDF15与具有恶病质的癌症患者的体重损失相关(WO2005/099746；WO2009/021293、WO2014/100689、WO2016/049470)。尽管在癌症患者中最为明显，还报导了在GDF15与和心力衰竭相关的恶病质中的体重损失之间的关联(WO/2015/196142)。与人数据一致，提高的血浆GDF15与小鼠肿瘤模型中的恶病质相关。进一步，使用多变量分析的多项研究已将GDF15确定为与许多癌症类型(例如NSCLC、胰腺和肉瘤等)以及心力衰竭、CKD及COPD中的较差存活相关的独立预后生物标志物。

最近，在2017年10月，报导了GDF15活性(例如其新陈代谢效应)是由GDF15与其同源(cognate)受体GDNF家族受体α样(GFRAL)(GFR-α家族的孤儿成员)的结合介导的。参见例如Hsu等，2017，Nature 550:255-259；Yang等，2017，Nature Med.23(10):1158；以及Emmerson等，2017，Nature Med.23(10):1215。这些研究表明结合GFRAL的GDF15活化GFRAL介导的信号转导途径，由此受体酪氨酸激酶RET被活化并充当GFRAL的共同受体，并且RET继而介导ERK(pERK)、核糖体蛋白S6(pS6)、AKT、MAPK以及磷脂酶Cγ1(PLC-γ1)等的下游磷酸化。进一步，这些研究表明由GDF15对GFRAL的活化发生于脑干的区域(最后区和孤束核)中，这些区域包含感化性神经元以及控制食欲及呕吐的神经肽的受体。最后区感测血液中的化学信使并且控制自主生理系统，包括控制新陈代谢和食欲的系统。此外，脑干的这些区域位于血脑屏障(BBB)外，血脑屏障使这些区域除其它方面之外还易接近大分子(包括抗体)，这些大分子可结合GFRAL或GDF15并防止GFRAL-GDF15相互作用以调节与食欲、身体质量、重量、脂肪量以及食物摄取有关的GDF15的新陈代谢效应。因此，脑干中存在的GDF15-GFRAL途径是用于调节由GDF15活性介导的疾病、病症以及失调的潜在靶标。

仍然非常需要用于由恶病质引起或与恶病质相关的体重损失的治疗选择，该恶病质是由提高的GDF15水平介导或与提高的GDF15水平相关。本发明提供了满足该需要的新颖的潜在治疗性抗体。

PD-L1(程序性死亡配体1；也被称为CD274及B7同源物1[B7-H1])在许多癌症中过度表达，并且常与预后不良相关(Okazaki T等，Intern.Immun.200719(7):813)(ThompsonRH等，Cancer Res 2006,66(7):3381)。令人感兴趣的是，与正常组织及周围血液中的T淋巴细胞相比，大多数肿瘤浸润性T淋巴细胞主要表达PD-1。PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)(肿瘤反应性T细胞上的PD-L1的同源受体)可对受损的抗肿瘤免疫应答有贡献(Ahmadzadeh等，Blood 2009 1 14(8):1537)。这可能是由于由表达PD-L1的肿瘤细胞介导的PD-L1信号转导的利用，该肿瘤细胞与表达PD-1的T细胞相互作用以导致T细胞活化的衰减以及免疫监视的规避(Sharpe等，Nat Rev 2002)(Keir ME等，2008Annu.Rev.Immunol.26:677)。因此，PD-L1/PD-1相互作用以及信号转导途径(也被称为“PD-1轴”)的抑制可以增强CD8+T细胞介导的对肿瘤的杀伤作用。

已提出了通过其直接配体(例如PD-L1、PD-L2[程序性细胞死亡1配体2以及B7-DC])对PD-1轴信号转导的抑制增强用于治疗癌症的T细胞免疫力(例如肿瘤免疫力)。此外，通过抑制PD-L1与另一结合配偶体(即B7-1(也被称为CD80))的结合能够观察到对T细胞免疫力的类似增强。

目前存在经FDA批准的超过10种癌症适应症以及本领域中已知的其它适应症中的至少5种PD-1轴结合拮抗剂(A Ribas等，Science,359,1350-1355,2018)。在这些中，纳武单抗(Opdivo)、派姆单抗(Keytruda)、斯巴达珠单抗、匹地利珠单抗、替雷利珠单抗、AMP-224、AMP-514、西米普利单抗、PF-06801591(萨善利单抗、RN888)分别为抗PD-1抗体，而阿维鲁单抗(BAVENCIO)、阿替唑利单抗(TECENTRIQ)、得瓦鲁单抗(IMFINZI)、BMS-936559(MDX-1105)、MEDI4736、MPDL3280A(YW243.55.s70)分别为抗PD-L1抗体。

已研究了PD-1轴结合拮抗剂与一种或多种抗癌物质的组合疗法，其中第一临床试验开始于2009年。针对此类组合的新临床试验明显增加；从此，在2017年登记了467项新试验(C.Schmidt，Nature，第552卷，2017年12月21/28日)。尽管分别在2015年以及2017年由FDA批准了用于治疗黑素瘤的纳武单抗(抗PD-1)与易普利姆玛(抗CTLA-4)的组合疗法以及用于治疗非小细胞性肺癌的派姆单抗(抗PD-1)与化学疗法的组合疗法，持续需要寻找用于治疗、稳定、预防和/或延缓多种癌症的发展的组合PD-1轴结合拮抗剂与一种或多种其它抗癌物质的最佳治疗处理。

GDF15显示出由许多促炎性因子以及脂多糖(LPS)诱导，并且涉及反馈机制，其通过经由抑制NF-kB信号转导途径抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)产生而打断巨噬细胞活化(Bootcov等，1997，PNAS 94(21):11514-11519；Ratnam等，2017,J.Clin.Invest.127(10):3796-3809)。降低的TNFα表达与巨噬细胞群朝原致瘤M2表型的漂变相关(Kratochvill，2015，Cell Reports 12(11):1902-1914)。靶向肿瘤相关的巨噬细胞中的M2表型是用于增强对专注于宿主免疫应答的活化的癌症疗法的应答的潜在策略。

仍然非常需要用于癌症、特别是用于实体肿瘤的治疗选择。本发明提供了满足这些需要的的新颖的潜在治疗性GDF15抗体，与一种或多种其它抗癌物质一起或不与一种或多种其它抗癌物质一起。也仍然需要寻找用于治疗、稳定、预防和/或延缓多种癌症的发展的在具有或不具有一种或多种其它抗癌物质的条件下组合PD-1轴结合拮抗剂与另一治疗剂(如GDF15抑制剂)的最佳治疗。本发明提供了满足该需要的本发明的GDF15抗体与PD-1轴结合拮抗剂的新颖的潜在有用治疗组合。

发明简述

本发明提供了特异性结合GDF15的抗体及其抗原结合片段，以及用途及相关方法。本领域技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验查明本文所述的本发明的具体实施方式的许多等同方案。此类等同方案旨在涵盖在下列实施方式(E)内。

E1、特异性结合GDF15的分离的抗体或其抗原结合片段。

E2、E1的抗体或其抗原结合片段，包含SEQ ID NO:21、34、44、53、60、68、73、80、86、93、99、106、112、120、127、136、142、148、155、161和166之一的HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3序列。

E3、E1-E2中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含SEQ ID NO:11、30、39、49、56、64、71、77、83、90、96、103、109、115、123、131、139、144、151、158以及163之一的LCDR-1、LCDR-2和LCDR-3序列。

E4、E1-E3中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含(a)-(f)中的一项或多项

a)选自SEQ ID NO:7、27、36、46、55、62、82、88、95、101、129、138、150和157的LCDR-1，

b)选自SEQ ID NO:8、28、37、47、70、108、114、122和130的LCDR-2，

c)选自SEQ ID NO:9、29、38、48、63、76、89和102的LCDR-3，

d)选自SEQ ID NO:17、32、41、58、66、117、125、133和153的HCDR-1，

e)选自SEQ ID NO:18、33、42、51、59、67、85、92、98、105、118、126、134、141、146和165的HCDR-2，

f)选自SEQ ID NO:1、19、43、52、79、111、119、135、147、154和160的HCDR-3。

E5、根据E1-E4的抗体或其抗原结合片段，包含：i)包含氨基酸序列GYTFX₁X₂YNID的HCDR-1，其中X₁为S或T并且X₂为S或D；ii)包含氨基酸序列X₃INPX₄X₅GX₆AX₇X₈X₉QKFQG的HCDR-2，其中X₃为G或Q，X₄为I或N，X₅为F或N，X₆为T或L，X₇为F或N，X₈为Y或F并且X₉为N或A；以及iii)包含氨基酸序列EX₁₀ITTX₁₁GAMDX₁₂的HCDR-3，其中X₁₀为A或Q，X₁₁为V或I并且X₁₂为H或Y。

E6、根据E1-E5的抗体或其抗原结合片段，包含：i)包含氨基酸序列RX₁SQX₂X₃X₄X₅YLA的LCDR-1，其中X₁为T或A，X₂为S或N，X₃为V或L，X₄为H或S并且X₅为N或S；ii)包含氨基酸序列DAX₆X₇RAX₈的LCDR-2，其中X₆为S或K，X₇为T或N并且X₈为D或T；以及iii)包含氨基酸序列QQFX₉X₁₀X₁₁PX₁₂T的LCDR-3，其中X₉为W或S，X₁₀为S或N，X₁₁为W或D并且X₁₂为W或Y。

E7、E1-E6中任一项中的抗体或其抗原结合片段，包含以下一项或多项：

a)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的LCDR-1，

b)包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的LCDR-2，

c)包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的LCDR-3，

d)包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的HCDR-1，

e)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的HCDR-2，

f)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的HCDR-3。

E8、E1-E7中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含选自SEQ ID NO:34、106、148、155和166的至少一个序列的HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3序列。

E9、E1-E8中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含选自SEQ ID NO:30、103、144、151和163的至少一个序列的LCDR-1、LCDR-2和LCDR-3序列。

E10、E1-E9中任一项中的抗体或其抗原结合片段，包含(a)-(f)中的一项或多项

a)选自SEQ ID NO:27、88、95、101和150的LCDR-1。

b)选自SEQ ID NO:8、28和108的LCDR-2。

c)选自SEQ ID NO:9、29、38、48和102的LCDR-3。

d)选自SEQ ID NO:32、41和153的HCDR-1。

e)选自SEQ ID NO:33、105、146和165的HCDR-2。

f)选自SEQ ID NO:19、52、147和154的HCDR-3。

E11、E1-E10中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含SEQ ID NO:166的HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3序列。

E12、E1-E11中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含SEQ ID NO:163的LCDR-1、LCDR-2和LCDR-3序列。

E13、E1-E12中任一项中的抗体或其抗原结合片段，包含以下一项或多项：

a)包含SEQ ID NO:95的序列的LCDR-1，

b)包含SEQ ID NO:28的序列的LCDR-2，

c)包含SEQ ID NO:9的序列的LCDR-3，

d)包含SEQ ID NO:32的序列的HCDR-1，

e)包含SEQ ID NO:165的序列的HCDR-2，以及

f)包含SEQ ID NO:52的序列的HCDR-3。

E14、E1-E13中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含：包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的LCDR-1、包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR-2、包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR-3、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HCDR-1、包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的HCDR-2以及包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR-3。

E15、E1-E14中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含以下取代中的一项或多项：

a)LCDR-1中的1、2、3、4、5或6个取代，取代成人种系VL序列的对应残基，

b)LCDR-2中的1、2、3、4或5个取代，取代成人种系VL序列的对应残基，

c)LCDR-3中的1、2、3、4、5或6个取代，取代成人种系VL序列的对应残基，

d)HCDR-1中的1个取代，取代成人种系VL序列的对应残基，

e)HCDR-2中的1、2、3、4、5、6、7或8个取代，取代成人种系VL序列的对应残基，

其中人种系VL序列选自IGKV1-12*01、IGKV1-13*02、IGKV1-33*01、IGKV1-39*01、IGKV1-5*01、IGKV3-11*01、IGKV3-15*01、IGKV3-20*01、IGKV3D-20*02和IGKV4-1*01，并且人种系VH选自IGHV1-2*02、IGHV1-3*01、IGHV1-46*01、IGHV1-69*01、IGHV1-69*02、IGHV1-8*01、IGHV3-13*01、IGHV3-23*01、IGHV3-23*04、IGHV3-30*01、IGHV3-30*18、IGHV5-10-1*01、IGHV5-10-1*04和IGHV5-51*01。

E16、E1-E15中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含来源于人种系VH序列的VH框架序列，该人种系VH序列选自IGHV1-2*02、IGHV1-3*01、IGHV1-46*01、IGHV1-69*01、IGHV1-69*02、IGHV1-8*01、IGHV3-13*01、IGHV3-23*01、IGHV3-23*04、IGHV3-30*01、IGHV3-30*18、IGHV5-10-1*01、IGHV5-10-1*04以及IGHV5-51*01。

E17、E1-E16中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含IGHV1-69*01VH框架序列。

E18、E1-E17中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含来源于人种系VL序列的VL框架序列，该人种系VL序列选自IGKV1-12*01、IGKV1-13*02、IGKV1-33*01、IGKV1-39*01、IGKV1-5*01、IGKV3-11*01、IGKV3-15*01、IGKV3-20*01、IGKV3D-20*02以及IGKV4-1*01。

E19、E1-E18中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含IGKV3-11*01VL框架序列。

E20、E1-E19中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含VL框架序列和VH框架序列，并且其中VL框架序列与其所来源于的人种系序列至少72％相同。

E21、E1-E20中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含VL框架序列和VH框架序列，并且其中VL框架序列与其所来源于的人种系序列至少72％、74％、75％、77％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

E22、E1-E21中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含VL框架序列和VH框架序列，并且其中VH框架序列与其所来源于的人种系序列至少53％相同。

E23、E1-E22中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含VL框架序列和VH框架序列，并且其中VH框架序列与其所来源于的人种系序列至少53％、58％、60％、63％、71％、72％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

E24、E1-E23中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:166至少90％相同的氨基酸序列。

E25、E1-E24中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:166至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

E26、E1-E25中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含VH，该VH包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列。

E27、E1-E26中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:163至少90％相同的氨基酸序列。

E28、E1-E27中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:163至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

E29、E1-E28中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含VL，该VL包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列。

E30、E1-E29中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含：包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH以及SEQ ID NO:163的VL氨基酸序列。

E31、E1-E30中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含Fc结构域。

E32、E31的抗体或其抗原结合片段，其中Fc结构域是IgA(例如IgA₁或IgA₂)、IgD、IgE、IgM或IgG(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)的Fc结构域。

E33、E32的抗体或其抗原结合片段，其中Fc结构域是IgG的Fc结构域。

E34、E33的抗体或其抗原结合片段，其中IgG选自IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄。

E35、E34的抗体或其抗原结合片段，其中IgG是IgG₁。

E36、E1-E35中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含重链，该重链包含与SEQ IDNO:164至少90％相同的氨基酸序列。

E37、E1-E36中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含重链，该重链包含与SEQ IDNO:164至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

E38、E1-E37中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含重链，该重链包含SEQ IDNO:164的氨基酸序列。

E39、E1-E38中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含LC，该LC包含与SEQ ID NO:162至少90％相同的氨基酸序列。

E40、E1-E39中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含LC，该LC包含与SEQ ID NO:162至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

E41、E1-E40中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含LC，该LC包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列。

E42、E1-E41中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的重链以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的轻链。

E43、E1-E42中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含CDR1、CDR2和CDR3，其由保藏在ATCC且具有ATCC登录号PTA-125038的质粒的插入物编码。

E44、E1-E43中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含CDR1、CDR2和CDR3，其由保藏在ATCC且具有ATCC登录号PTA-125039的质粒的插入物编码。

E45、E1-E44中任一项的抗体或其抗原结合片段，其由保藏在ATCC且具有ATCC登录号PTA-125038的质粒中的插入物编码。

E46、E1-E45中任一项的抗体或其抗原结合片段，其由保藏在ATCC且具有ATCC登录号PTA-125039的质粒中的插入物编码。

E47、E1-E46中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含由保藏在ATCC且具有ATCC登录号PTA-125038的质粒中的插入物编码的氨基酸序列以及由保藏在ATCC且具有ATCC登录号PTA-125039的质粒中的插入物编码的氨基酸序列。

E48、E1-E47中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段是Fc融合蛋白、单抗体(monobody)、大抗体(maxibody)、双功能抗体、scFab、scFv、肽抗体(peptibody)。

E49、E1-E48的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段以约为或小于选自约10nM、5nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、250pM、200pM、150pM、100pM、50pM、40pM、30pM、25pM、20pM、15pM和10pM的值的K_D结合人GDF15。

E50、E1-E49的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段以约为或小于选自约10nM、5nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、250pM、200pM、150pM、100pM、50pM、40pM、30pM、25pM、20pM、15pM、13pM、10pM和9pM的值的K_D结合食蟹猴GDF15。

E51、E1-E50的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段以约8pM或9pM的K_D结合食蟹猴GDF15。

E52、E1-E51的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段以约8.28pM的K_D结合食蟹猴GDF15。

E53、E1-E52中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中在人中的最终半衰期为至少约16天。

E54、E1-E53中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中在人中的最终半衰期为至少17天。

E55、E1-E54的抗体或其抗原结合片段，其中由t-regitope(tReg)调整分数表示的抗体的预测免疫原性潜能小于约-24。

E56、E1-E55的抗体或其抗原结合片段，其中由tReg调整分数表示的抗体的预测免疫原性潜能小于选自约-24、-26、-27、-30、-32、-33、-34、-35、-36、-37、-38、-39、-40、-41、-42、-43、-50和-51的tReg调整分数。

E57、E1-E56的抗体或其抗原结合片段，其中由tReg调整分数表示的抗体的预测免疫原性潜在性选自约-26、-34、-36、-41和-42。

E58、E1-E57的抗体或其抗原结合片段，其中由tReg调整分数表示的抗体的预测免疫原性潜在性为约-41或-42。

E59、E1-E58的抗体或其抗原结合片段，其中当在25℃下测量时，抗体或抗原结合片段具有选自至少约10厘泊(cP)、至少约15cP、至少约20cP、至少约40cP以及至少约70cP的粘度。

E60、E1-E59的抗体或其抗原结合片段，其中当在25℃下测量时，抗体或抗原结合片段具有约20cP的粘度。

E61、E1-E60的抗体或其抗原结合片段，其中当在25℃下测量时，抗体或抗原结合片段具有20cP的粘度。

E62、E1-E61的抗体或其抗原结合片段，其中与结合鼠GDF15相比，抗体或抗原结合片段结合人GDF15的K_D的比率在约0.05与约0.10之间。

E63、E1-E62的抗体或其抗原结合片段，其中与结合鼠GDF15相比，抗体或抗原结合片段结合人GDF15的K_D的比率为约0.07。

E64、E1-E63的抗体或其抗原结合片段，其中与结合鼠GDF15相比，抗体或抗原结合片段结合人GDF15的K_D的比率为0.07。

E65、E1-E64的抗体或其抗原结合片段，其中与结合食蟹猴GDF15相比，抗体或抗原结合片段结合人GDF15的K_D的比率在约1.0与约1.5之间。

E66、E1-E65的抗体或其抗原结合片段，其中与结合食蟹猴GDF15相比，抗体或抗原结合片段结合人GDF15的K_D的比率为约1.2。

E67、E1-E66的抗体或其抗原结合片段，其中与结合食蟹猴GDF15相比，抗体或抗原结合片段结合人GDF15的K_D的比率为1.21。

E68、E1-E67的抗体或其抗原结合片段，其中与结合鼠GDF15相比，抗体或抗原结合片段结合食蟹猴GDF15的K_D的比率在约0.03与约0.09之间。

E69、E1-E68的抗体或其抗原结合片段，其中与结合鼠GDF15相比，抗体或抗原结合片段结合食蟹猴GDF15的K_D的比率在约0.04与0.08之间。

E70、E1-E69的抗体或其抗原结合片段，其中与结合鼠GDF15相比，抗体或抗原结合片段结合食蟹猴GDF15的K_D的比率在0.05与0.06之间。

E71、E1-E70的抗体或其抗原结合片段，其中与结合鼠GDF15相比，抗体或抗原结合片段结合食蟹猴GDF15的K_D的比率为0.05。

E72、E1-E71的抗体，其中通过差示扫描量热法测量，抗体在熔融温度(T_m1)或抗体的C_H2打开50％时的约71℃或更高的温度下具有热稳定性。

E73、E1-E72的抗体，其中通过差示扫描量热法测量，抗体在熔融温度(T_m1)或抗体的C_H2展开50％时的在71℃与72℃之间的温度下具有热稳定性。

E74、E1-E73的抗体，其中通过差示扫描量热法测量，抗体在熔融温度(T_m1)或抗体的C_H2展开50％时的在71℃与72℃之间的温度下具有热稳定性。

E75、E1-E74的抗体，其中通过差示扫描量热法测量，抗体在熔融温度(T_m2)或抗体的Fab展开50％时的约80℃或更高的温度下具有热稳定性。

E76、E1-E75的抗体，其中通过差示扫描量热法测量，抗体在熔融温度(T_m2)或抗体的Fab展开50％时的在80℃与86℃之间的温度下具有热稳定性。

E77、E1-E76的抗体，其中通过差示扫描量热法测量，抗体在熔融温度(T_m2)或抗体的Fab展开50％时的在84℃与85℃之间的温度下具有热稳定性。

E78、E1-E77的抗体，其中通过差示扫描量热法测量，抗体在熔融温度(T_m3)或抗体的C_H3展开50％时的约82℃或更高的温度下具有热稳定性。

E79、E1-E78的抗体，其中通过差示扫描量热法测量，抗体在熔融温度(T_m3)或抗体的C_H3展开50％时的在83℃与91℃之间的温度下具有热稳定性。

E80、E1-E79的抗体，其中通过差示扫描量热法测量，抗体在熔融温度(T_m3)或抗体的C_H3展开50％时的在87℃与89℃之间的温度下具有热稳定性。

E81、分离的核酸分子，包含编码E1-E80中任一项的抗体或其抗原结合片段的核酸序列。

E82、分离的核酸分子，包含编码E1-E81中任一项的抗体或其抗原结合片段的至少一个核酸序列。

E83、分离的核酸分子，其编码特异性结合人GDF15的抗体或其抗原结合部分的VL、VH或二者，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:167的核酸序列、SEQ ID NO:168的核酸序列或二者。

E84、分离的核酸分子，包含SEQ ID NO:167的核酸序列、SEQ ID NO:168的核酸序列或二者。

E85、分离的核酸分子，其编码特异性结合人GDF15的抗体或其抗原结合部分的轻链、重链或二者，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:169的核酸序列、SEQ ID NO:170的核酸序列或二者。

E86、分离的核酸分子，包含SEQ ID NO:169的核酸序列、SEQ ID NO:170的核酸序列或二者。

E87、一种分离的核酸分子，包含选自如SEQ ID NO:167、168、169或170所示序列的至少一个核酸序列。

E88、分离的核酸分子，包含如SEQ ID NO:167所示的核酸序列。

E89、分离的核酸分子，包含如SEQ ID NO:168所示的核酸序列。

E90、分离的核酸分子，包含如SEQ ID NO:169所示的核酸序列。

E91、分离的核酸分子，包含如SEQ ID NO:170所示的核酸序列。

E92、分离的核酸分子，其编码特异性结合人GDF15的抗体或其抗原结合部分，其中所述核酸分子包含保藏在ATCC且具有登录号PTA-125038的质粒的插入物的核酸序列。

E93、分离的核酸分子，其编码特异性结合人GDF15的抗体或其抗原结合部分，其中所述核酸分子包含保藏在ATCC且具有登录号PTA-125039的质粒的插入物的核酸序列。

E94、分离的核酸分子，其编码特异性结合人GDF15的抗体或其抗原结合部分，其中所述核酸分子包含保藏在ATCC且具有登录号PTA-125038的质粒的插入物的核酸序列以及保藏在ATCC且具有登录号PTA-125039的质粒的插入物的核酸序列。

E95、分离的核酸分子，包含保藏在ATCC且具有登录号PTA-125038的质粒的插入物的核酸序列。

E96、分离的核酸分子，包含保藏在ATCC且具有登录号PTA-125039的质粒的插入物的核酸序列。

E97、分离的核酸分子，包含保藏在ATCC且具有登录号PTA-125038的质粒的插入物的核酸序列以及保藏在ATCC且具有登录号PTA-125039的质粒的插入物的核酸序列。

E98、载体，包含E81-E97中任一项的核酸分子。

E99、宿主细胞，包含E81-E98中任一项的核酸分子或E98所述的载体。

E100、E99的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

E101、E100的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞、HEK-293细胞、NS0细胞、PER.

细胞或Sp2.0细胞。

E102、制备抗体或其抗原结合片段的方法，包括在其中所述抗体或抗原结合片段由E99-E101中任一项的宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞。

E103、E102的方法，进一步包括分离所述抗体或其抗原结合片段。

E104、药物组合物，包含E1-E103中任一项的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载体或赋形剂。

E105、E104的组合物，包括噻替派、环磷酰胺(CYTOXAN)、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、米得哌、乌得哌、六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫化磷酰胺、三羟甲蜜胺；布拉它辛、布拉它辛酮、δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚、MARINOL)、β-拉帕醌、拉帕醇、秋水仙碱、桦木酸、托泊替康(HYCAMTIN)、CPT-11(依立替康、CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪素、9-氨基喜树碱、苔藓抑素、培美曲塞、卡利司他汀、CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新及比折来新合成类似物)、鬼臼毒素、鬼臼酸、替尼泊苷、念珠藻素、多拉司他汀、倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189以及CB1-TM1)、艾榴塞洛素、水鬼蕉碱、TLK-286、CDP323、口服α-4整合素抑制剂、甸枝珊瑚醇、海绵素、苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸二氯甲基二乙胺氧化物、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、烯二炔抗生素(包括卡奇霉素、卡奇霉素γ以及卡奇霉素ω、达内霉素、达内霉素A、埃斯培拉霉素、新制癌菌素发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCIN、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星、多柔比星HC1脂质体注射剂(DOXIL)以及去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄揽霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星、甲氨蝶呤、吉西他滨(GEMZAR)、替加氟(UFTORAL)、卡培他滨(XELODA)、埃坡霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、伊马替尼、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、倍曲布西(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、地美可辛、地吖醌、伊佛米新、依利醋铵、乙环氧啶、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、洛尼代宁、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫匹达醇、二胺硝吖啶、喷司他汀、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、2-乙基酰肼、丙卡巴肼、PSK多糖复合物、雷佐生、利索新、西佐喃、螺旋锗、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2,2',2"-三氯三乙胺、T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A、蛇形菌素、乌拉坦、长春地辛(ELDISINE、FILDESIN)、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、加西托新、阿糖胞苷(“Ara-C”)、噻替派、紫杉醇(TAXOL)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米粒子制剂(ABRAXANE)、紫杉萜(TAXOTERE)、苯丁酸氮芥、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、长春碱(VELBAN)、铂、依托泊苷(VP-16)、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱(ONCOVIN)、奥沙利铂、亚叶酸(leucovovin)、长春瑞滨(NAVELBINE)、诺安托、依达曲沙、道诺霉素、氨基蝶呤、伊班膦酸盐、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、抗雌激素类及选择性雌激素受体调节剂(SERM)(包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX他莫昔芬)、拉洛昔芬(EVISTA)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY 11 7018、奥那司酮、以及托瑞米芬(FARESTON)、抗黄体素、雌激素受体下调剂(ERD)、氟维司群(FASLODEX)、促黄体生成激素释放激素(LHRFl)激动剂(包括醋酸亮丙瑞林(LUPRON以及ELIGARD)、醋酸性瑞林、醋酸布舍瑞林及曲普瑞林(tripterelin))、抗雄激素类(包括氟他胺、尼鲁米特及比卡鲁胺)；芳香酶抑制剂(包括4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(MEGASE)、依西美坦(AROMASIN)、福美坦、法曲唑、伏氯唑(RJVISOR)、来曲唑(FEMARA)及阿那曲唑(ARIMIDEX))、双膦酸类(包括氯屈膦酸二钠(BONEFOS或OSTAC)、羟乙二磷酸盐(DIDROCAL)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA)、阿仑膦酸盐(FOSAMAX)、帕米膦酸盐(AREDIA)、替鲁膦酸盐(SKELID)及利塞膦酸盐(ACTONEL))、曲沙他滨、反义寡核苷酸(包括PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生长因子受体(EGF-R))、THERATOPE疫苗、基因治疗疫苗(包括ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及

疫苗；拓朴异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN))、氟维司群；伊马替尼、EXEL-0862、厄洛替尼、西妥昔单抗、贝伐单抗、艾利替康、rmRH(例如ABARELIX)、拉帕替尼、二甲苯磺酸拉帕替尼(也被称为GW572016)、17AAG、伊珠单抗奥佐米星(BESPONSA)、波舒替尼(BOSULIF)、帕博西尼(IBRANCE)、阿西替尼(INLYTA)、苹果酸舒尼替尼(SUTENT)、克里唑蒂尼(XALKORI)、恩杂鲁胺(XTANDI)以及上述任一项的药学上可接受的盐和/或酸或衍生物中的两个或更多个的组合。

E106、降低GDF15的活性的方法，包括：向有需要的对象施用治疗有效量的实施方式E1-E80中任一项的抗体或其抗原结合片段或E104或E105的药物组合物，以及将施用前的GDF15的活性与施用抗体后的GDF15活性的水平进行比较，由此降低GDF15的活性。

E107、E106的方法，其中GDF15的活性选自以下：

(a)GFRAL的结合；

(b)降低食物摄取；

(c)降低身体质量；

(d)降低肌肉质量；

(e)降低脂肪量；

(f)活化RET；

(g)增加ERK的磷酸化(pERK)；

(h)增加核糖体蛋白S6的磷酸化(S6)；

(i)增加AKT的磷酸化；

(j)增加MAPK的磷酸化；以及

(k)增加PLC-γ1的磷酸化。

E108、一种在有需要的对象中降低游离GDF15的水平的方法，该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的实施方式E1-E80中任一项的抗体或其抗原结合片段或E104或E105的药物组合物。

E109、E108所述的方法，其中将施用前的游离GDF15的水平与施用后的游离GDF15的水平进行比较，并且调整剂量及给药方案以降低至1ng/ml以下的游离GDF15水平。

E110、E108所述的方法，其中将施用前的游离GDF15的水平与施用后的游离GDF15的水平进行比较，并且调整剂量及给药方案以降低至0.9ng/ml以下的游离GDF15水平。

E111、E108所述的方法，其中将施用前的游离GDF15的水平与施用后的游离GDF15的水平进行比较，并且调整剂量及给药方案以降低至0.8ng/ml以下的游离GDF15水平。

E112、E108所述的方法，其中将施用前的游离GDF15的水平与施用后的游离GDF15的水平进行比较，并且调整剂量及给药方案以降低至0.7ng/ml以下的游离GDF15水平。

E113、E108所述的方法，其中将施用前的游离GDF15的水平与施用后的游离GDF15的水平进行比较，并且调整剂量及给药方案以降低至0.6ng/ml以下的游离GDF15水平。

E114、E108所述的方法，其中将施用前的游离GDF15的水平与施用后的游离GDF15的水平进行比较，并且调整剂量及给药方案以降低至0.5ng/ml以下的游离GDF15水平。

E115、E108所述的方法，其中将施用前的游离GDF15的水平与施用后的游离GDF15的水平进行比较，并且调整剂量及给药方案以降低至0.4ng/ml以下的游离GDF15水平。

E116、一种治疗恶病质的方法，包括向有需要的对象施用治疗有效量的E1-E80中任一项的抗体或其抗原结合片段或E104或E105的药物组合物。

E117、E116所述的方法，其中是与癌症、化学疗法、与免疫肿瘤学疗法组合的化学疗法、慢性阻塞性肺病、慢性肾脏疾病、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭或肌肉减少症相关的恶病质。

E118、E117所述的方法，其中癌症是实体肿瘤癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌或睾丸癌。

