KR20180002597A - 암 치료법의 효능을 증강시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

암 치료법의 효능을 증강시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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프로비던스 헬스 앤드 서비시즈 - 오레곤
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Abstract

본 발명은 암 치료법과 병행하여 OX40 작용제(예컨대, 항-OX40 항체) 및/또는 항-CTLA4 항체(예컨대, CTLA4-차단 항체)를 투여함으로써 항-종양 반응을 증강시키기 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다.

Description

암 치료법의 효능을 증강시키기 위한 조성물 및 방법
모든 기(stage)의 췌장암에 대한 1년 생존율은 약 20%인 반면, 5년 생존율은 6%만큼 낮은 것으로 추정된다. 이러한 낮은 생존율에 기여하는 것은 진단 시 많은 환자가 이미 췌장을 넘어 확산되고 수술적 절제가 불가능한 지점까지 전이된 종양을 갖는다는 점이다.
최근 연구에서는 단독으로 또는 증가된 대식구 침윤과 조합하여 감소된 T 세포 침윤이, 췌장암 환자를 포함하여, 다양한 암에서 감소된 생존과 연관됨을 보고하였다. 이러한 후향 연구에서, 환자들은 화학치료법, 방사선 및 수술적 절제를 포함하는 통상적 암 치료법으로 치료되었으며, 종양에서의 T 세포 및 대식구 침윤이 통상적 치료법에 반응하는 결과에 영향을 미침을 제시하였다.
지난 몇 년 동안, 전통적 세포독성 종양 치료법에 대한 신규 보완책으로서 면역치료법에 대한 관심이 증가하였다. 흑색종에서 체크포인트 억제제, 예컨대 이필리무맙의 임상적 성공으로, 더 광범위한 악성 종양에 대한 면역치료법의 적용에 대한 관심이 확대되었다. 임상적 적응증 증가와 함께, 방사선 또는 화학치료법과 함께 면역치료법을 이용하는 조합 방식 치료법이 보다 일반적이다. 그러나, 조합 이용이 보다 우세해지고 있지만, 각 제제의 투여 시점에 기반하여 치료 효능을 최적화하도록 설계된 연구는 거의 없다(Dewan et al., Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 2009. 15(17): 5379-88). 따라서 통상적 암 치료법에 대한 반응을 개선함으로써 생존을 증가시키기 위한 방법이 긴급히 요구된다.
후술되는 바와 같이, 본 발명은 화학치료제 및/또는 요법과 병행하여 OX40 작용제(예컨대, 항-OX40 항체) 및 항-CTLA4 항체(예컨대, CTLA4-차단 항체)를 투여함으로써 항-종양 반응을 증강시키기 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 적어도 부분적으로 이러한 제제 조합이 통상적 치료 요법에 고도 내성인 종양(예컨대, 췌장 종양)의 치료에 특히 효과적이라는 발견에 기반한다. 따라서, 본 발명은 OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 포함하는 면역치료 조성물 및 암(예컨대, 췌장암)의 치료를 위해 암 치료법(예컨대, 화학치료법 및/또는 방사선치료법)과 조합된 OX40 작용제 및 항-CTLA4의 투여 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본원의 개시는 종양을 갖는 대상체에서 화학치료법 또는 방사선치료법의 효능 증강 방법을 제공하며, 상기 방법은 화학치료법 또는 방사선치료법 전에, 동안 또는 후에 OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원의 개시는 종양을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계; (b) 대상체에서 대식구 분화 감소를 나타내는 세포 측정치를 수득하는 단계; 및 (c) 화학치료법 또는 방사선치료법을 대상체에 시행하는 단계를 포함한다.
추가 양태에서, 본원의 개시는 종양을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계; (b) 대상체에서 대식구 분화 감소를 나타내는 세포 측정치를 수득하는 단계; 및 (c) 항-IL4 항체를 투여하고 화학치료법 또는 방사선치료법을 대상체에 시행하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원의 개시는 종양을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계; 대상체에서 대식구 분화 감소를 나타내는 세포 측정치를 수득하는 단계; (b) 화학치료법을 대상체에 시행하는 단계; (c) 대상체에 OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 투여하는 단계; 및 (d) 화학치료법 또는 방사선치료법을 대상체에 시행하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원의 개시는 결장직장암을 갖는 대상체에서 화학치료법 또는 방사선치료법의 효능 증강 방법을 제공하며, 상기 방법은 화학치료법 또는 방사선치료법 전에, 동안 또는 후에 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원의 개시는 결장직장 종양을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계; 및 (b) 방사선치료법을 대상체에 시행하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원의 개시는 결장직장암을 갖는 대상체에서 화학치료법 또는 방사선치료법의 효능 증강 방법을 제공하며, 상기 방법은 화학치료법 또는 방사선치료법 동안 또는 후에 OX40 작용제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원의 개시는 결장직장암을 갖는 대상체의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 방사선치료법을 대상체에 시행하는 단계; 및 (b) OX40 작용제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 항-CTLA4 항체는 9D9 및 트레멜리무맙 중 하나 이상이다. 본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 화학치료법 또는 방사선치료법은 항-CTLA4 항체의 투여 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 후 시행된다. 본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 화학치료법 또는 방사선치료법은 항-CTLA4 항체의 투여 약 1일, 2일, 3일 또는 4일 전에 시행된다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, OX40 작용제는 항-OX40 항체이다. 다양한 구현예에서, 항-OX40 항체는 OX86, 인간화 항-OX40 항체 및 9B12 중 하나 이상이다. 다양한 구현예에서, OX40 작용제는 OX40 융합 단백질이다. 본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, OX40 작용제는 화학치료법 또는 방사선치료법의 시행 약 1일 또는 2일 후 투여된다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 방법은 대상체에서 종양 성장을 지연시키거나 감소시키고/시키거나, 종양 크기를 감소시키고/시키거나 생존을 증강시킨다. 특정 구현예에서, 대상체는 결장직장 종양을 갖는다.
본 발명의 다른 특징 및 장점이 상세한 설명으로부터, 그리고 청구범위로부터 자명할 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]은 본 발명에서 이용되는 여러 용어의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다. 본원에서 이용되는 하기 용어는, 달리 명시되지 않는 한, 아래에서 이들에게 부여되는 의미를 갖는다.
"OX40 폴리펩타이드"란 항원-활성화 포유류 CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 표면 상에 발현되는 수용체 TNFR-수퍼패밀리의 구성원을 의미한다. 예를 들어, 문헌[Paterson et al, Mol Immunol 24, 1281-1290 (1987); Mallett et al., EMBO J 9, 1063-1068(1990); 및 Calderhead et al., J Immunol 151, 5261-5271 (1993)]을 참고한다. OX40은 CD134, ACT-4 및 ACT35로도 불린다. OX40 수용체 서열은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, GenBank Accession Number(접근 번호): AAB33944 또는 CAE11757에서 제공된다.
예시적인 인간 OX40 서열은 아래에 제공된다:
Figure pct00001
"OX40 작용제"란 OX40 수용체와 특이적으로 상호작용하고 이의 생물학적 활성을 증가시키는 OX40 리간드를 의미한다. 바람직하게는, 생물학적 활성은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 심지어 100% 증가된다. 특정 양태에서, 본원에 개시되는 OX40 작용제에는 OX40 결합 폴리펩타이드, 예컨대 항-OX40 항체(예컨대, OX40 작용제 항체), OX40 리간드 또는 이들 분자의 단편 또는 유도체가 포함된다.
"OX40 항체"란 OX40에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. OX40 항체에는 OX40 및 이의 항원-결합 단편에 특이적인 모노클로날 및 폴리클로날 항체가 포함된다. 특정 양태에서, 본원에 기재되는 항-OX40 항체는 모노클로날 항체(또는 이의 항원-결합 단편), 예컨대, 뮤린, 인간화 또는 완전 인간 모노클로날 항체이다.
"CTLA4 폴리펩타이드"란 GenBank Accession Number AAL07473.1과 적어도 85% 아미노산 서열 동일성을 가지는 폴리펩타이드 또는 T 세포 억제 활성을 가지는 이의 단편을 의미한다. AAL07473.1의 서열은 아래에 제공된다:
Figure pct00002
"항-CTLA4 항체"란 CTLA4 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 항체를 의미한다. 예시적인 항-CTLA4 항체에는 9D9 및 트레멜리무맙이 포함된다.
"IL4 폴리펩타이드"란 NCBI Accession No. NP_000580과 적어도 85% 아미노산 서열 동일성을 가지는 폴리펩타이드 또는 면역 세포(예컨대, 대식구, T 세포) 분화 활성을 갖는 이의 단편을 의미한다. NP_000580의 서열은 아래에 제공된다:
Figure pct00003
"항-IL4 항체"란 IL4 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 항체를 의미한다. 11B11은 예시적인 항-IL4 항체이다.
"항체"란 표적을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 이용되는 "항체"라는 용어는 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 온전한 폴리클로날 항체, 온전한 모노클로날 항체, 항체 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 단일쇄 Fv(scFv) 돌연변이체, 다중특이적 항체, 예컨대 적어도 2개의 온전한 항체로부터 생성되는 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정부를 포함하는 융합 단백질 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불리는, 이의 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기반하여, 면역글로불린의 임의의 5가지 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 또는 이의 서브클래스(이소형)(예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린은 상이하고 널리 공지된 서브유닛 구조 및 3차원 배치를 갖는다.
"항원-결합 도메인", "항원-결합 단편" 및 "결합 단편"이라는 용어는 항체 및 항원 간 특이적 결합에 관여하는 아미노산을 포함하는 항체 분자의 일부를 나타낸다. 항원이 큰 경우, 항원-결합 도메인은 항원의 일부에만 결합할 수 있다. 항원-결합 도메인과의 특이적 상호작용에 관여하는 항원 분자의 부분은 "에피토프" 또는 "항원성 결정기"로 불린다. 항원-결합 도메인은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하지만, 반드시 둘 다를 포함할 필요는 없다. 예를 들어, 소위 Fd 항체 단편은 VH 도메인으로만 구성되지만, 여전히 온전한 항체의 일부 항원-결합 기능을 보유한다.
"완화한다"란 질환의 발생 또는 진행을 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나, 감쇠시키거나, 정지시키거나, 안정화함을 의미한다.
"항원 결합 단편"이란 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 의미한다. 특히, 항원 결합 단편이라는 용어는 온전한 항체의 항원성 결정 가변 영역을 나타낸다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체 단편의 예에는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일쇄 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
"암"이란 과도한 증식 또는 감소된 아폽토시스를 특징으로 하는 질환 또는 장애를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 췌장암의 치료에 유용하다.
본 개시에서, "포함한다", "포함하는", "함유하는" 및 "가지는" 등은 U.S. 특허법에서 이들에게 부여되는 의미를 가질 수 있고, "포함된다", "포함되는" 등을 의미할 수 있으며; "로 본질적으로 구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는" 등은 U.S. 특허법에서 부여되는 의미를 가지고, 이 용어는 개방형으로, 인용되는 것의 기본적인 또는 신규한 특징이 인용되는 것 이외의 존재에 의해 변화되지 않는 한, 인용되는 것 이외의 존재를 허용하지만 선행 기술의 구현예는 배제한다.
"검출한다"란 검출될 분석물질의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 나타낸다.
"증강시킨다"란 적어도 10%, 25%, 50%, 75% 또는 100%의 양성적 변경을 의미한다.
"단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"이라는 용어는 그 원상태인 상태에서 확인되는 것처럼 이와 보통 동반되는 성분이 다양한 정도로 없는 물질을 나타낸다. "단리물"은 원래 원천 또는 환경으로부터의 어느 정도의 분리를 표시한다. "정제한다"란 단리보다 높은 정도의 분리를 표시한다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질에는 임의의 불순물이 단백질의 생물학적 특성에 실질적으로 영향을 미치거나 다른 유해 결과를 유도하지 않도록 다른 물질이 충분히 없다. 즉, 본 발명의 핵산 또는 펩타이드는 재조합 DNA 기법에 의해 제조되는 경우 세포성 물질, 바이러스성 물질 또는 배양 배지가, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없으면 정제된 것이다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석 화학 기법, 예를 들어, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용해서 결정된다. "정제된"이라는 용어는 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성함을 표시할 수 있다. 변형, 예를 들어, 인산화 또는 글리코실화를 거칠 수 있는 단백질에 있어서, 상이한 변형은 상이한 단리된 단백질을 생성할 수 있고, 이는 별도로 정제될 수 있다.
"단리된 폴리펩타이드"란 이와 자연적으로 동반되는 성분으로부터 분리된 본 발명의 폴리펩타이드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩타이드는 이것에 자연적으로 연관되는 단백질 및 자연 발생 유기 분자가 적어도 60중량% 없는 경우 단리된 것이다. 바람직하게는, 조제물은 적어도 75중량%, 보다 바람직하게는 적어도 90중량%, 가장 바람직하게는 적어도 99중량%가 본 발명의 폴리펩타이드이다. 본 발명의 단리된 폴리펩타이드는, 예를 들어, 자연적 원천으로부터의 추출에 의해, 이러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 단백질의 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
"감소시킨다"란 적어도 10%, 25%, 50%, 75% 또는 100%의 음성적 변경을 의미한다.
"참조"란 표준 또는 대조군 조건을 의미한다.
"참조 서열"이란 서열 비교를 위한 기준으로 이용되는 정의된 서열이다. 참조 서열은 명시된 서열의 하위세트 또는 전체; 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 절편 또는 전체 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다. 폴리펩타이드에 있어서, 참조 폴리펩타이드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 20 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 25 아미노산 및 더욱 바람직하게는 약 35 아미노산, 약 50 아미노산 또는 약 100 아미노산일 것이다. 핵산에 있어서, 참조 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 50 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 약 60 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 적어도 약 75 뉴클레오타이드 및 더욱 바람직하게는 약 100 뉴클레오타이드 또는 약 300 뉴클레오타이드 또는 이들 근처 또는 이들 사이의 임의의 정수일 것이다.
"특이적으로 결합하는"이란 본 발명의 폴리펩타이드를 인식하고 이에 결합하지만, 샘플, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드를 자연적으로 포함하는 생물학적 샘플 중 다른 분자를 실질적으로 인식하고 이에 결합하지 않는 화합물 또는 항체를 의미한다.
"실질적으로 동일한"이란 참조 아미노산 서열(예를 들어, 본원에 기재되는 임의의 하나의 아미노산 서열) 또는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재되는 임의의 하나의 핵산 서열)과 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 아미노산 수준 또는 핵산에서 비교를 위해 이용되는 서열과 적어도 60%, 보다 바람직하게는 80% 또는 85% 및 보다 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다.
서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, Genetics Computer Group(University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)의 서열 분석 소프트웨어 패키지, BLAST, BESTFIT, GAP 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 이용해서 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형에 대해 상동성 정도를 할당하여 동일하거나 유사한 서열을 매칭한다. 보존적 치환에는 전형적으로 다음 그룹 내의 치환이 포함된다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근에서, BLAST 프로그램이 이용될 수 있고, e-3 내지 e-100의 개연성 스코어가 밀접하게 관련된 서열을 시사한다.
"대상체"란 비제한적으로 인간 또는 비-인간 포유류, 예컨대 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하는 포유류를 의미한다.
항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 조합되어 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 고가변 영역으로도 알려져 있는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FW)으로 구성된다. 각 사슬에서의 CDR은 FW 영역에 의해 가까이 인접하여 함께 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2개의 기법이 존재한다: (1) 교차-종 서열 가변성에 기반하는 접근(즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기반하는 접근(Al-lazikani et al. (1997) J. Molec . Biol. 273:927-948)). 또한, 때때로 당분야에서 이들 두 접근의 조합이 CDR을 결정하기 위해 이용된다.
본원에서 제공되는 범위는 범위 내의 모든 값에 대해 약술하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50으로 구성되는 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합 또는 하위범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 이용되는 "치료하다", "치료하는", "치료" 등의 용어는 장애 및/또는 이와 연관된 증상의 감소 또는 완화를 나타낸다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 질병의 치료는 장애, 질병 또는 이와 연관된 증상이 완전히 제거되는 것을 필요로 하지는 않음이 이해될 것이다.
구체적으로 언급되거나 맥락 상 명백하지 않은 경우, 본원에서 이용되는 "또는"이라는 용어는 포괄적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 맥락 상 명백하지 않은 경우, 본원에서 이용되는 단수 용어는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
구체적으로 언급되거나 맥락 상 명백하지 않은 경우, 본원에서 이용되는 "약"이라는 용어는 당분야의 일반 관용 범위 내인 것으로, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내인 것으로 이해된다. "약"은 언급되는 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 내인 것으로 이해될 수 있다. 맥락 상 달리 명확하지 않은 한, 본원에서 제공되는 모든 수치 값은 "약"이라는 용어로 수식된다.
본원에서 변수의 임의의 정의 내인 화학 그룹의 목록의 인용에는 임의의 단일 그룹 또는 기재된 그룹의 조합으로서의 그 변수의 정의가 포함된다. 본원에서 변수 또는 양태에 대한 구현예의 인용에는 임의의 단일 구현예 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 일부와의 조합으로서의 그 구현예가 포함된다.
본원에서 제공되는 임의의 조성물 또는 방법은 본원에서 제공되는 하나 이상의 임의의 다른 조성물 및 방법과 병행될 수 있다.
도 1a 내지 1c는 종양 대식구의 적응 면역 리모델링을 나타낸다. Panc02 종양을 보유하는 면역적격 C57BL/6 마우스를 치료하지 않고 두거나(NT) 14일 및 17일차에 100 mg/kg 젬시타빈으로 복강내(i.p.) 치료한 뒤(GZ), 종양을 21일차에 수확하였다. 도 1a는 F4/80+ 대식구(녹색) 및 DAPI(파란색)에 대한 면역조직학을 나타내는 2개의 이미지를 도시한다. 종양에 걸친 여러 이미지를 병합하여 전체 종양의 경계부터 경계까지의 개관을 생성하였다. 종양 경계는 흰색 화살표로 표시된다. 도 1b는 2개의 산란 그래프를 나타낸다. 14일차 Panc02 종양을 보유하는 면역적격 C57BL/6 마우스는 치료하지 않고 두거나 250 ㎍ 항-OX40, 250 ㎍ 항-CTLA4 또는 조합으로 치료하였다. 종양을 면역치료법 4일 또는 8일 후 수확하고, 단일 세포 현탁액을 염색하고 유세포 측정에 의해 정렬하여, 그래프 상에서 패널 (i)에 CD11b+ 세포를, 그리고 그래프 상에서 패널 (ii)에 GrlloIA+ 세포를 CD11b+ 집단 내에 관문화하였다. 도 1c는 용해되고 아르기나제 I 및 GAPdH의 발현에 대해 웨스턴 블로팅된 정렬된 종양 대식구를 나타내는 웨스턴 블롯 이미지를 제공한다.
도 2a 및 도 2b는 예비 면역치료법이 화학치료법을 개선하였음을 나타낸다. 도 2a는 선형 그래프(패널 i) 및 산란도(패널 ii)를 도시한다. Panc02 종양을 보유하는 면역적격 C57BL/6 마우스를 치료하지 않고 두거나, 14일차에 250 ㎍ 항-OX40, 250 ㎍ 항-CTLA4 또는 조합으로 치료하였다(빨간 점선). 18일차에 마우스를 3주 동안 추가 치료 없음 또는 주 2회 젬시타빈(100 mg/kg 복강내)으로 무작위화하였다. 도 2a, 패널 (i)에서, 그래프는 군 당 6 내지 7마리 마우스를 갖는 각 군에 대한 평균 종양 면적을 나타낸다. 도 2a, 패널 (ii)에서, 그래프는 화학치료법을 받은 군에 대한 39일차 종양 면적을 나타낸다. 각각의 기호는 1마리의 동물을 나타낸다. 도 2b는 명확성을 위한 시점에 2개 군을 비교하는, 도 2a에서와 같이 치료받은 마우스에 대한 생존 곡선을 나타내는 5개 그래프(패널 i 내지 v)를 제공한다. 색인: NS 유의미하지 않음; * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005; **** p<0.001).
도 3은 예비 면역치료법 후 종양 침윤 면역 세포를 도시하는 3개의 산란 그래프를 나타낸다. Panc02 종양을 보유하는 면역적격 C57BL/6 마우스는 치료하지 않고 두거나 14일차에 250 ㎍ 항-OX40 및 250 ㎍ 항-CTLA4로 치료하였다. 종양을 치료 4일 또는 7일차에 수확하고, CD3+CD8+ T 세포(패널 (i)); CD3+CD4+ T 세포(패널 (ii)); 또는 CD11b+(패널 (iii)), 골수 세포에 대해 유세포 측정에 의해 침윤 세포 집단에 대해 분석하였다. 각각의 기호는 하나의 종양을 나타낸다. 색인: NS 유의미하지 않음; * p<0.05.
도 4a 내지 4e는 조합 치료법이 2형 헬퍼 T 세포(Th2) 분화를 유도함을 나타낸다. 도 4a는 치료하지 않고 두거나 14일차에 250 ㎍ 항-OX40, 250 ㎍ 항-CTLA4 또는 조합되어 치료받은 Panc02 종양을 보유하는 면역적격 C57BL/6 마우스를 나타낸다. 림프절을 7일 후 수확하고 세포 집단에 대한 유세포 측정에 의해 분석하였다. 도 4a는 CD4 T 세포(패널 (i)); CD4+FoxP3+ T 조절 세포(패널 (ii)); CD4+FoxP3- T 세포(패널 (iii)); 및 CD8 T 세포(패널 (iv))의 수를 나타내는 4개 그래프를 도시한다. 도 4b는 미치료 마우스(패널 (i)) 또는 항-CTLA4(패널 (ii)); 항-OX40(패널 (iii) 또는 항-CTLA4 및 항-OX40(패널 iv)으로 치료받은 마우스로부터의 FoxP3-CD4+ T 세포에서 전사 인자 Tbet 및 GATA3에 대한 세포내 염색의 예를 나타내는 4개 그래프를 도시한다. 도 4c는 GATA3+Tbet-(패널 (i)) 또는 GATA3-Tbet+(패널 (ii))인 FoxP3-CD4 T 세포의 비율을 나타내는 도 4b에 따른 데이터 요약을 제공하는 2개 그래프를 나타낸다. 각각의 기호는 1마리 마우스를 나타낸다. 도 4d는 분비 억제제의 존재 하에 4시간 동안 플레이트-결합된 항-CD3으로 시험관내 자극된 도 4a에서와 같이 수확된 림프절 세포를 기재한다. 세포를 표면 염색한 뒤 사이토카인에 대해 세포내 염색하였다. 도 4d는 IL-4+IFNγ-(패널 (i)) 또는 IL-4-IFNγ+(패널 (ii))인 FoxP3-CD4 T 세포의 백분율을 나타내는 2개 그래프를 제공한다. 도 4e는 전사 인자 Eomes에 대해 세포내 염색되고 도 4a에서와 같이 수확된 림프절 CD8 T 세포(패널 (i)) 및 도 4d에서와 같이 자극되고 IFNγ에 대해 염색된 림프절 CD8 T 세포(패널 (ii))를 나타내는 2개 그래프를 제공한다. 색인: NS 유의미하지 않음; * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005; **** p<0.001).
도 5a 및 도 5b는 인터류킨-4(IL-4) 차단이 종양 제어를 개선하였음을 나타낸다. 도 5a는 치료하지 않고 두거나 14일차에 250 ㎍ 항-OX40 및 250 ㎍ 항-CTLA4로 치료받은 Panc02 종양 보유 면역적격 C57BL/6 마우스를 기재하는 2개 그래프를 나타낸다. 18일차에 마우스를 3주 동안 추가 치료 없음 또는 주 2회 젬시타빈(100 mg/kg 복강내)으로 무작위화하고, 추가 치료를 받지 않거나(패널 (i)) 또는 젬시타빈 주사와 동시에 100 ㎍ 항-IL-4를 복강내(i.p.) 투여받도록(패널 (ii)) 추가로 무작위화하였다. 그래프는 군 당 6 내지 7마리 마우스를 갖는 각 군에 대한 평균 종양 면적을 나타낸다. 도 5b는 도 5a에서와 같이 치료 조합을 받는 군에 대한 35일차 종양 면적을 기재하는 그래프를 나타낸다. 각각의 기호는 1마리 동물을 나타낸다. 색인: NS 유의미하지 않음; * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005; **** p<0.001).
도 6a 내지 도 6c는 반복 사이클의 면역화학치료법으로의 개선된 효능을 나타낸다. 도 6a는 CD11b+ 골수 세포(패널 (i)); 관문화된 CD11b+ 골수 세포에서의 GrlHI 호중구(패널 (ii)); 관문화된 CD11b+ 골수 세포에서의 GrlloMHCII+ 단핵구(패널 (iii)); 관문화된 CD11b+ 골수 세포에서의 Ly6C+Ly6G-(패널 (iv)); CD8+ 및 CD4+ T 세포(패널 (v)); 및 CD4+CD25+ T 세포(패널 (vi))에 대한 대표적 관문화를 기재하는 6개 그래프를 나타내는 1 사이클의 화학면역치료법 후 말초 혈액 면역 세포의 분석이다. 도 6b는 1사이클의 화학면역치료법 후 전체 말초 혈액에서 도 6a에서와 같이 관문화된 집단의 정량적 분석을 제공하는 6개 산란 그래프를 나타낸다. 각각의 기호는 1마리 마우스를 나타낸다. 도 6c는 치료하지 않고 두거나 14일차에 항-OX40(250 ㎍) 및 항-CTLA4(250 ㎍)으로 치료받은 Panc02 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스를 기재하는 6개 그래프를 나타낸다. 18일차에 마우스를 2주 동안 추가 치료 없음 또는 주 2회 젬시타빈(100 mg/kg 복강내)으로 무작위화하였다. 젬시타빈의 마지막 투여 3일 후, 선택군은 또 다른 용량의 항-OX40 및 항-CTLA4 또는 미치료 후 2주 동안 또 다른 사이클의 주 2회 젬시타빈(100 mg/kg 복강내)을 투여받았다. 그래프는 군 당 6 내지 7마리 마우스로 개별 마우스에 대한 종양 면적을 나타낸다. 색인: NS 유의미하지 않음; * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005; **** p<0.001).