E119、E117或E118所述的方法，其中化学疗法是噻替派、环磷酰胺(CYTOXAN)、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、米得哌、乌得哌、六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫化磷酰胺、三羟甲蜜胺；布拉它辛、布拉它辛酮)、δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚、MARINOL)、β-拉帕醌、拉帕醇、秋水仙碱、桦木酸、托泊替康(HYCAMTIN)、CPT-11(依立替康、CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪素、9-氨基喜树碱、苔藓抑素、培美曲塞、卡利司他汀、CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新及比折来新合成类似物)、鬼臼毒素、鬼臼酸、替尼泊苷、念珠藻素、多拉司他汀、倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189以及CB1-TM1)、艾榴塞洛素、水鬼蕉碱、TLK-286、CDP323、口服α-4整合素抑制剂、甸枝珊瑚醇、海绵素、苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸二氯甲基二乙胺氧化物、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、烯二炔抗生素(包括卡奇霉素、卡奇霉素γ以及卡奇霉素ω、达内霉素、达内霉素A、埃斯培拉霉素、新制癌菌素发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCIN、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星、多柔比星HC1脂质体注射剂(DOXIL)以及去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄揽霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星、甲氨蝶呤、吉西他滨(GEMZAR)、替加氟(UFTORAL)、卡培他滨(XELODA)、埃坡霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、伊马替尼、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、倍曲布西、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、地美可辛、地吖醌、伊佛米新、依利醋铵、乙环氧啶、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、洛尼代宁、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫匹达醇、二胺硝吖啶、喷司他汀、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、2-乙基酰肼、丙卡巴肼、PSK多糖复合物、雷佐生、利索新、西佐喃、螺旋锗、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2,2',2"-三氯三乙胺、T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A、蛇形菌素、乌拉坦、长春地辛(ELDISINE、FILDESIN)、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、加西托新、阿糖胞苷(“Ara-C”)、噻替派、紫杉醇(TAXOL)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米粒子制剂(ABRAXANE)、紫杉萜(TAXOTERE)、苯丁酸氮芥、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、长春碱(VELBAN)、铂、依托泊苷(VP-16)、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱(ONCOVIN)、奥沙利铂、亚叶酸(leucovovin)、长春瑞滨(NAVELBINE)、诺安托、依达曲沙、道诺霉素、氨基蝶呤、伊班膦酸盐、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、抗雌激素类及选择性雌激素受体调节剂(SERM)(包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX他莫昔芬)、拉洛昔芬(EVISTA)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY 11 7018、奥那司酮、以及托瑞米芬(FARESTON)、抗黄体素、雌激素受体下调剂(ERD)、氟维司群(FASLODEX)、促黄体生成激素释放激素(LHRFl)激动剂(包括醋酸亮丙瑞林(LUPRON以及ELIGARD)、醋酸性瑞林、醋酸布舍瑞林及曲普瑞林(tripterelin))、抗雄激素类(包括氟他胺、尼鲁米特及比卡鲁胺)；芳香酶抑制剂(包括4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(MEGASE)、依西美坦(AROMASIN)、福美坦、法曲唑、伏氯唑(RJVISOR)、来曲唑(FEMARA)及阿那曲唑(ARIMIDEX))、双膦酸类(包括氯屈膦酸二钠(BONEFOS或OSTAC)、羟乙二磷酸盐(DIDROCAL)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA)、阿仑膦酸盐(FOSAMAX)、帕米膦酸盐(AREDIA)、替鲁膦酸盐(SKELID)及利塞膦酸盐(ACTONEL))、曲沙他滨、反义寡核苷酸(包括PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生长因子受体(EGF-R))、THERATOPE疫苗、基因治疗疫苗(包括ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及

E120、E119的方法，其中化学疗法是基于铂的化学疗法。

E121、E106-E120中任一项的方法，其中所述对象是人。

E122、E106-E121中任一项的方法，包括皮下施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E123、E106-E122中任一项的方法，包括静脉内施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E124、E106-E123中任一项的方法，其中约每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每月两次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、或每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次或每十二个月一次施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E125、E106-E124中任一项的方法，其中以约0.1mg与约60mg之间的剂量每周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E126、E106-E125中任一项的方法，其中以约2mg与约50mg之间的剂量每周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E127、E106-E126中任一项的方法，其中以选自约2mg、约5mg、约7mg、约10mg、约12mg、约15mg、约25mg、约40mg以及约50mg的剂量每周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E128、E106-E124中任一项的方法，其中以约0.1mg与约130mg之间的剂量每两周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E129、E106-E124或E128中任一项的方法，其中以约5mg与约125mg之间的剂量每两周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E130、E106-E124或E128-E129中任一项的方法，其中以选自约5mg、约12mg、约20mg、约25mg、约30mg、约40mg、约60mg、约90mg以及约125mg的剂量每两周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E131、E106-E124中任一项的方法，其中以约0.1mg与约400mg之间的剂量每四周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E132、E106-E124或E131中任一项的方法，其中以约15mg与约385mg之间的剂量每四周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E133、E106-E124或E131-E132中任一项的方法，其中以选自约15mg、约40mg、约60mg、约75mg、约100mg、约115mg、约200mg、约300mg以及约385mg的剂量每四周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E134、E1-E80中任一项的抗体或其抗原结合片段，或E104或E105所述的药物组合物，其用作药物。

E135、E1-E80中任一项的抗体或其抗原结合片段，或E104或E105所述的药物组合物，其用于降低对象中GDF15的活性。

E136、一种降低GDF15的活性的方法，包括：向有需要的对象施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含

a)SEQ ID NO:177的HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3序列以及SEQ ID NO:178的LCDR-1、LCDR-2LCDR-2和LCDR-3序列，或

b)包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的VH以及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL；

以及将施用前的GDF15的活性与施用抗体后的GDF15活性的水平进行比较，由此降低GDF15的活性。

E137、降低GDF15的活性的方法，包括向有需要的对象施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含

a)包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，该抗体或其抗原结合片段包含：SEQID NO:177的HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3序列；SEQ ID NO:178的LCDR-1、LCDR-2和LCDR-3序列；以及药学上可接受的载体或赋形剂，或

b)包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，该抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的VH；包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL；以及药学上可接受的载体或赋形剂，由此降低GDF15的活性。

E138、E137所述的方法，其中GDF15的活性选自以下：

(a)GFRAL的结合；

(b)降低食物摄取；

(c)降低身体质量；

(d)降低肌肉质量；

(e)降低脂肪量；

(f)活化RET；

(g)增加ERK的磷酸化(pERK)；

(h)增加核糖体蛋白S6的磷酸化(S6)；

(i)增加AKT的磷酸化；

(j)增加MAPK的磷酸化；以及

(k)增加PLC-□1的磷酸化。

E139、治疗恶病质的方法，包括向有需要的对象施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含

a)SEQ ID NO:177的HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3序列以及SEQ ID NO:178的LCDR-1、LCDR-2和LCDR-3序列，或

b)包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的VH以及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL。

E140、一种治疗恶病质的方法，包括向有需要的对象施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，其包含

b)包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，该抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的VH；包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL；以及药学上可接受的载体或赋形剂。

E141、E139或E140所述的方法，其中是与癌症、化学疗法、与免疫肿瘤学疗法组合的化学疗法、慢性阻塞性肺病、慢性肾脏疾病、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭或肌肉减少症相关的恶病质。

E142、E141所述的方法，其中癌症是实体肿瘤癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌或睾丸癌。

E143、E141或E142所述的方法，其中化学疗法是噻替派、环磷酰胺(CYTOXAN)、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、米得哌、乌得哌、六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫化磷酰胺、三羟甲蜜胺；布拉它辛、布拉它辛酮)、δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚、MARINOL)、β-拉帕醌、拉帕醇、秋水仙碱、桦木酸、托泊替康(HYCAMTIN)、CPT-11(依立替康、CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪素、9-氨基喜树碱、苔藓抑素、培美曲塞、卡利司他汀、CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新及比折来新合成类似物)、鬼臼毒素、鬼臼酸、替尼泊苷、念珠藻素、多拉司他汀、倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189以及CB1-TM1)、艾榴塞洛素、水鬼蕉碱、TLK-286、CDP323、口服α-4整合素抑制剂、甸枝珊瑚醇、海绵素、苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸二氯甲基二乙胺氧化物、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、烯二炔抗生素(包括卡奇霉素、卡奇霉素γ以及卡奇霉素ω、达内霉素、达内霉素A、埃斯培拉霉素、新制癌菌素发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCIN、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星、多柔比星HC1脂质体注射剂(DOXIL)以及去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄揽霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星、甲氨蝶呤、吉西他滨(GEMZAR)、替加氟(UFTORAL)、卡培他滨(XELODA)、埃坡霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、伊马替尼、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、倍曲布西、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、地美可辛、地吖醌、伊佛米新、依利醋铵、乙环氧啶、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、洛尼代宁、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫匹达醇、二胺硝吖啶、喷司他汀、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、2-乙基酰肼、丙卡巴肼、PSK多糖复合物、雷佐生、利索新、西佐喃、螺旋锗、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2,2',2"-三氯三乙胺、T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A、蛇形菌素、乌拉坦、长春地辛(ELDISINE、FILDESIN)、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、加西托新、阿糖胞苷(“Ara-C”)、噻替派、紫杉醇(TAXOL)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米粒子制剂(ABRAXANE)、紫杉萜(TAXOTERE)、苯丁酸氮芥、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、长春碱(VELBAN)、铂、依托泊苷(VP-16)、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱(ONCOVIN)、奥沙利铂、亚叶酸(leucovovin)、长春瑞滨(NAVELBINE)、诺安托、依达曲沙、道诺霉素、氨基蝶呤、伊班膦酸盐、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、抗雌激素类及选择性雌激素受体调节剂(SERM)(包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX他莫昔芬)、拉洛昔芬(EVISTA)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY 11 7018、奥那司酮、以及托瑞米芬(FARESTON)、抗黄体素、雌激素受体下调剂(ERD)、氟维司群(FASLODEX)、促黄体生成激素释放激素(LHRFl)激动剂(包括醋酸亮丙瑞林(LUPRON以及ELIGARD)、醋酸性瑞林、醋酸布舍瑞林及曲普瑞林(tripterelin))、抗雄激素类(包括氟他胺、尼鲁米特及比卡鲁胺)；芳香酶抑制剂(包括4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(MEGASE)、依西美坦(AROMASIN)、福美坦、法曲唑、伏氯唑(RJVISOR)、来曲唑(FEMARA)及阿那曲唑(ARIMIDEX))、双膦酸类(包括氯屈膦酸二钠(BONEFOS或OSTAC)、羟乙二磷酸盐(DIDROCAL)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA)、阿仑膦酸盐(FOSAMAX)、帕米膦酸盐(AREDIA)、替鲁膦酸盐(SKELID)及利塞膦酸盐(ACTONEL))、曲沙他滨、反义寡核苷酸(包括PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生长因子受体(EGF-R))、THERATOPE疫苗、基因治疗疫苗(包括ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及

E144、E141所述的方法，其中化学疗法是基于铂的化学疗法。

E145、E136-E144中任一项的方法，其中所述对象是人。

E146、E136-E145中任一项的方法，包括皮下施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E147、E136-E146中任一项的方法，包括静脉内施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E148、E136-E147中任一项的方法，其中约每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每月两次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每四个月一次施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E149、E136-E148中任一项的方法，其中以约0.1mg与约60mg之间的剂量每周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E150、E136-E149中任一项的方法，其中以约2mg与约50mg之间的剂量每周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E151、E136-E150中任一项的方法，其中以选自约2mg、约5mg、约7mg、约10mg、约12mg、约15mg、约25mg、约40mg以及约50mg的剂量每周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E152、E136-E148中任一项的方法，其中以约0.1mg与约130mg之间的剂量每两周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E153、E136-E148或E152中任一项的方法，其中以约5mg与约125mg之间的剂量每两周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E154、E136-E148或E152-E153中任一项的方法，其中以选自约5mg、约12mg、约20mg、约25mg、约30mg、约40mg、约60mg、约90mg以及约125mg的剂量每两周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E155、E136-E148中任一项的方法，其中以约0.1mg与约400mg之间的剂量每四周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E156、E136-E148或E155中任一项的方法，其中以约15mg与约385mg之间的剂量每四周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E157、E136-E148或E155-E156中任一项的方法，其中以选自约15mg、约40mg、约60mg、约75mg、约100mg、约115mg、约200mg、约300mg以及约385mg的剂量每四周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E158、一种降低有需要的对象的血浆中的游离GDF15的水平的方法，所述方法包括施用E1-E80中任一项的抗体或E104-E105中任一项的组合物。

E159、E106-E108或E116-E158中任一项的方法，其中将对象的血浆中的游离GDF15的水平降低至约0.05ng/mL至约3ng/mL范围内。

E160、E106-E108或E116-E159中任一项的方法，其中将对象的血浆中的游离GDF15的水平降低至约0.1ng/mL至约1ng/mL范围内。

E161、E106-E108或E116-E160中任一项的方法，其中将对象的血浆中的游离GDF15的水平降低至约0.4ng/mL至约0.8ng/mL范围内。

E162、E106-E114或E116-E158中任一项的方法，其中将对象的血浆中的游离GDF15的水平降低至0.5ng/mL以下。

E163、E106-E158或E162中任一项的方法，其中将对象的血浆中的游离GDF15的水平降低至0.4ng/mL以下。

E164、E106-E108或E116-E158中任一项的方法，其中将对象的血浆中的游离GDF15的水平降低至下限值选自0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9ng/mL且上限值选自0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9以及3.0ng/mL的范围。

E165、E106-E114或E116-E158所述的方法，其中将对象的血浆中的游离GDF15的水平降低至小于约0.5ng/mL。

E166、E106-E165中任一项的方法，其中将对象的血浆中的游离GDF15的水平降低至超过使用本领域已知的用于检测血浆中游离GDF15的测定获得的最低检测水平。

E167、药物组合物，包含E1-E80的抗体或其抗原结合片段、PD-1轴结合拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。

E168、药物组合物，包含E1-E80的抗体或其抗原结合片段、PD-1轴结合拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂，条件是PD-1轴结合拮抗剂不是阿维鲁单抗。

E169、用于治疗癌症的方法，包括向有需要的患者施用某一量的PD-1轴结合拮抗剂、以及某一量的E1-E80中任一项的抗体或其抗原结合片段或某一量的E167-E168的药物组合物，其中这些量一起在治疗癌症中是有效的。

E170、治疗癌症的方法，包括向有需要的患者施用某一量的PD-1轴结合拮抗剂、以及某一量的E1-E80中任一项的抗体或其抗原结合片段或某一量的E167-E169的药物组合物，其中这些量一起在治疗癌症中是有效的，并且其中PD-1轴结合拮抗剂不是阿维鲁单抗。

E171、E169-E170所述的方法，其中这些量一起在治疗癌症中提供协同疗效。

E172、E169所述的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。

E173、E169所述的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-L1抗体，条件是抗PD-L1抗体不是阿维鲁单抗。

E174、E172所述的方法，其中PD-L1抗体选自阿维鲁单抗、阿替唑利单抗或得瓦鲁单抗。

E175、E172所述的方法，其中PD-L1抗体是阿特珠单抗或得瓦鲁单抗。

E176、E172所述的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂是阿维鲁单抗并且以约10mg/kgQ2W或约800mg Q2W的量静脉内施用。

E177、E168的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-1抗体。

E178、E177的方法，其中抗PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗、斯巴达珠单抗、替雷利珠单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-514、西米普利单抗和萨善利单抗(PF-06801591、RN888、mAb7)。

E179、E178的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂是萨善利单抗并且以约300mg Q4W或约600mg Q6W的量皮下施用。

E180、E170-E180中任一项的方法，其中癌症选自黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、Merkel细胞癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、尿路上皮癌和去势难治性前列腺癌。

E181、E180所述的方法，其中癌症是肾细胞癌。

E182、E181所述的方法，其中癌症是胰腺癌。

E183、使用E1-E80中任一项的抗体或其抗原结合部分检测样品、组织或细胞中的GDF15的方法，包括使样品、组织或细胞与抗体接触以及检测抗体。

E184、用于在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用组合疗法，该组合疗法包括协同治疗有效量的PD-1轴结合拮抗剂以及协同治疗有效量的GDF15抑制剂，其中这些量一起提供协同疗效，由此治疗癌症。

E185、在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用组合疗法，该组合疗法包括协同治疗有效量的PD-1轴结合拮抗剂以及协同治疗有效量的GDF15抑制剂，其中这些量一起提供协同疗效，由此治疗癌症，并且其中PD-1轴结合拮抗剂不是阿维鲁单抗。

E186、E184-E185所述的方法，其中GDF15抑制剂是E1-E80中任一项的抗GDF15抗体或其抗原结合片段。

E187、E186所述的方法，其中抗GDF15抗体或其抗原结合片段包含：

a)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的LCDR-1；

b)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR-2；

c)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR-3；

d)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HCDR-1；

e)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的HCDR-2；以及

f)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR-3。

E188、E187所述的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂是特异性结合PD-1的抗体并且包含：

a)包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的LCDR-1；

b)包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列的LCDR-2；

c)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的LCDR-3；

d)包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的HCDR-1；

e)包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的HCDR-2；以及

f)包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列的HCDR-3。

E189、E186所述的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂是选自纳武单抗、派姆单抗、斯巴达珠单抗、匹地利珠单抗、替雷利珠单抗、AMP-224、AMP-514、西米普利单抗以及萨善利单抗(PF-06801591)的抗PD-1抗体。

E190、根据权利要求E188-E189所述的方法，其中抗PD-1抗体是萨善利单抗(PF-06801591)。

E191、根据权利要求186所述的方法，其中PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。

E192、根据权利要求190所述的方法，其中萨善利单抗以约300mg Q4W或约600mgQ6W的量皮下施用。

E193、根据权利要求191所述的方法，其中PD-L1抗体选自阿特珠单抗、得瓦鲁单抗、BMS-936559、MEDI4736以及MPDL3280A。

E194、根据权利要求187所述的方法，其中抗GDF15抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH以及包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的VL。

E195、E194所述的方法，其中抗GDF15抗体包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的HC以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的LC。

E196、E195所述的方法，其中抗PD-1抗体包含：包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的HC以及包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的LC。

E197、根据权利要求31所述的方法，其中癌症选自黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、Merkel细胞癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、尿路上皮癌和去势难治性前列腺癌。

E198、E184-E197所述的方法，其中癌症是肾细胞癌或胰腺癌。

E199、用于治疗癌症的试剂盒，包含协同治疗有效量的抗PD-1抗体以及协同治疗有效量的抗GDF15抗体。

E200、治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用治疗有效量的E1-E80中任一项的抗体或其抗原结合片段或E104或E105的药物组合物。

E201、E200所述的方法，其中癌症是例如但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、食管癌、胃癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、脑肿瘤、头颈癌、肾癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、子宫癌、骨癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、血癌、甲状腺癌、胸腺癌、眼癌以及皮肤癌。

E202、E200或E201所述的方法，其中该方法还包括施用一种或多种额外的治疗剂。

E203、E202所述的方法，其中额外的治疗剂选自化学疗法、疫苗、基于CAR-T细胞的疗法、放射疗法、细胞因子疗法、疫苗、双特异性抗体、其它免疫抑制途径的抑制剂、血管生成抑制剂、T细胞活化剂、代谢途径抑制剂、mTOR抑制剂、腺苷途径抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(包括但不限于INLYTA、ALK抑制剂及舒尼替尼)、BRAF抑制剂、表观遗传学调节剂、Treg细胞和/或骨髓来源的抑制细胞的抑制剂或耗竭剂、JAK抑制剂、STAT抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、生物治疗剂(包括但不限于针对VEGF、VEGFR、EGFR、Her2/neu、其它生长因子受体、CD20、CD40、CD-40L、CTLA-4、OX-40、4-1BB和ICOS的抗体)、免疫原性剂(例如减毒癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞(如用肿瘤来源的抗原或核酸脉冲处理的树突细胞)、免疫刺激细胞因子(例如IL-2、IFNα2、GM-CSF)、用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(如但不限于GM-CSF))、STING激动剂和toll样受体(例如TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)激动剂。

E204、E202所述的方法，其中额外的治疗剂是抗CD40抗体。

E205、E203所述的方法，其中化学疗法是噻替派、环磷酰胺(CYTOXAN)、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、米得哌、乌得哌、六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫化磷酰胺、三羟甲蜜胺；布拉它辛、布拉它辛酮)、δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚、MARINOL)、β-拉帕醌、拉帕醇、秋水仙碱、桦木酸、托泊替康(HYCAMTIN)、CPT-11(依立替康、CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪素、9-氨基喜树碱、苔藓抑素、培美曲塞、卡利司他汀、CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新及比折来新合成类似物)、鬼臼毒素、鬼臼酸、替尼泊苷、念珠藻素、多拉司他汀、倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189以及CB1-TM1)、艾榴塞洛素、水鬼蕉碱、TLK-286、CDP323、口服α-4整合素抑制剂、甸枝珊瑚醇、海绵素、苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸二氯甲基二乙胺氧化物、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、烯二炔抗生素(包括卡奇霉素、卡奇霉素γ以及卡奇霉素ω、达内霉素、达内霉素A、埃斯培拉霉素、新制癌菌素发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCIN、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星、多柔比星HC1脂质体注射剂(DOXIL)以及去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄揽霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星、甲氨蝶呤、吉西他滨(GEMZAR)、替加氟(UFTORAL)、卡培他滨(XELODA)、埃坡霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、伊马替尼、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、倍曲布西、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、地美可辛、地吖醌、伊佛米新、依利醋铵、乙环氧啶、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、洛尼代宁、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫匹达醇、二胺硝吖啶、喷司他汀、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、2-乙基酰肼、丙卡巴肼、PSK多糖复合物、雷佐生、利索新、西佐喃、螺旋锗、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2,2',2"-三氯三乙胺、T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A、蛇形菌素、乌拉坦、长春地辛(ELDISINE、FILDESIN)、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、加西托新、阿糖胞苷(“Ara-C”)、噻替派、紫杉醇(TAXOL)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米粒子制剂(ABRAXANE)、紫杉萜(TAXOTERE)、苯丁酸氮芥、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、长春碱(VELBAN)、铂、依托泊苷(VP-16)、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱(ONCOVIN)、奥沙利铂、亚叶酸(leucovovin)、长春瑞滨(NAVELBINE)、诺安托、依达曲沙、道诺霉素、氨基蝶呤、伊班膦酸盐、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、抗雌激素类及选择性雌激素受体调节剂(SERM)(包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX他莫昔芬)、拉洛昔芬(EVISTA)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY 11 7018、奥那司酮、以及托瑞米芬(FARESTON)、抗黄体素、雌激素受体下调剂(ERD)、氟维司群(FASLODEX)、促黄体生成激素释放激素(LHRFl)激动剂(包括醋酸亮丙瑞林(LUPRON以及ELIGARD)、醋酸性瑞林、醋酸布舍瑞林及曲普瑞林(tripterelin))、抗雄激素类(包括氟他胺、尼鲁米特及比卡鲁胺)；芳香酶抑制剂(包括4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(MEGASE)、依西美坦(AROMASIN)、福美坦、法曲唑、伏氯唑(RJVISOR)、来曲唑(FEMARA)及阿那曲唑(ARIMIDEX))、双膦酸类(包括氯屈膦酸二钠(BONEFOS或OSTAC)、羟乙二磷酸盐(DIDROCAL)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA)、阿仑膦酸盐(FOSAMAX)、帕米膦酸盐(AREDIA)、替鲁膦酸盐(SKELID)及利塞膦酸盐(ACTONEL))、曲沙他滨、反义寡核苷酸(包括PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生长因子受体(EGF-R))、THERATOPE疫苗、基因治疗疫苗(包括ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及

E206、E203所述的方法，其中化学疗法是基于铂的化学疗法。

E207、E200-E206中任一项的方法，其中所述对象是人。

E208、E200-E207中任一项的方法，包括皮下施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E209、E200-E206中任一项的方法，包括静脉内施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E210、E200-E206中任一项的方法，其中约每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每月两次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每四个月一次施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E211、E200-E206中任一项的方法，其中以约0.1mg与约60mg之间的剂量每周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E212、E200-E206中任一项的方法，其中以约2mg与约50mg之间的剂量每周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E213、E200-E206中任一项的方法，其中以选自约2mg、约5mg、约7mg、约10mg、约12mg、约15mg、约25mg、约40mg以及约50mg的剂量每周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E214、E200-E206中任一项的方法，其中以约0.1mg与约130mg之间的剂量每两周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E215、E200-E206中任一项的方法，其中以约5mg与约125mg之间的剂量每两周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E216、E200-E206中任一项的方法，其中以选自约5mg、约12mg、约20mg、约25mg、约30mg、约40mg、约60mg、约90mg以及约125mg的剂量每两周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E217、E200-E206中任一项的方法，其中以约0.1mg与约400mg之间的剂量每四周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E218、E200-E206中任一项的方法，其中以约15mg与约385mg之间的剂量每四周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E219、E200-E206中任一项的方法，其中以选自约15mg、约40mg、约60mg、约75mg、约100mg、约115mg、约200mg、约300mg以及约385mg的剂量每四周施用一次所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

E220、治疗有需要的对象中的癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的E1-E80所述的抗GDF15抗体或其抗原结合片段或E104或E105的药物组合物。

E221、E220的方法，其中该方法进一步包括向对象施用有效量的一种或多种额外的治疗剂。

E222、E221的方法，其中额外的治疗剂是抗CD40抗体或其抗原结合片段。

E223、E220-E222中任一项的方法，其中癌症选自胃癌、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、头颈癌、鳞状细胞头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑素瘤。

E224、E220-223中任一项的方法，其中对象是人。

E225、用于增强施用于对象以治疗癌症的免疫调节剂的疗效的方法，该方法包括向接收免疫调节剂的对象施用有效量的E1-E80所述的抗GDF15抗体或其抗原结合片段或E104或E105的药物组合物。

E226、E225的方法，其中癌症选自乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肾癌、子宫内膜癌和结直肠癌。

E227、用于治疗或预防有需要的对象中的细胞因子释放综合征(CRS)的方法，该方法包括向对象施用有效量的E1-E80所述的抗GDF15抗体或其抗原结合片段或E104或E105的药物组合物，由此在对象中治疗或预防CRS。

E228、降低或抑制对象中的毒性的方法，所属对象正在经历细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴伤害，包括施用组合物的步骤，包括向对象施用有效量的E1-E80所述的抗GDF15抗体或其抗原结合片段或E104或E105所述的药物组合物。

E229、根据权利要求E227或E228所述的方法，其中与正在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴伤害并且未施用E1-E80的抗GDF15抗体或其抗原结合片段或E104或E105的药物组合物的对象相比，在所述对象中降低或抑制至少一种促炎性细胞因子的产生。

E230、E227-E229中任一项的方法，其中对象正经受癌症治疗并且所述方法不降低癌症治疗的功效。

E231、E230所述的方法，其中癌症治疗包括免疫调节剂。

E232、E230或E231所述的方法，其中抗GDF15抗体或其抗原结合片段的施用是在癌症治疗之前、与癌症治疗同时或在癌症治疗之后进行。

E233、E231-E232中任一项的方法，其中免疫调节剂是：抗CD40抗体、抗CD47抗体、抗CTLA4抗体、抗4-1BB/CD137抗体、白细胞介素12(IL-12)或IL-15。

E234、E228-E233中任一项的方法，其中CRS或细胞因子风暴的原因包括感染性刺激、病症或综合征，或其中所述细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因包括非感染性刺激、病症或综合征、或其任何组合。

E235、E234所述的方法，其中所述感染性刺激、病症或综合征包括流感、禽流感、严重急性呼吸综合征(SARS)、EB病毒相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、败血症、革兰氏阴性败血症、疟疾、埃博拉病毒、天花病毒、系统性革兰氏阴性细菌感染或Jarisch-Herxheimer综合征，或其中所述非感染性刺激、病症或综合征包括噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、散发性HLH、巨噬细胞活化综合征(MAS)、慢性关节炎、全身性幼年特发性关节炎(sJIA)、斯蒂尔病、Cryopyrin蛋白相关周期性综合征(CAPS)、家族性寒冷性自身炎性综合征(FCAS)、家族性寒冷性荨麻疹(FCU)、Muckle-Well综合征(MWS)、慢性小儿神经皮肤和关节(CINCA)综合征、包括NLRP3基因中的遗传或新发生获得性功能突变的cryopyrinopathy、遗传性自身炎性失调、急性胰腺炎、严重烧伤、创伤、急性呼吸窘迫综合征，次于药物使用的免疫疗法、单克隆抗体疗法，次于吸入毒素、脂多糖(LPS)、革兰氏阳性毒素、真菌毒素、糖基磷脂酰肌醇(GPI)或调节RIG-1基因表达。

附图说明

图1A示出了描绘如通过差示扫描量热法(DSC)测定的本发明抗GDF15抗体的转变温度(T_m1)的图。T_m1表示抗体的C_H2展开50％时的温度。

图1B示出了描绘如通过差示扫描量热法(DSC)测定的本发明抗GDF15抗体的转变温度(T_m2)的图。T_m2表示抗体的Fab展开50％时的温度。

图1C示出了描绘如通过差示扫描量热法(DSC)测定的本发明抗GDF15抗体的转变温度(T_m3)的图。T_m3表示抗体的C_H3展开50％时的温度。

图2示出了通过Anton Parr仪器分析的GDF15_001的粘度。在约140mg/ml时达到可接受的粘度限值(20cP)。

图3示出了在健康雄性C57BL6N小鼠中进行腺伴随病毒(AAV)人GDF15注射后的人血浆GDF15浓度。血浆GDF15经由ELISA(R&D系统DGD150)在AAV注射后13和14天(对应于图3中的第2天和第1天)测定。水平线表示平均值。n＝9只/组。

图4描绘了示出GDF15_001在健康小鼠中逆转GDF15诱导的体重损失的能力的图。箭头指向AAV人GDF15注射(第15天)以及第一单克隆抗体(mAb)给药(第0天)的时间。用GDF15_001(30mg/kg，皮下(SC)每3天(Q3D))或免疫球蛋白G(IgG)对照处理健康雄性C57BL6N小鼠。值为平均值±SEM。n＝8只/组。使用具有自回归(1)协方差结构的重复测量ANOVA来比较给药期间的第4-6天中治疗组之间从基线体重的百分比变化。使用Tukey-Kramer多重比较调整来控制实验方面的误差率，以在重复测量方差分析(ANOVA)中进行治疗组比较。*为p<0.0001vs对照+IgG(第4-6天)；

为p<0.0001vs GDF15+GDF15_001(第4-6天)。

图5描绘了示出GDF15_001逆转GDF15诱导的脂肪组织量损失的能力的图。在第15天用AAV人GDF15注射健康雄性C57BL6N小鼠，随后从第0天开始施用第一mAb剂量。用GDF15_001(30mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照进行的mAb治疗持续6天。通过磁共振成像(MRI)在第6天测量身体组成。值为平均值±SEM。n＝8只/组。用ANOVA执行统计学分析。*为p<0.0001vs对照+IgG；

为p<0.01vs GDF15+GDF15_001。

图6描绘了示出GDF15_001逆转GDF15诱导的无脂肪组织量损失的能力的曲线图。在第15天用AAV人GDF15注射健康雄性C57BL6N小鼠，随后从第0天开始施用第一mAb剂量。用GDF15_001(30mg/kg，皮下，每3天)或IgG对照进行的mAb治疗持续6天。通过MRI在第6天测量身体组成。值为平均值±SEM。n＝8只/组。用ANOVA执行统计学分析。*p<0.01vs对照+IgG；

p<0.01vs GDF15+GDF15_001。

图7描绘了示出在健康雄性C57BL6N小鼠中进行AAV鼠GDF15注射之后的鼠血浆GDF15浓度的曲线图。通过ELISA(R&D系统MGD150)在AAV注射之后的9天(对应于图5中的第9天)测量血浆GDF15。水平线表示平均值。n＝6只/组。通过使用Satterthwaite调整用于不等方差的t检验在治疗之间比较平均血浆GDF15水平。*为p<0.001vs对照。

图8示出了描绘GDF15_001在健康小鼠中逆转GDF15诱导的体重损失的能力的曲线图。箭头指向AAV鼠GDF15注射(第0天)以及第一mAb剂量(第11天)的时间。用GDF15_001(30mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照治疗健康雄性C57BL6N小鼠。值为平均值±SEM。n＝10只/组。使用具有非结构化协方差结构的重复ANOVA比较在给药期间的第12-16天中治疗组之间的基线体重百分比。在存在通过时间相互作用进行统计上显著的治疗的情况下，使用适用于完全随机化设计的ANOVA针对基线体重百分比在第16天进行治疗组之间的比较。*为在第16天p<0.0001vs对照+IgG；

为在第16天p<0.0001vs hGDF15+PF-06946860。

图9示出了描绘GDF15_001在健康小鼠中在GDF15治疗之后提高食物摄取的能力的图。用GDF15_001(30mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照治疗健康雄性C57BL6N小鼠。每天测量食物摄取，并且计算累积食物摄取。值为平均值±SEM。n＝8-10只/组。使用ANOVA以通过使用Bonferroni多重比较调节针对第11天-第16天的累积食物摄取进行治疗组比较。*为p<0.001vs对照+IgG；

为p<0.001vs对照+GDF15_001；p＝0.0505GDF15+GDF15_001vs GDF15+IgG。

图10示出了描绘GDF15_001在HT-1080(人纤维肉瘤细胞系)荷瘤小鼠中逆转体重损失的能力的图。箭头指向HT-1080细胞皮下植入(第13天)以及第一mAb剂量(第0天)的时间。用GDF15_001(10mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照来处理雌性重症联合免疫缺陷小鼠。值为平均值±SEM。n＝9-10只/组。使用具有自回归(1)协方差结构的重复测量ANOVA来比较在给药期间的第9-11天中(其中疾病已稳定，并且动物未由于体重损失而开始退出)处理组之间的来自基线重量的百分比变化。*＝p<0.0001HT-1080+IgG vs NTB+PBS和HT-1080+GDF15_001(第9-11天)。

图11示出了描绘GDF15_001在HT-1080(人纤维肉瘤细胞系)荷瘤小鼠中逆转脂肪量损失的能力的图。在第13天将雌性重症联合免疫缺陷小鼠(皮下)植入HT-1080细胞，随后从第0天开始施用第一mAb剂量。用GDF15_001(10mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照进行的mAb处理持续18天。通过回声MRI在第18天测量身体组成。值为平均值±SEM。n＝9-10只/组。用ANOVA执行统计学分析。*＝p<0.0001HT-1080+IgG vs NTB+PBS和HT-1080+GDF15_001。

图12示出了描绘GDF15_001在HT-1080(人纤维肉瘤细胞系)荷瘤小鼠中逆转无肿瘤无脂肪组织质量损失的能力的图。在第-13天将雌性重症联合免疫缺陷小鼠(皮下)植入HT-1080细胞，随后从第0天开始施用第一mAb剂量。用GDF15_001(10mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照进行的mAb处理持续18天。通过回声MRI在第18天测量身体组成。值为平均值±SEM。n＝9-10只/组。用ANOVA执行统计学分析。*＝p<0.001HT-1080+IgG vs NTB+PBS；