도 7은 교대 시점의 화학치료법을 나타내는 3개 그래프를 도시한다. Panc02 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스를 치료하지 않고 두거나 11일(7일)차에 또는 18일(0일)차에 250 ㎍ 항-OX40 및 250 ㎍ 항-CTLA4로 치료하였다. 마우스를 18일부터 시작해서 3주 동안 추가 치료 없음 또는 주 2회 젬시타빈(GZ 100 mg/kg 복강내)으로 무작위화하였다. 그래프는 NT 대 GZ 단독(패널 (i)); GZ 단독 대 항-OX40 및 항-CTLA4 + 0일 GZ(패널 (ii)); 및 GZ 단독 대 항-OX40 및 항-CTLA4 + 7일 GZ(패널 (iii))에 대해 군 당 6 내지 7마리 마우스로 마우스에 대한 생존 곡선을 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 CT26 결장직장 종양의 항-CTLA4 사전-치료를 포함하는 방사선의 개선된 효능을 나타낸다. 도 8a는 평균 종양 크기(패널 (i)) 및 전반적 생존(패널 (ii))을 나타내는 그래프를 제공한다. 종양이 지름 12 mm를 초과하거나 신체적 악화를 나타내는 경우 마우스를 안락사시켰다. 도 8b는 다음 군에서 개별 마우스로부터의 종양 측정치를 도시하는 그래프를 제공한다: 미치료(패널 (i)) 또는 항-CTLA4 d7(패널 (ii)); 방사선치료법(RT) 20 Gy d14(패널 (iii)); 항-CTLA4 d7 + RT 20 Gy d14(패널 (iv)); 항-CTLA4 d15 + RT 20 Gy d14(패널 (v)); 항-CTLA4 d19 + RT 20 Gy d14(패널 (vi)) 치료. 군 당 n=6 마우스로 나타낸 대표적 실험. 실험을 최소 2회 반복하였다.
도 9는 4T1 종양 보유 마우스에서 항-CTLA4 사전-치료의 효과를 나타내는 그래프이다. 4T1 종양은 4기 유방암에 대한 동물 모델이다. 미치료(패널 (i)) 또는 항-CTLA4 d7 치료(패널 (ii)); 방사선치료법(RT) 20 Gy d14, 15 및 16(패널 (iii)); 항-CTLA4 d7 + RT 20 Gy d14, 15 및 16(패널 (iv)); 항-CTLA4 d17 + RT 20 Gy d14, 15 및 16(패널 (v))의 군에서 개별 마우스로부터의 종양 측정. 실험을 최소 2회 반복하였다.
도 10은 방사선 치료법 후 항-OX40 면역치료법의 최적 시점을 나타내는, CT26 결장직장 종양을 보유하는 마우스에서의 전반적 생존 그래프이다. 오른쪽 다리에 CT26 종양을 보유하는 마우스는 치료하지 않고 두거나 20 Gy 국소 방사선으로 치료하였다. 마우스를 7일, 15일 또는 19일차에 250 ㎍ 항-OX40을 투여받도록 무작위화하였다. 종양이 지름 12 mm를 초과하거나 신체적 악화를 나타낸 경우 마우스를 안락사시켰다. 데이터를 군 당 총 n=12 내지 18 마우스로, 3개 실험으로부터 조합하였다.
도 11a 내지 도 11c는 방사선 효능이 T 조절 세포의 사전-소모에 의해 개선되었음을 나타낸다. 오른쪽 다리에 CT26 종양을 보유하는 마우스를 7일차에 미치료, CD4 소모 항체 또는 CD25 소모 항체를 투여받도록 무작위화하였다. 마우스를 14일차에 치료하지 않고 두거나 20 Gy 국소 방사선으로 치료하도록 추가 무작위화하였다. 도 11a는 대조군(패널 (i)) 및 CD4 소모된 마우스(패널 (ii))에서 CD8 및 CD4 T 세포를 나타내도록 관문화된 말초 혈액 림프구 및 대조군(패널 (iii)) 및 CD25 소모된 마우스(패널 (iv))에서 CD25+ T 세포를 나타내도록 관문화된 CD4 T 세포의 세포 정렬을 도시한다. 도 11b는 미치료(패널 (i)) 또는 항-CD4(패널 (ii)); 항-CD25(패널 (iii)); 방사선치료법(RT)(패널 (iv)); 항-CD4+RT(패널 (v)); 항-CD25+RT(패널 (vi))로 치료받은 주어진 군에서 개별 마우스로부터의 종양 측정치를 도시하는 그래프를 제공한다. 도 11c는 전반적 생존을 나타내는 그래프이다. 종양이 지름 12 mm를 초과하거나 신체적 악화를 나타낸 경우 마우스를 안락사시켰다. 군 당 n=6 마우스로 나타낸 대표 실험.
도 12a 및 도 12b는 상이한 항-CTLA4 클론의 비교를 나타낸다. 오른쪽 다리에 CT26 종양을 보유하는 마우스를 7일차에 치료하지 않고 두거나 250 ㎍ 항-CTLA4 클론 9D9 또는 250 ㎍ 항-CTLA4 클론 UC10으로 치료하였다. 마우스를 14일차에 치료하지 않고 두거나 20 Gy 국소 방사선으로 치료하도록 추가 무작위화하였다. 도 12a는 평균 종양 크기(패널 (i)) 및 전반적 생존(패널 (ii))을 나타내는 그래프를 도시한다. 종양이 지름 12 mm를 초과하거나 신체적 악화를 나타낸 경우 마우스를 안락사시켰다. 도 12b는 다음 군에서 개별 마우스로부터의 종양 측정치를 도시하는 그래프이다: 미치료(패널 (i)) 또는 항-CTLA4(9D9) d7(패널 (ii)); 항-CTLA4(UC10) d7(패널 (iii)); RT 20 Gy d14(패널 (iv)); 항-CTLA4(9D9) d7 + RT 20 Gy d14(패널 (v)); 항-CTLA4(UC10) d7 + RT 20 Gy d14(패널 (vi))로 치료. 군 당 n=6 마우스로 나타낸 대표 실험.
본원의 개시는 암 화학치료법의 효능 증강에 유용한 방법을 제시한다.
본원의 개시는 뮤린 췌장 선암종 종양이 확립된 마우스에 대한 작용성 항-OX40 항체 및 항-CTLA4 항체의 조합 투여가 종양에서 대식구의 재분극화와 연관된 일시적 표현형 변화를 일으켰다는 발견을 제시한다. 대식구 재분극화와 동시적인 젬시타빈의 투여는 화학치료법 또는 조합된 면역치료법 단독에 비해 유의미하게 개선된 종양 제어를 일으켰다. 상기 면역화학치료법의 치료 윈도우는 단기-지속되었다. 억제성 종양 환경의 복귀는 배액 림프절에서 CD4 T 세포의 Th2 분극화, 종양의 증가된 CD4 침윤 및 종양 대식구의 M2 분화 반동과 연관되었다. IL-4 차단 항체의 투여는 면역화학치료법에 의한 종양 제어를 개선하였다. 중요하게는, 마우스는 화학치료법 후 면역 기능을 보유하였고, 추가 사이클의 면역화학치료법은 종양 제어를 개선할 수 있었다. 이들 데이터는 면역치료법 및 화학치료법에 고도 내성인 전임상 종양 모델에서, 예비 면역치료법이 통상적 화학치료법에 비해 종양 제어를 개선하기 위해 이용될 수 있음을 나타낸다.
또한, 항-CTLA4를 이용한 면역치료법 후 전달된 방사선 치료법은 확립된 결장직장 암종 종양을 갖는 마우스에서 100% 종양 치유를 일으키는 것으로 발견되었다. 항-OX40 작용제 항체의 투여는 방사선 1일 후 전달되는 경우 최적이었다(중앙값 생존이 RT 단독으로 50일에 비해 도달되지 않았다, p<0.05). 항-CTLA4는 부분적으로는 T 조절 세포 소모에 의해 매개되어, 방사선 전에 주어지는 경우 고도로 효과적인 반면, 항-OX40 작용제 항체는 방사선 직후 전달되는 경우 항원 방출 및 증가된 항원 제시 시점과 일치하게 고도로 효과적이었다. 이들 데이터는 면역치료법 및 방사선의 조합이 개선된 치료 효능을 일으키며; 방사선과 함께 투여의 이상적 시점이 이용되는 면역치료법의 유형에 의존함을 나타낸다.
추가 구현예에서, 본원에 개시된 면역치료법은 비제한적으로 유방암, 췌장암 및 폐암을 포함하는 치료를 위해 이용될 수 있다.
종양 면역 환경
종양의 면역 환경은 통상적 치료법 이후 결과를 예측한다. 췌장암의 마우스 모델에서, 종양-연관된 대식구의 침윤을 감소시키는 치료법은 화학치료법에 대한 반응을 개선하였다. 유사한 결과가 마우스 유방암 모델에서도 관찰되었다.
종양 성장을 촉진하는 면역 환경을 갖는 환자에 있어서, 통상적 치료법을 이용하는 결과를 개선하기 위해 면역치료법을 통해 종양 환경을 개선할 기회가 존재함이 제안된다. OX40 또는 CTLA4를 표적으로 하는 면역치료법은 T 세포 침윤에서의 변화를 통해 종양 환경을 리모델링하는 것으로 나타났다. OX40에 대한 작용성 항체를 이용한 면역치료법은 종양을 리모델링하여 증가된 CD8 침윤을 그리고 결과적으로 감소된 대식구 침윤을 일으킬 수 있다(Gough et al., Cancer Res 2008; 68:5206-15). 유사하게, CTLA-4에 대한 차단 항체는 마우스 모델(Curran et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010; 107:4275-80) 및 환자(Huang et al., Clinical Cancer research 2011; 17:4101-9) 모두에서 종양에 대해 증가된 T 세포 침윤을 일으키는 것으로 나타났다. 그러나, 환자에서 이들 침윤의 단순한 존재가 반드시 치료 성공과 연관되지는 않았다(Huang et al., Clinical cancer research 2011; 17:4101-9). 종양 면역 환경에서 대식구는 친-적응 면역 M1 분화에서 친-상처 치유 M2 분화로 이의 표현형을 신속히 변경하고 T 세포 치료법 후 초기 염증을 해소할 수 있는 것으로 나타났다(Gough et al., Immunology 2012; 136:437-47). 그럼에도 불구하고, 화학치료법의 효능이 비효율적은 약물 전달에 의해 제한되므로, 전신 면역치료법 후 종양 내로의 초기 T 세포 침윤은, 예를 들어 비효율적인 신생혈관 혈관계를 재구축하거나 정상화함으로써, 종양 환경을 일시적으로 리모델링하기 충분할 수 있다(Ganss et al., Cancer Res 2002; 62: 1462-70). 특정 이론에 구애받지 않고, 면역치료법에 의한 종양 리모델링은 다른 종양 면역 환경에서 종양을 화학치료법에 더 감수성으로 만들 가능성을 갖는 것으로 가정되었다.
상기 가설을 시험하기 위해, 더 면역원성이 높은 종양에 비해 광범위한 기질 관여 및 감소된 약물 침투를 가지는, 면역적격 마우스에서 고도 화학내성이고 방사선내성인 종양을 형성하는 췌장 선암종의 Panc02 마우스 모델이 이용되었다. 본원에 나타낸 바와 같이, 전신 면역치료법은 감소된 아르기나제 발현에 의해 결정되는 종양 내 대식구의 분극화를 일시적으로 변경하였다. 변경된 대식구 분극화의 윈도우 동안 젬시타빈 화학치료법의 전달은 종양 제어 및 생존을 유의미하게 개선시켰다. 추가적으로, 이들 종양-보유 마우스에서의 T 세포 분화는 상기 면역화학치료법을 위해 최적이 아닌 것으로 나타났다. 이는 활성화된 CD4 T 세포에 의해 인터류킨-4(IL-4) 생산과 연관된 2형 헬퍼 T 세포(Th2) 분화를 일으켰다. 생체내 인터류킨-4(IL-4)의 억제는 면역화학치료법의 효능을 유의미하게 개선하였다. 마지막으로, 뮤린 면역 세포는 추가 회의 면역화학치료법이 종양 제어 및 생존을 유의미하게 증가시키도록 화학치료법 후 기능적으로 유지되는 것으로 나타났다. 이들 데이터는 면역치료법 및 화학치료법의 순서 및 시점이 종양 미세환경 및 종양 반응에 유의미한 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 예비 면역치료법은 면역 환경이 불량한 경우 화학치료법의 효능을 개선할 잠재성을 갖는 신규 치료 옵션이며, 음성적 면역학을 갖는 암에서 반응률을 증가시킬 수 있다.
방사선 치료법은 환자의 면역계에 영향을 미치며, 면역계는 방사선 치료법에 대한 반응에 영향을 미친다(Gough et al., Immunotherapy, 2012. 4(2): 125-8). 종양의 방사선 치료법은 MHC 클래스 I 발현에서 용량-반응성 증가(Reits et al., The Journal of experimental medicine, 2006. 203(5): 1259-71) 및 고선량 방사선 후 2일 내에 짧은 항원 제시 윈도우(Zhang et al., The Journal of experimental medicine, 2007. 204(1): 49-55)를 일으킨다. 따라서 T 세포를 표적화하는 여러 전임상 및 임상 면역 치료법은 방사선 선량 후 가깝게 공동 자극 또는 면역 보강제를 적용한다(Lee et al., Blood, 2009. 114(3): 589-595; Gough et al., J Immunother, 2010. 33(8): 798-809; Demaria et al., Clin Cancer Res, 2005. 11(2 Pt 1): 728-34; Deng et al., J Clin Invest, 2014. 124(2): 687-95; Seung et al., Sci Transl Med, 2012. 4(137): 137ra74). 이들 접근법은 다양한 정도로 종양-항원 특이적 면역 반응을 증가시키고, 방사선 치료 종양 및 원발성 미치료 종양의 제거를 개선하고, 치유된 동물을 후속 종양 유발접종으로부터 보호하는 것으로 나타났다. 그러나, 일련의 흥미로운 증례 연구는 방사선이 뒤따르는 이필리무맙(인간 항-CTLA4 항체)을 이용한 면역 치료법이 증가된 종양 항원 특이적 반응을 가지며 흑색종에서 광범위한 종양 퇴행으로 이어질 수 있음을 나타내었다(Postow et al., The New England journal of medicine, 2012. 366(10): 925-31; Hiniker et al., Translational Oncology, 2012. 5(6): 404-407). 이들 환자에서, 방사선 치료법은 이필리무맙 연구에 이미 참여 중인 환자에서 개별 병소에 대해 완화적인 방식으로 전달되었다. 이필리무맙 치료법은 이들 종양이 항체 치료법에 대한 반응을 나타내는지와 무관하게, 환자에서 종양 내로 T 세포 침윤을 증가시키는 것으로 나타났다(Huang et al., Clin Cancer Res, 2011. 17(12): 4101-9). 따라서, 면역 치료법 후 전달된 국소적인 완화적 방사선을 이용해서 국소 및 원발성 질환 제어를 모두 달성한 환자는 개선된 종양 환경에 대한 치료를 받았을 수 있다. 이필리무맙 및 방사선으로 치료받은 환자의 리뷰에서, Barker 등은 '관리기'에 방사선 치료법 후 방사선으로 치료받은 환자가 '유도기' 동안 방사선으로 치료받은 환자에 비해 유의미한 생존 이점을 나타냄을 확인하였다(Barker et al., Cancer Immunol Res, 2013. 1(2): 92-8). 이들 데이터는 항-CTLA4 및 방사선 치료법의 일정수립이 시점 최적화에 의해 개선될 수 있음을 시사한다.
현재까지, 면역치료법이 먼저 전달되도록 방사선과 함께 면역치료법의 시점을 합리적으로 최적화한 연구는 거의 없었다. 최근에 방사선 치료법의 전임상 뮤린 모델에서, TGFβ 억제제를 이용한 사전-치료가 잔여 질환의 면역 제어를 개선함으로써 방사선 치료법에 대한 반응을 개선하는 것으로 나타났다(Young et al., Cancer Immunol Res, 2014). 특정 이론에 구애받고자 하지 않고, 방사선 치료법 전에 항-CTLA4 항체를 이용한 사전-치료는 방사선-이후 치료에 비해 종양 제어를 개선할 것으로 가정되었다. 면역 적격 마우스에서의 결장직장암의 전임상 모델에서, 항-CTLA4 항체를 이용한 사전-치료는 최적 종양 제어를 제공하였다. 그러나, 최근-활성화된 T 세포를 표적화하는 항-OX40을 이용한 교대 면역치료법은 방사선 치료법 직후 전달되는 경우 최적이었다. 특정 이론에 구애받고자 하지 않고, 항-CTLA4 사전치료의 효능은 T 조절 세포를 소모시키는 그 능력에 있을 수 있다. 본원에 기재된 결과는 임상에 대한 최적 조합 치료로 반영하는 경우 고려할 중요한 전임상 증거를 제공하며, 구체적으로 면역치료법 작용 기전은 방사선과의 최적 시점을 지시할 수 있다.
항-종양 치료법
다른 암 치료와 조합된, OX40 작용제 또는 항-OX40 항체(예컨대, OX40 작용제 항체) 및/또는 항-CTLA4 항체의 투여를 포함하는 암 치료 방법이 본원에 제공된다. 항-OX40 항체(예컨대, OX40 작용제 항체) 및/또는 항-CTLA4 항체의 투여는 종양 환경에 변화(예컨대, 억제된 대식구 분화)를 일으켰으며, 상기 면역치료법의 시행은 화학치료법의 항-종양 효과, 예컨대, 가변 수준의 종양 퇴행, 수축 또는 질환 진행의 지연을 증가시켰다.
본 개시의 일 양태는 유효량의 항-OX40 항체(예컨대, OX40 작용제 항체) 및/또는 항-CTLA4 항체 및 하나 이상의 화학치료제를 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 적합한 화학치료제 및 독소는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995) 및 Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)]에 기재되어 있다. 다른 적합한 독소 및/또는 화학치료제는 당업자에게 공지되어 있다.
항-OX40 항체(예컨대, OX40 작용제 항체) 및/또는 항-CTLA4 항체의 투여는 종양 연관된 대식구에서 아르기나제 발현 수준의 감소로 나타나는 바와 같이, 종양에서 대식구 분화를 억제하였다. 종양 연관된 대식구 분화의 억제는 화학치료법에 의한 항-종양 효과가 다르게는 통상적 치료법에 대해 내성인 종양에서 관찰되는 윈도우에서 일어났다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예에서, 화학치료제(예컨대, 젬시타빈, 5FU, 도세탁셀, 파클리탁셀 또는 CPT11)는 대식구 분화가 감소되는 시점에 투여된다. 항-OX40 항체(예컨대, OX40 작용제 항체) 및 항-CTLA4 항체의 투여는 또한 대식구 분화를 촉진하는 IL4를 분비하는 T 세포의 Th2 분화와 연관되었다. 면역치료법과 항-IL4 항체의 투여는 Th2 세포에 의한 IL4 분비에 반응하여 대식구 분화를 억제하였다. 따라서, 특정 구현예에서, 항-IL4 항체의 이용이 항-OX40 항체(예컨대, OX40 작용제 항체) 및 항-CTLA4를 이용한 항-종양 요법에 포함된다.
바람직하게는, OX40 작용제 및/또는 항-CTLA4 항체의 투여는 종양 리모델링, 대식구 분화의 억제 및/또는 T 세포 분화의 억제 중 하나 이상을 일으킨다. 따라서, OX40 작용제 및/또는 항-CTLA4 항체의 투여는, 예를 들어 화학치료법 및 방사선치료법을 포함하는 통상적 암 치료법의 항-종양 효과를 증강시키기 위해 이용될 수 있다. OX40 작용제 및/또는 항-CTLA4 항체는 화학치료법 또는 방사선치료법 전에, 동안 또는 후에 투여될 수 있다. 투여될 OX40 작용제 및/또는 항-CTLA4 항체의 유효량은 널리 공지된 방법에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있다. 암 치료법의 독성이 (예컨대, 낮은 림프독성을 가지는)대상체에 의해 관용되는 경우, 본 발명의 방법에 따른 1회 이상의 면역화학치료법이 이용될 수 있다.
OX40 작용제의 투여에 대한 임상적 반응은 비제한적으로 자기 공명 조영(MRI) 스캐닝, x-선 촬영 조영, 전산화 단층촬영(CT) 스캐닝, 유세포 측정 또는 형광-활성화 세포 정렬장치(FACS) 분석, 조직학, 거시 병리학 및 비제한적으로 ELISA, RIA 및 크로마토그래피에 의해 검출 가능한 변화를 포함하는 혈액 화학을 포함하는, 임상의에게 공지된 진단 기법을 이용하여 평가될 수 있다. 일 예에서, OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체는 대식구 분화를 감소시키며, 이는 대식구에서 아르기나제 발현의 감소에 의해 측정될 수 있다(예컨대, 본원에 기재된 방법을 이용).
OX40 작용제 및/또는 항-CTLA4 항체를 포함하는 암 치료법을 이용하는 효과적인 치료에는, 예를 들어, 일차 종양 부위 또는 하나 이상의 전이에서, 암의 진행 속도 감소, 종양 또는 전이성 성장의 지연 또는 안정화, 종양 수축 및/또는 종양 퇴행이 포함된다.
본원에서 아래에 보고된 바와 같이, OX40 작용제 및 IDO 억제제의 투여는 종양 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 효능을 예상치 못하게 증강시킨다.
OX40 작용제
OX40 작용제는 항원에 의한 감작 동안 또는 직후 CD4+ T-세포 상에서 OX40 수용체와 상호작용하여 항원에 대한 CD4+ T-세포의 증가된 반응을 일으킨다. 항원 특이적 CD4+ T-세포 상에서 OX40 수용체와 상호작용하는 OX40 작용제는 항원 단독에 대한 반응에 비해 T 세포 증식을 증가시킬 수 있다. 항원에 대한 상승된 반응은 OX40 작용제의 부재 하에서보다 실질적으로 더 긴 시기 동안 유지될 수 있다. 따라서, OX40 작용제를 통한 자극은 항원, 예컨대, 종양 세포의 T-세포 인식을 강화함으로써 항원 특이적 면역 반응을 증강시킨다. OX40 작용제는, 예를 들어, 본원에 이의 전문이 참조로 포함되는, U.S. 특허 제6,312,700호, 제7,504,101호, 제7,622,444호 및 제7,959,925호에 기재된다. 암 치료에서 이러한 작용제의 이용 방법은, 예를 들어, 각각 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 WO/2013/119202 및 WO/2013/130102에 기재된다.
OX40 작용제에는 비제한적으로 OX40 결합 분자, 예컨대, 결합 폴리펩타이드, 예컨대, OX40 리간드("OX40L") 또는 OX40-결합 단편, 이의 변이체 또는 유도체, 예컨대 가용성 세포외 리간드 도메인 및 OX40L 융합 단백질 및 항-OX40 항체(예를 들어, 모노클로날 항체, 예컨대 인간화 모노클로날 항체) 또는 항원-결합 단편, 이의 변이체 또는 유도체가 포함된다. 항-OX40 모노클로날 항체의 예는, 예를 들어, 그 개시의 전문이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 제5,821,332호 및 제6,156,878호에 기재된다. 특정 구현예에서, 항-OX40 모노클로날 항체는 본원에 그 전문이 참조로 포함되는, 문헌[Weinberg, A.D., et al. J Immunother 29, 575-585(2006)]에 기재된 바와 같은 9B12 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이다.
특정 양태에서, 본 개시는 항체 VH 및 항체 VL을 포함하는 인간화 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VL은 참조 아미노산 서열 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 32와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시는 항체 VH 및 항체 VL을 포함하는 인간화 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VL은 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 32를 포함한다.
본 개시는 항체 VH 및 항체 VL을 포함하는 인간화 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 추가로 제공하며, 여기서 VH는 VHCDR1 아미노산 서열 SEQ ID NO: 8, VHCDR2 아미노산 서열 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 16 및 VHCDR3 아미노산 서열 SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 또는 SEQ ID NO: 27과 동일하거나 하나 이상의 VH-CDR에서의 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 단일 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 제외하고 동일한 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 항체 VH 및 항체 VL을 포함하는 인간화 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 추가로 제공하며, 여기서 VH는 하기 식:
HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4를 가지는 아미노산 서열을 포함하며,
여기서 HFW1은 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 7이고, HCDR1은 SEQ ID NO: 8이고, HFW2는 SEQ ID NO: 9이고, HCDR2는 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 16이고, HFW3은 SEQ ID NO: 17이고, HCDR3은 SEQ ID N: 25, SEQ ID NO: 26 또는 SEQ ID NO: 27이고, HFW4는 SEQ ID NO: 28이다. 특정 양태에서, HFW2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 13이다. 특정 양태에서, HFW3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 또는 SEQ ID NO: 24이다.
또한, 본 개시는 항체 VH 및 항체 VL을 포함하는 인간화 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VH는 참조 아미노산 서열 SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65 또는 SEQ ID NO: 67과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 항체 VH 및 항체 VL을 포함하는 인간화 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VL은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 29를 포함하고 VH는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 59를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시는 항체 중쇄 또는 이의 단편 및 항체 경쇄 또는 이의 단편을 포함하는 인간화 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 중쇄는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 71을 포함하고, 경쇄는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 30을 포함한다.
다른 구현예에서, OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 mAb 9B12와 동일한 OX40 에피토프에 결합한다.
예시적인 인간화 OX40 항체는 문헌[Morris et al., Mol Immunol. May 2007; 44(12): 3112-3121]에 기재되며, 하기 서열을 갖는다:
Figure pct00004
Figure pct00005
9B12는 인간 OX40의 세포외 도메인(CD134)에 대해 유도된 뮤린 IgG1, 항-OX40 mAb이다(Weinberg, A.D., et al. J Immunother 29, 575-585(2006)). 이는 OX40 신호전달, 안정성을 위한 및 하이브리도마에 의한 고수준 생산을 위한 작용제 반응을 유발하는 그 능력으로 인해 항-OX40 모노클로날 항체 패널로부터 선택되었다. 임상적 적용에서의 이용을 위해, 9B12 mAb는 인산염 완충 식염수, pH 7.0로 평형화되며, 그 농도는 투석여과에 의해 5.0 mg/ml까지 조정된다.