图13示出了描绘GDF15_001在HT-1080(人纤维肉瘤细胞系)荷瘤小鼠中延长存活期的能力的图。在第13天将雌性重症联合免疫缺陷小鼠(皮下)植入HT-1080细胞，随后从第0天开始施用第一mAb剂量。用GDF15_001(10mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照进行的mAb处理持续进行，直至死亡或安乐死(根据机构动物照顾与使用委员会准则由健康状况不佳和/或>30％体重损失确定)。n＝9-10只/组。使用对数秩统计将Kaplan-Meier存活曲线调整为符合失效时间数据以比较处理组。*为p<0.0001vs HT-1080+GDF15_001组。

图14示出了描绘饲养于温度适中条件(86°F)下的HT-1080(人纤维肉瘤细胞系)荷瘤小鼠中的人血浆GDF15浓度的图。在第13天将雌性重症联合免疫缺陷小鼠(皮下)植入HT-1080细胞，随后从第0天开始施用第一mAb(IgG对照，10mg/kg，SC，Q3D)剂量。经由ELISA(R&D系统MGD150)在第18天测量血浆GDF15。水平线表示平均值。n＝7。

图15示出了描绘GDF15_001在饲养于温度适中条件(86°F)下的HT-1080(人纤维肉瘤细胞系)荷瘤小鼠中逆转体重损失的能力的图。箭头指向HT-1080细胞皮下植入(第-13天)以及第一mAb剂量(第0天)的时间。用GDF15_001(10mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照处理雌性重症联合免疫缺陷小鼠。值为平均值±SEM。n＝10只/组。使用具有非结构化协方差结构的重复测量ANOVA比较给药期间的第1-13天处理组之间的基线体重百分比，随后使用ANOVA在第7天和第13天的处理组之间进行比较。然后以使用来自ANOVA的方差综合估计的t检验来测试处理组之间的感兴趣的比较。使用Bonferroni多重比较调节来控制实验方面的误差率，以进行处理组比较。*＝p<0.0001vs NTB+IgG和HT-1080+GDF15_001(第7天及第13天)。

图16示出了描绘PA-1065(来自胰腺肿瘤肝转移)荷瘤小鼠中的人血浆GDF15浓度的图。在第18天将雌性重症联合免疫缺陷小鼠(皮下)植入PA-0165肿瘤组织，随后从第0天开始施用第一mAb(IgG对照，10mg/kg，SC，Q3D)剂量。经由ELISA(R&D系统MGD150)在第27天测量血浆GDF15。水平线表示平均值。n＝14。

图17示出了描绘GDF15_001在PA-0165(来自人胰腺肿瘤肝转移)荷瘤小鼠中预防体重损失的能力的图。箭头指向PA-0165肿瘤组织皮下植入(第18天)以及第一mAb剂量(第0天)的时间。用GDF15_001(10mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照处理雌性重症联合免疫缺陷小鼠。值为平均值±SEM。n＝10-17只/组。使用具有非结构化协方差结构的重复测量方差分析比较给药期间第10-16天处理组之间的基线体重百分比。在存在通过时间相互作用进行统计上显著的处理的情况下，以使用来自重复测量ANOVA的方差综合估计的t检验在第16天进行处理组之间的比较。使用Bonferroni多重比较调节来控制实验方面的误差率，以进行处理组比较。*＝p<0.0001NTB+PBS和PA-0165+GDF15_001。

图18示出了描绘GDF15_001在PA-1065(来自人胰腺肿瘤肝转移)荷瘤小鼠中延长存活期的能力的图。在从第0天开始施用第一mAb剂量之前的18天将雌性重症联合免疫缺陷小鼠(皮下)植入PA-0165肿瘤组织。用GDF15_001(10mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照进行的mAb处理持续进行，直至死亡或安乐死(根据机构动物照顾与使用委员会准则由健康状况不佳和/或>30％体重损失确定)。n＝17只/组。使用对数秩统计将Kaplan-Meier存活曲线调整为符合失效时间数据以比较处理组之间的存活率。*为p<0.01vs PA-0165+GDF15_001。

图19示出了描绘在温度适中条件(86°F)下的RENCA(小鼠肾腺癌细胞系)荷瘤小鼠中的小鼠血浆GDF15浓度的曲线图。将雌性Balb/c小鼠(皮下)植入RENCA细胞，并且经由ELISA(R&D系统MGD150)在研究结束时(对应于图17)测量血浆GDF15。值为平均值。n＝10-12只/组。具有用于非齐性方差的Kenward-Roger调节的ANOVA用于使用Tukey-Kramer多重比较调节以控制实验方面的误差率进行处理组之间的累积食物摄取量以及自然对数转化血浆GDF15比较。针对自然对数转化GDF15平均值以及95％置信区间估计，产生几何平均数。使用Shapiro-Wilks检验以及Q-Q图评价了所有反应变量以满足正态性假设。*为p<0.0001(与NTB+载体存在差异)，

为p<0.0001(与NTB+索拉非尼存在差异)，

为p<0.01vs RENCA+索拉非尼+IgG。

图20示出了描绘GDF15_001在用抗癌剂处理并饲养于温度适中条件(86°F)下的RENCA(小鼠肾腺癌细胞系)荷瘤小鼠中逆转体重损失的能力的图。箭头指向RENCA细胞皮下植入(第12天)、第一索拉非尼剂量(第2天)以及第一mAb剂量(第0天)的时间。用索拉非尼(15mg/kg，PO，QD)和GDF15_001(10mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照处理雌性Balb/c小鼠。值为平均值±SEM。n＝10-12只/组。使用具有非齐性自回归(1)协方差结构的重复测量ANOVA比较给药期间第3-7天和第13-17天处理组之间从基线体重的百分比变化。使用Tukey-Kramer多重比较调节来控制实验方面的误差率，以在重复测量ANOVA中进行处理组比较。**为p<0.0001(与NTB+载体存在差异)(第3-7天)；*为p<0.0001(与NTB+索拉非尼存在差异)(第13-17天)；相比，

为p<0.0001(与RENCA+索拉非尼+GDF15_001存在差异)(第13-17天)。

图21示出了描绘GDF15_001在用抗癌剂处理并饲养于温度适中条件(86°F)下的RENCA(小鼠肾腺癌细胞系)荷瘤小鼠中延长存活期的能力的图。在施用第一索拉非尼剂量前10天，将雌性Balb/c小鼠(皮下)植入RENCA细胞，然后在随后的2天(对应于第0天)施用第一mAb剂量。索拉非尼(15mg/kg，PO，QD)以及用GDF15_001(10mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照进行的mAb处理持续进行，直至死亡或安乐死(根据机构动物照顾与使用委员会准则由健康状况不佳和/或>30％体重损失确定)。n＝10-12只/组。使用对数秩统计调整Kaplan-Meier存活曲线以符合失效时间数据以比较处理组之间的存活率。*为p<0.01vs RENCA+索拉非尼+GDF15_001。

图22示出了描绘NSX-26115(来自人非小细胞肺癌腺癌)荷瘤小鼠中的人血浆GDF15浓度的图。将雌性重症联合免疫缺陷小鼠(皮下)植入NSX-26115肿瘤组织，并且经由ELISA(R&D系统DGD150)在研究结束时(对应于图20)测量血浆GDF15。n＝10-12只/组。使用具有用于非齐性方差的Kenward-Roger调节的ANOVA比较不同处理组之间血浆中的GDF15水平。使用直方图以及Shapiro-Wilk检验评估正态性，并且使用Levene检验评估方差齐性。使用Tukey-Kramer方法调整处理组的成对比较以进行多重比较。*为p<0.01vs所有其它组。

图23示出了描绘GDF15_001在用或未用抗癌剂处理的NSX-26115(来自人非小细胞肺癌腺癌)荷瘤小鼠中逆转体重损失的能力的图。箭头指向NSX-26115肿瘤组织皮下植入(第30天)、第一顺铂剂量(第0天)和第一mAb剂量(第0天)的时间。用顺铂(5mg/kg，IP，Q7D)和/或GDF15_001(10mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照处理雌性重症联合免疫缺陷小鼠。值为平均值±SEM。n＝10-12只/组。具有一阶自回归协方差结构的重复ANOVA用于使用来自第17天-第19天的数据比较处理组之间随时间的体重百分比变化。此时，疾病处于稳定状态，处理与日期之间无显著的相互影响。对于偏度及峰度，使用Mardia检验评估多变量正态性。如通过给药方案所告知，在第10天进行就处理而言的单向ANOVA以评估最大顺铂效果日的处理组之间的差异。使用Tukey-Kramer方法调整处理组的所有成对比较以进行多重比较。*为p<0.0001vs NTB+载体(第17-19天)；

为p<0.0001vs NSX-26115+GDF15_001(第17-19天)；

为p<0.001vs NTB+顺铂(第17-19天)；§为p<0.0001vs NSX-26115+顺铂+GDF15_001(第17-19天)；

为p<0.01vs NTB+载体(第10天)；**为p<0.0001vs NSX-26115+IgG(第10天)。

图24示出了描绘GDF15_001在用抗癌剂处理的NSX-26115(来自人非小细胞肺癌腺癌)荷瘤小鼠中延长存活期的能力的图。在第一顺铂和mAb给药(对应于第0天)前30天将雌性重症联合免疫缺陷小鼠(皮下)植入NSX-26115肿瘤组织。顺铂(5mg/kg，IP，Q7D)以及用GDF15_001(10mg/kg，SC，Q3D)或IgG对照进行的mAb处理持续进行，直至死亡或安乐死(根据机构动物照顾与使用委员会准则由健康状况不佳和/或>30％体重损失确定)。n＝10-12只/组。使用具有对数秩检验的Kaplan-Meier存活曲线比较各组之间的存活期至早于预期的安乐死。*为p<0.0001vs NSX-26115+顺铂+GDF15_001。

图25示出了表明在给药间隔期间能够在对象中将游离GDF15水平降低至小于0.5ng/mL的GDF15_001每周皮下剂量作为对象中起始游离GDF15水平的函数的图。

图26示出了表明在给药间隔期间能够在对象中将游离GDF15水平降低至小于0.5ng/mL的GDF15_001每周皮下剂量作为对象中起始游离GDF15水平的函数的图。

图27示出了表明在给药间隔期间能够在对象中将游离GDF15水平降低至小于0.5ng/mL的GDF15_001每周皮下剂量作为对象中起始游离GDF15水平的函数的图。

图28提供了示出对应于本发明的GDF15抗体的SEQ ID NO的表。

图29描绘了概述抗GDF15处理(实心三角形)、抗CD40抗体处理(空心圆)以及组合处理(倒空心三角形)的结果的图。MHCII表达水平表示为肿瘤浸润巨噬细胞群的平均荧光强度(MFI)。

图30描绘了概述抗GDF15处理(实心三角形)、抗CD40抗体处理(空心圆)以及组合处理(空心三角形)的结果的图。

图31描绘了概述抗GDF15处理(倒置实心三角形)、抗CD40抗体处理(空心三角形)以及组合处理(实心正方形)的结果的图。

图32描绘了概述抗GD15_297抗体处理(空心圆)以及抗GD15_001抗体处理(空心三角形)的结果的图。

具体实施方式

本发明提供了抗体及其抗原结合片段，其特异性结合GDF15并且降低或抑制GDF15活性，包括但不限于GDF15与GDNF家族受体α样蛋白(GFRAL)相互作用的能力。本发明还提供了用于制作、制备或生产GDF15抗体的工艺。本发明的抗体可用于由GDF15活性介导或与GDF15活性相关的失调或病症(包括但不限于以GDF15为特征的高增生性失调、肌肉质量损失、体重减少、脂肪重量减少、食物摄取减少等)的诊断、预防和/或治疗。本发明进一步涵盖抗体的表达、以及包括本发明抗体或其抗原结合片段的组合物(如用于抗体使用的药物)的制备和制造。

提供了结合GDF15或其抗原结合部分的多核苷酸编码抗体。还提供了多核苷酸编码抗体重链或轻链或二者。提供了表达抗GDF15抗体的宿主细胞。提供了使用GDF15抗体的治疗方法。此类方法包括但不限于治疗与GDF15表达和/或结合GFRAL的GDF15相关或由GDF15表达和/或结合GFRAL的GDF15介导的疾病(包括但不限于炎症及免疫疾病以及高增生性失调)的方法。

本文所用的各部分标题仅为组织目的，而不应被解释为是对所述主题的限制。

本文所引用的所有参考文献(包括专利申请、专利出版物、以及Genbank登录号)均通过引用的形式并入本文，如同每一单独参考文献均被具体地且单独地表明通过引用的方式整体并入。

本领域技术人员通常充分理解并普遍使用常规方法学采用本文所述或所参考的技术及程序，如例如以下文献中所述的广泛利用的方法学：Sambrook等，MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等主编，(2003))；the series METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)：PCR 2:APRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson、B.D.Hames和G.R.Taylor主编，(1995))，Harlow以及Lane主编，(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney主编，(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait主编，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana出版社；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis主编，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)主编，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather以及P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths、以及D.G.Newell主编，1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir以及C.C.Blackwell主编)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos主编，1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction，(Mullis等主编，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等主编，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.主编，IRL出版社，1988-1989)；MonoclonalAntibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean主编，Oxford UniversityPress，2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold SpringHarbor Laboratory Press，1999))；The Antibodies(M.Zanetti以及J.D.Capra主编，Harwood Academic Publishers，1995)；以及Cancer:Principles and Practice ofOncology(V.T.DeVita等主编，J.B.Lippincott公司，1993)；以及它们更新后的版本。

抗体

“抗体”或“Ab”是能够通过至少一个抗原识别位点识别并结合特异性靶或抗原(Ag)(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子，该至少一个抗原识别位点位于免疫球蛋白分子的可变区中。如本文所用，术语“抗体”可涵盖任何类型的抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、保持特异性结合给定抗原(例如GDF15)的能力的完整抗体的抗原结合片段(或部分)。

术语“抗原”是指用于有免疫能力的脊椎动物的免疫作用以产生识别Ag的抗体或筛选表达文库(例如噬菌体、酵母或核糖体展示文库等)的分子实体。此处，Ag具有更广泛的意义，并且通常旨在包括由Ab特异性识别的靶分子，因此包括在免疫过程中用于提高Ab或在文库筛选中用于选择Ab的分子的片段或模拟物。因此，对于结合GDF15的本发明的抗体，来自哺乳动物物种的全长GDF15(例如人、猴、小鼠以及大鼠GDF15)(包括单体及多体，如其二聚体、三聚体等)、以及截短的及其它GDF15变体被称为抗原。

抗体的“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原的能力(优选具有基本上相同的结合亲和力)的全长抗体的片段。抗原结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL以及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含两个通过铰链区处的二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，1989Nature 341:544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)、二硫键连接的Fvs(dsFv)、以及抗独特型(抗Id)抗体及胞内抗体。此外，虽然Fv片段的两个结构域(VL及VH)由不同基因编码，它们可利用重组方法通过合成接头接合，该合成接头使它们能够成为单个蛋白质链，其中VL及VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见例如Bird等，Science 242:423-426(1988)以及Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)。还涵盖其它形式的单链抗体，如双特异抗体。双特异抗体是二价的、双重的特异性抗体，其中VH及VL结构域在单个多肽链上表达，但使用过短的接头而不能在同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点(参见例如Holliger等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak等，1994，Structure 2:1121-1123)。

抗体“可变结构域”是指以单独或组合形式的抗体轻链的可变区(VL)或抗体重链的可变区(VH)。如本领域中已知，重链及轻链的可变区各由4个通过3个互补决定区(CDR)连接的框架区(FR)组成，并有助于形成抗体的抗原结合位点。

可根据Kabat、Chothia、Kabat与Chothia二者的累积、AbM、接触、North的定义和/或构象定义或本领域中熟知的任何CDR决定方法鉴定“互补决定区”(CDR)。参见例如：Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版(高变区)；Chothia等，1989，Nature 342:877-883(结构性环状结构)。可使用本领域中熟知的方法确定构成CDR的特定抗体中的氨基酸残基的相同性。CDR的AbM定义是Kabat与Chothia之间的折中并且使用Oxford Molecular的AbM抗体建模软件

CDR的“接触”定义是基于观察到的抗原接触，如MacCallum等，J.Mol.Biol.，262:732-745(1996)中所述。CDR的“构象”定义是基于对抗原结合作出焓贡献的残基(参见例如Makabe等，2008，J.Biol.Chem.，283:1156-1166)。North使用不同的优选CDR定义组识别经典CDR构象(North等，2011，J.Mol.Biol.406:228-256)。在另一方法(在本文中被称为CDR的“构象定义”)中，可将CDR的位置鉴定为对抗原结合作出焓贡献的残基(Makabe等，2008，J Biol.Chem.283:1156-1166)。其它CDR界限定义可不严格遵循上述方法之一，但与Kabat CDR的至少一部分重叠，尽管它们可依照特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现来进行缩短或延长。如本文所用，CDR可指通过本领域已知的任何途径(包括途径的组合)定义的CDR。本文所用的方法可利用根据这些途径中的任一种定义的CDR。对于含有多于一个CDR的任何给定实施方式，可根据Kabat、Chothia、North、扩展、AbM、接触和/或构象定义中的任一项限定CDR(或抗体的其它残基)。

“框架”(FR)残基是非CDR残基的抗体可变结构域残基。VH或VL结构域框架包含4个框架子区FR1、FR2、FR3和FR4，其中按以下结构散布着CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

如本领域中已知，抗体的“恒定区”是指处于单独或组合形式的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。

如本文中可互换地使用，术语“Fc区”、“Fc结构域”以及“Fc”是指与通过免疫球蛋白(Ig)分子的木瓜蛋白酶消化而获得的可结晶片段关联的Ig分子的部分。如本文所用，术语涉及排除第一恒定区免疫球蛋白结构域外的抗体的恒定区，并且进一步涉及该区的部分。因此，Fc是指IgA、IgD以及IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、以及IgE和IgM的最后3个恒定区免疫球蛋白结构域、以及这些结构域的柔性铰链N末端，或它们的部分。对于IgA和IgM，Fc可包含J链。

对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2以及Cγ3(C伽玛2以及C伽玛3)以及Cγ1(C伽玛1)与Cγ2(C伽玛2)之间的铰链。尽管Fc区的界限可能变化，人IgG重链Fc区通常被定义为包含其羧基末端的残基C226或P230，其中编号是根据Edelman等，1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1):78-85的EU索引，如Kabat等(1991)所述。通常，Fc结构域包含人IgG1恒定结构域氨基酸残基的约236至约447。SEQ ID NO:31中示出了示例性人野生型IgG1 Fc结构域氨基酸序列。Fc多肽可指孤立的该区域、或在抗体背景中的该区域、或其抗原结合部分、或Fc融合蛋白。

重链恒定结构域包含Fc区并且进一步包含CH1结构域及铰链以及IgG重链的CH2及CH3(以及任选地，IgA以及IgE的CH4)结构域。

在某些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含Fc结构域。Fc结构域可来源于IgA(例如IgA₁或IgA₂)、IgD、IgE、IgM、或IgG(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)。

“Fc融合”蛋白是其中一个或多个多肽可操作地连接至Fc多肽的蛋白质。Fc融合将免疫球蛋白的Fc区与融合伴侣组合。

“表位”是指抗体特异性结合的抗原的范围或区域，例如包含与抗体相互作用的残基的范围或区域。表位可以是线性的或构象的。

在其最详细的水平上，针对Ag与Ab之间的相互作用的表位可通过空间座标定义，这些空间座标定义了Ag-Ab相互作用中存在的原子接触以及关于它们对结合热力学的相对贡献的信息。在较不详细的水平上，表位的特征可以是限定Ag与Ab之间的原子接触的空间座标。在进一步较不详细的水平上，表位的特征可以是其包含的氨基酸残基，如通过具体准则定义，例如通过Ab与Ag中的原子(例如重原子，即非氢原子)之间的距离限定。在进一步不太详细的水平上，表位的特征可通过功能实现，例如通过与其它Ab的竞争结合实现。表位还可更一般地定义为包含氨基酸残基，因为氨基酸残基由另一氨基酸取代将改变Ab与Ag之间相互作用的特征(例如使用丙氨酸扫描)。

根据在不同详细水平上获得了取决于所用的表位作图方法的表位的描述和定义的事实，由此可在不同详细水平上类似地进行针对同一Ag上的不同Ab的表位的比较。

如果在氨基酸水平上描述的表位(例如根据X射线结构确定的表位)含有同一组氨基酸残基，则它们被称为相同。如果表位共有至少一个氨基酸，则表位被称为重叠。如果表位不共有氨基酸残基，则表位被称为单独的(独特的)。

如果对应抗体的结合是相互排除的(即一个抗体的结合排除另一抗体的同时或连续结合)，则特征为竞争结合的表位被称为重叠。如果抗原能够同时接纳两个对应抗体的结合，则表位被称为单独的(独特的)。

“优先结合”或“特异性结合”(在本文中可互换地使用)至表位的抗体是本领域熟知的术语，并且确定此类特异性或优先结合的方法也是本领域熟知的。如果分子与特定细胞或物质的反应或缔合比与另外的细胞或物质的反应或缔合更频繁、更迅速且具有更长的持续时间和/或更强的亲和力，则将其称为显示出“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体比结合其它物质以更强的亲和力、活动性、更容易和/或以更长的持续时间结合靶标，则其“特异性结合”或“优先结合”至靶标。例如，特异性或优先结合GDF15、PD-1或PD-L1表位的抗体是比其结合其它GDF15、PD-1或PD-L1表位或非GDF15、PD-1或PD-L1表位以更强的亲和力、活动性、更容易和/或以更长的持续时间结合该表位的抗体。一般地但并非必需地，提及结合意味着优先结合。“特异性结合”或“优先结合”包括化合物，例如蛋白质、核酸、抗体等，其识别并结合样品中的特异性分子，但基本上不识别或结合样品中的其它分子。例如，识别并结合样品中的同源配体或结合配偶体(例如结合肿瘤抗原的抗人肿瘤抗原抗体、结合PD-L1或PD-L2的PD-1分子等)但基本上不识别或结合样品中的其它分子的抗体或肽受体特异性结合该同源配体或结合配偶体。因此，在指定的测定条件下，指定的结合部分(例如抗体或其抗原结合部分或者受体或其配体结合部分)优先结合特定靶分子而不会以相当大的数量结合测试样品中存在的其它成分。

可使用各种测定形式选择特异性结合感兴趣的分子的抗体或肽。例如，固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BIAcore^TM(GE Healthcare，Piscataway，NJ)、荧光活化细胞分类(FACS)、Octet^TM(FortéBio公司，Inc.，Menlo Park，CA)以及蛋白质印迹分析是许多测定中的几种，其可用于鉴定与抗原或受体或其配体结合部分特异性反应(其与同源配体或结合配偶体特异性结合)的抗体。典型地，当平衡解离常数(K_D)为≤1μM、优选≤100nM、更优选≤10nM、甚至更优选≤100pM、又更优选≤10pM以及甚至更优选≤1pM时，特异性或选择性反应是至少两倍背景信号或噪声且更典型地是超过10倍背景，甚至更具体地，抗体被称作“特异性结合”抗原。

在本文中关于抗体所使用的术语“竞争”意味着第一抗体或其抗原结合部分与抗原的结合减少第二抗体或其抗原结合部分与同一抗原的后续结合。通常，第一抗体的结合造成位阻、构象变化或与共同表位(或其部分)的结合，从而减少第二抗体与同一抗原的结合。可使用标准竞争测定确定两个抗体是否相互竞争。一种用于抗体竞争的测定涉及使用Biacore技术，其可使用表面等离子体共振(SPR)技术、通常使用生物传感器系统(如BIACORE系统)测量相互作用的程度。例如，可以在体外竞争结合抑制测定中使用SPR来确定一个抗体抑制第二抗体的结合的能力。另一用于测量抗体竞争的测定使用基于ELISA的方法。

此外，国际专利申请号WO2003/48731中描述了用于基于抗体的竞争而将抗体“装箱(binning)”的高通量过程。如果一个抗体(或片段)减少了另一抗体(或片段)与GDF15的结合，则存在竞争。例如，可使用顺序结合竞争测定，其中顺序添加不同的抗体。可添加第一抗体以达到接近饱和的结合。然后，添加第二抗体。如果未检测到第二抗体与GDF15的结合，或与不存在第一抗体的平行测定(其值可以设置为100％)相比第二抗体与GDF15的结合明显减少(例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％减少)，则认为两个抗体相互竞争。

变体抗体可包含从上述特异性序列及片段进行的1、2、3、4、5、多达10、多达20、多达30或更多个氨基酸取代和/或缺失和/或插入。“缺失”变体可包含个别氨基酸的缺失、小组氨基酸(如2、3、4或5个氨基酸)的缺失、或较大氨基酸区域的缺失，如特异性氨基酸结构域或其它特征的缺失。“插入”变体可包含个别氨基酸的插入、小组氨基酸(如2、3、4或5个氨基酸)的插入、或较大氨基酸区域的插入，如特异性氨基酸结构域或其它特征的插入。“取代”变体优选涉及用一个或多个氨基酸置换相同数量的氨基酸并且作出保守氨基酸取代。例如，氨基酸可被具有类似特性的替代氨基酸(例如另一碱性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一带电氨基酸、另一亲水性氨基酸、另一疏水性氨基酸、另一极性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸)取代。可用于选择合适取代基的20种主要氨基酸的一些特性如下。

取代变体在抗体分子中移去至少一个氨基酸残基，并且在其位置插入不同的残基。用于取代诱变的最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑框架改变。表1中标题“保守取代”下示出了保守取代。如果这些取代导致生物学活性的改变，则可引入更多实质改变(命名为下文所示的“示例性取代”或如关于氨基酸类别进一步在下文所述的)并筛选产物。

表1氨基酸及取代

通过选择取代来完成对抗体的生物学特性的实质性修改，这些取代在其维持(a)取代区域中多肽主链的结构(例如作为β折叠或螺旋构象)、(b)在靶位点处分子的电荷或疏水性或(c)侧链的主体的效果上显著不同。基于共有的侧链特性将天然存在的残基分组：

i、非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

ii、极性无电荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

iii、酸性(带负电荷)：Asp、Glu；

iv、碱性(带正电荷)：Lys、Arg；

v、影响链取向的残基：Gly、Pro；以及

vi、芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。

通过将这些类别中的一种类别的成员更换为另一类别来作出非保守取代。

例如可作出的一种类型的取代是将抗体中的一个或多个半胱氨酸(其可为化学反应性的)改变为另一残基(如但不限于丙氨酸或丝氨酸)。例如，可存在非经典半胱氨酸的取代。取代可在可变结构域的CDR或框架区中或者在抗体的恒定区中作出。在一些实施方式中，半胱氨酸是经典的。一般也可用丝氨酸取代任何不涉及维持抗体的适当构象的半胱氨酸残基，以提高分子的氧化稳定性并避免异常交联。相反，特别是当抗体是抗体片段如Fv片段时，可向抗体添加半胱氨酸键以提高其稳定性。

在被称作“种系化(germlining)”的过程中，可使VH及VL序列中的某些氨基酸突变以匹配种系VH及VL序列中天然发现的氨基酸。具体而言，可使VH及VL序列中的框架区的氨基酸序列突变以匹配种系序列，以降低施用抗体时免疫原性的风险。如本文所用，术语“种系”是指抗体基因以及基因片段在经由生殖细胞从亲本传递至后代时的核苷酸序列及氨基酸序列。该种系序列不同于编码成熟B细胞中的抗体的核苷酸序列(其在B细胞成熟过程中通过重组及高突变事件被改变)。“利用”特定种系的抗体具有与该种系核苷酸序列或与其指定的氨基酸序列比对最接近的核苷酸或氨基酸序列。与种系序列相比，此类抗体频繁突变。人VH及VL基因的种系DNA序列在本领域中是已知的(参见例如“Vbase”人种系序列数据库；同样参见Kabat,E.A.等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版物第91-3242号；Tomlinson等，J.Mol.Biol.227:776-798，1992；以及Cox等，Eur.J.Immunol.24:827-836，1994)。

结合亲和力

抗体的结合亲和力可表示为K_D值，其是指特定抗原-抗体相互作用的解离速率。K_D是解离速率(也称为“off-rate(k_off)”)与缔合速率或“on-rate(k_on)”的比。因此，K_D等于k_off/k_on且被表示为摩尔浓度(M)，并且K_D越小，结合亲和力越强。可使用本领域中熟知的方法确定抗体的K_D值。一种用于测量Kd的示例性方法是表面等离子体共振(SPR)，其通常使用生物传感器系统，如

系统。BIAcore动力学分析包括分析来自芯片的抗原与固定化的分子(例如包括表位结合结构域的分子)在其表面上的结合及解离。另一用于确定抗体的Kd的方法是通过使用生物层干涉法，其通常使用OCTET技术(Octet QKe系统，ForteBio)。替代地或另外还可使用可从Sapidyne Instruments(Boise,Id)获得的KinExA(动力学排除测定)测定。

针对GDF15的抗体

本发明提供了抗GDF15抗体。抗GDF15抗体(优选地，高亲和力抗体)可在血浆以及多种组织区室中有效，其中据信GDF15作用于其靶细胞。本发明的抗体具有改变驱动与癌症、心力衰竭或COPD等相关的恶病质的发展及进展的途径的潜能。

中和或“阻断”抗体是指其与GDF15的结合干扰、限制或抑制GDF15或GDF15片段与GDF15受体(如GFRAL)或GDF15受体成分之间的相互作用和/或(ii)导致GDF15的至少一种生物学功能抑制的抗体。本文的其它部分描述了用于确定本发明抗体的中和作用的测定，并且在本领域中是熟知的。

如本文所用，术语“GDF15”包括人GDF15的变体、同型体、同源物、直系同源物以及旁系同源物。在本发明的一些方面，抗体与来自除人以外的物种的GDF15(如小鼠、大鼠或非人灵长类的GDF15)以及GDF15的不同形式交叉反应。在其它方面，抗体可完全特异于人GDF15，并且可能不表现出物种或其它类型的交叉反应性。如本文所用，术语GDF15是指天然存在的人GDF15，除非另外根据上下文规定。因此，“GDF15抗体”、“抗GDF15抗体”或其它类似名称意味着与GDF15类型配体或同种型或其片段或衍生物特异性地缔合、结合或反应的任何抗体(如本文所定义)。本文作为SEQ ID NO:1提出了由UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q99988.1表示的人GDF15的全长成熟形式。

不希望束缚于任何特定理论，在与GDF15相互作用后，GFRAL与原癌基因酪氨酸-蛋白激酶受体Ret(RET)相互作用并通过MAPK及AKT信号转导途径的活化诱导细胞信号转导。然后RET信号转导诱导或介导例如ERK、S6等的磷酸化。如本文所用，术语“GFRAL”包括人GFRAL的变体、同型体、同源物、直系同源物和旁系同源物。人GFRAL的全长成熟形式由UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q6UXV0表示。如本文所用，术语“RET”包括人RET的变体、同型体、同源物、直系同源物和旁系同源物。人RET的全长成熟形式由UniProtKB/Swiss-Prot登录号P07949表示。

GDF15的“生物学功能”或“生物学活性”意味着包括细胞损伤后调控组织中的炎性及细胞凋亡途径以及细胞的应激反应程序。GDF15的“生物学功能”或“生物学活性”包括介导增强：本领域中现在已知或以后所鉴定的恶病质、食物摄取降低、食欲降低、体重降低、体重损失、脂肪量降低、无脂肪重量降低、GFRAL的结合、RET的活化、ERK的磷酸化以及S6的磷酸化等。GDF15的生物学功能或生物学活性可以但不需要由GDF15与其同源受体GFRAL之间的相互作用介导。

本发明包括可调节GDF15的生物学活性的抗体或其抗原结合部分。即，本发明包括分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合GDF15并调节至少一种可检测的GDF15活性，使得抗体：(a)增加食物摄取；(b)增加食欲；(c)增加体重；(d)降低体重损失；(e)增加脂肪量；(f)增加无脂肪重量；(g)降低脂肪量损失；(h)降低无脂肪肌肉量损失；(i)减少GDF15与GFRAL的结合；(j)减少由RET介导的下游信号转导；(k)减少或抑制ERK的磷酸化；(l)减少或抑制S6的磷酸化；(m)减少MAPK信号转导途径的RET活化；(n)降低AKT-信号转导途径的RET活化；和/或(o)降低PLC-□1信号转导途径的活化。

在许多本领域公认的测定中，可使用共表达GFRAL及RET的HEK293或CHO细胞体外评估GDF15的生物学活性以及GDF15依赖性的信号转导活性。可使用基于荧光素酶的基因报告系统(例如PathDetect，Agilent Technologies)等测量在用GDF15刺激后MAPK途径的活化。还可使用基于均相时间分辨荧光技术的磷蛋白测定(Cisbio Inc.)作为正交途径以测量响应于GDF15与其受体的结合的MAPK及AKT途径(例如磷-ERK1/2)的活化。还可通过在不存在或存在增加浓度的抗GDF15抗体情况下将细胞与固定浓度的GDF15温育来评估中和抗体阻止GDF15依赖性的信号转导的能力。

在本发明的一个方面，本发明的GDF15抗体涵盖如下抗体：其与具有如SEQ ID NO:166所示的重链可变区的氨基酸序列以及如SEQ ID NO:163所示的轻链可变区的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段竞争以结合人GDF15和/或结合与上述抗体或其抗原结合片段相同的表位。

在本发明的一个方面，本发明的GDF15抗体涵盖抑制或减少GDF15与GFRAL的结合的抗体。

在一个方面，本发明涵盖如下的抗体：其在抑制GDF15与GFRAL的结合方面与具有如SEQ ID NO:166所述的重链可变区的氨基酸序列以及如SEQ ID NO:163所述的轻链可变区的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段竞争。

在本发明的一些方面，抗体或其抗原结合片段包含IgG1重链恒定区，例如如SEQID NO:164所示的GDF15重链。在其它方面，抗体或其抗原结合片段包含κ轻链恒定区，例如如SEQ ID NO:162所示的GDF15轻链。

表2提供了本发明的抗GDF15抗体的氨基酸(蛋白质)序列以及相关核酸(DNA)序列。如由Kabat和Chothia定义的抗GDF15 VH和抗GDF15 VL的CDR被阐述为单独的序列。

在一些方面，CDR包含SEQ ID NO:171、172、173、174、175和176。基于下文实施例1-10中所示的有利序列分析以及生物物理学谱数据，这些CDR序列体现了共有序列。这些CDR序列基于其序列、结合、热稳定性、在低pH和粘度谱下的稳定性而具有优势。

表2、GDF15肽以及抗GDF15抗体的序列。

在某些实施方式中，取代是人种系取代，其中(供体)CDR残基被置换为对应人种系(受体)残基以提高人氨基酸含量并潜在降低抗体的免疫原性，如例如美国专利申请公开号2017/0073395以及Proc.Nat.Acad.Sci.USA 112(50):15354-15359(Townsend等，2015)中所述。例如，如果使用人种系IGHV1-69*01框架并且比较示例性抗体GDF15_001VH(SEQ IDNO:166)，则GDF15_001抗体的HCDR-1(SEQ ID NO:32)与人种系IGHV1-69*01的比对如下：

位置

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

人种系IGHV1-69*01

G

T

F

S

Y

A

I

S

GDF15_001VH(SEQ ID NO:166)

G

Y

T

F

S

Y

N

I

D

对于氨基酸位置编号26、28、29、30、31、32和34(斜体)，人种系残基(受体)与对应GDF15_001残基(供体)相同，并且种系取代是不可能的。对于位置27、33和35(粗体且标有下划线)，人种系(受体)残基与对应GDF15_001(供体)残基是不同的。可将这些位置处的GDF15_001残基置换为对应人种系IGHV1-69*01残基，以进一步提高人残基含量。可对每一重链和轻链CDR进行相同的过程以在保存结合特征(例如表位结合、亲和力等)的同时提高人氨基酸残基的含量，同时将小鼠残基的含量最小化，由此降低对人体中抗体的任何潜在免疫原性(例如人抗小鼠抗体(HAMA)免疫应答)。

美国专利申请公开第2017/0073395号以及Proc.Natl.Acad.Sci.USA.112(50):15354-15359(Townsend等，2015)中详细描述了用于引入抗体CDR中的人种系残基的方法和文库，并且二者以引用的形式整体并入本文。

抗GDF15抗体或其抗原结合片段可包含VH框架，该VH框架包含人种系VH框架序列。在一些方面，可使用来自以下种系的VH框架：IGHV1-2*02、IGHV1-3*01、IGHV1-46*01、IGHV1-69*01、IGHV1-69*02、IGHV1-8*01、IGHV3-13*01、IGHV3-23*01、IGHV3-23*04、IGHV3-30*01、IGHV3-30*18、IGHV5-10-1*01、IGHV5-10-1*04或IGHV5-51*01(种系名称基于IMGT种系定义)。在一些方面，可使用来自以下种系的VL框架：IGKV1-12*01、IGKV1-13*02、IGKV1-33*01、IGKV1-39*01、IGKV1-5*01、IGKV3-11*01、IGKV3-15*01、IGKV3-20*01、IGKV3D-20*02以及IGKV4-1*01(种系名称基于IMGT种系定义)。可从多种公用数据库(如V-base、IMGT、NCBI或Abysis)获得人种系框架的序列。

抗GDF15抗体或其抗原结合片段可包含VL框架，该VL框架包含人种系VL框架序列。VL框架可包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，同时仍保持在功能及结构上与其所来源于的种系的相似性。在一些方面，VL框架与其所来源于的人种系序列至少53％、58％、60％、63％、71％、72％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含VL框架，该VL框架包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个与人种系VL框架序列有关的氨基酸取代、添加或缺失。在一些方面，所述1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、添加或缺失仅位于框架区中。在一些方面，百分比(％)相同性是基于与排除本文定义为CDR的那些部分的VL的相似性。

抗GDF15抗体或其抗原结合片段可包含VH框架，该VH框架包含人种系VH框架序列。VH框架可包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，同时仍保持在功能及结构上与其所来源于的种系的相似性。在一些方面，VH框架与其所来源于的人种系序列至少72％、74％、75％、77％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含VH框架，该VH框架包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个与人种系VH框架序列有关的氨基酸取代、添加或缺失。在一些方面，所述1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、添加或缺失仅位于框架区中。在一些方面，％相同性是基于与排除本文定义为CDR的那些部分的VH的相似性。

抗GDF15抗体或其抗原结合片段可包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。VH可包含与SEQ ID NO:21、34、44、53、60、68、73、80、86、93、99、106、112、120、127、136、142、148、155、161和166的氨基酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。VH可包含SEQ ID NO:21、34、44、53、60、68、73、80、86、93、99、106、112、120、127、136、142、148、155、161和166的氨基酸序列。

抗体或其抗原结合片段可包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。VL可包含与SEQ ID NO:11、30、39、49、56、64、71、77、83、90、96、103、109、115、123、131、139、144、151、158和163的氨基酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。VL可包含SEQ ID NO:11、30、39、49、56、64、71、77、83、90、96、103、109、115、123、131、139、144、151、158和163的氨基酸序列。

在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO:11、30、39、49、56、64、71、77、83、90、96、103、109、115、123、131、139、144、151、158以及163中的至少一项的氨基酸序列中所示的LCDR-1、LCDR-2和LCDR-3。

在一些方面，抗体或其抗原结合部分还包含如SEQ ID NO:21、34、44、53、60、68、73、80、86、93、99、106、112、120、127、136、142、148、155、161以及166中的至少一项的氨基酸序列中所示的HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3。

在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO:163的氨基酸序列中所示的LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3，以及如SEQ ID NO:166的氨基酸序列中所示的HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3。

抗体或其抗原结合部分可包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:163的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。VL可包含与SEQ ID NO:163的氨基酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。VL可包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列。

抗体或其抗原结合部分可包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:166的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。VH可包含与SEQ ID NO:166的氨基酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。VH可包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列。

抗体或抗原结合片段可包含HC，该HC包含与SEQ ID NO:164的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。HC可包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列。

抗体或抗原结合片段可包含LC，该LC包含与SEQ ID NO:162至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。LC可包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列。

PD-1轴结合拮抗剂

如本文所用的术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指如下的分子，其抑制PD-1轴结合配偶体与其结合配偶体中的一种或多种的相互作用以便消除由PD-1信号转导轴(也称为“PD-1/PD-L途径”或“PD-1/PD-L信号转导途径”)上的信号转导所产生的T细胞功能障碍，从而恢复或增强T细胞功能。如本文所用，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂以及PD-L2结合拮抗剂。在一些实施方式中，PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在一些实施方式中，PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方式中，PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-L2抗体。

在一些方面，PD-1轴拮抗剂、PD-1轴结合拮抗剂、PD-1结合拮抗剂以及抗PD-L1抗体不包括阿维鲁单抗。即，任选地，抑制PD-1轴信号转导轴的制剂排除阿维鲁单抗。

用于本发明的治疗方法、药物及用途中的示例性PD-1轴结合拮抗剂包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、具有或不具有如国际专利公开号WO2010/027827和WO2011/066342中所述的信号序列的AMP-224、如国际专利公开号WO2016/092419中所公开的mAb7及mAb15、以及如WO2013/079174中所述的阿维鲁单抗。WO2010/027827、WO2011/066342、WO2016/092419以及WO2013/079174的公开以引用的形式整体并入本文。表3列出了所例示的PD-1轴结合拮抗剂中的一些的多种序列。

表3

如本文所用的术语“PD-1结合拮抗剂”是指如下的分子，其特异性结合PD-1并减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其结合配偶体(如PD-L1、PD-L2)中的一种或多种的相互作用产生的信号转导。在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其结合配偶体的结合的分子。在具体方面，PD-1结合拮抗剂特异性结合PD-1并由此抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗PD-1抗体、其抗原结合片段、免疫粘合素、融合蛋白、寡肽以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用产生的信号转导的其它分子。在一个实施方式中，PD-1结合拮抗剂特异性结合PD-1并由此减弱由或通过T淋巴细胞上所表达的细胞表面蛋白质介导的阴性共刺激信号(由通过PD-1进行的信号转导介导)，从而使功能障碍性T细胞的功能不太正常。在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、斯巴达珠单抗、替雷利珠单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-554、西米普利单抗和PF-06801591。

PF-06801951也被称为萨善利单抗(CAS登记号2206792-50-7)、RN888，并且公开于国际专利公开号WO 2016/092419中，其以引用的形式整体并入本文。萨善利单抗是人源化的铰链区稳定化IgG4-κ单克隆抗体。下表4中示出了萨善利单抗(PF-06801951；RN888)的氨基酸序列。

在具体方面，PD-1结合拮抗剂是纳武单抗。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂是派姆单抗。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂是匹地利珠单抗。

如本文所用的术语“PD-L1结合拮抗剂”是指如下的分子，其特异性结合PD-L1并减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合配偶体(如PD-1、B7-1)中的一种或多种的相互作用产生的信号转导。在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体的结合的分子。在一些方面，PD-L1结合拮抗剂不包括阿维鲁单抗。在具体方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和/或B7-1的结合。在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体、其抗原结合片段、免疫粘合素、融合蛋白、寡肽以及减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合配偶体(如PD-1、B7-1)中的一种或多种的相互作用产生的信号转导的其它分子。在一个实施方式中，PD-L1结合拮抗剂减弱由或通过T淋巴细胞上所表达的细胞表面蛋白质介导的阴性共刺激信号(由通过PD-L1进行的信号转导介导)，从而使功能障碍性T细胞的功能不太正常。在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在具体方面，抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗(在国际专利公开号WO2013/079174中公开为A09-246-2)。在一些方面，PD-1轴拮抗剂不包括阿维鲁单抗。

在另一具体方面，抗PD-L1抗体是阿替唑利单抗。在另一具体方面，抗PD-L1抗体是得瓦鲁单抗。在另一具体方面，抗PD-L1抗体是BMS-936559(MDX-1105)。

如本文所用，抗人PD-L1抗体是指特异性结合成熟人PD-L1或其部分的抗体，其中成熟人PD-L1分子由以下序列的氨基酸19-290组成：

表4、抗人PD-L1单克隆抗体萨善利单抗(PF-06801951、RN888、mAb7)序列

如本文所用的术语“PD-L2结合拮抗剂”是指如下的分子，其特异性结合PD-L2并减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其结合配偶体(如PD-1)中的一种或多种的相互作用产生的信号转导。在一些实施方式中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合配偶体的结合的分子。在具体方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1的结合。在一些实施方式中，PD-L2拮抗剂包括抗PD-L2抗体、其抗原结合片段、免疫粘合素、融合蛋白、寡肽以及特异性结合PD-L2并减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其结合配偶体(如PD-1)中的一种或多种的相互作用产生的信号转导的其它分子。在一个实施方式中，PD-L2结合拮抗剂减弱由或通过T淋巴细胞上所表达的细胞表面蛋白质介导的阴性共刺激信号(由通过PD-L2进行的信号转导介导)，从而使功能障碍性T细胞的功能不太正常。在一些实施方式中，PD-L2结合拮抗剂是PD-L2免疫粘合素。

核酸

本发明还提供了编码本发明的任一抗体(包括本文所述的抗体部分以及经修饰的抗体)的多核苷酸。本发明还提供了制备本文所述的任一多核苷酸的方法。可通过本领域已知的程序来制备并表达多核苷酸。

可使用标准测序技术来确定期望的抗体或其抗原结合片段以及编码此类抗体或其抗原结合片段的核酸的序列。可将编码期望的抗体或其抗原结合片段的核酸序列插入多种载体(如克隆和表达载体)中用于重组生产和表征。可将编码重链或重链的抗原结合片段的核酸与编码轻链或轻链的抗原结合片段的核酸克隆至同一载体或不同载体中。

在一个方面，本发明提供了编码以下GDF15抗体及其抗原结合部分中任一种的氨基酸序列的多核苷酸：GDF15_001、GDF15_002、GDF15_003、GDF15_004、GDF15_005、GDF15_006、GDF15_007、GDF15_008、GDF15_009、GDF15_010、GDF15_011、GDF15_012、GDF15_013、GDF15_014、GDF15_015、GDF15_017、GDF15_018、GDF15_020、GDF15_021、GDF15_022、GDF15_100、GDF15_200、GDF15_297、GDF15_301、GDF15-470。

本发明提供了编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，该一种或多种蛋白质包含选自以下的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:21、34、44、53、60、68、73、80、86、93、99、106、112、120、127、136、142、148、155、161、166、11、30、39、49、56、64、71、77、83、90、96、103、109、115、123、131、139、144、151、158、163、166、183、187、189、191、193和195。

本发明提供了包含如SEQ ID NO:167、168、169和170中的一种或多种所示的核酸序列的多核苷酸。本发明提供了包含如SEQ ID NO:167所示的核酸序列的多核苷酸。本发明提供了包含如SEQ ID NO:168所示的核酸序列的多核苷酸。本发明提供了包含如SEQ IDNO:169所示的核酸序列的多核苷酸。本发明提供了包含如SEQ ID NO:170所示的核酸序列多核苷酸。由于遗传密码的简并，本发明还提供了核酸序列，其中在SEQ ID NO:170的位置编号1344处的核苷酸可以是A、C、G、T，和/或在位置编号1347处的核苷酸可以是A、C、G、T。SEQ ID NO:170中所提供的最后两个密码子仍然分别编码脯氨酸以及甘氨酸。

本发明提供了多核苷酸，其包含编码GDF15_001的VH结构域的保藏在ATCC且具有登录号PTA-125038的质粒的插入物的核酸序列。本发明还提供了多核苷酸，其包含编码GDF15_001的VL结构域的保藏在ATCC且具有登录号PTA-125039的质粒的插入物的核酸序列。此外，本发明提供了多肽，其包含由编码GDF15_001的VH结构域的保藏在ATCC且具有登录号PTA-125038的质粒的DNA插入物编码的氨基酸序列。本发明还提供了多肽，其包含由编码GDF15_001的VL结构域的保藏在ATCC且具有登录号PTA-125039的质粒的插入物编码的氨基酸序列。

本发明还提供了一种多核苷酸，其包含：保藏在ATCC且具有登录号PTA-125038的质粒的插入物的核酸序列，其编码GDF15_001的VH结构域；以及保藏在ATCC且具有登录号PTA-125039的质粒的插入物的核酸序列，其编码GDF15_001的VL结构域。

在另一方面，本发明提供了编码抗GDF15抗体的多核苷酸及其变体，其中此类变体多核苷酸与本文所公开或提及的任何核酸序列共用至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％核酸序列相同性。这些量不意味着为限制性的，并且所述百分比之间的增量被具体设想为本公开的一部分。

本发明提供了由本文所述的核酸分子编码的多肽。

在一个实施方式中，VH及VL结构域或其抗原结合部分或全长HC或LC是由单独的多核苷酸编码。或者，VH及VL二者或其抗原结合部分或者HC及LC是由单个多核苷酸编码。

本公开还包括与任何此类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子以及mRNA分子，这些HnRNA分子含有内含子并以一对一的方式对应于DNA分子，这些mRNA分子不含有内含子。额外的编码或非编码序列可以但不需要存在于本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不需要连接至其它分子和/或支持材料。

多核苷酸可包含编码抗体或其部分的核酸序列，或者可包含此类序列的变体。多核苷酸变体含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得相对于天然抗体分子，所编码多肽的结合特征未减少。对由变体核酸序列编码的多肽的结合特征的影响一般可如本文所述进行评估。在一些实施方式中，多核苷酸变体表现出与编码不包含任何取代、添加、缺失和/或插入的原始(亲本)抗体或其部分的多核苷酸序列的至少约70％相同性，在一些实施方式中至少约80％相同性，在一些实施方式中至少约90％相同性，并且在一些实施方式中至少约95％相同性。这些百分比相同性并非意味着为限制性的，并且所述百分比之间的增量被具体设想为本公开的一部分。

如果当如下所述进行比对以获得最大对应时，两条多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则将两序列称为“相同的”。两序列之间的比较通常是通过在比较窗上比较序列以鉴定并比较序列相似性的局部区域来进行。如本文所用的“比较窗”是指具有至少约20个连续位置、通常30至约75或40至约50个连续位置的片段，其中可在将序列与具有相同数目的连续位置的参比序列进行最佳比对之后对两序列进行比较。

可以利用生物信息学软件的

套件中的

程序(

Inc.，Madison，WI)使用默认参数进行用于比较的最佳序列比对。该程序体现数个比对方案，其描述于以下参考文献中：Dayhoff,M.O.，1978，A model of evolutionary change inproteins-Matrices for detecting distant relationships；Dayhoff,M.O.(主编)Atlasof Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，Washington DC，第5卷，第3增刊，第345-358页；Hein J.，1990，Unified Approach toAlignment and Phylogenes，第626-645页，Methods in Enzymology，第183卷，AcademicPress,Inc.，San Diego，CA；Higgins,D.G.以及Sharp,P.M.，1989，CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.以及Muller W.，1988，CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.，1971，Comb.Theor.11:105，Santou,N.、Nes,M.，1987，Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.以及Sokal,R.R.，1973，Numerical Taxonomy the Principles and Practice of NumericalTaxonomy，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur,W.J.以及Lipman,D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730。

在一些实施方式中，“序列相同性百分比”是通过在至少20个位置的比较窗口上比较两条最佳比对序列而确定，其中与用于两条序列的最佳比对的参比序列(其不包含添加或缺失)相比，多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分可包含20％或更少、通常5至15％或10-12％的添加或缺失(即缺口)。百分比是通过以下步骤进行计算：确定两条序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得出匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以参比序列中位置的总数目(即窗口大小)并将结果乘以100以得出序列相同性百分比。

多核苷酸变体也可以，或替代地与基因或其部分或其补体基本上同源。此类多核苷酸变体能够在适度严格的条件下与编码抗体(或互补序列)的天然存在的DNA序列杂交。

合适的“适度严格的条件”包括：在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在约50℃至65℃、5X SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)下杂交，过夜；然后在65℃下洗涤两次达20分钟，其中2X、0.5X以及0.2X SSC各含有0.1％SDS。

如本文所用，“高度严格的条件”或“高严格性条件”是：(1)采用低离子强度及高温进行洗涤，例如50℃下0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间，在42℃下采用变性剂如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃下采用50％甲酰胺、5X SSC、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5XDenhardt溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下在0.2X SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中以及在55℃下在50％甲酰胺中洗涤，然后在55℃下进行由含有EDTA的0.1X SSC组成的高严格性洗涤。本领域的技术人员理解如何调节温度、离子强度等，以在必要时调整如探针长度等的因素。

本领域的普通技术人员应理解，由于遗传密码的简并，存在许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任一天然基因的核苷酸序列带有最小同源性。但是，本公开特别地考虑了由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸。进一步地，包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本公开的范围内。等位基因是由于一个或多个突变(如核苷酸的缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。得到的mRNA和蛋白质可具有但不需要具有改变的结构或功能。可使用标准技术(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定等位基因。

可使用化学合成、重组方法或PCR来获得本公开的多核苷酸。多核苷酸化学合成方法是本领域熟知的，因此本文不需要详细描述。本领域的技术人员可利用本文提供的序列以及购得的DNA合成仪来生产所需DNA序列。

为使用重组方法制备多核苷酸，可将包括期望的序列的多核苷酸插入合适的载体中，并且继而可将该载体导入合适的宿主细胞中进行复制及扩增，如本文中进一步论述。可通过本领域已知的任何手段将多核苷酸插入宿主细胞中。通过直接摄取、胞吞、转染、F-接合或电穿孔来导入外源多核苷酸以转化细胞。一旦导入，外源多核苷酸可作为非整合载体(如质粒)被维持在细胞内，或整合入宿主细胞基因组。可通过本领域熟知的方法将如此扩增的多核苷酸从宿主细胞分离。参见例如Sambrook等，1989。

替代地，PCR允许DNA序列的复制。PCR技术在本领域中是熟知的，并且在以下文献中描述：美国专利号4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202；以及PCR:ThePolymerase Chain Reaction，Mullis等主编，Birkauswer Press，Boston，1994。

可通过将分离的DNA用于合适的载体中并将其插入合适的宿主细胞中来获得RNA。当细胞复制且DNA被转录为RNA时，可使用本领域技术人员熟知的方法(例如，如Sambrook等，1989中所示)将RNA分离。

如本文所用，“载体”是指能够在宿主细胞中传递并优选表达一个或多个感兴趣的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子浓缩剂相关的DNA或RNA表达载体、包裹在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞(如生产细胞)。

合适的克隆及表达载体可包括多种成分，如启动子、增强子以及其它转录调节序列。还可将载体构建为允许随后将抗体可变结构域克隆至不同载体中。合适的克隆载体可根据标准技术进行构建，或可选自本领域中可获得的大量克隆载体。尽管所选择的克隆载体可根据将使用的宿主细胞而不同，有用的克隆载体通常具有自我复制能力，可具有针对特定限制性内切酶的单一靶标，和/或可携带标志物的基因，该标志物可用于选择含有该载体的克隆。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA、以及如pSA3及pAT28的穿梭载体。这些以及许多其它克隆载体可从如BioRad、Strategene以及Invitrogen的商业供应商获得。进一步提供了表达载体。表达载体通常是可复制的多核苷酸构建体，其含有根据本公开的多核苷酸。这暗示表达载体在宿主细胞中必须是可作为附加体或染色体DNA的必不可少的部分复制的。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒)、粘粒、以及PCT公开号WO 87/04462中所公开的表达载体。载体成分通常可包括但不限于以下一种或多种：信号序列；复制起点；一个或多个标记基因；合适的转录控制元件(如启动子、增强子及终止子)。对于表达(即翻译)，通常还需要一个或多个翻译控制元件，如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。

可通过多个合适手段中的任一种将含有感兴趣的多核苷酸的载体和/或多核苷酸本身导入宿主细胞，方法包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质转染；微粒轰击；脂质转染；以及感染(例如，载体为感染剂如痘苗病毒)。导入载体或多核苷酸的选择常常取决于宿主细胞的特征。

因此，“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其可以是或已是多核苷酸和/或包含多核苷酸的载体的接受者，以用于并入多核苷酸和/或载体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变，该后代可不必与原始亲本细胞完全相同(在形态学上或在基因组DNA补体上)。宿主细胞包括使用本发明的多核苷酸在体内转染和/或转化的细胞。

可使用合适的宿主细胞重组制备抗体或其抗原结合片段。可将编码抗体或其抗原结合片段的核酸克隆至表达载体中，随后可将该表达载体导入宿主细胞(如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，其中细胞不另外产生免疫球蛋白)中，以获得抗体在重组宿主细胞中的合成。优选的宿主细胞包括CHO细胞、人胚肾(HEK)293细胞、NS0细胞或Sp2.0细胞等本领域熟知的许多细胞。可通过全长抗体的蛋白水解或其它降解方式、通过重组方法或通过化学合成来产生抗体片段。可通过化学合成方便地制备抗体的多肽片段，尤其是至多约50个氨基酸的较短多肽。用于蛋白质及肽的化学合成方法在本领域中是已知的并且可商购获得。

本发明的抗体或其抗原结合片段可以是亲和力成熟的。例如，亲和力成熟抗体可通过本领域已知的程序(Marks等，1992，Bio/Technology，10:779-783；Barbas等，1994，Proc Nat.Acad.Sci，USA 91:3809-3813；Schier等，1995，Gene，169:147-155；Yelton等，1995，J.Immunol.，155:1994-2004；Jackson等，1995，J.Immunol.，154(7):3310-9；Hawkins等，1992，J.Mol.Biol.，226:889-896；以及WO2004/058184)来产生。

免疫原性

免疫原性是蛋白质治疗剂(包括抗体及Fc融合蛋白)的开发及利用的主要障碍。数种因素可贡献蛋白质免疫原性，包括但不限于蛋白质序列、施用路径及频率以及患者群。尽管免疫应答对于非人蛋白质(如小鼠抗体)通常是最严重的，甚至主要或全部具有人序列内容的治疗剂仍可具有免疫原性。免疫原性是对被视为外来的物质所产生的一系列复杂的应答，并且可包括中和及非中和抗体产生、免疫复合物形成、补体活化、肥大细胞活化、炎症以及过敏性反应。不需要的免疫应答可通过直接干扰抗原识别、改变与效应分子的相互作用或扰动治疗剂的血清半衰期或组织分布而降低抗体及Fc融合蛋白治疗剂的功效。

可使用可商购获得的服务(如由Epivax，Inc.of Providence，R.I提供)来分析蛋白质治疗剂以预测潜在免疫原性表位的存在。在一些实施方式中，计算机模拟算法可以预测结合II类MHC分子的表位。利用此类算法对多肽的数据组的分析提供了预测表位。预测表位用于通过自动化肽合成或重组DNA技术的标准方法制备肽。由Epivax提供的分数信息可提供群中识别的预测表位的普遍程度的指示。

如下文实施例10中所述，使用由EpiVax开发的EpiMatrix算法针对由T细胞识别的表位(本文也称为T细胞表位、“T-regitopes”或“tReg”)的存在筛选本发明的抗体。将抗体序列解析为重叠9-mer框架，其中每一框架均与最后一个重叠8个氨基酸。然后针对关于8个共同MHC II类HLA等位基因(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301以及DRB1*1501)组的预测结合亲和力对每一所得框架进行评分。根据随机生成的肽的大样品的分数使原始分数标准化，并且报告所得的“Z”分数。

可使用EpiMatrix Z分数计算总序列分数(tReg调整分数)，以预测抗体的免疫原性。如实施例10中所述，通过合计9-mer框架的EpiMatrix Z分数(累计总数)并记录HLA类型观察的数目来计算tReg调整分数。无论9-mer是否为表位，检查了9-mer与HLA类型(“观察”)的所有个别组合。如果特定观察表明对于给定HLA类型，肽处于结合剂的前5％，则将该观察的EpiMatrix Z分数添加至与整个蛋白质序列相关的累计总数。还记录了所检查的观察的总数。仅有的例外是，由EpiVax开发的ISPRI软件包识别为“T-regitopes”的9-mer的所有观察均被假设具有零的EpiMatrix分数。如本文所用，“T-regitopes”是单克隆抗体框架区内的氨基酸序列，其可潜在地活化天然调节性T细胞并减少不需要的免疫应答。如下计算tReg调整分数：tReg调整分数＝(累计总数)*1000/(观察数目)。在累计总数中，从每一观察(包括T-regitopes)中减去0.05*2.2248的基线分数。较低的tReg调整分数预测免疫原性风险的较低潜能。

用途

用于治疗恶病质的方法

在一些方面，本发明提供了用于使用抗GDF15抗体或其抗原结合片段来降低或抑制GDF15活性的治疗方法，其中治疗方法包括施用治疗有效量的包括抗体或其抗原结合片段的药物组合物。所治疗的失调是通过除去、抑制或降低GDF15活性或信号转导而得到改善、减轻、抑制或预防的任何疾病或病症。

本发明涵盖降低有需要的对象中的游离GDF15的水平的方法。该方法包括：确定对象中的游离GDF15的水平；施用治疗量的本发明的抗体或其抗原结合片段；并且将施用前的GDF15的水平与施用抗体或其抗原结合片段后的游离GDF15的水平进行比较，由此降低对象中的游离GDF15的水平。

在一个实施方式中，游离GDF15的水平的降低降低了GDF15的不期望的、有害的或不需要的生物学活性。GDF15的此类活性包括但不限于：(a)降低食物摄取；(b)降低食欲；(c)降低体重；(d)增加体重损失；(e)降低脂肪量；(f)降低无脂肪重量；(g)增加脂肪量损失；(h)增加无脂肪肌肉量损失；(i)与GFRAL的结合；(j)增加由RET介导的下游信号转导；(k)增加ERK的磷酸化；(l)增加S6的磷酸化；(m)增加MAPK信号转导途径的RET介导的活化；(n)增加AKT-信号转导途径的RET活化；以及(o)增加PLC-γ1信号转导途径的活化。

在一个实施方式中，本发明包括降低有需要的对象中的GDF15的生物学活性的方法。该方法包括施用治疗量的本发明抗体或其抗原结合片段，由此降低GDF15的生物学活性。

在一个方面，GDF15的生物学活性包括但不限于：(a)降低食物摄取；(b)降低食欲；(c)降低体重；(d)增加体重损失；(e)降低脂肪量；(f)降低无脂肪重量；(g)增加脂肪量损失；(h)增加无脂肪肌肉量损失；(i)与GFRAL的结合；(j)增加由RET介导的下游信号转导；(k)增加ERK的磷酸化；(l)增加S6的磷酸化；(m)增加MAPK信号转导途径的RET介导的活化；(n)提高AKT-信号转导途径的RET活化；以及(o)提高PLC-γ1信号转导途径的活化。

术语“治疗”或“被治疗”包括预防性和/或治疗性治疗。如果在病症的临床表现前施用，则治疗被认为是预防性的。治疗性治疗包括例如减轻或降低疾病的严重性、或缩短疾病的长度。

如本文所用，术语“恶病质”包括与多种慢性疾病一起出现的代谢病及合并症，这些慢性疾病包括癌症、化学疗法、与免疫肿瘤学疗法结合的化学疗法、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、肌肉减少症、慢性阻塞性肺病(COPD)、肌肉减少症和慢性肾脏疾病(CKD)。

本发明涵盖治疗由GDF-15介导或与GDF-15相关的疾病、失调或病症的方法。在一个方面，失调是恶病质。在其它方面，失调是与癌症、化学疗法、与免疫肿瘤学疗法结合的化学疗法、慢性阻塞性肺病、慢性肾脏疾病、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭或肌肉减少症相关的恶病质。在一些方面，癌症是实体肿瘤癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌或睾丸癌。在一些方面，化学疗法是基于铂的化学疗法。可在严重性、持续时间或出现频率方面缓解或减轻疾病或失调或症状。

本发明进一步涵盖如本文所定义的用于所定义的治疗方法中的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。在提及如本文所述的治疗方法的实施方式中，此类实施方式也是涉及用于该治疗中或替代地用于制造用于该治疗的药物的抗体或其抗原结合片段或药物组合物的进一步的实施方式。

抗体及其抗体片段可与一种或多种额外的治疗活性化合物组合施用。额外的治疗活性化合物包括用于治疗与恶病质相关的慢性失调的物质、抗癌剂(例如免疫疗法及化学疗法)、诱导细胞应激的抗癌剂(例如基于铂的化疗剂，如顺铂)、肌肉合成代谢剂(例如选择性雄激素受体调节剂(SARM)、肌抑素抑制剂和活化素A受体抑制剂)、抗炎剂(例如JAK抑制剂、IL-6抑制剂、IL-8抑制剂)、食欲刺激剂(例如胃饥饿素模拟物、黑皮质素4受体抑制剂)、以及改善新陈代谢的物质(例如二甲双胍)。包括抗体或其抗原结合片段的组合疗法的预防性或治疗性物质可在同一药物组合物中施用于对象。替代地，组合疗法的预防性或治疗性物质可在分开的药物组合物中同时施用于对象。预防性或治疗性物质可通过相同或不同的施用路径施用于对象。

“化疗剂”是在癌症治疗中使用的化学化合物。化疗剂的实例包括：烷化剂，如噻替派以及环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，如苯佐替派、卡波醌、米得哌以及乌得哌；氮丙啶类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫化磷酰胺和三羟甲蜜胺；聚乙酸(特别是布拉它辛和布拉它辛酮)；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，MARINOL)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物托泊替康(HYCAMTIN)、CPT-11(依立替康、CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪素和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；培美曲塞；卡利司他汀；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；念珠藻素(特别是念珠藻素1以及念珠藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189以及CB1-TM1)；艾榴塞洛素；水鬼蕉碱；TLK-286；CDP323；口服α-4整合素抑制剂；甸枝珊瑚醇；海绵素；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸二氯甲基二乙胺氧化物、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，特别是卡奇霉素γI和卡奇霉素ωI(参见例如Nicolaou等，Angew.ChemIntl.Ed.Engl.，33:183-186(1994))；达内霉素，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCIN、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星、多柔比星HC1脂质体注射剂(DOXIL)以及去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、麦考酚酸、诺加霉素、橄揽霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤、吉西他滨(GEMZAR)、替加氟(UFTORAL)、卡培他滨(XELODA)、埃坡霉素以及5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、以及伊马替尼(2-苯基氨基嘧啶衍生物)、以及其它c-it抑制剂；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍曲布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；伊佛米新；依利醋铵；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；洛尼代宁；美登素类，如美登素以及安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫匹达醇；二胺硝吖啶；喷司他汀；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物(JHS天然产物、Eugene、OR)；雷佐生；利索新；西佐喃；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(特别是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A以及蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛(ELDISINE、FILDESIN)；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托新；阿糖胞苷(“Ara-C”)；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米粒子制剂(ABRAXANE)以及紫杉萜(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂以及卡铂；长春碱(VELBAN)；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌、长春新碱(ONCOVIN)；奥沙利铂；亚叶酸(leucovovin)；长春瑞滨(NAVELBINE)；诺安托；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；伊珠单抗奥佐米星(BESPONSA)、波舒替尼(BOSULIF)、帕博西尼(IBRANCE)、阿西替尼(INLYTA)、苹果酸舒尼替尼(SUTENT)、克里唑蒂尼(XALKORI)、恩杂鲁胺(XTANDI)；上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合，如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱以及泼尼松龙的组合疗法的缩写)和FOLFOX(使用奥沙利铂(ELOXATIN)组合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。