"OX40 리간드"("OX40L")(또한 종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 4, gp34, TAX 전사 활성화 당단백질-1 및 CD252로 다양하게 명명됨)는 대부분 항원 제시 세포(APC) 상에서 확인되며, 활성화된 B 세포, 수지상 세포(DC), 랑게르한스 세포, 형질세포양 DC 및 대식구 상에서 유도될 수 있다(Croft, M., (2010) Ann Rev Immunol 28:57-78). 활성화된 T 세포, NK 세포, 비만 세포, 내피 세포 및 평활근 세포를 포함하는 다른 세포는 염증성 사이토카인에 반응하여 OX40L을 발현할 수 있다(Id.). OX40L은 OX40 수용체에 특이적으로 결합한다. 인간 단백질은 PCT 공개 번호 WO 95/21915에 기재되어 있다. 마우스 OX40L은 U.S. 특허 제5,457,035호에 기재되어 있다. OX40L은 세포의 표면 상에서 발현되며 세포내, 막통과 및 세포외 수용체-결합 도메인이 포함된다. OX40L의 기능적 활성 가용성 형태는, 예컨대, 그 개시가 모든 목적을 위해 본원에 포함되는 U.S. 특허 제5,457,035호 및 제6,312,700호 및 WO 95/21915에 기재된 바와 같이, 세포내 및 막통과 도메인의 결실에 의해 생산될 수 있다. OX40L의 기능적 활성 형태는 OX40에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, 즉 OX40 "수용체 결합 도메인"을 보유하는 형태이다.
관련된 구현예에서, 본 개시는 OX40에 특이적으로 결합하는 능력을 소실한 OX40L의 돌연변이체, 예를 들어 SEQ ID NO: 96의 아미노산 51 내지 183을 제공하며, 여기서 인간 OX40L의 수용체-결합 도메인의 위치 180에서의 페닐알라닌은 알라닌으로 대체되었다(F180A).
Figure pct00006
Figure pct00007
OX40L 분자 또는 유도체의 OX40에 특이적으로 결합하는 능력을 결정하는 방법이 아래에서 논의된다. OX40L 및 그 유도체(예컨대 OX40 결합 도메인을 포함하는 유도체)의 제조 및 이용 방법은 WO95/21915에 기재되어 있으며, 이는 배양된 세포로부터 OX40 리간드의 정제를 촉진하기 위해 또는 포유류에 대한 생체내 투여 후 분자의 안정성을 증강시키기 위해 생산될 수 있는, 다른 펩타이드, 예컨대 인간 면역글로불린("Ig") Fc 영역에 연결된 OX40L의 가용성 형태를 포함하는 단백질을 또한 기재한다(또한, 둘 다 본원에 이의 전문이 참조로 포함되는, U.S. 특허 제5,457,035호 및 PCT 공개 번호 WP 2006/121810을 참고한다).
OX40 작용제에는 OX40L의 하나 이상의 도메인이 하나 이상의 추가 단백질 도메인에 공유 결합되는 융합 단백질이 포함된다. OX40 작용제로 이용될 수 있는 예시적인 OX40L 융합 단백질은 그 개시의 전문이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 제6,312,700호에 기재되어 있다. 일 구현예에서, OX40 작용제에는 다량체성(예컨대, 삼량체성 또는 육량체성) OX40L 융합 단백질로 자가-조립되는 OX40L 융합 폴리펩타이드가 포함된다. 이러한 융합 단백질은, 예컨대 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 U.S. 특허 제7,959,925호에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, OX40L 융합 단백질은 OX40L-IgG4-Fc 폴리펩타이드 서브유닛 또는 다량체성 융합 단백질이다. 상술된 바와 같은 OX40L 융합 폴리펩타이드 서브유닛은 삼량체성 또는 육량체성 OX40L 융합 단백질로 자가-조립될 수 있다. 따라서, 본 개시는 상술된 바와 같은 6개의 폴리펩타이드 서브유닛을 포함하는 육량체성 단백질을 제공한다. 하나의 예시적인 폴리펩타이드 서브유닛은 "OX40L IgG4P 융합 단백질"로 본원에서 명명된 육량체성 단백질로 자가-조립된다. 구체적으로 주지된 경우를 제외하고, 본원에서 이용되는 "OX40L IgG4P 융합 단백질"이라는 용어는 인간 OX40L IgG4P 융합 단백질을 나타낸다. 육량체성 단백질 OX40 IgG4P 융합 단백질로 자가-조립되는 폴리펩타이드 서브유닛의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 98에 제공된다. 그럼에도 불구하고, 당업자는 여러 다른 서열이 또한 육량체성 OX40L 융합 단백질에 대해 본원에 나타낸 기준을 충족함을 인식할 것이다.
본 개시는 OX40L 융합 폴리펩타이드 서브유닛 또는 본원에 제공된 바와 같은 육량체성 단백질, 예컨대, OX40L IgG4P 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. OX40L IgG4P 융합 단백질의 폴리펩타이드 서브유닛을 인코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 SEQ ID NO: 97로 나타낸다. 특정 양태에서, IgG4 Fc 도메인, 삼량체화 도메인 및 OX40L 수용체 결합 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 5'에서 3' 배향으로 연결된다, 예컨대, 5'에서 3' 배향으로 인접하여 연결된다. 다른 양태에서, 제공되는 폴리뉴클레오타이드는 예컨대, 분비 신호 펩타이드 또는 막 편재 서열을 인코딩하는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 그리고 모든 OX40L 융합 폴리펩타이드 서브유닛 또는 서브유닛을 포함하는 다량체성, 예컨대, 육량체성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본 개시에 의해 제공된다.
특정 양태에서, 본 개시는 OX40L IgG4P 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 특정 양태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 97을 포함한다. 본 개시는 본원에서 제공되는 제어 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, HuIgG-4FcPTFOX40L F180A를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 특정 양태에서, 핵산은 SEQ ID NO: 99를 포함하며, 또한 본원에서 huIgGFcPTF2OX40L F180A로 불리는 상기 구축물로부터의 발현 산물은 SEQ ID NO: 100의 아미노산 서열을 포함한다.
SEQ ID NO: 97: huIgG4FcPTF2OX40L의 DNA 서열(5'에서 3'으로의 오픈 리딩 프레임)
Figure pct00008
SEQ ID NO: 98: huIgG4FcPTF2OX40L의 아미노산 서열(N에서 C 말단으로)
Figure pct00009
huIgG4FcPTF2OX40L F180A의 DNA 서열(5'에서 3'으로의 오픈 리딩 프레임)( SEQ ID NO: 99)
Figure pct00010
huIgG4PFcTF2OX40L F180A의 아미노산 서열(N에서 C 말단으로)( SEQ ID NO: 100)
Figure pct00011
다량체성 OX40L 융합 단백질은 고도로 안정한 삼량체 및 육량체로 자발 조립되는 그 능력으로 인해 대상체, 특히 인간 대상체에서 항원 특이적 면역 반응의 증강에 있어서 증가된 효능을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 다량체 형태로 조립될 수 있는 OX40 작용제에는 N-말단에서 C-말단 방향으로 면역글로불린 도메인(Fc 도메인이 포함됨), 삼량체화 도메인(꼬인 코일 삼량체화 도메인이 포함됨) 및 수용체 결합 도메인(OX40 수용체 결합 도메인, 예컨대, OX40L 또는 OX40-결합 단편, 이의 변이체 또는 유도체)을 포함하는 융합 폴리펩타이드가 포함되며, 여기서 융합 폴리펩타이드는 삼량체성 융합 단백질로 자가-조립될 수 있다. 일 양태에서, 다량체 형태로 조립될 수 있는 OX40 작용제는 OX40 수용체에 결합하고 적어도 하나의 OX40 매개 활성을 자극할 수 있다. 특정 양태에서, OX40 작용제에는 OX40 리간드의 세포외 도메인이 포함된다.
다량체 형태로 조립될 수 있는 OX40 작용제의 삼량체화 도메인은 개별 OX40L 융합 폴리펩타이드 분자의 삼량체성 단백질로의 자가-조립을 촉진하는 작용을 한다. 따라서, 삼량체화 도메인을 갖는 OX40L 융합 폴리펩타이드는 삼량체성 OX40L 융합 단백질로 자가-조립된다. 일 양태에서, 삼량체화 도메인은 이소류신 지퍼 도메인 또는 다른 꼬인 코일 폴리펩타이드 구조이다. 예시적인 꼬인 코일 삼량체화 도메인에는 TRAF2(GENBANK® Accession No. Q12933, 아미노산 299 내지 348; 트롬보스폰딘 1(Accession No. PO7996, 아미노산 291 내지 314; 매트릴린(Matrilin)-4(Accession No. O95460, 아미노산 594 내지 618; CMP(매트릴린-1)(Accession No. NP-002370, 아미노산 463 내지 496; HSF1(Accession No. AAX42211, 아미노산 165 내지 191; 및 쿠빌린(Cubilin)(Accession No. NP-001072, 아미노산 104 내지 138이 포함된다. 특정한 구체적 양태에서, 삼량체화 도메인에는 TRAF2 삼량체화 도메인, 매트릴린-4 삼량체화 도메인 또는 이의 조합이 포함된다.
특정한 구현예에서, OX40 작용제는 그 혈청 반감기를 증가시키도록 변형된다. 예를 들어, OX40 작용제의 혈청 반감기는 이종성 분자, 예컨대 혈청 알부민, 항체 Fc 영역 또는 PEG로의 접합에 의해 증가될 수 있다. 특정 구현예에서, OX40 작용제는 다른 치료제 또는 독소로 접합되어 면역접합체 및/또는 융합 단백질을 형성할 수 있다.
특정 양태에서, OX40 작용제는 활성 제제의 투여를 촉진하고 안정성을 도모하기 위해 제형화될 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 무독성 멸균 담체, 예컨대 생리 식염수, 무독성 완충제, 보존제 등을 포함한다. 본원에 개시된 치료 방법에서의 이용에 적합한 제형은, 예컨대, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)]에 기재되어 있다.
항- CTLA4 항체
CTLA4에 특이적으로 결합하고 CTLA4 활성을 억제하는 항체는 항-종양 면역 반응의 증강에 유용하다. 본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 트레멜리무맙(또는 이의 항원-결합 단편)에 관한 정보는 US 6,682,736에서 확인될 수 있고(11.2.1로 언급됨), 그 개시는 본원에 그 전문이 참조로 포함된다. 트레멜리무맙(CP-675,206, CP-675, CP-675206 및 티실리무맙으로도 알려져 있음)은 CTLA4에 대해 고도로 선택적이고 CTLA4의 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)에 대한 결합을 차단하는 인간 IgG2 모노클로날 항체이다. 이는 시험관내 면역 활성화를 일으키는 것으로 나타났으며, 트레멜리무맙으로 치료받은 일부 환자는 종양 퇴행을 나타내었다. 예시적인 항-CTLA4 항체는, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 US 특허 제6,682,736호; 제7,109,003호; 제7,123,281호; 제7,411,057호; 제7,824,679호; 제8,143,379호; 제7,807,797호; 및 제8,491,895호(트레멜리무맙은 여기서 11.2.1임)에 기재되어 있다. 트레멜리무맙은 예시적인 항-CTLA4 항체이다. 트레멜리무맙 서열은 아래에 제공된다(U.S. 특허 제6,682,736호를 참고한다).
트레멜리무맙 VH
Figure pct00012
트레멜리무맙 VL
Figure pct00013
트레멜리무맙 VH CDR1
Figure pct00014
트레멜리무맙 VH CDR2
Figure pct00015
트레멜리무맙 VH CDR3
Figure pct00016
트레멜리무맙 VL CDR1
Figure pct00017
트레멜리무맙 VL CDR2
Figure pct00018
트레멜리무맙 VL CDR3
Figure pct00019
본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 트레멜리무맙은 중쇄 및 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이의 항원-결합 단편은 본원에서 상기에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 본원에서 상기에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이들의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 상기에서 본원에 나타낸 Kabat-정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상기에서 본원에 나타낸 Kabat-정의된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 당업자는 당업자에게 공지된 Chothia-정의된, Abm-정의된 또는 다른 CDR 정의를 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법에서 이용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이의 항원-결합 단편은, 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 US 6,682,736에 개시된 바와 같은 11.2.1 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
다른 항-CTLA4 항체는, 예를 들어, US 20070243184에 기재된다. 일 구현예에서, 항-CTLA4 항체는 MDX-010; BMS-734016으로도 명명된 이필리무맙(Ipilimumab)이다.
항체
OX40, CTLA4 또는 IL4에 선택적으로 결합하고 각각 OX40, CTLA4 및 IL4의 결합 또는 활성을 억제하는 항체가 본 발명의 방법에서 유용하다. 면역치료법이 관여되는 치료를 받고 있는 대상체에는 실질적으로 당분야에 공지된 임의의 항-OX40, 항-CTLA4 또는 항-IL4 항체가 투여될 수 있다. 적합한 항체에는, 예를 들어, 공지된 항체, 상업적으로 이용 가능한 항체 또는 당분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 개발된 항체가 포함된다.