化疗剂的额外实例包括抗激素剂，其用于调节、降低、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的作用，并且常常处于系统性或全身性治疗的形式。它们可以是激素本身。实例包括：抗雌激素类及选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX他莫昔芬)、拉洛昔芬(EVISTA)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY 11 7018、奥那司酮、以及托瑞米芬

抗黄体素；雌激素受体下调剂(ERD)；雌激素受体拮抗剂，如氟维司群(FASLODEX)；用于抑制或关闭卵巢的制剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRFl)激动剂，如醋酸亮丙瑞林(LUPRON以及ELIGARD)、醋酸性瑞林、醋酸布舍瑞林及曲普瑞林；抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特及比卡鲁胺；以及抑制在肾上腺中调节雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(MEGASE)、依西美坦(AROMASIN)、福美坦、法曲唑、伏氯唑(RJVISOR)、来曲唑(FEMARA)及阿那曲唑(ARIMIDEX)。另外，化疗制剂的此种定义包括：双膦酸类，如氯屈膦酸二钠(例如BONEFOS或OSTAC)、羟乙二磷酸盐(DIDROCAL)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA)、阿仑膦酸盐(FOSAMAX)、帕米膦酸盐(AREDIA)、替鲁膦酸盐(SKELID)或利塞膦酸盐(ACTONEL)；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是在异常细胞增殖中所牵涉的信号转导途径中抑制基因表达的那些，如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，如THERATOPE疫苗和基因治疗疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及VAXID疫苗；拓朴异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN)；抗雌激素，如氟维司群；Kit抑制剂，如伊马替尼或EXEL-0862(酪氨酸激酶抑制剂)；EGFR抑制剂，如厄洛替尼或西妥昔单抗；抗VEGF抑制剂，如贝伐单抗；艾利替康；rmRH(例如ABARELIX)；拉帕替尼和二甲苯磺酸拉帕替尼(ErbB-2及EGFR双特异性酪氨酸激酶小分子抑制剂，也被称为GW572016)；17AAG(格尔德霉素衍生物，其是热应激蛋白(Hsp)90毒)，以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

如本文所用的“化学疗法”是指用于治疗癌症的如上文所定义的化疗剂，或两种、三种或四种化疗剂的组合。当化学疗法是由一种以上化疗剂组成时，可在同一治疗周期中的同一天或不同天将化疗制剂施用于患者。

如本文所用的“基于铂的化学疗法”是指其中至少一种化疗制剂是铂的配位络合物的化学疗法。示例性的基于铂的化学疗法包括但不限于顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、吉西他滨联合顺铂、卡铂联合培美曲塞。

如本文所用的“基于铂的双药”是指包括两种且不多于两种化疗剂并且其中至少一种化疗制剂是铂的配位络合物的化学疗法。示例性的基于铂的双药包括但不限于吉西他滨组合顺铂、卡铂组合培美曲塞。

如本文所用，术语“系统性抗癌疗法”是指世界上任何国家的管理机构所批准的或在世界上任何国家的管理机构控制下进行的人临床试验中的药剂的系统性施用，其大体目的是改变癌症的结果。系统性抗癌疗法包括但不限于化学疗法、激素疗法、靶向抗癌疗法、癌症疫苗、溶瘤细胞疫苗以及过继T细胞疗法。

治疗癌症的方法

本发明涵盖治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GDF15抗体。在一些实施方式中，癌症选自胃癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌以及黑素瘤。在一些实施方式中，对象是先前经治疗的成年患者，其患有局部晚期或转移性黑素瘤、鳞状细胞头颈癌(SCHNC)、卵巢癌、肉瘤、或复发性或顽固性典型霍奇金淋巴瘤(cHL)。在一些实施方式中，癌症可以是铂耐药性和/或铂难治性癌症，如例如铂耐药性和/或难治性卵巢癌、铂耐药性和/或难治性乳腺癌、或铂耐药性和/或难治性肺癌。

在另一方面，本发明提供了在患有肿瘤的对象中抑制肿瘤生长或进展的方法，包括向对象施用有效量的如本文所述的药物组合物。

在另一方面，本发明提供了在对象中抑制或预防癌细胞转移的方法，包括向有需要的对象施用有效量的如本文所述的药物组合物。

在另一方面，本发明提供了在患有肿瘤的对象中诱导肿瘤退行的方法，包括向对象施用有效量的如本文所述的药物组合物。

在一些实施方式中，方法可进一步包括施用有效量的第二治疗剂。在一些实施方式中，第二治疗剂是例如免疫调节剂。术语“免疫调节剂”是指能够改变(例如抑制、降低、提高、增强或刺激)宿主哺乳动物的固有体液或细胞免疫系统的任一成分的免疫应答(如本文所定义)或运作的物质。因此，术语“免疫调节剂”涵盖如本文所定义的“免疫效应细胞增强剂”及如本文所定义的“免疫抑制细胞抑制剂”、以及影响哺乳动物的免疫系统的其它成分的物质。在一些实施方式中，免疫调节剂可以是抗CD40激动剂抗体。

本发明还涵盖如本文所定义的用于所定义的治疗方法中的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。在涉及如本文所述的治疗方法的实施方式中，此类实施方式也是涉及在该治疗中使用或替代地用于制造在该治疗中使用的药物的抗体或其抗原结合片段或药物组合物的其它实施方式。

因此，本发明还提供了抗GDF15抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其在本文中被提供用于癌症治疗或用于抑制有需要的对象中的肿瘤生长或进展。

本发明还提供了本文提供的任一抗GDF15抗体在制造用于在有需要的对象中治疗癌症或抑制肿瘤生长或进展的药物中的用途。

抗体及其抗体片段可与一种或多种额外的治疗活性化合物组合施用。额外的治疗活性化合物包括用于治疗与恶病质相关的慢性失调的制剂、抗癌剂(例如免疫疗法和化学疗法)、诱导细胞应激的抗癌剂(例如基于铂的化疗剂，如顺铂)、肌肉合成代谢剂(例如选择性雄激素受体调节剂(SARM)、肌肉生长抑制素抑制剂以及活化素A受体抑制剂)、抗炎剂(例如JAK抑制剂、IL-6抑制剂、IL-8抑制剂)、食欲兴奋剂(例如胃饥饿素模拟物、黑皮质素4受体抑制剂)、以及改善新陈代谢的物质(例如二甲双胍)。

包括抗体或其抗原结合片段的组合疗法的预防性或治疗性物质可在同一药物组合物中施用于对象。替代地，组合疗法的预防性或治疗性物质可在分开的药物组合物中同时施用于对象。预防性或治疗性物质可通过相同或不同的施用路径施用于对象。

术语“免疫应答”是指宿主哺乳动物的免疫系统对特定物质(如抗原或免疫原)的任何可检测应答，如固有免疫应答(例如Toll受体信号转导级联的活化)、细胞介导的免疫应答(例如由T细胞，如抗原特异性T细胞，以及免疫系统的非特异性细胞介导的应答)、以及体液免疫应答(例如由B细胞介导的应答，如抗体生成并分泌至血浆、淋巴液和/或组织液中)。

术语“免疫原性”是指在存在或不存在佐剂的条件下物质(单独或与载体连接)针对特定抗原引起、引发、刺激或诱导免疫应答或改善、增强、提高或延长既存的免疫应答的能力。

本文所提供的用于治疗癌症的组合物和方法可进一步包括一种或多种其它免疫调节剂。

在一些实施方式中，免疫调节剂可以是抗CD40激动剂抗体。抗体可以是例如人、人源化或部分人嵌合抗CD40抗体。特异性抗CD40单克隆抗体的实例包括G28-5、mAb89、EA-5或S2C6单克隆抗体、CP870893或APX005M。在特定实施方式中，抗CD40激动剂抗体是CP870893或达西珠单抗(SGN-40)。

CP-870,893是完全人激动性抗CD40单克隆抗体，其已作为抗肿瘤疗法被临床研究。WO2003040170公开了CP870,893的结构和制备，其中抗体CP870,893被鉴定为抗体“21.4.1”。在WO2003040170中，分别在SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:48中以及在表7中示出了CP-870,893的重链和轻链的氨基酸序列。在临床试验中，以每次输注通常在0.05-0.25mg/kg范围内的剂量通过静脉内输注施用CP870,893。在本文提供的用于治疗癌症的方法中，可皮内、皮下或局部施用CP-870,893。

达西珠单抗(也称为SGN-40或huS2C6；CAS编号88-486-59-9)是另一示例性抗CD40激动剂抗体，其已针对惰性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤在临床试验中进行了研究。在本文提供的用于治疗癌症的方法中，可皮内、皮下或局部施用达西珠单抗。

细胞因子释放综合征(CRS)

本发明涵盖用于治疗CRS的方法，包括向有需要的患者施用有效量的GDF15抗体。CRS是在施用单克隆抗体和T细胞免疫治疗剂后有时可见的全身炎性反应。(Shimabukuro-Vornhagen等，Journal for ImmunoTherapy of Cancer 6,56(2018))。关于CRS的病理生理学以及触发保持CRS的全身炎性反应的多种细胞因子的大量释放的起始时间了解较少。

在一些实施方式中，本发明提供了治疗有需要的对象中的CRS的方法，包括向对象施用有效量的本文所述的药物组合物。

在其它实施方式中，方法可进一步包括施用有效量的第二治疗剂。第二治疗剂包括抗炎剂，例如IL-6抑制剂、肿瘤坏死因子α(TNF-α)抑制剂、干扰素γ(IFN-γ)抑制剂、皮质类固醇、抗组织胺药)、退热剂和/或抗生素。在一些实施方式中，第二治疗剂是抗体，例如托珠单抗和/或司妥昔单抗。

本发明还提供了如本文所定义的在治疗CRS的方法中使用的GDF15抗体或其抗原结合片段或药物组合物。本发明还提供了如本文所定义的GDF15抗体或其抗原结合片段或药物组合物在制造用于治疗CRS的药物中的用途。在涉及如本文所述的治疗方法的实施方式中，此类实施方式也是涉及在该治疗中使用或替代地用于制造在该治疗中使用的药物的抗体或其抗原结合片段或药物组合物的其它实施方式。

GDF15抗体与PD-1轴结合拮抗剂的组合疗法

本发明涵盖用于治疗癌症的方法，包括向有需要的患者施用与PD-1轴结合拮抗剂组合的GDF15抗体，该组合对治疗癌症有效。即，本文公开的数据证明了抗GDF15抗体与PD-1轴拮抗剂的组合在癌症治疗中提供了疗效。这些数据进一步证明了抗GDF15与PD-1轴拮抗剂的组合提供了大于单独施用的每一疗法的预测相加效果的疗效协同疗效。

本发明涵盖用于治疗癌症的方法，包括向有需要的患者施用与某一量的PD-1轴结合拮抗剂组合的某一量的GDF15抑制剂，其对治疗癌症有效。本发明还涵盖用于治疗癌症的方法，包括向有需要的患者施用某一量的GDF15抑制剂以及某一量的PD-1轴结合拮抗剂，其中这些量一起对治疗癌症有效。在另一实施方式中，本发明是关于用于治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用某一量的GDF15抑制剂以及某一量的PD-1轴结合拮抗剂，其中这些量一起在癌症治疗中实现协同效果，即组合是“协同的”。在一个方面，GDF15抑制剂是抗GDF15抗体GDF15_001，并且PD-1轴结合拮抗剂选自阿维鲁单抗、PF-06801591(萨善利单抗、RN-888)、纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗和得瓦鲁单抗。本发明涵盖用于治疗癌症的药物组合物，包含GDF15抑制剂及PD-1轴结合拮抗剂以及药学上可接受的载体。本发明涵盖用于治疗癌症的药物组合物，其包括协同有效量的GDF15抑制剂、协同治疗有效量的PD-1轴结合拮抗剂以及药学上可接受的载体。组合物可进一步包括额外的治疗剂，如但不限于至少一种化疗剂。

基于本文提供的公开，本领域的技术人员应理解本发明的治疗癌症的方法涵盖向先前经至少一种额外的治疗剂治疗或当前正接收至少一种额外的治疗剂以治疗癌症的患者施用协同治疗有效量的抗GDF15抗体以及协同治疗有效量的PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体等)。这种额外的治疗剂涵盖治疗癌症的标准制剂。即，本发明的组合疗法可被添加至已接收不同疗法(包括但不限于外科手术、放射、化学疗法、以及本领域中已知的任何其它疗法)的癌症患者的治疗方案中。

本领域的技术人员能够考虑到如年龄、体重、总体健康状况、施用的化合物、施用途径、需要治疗的癌症的性质及发展以及其它药物的存在的因素根据已知方法来确定本发明的组合中使用的每一化合物的合适量、剂量或用量以施用于患者。

在实施方式中，GDF15抑制剂是抗GDF15抗体或其抗原结合部分，并且以约0.025mg/kg至约20mg/kg的初始剂量静脉内(IV)或皮下(SC)施用。初始剂量之后可具有一个或多个后续剂量。在一些实施方式中，可以至少每周、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周、每九周、每十周、每十一周或每十二周中的任一种施用一个或多个后续剂量。

在一些实施方式中，GDF15抑制剂是抗GDF15抗体，并且以约0.25mg至约2000mg的固定剂量静脉内(IV)或皮下(SC)施用。在一些实施方式中，每周、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周、每九周、每十周、每十一周或每十二周施用抗体。

在一些实施方式中，GDF15抑制剂是抗GDF15抗体，其中抗GDF15抗体每周以约0.1至约60mg的固定剂量静脉内(IV)或皮下(SC)施用。在一些实施方式中，抗GDF15抗体每周以约2mg、约5mg、约7mg、约10mg、约12mg、约15mg、约25mg、约40mg以及约50mg的固定剂量施用。

在一些实施方式中，GDF15抑制剂是抗GDF15抗体，其中抗GDF15抗体每两周以约0.1至约130mg的固定剂量静脉内(IV)或皮下(SC)施用。在一些实施方式中，抗GDF15抗体每两周以约5mg、约10mg、约12mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约75mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg以及约125mg的固定剂量施用。

在一些实施方式中，GDF15抑制剂是抗GDF15抗体，其中该抗GDF15抗体每21天(±2天)以约0.1至约400mg的固定剂量静脉内(IV)或皮下(SC)施用。在一些实施方式中，抗GDF15抗体每21天(±2天)以约15mg、约25mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约75mg、约100mg、约115mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约225mg、约250mg、约275mg、约300mg、约325mg、约350mg、约375mg以及约385mg的固定剂量施用。

在一些实施方式中，GDF15抑制剂是抗GDF15抗体，其中该抗GDF15抗体每28天(±2天)以约0.1至约400mg的固定剂量通过静脉内(IV)或皮下(SC)施用。在一些实施方式中，抗GDF15抗体每28天(±2天)以约15mg、约25mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约75mg、约100mg、约115mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约225mg、约250mg、约275mg、约300mg、约325mg、约350mg、约375mg以及约385mg的固定剂量施用。

本发明方法的实践可通过多种施用或给药方案来完成。可间歇、同时或顺序施用本发明的组合的化合物。在实施方式中，可在同时存在的给药方案中施用本发明的组合的化合物。

可根据需要进行施用或给药方案的重复以实现期望的癌细胞的减少或缩减。如本文所用，“连续给药方案”是无剂量中断(例如，没有停止治疗的天数)的施用或给药方案。在治疗周期之间无剂量中断的21或28天治疗周期的重复是连续给药方案的实例。在实施方式中，可在连续给药方案中施用本发明的组合的化合物。在实施方式中，可在连续给药方案中同时施用本发明的组合的化合物。

在实施方式中，GDF15抑制剂是抗GDF15抗体。在一些实施方式中，抗GDF15抗体是GDF-001。

在一些实施方式中，PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体，如但不限于MEDI4736、MPDL3280A(YW243.55.s70)、BMS-936559(MDX-1105)、阿维鲁单抗、阿特珠单抗和得瓦鲁单抗。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗，并且可在整个治疗过程中以约14天(±2天)或约21天(±2天)或约30天(±2天)的间隔以约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg的剂量通过静脉内施用。在一些实施方式中，在整个治疗过程中以约14天(±2天)或约21天(±2天)或约30天(±2天)的间隔以约80、150、160、200、240、250、300、320、350、400、450、480、500、550、560、600、640、650、700、720、750、800、850、880、900、950、960、1000、1040、1050、1100、1120、1150、1200、1250、1280、1300、1350、1360、1400、1440、1500、1520、1550或1600mg、优选800mg、1200mg或1600mg的固定剂量(flat dose)施用阿维鲁单抗。在某些实施方式中，通过静脉内(IV)输注向对象施用包括本文所述的任一PD-1轴结合拮抗剂的药物。在某一实施方式中，通过皮下(SC)输注向对象施用包括本文所述的任一PD-1轴结合拮抗剂的药物。

在一些实施方式中，PD-1轴拮抗剂是PD-1轴结合拮抗剂。在一些实施方式中，PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-1抗体，例如PF-06801591(萨善利单抗、RN888)、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、替雷利珠单抗、AMP-224、AMP-514、西米普利单抗，并且在整个治疗过程中以约14天(±2天)或约21天(±2天)或约30天(±2天)的间隔以约1、2、3、4、5、6、7或8mg/kg的剂量静脉内或皮下施用，但优选皮下施用抗GDF15抗体。在一些实施方式中，(萨善利单抗、RN888)以约14天(±2天)或约21天(±2天)或约30天(±2天)或约35天(±2天)或约42天(±2天)的间隔以约80、150、160、200、240、250、300、320、350、400、450、500、550或600mg、优选300mg的固定剂量施用如US 2016/159905中所公开的PF-06801591。在一些实施方式中，以300mg Q4W的量皮下施用PF-06801591(萨善利单抗、RN888)。在一些实施方式中，以600mgQ6W的量皮下施用PF-06801591(萨善利单抗、RN888、mAb7)。

进一步，本发明关于用于治疗癌症的方法，包括向有需要的患者施用某一量的GDF15抗体以及某一量的PD-1轴结合拮抗剂，其中这些量一起在癌症治疗中实现协同效果，所述协同效果大于抗GDF15抗体和PD-1轴结合抑制剂的单独疗效加在一起。本发明的方法或用途是关于靶向治疗剂(尤其是GDF15抗体和PD-1轴结合拮抗剂)的协同组合。在实施方式的一个方面，GDF15抑制剂是抗GDF15抗体，并且PD-1轴结合拮抗剂选自纳武单抗、派姆单抗、替雷利珠单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-514、西米普利单抗、PF-06801591(萨善利单抗、RN888、mAb7)、阿维鲁单抗、阿替唑利单抗以及得瓦鲁单抗。在实施方式的一个方面，GDF15抑制剂是抗GDF15抗体，并且PD-1轴结合拮抗剂选自纳武单抗、派姆单抗、替雷利珠单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-514、西米普利单抗、PF-06801591(萨善利单抗、RN888、mAb7)、阿替唑利单抗以及得瓦鲁单抗，并且它不是阿维鲁单抗。

根据本发明，某一量的第一化合物或成分(例如GDF15抑制剂)与某一量的第二化合物或成分(例如PD-1轴结合拮抗剂(其不包括阿维鲁单抗))一起施用，并且这些量一起对治疗癌症有效。加在一起有效的这些量将在一定程度上缓解被治疗的失调的一种或多种症状。提及癌症的治疗，有效量是指具有以下效果的量：(1)减小肿瘤的尺寸；(2)抑制(即在某种程度上减缓，优选阻止)肿瘤转移出现；(3)在某种程度上抑制(即在某种程度上减缓，优选阻止)肿瘤生长或肿瘤侵入；和/或(4)在某种程度上缓解(或优选消除)与癌症相关的一种或多种迹象或症状。剂量以及施用方案的治疗或药理有效性的特征还可以是在患有这些特定肿瘤的患者中诱导、增强、维持或延长疾病控制和/或总存活期的能力，其可以作为疾病进展前的时间的延长来进行测量。

本发明提供了用于向有需要的对象单独地或与其它疗法组合地施用本公开的抗GDF15抗体或其抗原结合部分的方法。本公开的组合疗法(例如抗GDF15与PD-1轴拮抗剂)可同时或顺序施用于对象。本公开的抗GDF15与PD-1轴拮抗剂组合疗法也可周期施用。周期疗法涉及：施用第一疗法(例如第一预防或治疗剂)一段时间，然后施用第二疗法(例如第二预防或治疗剂)一段时间，并且重复该顺序施用(即循环)，以便减少对疗法(例如物质)之一的抗性的发展以避免或降低疗法(例如物质)之一的副作用和/或改善疗法的功效。

本发明进一步涵盖如本文所定义的用于定义的治疗方法中的抗GDF15抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中抗体或其抗原结合片段或药物组合物与如本文所定义的PD-1轴结合拮抗剂联合施用。在提及如本文所述的治疗方法的实施方式中，此类实施方式是也涉及在该治疗中使用或替代地用于制造在该治疗中使用的药物的抗体或其抗原结合片段或药物组合物的另外的实施方式。

本公开的组合疗法的各疗法(例如预防或治疗剂)可同时施用于对象。术语“同时”并不限于完全同时施用各疗法(例如预防或治疗剂)，相反意味着本公开的包含GDF15抗体或其抗原结合部分的药物组合物按顺序且在时间间隔内施用于对象，使得抗体可与其它疗法(例如可不包括阿维鲁单抗的PD-1轴拮抗剂)一起发挥作用以提供提高的成效(其大于它们以其它方式施用时的成效)，更优选地，组合疗法提供了“协同疗效”，其中疗效大于两种疗法分别施用时的相加效果。例如，每一疗法可同时或在不同时间点以任何次序顺序施用于对象；然而，如果不是同时施用，它们在时间上应足够近地施用以便提供期望的治疗或预防效果。每一疗法均可以以任何合适的形式并通过任何合适的途径分别施用于对象。抗GDF15抗体或其抗原结合片段可以是本发明的任一抗体，优选GDF-15_001。PD-1轴拮抗剂包括但不限于PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。在其它方面，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在另外的方面，抗PD-1抗体包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、斯巴达珠单抗、替雷利珠单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-514、西米普利单抗以及PF-06801591(萨善利单抗、RN888)。在其它方面，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在其它方面，抗PD-L1抗体是BMS-936559(MDX-1105)、阿维鲁单抗、阿替唑利单抗、得瓦鲁单抗。在其它方面，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，但不是阿维鲁单抗。

在各种实施方式中，抗GDF15抗体或其抗原结合片段向对象的施用与PD-1轴拮抗剂(例如抗PD-1抗体、可不包括阿维鲁单抗的抗PD-L1抗体、或抗PD-L2抗体等)的施用相隔小于15分钟、小于30分钟、小于1小时、约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约5小时、约5小时至约6小时、约6小时至约7小时、约7小时至约8小时、约8小时至约9小时、约9小时至约10小时、约10小时至约11小时、约11小时至约12小时、24小时、48小时、72小时或1周。在其它实施方式中，两种或更多种疗法(例如抗GDF15抗体、可不包括阿维鲁单抗的抗PD-L1抗体以及化疗剂)在同一次患者就诊内施用于给患者。

组合疗法的预防或治疗剂可在同一药物组合物中施用于对象。替代地，组合疗法的预防或治疗剂可在分开的药物组合物中同时施用于对象。预防或治疗剂可通过相同或不同的施用路径施用于对象。

诊断方法

本发明的抗GDF15抗体、抗体组合物和方法具有体外及体内用途，包括免疫测定以及针对GDF15介导的失调征的诊断及治疗评估的使用。这些方法特别适合于诊断、评估和治疗患有与GDF15的存在(更优选地，与提高的GDF15水平)相关的失调的人患者，其中提高的GDF15水平涵盖高于人健康志愿者中游离GDF-15的血浆浓度的提高的水平。该与GDF15的存在相关的失调包括但不限于与癌症、化学疗法、与免疫肿瘤学疗法组合的化学疗法、慢性阻塞性肺病、慢性肾脏疾病、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭或肌肉减少症相关的恶病质。

本发明提供了一种用于检测样品中GDF15的存在的方法，该方法包括使被怀疑包含GDF15的样品与对于GDF15特异的抗体接触并且检测与该抗体结合的GDF15的存在，由此检测样品中的GDF15。用于检测与抗体结合的GDF15的方法在本领域中是熟知的，包括但不限于其中使GDF15结合固体支持物并将样品添加至其中以使抗体结合样品中的GDF15的测定。添加与结合固体支持物的抗体相同或不同的第二GDF15抗体，并且可通过直接标记(即第二抗体与可检测标记连接)或通过添加例如来自另一物种的第三抗体(其与第二抗体的恒定结构域反应并包括可检测标记)来检测。因此，可使用该测定来检测样品中GDF15的存在或不存在。

在另一实施方式中，本发明包括一种用于检测样品中GDF15的存在的试剂盒，该试剂盒包括对于GDF15特异的抗体、施药器以及其使用说明材料。

本发明还提供了用于确定样品中GDF15的浓度的方法，所述方法包括：提供标记竞争剂，其包括联结至可检测标记的GDF15；提供特异性结合GDF15的抗体或其抗原结合片段；将样品、抗体与标记竞争剂组合，其中样品中的GDF15与标记竞争剂竞争结合抗体；以及通过检测标记以测量未结合抗体的标记竞争剂的量来确定所述样品中GDF15的浓度。将不存在样品时结合抗体的标记竞争剂的量与添加样品时结合抗体的标记竞争剂的量进行比较。存在样品时结合的标记竞争剂的减少的量是样品中存在的未标记GDF15的量的指示剂，使得该测定可用于评估样品中GDF15的存在及水平。

在一个实施方式中，本发明提供了一种用于评估与对象中GDF15水平提高相关的疾病或失调的治疗有效性的方法，方法包括向对象施用治疗以及将在治疗前从对象获得的样品中GDF15的水平与在治疗后从对象获得的原本相同的样品中GDF15的水平进行比较，其中使用GDF15特异性抗体评估样品中GDF15的水平，并且进一步地，其中与在治疗前从对象收集的样品中GDF15的水平相比，在治疗后从对象收集的样品中GDF15的较低水平是治疗过程的有效性的指示。

关于GDF15特异性抗体或标记竞争剂，术语“标记”包括通过将可检测物质联结(即物理连接)至抗体或标记竞争剂而实现的直接标记、以及通过将抗体或标记竞争剂与被直接标记的另一试剂联结而实现的间接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的次级抗体检测初级抗体。本发明的多肽的体外检测技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。

术语“生物样品”旨在包括从对象分离的组织、细胞及生物液体，以及存在于对象内的组织、细胞及液体。

本文所述的抗体、标记竞争剂和潜在治疗化合物也适合于用广泛的检测系统与许多其它均相和非均相免疫测定中的任一种一起使用。

组合物

可将本发明的GDF15抗体配制为药物组合物。药物组合物还可包含处于冻干制剂或水性溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂(Remington:The Scienceand practice of Pharmacy第21版，2005，Lippincott Williams以及Wilkins主编，K.E.Hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在用量和浓度下对受体无毒性，并且可包括：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基铵氯化物；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烃基对羟苯甲酸，如甲基或丙基对羟苯甲酸；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。本文进一步描述了药学上可接受的赋形剂。

本公开的药物组合物可进一步包括如本文所述的PD-1轴拮抗剂以及如本文所述的GDF15抑制剂。在一个实施方式中，GDF15抑制剂是抗GDF15抗体GDF15_001或GDF15_297，并且PD-1轴拮抗剂选自任选地由阿维鲁单抗、PF-06801591(也被称为“萨善利单抗”、以及“RN-888”及mAb7，所有如WO 2016/092419中公开的)、纳武单抗、派姆单抗、阿替唑利单抗以及得瓦鲁单抗。在一个实施方式中，PD-1轴拮抗剂不包括阿维鲁单抗。

本公开的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。此类盐的实例包括酸加成盐以及碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)的那些盐以及衍生自无毒有机酸(如脂族一元羧酸及二羧酸、苯基取代链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂族及芳族磺酸等)的那些盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(如钠、钾、镁、钙等)的那些盐以及衍生自无毒有机胺(如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些盐。

本公开的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸盐、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

可在本公开药物组合物中采用的适宜水性及非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及它们的适宜混合物、植物油(如橄榄油)、以及可注射的有机酯(如油酸乙酯)。例如，可通过使用包衣材料(如卵磷脂)、通过维持所需粒径(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。

这些组合物还可含有辅助剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌程序并且通过包含多种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等)二者来确保防止微生物的存在。还可能期望将等渗剂(如糖类、氯化钠等)包含到组合物中。此外，可通过包含延长吸收的物质(如单硬脂酸铝以及明胶)引起可注射药物形式的延长吸收。

药物组合物通常在制造和存储的条件下必须是无菌且稳定的。组合物可被配制为溶液、微乳剂、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质以及它们的合适混合物。例如，可通过使用如卵磷脂之类的包衣、通过维持所需粒径(在分散体的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，在组合物中包含等渗剂(例如糖类、多元醇(如甘露醇)、山梨糖醇或氯化钠)是合适的。可通过在组合物中包含延长吸收的制剂(如单硬脂酸盐以及明胶)引起可注射组合物的延长吸收。

可通过根据需要将所需量的活性化合物与上述组分中的一种或组合掺入至合适的溶剂中并且随后进行灭菌微孔过滤来制备无菌可注射溶液。

通常，通过将活性化合物掺入含有碱性分散介质以及来自所需的上述其它组分的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从先前经无菌过滤的溶液产出活性组分加上任何额外的期望组分的粉末。

本公开的药物组合物可作为适于眼部施用的配制物来制备、包装或售卖。此类配制物可例如处于眼滴剂的形式，其包含例如水性或油性液体载体中的活性组分的0.1％-1.0％(w/w)溶液或悬浮液。此类滴剂可进一步包含缓冲剂、盐、或一种或多种本文所述的额外的组分。其它有用的可在眼部施用的配制物包括那些含有呈微晶形式或在脂质体制剂中的活性组分的配制物。

如本文所用，“额外的组分”包括但不限于以下一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；制粒和崩解剂；结合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理上可降解的组合物，如明胶；水性载体及溶剂；油性载体及溶剂；悬浮剂；分散或湿润剂；乳化剂、缓和剂；缓冲液；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；以及药学上可接受的聚合或疏水材料。本公开的药物组合物中可能包含的其它的“额外的组分”在本领域中是已知的并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences，Genaro主编，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1985)中，其以引用的形式并入本文。

在一个实施方式中，GDF15抗体或其抗原结合部分作为pH在约5-6范围内的含有5mg/mL、或在一些实施方式中含有约10mg/mL、或在一些实施方式中含有约15mg/mL、或在一些实施方式中含有约20mg/mL抗体、或在一些实施方式中含有约25mg/mL、或在一些实施方式中含有约50mg/mL并具有硬脂酸钠、聚山梨醇酯80和氯化钠的无菌水性溶液以静脉配制物的方式施用。在一些实施方式中，静脉配制物是pH为5.5的含有5或10mg/ml抗体并具有20mM硬脂酸钠、0.2mg/ml聚山梨醇酯80以及140mM氯化钠的无菌水性溶液。进一步，除许多其它化合物之外，包含抗体或其抗原结合部分的溶液可包含组氨酸、甘露醇、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、聚乙二醇、EDTA、蛋氨酸以及它们的任何组合、以及相关领域中已知的许多其它化合物。

在一个实施方式中，本公开的药物组合物包含以下成分：50mg/mL本公开的GDF15抗体或抗原结合部分、20mM组氨酸、8.5％蔗糖以及0.02％聚山梨醇酯80、0.005％EDTA(pH为5.8)；在另一实施方式中，本发明的药物组合物包含以下成分：100mg/mL本公开的GDF15抗体或抗原结合部分、10mM组氨酸、5％蔗糖和0.01％聚山梨醇酯80(pH为5.8)。可作为液体配制物或作为冻干粉提供该组合物。当以完整体积重新配制粉末时，组合物保持相同的配制物。替代地，可以以一半体积重新配制粉末，在此情况下，组合物包含100mg本公开的GDF15抗体或其抗原结合部分、20mM组氨酸、10％蔗糖和0.02％聚山梨醇酯80(pH为5.8)。

在一个实施方式中，部分剂量通过静脉团注施用，剩余通过抗体配制物的输注施用。例如，GDF15抗体或其抗原结合部分的0.01mg/kg静脉注射可作为团注给予，剩余抗体剂量可通过静脉注射施用。GDF15抗体或其抗原结合部分的预定剂量可例如在一个半小时至两个小时至五个小时期间内施用。

关于治疗剂，其中该治疗剂为例如小分子，其可以采用生理学上可接受的酯或盐的形式(如组合生理学上可接受的阳离子或阴离子)存在于药物组合物中，这是本领域中熟知的。

可通过药理学领域中已知或随后开发的任何方法制备本文所述的药物组合物的配制物。一般而言，此类制备方法包括以下步骤：将活性组分与载体或一种或多种其它附加组分缔合，然后如果需要或期望，将产物成形或包装成期望的单剂量或多剂量单位。

在一个实施方式中，本公开的组合物是无热原制剂，其基本上不含内毒素和/或相关的致热物质。内毒素包括被限制在微生物内并且在微生物崩解或死亡时被释放的毒素。致热物质还包括诱导发热的热稳定物质(糖蛋白)，其来自细菌及其它微生物的外膜。如果施用至人，两种物质均引起发烧、低血压和休克。由于潜在的有害作用，从静脉内施用的药物溶液中除去即使较低量的内毒素是有利的。食品药品管理局(“FDA”)针对静脉内药物施加已将上限设定为在单个一小时期间内每千克体重每剂量5内毒素单位(EU)(The UnitedStates Pharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum 26(1):223(2000))。当以每千克体重数百或数千毫克的量施用治疗蛋白质时，除去即使微量的内毒素是有利的。在一个实施方式中，组合物中的内毒素及热原水平小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。在另一实施方式中，组合物中的内毒素及热原水平小于约10EU/mg、或小于约5EU/mg、或小于约1EU/mg、或小于约0.1EU/mg、或小于约0.01EU/mg、或小于约0.001EU/mg。