본 발명에서 유용한 항체에는 면역글로불린, 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 상이한 에피토프 결합 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 인간 항체, 인간화 항체, 카멜리드화 항체, 키메라 항체, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편(예컨대 항원 결합부), 디설파이드-결합 Fv(dsFv) 및 항-개별특이형(항-Id) 항체(예컨대, 본원에 개시된 항체에 대한 항-Id 항체), 인트라바디 및 상기 중 임의의 에피토프-결합 단편이 포함된다. 특히, 항체에는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 예컨대, 적어도 하나의 항원-결합 부위를 함유하는 분자가 포함된다.
본 발명의 항체는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 포괄한다. 본 발명의 조성물 및 방법에서 이용되는 항체는 네이키드 항체, 면역접합체 또는 융합 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 IgG 이소형, 특히 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 인간 이소형 또는 인간 집단에서 확인되는 임의의 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 대립유전자를 가지는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 인간 IgG 클래스의 항체는 유리한 기능적 특징, 예컨대 혈청 중 긴 반감기 및 다양한 효과기 기능을 매개하는 능력을 갖는다(Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 1 (1995)). 인간 IgG 클래스 항체는 다음 4개 하위클래스: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가 분류된다. IgG1 하위클래스는 인간에서 높은 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖는다(Chemical Immunology, 65, 88 (1997)). 다른 구현예에서, 항체는 공지된 항체의 이소형 전환된 변이체이다.
약제학적 조성물
종양 또는 고형암의 치료를 위한 화합물 또는 화합물 조합의 투여는 다른 성분과 조합되어, 항-종양 효과를 갖거나 화학치료법의 항-종양 효과(예컨대, 다양한 수준의 종양 퇴행, 수축 또는 질환 진행의 지연)를 증강시키는 치료제 농도를 생성하는 임의의 적합한 수단에 의해 이루어질 수 있다. 화합물은 임의의 적합한 담체 성분 중 임의의 적절한 양으로 함유될 수 있다. 조성물은 비경구(예컨대, 복강내) 투여 경로에 적합한 투여량 형태로 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은 통상적 약제학적 관습에 따라 제형화될 수 있다(예컨대, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 및 Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York]을 참고한다). 인간 투여량은 처음에는 당업자가 동물 모델에 비해 인간에 대한 투여량을 변경하기 위해 당분야에서 일상적이라고 인식하는, 마우스에서 이용되는 화합물의 양으로부터 외삽에 의해 결정될 수 있다.
비경구 이용을 위한 조성물은 단위 투여량 형태로(예컨대, 단일-용량 앰플 중) 또는 몇몇 용량을 함유하고 적합한 보존제가 첨가될 수 있는(아래를 참고한다) 바이알 중 제공될 수 있다. 활성 제제(들)와는 별도로, 조성물에는 적합한 비경구적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제가 포함될 수 있다. 또한, 조성물에는 현탁화제, 가용화제, 안정화제, pH-조정제, 등장성 조정제 및/또는 분산제가 포함될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 멸균 주사에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 조성물을 제조하기 위해, 적합한 활성 치료제(들)는 비경구적으로 허용 가능한 액체 비히클 중에 용해되거나 현탁된다. 이용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 적절한 양의 염화수소산, 나트륨 하이드록사이드 또는 적합한 완충제 첨가에 의해 적합한 pH까지 조정된 물, 1,3-부탄디올, 링거액 및 등장성 나트륨 클로라이드 용액 및 덱스트로스 용액이 있다. 수성 제형물은 또한 하나 이상의 보존제(예컨대, 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트)를 함유할 수 있다. 화합물 중 하나가 수중 거의 불용성이거나 약간만 가용성인 경우, 용해 증강제 또는 가용화제가 첨가될 수 있거나, 용매에 10 내지 60 % w/w의 프로필렌 글리콜 등이 포함될 수 있다.
조합 치료법
특정 구현예에서, 본원에 제시된 개시는 결장직장암을 갖는 대상체에서 화학치료법 또는 방사선치료법 효능을 증강시키는 방법으로서, 방법은 화학치료법 또는 방사선치료법 전에, 동안 또는 후에 항-CTLA4 항체 및/또는 OX40 작용제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
면역치료법 및 화학치료법 간 잠재적 상호작용이 여러 연구자들에 의해 논의되고 있다(Chen and Emens, Cancer immunology, immunotherapy: CII 2013; 62:203-16). 중요하게, 선행 연구는 비-소세포 폐암 환자에서 백신 치료법 후 화학치료법에 대해 예상치 못한 높은 반응률을 나타내었다(Antonia et al., Clinical cancer research 2006; 12:878-87). 본 연구에서, 백신 단독은 항원-특이적 T 세포 반응을 생성하는 데 효과적이었지만, 대부분의 환자에서 질환 진행에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 백신접종 치료법은 결과를 개선하기 위해 화학치료법과 일관되게 상승작용을 갖지 않았다. 다카르바진 화학치료법과 항-CTLA4의 동시적 전달은 전이성 흑색종 환자에서 다카르바진 단독에 비해 반응을 개선하였으나(Robert et al., New England Journal of Medicine 2011; 364:2517-26), 반응률은 이전에 치료받은 환자에서 항-CTLA4 단독으로 나타난 것과 일치하였다(Weber et al., Clinical cancer research 2009; 15:5591-8; Hodi et al., New England Journal of Medicine 2010; 363:711-23). 6회 파클리탁셀 및 카보플라틴이 제공된 비-소세포 폐암 환자에서, 최초 4개 용량의 화학치료법과 동시에 항-CTLA4의 첨가는 화학치료법 단독에 비해 생존을 개선하지 않았지만, 마지막 4개 용량의 화학치료법과 동시에 항-CTLA4의 첨가는 무진행 생존을 개선하였고, 그렇지만 어느 동시 요법도 전반적 생존에 영향을 미치지는 않았다(Lynch et al., Journal of clinical oncology; 30:2046-54). 이후 용량의 화학치료법과 동시적인 항-CTLA4가 화학치료법 단독 대비 무진행 생존을 개선하였지만 전반적 생존을 개선하지 않은 광범위한 질환의 소세포 폐암 환자에서 유사한 결과가 나타났다(Reck et al., Annals of oncology 2013; 24:75-83). 따라서 지금까지 어떤 임상 연구도 본 발명의 전임상 연구에서 관찰된 치료 윈도우를 탐색하기 위해 면역치료법 및 화학치료법의 시점을 변경하지 않았다.
본 발명자들은 화학치료법 및 방사선 치료법이 모두 주조직적합복합체(MHC) 및 공동자극 수용체의 조정을 통해, 암 세포를 면역 파괴에 대해 더 감수성으로 만들 수 있음을 나타내었다(Reits et al., The Journal of experimental medicine 2006; 203: 1259-71; Chakraborty et al, Cancer Res 2004; 64:4328-37; Ramakrishnan et al., The Journal of clinical investigation 2010; 120: 1111-24). 또한, 화학치료법에 의해 유도된 세포사는 치료 후 새로운 종양 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 것으로 제안되었다(Chen and Emens, Cancer immunology, immunotherapy: CII 2013; 62:203-16; Zitvogel et al., Nature reviews Immunology 2008; 8:59-73). 면역치료법은 또한 다른 기전을 통해 화학치료법에 대한 반응에 영향을 미칠 수 있다. 화학치료법의 효능은 암 세포에 대해 효과적인 용량을 제한하는 약물 침투에 의해 제한된다. 면역치료법은 신생혈관 혈관계를 정상화함으로써 종양의 혈관 조직을 개선할 수 있었고(Ganss et al., Cancer Res 2002; 62: 1462-70), 흥미롭게도, 면역치료법은 또한 정상화된 혈관계를 통해 더 효과적이었다(Hamzah et al., Nature 2008; 453:410-4). 이들 데이터는 종양의 면역 상태 및 치료법에 대한 반응 간 복잡한 상호작용이 존재할 수 있고, 면역치료법을 통해 환자 종양을 화학치료법에 대한 이의 감수성을 개선하도록 조작할 기회가 존재함을 시사한다.
상이한 전신 화학치료법은 전신 면역 세포 상에서의 이의 효과가 폭넓게 변한다. 화학치료법의 FOLFIRINOX 칵테일은 전이성 췌장암 환자에서의 결과에서 개선을 제공했다는 증거가 증가해왔으나, 젬시타빈과 마찬가지로 지속적 치유를 일으키지는 않았다(Conroy et al., The New England journal of medicine 2011; 364: 1817-25). 그러나, 상기 칵테일은 젬시타빈에 비해 유의미하게 더 림프독성이었다. 임상 승인을 향해 가고 있는 여러 면역치료법을 이용하여 종양의 면역 환경을 강화할 수 있다면, 최적 화학치료법 파트너는 새로운 기준으로의 재평가를 필요로 할 수 있다. 현재 종양 내 면역 환경이 통상적 치료법에 대한 결과에 유의미하게 영향을 미치는 것이 매우 다양한 종양에서 나타났으므로, 면역치료법을 통한 종양 내 면역 환경의 개선이 일정 범위의 통상적 치료법에 대한 결과를 개선한다고 가정하는 것이 합리적이다. 이는 뛰어난 면역 환경을 갖는 환자에게는 크게 영향을 미치지 않을 수 있다. 예를 들어 여러 단계에 걸쳐, 우수한 '면역스코어'를 갖는 결장직장 암종 환자는 뛰어난 예후를 가졌다(Galon et al., Science 2006; 313: 1960-4). 그러나, 친-종양 면역 환경을 갖는 환자에 있어서는 단계와 무관하게 예후가 불량하였다(Galon et al., Science 2006; 313: 1960-4). 예비 면역치료법으로부터 가장 이익을 얻을 수 있는 대상은 이러한 환자들이다. 상기 접근은 췌장 선암종과 같은 암 유형에서 가장 큰 이익을 가질 수 있고, 여기서 종양은 매우 친-종양 면역 환경을 가지며, 통상적 치료법에 대해 고도 내성이고, 환자 예후가 불량하다.
본원에 정의된 항-종양 치료는 단독 치료법으로 적용될 수도 있고, 또는 본 발명의 화합물에 부가하여, 통상적 수술, 골수 및 말초 줄기 세포 이식, 화학치료법 및/또는 방사선치료법이 관여될 수 있다.
키트
본 발명은 종양 및 고형암 치료를 위한 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 키트에는 항-OX40 항체 및 항-CTLA4 항체가 포함된다. 추가 구현예에서, 키트는 화학치료제(예컨대, 젬시타빈)를 함유한다. 추가 구현예에서, 키트는 항-IL4 항체를 함유한다. 일부 구현예에서, 키트는 치료적 또는 예방적 세포 조성물을 함유하는 멸균 용기를 포함한다; 이러한 용기는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 가방, 파우치, 블리스터-팩 또는 당분야에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 라미네이트지, 금속 호일 또는 약제 보유에 적합한 다른 물질로 제조될 수 있다. 원하는 경우, 본 발명의 항체(예컨대, 항-OX40, 항-CTLA4, 항-IL4)는 고형 종양을 갖는 대상체에 대한 항체의 투여 지침과 함께 제공된다.
특정한 구현예에서, 지침에는 다음 중 적어도 하나가 포함된다: 치료제의 설명; SCLC 또는 이의 증상의 치료를 위한 투여량 일정 및 투여; 주의; 경고; 적응증; 반대 적응증; 과투여량 정보; 유해 반응; 동물 약리; 임상 연구; 및/또는 참고문헌. 지침은 용기(존재하는 경우) 상에 직접 또는 용기에 적용되는 표지로서 또는 용기 내에 또는 이와 함께 공급되는 별도 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로서 인쇄될 수 있다.
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적 기법을 이용하며, 이는 당업자의 수준 내에 확실히 속한다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)]에서 자세히 설명된다. 이들 기법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 생산에 적용 가능하며, 이대로 본 발명의 수행 및 실시에서 고려될 수 있다. 특정한 구현예에 특히 유용한 기법은 후술되는 섹션에서 논의될 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 검정, 스크리닝 및 치료 방법을 어떻게 수행하고 이용하는지에 대한 전체 개시와 설명을 당업자에게 제공하기 위해 나타내며, 본 발명자들이 이들의 발명에 대해 간주하는 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 면역치료법은 화학치료법에 대한 반응을 개선하였다 .
면역치료법이 화학치료법에 대한 반응을 개선할 수 있는지를 연구하기 위해, 췌장 선암종의 Panc02 뮤린 모델을 이용하였다. 상기 모델은 환자에서의 췌장 선암종과 마찬가지로, 시험관내 다른 세포주와 유사한 수준에서 세포독성제에 감수성이지만, 생체내 화학치료법 및 방사선 치료법에 고도 내성이다(Priebe et al, Cancer Chemother Pharmacol 1992; 29:485-9; Young et al, Cancer Immunol Res 2014). Panc02 종양은 생체내 대식구에 의해 고도 침윤되며, Panc02 종양에서의 대식구 분화는 방사선 치료법의 생체내 효능을 제한하는 중요 인자인 것으로 나타났다(Crittenden et al., PloS one 2012; 7:e39295).