在一个实施方式中，本公开包括施用组合物，其中所述施用是口服、肠胃外、肌内、鼻内、阴道、直肠、舌、舌下、口腔、颊内、静脉内、皮肤、皮下或经皮施用。

在另一实施方式中，本公开还包括组合其它疗法(如手术、化学疗法、激素疗法、生物疗法、免疫疗法或放射疗法)施用组合物。

用量

为制备包含本公开的GDF15抗体或其抗原结合部分的药物或无菌组合物，将该抗体与药学上可接受的载体或赋形剂混合。可通过与处于例如冻干粉、浆、水性溶液、乳液或悬浮液形式的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗和诊断剂的配制物(参见例如Hardman等(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics,McGraw-Hill，New York；Gennaro(2000)Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins，New York；Avis等(主编)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker，NewYork；Lieberman等(主编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,MarcelDekker，New York；Lieberman等(主编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems,Marcel Dekker，New York；Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicityand Safety,Marcel Dekker公司，New York)。

治疗剂的施用方案的选择取决于数种因素，包括实体的血清或组织周转速率、症状程度、实体的免疫原性、以及生物基质中的靶细胞的可接近性。在某些实施方式中，施用方案使递送至患者的符合可接受的副作用水平的治疗剂的量最大化。相应地，生物递送的量部分地取决于特定的实体以及所治疗的病症的严重性。选择适当剂量的抗体、细胞因子以及小分子的指导是可获得的(参见例如Wawrzynczak，1996，Antibody Therapy，BiosScientific Pub.Ltd，Oxfordshire，UK；Kresina(主编)，1991，Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis，Marcel Dekker，New York；Bach(主编)，1993，MonoclonalAntibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases，Marcel Dekker，New York；Baert等，2003，New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等，1999，New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等，2001，New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等，2000，NewEngl.J.Med.342:613-619；Ghosh等，2003，New Engl.J.Med.348:24-32；Lipsky等，2000，New Engl.J.Med.343:1594-1602)。

合适的剂量是由临床医生例如使用本领域中已知或推测影响治疗或预测影响治疗的参数或因素来确定。通常，剂量以稍低于最优剂量的量开始，并且此后以小的增量增加，直至相对于任何负面副作用达到期望的或最优的效果。

如术语在本文所用，“降低GDF15的水平”或“减小GDF15的水平”意味着与在任何治疗干预前的游离GDF15的水平相比减小游离GDF15的水平。如本文所用，“游离GDF15”是指不与另一分子(例如存在于例如血浆中的抗体或结合分子)结合或以其它方式位于复合体中的GDF15。

GDF15的水平包括对象中游离GDF15的水平，其中使用本文公开的方法或本领域中已知的任何其它用于评估游离GDF15的水平的方法评估该水平。

在一个实施方式中，与在施用本发明的抗体前对象中GDF15的水平相比，游离GDF15的水平降低。在一个实施方式中，与游离GDF15的标准水平相比，游离GDF15的水平降低，该标准水平与对象未患有疾病、失调或病症(其与游离GDF15的水平提高相关或由游离GDF15的水平提高介导)的情况相关或指示对象未患有疾病、失调或病症。在一个实施方式中，游离GDF15的标准或参比水平为血浆中约0.05ng/mL至约3ng/mL。在另一实施方式中，游离GDF15的标准或参比水平位于以下范围内，该范围的下限值选自0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9ng/mL，并且该范围的上限值选自0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9以及3.0ng/mL。在进一步的实施方式中，游离GDF15的标准或参比水平小于1ng/mL、优选小于0.9ng/mL、甚至更优选小于0.8ng/mL、再进一步更优选小于0.7ng/mL、甚至更优选小于0.6ng/mL、再进一步更优选小于0.5ng/mL、并且甚至更优选小于0.4ng/mL。在一个实施方式中，游离GDF15的水平是血浆中的水平。

本发明不限于小于0.5ng/mL的游离GDF15水平；相反，本领域技术人员将理解，治疗水平对于特定对象可低于或高于0.5ng/mL。因此，本发明涵盖将游离GDF15的水平降低至其中由游离GDF15的水平提高介导或与游离GDF15的水平提高相关的可检测的有害影响降低或完全缺乏的水平。此类影响包括但不限于恶病质、食物摄取降低、食欲降低、体重降低、重量损失、脂肪量降低、无脂肪重量降低等。

如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效用量”、“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效量”是足以达到任一种或多种有利或期望的结果的量。对于预防性用途，有利或期望的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延缓疾病(包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症及疾病发展过程中出现的过渡病理学表型)的开始。对于治疗性用途，有利或期望的结果包括可检测的临床结果，如减少或降低重量损失的速率或减少由活性GDF15的高表达引起的一种或多种症状(例如食物摄取降低、食欲降低、体重降低、重量损失、脂肪量降低以及无脂肪重量降低)、降低治疗疾病所需的其它药物的剂量、增强另一药物的作用和/或延缓患者的疾病进展。有效用量可通过一次或多次施用进行施用。出于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效用量是足以直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。如临床背景中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效用量可以是或可以不是与另一药物、化合物或药物组合物联合实现的。因此，可在施用一种或多种治疗剂的背景中考虑“有效用量”，并且如果与一种或多种其它制剂联合实现或已实现期望结果，可考虑给予有效量的单一物质。

在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段的有效用量是基于人健康志愿者中以及患病患者中的游离GDF-15的血浆浓度。总有效剂量取决于患病患者中的游离GDF-15的血浆浓度。在一个实施方式中，有效用量可以是能够在稳定状态下在整个给药间隔中将对象中的游离GDF15水平减小或降低至人健康志愿者中所测量的相同或较低平均水平的用量。在另一实施方式中，有效用量可以是能够在稳定状态下在整个给药间隔中将患者中的游离GDF15水平减小或降低至小于0.5ng/mL的用量。在又一实施方式中，有效用量可以是给予70kg对象的用量，其可在稳定状态下在整个给药间隔中将对象中的游离GDF15水平减小或降低至小于0.5ng/mL。

“个体”、“患者”或“对象”是哺乳动物，更优选人。哺乳动物还包括但不限于家畜、运动动物、宠物、灵长类动物、马、犬、猫、小鼠和大鼠。在一些实施方式中，个体被认为具有患由GDF15(结合其受体)及其介导的信号转导介导或与GDF15(结合其受体)及其介导的信号转导相关的疾病、失调或病症的风险。在某些实施方式中，对象具有与癌症、化学疗法、与免疫肿瘤学疗法结合的化学疗法、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、肌肉减少症、慢性阻塞性肺病(COPD)、肌肉减少症以及慢性肾脏疾病(CKD)相关的恶病质。

在一些实施方式中，方法或用途包括施用约0.025mg/kg至约20mg/kg的初始剂量的本发明抗体或其抗原结合片段或药物组合物。初始剂量后可具有一个或多个后续剂量。在一些实施方式中，可以至少每周、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周、每九周、每十周、每十一周或每十二周中的任一种施用一个或多个后续剂量。

在一些实施方式中，方法或用途包括施用约0.25mg至约2000mg的固定剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，每周、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周、每九周、每十周、每十一周或每十二周施用抗体或其抗原结合片段。

在其它实施方式中，方法或用途包括每周施用约0.1至约60mg的固定剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段的固定剂量为每周施用约2mg、约5mg、约7mg、约10mg、约12mg、约15mg、约25mg、约40mg以及约50mg。

在一些实施方式中，方法或用途包括每两周施用约0.1至约130mg的固定剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段的固定剂量为每两周施用约5mg、约12mg、约20mg、约25mg、约30mg、约40mg、约60mg、约90mg以及约125mg。

在一些实施方式中，方法或用途包括每四周施用约0.1至约400mg的固定剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段的固定剂量为每四周施用约15mg、约40mg、约60mg、约75mg、约100mg、约115mg、约200mg、约300mg以及约385mg。

试剂盒

本发明还提供了包含本发明的抗体或其抗原结合片段的试剂盒或制品、以及使用说明。相应地，在一些实施方式中，提供了试剂盒或制品，包含容器、位于容器内的包含抗GDF15抗体的组合物以及含有施用治疗有效量的抗GDF15抗体以治疗有需要的患者的使用说明的包装插页。

在某些实施方式中，试剂盒可包含具有干燥蛋白质的第一容器以及具有水性制剂的第二容器二者。在某些实施方式中，包括了包含单腔及多腔预填充注射器(例如液体注射器以及冻干剂注射器)的试剂盒。

在一个实施方式中，本发明提供了用于确定样品中GDF15的浓度的试剂盒，该试剂盒包含：标记竞争剂，其包含接合至可检测标记的GDF15；抗体或其抗原结合片段，其特异性结合GDF15；施药器；以及其使用说明材料。

本发明还提供了用于确定检验样品中GDF15的量的竞争性免疫测定试剂盒，该竞争性免疫测定试剂盒包含：抗体或其抗原结合片段，其特异性结合GDF15；标记竞争剂，其包含缀合至可检测标记的GDF15；其中标记竞争剂与测试样品中的GDF15竞争与抗体结合，并且进一步其中标记提供了指示测试样品中GDF15的量的信号。在示例性实施方式中，与不含有GDF15的原本相同的样品中的抗体所结合的标记相比，测试样品中的抗体所结合的标记的减少是检验样品中的GDF15的量的指示。

在替代实施方式中，本发明提供了用于鉴定有患恶病质风险的人患者的试剂盒，其包含GDF15特异性抗体或其抗原结合片段、施药器以及其使用说明材料。

在一些实施方式中，提供了试剂盒或制品，其包含第一容器、该容器内的包含抗GDF15抗体的组合物、第二容器、该第二容器内的包含PD-1轴结合拮抗剂的组合物、以及含有施用治疗有效量的抗GDF15抗体和PD-1轴结合拮抗剂以治疗有需要的患者的使用说明的包装插页。

本发明涵盖试剂盒或制品，包含第一容器、容器内的包含协同治疗有效量的抗GDF15抗体的组合物、第二容器、第二容器内的包含治疗有效量的PD-1轴结合拮抗剂的组合物、以及含有施用协同治疗有效量的抗GDF15抗体和PD-1轴结合拮抗剂以组合治疗有需要的患者的使用说明的包装插页。

在一些方面，PD-1轴结合拮抗剂选自PD-1抗体或其抗原结合片段、PD-L1抗体或其抗原结合片段、以及PD-L2抗体或其抗原结合片段。在一些方面，PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗、斯巴达珠单抗、替雷利珠单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-514、西米普利单抗以及PF-06801591(萨善利单抗、RN888)。在其它方面，PD-L1抗体选自任选地由阿维鲁单抗、阿替唑利单抗、得瓦鲁单抗。在其它方面，PD-L1抗体不是阿维鲁单抗。

在其它实施方式中，提供了试剂盒或制品，包含第一容器、容器内的包含抗GDF15抗体的组合物、第二容器、第二容器内的包含抗癌治疗剂的组合物、以及含有施用治疗有效量的抗GDF15抗体及抗癌治疗剂以治疗有需要的患者的使用说明的包装插页。在一些方面，抗癌治疗剂是抗CD40抗体。

本发明涵盖试剂盒或制品，包含第一容器、容器内的包含协同治疗有效量的抗GDF15抗体的组合物、第二容器、第二容器内的包含治疗有效量的抗癌治疗剂的组合物、以及含有施用协同治疗有效量的抗GDF15抗体和抗癌治疗剂以联合治疗有需要的患者的使用说明的包装插页。在一些实施方式中，抗癌治疗剂是抗CD40抗体。

关于本发明的抗体或其抗原结合片段的使用的使用说明通常包括关于用于预期治疗的用量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的使用说明通常是标签或包装插页(例如试剂盒中包括的纸张)上的书面使用说明，但机器可读的使用说明(例如磁盘或光盘上携带的使用说明)也是可接受的。

本发明的试剂盒处于适合的包装中。适合的包装包括但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如密封的Mylar或塑料袋)等。还考虑了用于与如吸入器、鼻施用装置(例如喷雾器)或输液装置(如微型泵)的特定装置组合使用的包装。试剂盒可具有无菌入口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针刺透的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。容器也可具有无菌入口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针刺透的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。容器还可包含第二药物活性剂。

试剂盒可任选地提供额外的成分，如缓冲液和说明信息。通常，试剂盒包含容器以及容器上的或与容器相关的标签或包装插页。

定义

除非本文另有定义，当与可测量的数字变量一起使用时，“约”或“大约”是指变量的指示值以及在指示值的实验误差内(例如在平均值的95％置信区间内)或在指示值的10％内(无论哪一个更大)的变量的所有值。数字范围包括定义该范围的数字。

如本领域中已知的术语“相同性”是指通过比较序列确定的两种或更多种多肽分子或两种或更多种核酸分子的序列之间的关系。在本领域中，“相同性”还意味着根据具体情况通过核苷酸或氨基酸序列串之间的匹配而确定的多肽或核酸分子序列之间的序列关联性的程度。“相同性”用由计算机程序的特定数学模型(即算法)处理的缺口比对来测量两个或更多个序列之间的相同匹配的百分比。

术语“相似性”是与“相同性”相关但与之形成对比的概念，是指相似性的量度，其包括相同匹配以及保守取代匹配二者。由于保守取代适用于多肽而不适用于核酸分子，相似性仅涉及多肽序列比较。如果两条多肽序列具有例如二十分之十的相同氨基酸，并且剩余均为非保守取代，则相同性百分比及相似性百分比均为50％。如果在同一实例中另有5个位置是保守取代，则相同性百分比仍为50％，但相似性百分比却是75％(二十分之十五)。因此，在存在保守取代的情况下，两条多肽序列之间的相似性程度将高于这两条序列之间的相同性百分比。

尽管本公开支持仅指替代方式以及“和/或”的定义，除非明确指明仅指替代方式或表示这些替代方式相互排斥，术语“或”在权利要求中的使用用于意味着“和/或”。除非另有明确指明，如本说明书中所用，“一(a/an)”或可指一个或多个。如在权利要求中所用，当与词语“包括”联合使用时，词语“一(a/an)”可指一个或多于一个。如本文所用，“另一”可指至少第二个或更多个。除非本文另有定义，关于本发明所使用的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常所理解的含义。进一步，除非上下文另有需要，单数术语应包括复数含义且复数术语应包括单数含义。本文涉及本发明使用的词语“包括(comprises/comprising)”以及词语“具有/包括”是用于说明所述特征、整数、步骤或成分的存在，但不排除一种或多种其它特征、整数、步骤、成分或其组的存在或加入。

如本文所用，在描述施用于患者的卡铂的量时，术语“计算AUC 3剂量”、“计算AUC4剂量”、“计算AUC 5剂量”、“计算AUC 6剂量”等是指基于分别为3、4、5和6mg.min/mL的靶曲线下面积(AUC)的以及患者的肾小球滤过率(GFR，mL/min)根据Calvert方程计算出的卡铂的量：卡铂剂量(mg)＝靶AUC(mg.min/mL)×(GFR+25)，如2018年2月更新的NationalComprehensive Cancer

(NCCN)Chemotherapy Order Templates Appendix B所述。

如本文所用，术语“细胞因子”一般指由一个细胞群释放的蛋白质，其在另一细胞上充当细胞间介体或对产生蛋白质的细胞具有自分泌效应。此类细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子；白细胞介素(“IL”)，如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17A-F、IL-18至IL-29(如IL-23)、IL-31，包括

rIL-2；肿瘤坏死因子，如TNF-a或TNF-β、TGF-1-3；以及其它多肽因子，包括白血病抑制因子(“LIF”)、睫状神经营养因子(“CNTF”)、CNTF样细胞因子(“CLC”)、心脏营养素(“CT”)以及kit配体(“L”)。

如本文所用，术语“趋化因子”是指具有选择性诱导白细胞的趋化性和活化能力的可溶性因子(例如细胞因子)。它们还引发血管生成、炎症、伤口愈合和肿瘤发生的过程。示例趋化因子包括IL-8、小鼠角化细胞化学引诱物(KC)的人同源物。

术语“癌症”、“癌性”或“恶性”是指或描述哺乳动物中通常以未受调控的细胞生长为特征的病理学状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤和肉瘤。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、成神经细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。癌症的另一具体实例包括肾细胞癌。

除非另有指明，如本文所用的术语“治疗”意味着逆转、缓解、预防此术语适用的失调或病症或此类失调或病症的一种或多种症状，或抑制其进展。

根据本发明的待治疗的“患者”包括任何温血动物，如但不限于人、猴或其它低等灵长类动物、马、犬、兔、豚鼠或小鼠。例如，患者是人。医学领域的技术人员能够容易地鉴定患有非小细胞肺癌且需要治疗的各个患者。

术语“治疗方案”、“给药计划”和给药方案可互换使用，是指本发明组合中每一治疗剂的施用剂量和时间。

“减轻”意味着与未施用治疗相比，一种或多种症状得以减少或改善。“减轻”还包括症状持续时间的缩短或减少。

当用于诊断为患有或怀疑患有癌症的对象时，“肿瘤”是指任何尺寸的恶性或潜在恶性肿瘤或组织块，并且包括原发性肿瘤和继发性肿瘤。实体肿瘤是通常不含有囊肿或液体区域的异常生长或组织块。不同类型的实体肿瘤以形成这些肿瘤的细胞的类型命名。实体肿瘤的实例为肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血癌)通常不形成实体肿瘤(国家癌症研究所，癌症术语词典)。

“肿瘤负荷”(也称为“肿瘤负载”)是指分布在整个身体中的肿瘤材料的总量。肿瘤负荷是指整个身体(包括淋巴结和骨髓)中的癌症细胞的总数量或肿瘤的总尺寸。肿瘤负荷可通过本领域中已知的多种方法确定，如例如在从对象取出时通过例如使用测径器测量肿瘤的尺寸，或在身体中时使用成像技术(例如超声、骨扫描、计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)扫描)来测量。

术语“肿瘤尺寸”是指可作为肿瘤的长度和宽度测量的肿瘤的总尺寸。肿瘤尺寸可通过本领域中已知的多种方法确定，如例如在从对象取出时通过例如使用测径器测量肿瘤的尺寸，或在身体中时使用成像技术(例如骨扫描、超声、CT或MRI扫描)来测量。

“个体应答”或“应答”可使用指示对患者的益处的任何终点进行评估，包括但不限于：(1)在某种程度上抑制疾病进展(例如癌症进展)，包括减缓或完全阻止；(2)减小肿瘤尺寸；(3)抑制(即减少、减缓或完全阻止)癌细胞渗入邻近外周器官和/或组织；(4)抑制(即减少、减缓或完全阻止)转移；(5)在某种程度上减轻与疾病或失调(例如癌症)相关的一种或多种症状；(6)增加或延长存活期(包括总存活期和无进展存活期)的长度；和/或(7)降低在治疗后的给定时间点的死亡率。

患者对用药物治疗的“有效应答”或患者的“应答性”以及类似的用词是指给予有患有疾病或失调(如癌症)风险或患有疾病或失调(如癌症)的患者的临床或治疗益处。在一个实施方式中，此类益处包括以下任一种或多种：延长存活期(包括总存活期和/或无进展存活期)；导致目标应答(包括完全应答或部分应答)；或改善癌症的迹象或症状。

“客观应答”是指可测量的应答，包括完全应答(CR)或部分应答(PR)。在一些实施方式中，“客观应答率(ORR)”是指完全应答(CR)率与部分应答(PR)率的总和。

如本文所用的“完全应答”或“CR”意味着癌症的所有迹象响应于治疗而消失(例如所有靶损伤消失)。这并非总是指癌症得到治愈。

如本文所用，“部分应答”或“PR”是指响应于治疗，一个或多个肿瘤或损伤的尺寸减小或体内癌症的范围上的减小。例如，在一些实施方式中，PR是指以基线SLD作为参比，靶损伤的最长直径总和(SLD)的至少30％减小。

“持续应答”是指治疗终止后对减少肿瘤生长的持续效果。例如，与在药物施用阶段开始时的尺寸相比，肿瘤尺寸可为相同尺寸或更小。在一些实施方式中，持续应答具有至少与治疗持续时间相同、至少为治疗持续时间的1.5×、2×、2.5×或3×长度或更长的持续时间。

如本文所用，“无进展存活期”(PFS)是指在治疗期间及之后的时间长度，在此期间所治疗的疾病(例如癌症)未恶化。无进展存活期可包括患者经历完全应答或部分应答的时间量以及患者经历稳定疾病的时间量。

在一些实施方式中，如本文所用，治疗癌症的方法的抗癌效果(包括“目标应答”、“完全应答”、“部分应答”、“进展性疾病”、“稳定疾病”、“无进展存活期”、“应答持续时间”)由研究人员在患有局部晚期或转移性实体肿瘤而非转移性CRPC的患者中使用RECIST v1.1(Eisenhauer等，Eur J of Cancer 2009；45(2):228-47)以及在患有转移性CRPC的患者中使用RECIST v1.1和PCWG3(Scher等，J Clin Oncol 2016年4月20日；34(12):1402-18)定义并评估。Eisenhauer等，Eur J of Cancer 2009；45(2):228-47以及Scher等，J Clin Oncol2016年4月20日；34(12):1402-18的公开以引用的形式整体并入本文。

在一些实施方式中，如本文所用，治疗的抗癌效果(包括“免疫相关目标应答”(irOR)、“免疫相关完全应答”(irCR)、“免疫相关部分应答”(irCR)、“免疫相关进展性疾病”(irPD)、“免疫相关稳定疾病”(irSD)、“免疫相关无进展存活期”(irPFS)、“免疫相关应答持续时间”(irDR))针对患有局部晚期或转移性实体肿瘤的患者而非患有转移性CRPC的患者通过免疫相关应答标准(irRECIST，Nishino等，J Immunother Cancer 2014；2:17)定义并评估。Nishino等，J Immunother Cancer 2014；2:17的公开以引用的形式整体并入本文。

如本文所用，“总存活期”(OS)是指在特定时间段后组中的个体可能存活的百分比。

“延长存活期”意味着相对于未治疗患者(即相对于未用药物治疗的患者)在经治疗患者中增加总存活期或无进展存活期。

如本文所用，“药物相关毒性”、“输注相关反应”以及“免疫相关不良事件”(“irAE”)及其严重性或等级在国家癌症研究所的不良事件通用术语标准v 4.0(NCI CTCAEv 4.0)中例示及定义。

如本文所用，“与......组合”或“与......联合”是指除一种治疗形式外的另一治疗形式的施用。因而，“与......组合”或“与......联合”是指在向个体施用一种治疗形式之前、期间或之后另一治疗形式的施用。

如本文所用，“低剂量的量”是指低于临床环境中通常使用的量或剂量的物质、制剂、化合物或组合物的量或剂量。

如本文所用，术语“晚期”在涉及实体肿瘤时包括局部晚期(非转移性)疾病及转移性疾病。局部晚期实体肿瘤(其可或可不以治愈目的进行治疗)以及转移性疾病(其无法以治愈目的进行治疗)包括在如本发明中所用的“晚期实体肿瘤”的范围内。本领域的技术人员能够识别并诊断患者中的晚期实体肿瘤。

用于本发明目的的“应答持续时间”意味着从记录由于药物治疗而出现的肿瘤模型生长抑制到获得类似于预治疗生长速率的恢复生长速率的时间。

术语“相加”用于意味着两种化合物、成分或靶物质的组合的结果不大于单独每一化合物、成分或靶制剂的总和。术语“相加”意味着通过单独使用每一化合物、成分或靶制剂，所治疗的疾病病症或失调未得到改善。

术语“协同作用”或“协同”用于意味着两个化合物、成分或靶物质的组合的效果大于每一制剂单独提供的效果的总和。术语“协同作用”或“协同”意味着所治疗的疾病病症或失调相对单独使用每一化合物、成分或靶制剂存在改善。所治疗的疾病病症或失调的此种改善是“协同效应”或“协同疗效”。如本文中所定义的“协同”，“协同量”、“协同有效量”或“协同治疗有效量”是化合物、成分或靶物质在联合施用时的导致协同效应的量。确定两个或更多个成分之间的协同相互作用，效应的最佳范围以及效应的每一成分的绝对剂量范围可最终通过将成分以不同w/w(重量/重量)比范围及剂量施用于需要治疗的患者来测量。然而，体外模型或体内模型中的协同作用的观察可预测人和其它物种中的效应，并且如本文所述，存在体外模型或体内模型以测量协同效应，并且此类研究的结果也可用于通过应用药物动力学/药效学方法来预测人和其它物种中所需的有效剂量及血浆浓度比范围以及绝对剂量及血浆浓度。

等同物

前述说明以及接下来的实例详述了本公开的某些具体实施方式并且描述了发明人预期的最佳模式。然而，应理解无论前述内容以文本形式表现得如何详细，本公开可采用许多方式实施，并且应根据随附权利要求及其任何等同物解释本公开。

虽然已参照多种应用、方法、试剂盒和组合物描述了所公开的教导，但应理解在不背离本文教导以及下文要求的公开的条件下可作出多种改变和修改。提供了以下实例以更好地说明公开的教导，并且这些实施例不旨在限制本文提出的教导的范围。尽管已根据这些示例性实施方式描述了本教导，但技术人员容易理解这些示例性实施方式的许多变化和修改在不进行过度实验的条件下是可能的。所有这些变化及修改均处于当前教导的范围内。

本文中引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及其中引用的参考文献(在它们还未曾引用过的程度上)以引用的形式整体并入本文。如果并入的文献和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾，包括但不限于定义的术语、术语使用、描述的技术等，以本申请为主。

通用技术

应理解本发明不限于具体的制备合成方法(其当然可有所变化)。除非本文另有定义，关于本发明使用的科学及技术术语应具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。进一步，除非上下文另有需要，单数术语应包括复数含义且复数术语应包括单数含义。通常，关于本文所述的细胞he1组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质及核酸化学及杂交所使用的术语表以及它们的技术是本领域中熟知和常用的。

除非另外指明，否则本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其为本领域内的技术。在如以下的文献中充分地解释了这些技术：Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook等，1989)冷泉港出版社；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait主编，1984)；Methods in Molecular Biology，Human Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis主编，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney主编，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather以及P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths以及D.G.Newell主编，1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell主编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos主编，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等主编，1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等主编，1994)；Current Protocolsin Immunology(J.E.Coligan等主编，1991)；Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY(2001)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1998)；Coligan等，ShortProtocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY(2003)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley and Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.主编，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd和C.Dean主编，Oxford University Press，2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti以及J.D.Capra主编，Harwood Academic Publishers，1995)。

如本领域中通常所完成的或如本文所述，酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行。关于本文所述的分析化学、生物化学、免疫学、分子生物学、合成有机化学、以及医药及药物化学使用的术语以及它们的实验室程序及技术是本领域熟知和常用的。对化学合成、化学分析、药物制备、配制及递送以及对患者的治疗使用标准技术。

生物保藏物

本发明的代表性材料于2018年4月4日保藏在美国模式培养物集存库(10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209，USA)中。具有ATCC登录号PTA-125038的载体GDF15_001-VH包含质粒，该质粒包含编码抗体GDF15_001的重链可变区的DNA插入物，并且具有ATCC登录号PTA-125039的载体GDF15_001-VL包含质粒，该质粒包含编码抗体GDF15_001的轻链可变区的DNA插入物。在关于用于专利程序目的的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约的规定及其下(布达佩斯条约)的规则下进行保藏。这确保了从保藏日起维持30年可存活的保藏培养物。保藏在布达佩斯条约的条款下通过ATCC获得，并且服从Pfizer公司与ATCC之间的协议，其向公众确保一经发布有关美国专利或一经向公众公开任何美国或国外专利申请(无论哪个在前)便永久且无限制地可获得该保藏的培养物的后代，并且向由美国专利和商标专员根据35U.S.C.第122部分以及所依照的专员规则(包括37C.F.R.第1.14部分，特别参照886OG 638)所确定的享有的一方确保了后代的可获得性。

本申请的申请人同意，如果在合适的条件下培养时，保藏材料的培养物死亡或丢失或毁坏，一经通知便迅速用另一相同者代替。保藏材料的可获得性不解释为在违背任何政府的主管部门根据其专利法所授权的权利的前提下实践本发明的许可。

实施例

实施例1：抗GDF15抗体

通过一系列结合和生物物理学测定来生成并比较一组抗体(参见表2及表5以及图29)。

本发明的抗GDF15抗体是基于它们的氨基酸序列以及CDR区域中“热点”(例如潜在糖基化、氧化以及化学降解位点)的存在而进行分析。抗GDF15抗体的热点序列分析在下表5中示出。GDF15_005、GDF15_006、GDF15_007、GDF15_008、GDF15_009以及GDF15_200证明了CDR区域中N连接糖基化位点的存在并且未被选择用于进一步研究。

表5、抗GDF15抗体的序列分析

潜在序列不利因素(liability)位点(例如脱酰胺基：NG，异构化：DG，切割：DP)同样标有下划线。

实施例2：抗GDF15抗体的结合特性：通过SPR测定与人、食蟹猴以及鼠GDF15的结合活性

以10Hz的收集速率在37℃下使用BIAcore T200仪器(GE Healthcare)确定了抗体GDF15_001(包含含有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH以及含有SEQ ID NO:163的氨基酸序列的VL)与人、食蟹猴以及鼠GDF15的结合亲和力。根据制造商的方案使用小鼠抗体捕获试剂盒(BR100838，GE Healthcare)将小鼠Fc-人GDF15(Mu IgG1Fc_Fxa_Hu GDF15；SEQ IDNO:2)、小鼠Fc-小鼠GDF15(Mu IgG1Fc_Fxa_Mu GDF15；SEQ ID NO:5)和小鼠Fc-食蟹猴GDF15(Mu IgG1Fc_Fxa_Cyno GDF15；SEQ ID NO:4)捕获到CM4传感器芯片(目录号BR100534，GE Healthcare)表面的3个不同流动池上。运行及样品缓冲液为10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％P-20(HBS-EP+)。Mu IgG1Fc_Fxa_Hu GDF15、Mu IgG1Fc_Fxa_Mu GDF15和Mu IgG1Fc_Fxa_Cyno GDF15的最终捕获水平分别为40共振单位(RU)、32RU以及25RU。流动池1用作参比流动池。将浓度在10nM-0.625nM范围内的GDF15_001的两倍稀释系列注射到传感器表面120秒。监测解离2.8小时并使用pH 1.7的10mM甘氨酸使表面再生。通过将得到的传感图数据匹配至BIAcore T200评价软件2.0版(GE Healthcare)中的1:1Langmuir模型来针对鼠及食蟹猴GDF15确定结合亲和力及速率常数。如下表6所示确定亲和力值。

还使用本文实施例2中所述的方法学确定了GDF15结合抗体的数个克隆与小鼠Fc-人GDF15的结合亲和力，并且示于下表6中。以二价形式测试的所有克隆证明了150pM以下的表观KD值，提示它们是人GDF15的强结合剂。此外，使用上述BIAcore测定(表7)测量了克隆GDF15_001与食蟹猴及小鼠GDF15的结合。克隆GDF15_001表现出与食蟹猴GDF-15的强结合(表观KD 8.28pM)并维持与小鼠GDF15结合(表观KD 142.3pM)，使克隆GDF15_001适用于两个物种的临床前研究。

表6、结合人GDF15的抗体克隆的BIAcore动力学数据

表7、结合人、小鼠及食蟹猴GDF15的GDF15_001的BIAcore动力学数据

实施例3：抗GDF15抗体的结合特性：通过SPR测定单体抗GDF15抗体与人、食蟹猴以及鼠GDF15的结合活性

为理解在无亲合性效应情况下的结合GDF15的GDF15_001的KD值，在实施例2中所使用的同一测定中产生并测试单体Fc-Fab。以10Hz的收集速率在37℃下使用BIAcore T200仪器(GE Healthcare)确定了单体GDF15_001与人、食蟹猴以及鼠GDF15的结合亲和力是。根据制造商的方案使用小鼠抗体捕获试剂盒(BR100838，GE Healthcare)将Mu IgG1Fc_Fxa_Hu GDF15、Mu IgG1Fc_Fxa_Mu GDF15以及Mu IgG1Fc_Fxa_Cyno GDF15捕获到CM4传感器芯片(目录号BR100534，GE Healthcare)表面的3个不同流动池上。运行及样品缓冲液为10mMHEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％P-20(HBS-EP+)。Mu IgG1Fc_Fxa_Hu GDF15、Mu IgG1Fc_Fxa_Mu GDF15以及Mu IgG1Fc_Fxa_Cyno GDF15的最终捕获水平分别为19共振单位(RU)、22RU以及19RU。流动池1用作参比流动池。将浓度在10nM-1.25nM范围内的单体GDF15_001的两倍稀释系列注射到传感器表面120秒。监测解离1200秒并使用pH 1.7的10mM甘氨酸使表面再生。通过将得到的传感图数据匹配至BIAcore T200评价软件2.0版(GEHealthcare)中的1:1Langmuir模型确定了结合亲和力及速率常数。如下表8所示，单体克隆GDF15_001表现出与人(KD 21.3pM)以及食蟹猴GDF-15(KD 62.0pM)的强的结合，与鼠GDF15(KD 1965.0pM)的较弱的结合。

表8、结合人、鼠以及食蟹猴GDF15的单体GDF15001的BIAcore动力学数据

实施例4：抗GDF15抗体的结合特性：GDF15_001与人GDF15的结合特异性

为评估GDF15_001与人GDF15的结合特异性，测试了结合另外的TGFβ家族成员的GDF15_001。在Octet Red仪器上进行分析。

使用OctetRED 384(ForteBio，Menlo Park，CA)评价了单体GDF15_001(CH23LS-GBT-GDF15_001)与10个TGFβ家族成员包括人GDNF(R&D，212-GD/CF)、人抑制素A(R&D，8506-AB/CF)、人活化素B(R&D，659-AB/CF)人TGFβ-1(R&D，240-B/CF)人BMP2(R&D，355-BM/CF)、人BMP3b(R&D，1543-BP/CF)、人BMP6(R&D，507-BP/CF)、人BMP9(R&D，3209-BP/CF)、人BMP11(R&D，1958-CD/CF)、人GDF8(Pfizer，41075-201)以及对照人GDF15(Mu IgG1Fc_Fxa_HuGDF15)的脱靶结合。根据制造商的说明，在10mM醋酸钠(pH 4.5)以及连接至AR2G生物传感器(目录#18-5092，ForteBio)上的胺中将TGFβ家族成员稀释到10μg/ml。在动力学缓冲液(目录#18-5032，ForteBio)中将单体GDF15_001稀释至200nM。在室温下进行Octet测定，其中结合时间为300秒且解离时间为180秒。数据被双重引用(Myszka，D.，J.Mol.Recognit 1999；279-284)并使用Octet数据分析软件8.1版(ForteBio)进行分析。

如所预期的那样，GDF15_001结合人GDF15。在200nM的单体克隆GDF15_001下未检测到与其它TGFβ家族成员(GDF-11、BMP-9、GDF-8、BMP-2、BMP-6、TGFβ-1、活化素-B、抑制素-A)结合，证明了GDF15_001的高特异性，其不结合这些其它相关家族成员。GDF15_001的高特异性将脱靶结合的风险最小化，并表明了GDF15_001是潜在的、新的、有用的人治疗剂。

实施例5：抗GDF15抗体阻止GDF15结合GFRAL

通过竞争测定评估了GDF15_001阻止人GDF15结合GFRAL的胞外结构域的能力。使用BIAcore T200仪器(GE Healthcare，Chicago，IL)进行分析。

以10nM-2.5nM范围内的浓度将GDF15_001滴定至10nM人GDF-15中。将混合物(GDF-15、GDF15_001)以及对照物注射到被直接固定至CM4传感器芯片上的人GFRAL的胞外结构域。观察到结合GFRAL的人GDF15的浓度依赖性抑制。人GDF15与人GFRAL ECD的结合被7.5nMGDF15_001完全阻断。

这些数据证明了GDF15_001阻断人GDF15与其同源受体GFRAL之间的相互作用，并且因此可干扰GFRAL信号转导。这还证明了GDF15_001可能是用于降低由结合GFRAL的GDF15介导的活性的新的、潜在的有用的治疗剂。

实施例6：抗GDF15抗体的生物物理学特性：热稳定性

通过差示扫描量热法(DSC)评估抗GDF15抗体的热稳定性。在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中将蛋白质稀释至0.3mg/ml，体积400μl。PBS在参比池中用作缓冲液空白对照。PBS含有137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na₂HPO₄以及1.47mM KH₂PO₄，pH 7.2。使用自动进样器(Malvern Instruments Ltd，Malvern，UK)将样品分配至MicroCal VP-Capillary DSC的样品托盘中。使样品在10℃下平衡5分钟，然后以每小时100℃的速率匀速升至(scanned up)110℃。选择16秒的过滤周期。将原始数据进行基线校正并且将蛋白质浓度标准化。使用Origin软件7.0(OriginLab公司，Northampton，MA)以合适的转变次数将数据匹配至MN2状态模型。

转变温度示于图1A、1B及1C中并且列于表9中。T_m1表示抗体的C_H2展开50％时的温度。T_m2表示抗体的Fab展开50％时的温度。T_m3表示抗体的C_H3展开50％时的温度。熔融温度(T_m1)超过65℃的所有克隆均被设计为稳定克隆，其在制造及存储期间是稳定的。

表9、抗GDF15抗体的转变温度

克隆	T<sub>m</sub>1(℃)	T<sub>m</sub>2(℃)	T<sub>m</sub>3(℃)
				GDF15_001	71.67±0.08	84.30±0.25	88.00±0.04
GDF15_002	71.81±0.06	80.51±1.10	82.51±0.21
				GDF15_003	71.67±0.10	83.69±0.37	86.66±0.12
GDF15_004	71.57±0.11	84.94±0.29	88.50±0.07
				GDF15_005	71.37±0.14	83.30±0.67	85.79±0.18
GDF15_006	71.40±0.09	84.45±0.26	87.92±0.11
				GDF15_007	71.41±0.11	85.14±0.23	89.72±0.07
GDF15_008	71.70±0.14	83.05±0.76	85.33±0.24
				GDF15_009	71.35±0.15	85.42±0.31	89.88±0.09
GDF15_010	72.14±0.20	81.18±0.64	84.13±0.19
				GDF15_100	71.33±0.17	85.45±0.28	90.02±0.07
GDF15_0297	73.01±0.20	74.45±0.07	80.80±0.07
				GDF15_0301	76.14±0.06	77.20±0.04	78.82±0.05

实施例7：抗GDF15抗体的生物物理学特性：尺寸排阻色谱

通过分析型尺寸排阻色谱法(aSEC)分析抗体克隆。在磷酸盐缓冲盐(PBS)溶液中将蛋白质稀释至1.0mg/ml，并且用包含20mM磷酸钠pH 7.2、400mM NaCl的等度运行缓冲液在YMC-Pack Diol-200，300×8mm柱上通过aSEC进行分析。使用天然SEC来确定高分子量(聚集体)及单体完整抗体的相对量。将聚集体百分比计算为高分子量的峰面积除以总(聚集体及单体)峰面积乘以100。记录保留时间(单位为分钟)并与测定对照进行比较。根据aSEC分析具有正常保留时间及峰形的抗体克隆可表明在固定相树脂以及最佳疏水性的条件下相互作用最小，这些是有用的特征并表明了该抗体可以是潜在有用的治疗剂。

所测试的每种抗体克隆的保留时间示于表10中。GDF15_002显示出延迟的保留时间以及宽的峰形，因此不再进一步研究。

表10、抗GDF15抗体的aSEC保留时间

抗体	aSEC保留时间(min)
		对照mAb	10.40
GDF15_001	10.79
		GDF15_002	11.69
GDF15_003	10.22
		GDF15_004	10.24
GDF15_005	9.74
		GDF15_100	10.30
GDF15_0297	9.96
		GDF15_0301	9.91

实施例8：抗GDF15抗体的生物物理学特性：低pH下的稳定性

由于抗体是通过蛋白质A捕获来纯化并且洗脱是在低pH条件下进行，因此针对低pH保持稳定性测试了抗GDF15抗体克隆。将抗体(在PBS中为1.0mg/ml，pH 7.2)用pH3.4的甘氨酸酸化，并且在25℃下温育5小时，然后用Tris碱中和并运行aSEC以确定高分子量种类(HMMS)以及低分子量种类(LMMS)的量，参见表11。所有被测试的克隆均在低pH考验后显示出可接受的HMMS增量(<5％)。这表明抗GDF15抗体在纯化过程中保持稳定并且可能是潜在有用的治疗剂。

表11、低pH考验后HMMS及LMMS的量

实施例9：抗GDF15抗体的生物物理学特性：粘度

通过Anton Paar仪器来分析GDF15_001的粘度。使用30kDa分子量截留Amicon离心过滤单元(EMD Millipore，Billerica，MA)将GDF15_001浓缩至215mg/mL。使用20mM组氨酸、85g/L蔗糖、0.05mg/ml EDTA pH 5.8缓冲液作为稀释剂来制备46-178mg/mL范围内的一系列稀释液。通过在SoloVPE可变路径长度系统(C Technologies，Inc，Bridgewater，NJ)上进行280nm分析来确定蛋白质浓度。在25℃下以150rpm的恒定旋转速度在MCR-302流变仪(Anton Paar USA Inc.，Ashland，VA)上使用CP25-1锥和板来进行粘度测量。针对每一样品总共收集10个10秒的测量结果，并且使用Rheoplus(Anton Paar USA Inc.)V 3.62软件来分析数据。粘度以厘泊(cP)单位进行报告。

GDF15_001的粘度示于图2中。数据显示了在约140mg/ml时达到了可接受的粘度限值(20cP)，从而使GDF15_001的皮下注射可行，进一步表明了该抗体是有用的潜在治疗剂。

实施例10：抗GDF15抗体的免疫原性

基于非种系T细胞表位的检测以及计算出的tReg调整分数，预测了本发明抗GDF15抗体以及本领域中已知的作为hu01G06(hu01G06的VH及VL序列在本文中分别被提供为SEQID NO:177以及SEQ ID NO:178(VH，WO2014/100689的SEQ ID NO:248，以及VL，WO2014/100689的SEQ ID NO:254))的另一抗GDF15抗体的免疫原性。较低的tReg调整分数预测了免疫原性风险的较低可能性。

使用两个方案(下文方案1及2)识别表位来分析序列。通过任一方案的本文所述的规则识别的任何序列均被视为表位。以氨基酸9-mer的水平检查序列。

方案1-ISPRI/EpiMatrix：在ISPRI软件包(ISPRI v 1.8.0，EpiVax，Providence，RI(2017)；Schafer等，Vaccine 16(19)，1880-84(1998))中对序列进行EpiMatrix分析。原始结果提供了每一9-mer氨基酸片段针对8种不同HLA类型的结合可能性的排序。因此，对于每一9-mer存在8次预测(“观察”)。从序列的每一单独线性编号位置开始生成9-mer。同一9-mer可能在同一序列中出现一次以上。如果任何4次观察均表明9-mer在结合物的前5％，意味着对于至少4种HLA类型，预测9-mer在结合物的前5％，则9-mer被视为预测表位。另外地，如果8次预测中的任一次表明9-mer在结合物的前1％，则9-mer也被视为预测表位。

方案2-IEDB共识方法：在免疫表位数据库(IEDB)(IEDB MHC-II BindingPredictions，http://www.iedb.org；Vita等，Nucleic Acids Res.Jan 28(43)，D405-12(2015))中使用MHC-II结合共识方法(Wang等，BMC Bioinformatics 11，568(2010)；Wang等，PLoS Comput Biol.4(4)，e1000048(2008))对序列进行分析。软件的输出通过15-mer来布置结果。针对15-mer与HLA类型的每一组合提供共识分数以及百分等级。然而，产生每一15-mer的共识的各个分数是15-mer中发现的某些9-mer的等级：用于共识的每一方法均报告了15-mer内的9-mer的百分等级，并且被取作全体15-mer的值的共识是具有中值分数的9-mer的预测。如果(a)9-mer被选为代表15-mer的共识并且(b)9-mer针对所考虑的HLA类型具有在结合物前10％的百分等级，并且如果准则(a)及(b)对于相同9-mer针对三种或更多种不同的HLA类型出现(即三次观察)，则9-mer被分类为表位。考虑的HLA类型为DRB1*01、1*03、1*04、1*07、1*08、1*11、1*13和1*15，它们是标准ISPRI/EpiMatrix报告中的相同HLA类型。为便于与方案1比较，重新解释了数据以获得预测9-mer表位的列表，尽管共识方法的初级输出是15-mer的等级。

每一表位被分类为种系或非种系表位。对于抗体，每一表位基于其在抗体内的位置被进一步分类(例如CDR或非CDR)。过滤从IMGT(www.imgt.org)获得的人V结构域的序列以除去被注解为假基因或开放阅读框架的种系。剩余序列中发现的任何预测9-mer表位被视为种系表位。J或C区(包括IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4)或这些区域之间的接合中发现的表位也被分类为种系表位。否则，表位被分类为非种系表位。

CDR定义是基于Kabat的方法，其中CDR被定义为包括以下残基：HCDR-1(H26-H35，包括插入物，如H35A，直至H36但不包括H36)、HCDR-2(H50-H65，包括端值)、HCDR-3(H95-H102，包括端值)、LCDR-1(L24-L34，包括端值)、LCDR-2(L54-L56，包括端值)、LCDR-3(L89-L97，包括端值)。如果预测9-mer表位的任一氨基酸是CDR区的一部分，则将该预测9-mer表位定义为CDR表位。

总序列分数(tReg调整分数)：对于个别链或对于抗体VH及VL结构域的配对，可如下文所述通过对每一组成的9-mer进行求和来计算总分数。

检查9-mer与HLA类型的所有个别组合(“观察”)，无论9-mer是否为表位。如果特定观察表明对于给定HLA类型，肽处于结合剂的前5％，则将该观察的EpiMatrix Z分数添加至与整个蛋白质序列相关的累计总数。还记录了所检查的观察的总数。仅有的例外是，被ISPRI识别为“T-regitopes”(单克隆抗体框架区内的氨基酸序列，其可潜在地活化天然调节性T细胞并减少不需要的免疫应答)的9-mer上的所有观察均被假设具有零的EpiMatrix分数。

在累计总数中，从每一观察(包括T-regitopes)中减去0.05*2.2248的基线分数。如下计算最终分数：tReg调整分数＝(累计总数)*1000/(观察数目)。

计算出的分数列于表12中。如上所述，较低的分数表示较低的预测免疫原性潜能。本发明的抗GDF15抗体具有低于hu01G06的分数。克隆GDF15_001、GDF15_004、GDF15_005以及GDF15_013具有最低分数，因此具有最低的引起免疫原性应答的潜在预测风险。这进一步表明了本发明的抗体是潜在的有用治疗剂。

表12、GDF15 mAb的免疫原性风险预测、tReg调整分数

克隆#	分数(tReg调整)
		GDF15_001	-41.58
GDF15_002	-39.34
		GDF15_003	-26.99
GDF15_004	-42.06
		GDF15_005	-50.36
GDF15_006	-34.21
		GDF15_007	-39.6
GDF15_008	-24.95
		GDF15_009	-29.30
GDF15_010	-34.08
		GDF15_012	-38.79
GDF15_013	-42.09
		GDF15_014	-34.36
GDF15_015	-34.18
		GDF15_017	-38.82
GDF15_018	-33.79
		GDF15_020	-33.64
GDF15_021	-31.56
		GDF15_022	-33.16
GDF15_100	-36.41
		GDF15_200	-26.01
hu01G06	-20.36

还基于上述计算机模拟方法来比较GDF15_001与hu01G06的预测T细胞表位。如下表13所示，hu01G06在重链中具有两个预测T细胞表位并且在轻链中具有一个预测T细胞表位，而GDF15_001不具有任何预测T细胞表位。这表明了在与hu01G06相比时，GDF15_001也具有较低的引起免疫原性应答的潜在风险。这进一步表明了GDF15_001是具有改善的特征的潜在有用的新治疗剂。

表13、GDF15_001与hu01G06的预测T细胞表位

名称	重链	轻链
			Hu01G06	2	1
GDF15_001	0	0

实施例11：在健康小鼠中抑制人和鼠GDF15

在经腺相关病毒(AAV)-人GDF15处理的健康C57BL6N小鼠中评估GDF15_001抑制人GDF15活性的能力。AAV-人GDF15处理后两周，循环人GDF15水平提高至大约17ng/mL(图3)，并且体重减少15％(图4)。与IgG对照相比，在经AAV-人GDF15处理的小鼠中，GDF15_001的施用快速逆转了体重(图4)、脂肪(图5)以及无脂肪重量损失(图6)。GDF15_001在经AAV对照载体处理的小鼠中无作用。

还在经AAV-鼠GDF15处理的健康C57BL6N小鼠中评估了GDF15_001抑制鼠GDF15活性的能力。AAV-鼠GDF15施用后11天，循环鼠GDF15水平提高至大约3ng/mL(图7)，并且体重减少大约10％(图8)。与IgG对照相比，在经AAV-人GDF15处理的小鼠中，GDF15_001的施用快速逆转了重量损失(图8)并且增加了食物摄取(图9)。GDF15_001在经AAV对照载体处理的小鼠中无作用。

这些数据证明了即使在GDF15的水平提高的情况下，GDF15_001在健康小鼠中逆转了由于无脂肪重量损失及脂肪质量损失二者导致的重量损失并增加了食物摄取。

实施例12：在带有纤维肉瘤(HT-1080)的小鼠中抑制人GDF15

为确定GDF15_001是否可在荷瘤小鼠中逆转恶病质并增加寿命，经皮下给严重免疫受损(SCID)小鼠植入HT-1080人纤维肉瘤细胞。在肿瘤植入后两周，体重下降大约10％(图10)。与IgG对照相比，GDF15_001的施用快速逆转了体重质量损失(图10)、脂肪质量损失(图11)以及无脂肪重量损失(图12)。与IgG对照相比，除身体构成改善外，GDF15_001还增加了存活期(图13)。

为确认在热平衡条件(其中消除了基础代谢率的冷应激升高)下GDF15_001在带有HT-1080肿瘤的小鼠中的代谢益处，在小鼠饲养于86°F下时重复该研究。循环人GDF15升高至～5ng/mL(图14)。与IgG对照相比，GDF15_001的施用维持了重量损失的快速逆转(图15)。GDF15_001在不带有肿瘤的相同小鼠中对这些参数中的任一个都没有影响。

这些数据证明了GDF15_001在荷瘤小鼠中增加了存活期并逆转了恶病质。因此，这些结果进一步表明了GDF15_001是潜在的新的人治疗剂。

实施例13：在带有胰腺肿瘤的小鼠中抑制人GDF15

为进一步评价GDF15_001是否可在荷瘤小鼠中逆转恶病质并增加寿命，经皮下给SCID小鼠植入来自胰腺肿瘤肝转移，肿瘤组织片断的PA-0165。循环人GDF15升高至～2ng/mL(图16)。在肿瘤植入后4周，体重下降大约10％(图17)。与IgG对照相比，GDF15_001的施用完全防止了重量损失(图17)。与IgG对照相比，除体重改善外，GDF15_001还增加了存活期(图18)。

这些数据也证明了GDF15_001在荷瘤小鼠中增加了存活期并逆转了恶病质。因此，这些结果进一步表明了GDF15_001是潜在的新的人治疗剂。

实施例14：在用抗癌制剂处理的荷瘤小鼠中抑制人GDF15

为确定GDF15_001是否可在用抗癌制剂处理的荷瘤小鼠中逆转恶病质并增加寿命，经皮下给BALB/c小鼠植入RENCA(鼠肾腺癌)细胞。循环鼠GDF15升高至～8ng/mL(图19)。当肿瘤尺寸达到100mg时，开始用抗癌剂索拉非尼进行处理，然后当达到10％重量损失时加入GDF15_001或IgG对照(图20)。向经索拉非尼处理的小鼠施用GDF15_001完全逆转了重量损失(图20)。与索拉非尼+IgG对照相比，除体重改善外，索拉非尼+GDF15_001的组合增加了存活期(图21)。

还在经抗癌制剂顺铂处理的荷瘤小鼠中检查了GDF15_001改善体重的能力。经皮下给SCID小鼠植入NSX-26115(来自人非小细胞肺癌腺癌)肿瘤组织片段。循环人GDF15升高至～4.5ng/mL(图22)。当肿瘤尺寸达到100mg时，达到10％重量损失，并且开始用抗癌制剂顺铂连同GDF15_001或IgG对照进行处理(图23)。还给出了GDF15_001或IgG对照而无顺铂。与IgG对照相比，当在有或无顺铂的情况下给出时，GDF15_001的施用逆转了重量损失(图23)。与顺铂+IgG对照相比，除体重改善以外，顺铂+GDF15_001的组合还增加了存活期(图24)。

这些数据也证明了GDF15_001在经抗癌制剂处理的荷瘤小鼠中增加了存活期并逆转了恶病质。因此，这些结果进一步表明了GDF15_001是新的潜在的人治疗剂。

实施例15：抗GDF15抗体的给药

存在与确定抗GDF15抗体的有效剂量及给药方案以用于恶病质治疗相关的挑战。总有效剂量取决于患者中的初始循环GDF15浓度，已知该浓度是可变化的。此外，恶病质患者中的游离GDF15水平响应于治疗而以不同的速率降低。因此，针对给定的给药间隔的有效剂量可定义为给予70kg患者的量，该量在稳定状态下在整个给药间隔中将游离GDF15水平降低至小于0.5ng/mL(即在多个剂量后，使得某一剂量后的最大浓度与前一剂量后的最大浓度基本上相同)。基于针对健康对象报告的数据来选择该游离GDF15水平(Wollert等，2017，J Appl Lab Med 1(5):510-521)。因此，本文所公开的有效剂量被描述为患病对象中的起始游离GDF15水平以及将该水平降低至小于0.5ng/mL的函数。可以例如使用电化学发光免疫分析方法(如ELECSYS GDF15测定(Roche Diagnostics))来测量样品中的游离GDF15水平。ELECSYS GDF15测定使用生物素-链亲和素技术并且基于夹心免疫测定原理(参见Wollert等，2017)。还可使用本领域中已知的可测量样品中游离GDF15的量的其它测定来确定患者中的游离GDF15水平。

为克服挑战以预测本文所公开的抗体的有效剂量及剂量方案，开发出了二区室药物动力学模型。通过将指定的量定量加入仓库(其随后以指定速率k_a吸收至中央区室中)中来模拟抗GDF15抗体的皮下给药。抗体分布至周边区室中，并且随后从中央区室清除。如本文所用，术语“仓库”是指储存药物的位点(例如皮下空间)，术语“中央区室”是指血管空间以及高度灌注的器官(例如肝、肾以及肺)，并且术语“周边区室”是指灌注较少的组织(例如脂肪以及肌肉)。

通过根据表达人FcRn的小鼠中GDF15_001的药物代谢动力学研究中的参数进行定标来确定GDF15_001的参数。简单来说，通过静脉内向6只小鼠定量施用1mg/kg的GDF15_001并且监测1000小时；将所得抗体药物代谢动力学匹配至二区室药物代谢动力学模型。可采用类似的方式来确定本文所公开的其它抗体的参数。GDF15_001产生于中央区室中，分布到周边区室，并从这两个空间清除。假设体积及分布速率与上述药物代谢动力学研究中针对GDF15_001所确定的相同。基于实验来选择周转量以给出GDF15_001的16.6小时半衰期，该实验对在两名健康志愿者中将稳定同位素标记的氨基酸掺入循环GDF15中进行了量化(实验方法基本上如Lassman等，2014，Clin Chem60(9):1217-1224中所提供)。选择GDF15合成速率以给出GDF15的指定循环水平。该循环水平可表示针对给定疾病所报告的最高水平(以治疗具有对应病症的所有患者)、较低阈值但仍高于对象的指定部分的值(以控制最大剂量，同时允许治疗大部分患者)、或针对具体对象确定的具体水平以允许更精确的个别化的剂量。对于与人疾病相关的GDF15水平的范围，参见例如：Mutlu等，2015，Inflammation 38(5):1805-1813；Montero等，2016，PLoS One 11(2):e0148709；Kempf及Wollert，2009，Heart Fail Clin 5(4):537-547；以及Lerner等，2016，Oncol Lett 12(5):4219-4223。

在中央及周边区室中，基于抗体的结合及解离速率常数，GDF15可以可逆地结合抗GDF15抗体。对于GDF15_001，基于Biacore测量，分别将这些参数确定为1.59×10⁶M^-1s^-1(k_a)以及3.42×10^-5s^-1(k_d)(相当于21.3pM的平衡解离常数)(参见上表8)。可对本文所公开的其它抗体进行类似的测定，或可使用这些参数作为输入参数以探寻改变亲和力对剂量的影响。不希望束缚于任何特定的理论，使用与针对抗体本身所确定的相同的药物代谢动力学参数使抗体/GDF15复合物分布在这两个区室之间并从中央区室清除。二区室给药模型的参数示于表14中。

表14、GDF15_001二区室给药模型参数

作为对象中起始游离GDF15水平的函数的GDF15_001的预测治疗有效皮下剂量示于表15、16及17以及图25、26及27中。示出了用于每周、每两周以及大约每月的给药的预测治疗有效剂量。

本文提供的给药数据表明了GDF15_001可以以此种量及给药间隔施用，使得其可实现游离GDF15水平的潜在治疗水平拐点降低。这些结果证明了GDF15_001的给药可采用给药方案来达到并维持，该给药方案可行并保证患者依从性。

表15、用于降低GDF15水平的GDF15_001的皮下施用的可能的每周给药

起始游离GDF15(ng/mL)	每周皮下剂量(mg)
		5	2
10	5
		15	7
20	10
		25	12
30	15
		50	25
75	40
		100	50

表16、用于降低GDF15水平的GDF15_001的每两周皮下施用的可能的给药

表17、用于降低GDF15水平的GDF15_001的大约每月皮下施用的可能的给药

起始游离GDF15(ng/mL)	每四周皮下剂量(mg)
		5	15
10	40
		15	60
20	75
		25	100
30	115
		50	200
75	300
		100	385

实施例16：在RCC的皮下模型中使用抗PD-1(F2)抗体以及抗GDF15(GDF15-297)进行组合处理

本文公开的数据证明了在鼠RENCA转移性肾细胞癌(RCC)模型中抗GDF15抗体与抗PD1抗体组合疗法的协同疗效。

如下生成荷瘤动物：从Jackson Laboratories购买6-8周龄雌性BALB/c小鼠。将所有动物饲养在CID处的无病原体的动物饲养所中，并且根据与机构动物照顾与使用委员会(IACUC)准则一致的方案来进行实验。从美国模式培养物保藏所(ATCC)购买RENCA细胞系。在Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)中培养细胞，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺(37℃，5％二氧化碳(CO₂))，并在研究动物诊断实验室(RADIL)(Columbia，MO)针对病原体对细胞进行冲击测试。收获在指数生长期中生长的无病原体细胞并用于肿瘤接种。使用0.1mL的无血清DMEM中的0.2×10⁶RENCA在右胁腹皮下接种BALB/c小鼠。

如下进行肿瘤体积分析：当肿瘤达到目标尺寸时，将小鼠随机分为数不同处理组。随机选择在同一天(即第0天)开始处理。使用测径器每周在2个维度上两次测量肿瘤尺寸，并且使用以下公式以立方毫米表示体积：V＝0.5L×W²，其中L是肿瘤的最长直径并且W是垂直于L的直径。每周两次记录体重。

该研究中使用的治疗性抗体为：小鼠抗小鼠PD1 F2(小鼠免疫球蛋白G1[mIgG1])以及小鼠抗小鼠GDF15_0297，其包含Fc中的小鼠IgG1效应子功能无效D265A突变(即氨基酸残基编号265处的天冬氨酸(Asp，D)突变为丙氨酸(Ala，A))。抗体GDF15_0297实质上为GDF15_001的小鼠替代抗体，其类似地结合该抗体。同样，F2是类似地结合萨善利单抗(RN888)的小鼠替代抗体。分别在磷酸盐缓冲盐(PBS)溶液(Life Technologies)中将抗PD1抗体和抗GDF15抗体稀释至2mg/mL的浓度，并且在“处理日0”(d0)经腹膜内(ip)对每只小鼠以10mg/kg给药。相对于同种型对照(阴性对照小鼠IgG1)或其它处理组，应用单向或双向ANOVA以比较多组之间的统计学差异。应用未配对t检验以比较两组之间的统计学差异。将P<0.05视为显著差异。

使用RENCA模型来评价在rRCC模型中抗GDF15与抗PD1组合的疗效，平均起始肿瘤尺寸25-38mm³(n＝10只动物/组)。在处理开始后监测动物两周。移植后11天开始处理(即腹膜内施用抗GDF15和抗PD1)。当与对照同种型处理组相比时，抗GDF15抗体和抗PD1抗体组合处理显著抑制了RENCA rRCC皮下肿瘤的进展。在此环境中，抗GDF15单一疗法和抗PD1单一疗法未有效抑制肿瘤进展(表18和表19)。

表18：随时间对皮下RENCA肾癌进行的肿瘤测量(平均值±SEM)

肿瘤体积表示单位为mm³。N＝每组内的动物数量；SEM＝平均值的标准误差。

表19：与同种型对照相比，随时间对皮下RENCA肾癌进行的肿瘤测量之间的统计学比较

表19中所示的统计学分析结果证明了使用抗GDF15抗体与抗PD1组合进行的处理在RCC癌症模型中的肿瘤进展早期具有协同效果。

实施例17：使用抗PD1抗体和抗GDF15抗体的组合治疗胰腺癌

此实施例示出了在鼠转移性胰腺癌模型(即Pan02模型)中的抗GDF15抗体和抗PD1抗体组合疗法的协同疗效。为便于识别原位模型中的肿瘤生长，使用荧火虫荧光素酶构建体感染Pan02(NHI/NCI)细胞，生成Pan02荧光素酶细胞。

从Jackson Laboratories购买6只8周龄雌性B6(Cg)-Tyrc-2J/J(B6白化)小鼠。将所有动物饲养在CID处的无病原体动物饲养所中，并且根据与机构动物照顾与使用委员会(IACUC)准则一致的方案来进行实验。

从NHI/NCI获得Pan02细胞系。在Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)中培养细胞，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺(37℃，5％二氧化碳(CO₂))，并在研究动物诊断实验室(RADIL)(Columbia，MO)针对病原体对细胞进行冲击测试。收获在指数生长期中生长的无病原体细胞并用于肿瘤移植。将白化B6小鼠在胰腺中注射含有0.2×10⁶mLPan02-荧光素酶的无血清DMEM以及基质胶(Corning，ref 356237)的20μL肿瘤细胞:基质胶混合物。移植后4天，通过发光水平评估肿瘤负荷。将动物分组并开始试验。为检测荧光素酶释放量，将动物注射0.1mL的30mg/mL D-荧光素一钠盐盐溶液(Pierce，#88292)。在培养基容器处暴露1-15秒(1F/光圈)后，在IVIS谱CT(Caliper Life Science)上检测发光水平。通过LivingImage 4.5.1软件分析图像。将肿瘤负荷计算为在减去背景值之后的ROI(目标区域)中的光子/秒。在一个实例中，在入组时的平均释放为4.8*10⁸光子/秒。在另一实例中，在入组时的平均释放为1.8*10⁸光子/秒。

小鼠抗小鼠PD1 F2抗体(小鼠免疫球蛋白G1[mIgG1])以及小鼠抗小鼠GDF15_0297抗体如实施例16中所述。分别在磷酸盐缓冲盐(PBS)溶液(Life Technologies)中将抗PD1抗体和抗GDF15抗体稀释至2mg/mL的浓度，并且腹膜内(ip)对每只小鼠以10mg/kg的剂量给药。在另一实例中，将抗PD1抗体稀释至1mg/mL的浓度并且对每只小鼠以5mg/kg的剂量给药。在每种情况下，在同一天(处理日0)施用PD1抗体和GDF15抗体。

每周基于经处理的动物中的发光水平监测肿瘤进展。如上所述确定发光水平。每周记录体重。

移植后第35天，根据以下公式确定同种型抗体、抗GDF15抗体、抗PD1抗体以及抗GDF15抗体+抗PD1组合的动物之间的肿瘤负荷的变化：肿瘤负荷的变化＝(d35的光子通量-d4的光子通量)/第4天的光子通量。抗GDF15抗体+抗PD1抗体处理显著降低了移植有Pan02肿瘤的动物的肿瘤负荷，导致与抗PD1、抗GDF15以及同种型组(分别为4/12、1/12以及0/12)相比，8/12只动物表现出肿瘤退行的迹象。结果概括在下表20中。在表20中，列出了每组12只动物的每只的个体结果。

表20、移植后35天经Pan02移植的动物中的肿瘤负荷的变化

与66天(抗PD1)、52.5天(抗GDF15)以及45天(同种型对照)的存活期相比，肿瘤负荷的这些变化对应于经抗GDF15抗体+抗PD1抗体处理动物的增加的存活期，其中平均存活期延长至90天。当与在实验结束(第145天)时的对照同种型组p值相比时，p值为p<0.0001(抗GDF15+抗PD1)、p＝0.0010(抗PD1)以及统计学上不显著(ns)(抗GDF15)。在第79天，在经抗GDF15+抗PD1组合以及抗PD1单一疗法处理的动物的存活期之间存在统计学上显著的差异，反映在通过Matel-Cox检验建立的p＝0.05以及通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验建立的p＝0.042。

在另一实例中，在具有1.8*10⁸光子/秒的通过入组时的发光释放量估计的平均肿瘤负荷的Pan02胰腺癌模型中(n＝13只动物/组)评价了10mg/kg的抗GDF15抗体与5mg/kg的抗PD1抗体组合的疗效。在移植后4天开始处理。在第39天，经抗GDF15+抗PD1处理的组肿瘤体积在38％的动物中下降至检测限以下。PD1单一疗法仅在15％的动物中导致肿瘤减小，而同种型对照以及抗GDF15单一疗法二者在此环境中未表现出治疗益处。

这些结果证明了使用抗GDF15抗体与抗PD1组合进行的处理提供的协同抗肿瘤效果大于单独提供的每一处理对原位胰腺癌模型进展的叠加效果。

因此，这些数据证明了抗GDF15与PD1-1轴拮抗剂的组合疗法将是用于治疗癌症的新的有用的协同疗法。

实施例18、在癌症免疫疗法中用于测试功效的小鼠同源模型的选择

为选择合适的模型以确定抗GDF15疗法的疗效，测试了以下小鼠同源细胞系：MC38(由加利福尼亚大学，Los Angeles，CA的Antoni Ribas博士善意提供)、Pan02(NHI/NCI)、4T1(ATCC)、RENCA(ATCC)、CT26(ATCC)、ID8(堪萨斯大学以及堪萨斯大学医疗中心)、LL2(ATCC)、B16F10(ATCC)以及GL261(NHI/NCI)。通过小鼠GDF15ELISA试剂盒(R&D Systems，MGD 150)分析了条件培养基中的GDF15水平。在6孔细胞培养板(353224，Corning)中培养细胞(一式三份，0.3×10⁶个细胞/孔)，并且培养48小时。收集上清液，以2.000rpm离心5-10分钟，转移至新鲜的管中并在+4℃下存储。通过BioRad TC 20细胞计数器采用台盼蓝排除法来估计活/死亡细胞的量。记录每一样品的体积和细胞数量。结果示于表21中。