종양 내 대식구에 대한 화학치료법의 효과를 결정하기 위해, 확립된 Panc02 종양을 보유하는 마우스를 젬시타빈 화학치료법으로 치료하고 종양을 치료 1주 후 수확하였다. 면역형광 조직학은 침습성 경계 상에 특히 집중된, 그러나 또한 종양에 걸쳐 확산된, 미치료 종양에 걸친 광범위 대식구 침윤을 나타내었다(도 1a). 화학치료법 후, 대식구 침윤이 종양에 걸쳐 증가되어(도 1a), 다른 뮤린 췌장암 세포주로부터의 데이터(Mitchem et al., Cancer Res 2013; 73: 1128-41) 및 뮤린 유방암 모델(DeNardo et al., Cancer discovery 2011; 1:54-67)과 매칭되었다. 면역치료법이 Panc02 종양에서 대식구 분화를 조정할 수 있는지를 결정하기 위해, 확립된 Panc02 종양을 보유하는 마우스를 항-OX40, 항-CTLA4 또는 항-OX40 및 항-CTLA4 조합으로 치료하였다. 종양 대식구를 면역치료법 4일 또는 7일 후 유세포 측정에 의해 단리한 뒤(도 1b), 억제성/복원성 분화의 마커로서 아르기나제에 대한 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 항체 조합은 4일차에 종양 대식구에서 아르기나제 발현을 감소시켰으나, 이는 7일차에 상승된 아르기나제 발현까지 반동하였다(도 1c). 유도성 산화 질소 합성효소(iNOS)는 웨스턴 블로팅에 의해 어느 치료 하의 종양 대식구에서도 검출되지 않아서, 친염증성 상태로의 완전 전환이 없음을 제시하였다. 흥미롭게도, T 세포 표적화된 면역치료법을 이용한 이전 결과는 종양 대식구에 의해 유도된 활성 염증성 분해가 T 세포 침윤의 일시적 이익을 억제함을 나타내었다(Gough et al., Immunology 2012; 136:437-47). 특정 이론에 구애받고자 하지 않고, 이는 종양에서 면역-매개된 리모델링의 유한한 윈도우를 시사한다. 따라서, 항-OX40 및 항-CTLA의 조합은 Panc02 종양 모델에서 대식구 분화를 억제하였다.
실시예 2: 항-OX40 및 항- CTLA4 조합의 사전치료는 화학치료법을 이용한 종양 제어를 유의미하게 개선하였다.
상기 대식구 분화 시점에 기반하여, 면역치료법 4일 후에 시작하여 전달된 화학치료법의 효과를 시험하였다. 면역치료법 단독은 상기 모델에서 종양 치료에 있어서 비효과적이었지만, 젬시타빈 화학치료법은 일시적인 종양 지연(도 2a, 패널 (i)) 및 유의미하게 연장된 생존(도 2b, 패널 (ii))을 제공하였다. 단일 제제로서 항-OX40 또는 항-CTLA4를 이용한 사전-치료는 화학치료법에 대한 반응을 변경하지 않았다. 그러나, 화학치료법과 병행된 항체의 사전치료는 화학치료법을 이용한 종양 제어를 유의미하게 개선하였고(도 2a, 패널 (ii)) 화학치료법 또는 항체 조합 단독에 비해 생존을 개선하였다(도 2b). 상기 효과가 시점에 얼마나 민감한지를 결정하기 위해, 항체 면역치료법과 동일한 날 또는 면역치료법 7일 후 개시된 화학치료법의 효과를 시험하였다. 각 경우, 생존은 화학치료법 단독과 상이하지 않아서(도 7), 상기 면역치료법 효과가 시점에 민감함을 시사하였다.
실시예 3: 상이한 시점에 걸친 종양 환경에 대한 면역치료법의 효과.
이들 시점에 걸친 종양 환경에 대한 면역치료법의 효과를 조사하기 위해, 종양을 수확하고, 침윤 세포 집단에 대한 유세포 측정을 수행하였다. 치료 조합은 골수 세포 비율을 변경하지 않았고, 놀랍게도 치료 후 종양 내 CD8 T 세포의 전반적 비율에서 통계적으로 유의미한 차이가 존재하지 않았다(도 3). 면역치료법에 반응하는 CD8 T 세포의 이러한 불량한 침윤은 면역원성이 더 큰 종양 유형에서의 면역치료법에 대한 반응과 상이하여(Gough et al., Cancer Res 2008; 68:5206-15; Redmond et al., Cancer Immunology Research 2013; 2: 142-53), Panc02 종양이 면역치료법 단독에 대해 불량하게 반응하는 이유를 설명할 수 있다. CD8 T 세포와 마찬가지로, CD11b+ 골수 세포는 비율이 변화하지 않아서, 면역치료법에 의해 유도된 각 세포 집단에서의 변화가 비율이 아니라 분화에 있음을 시사하였다. 조합 치료법 7일 후 CD4 T 세포 침윤의 유의미한 증가가 있었으며(도 3), CD4 T 세포 침윤은 IL-4 분비를 통해 대식구에서 친-종양 및 면역억제성 표현형을 유도하는 것으로 나타났다. 다른 종양 모델에서, 항-OX40 및 항-CTLA4 면역치료법은 CD4 T 세포를 2형 헬퍼 T 세포(Th2) 분화 경로 내로 유도하고 IL-4 분비를 유도하기 위해 상승작용할 수 있는 것으로 나타났다(Redmond et al., Cancer Immunology Research 2013; 2: 142-53; Linch et al., Oncoimmunology 2014; 3:e28245). IL-4는 대식구에서 아르기나제 발현의 주요 유도인자 중 하나이므로, 이들 데이터는 종양 대식구에서 아르기나제 반동을 설명할 수 있을 것이다(도 1c).
실시예 4: 면역치료법은 Panc02 뮤린 모델에서 2형 헬퍼 T 세포( Th2 ) 분화를 증가시켰다.
면역치료법이 상기 모델에서 2형 헬퍼 T 세포(Th2)의 분화를 유도하는지를 결정하기 위해, 항-OX40, 항-CTLA4 또는 조합으로 치료받은 Panc02 종양-보유 마우스로부터의 림프절을 단리하고 T 세포 분화를 분석하였다. 조합 치료는 림프절에서 CD4 및 T 조절 세포수를 유의미하게 증가시켰지만, CD8 T 세포수는 조금만 증가시켰다(도 4a). 비조절(FoxP3-) CD4 T 세포의 전사 인자 분석은 Gata3 발현의 유도에서 항-OX40 및 항-CTLA4 간 상승작용을 나타내었으며(도 4b 및 4c), 이는 2형 헬퍼 T 세포(Th2) 분화를 시사한다. 1형 헬퍼 T 세포(Th1)-연관 전사 인자 Tbet도 더 낮은 수준까지지만 상향조절되었으며, 조합은 상승적이 아니라 부가적으로 나타났다(도 4c). 이들 데이터를 확인하기 위해, 치료받은 동물로부터의 림프절 T 세포를 시험관내에서 항-CD3으로 자극하고 세포내 사이토카인 생산을 측정하였다. 항-OX40 및 항-CTLA4로 치료받은 마우스로부터의 비조절 CD4 T 세포는 IL-4 생산의 상승적 유도 및 인터페론 감마(IFNγ, 도 4d)의 부가적 유도를 나타내어 전사 인자 데이터와 가깝게 매칭되었다. 흥미롭게도, CD8 T 세포에서, 조합 치료법은 Eomes의 유의미한 상향조절을 나타내어(Redmond et al., Cancer Immunology Research 2013; 2: 142-53), 조합 치료법이 이 시점에서 효과기보다는 메모리 T 세포 분화를 유도함을 시사하였다.
실시예 5: IL-4의 2형 헬퍼 T 세포( Th2 ) 생산은 항-OX40/항- CTLA4 치료와 조합된 화학치료법의 효과를 제한하였다.
IL-4의 상기 2형 헬퍼 T 세포(Th2) 생산이 상기 모델에서 화학치료법의 효과를 제한하는지를 결정하기 위해, 마우스를 젬시타빈 화학치료법 4일 후 시작해서 항-OX40 및 항-CTLA4로 치료하였다. 매칭되는 군의 마우스는 각각의 화학치료법 시행 시 IL-4 차단 항체를 투여받았다. 항-IL-4의 첨가는 종양 성장 단독에는 영향을 미치지 않았지만, 화학치료법 및 면역치료법 조합의 영향을 증가시켰다(도 5a). 항-OX40 및 항-CTLA4 사전치료에 이어 항-IL-4와 함께 전달된 화학치료법이 제공된 군은 모든 다른 군에 비해 치료 기간 말기에 유의미하게 개선된 종양 제어를 나타내었다(도 5b). 상기 나타낸 바와 같이, 화학치료법 및 항-IL-4를 둘 다 이용한 치료의 정지 시, 종양이 급속한 성장을 재개하기 전에 대략 1주 동안 종양 제어가 지속되었다.
실시예 6: 적응 면역계는 조합 치료와 화학치료법을 통해 충분히 기능적이었고 추가적인 조합 치료법은 생존을 개선하였다.
상이한 화학치료법은 조혈 세포 집단 상에서 매우 상이한 효과를 가질 수 있다. 젬시타빈은 골수독성 또는 림프독성이 더 높은 화학치료법 중 하나는 아니지만, 화학치료법이 효과기 집단을 사멸시킴으로써 면역 치료법의 효능을 제한할 수 있는 가능성이 있다. 면역 세포에 대한 치료 효과를 결정하기 위해, 면역화학치료법 이후 혈액 상에서 정량적 유세포 측정을 수행하였다. 하위-집단을 확인하기 위해 일정 범위의 표현형 마커를 이용하여(도 6a), 젬시타빈이 말초혈에서 CD11b+Grlhi 호중구뿐만 아니라 CD11b+Ly6C+Ly6Glo 미성숙 골수 세포를 유의미하게 감소시키는 것으로 나타났다(도 6b). CD11b+Grl-MHCII+ 단핵구가 면역치료법에서 증가되었으며, 화학치료법 이후 감소하는 경향이 있었으나 변화는 통계적으로 유의미하지 않았다. T 세포 집단은 화학치료법 이후 감소되지 않았고, 비교 시 CD8, CD4 및 T 조절 세포의 수는 미치료 대조군에 비해 조합 치료 + 화학치료법에서 모두 증가되었다(도 6b). 이들 데이터는 적응 면역계가 젬시타빈 화학치료법으로 치료받은 마우스에서 온전하게 유지되었음을 시사한다. 상기 경우에 있어서, 추가 회의 면역치료법이 화학치료법에 대한 반응을 강화하는 것을 도울 수 있는지를 시험하였다. 상기 실험에서, 마우스를 조합 면역치료법 및 4일 후 화학치료법으로, 그러나 더 짧은 2주 과정 동안 치료하였다. 모든 마우스가 제2회 치료를 위해 이용 가능하도록 치료 과정을 단축하였다. 마우스는 제2 용량의 조합 면역치료법 및 4일 후 제2회 2주 화학치료법을 받도록 무작위화하였다. 제2 용량의 면역치료법을 받는 마우스는 면역치료법 단독, 화학치료법 단독 또는 면역치료법을 1회만 받은 마우스에 비해 유의미하게 개선된 생존을 나타내었다(도 6c). 이들 데이터는 적응 면역계가 화학치료법을 통해 진행 중인 치료의 효능을 다시 증강시키는 추가 강화를 허용하도록 충분히 기능적임을 나타낸다.
이들 데이터는 예비 면역치료법이 화학치료법에 대한 반응을 개선하였고, 화학치료법에 대한 개선된 반응이 종양-연관 대식구의 재분극화와 일치하였음을 나타낸다. 기회 윈도우는 매우 좁았으며, 치료 윈도우의 종결은 2형 헬퍼 T 세포(Th2)의 출현 및 종양 대식구에서 아르기나제 I의 상향조절과 관련하였다. 2형 헬퍼 T 세포(Th2) 효과기 사이토카인 IL-4의 차단이 면역화학치료법의 효능을 개선하였으며, 중요하게는, 면역계가 화학치료법을 통해 적어도 1회의 추가 면역화학치료법을 허용하도록 충분히 기능적으로 유지되었다.
췌장 선암종은 고도 억제성 면역 환경을 갖는 것으로 알려져 있으며 또한 환자에서 그리고 동물 모델에서 화학치료법에 불량하게 반응한다. 상기 실패의 일정 부분은 고도 섬유성 종양 환경 및 비효율적인 신생혈관 혈관계의 결과 암 세포에 대한 화학치료법의 매우 불량한 전달에 기인하는 것으로 여겨진다. 특정 종양 모델에서, OX40에 대한 작용성 항체 또는 CTLA4에 대한 차단 항체는 종양 환경을 리모델링하는 데에 충분히 효과적이다(Gough et al., Cancer Res 2008; 68:5206-15). 그러나 본원에서 시험된 췌장 선암종 모델에서, 화학치료법에 대한 효과는 조합 치료법으로만 관찰되었다. 항-CTLA4 단독이 종양 성장을 늦출 수 있는 면역원성이 더 큰 모델에서는, 항-CTLA4가 화학치료법에 대한 반응을 개선하기 충분하였다(Lesterhuis et al., PloS one 2013; 8:e61895; Jure-Kunkel et al., Cancer immunology, immunotherapy: CII 2013; 62: 1533-45). 면역원성이 불량한 루이스 폐 암종(3LL) 종양 모델에서는, 젬시타빈 화학치료법과 항-CTLA4의 반복 투여가 생존 이점을 생성할 수 있었으며, 어느 제제도 단독으로는 효과적이지 않았다(Lesterhuis et al., PloS one 2013; 8:e61895).