表21

细胞系	pg/ml	SD	复制
				4T1	0	0.33	3
B16-F10	12.8	0.71	3
				CT26	0	0.25	3
GL261	14.72744	2.38	3
				ID8	6.375451	0.47	3
LL2	4.20784	1.35	3
				MC38	55.65824	3.56	3
PAN02	38.44435	16.32	3
				RENCA	342.397	8.08	3

为选择合适的体内模型，通过眼球后方法收集来自荷瘤动物的血液并将其转移至微容器采血管(365967，BD)。记录肿瘤体积并在适当时调整至200mm³。从末期动物(移植后35-40天)采集带有Pan02原位肿瘤的动物的血清。收集无肿瘤的遗传背景匹配的动物的血清作为对照。通过小鼠GDF15 ELISA试剂盒确定小鼠GDF15水平并示于表22中。

表22

转移性肾RCC小鼠模型(RENCA)以及胰腺癌模型(Pan02)被鉴定为体内GDF15的最高生产者并进一步用于体内研究以确定抗GDF15疗法与基于免疫肿瘤学的疗法组合的治疗潜力。

实施例19、使用抗CD40抗体以及抗GDF15抗体的组合疗法

此实施例示出了抗GDF15抗体和抗CD40抗体组合疗法在鼠RENCA转移性RCC模型中的治疗活性。

从Jackson Laboratories购买6-8周龄雌性BalbC小鼠。将所有动物饲养在CID处的无病原体动物饲养所中，并且根据与机构动物照顾与使用委员会(IACUC)准则一致的方案来进行实验。

从美国模式培养物保藏所(ATCC)购买RENCA细胞系。在Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)中培养细胞，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺(37℃，5％二氧化碳(CO₂))，并在研究动物诊断实验室(RADIL)(Columbia，MO)针对病原体对细胞进行冲击测试。收获在指数生长期中生长的无病原体细胞并用于肿瘤接种。使用0.1mL的无血清DMEM中的0.2×10⁶RENCA在右胁腹皮下接种BalbC小鼠。

在磷酸盐缓冲盐(PBS)溶液(Life Technologies)中将抗小鼠CD40抗体FGK45(小鼠IgG1)和抗小鼠GDF15抗体GDF_0297(包含小鼠效应子功能无效IgG1 Fc，其包含氨基酸残基编号265处的天冬氨酸取代为丙氨酸(D265A))稀释至2mg/mL的浓度，并且腹膜内(ip)对每只小鼠以10mg/kg的剂量给药。在另一实例中，将抗CD40稀释至1mg/mL的浓度，并且对每只小鼠以5mg/kg的剂量给药。

当肿瘤达到目标尺寸时，将小鼠随机分为不同处理组。随机选择在同一天开始处理。使用测径器每周两次在两个维度上测量肿瘤尺寸，并且使用以下公式以立方毫米表示体积：V＝0.5L×W²，其中L是肿瘤的最长直径并且W是垂直于L的直径。每周两次记录体重。

为分析对肿瘤浸润及脾白细胞的状态进行联合处理的结果，进行了以下分析。根据制造商的改良方案使用平缓MACS^TM以及Miltenyi小鼠解离试剂盒(Miltenyi Biotec)将肿瘤散布至单个细胞悬浮液中。使用氯化钾铵(ACK)溶解缓冲液(Life Technologies)除去红细胞。使用FACS染色缓冲液(补充有10％FBS的PBS)洗涤细胞两次，最后重悬浮在FACS染色缓冲液中。对于脾白细胞，将切下的脾用3mL消化溶液灌注，该消化溶液包含0.2mg/mL的Liberase TL(5401020001，Roche)以及20u/mL DNase I Roche(4716728001，Roche)。在37℃下培养脾15分钟，同时轻轻摇动。培养结束时，通过添加1mL的FBS来终止酶活性，将脾切成小片并过滤至50mL锥形管，在PBS中洗涤细胞，以1500fpm离心5分钟，并且将所得颗粒状物重悬浮在冷MACS缓冲液中。使用ACK溶解缓冲液除去红细胞。

在将表型mAb添加至特异性染色免疫细胞中前，将细胞的等分试样与0.5μg/10⁶个小鼠BD Fc块细胞(Biolegend，101310)在PBS中的10％大鼠血清中预培养。通过在4℃下培养细胞30分钟来对细胞表面抗原进行标记。在除去未结合的mAb之后，使用FACS染色缓冲液洗涤细胞两次，将细胞固定在固定缓冲液(PBS+1％多聚甲醛)中，并且在4℃下在暗处存储直至通过流式细胞术进行分析。根据制造商的方案使用Foxp3/转录因子染色缓冲设置(eBioscience)进行胞内染色。使用Fortessa^TMSORP(BD Biosciences)获得流式细胞术数据，并使用FlowJo^TM(TreeStar Inc.)进行分析。

从BD Biosciences、eBioscience、Invitrogen或Biolegend购买用于细胞表面或胞内染色的抗体。它们是大鼠抗小鼠CD45-PerCP-Cy5.5(克隆30-F11，BD Biosciences)、大鼠抗小鼠CD11b Texas Red(M1/70，BD Biosciences)、大鼠抗小鼠CD25-BUV395(PC61，BDBiosciences)、大鼠抗小鼠Ly6G-FITC(1A8，BD Biosciences)、大鼠抗小鼠CD90.2-BV786(53-2.1，BD Biosciences)、大鼠抗小鼠CD8-BV650(53-6.7，BD Biosciences)、大鼠抗小鼠Ly6C-BV421(AL-21，BD Biosciences)、大鼠抗小鼠F4/80-PECy7(BM8，Invitrogen^TM)、大鼠抗小鼠CD86-BV605(GL1，BD Biosciences)、亚美尼亚仓鼠抗小鼠CD49a-APC(HMA1，BioLegend)、大鼠抗小鼠MHCII(IA-IE)-Alexa Fluor 700(M5/114.15.2，BioLegend)、大鼠抗小鼠CD4-V450(RM4-5，BD Biosciences)、大鼠抗小鼠Foxp3-PE(FJK-16s，eBioscience)。为避免染色伪像，将样品置于Brilliant染色缓冲液(BD Biosciences)中。使用LIVE/DEADFixable eFluor^TM780死亡细胞染色试剂盒(Invitrogen)将活细胞与死亡细胞分离。

结果被表示为平均值±SEM。使用GraphPad Prism 6.0进行统计学分析。相对于同种型对照或其它处理组，应用单向或双向ANOVA以比较多组之间的统计学差异。应用未配对t检验以比较两个组之间的统计学差异。将P<0.05视为显著差异。

使用RENCA模型来评价抗GDF15与抗CD40组合对rRCC模型的疗效，平均起始肿瘤尺寸25-38mm³(n＝10只动物/组)。当肿瘤体积达到2000mm³或20％体重损失时杀死动物。对于同种型、单独的抗GDF15抗体、单独的抗CD40抗体以及抗GDF15抗体+抗CD40抗体组合，带有肿瘤的动物的中值存活期分别是26、25.5、32.5以及34天。当与同种型、单独的抗GDF15抗体以及单独的抗CD40抗体组中的0％相比时，抗CD40抗体组合+抗GDF15抗体组还导致了30％完全应答者。

在单独的研究中，在RENCA复发性肾细胞癌(rRCC)模型中评价了抗GDF15抗体与两种不同用量的抗CD40抗体(10mg/kg和5mg/kg)组合的疗效，平均起始肿瘤尺寸为47-54mm³(n＝10只动物/组)。结果概括在表23及表24中。

表23、随时间对皮下Renca肾癌进行的肿瘤测量(平均值±SEM)

肿瘤体积表示单位为mm³。N＝每一组内的动物的数量；SEM＝平均值的标准误差。

表24：与同种型对照相比，随着时间的过去对皮下RENCA肾癌进行的肿瘤测量之间的统计学比较

对于同种型、单独的抗GDF15抗体、抗CD40抗体(5mg/kg)、抗CD40抗体(10mg/kg)以及抗GDF15抗体(10mg/kg)+抗CD40抗体(5mg/kg)组合及抗GDF15抗体(10mg/kg)+抗CD40抗体(10mg/kg)组合，带有肿瘤的动物的中值存活期分别是29.5、29.5、36、36、38以及44.5天。

为确定肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在抗GDF15介导的抗肿瘤应答中的贡献，在最后处理后24小时将TIL从RENCA肿瘤分离，并针对与抗肿瘤免疫应答相关的标志物进行分析。结果概括在图29中(p值通过未配对t检验确定；p＝0.0026)。

与同种型处理组相比，联合处理[抗GDF15抗体(10mg/kg)+抗CD40抗体(10mg/kg)]将肿瘤中门控为CD11b+、F4/80+、Ly6C-细胞的巨噬细胞的活化状态(MHCII MFI)平均提高187％(图29)。相反，抗CD40单一疗法将MHCII MFI提高67％(图29)。抗GDF15单一疗法未提高巨噬细胞的活化状态(图29)。

同种型以及抗GDF15组中的CD8+T细胞/调节性T细胞(Treg)的比分别为2.4以及2.1(图30，实心圆和实心三角形)。在单独的抗CD40抗体处理中CD8+T细胞/Treg比提高至17(图30，空心圆)。相反，使用抗GDF15抗体+抗CD40抗体的联合处理导致84的CD8+T细胞/Treg比(图30，空心三角形)。

这些结果证明了基于抗GDF15的疗法有效增强抗CD40疗法的抗肿瘤功效。

除在RRC模型中增强抗CD40疗法的抗肿瘤功效外，基于抗GDF15的疗法减轻了抗CD40诱导的毒性(表现为经处理的动物的体重损失)。虽然基于抗CD40的疗法在经处理的动物中导致了4.43％体重损失，与经同种型对照处理的组中的1.2％体重增加相比，抗GDF15抗体+抗CD40抗体组合组表现出1.5％的体重增加(n＝20只动物/组，抗CD40抗体vs抗CD40抗体+抗GDF15抗体，通过未配对t检验确定p＝0.0006)。抗CD40抗体+抗GDF15抗体组中的体重的恢复通常伴有与经处理的动物血清中的细胞因子介导的毒性相关的细胞因子表达的降低。

如实施例1中所述从经处理的动物收集血清样品。通过来自Meso Scale

(

K15048D)的

促炎细胞板1(小鼠)试剂盒分析细胞因子水平。根据制造商的方案用稀释剂41(

R50AH-1)将每个样品一式三份稀释4倍。通过MesoScale

SQ 120机器以及Discovery工作台软件分析结果。分析以下细胞因子的表达：IFNγ、IL10、IL12p70、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、KC/GRO、TNFα。如图31所示，在暴露于抗GDF15处理后，在经抗CD40处理的组中大量促炎性细胞因子(IFNγ(IFNg)、TNFα(TNFa)、IL6、IL10、KC/GRO)的表达水平显著降低(n＝5，抗CD40 vs抗CD40+抗GDF15，通过双向ANOVA检验确定p＝0.0044)。

这些结果证明了使用抗GDF15抗体与抗CD40组合的处理具有协同抗肿瘤效果，伴有CD11b+、F4/80+细胞的活化水平提高以及肿瘤部位的CD8⁺T细胞/调节性T细胞(Treg)比提高。此外，抗GDF15疗法减轻了与细胞因子产生增加相关的抗CD40疗法毒性的临床症状。

实施例20、使用抗CD40抗体和抗GDF15抗体治疗胰腺癌

此实施例示出了抗GDF15抗体和抗CD40抗体组合疗法在鼠胰腺癌模型(Pan02)中的治疗活性。如实施例19中所述产生荷瘤动物。将肿瘤负荷计算为减去背景值之后的ROI(目标区域)中的光子/秒。入组时平均释放量为4.8*10⁸光子/秒。

对于该研究所使用的抗体为：小鼠抗小鼠CD40抗体FGK45(小鼠免疫球蛋白G1[mIgG1])(10mg/kg)以及小鼠抗小鼠GDF15_0297(小鼠IgG1效应子功能无效D265A突变)(10mg/kg)。

与经单独的抗CD40抗体处理的组中的106天、经单独的抗GDF15抗体处理的组中的52.5天以及同种型对照组中的45天相比，经抗GDF15抗体+抗CD40抗体处理的动物的中值存活期为126.5天。

这些结果证明了使用抗GDF15抗体与抗CD40组合进行的处理对胰腺癌的进展具有协同抗肿瘤效果。

实施例21、GDF15中和抗体逆转了对巨噬细胞介导的肿瘤杀伤的GDF15介导的抑制

此实施例示出了调节巨噬细胞的肿瘤杀伤活性的GDF15功能。

在用1mL 3％Brewer硫胶质培养基(B2551，Sigma)进行ip注射后5天从C57BL6小鼠分离腹膜巨噬细胞。在单独的完整巨噬细胞培养基(补充有10％热失活FBS、2mM L-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、10μM丙酮酸钠、100μM非必需氨基酸、25mM HEPES[pH7.4]、50μM巯基乙醇的RPMI 1640)中或存在测试的细胞因子和抗体的情况下以24孔细胞培养板浓度加载巨噬细胞(0.35×10⁶个细胞/孔)。在研究中使用以下细胞因子及抗体：重组小鼠GDF15(E.coli纯化，RD系统8944-GD)、抗小鼠GDF15_0297抗体“297”以及抗GDF15_001。在用重组小鼠GDF15(10nM)和抗体(各100nM)培养3小时后，对细胞进行LPS(10ng/ml，L2654，Sigma)以及IFNγ(100u/ml，485M100/CF，R&D Systems)处理以实现巨噬细胞的活化。第二天，根据制造商的使用说明用CSFE(C34554，Invitrogen)标记Pan02细胞并以1:4的比与活化的巨噬细胞共装载。24小时后，在用TrypLE Express^TM培养后收集巨噬细胞和肿瘤细胞，并且如实施例17中所述通过FACS进行分析。通过大鼠抗小鼠CD11b BUV395(M1/70，BDBiosciences)鉴定骨髓细胞，将肿瘤细胞鉴定为CSFE-阳性/CD11b-阴性群，通过DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)(62247，Thermo Scientific)将活细胞与死亡细胞分离。

如图32所示，重组GDF15抑制了巨噬细胞介导的肿瘤细胞杀伤(实心三角形)。通过用抗GDF15抗体进行的处理逆转了此种GDF15介导的抑制(空心圆以及空心三角形)。

这些结果证明了用抗GDF15抗体进行的处理有效提升了免疫细胞的抗致肿瘤活性。

虽然已参照多种应用、方法、试剂盒以及组合物描述了所公开的教导，但应理解在不背离本文教导以及下文要求保护的发明的条件下可作出多种改变及修改。提供以上实例是为更好地说明公开的教导，并且并非旨在限制本文提出的教导的范围。尽管已根据这些示例性实施方式描述了本教导，技术人员将容易地理解这些示例性实施方式的许多变化及修改在不进行过度实验的条件下是可能的。所有此类变化及修改处于当前教导的范围内。

本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及其中引用的参考文献，以其未曾被引用的程度上以引用的形式整体并入本文以用于所有目的。如果所并入的文献及类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语使用、描述的技术等，以本申请为主。

对本领域技术人员显而易见的是，可在不偏离本发明的范围和精神的情况下对本发明进行多种修改和变化。通过考虑本说明书以及实践本文公开的发明，本发明的其它实施方式将对本领域的技术人员显而易见。应认为说明书和实例仅是示范性的，而本发明的真正范围和精神将由以下权利要求表示。

序列表

<110> 辉瑞公司

<120> 抗GDF15抗体、组合物和使用方法

<130> PC72348A

<150> 62/765289

<151> 2018-08-20

<150> 62/750479

<151> 2018-10-25

<150> 62/750393

<151> 2018-10-25

<150> 62/881064

<151> 2019-07-31

<160> 221

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 1

Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 2

<211> 345

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 2

Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe

1 5 10 15

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

20 25 30

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val

35 40 45

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

50 55 60

Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu

65 70 75 80

Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys

85 90 95

Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

100 105 110

Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro

115 120 125

Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile

130 135 140

Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly

145 150 155 160

Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp

165 170 175

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp

180 185 190

Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

195 200 205

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ile Glu

210 215 220

Gly Arg Met Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ala Arg Asn Gly Asp His Cys

225 230 235 240

Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser

245 250 255

Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val

260 265 270

Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala

275 280 285

Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp

290 295 300

Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val

305 310 315 320

Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp

325 330 335

Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

340 345

<210> 3

<211> 332

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 3

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

1 5 10 15

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

20 25 30

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

35 40 45

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

50 55 60

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

65 70 75 80

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

85 90 95

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

100 105 110

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

115 120 125

Asn Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

130 135 140

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

145 150 155 160

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Asn Ser Thr Leu Thr

165 170 175

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

180 185 190

Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

195 200 205

Ser Pro Lys Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Arg Asn Gly

210 215 220

Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val

225 230 235 240

Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro

245 250 255

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260 265 270

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260 265 270

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275 280 285

Asn Met His Ala Gln Ile Lys Met Asn Leu His Arg Leu Lys Pro Asp

290 295 300

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305 310 315 320

Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp

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165 170 175

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp

180 185 190

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195 200 205

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Gly Arg Met Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ala Arg Asn Gly Asp His Cys

225 230 235 240

Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser

245 250 255

Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val

260 265 270

Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala

275 280 285

Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp

290 295 300

Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val

305 310 315 320

Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp

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Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

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Gly Gly Ile Asn Pro Ile Asn Gly Leu Ala Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Asn Val His Ser Tyr

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

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<220>

<223> Synthetic Construct

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gln Ile Asn Pro Asn Asn Gly Leu Ala Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

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275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

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Gly

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Gly

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<223> Synthetic Construct

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

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Gly Gln Ile Asn Pro Asn Asn Gly Leu Ala Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

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Glu Ala Ile Thr Thr Val Gly Ala Met Asp Pro

1 5 10

<210> 161

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 161

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ile Phe Gly Leu Ala Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Ile Thr Thr Val Gly Ala Met Asp Pro Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 162

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 162

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Val His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Asp Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Trp Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 163

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 163

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Val His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Asp Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Trp Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 164

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 164

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ile Phe Gly Thr Ala Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Ile Thr Thr Val Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 165

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 165

Gly Ile Asn Pro Ile Phe Gly Thr Ala Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 166

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 166

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ile Phe Gly Thr Ala Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Ile Thr Thr Val Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 167

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 167

gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc 60

ctgagctgcc gcaccagcca gagcgttcat aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggccaggcgc cgcgcctgct gatttatgat gcgagcaccc gtgcggatgg cattccggca 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctggaaccg 240

gaagattttg cggtgtatta ttgccagcag ttttggagct ggccgtggac ctttggccag 300

ggcaccaaag tggaaattaa a 321

<210> 168

<211> 360

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 168

caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttagc agctataaca ttgattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagg gcctggaatg gatgggcggt attaacccga tttttggcac cgcattttat 180

aaccagaaat ttcagggccg cgtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc acgcgaagcg 300

attaccaccg tgggcgcgat ggatcattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360

<210> 169

<211> 642

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 169

gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc 60

ctgagctgcc gcaccagcca gagcgttcat aactatctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggccaggcgc cgcgcctgct gatttatgat gcgagcaccc gtgcggatgg cattccggca 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctggaaccg 240

gaagattttg cggtgtatta ttgccagcag ttttggagct ggccgtggac ctttggccag 300

ggcaccaaag tggaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 170

<211> 1347

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 170

caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60

agctgcaaag cgagcggcta tacctttagc agctataaca ttgattgggt gcgccaggcg 120

ccgggccagg gcctggaatg gatgggcggt attaacccga tttttggcac cgcattttat 180

aaccagaaat ttcagggccg cgtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc acgcgaagcg 300

attaccaccg tgggcgcgat ggatcattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360

gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgctggggca 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc ccccgga 1347

<210> 171

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa can be S or T

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa can be S or D

<400> 171

Gly Tyr Thr Phe Xaa Xaa Tyr Asn Ile Asp

1 5 10

<210> 172

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa can be G or Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa can be I or N

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa can be F or N

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa can be T or L

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa can be F or N

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa can be Y or F

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa can be N or A

<400> 172

Xaa Ile Asn Pro Xaa Xaa Gly Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 173

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa can be A or Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa can be V or I

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa can be H or Y

<400> 173

Glu Xaa Ile Thr Thr Xaa Gly Ala Met Asp Xaa

1 5 10

<210> 174

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa can be T or A

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa can be S or N

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa can be V or L

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa can be H or S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa can be N or S

<400> 174

Arg Xaa Ser Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 175

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be S or K

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa can be T or N

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa can be D or T

<400> 175

Asp Ala Xaa Xaa Arg Ala Xaa

1 5

<210> 176

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa can be W or S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa can be S or N

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa can be W or D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa can be W or Y

<400> 176

Gln Gln Phe Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr

1 5

<210> 177

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 177

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gln Ile Asn Pro Asn Asn Gly Leu Ile Phe Phe Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Ile Thr Thr Val Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 178

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 178

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Leu His Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Asp Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 179

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 179

Gly Tyr Pro Phe Glu Gly Trp Tyr Ile His

1 5 10

<210> 180

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 180

Trp Asn Asn Pro Arg Thr Gly Leu Thr Asn His Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 181

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 181

Gly Val Gly Ala Asp Ala Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 182

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 182

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Glu Gly Trp

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Asn Asn Pro Arg Thr Gly Leu Thr Asn His Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Gly Ala Asp Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 183

<211> 443

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 183

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Glu Gly Trp

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Asn Asn Pro Arg Thr Gly Leu Thr Asn His Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Gly Ala Asp Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys

210 215 220

Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser

260 265 270

Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile

290 295 300

Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn

305 310 315 320

Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

325 330 335

Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu

340 345 350

Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe

355 360 365

Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala

370 375 380

Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr

385 390 395 400

Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly

405 410 415

Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His

420 425 430

Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 184

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 184

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Lys His Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 185

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 185

Leu Asp Arg Asn Arg Ala His

1 5

<210> 186

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 186

Met Gln Ser Phe Glu Thr Pro Ile Thr

1 5

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<211> 443

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

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Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

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Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

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Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

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Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

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Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

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Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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<223> Synthetic Construct

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Asn Ile Trp Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Trp Asp Ser

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Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

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Lys

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<223> Synthetic Construct

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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Gln Pro Gly Arg Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly

20 25 30

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

35 40 45

Val Arg Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

115 120 125

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Asp Tyr Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

145 150 155 160

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Thr Tyr Thr

180 185 190

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Arg Val Glu

195 200 205

Ser Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

210 215 220

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

225 230 235 240

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Trp Val Asp Val Ser Gln Glu

245 250 255

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Tyr Asp Gly Val Glu Val His

260 265 270

Asn Ala Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

275 280 285

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

290 295 300

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

305 310 315 320

Thr Ile Ser Lys Ala Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Lys Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

370 375 380

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

385 390 395 400

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

405 410 415

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

420 425 430

<210> 204

<211> 208

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 204

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser

100 105 110

Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Ser Gly Thr Ala Ser

115 120 125

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Val Gln Trp

130 135 140

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

145 150 155 160

Glu Gln Asp Ser Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

165 170 175

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr

180 185 190

His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

195 200 205

<210> 205

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 205

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 206

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 206

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 207

<211> 432

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 207

Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile Glu His Gly

1 5 10 15

Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser His Val Asn

20 25 30

Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr Ser

35 40 45

Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu Gly

50 55 60

Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp Glu Gly Gln

65 70 75 80

Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu

85 90 95

Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr His Ile Leu

100 105 110

Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln Ala Thr Gly

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val Pro Ala Asn

130 135 140

Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val Thr Ser Val

145 150 155 160

Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys Val Phe Trp

165 170 175

Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp Leu Gln Ser

180 185 190

Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Trp Glu Pro Lys Ser Cys Asp

195 200 205

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

210 215 220

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

225 230 235 240

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Trp Val Asp Val Ser His Glu Asp

245 250 255

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

260 265 270

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Trp

275 280 285

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

290 295 300

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

305 310 315 320

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

370 375 380

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

385 390 395 400

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

405 410 415

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

420 425 430

<210> 208

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<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 208

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

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<223> Synthetic Construct

<400> 209

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 210

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

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Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

1 5

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

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Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn

1 5 10

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<211> 5

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 212

Ser Tyr Trp Ile Asn

1 5

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 213

Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Leu

1 5

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<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 214

Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

<210> 215

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 215

Leu Ser Thr Gly Thr Phe Ala Tyr

1 5

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<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 216

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Trp Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu

1 5 10 15

Thr

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<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 217

Trp Thr Ser Tyr Arg Glu Ser

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 218

Gln Asn Asp Tyr Phe Tyr Pro His Thr

1 5

<210> 219

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 219

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ser Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 220

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 220

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Trp Asp Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Tyr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Phe Tyr Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 221

<211> 290

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 221

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

Claims

1.一种特异性结合人生长分化因子15(GDF15)的抗体或其抗原结合片段，包含以下至少之一：

a)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR-1)、包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR-2、包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR-3、包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR-1)、包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的HCDR-2以及包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HCDR-3；

b)选自SEQ ID NO:7、27、36、46、55、62、82、88、95、101、129、138、150、157、174和184的序列的LCDR-1氨基酸序列；

c)选自SEQ ID NO:8、28、37、47、70、108、114、122、130、175和185的序列的LCDR-2氨基酸序列；

d)选自SEQ ID NO:9、29、38、48、63、76、89、102、176和186的序列的LCDR-3氨基酸序列；

e)选自SEQ ID NO:17、32、41、58、66、117、125、133、153、171和179的序列的HCDR-1氨基酸序列；

f)选自SEQ ID NO:18、33、42、51、59、67、85、92、98、105、118、126、134、141、146、165、172和180的序列的HCDR-2氨基酸序列；

g)选自SEQ ID NO:1、19、43、52、79、111、119、135、147、154、160、173和181的序列的HCDR-3氨基酸序列；

h)如SEQ ID NO:166的氨基酸序列中所示的HCDR-1、HCDR-2和HCDR-3氨基酸序列以及如SEQ ID NO:163的氨基酸序列中所示的LCDR-1、LCDR-2和LCDR-3氨基酸序列；

i)由保藏在ATCC且具有ATCC登录号PTA-125038的质粒的插入物插入物编码的氨基酸序列以及由保藏在ATCC且具有ATCC登录号PTA-125039的质粒的插入物插入物编码的氨基酸序列；

j)包含与SEQ ID NO:166的序列至少90％相同的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)以及包含与SEQ ID NO:163的序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；

k)包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VH以及包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的VL；以及

l)与来自上述(a)-(k)的至少一个抗体竞争结合GDF15的抗体。

2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，包含选自IgA₁、IgA₂、IgD、IgE、IgM、IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄的Fc结构域的人Fc结构域。

3.权利要求1-2中任一项的抗体或其抗原结合片段，包含：

a)包含与SEQ ID NO:164的序列至少90％相同的氨基酸序列的重链(HC)以及包含与SEQ ID NO:162的序列至少90％相同的氨基酸序列的轻链(LC)；

b)包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的HC以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的LC。

4.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以约为或小于选自约10nM、5nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、250pM、200pM、150pM、100pM、50pM、40pM、30pM、25pM、20pM、15pM和10pM的值的K_D结合人或食蟹猴GDF15。

5.一种编码权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合部分的分离的核酸。

6.一种分离的核酸，包含：

a)SEQ ID NO:167的核酸序列、SEQ ID NO:168的核酸序列或二者；

b)SEQ ID NO:169的核酸序列、SEQ ID NO:170的核酸序列或二者；以及

c)保藏在ATCC且具有登录号PTA-125038的质粒的插入物插入物的核酸序列、保藏在ATCC且具有登录号PTA-125039的质粒的插入物插入物的核酸序列或二者。

7.一种载体，包含权利要求5或6的核酸。

8.一种宿主细胞，包含权利要求7的载体。

9.权利要求8的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自CHO细胞、COS细胞、HEK-293细胞、NS0细胞、PER.

细胞或Sp2.0细胞的哺乳动物细胞。

10.一种制备抗体或其抗原结合片段的方法，包括在其中所述抗体或其抗原结合片段由权利要求8的宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞。

11.一种药物组合物，包含权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体或赋形剂。

12.一种治疗有需要的对象中的由GDF15的表达介导或与所述GDF15的表达相关的医疗病症、疾病或失调的方法，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物。

13.权利要求12的方法，其中所述病症是与癌症、化学疗法、与免疫肿瘤学疗法组合的化学疗法、慢性阻塞性肺病、慢性肾脏疾病、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭或肌肉减少症相关的恶病质。

14.一种降低有需要的对象中的游离GDF15的水平的方法，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物，由此降低游离GDF15的水平。

15.一种用于降低有需要的对象中的GDF15的活性的方法，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物。

16.权利要求15的方法，其中所述GDF15的活性是选自下组的至少一种活性：(a)降低食物摄取；(b)降低食欲；(c)降低体重；(d)增加体重损失；(e)降低脂肪量；(f)降低无脂肪体重；(g)增加脂肪量损失；(h)增加无脂肪肌肉量损失；(i)与GFRAL结合；(j)增加由RET介导的下游信号转导；(k)增加ERK的磷酸化；(l)增加核糖体蛋白S6的磷酸化；(m)增加MAPK信号转导途径的RET介导的活化；(n)增加AKT-信号转导途径的RET活化；以及(o)增加PLC-□1信号转导途径的活化。

17.一种用于治疗有需要的患者中的癌症的方法，包括给所述患者施用提供协同疗效的组合疗法，所述方法包括施用协同治疗有效量的权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物，以及

a)协同治疗有效量的抗CD40拮抗剂抗体；或

b)协同治疗有效量的PD-1轴结合拮抗剂，其中所述PD-1轴结合拮抗剂不是阿维鲁单抗。

18.权利要求17(b)的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂是选自纳武单抗、派姆单抗、斯巴达珠单抗、匹地利珠单抗、替雷利珠单抗、AMP-224、AMP-514、西米普利单抗和萨善利单抗(PF-06801591)的抗PD-1抗体。

19.权利要求17(b)的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂是选自阿特珠单抗、得瓦鲁单抗、BMS-936559、MEDI4736和MPDL3280A的抗PD-L1抗体，并且其中所述抗PD-L1抗体不是阿维鲁单抗。

20.权利要求18-19中任一项的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、Merkel细胞癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、尿路上皮癌和去势难治性前列腺癌。

21.权利要求17(a)的方法，其中所述癌症选自胃癌、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、头颈癌、鳞状细胞头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液腺癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑素瘤。

22.一种用于治疗癌症的试剂盒，包含协同治疗有效量的抗GDF15抗体以及协同治疗有效量的抗PD-1抗体。

23.一种用于治疗癌症的试剂盒，包含治疗有效量的抗GDF15抗体以及治疗有效量的抗CD40抗体。

24.一种用于增强施用于对象以治疗癌症的免疫调节剂的疗效的方法，所述方法包括给接收所述免疫调节剂的对象施用有效量的权利要求1-4中任一项的抗GDF15抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物。

25.权利要求0的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肾癌、子宫内膜癌和结直肠癌。

26.一种降低或抑制对象中毒性的方法，所述对象正在经历细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴或者易受CRS或细胞因子风暴伤害，所述方法包括给所述对象施用有效量的权利要求1-4中任一项的抗GDF15抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物。

27.权利要求26的方法，其中所述对象正经受癌症治疗并且所述方法不降低所述癌症治疗的功效。

28.权利要求27的方法，其中所述癌症治疗包括免疫调节剂，如抗CD40抗体、抗CD47抗体、抗CTLA4抗体、抗4-1BB抗体、IL-12或IL-15。

29.权利要求26-28中任一项的方法，其中所述CRS或细胞因子风暴的原因包括感染性刺激、病症或综合征，或其中所述细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因包括非感染性刺激、病症或综合征或其任何组合。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述感染性刺激、病症或综合征包括流感、禽流感、严重急性呼吸综合征(SARS)、EB病毒相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、败血症、革兰氏阴性败血症、疟疾、埃博拉病毒、天花病毒、系统性革兰氏阴性细菌感染或Jarisch-Herxheimer综合征，或其中所述非感染性刺激、病症或综合征包括噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、散发性HLH、巨噬细胞活化综合征(MAS)、慢性关节炎、全身性幼年特发性关节炎(sJIA)、斯蒂尔病、Cryopyrin蛋白相关周期性综合征(CAPS)、家族性寒冷性自身炎性综合征(FCAS)、家族性寒冷性荨麻疹(FCU)、Muckle-Well综合征(MWS)、慢性小儿神经皮肤和关节(CINCA)综合征、包括NLRP3基因中的遗传或新发生获得性功能突变的cryopyrinopathy、遗传性自身炎性失调、急性胰腺炎、严重烧伤、创伤、急性呼吸窘迫综合征，次于药物使用的免疫疗法、单克隆抗体疗法次于吸入毒素、脂多糖(LPS)、革兰氏阳性毒素、真菌毒素、糖基磷脂酰肌醇(GPI)或调节RIG-1基因表达。

31.治疗有效量的权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物，其用于治疗有需要的对象中的由GDF15的表达介导或与GDF15的表达相关的医学病症、疾病或失调的方法。

32.治疗有效量的权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物，其用于降低有需要的对象中的游离GDF15的水平的方法。

33.治疗有效量的权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物，其用于降低有需要的对象中的GDF15的活性的方法。

34.治疗有效量的权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物，其用于治疗有需要的患者中的癌症的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物与以下组合施用：

a)协同治疗有效量的抗CD40拮抗剂抗体；或

35.有效量的权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物，其用于增强施用于对象以治疗癌症的免疫调节剂的疗效的方法。

36.有效量的权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求11的药物组合物，其用于降低或抑制对象中的毒性的方法，所述对象正在经历细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴或易受CRS或细胞因子风暴伤害。