면역치료법 후 상이한 화학치료법 시점을 시험하였으나, 변경된 면역치료법 일정은 시험하지 않았다. 예를 들어, 다른 모델에서는 항-OX40 및 항-CTLA4 면역치료법의 시간차 투여에 의한 종양 제어가 입증되었다(Redmond et al., Cancer Immunology Research 2013; 2: 142-53). 치료 주기의 수 증가 및 다른 제제, 예컨대 항-PD1, 항-41BB 또는 개발 중인 다른 공동자극 분자의 첨가를 이용하는 치료 계획의 최적화를 위해 상당한 범위가 남아 있다. 종양 제어를 최대화하기 위해 다른 제제의 이용을 2형 헬퍼 T 세포(Th2) 패턴 및 IL-4 생산에서 벗어나 CD4 T 세포 분화를 유도하기 위해 탐색할 수도 있다.
실시예 7: 방사선치료법 이전 항- CTLA4 면역치료법은 종양 부담을 감소시키고 전반적 생존을 증가시켰다.
반응을 증강시키기 위해 점점 더 면역치료법이 방사선과 조합되고 있다. 그러나, 조합 치료법의 이상적 시점에 관해서는 상대적으로 데이터가 거의 존재하지 않는다. 증례 보고는 항-CTLA4 치료법을 거치고 있는 환자에게 전달된 완화적 방사선이 전신 치료 반응을 일으켰음을 나타낸다(Postow et al., The New England journal of medicine, 2012. 366(10): 925-31; Hiniker et al., Translational Oncology, 2012. 5(6): 404-407). 이들 보고가 방사선과 동시에 또는 이후 항-CTLA4 치료법을 전달하는 대부분의 임상 시험 설계와 일치하지 않으므로, 방사선에 관한 항-CTLA4 면역치료법 시점의 효과를 연구하였다.
CT26 결장직장 종양을 동계 BALB/c 마우스의 오른쪽 뒷다리에 확립하고, 마우스를 7일, 15일 또는 19일차에 항-CTLA4 항체로 치료하였다; 20 Gy 방사선을 14일차에 종양으로만 전달하였다. 7일차에 항-CTLA4 치료 단독은 미치료(NT) 대조군(p=0.03)에서의 28일 대비 32일의 중앙값 생존을 가지며 적은 생존 이점을 일으켰다(도 8a 및 8b, 패널 (i) 및 (ii)). 방사선 단독은 일시적인 종양 제어를 일으켰으나, 모든 종양은 재성장하여 47일의 중앙값 생존을 가지며 종양 부담에 부차적인 안락사를 일으켰다(NT 대비 p=0.0014)(도 8a 및 8b, 패널 (iii)). 방사선 이전 7일차에 항-CTLA4를 투여받은 종양-보유 마우스는 이의 종양이 제거되었으며, 중앙값 생존은 정의되지 않았다(방사선 단독 대비 p=0.002)(도 8a 및 8b, 패널 (iv)). 대조군 마우스 대비 항-CTLA4로 사전치료받은 마우스의 평균 종양 크기는 방사선 치료법 시점에는 유의미하게 상이하지 않았다. 방사선 이후 항-CTLA4를 투여받은 종양-보유 마우스의 절반에서는 19일차 투여에 대해 53일(방사선 단독 대비 p=0.07) 대비 15일차 투여에 대해 92일(방사선 단독 대비 p=0.002)의 중앙값 생존을 가지며 종양이 제거되었다(도 8a 및 8b, 패널 (v) 및 (vi)). 중요하게는, 조합 치료법에 의해 종양이 치유된 모든 마우스는 CT26 종양의 재유발접종에 내성이었으나, 상이한 종양에 대해서는 여전히 감수성이어서, 장기 항원-특이적 면역성이 달성됨을 시사하였다(표 1, 아래).
CT26 종양이 치유된 종양-보유 마우스는 CT26의 재유발접종에는 거부 반응을 나타냈으나, 면역학적으로 구별되는 4T1 종양에 대해서는 굴복하였다.
CT26 일차 종양 다음으로의 재유발접종으로 인한 종양
CT26 4T1
항-CTLA4와 RT 0/17 17/17
항-OX40과 RT 0/13 13/13
RT 단독 0/3 3/3
CT26 종양이 치유된 종양-보유 마우스의 반대쪽 측복부 상에 CT26 및 4T1을 100일 후 재유발접종하였다. 결과로 초래된 종양 성장은, CT26이 치유된 모든 마우스가 CT26의 재유발접종에는 거부 반응을 나타냈지만 동계의 그러나 면역학적으로는 구별되는 4T1 종양에 대해서는 굴복하는 것으로 입증되었다. 이들 데이터는 방사선 치료법에 항-CTLA4의 추가가 모든 시점에서 생존을 개선하였지만, 방사선 이전에 전달되는 경우 특히 효과적이었음을 입증한다.
이전 보고는 4T1 유방 종양 모델에서 방사선에 항-CTLA4 투여가 뒤따르는 경우 개선된 종양 성장 제어를 입증하였다(Demaria et al., Clin Cancer Res, 2005. 11(2 Pt 1): 728-34; Dewan et al., Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 2009. 15(17): 5379-88). 상기 모델에서 시점의 효과가 유사했는지를 결정하기 위해, 방사선과 항-CTLA4 투여 시점을 4T1 종양 모델에서 반복하였다. BALB/c 마우스에 4T1 세포를 유발접종하고 14일, 15일 및 16일차에 전달된 20 Gy의 방사선과 함께 7일 또는 17일차에 항-CTLA4를 제공하고, 4T1 방사선 선량 및 시점은 이전 연구에 기반하였다(Crittenden et al., PLoS One, 2013. 8(7): e69527). 폐 전이에 부차적인 신체 상태 악화로 모든 군의 마우스를 안락시켰고 이에 따라 항-CTLA4 치료법의 생존 이점을 결정할 수 없었지만, 방사선 단독에 비해 방사선 이전 항-CTLA4를 투여받은 마우스에서 유의미하게 더 작은 일차 종양이 관찰되었다(p<0.05, 도 9, 패널 (i) 내지 (v)). 상기 모델에서 방사선 단독에 비해 방사선 후에 주어진 항-CTLA4로는 종양 크기의 개선이 검출되지 않았다(도 9, 패널 (iii) 및 (v)). 시점의 효과를 엄격히 시험하기 위해 이전에 시험된 것과 같은 반복된 투여가 아니라 항-CTLA4의 단회 투여로 연구가 제한되었지만(Demaria et al., Clin Cancer Res, 2005. 11(2 Pt 1): 728-34; Dewan et al., Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 2009. 15(17): 5379-88), 상기 방사선-이후 반응은 이전에 보고된 것보다 덜 효과적이었다(Demaria et al., Clin Cancer Res, 2005. 11(2 Pt 1): 728-34; Dewan et al., Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 2009. 15(17): 5379-88). 그러나, 생존이 보고되는 경우, 본 발명의 데이터와 일치하게, RT-이후 반복 투여를 포함해도, 항-CTLA4는 방사선 단독에 비해 4T1 종양을 보유하는 야생형 마우스에서 생존 장점을 제공하지 않는 것으로 나타났다(Pilones et al., Clin Cancer Res, 2009. 15(2): 597-606).
실시예 7: 방사선치료법 이후 OX40 면역치료법은 전반적 생존을 증가시켰다.
항-CTLA4 면역치료법의 시점이 항-CTLA4의 작용 기전에 고유하게 기반하는지를 결정하기 위해, 방사선을 이용한 항-OX40 면역치료법의 이상적 시점을 평가하였다. 항-OX40을 항원 노출 직후 T 세포 상에서 유도하고(Evans et al., J Immunol, 2001. 167(12): 6804-11), 방사선 치료법 이후 항-OX40의 전달은 3LL 폐 암종 모델에서 생존을 유의미하게 증가시킨다(Gough et al., J Immunother, 2010. 33(8): 798-809; Yokouchi et al., Cancer Sci, 2008. 99(2): 361-7). CT26 결장직장 종양을 BALB/c 마우스의 뒷다리에 확립하고 항-OX40 작용제 항체를 7일, 15일 또는 19일차에 전달하였다; 20 Gy 방사선은 14일차에 종양으로만 전달하였다. 방사선과 조합된 항-CTLA4 치료법으로 관찰된 것과 대조적으로, 항-OX40 항체를 이용한 사전치료는 방사선 단독에 비해 어떠한 치료적 이점도 제공하지 않았다(중앙값 생존 48일 대비 55일, p=0.23)(도 10). 많이 지연된 19일차 항-OX40 투여도 방사선 단독에 비해 이익을 제공하지 않았다(중앙값 생존 41일, p=0.6). 그러나, 방사선 1일 후 전달된 항-OX40은 약 50% 종양 제거를 일으켰다(116.5일, 방사선 단독 대비 p=0.0006)(도 10). 상기 시점은 항-OX40이 T 세포 상에서 OX40 상향조절과 일치하기 위해 항원 노출 후 12 내지 24시간의 중요 기간 동안 존재해야 함을 나타내는 선행 연구(Evans et al., J Immunol, 2001. 167(12): 6804-11), 및 방사선 치료법 대략 2일 후 종양 항원-제시의 증거(Zhang et al.,. The Journal of experimental medicine, 2007. 204(1): 49-55)와 일치하며, 방사선 치료법 5일 후는 상기 치료 윈도우를 벗어남을 제시한다. 중요하게는, 최적 시점에 의해 종양이 치유된 모든 마우스가 CT26 종양을 이용한 재유발접종에 내성이었으나, 동계이고 항원적으로 구별되는 종양에 대해서는 여전히 감수성이었으므로, 장기 항원-특이적 면역성이 달성됨을 시사하였다(표 1).
실시예 7: 방사선 이전 항- CTLA4의 개선된 방사선 효능은 부분적으로 T 조절 세포 소모에 기반한다 .
최근 연구는 항-CTLA4 항체가 종양에서 T 조절 세포의 Fc-의존적 소모를 유도함을 나타내며(Simpson et al., J Exp Med, 2013. 210(9): 1695-710), 방사선 치료법과 동시 또는 이후 T 조절 세포의 소모는 증강된 종양 제어를 일으키는 것으로 나타났다(Bos et al., J Exp Med, 2013. 210(11): 2435-66; Sharabi et al., Cancer Immunol Res, 2014). 방사선 이전 항-CTLA4의 개선된 방사선 효능이 T 조절 세포 소모에 의해 설명될 수 있는지를 결정하기 위해, CT26 종양을 BALB/c 마우스의 뒷다리에 확립하고, 7일차에 항-CD4로 치료하여 모든 CD4 T 세포를 소모시키거나 항-CD25로 치료하여 T 조절 세포를 소모시켰다. 마우스를 상기와 같이 14일차에 방사선 치료법으로 치료하였다. 항체 치료는 마우스에서 CD4+ 및 CD25+ 세포를 효율적으로 소모시켰다(도 11a). CD4 소모는 단독으로 또는 후속 방사선 치료법과 병행되어 종양 성장에 영향을 미치지 않았다(도 11b). CD25 소모는 종양 성장 단독에는 영향을 미치지 않았지만, 방사선 치료법이 뒤따르는 경우에는 마우스의 절반에서 종양 치유를 일으켰다(도 11c). 중요하게는, CD25 소모는 항-CTLA4 사전-치료를 이용한 선행 연구에서만큼 잘 수행되지 않았고(도 8a 및 8b 참고), T 조절 세포 소모를 포함할 전체 CD4 소모가 효과적이 아니었다. 특정 이론에 구애받지 않고, 이는 항-CTLA4가 T 조절 세포 소모에 부가하는 효과를 제공하며, 비-조절 CD4 세포가 CD25-소모된 동물에서 치유를 위해 중요함을 시사한다. 그러나, 증가된 비율의 항원-반응성 CD8+CD25+ 세포가 방사선 치료법 이후 종양에 재증식하며(Gough et al., J Immunother, 2010. 33(8): 798-809), 이들 세포도 항-CD25 치료에 의해 소모될 것임이 이전에 나타났다. 특정 이론에 구애받지 않고, 항-CTLA4 치료법은 기존 T 조절 세포의 제거 및 CD4 및 CD8 효과기 T 세포의 CTLA4-매개된 억제를 차단하는 통상적 효과 모두에 의해 이중 역할을 담당하여 방사선 치료법 이후 잔여 암 세포의 개선된 제거를 허용할 가능성이 있다.
상이한 항-CTLA4 클론은 조절 T 세포의 소모가 상이한 것으로 나타났으므로, 방사선 치료법과 병행된 상이한 클론: 고도 소모성인 9D9 클론 및 덜 소모성인 UC10 클론을 시험하였다(Simpson et al., J Exp Med, 2013. 210(9): 1695-710). 이전과 마찬가지로, CT26 종양을 면역적격 Balb/c 마우스의 뒷다리에 확립하고 7일차에 9D9 클론 또는 UC10 클론에 이어 14일차에 방사선을 투여하였다. 9D9 및 방사선으로 치료받은 마우스는 모두 이의 종양이 제거된 반면, UC10 클론으로 치료받은 마우스는 67%가 이의 종양이 제거되었다(도 12). 종합하면, 이들 데이터는 T 조절 세포 소모가 종양 제거를 증강시키지만, 항-CTLA 사전치료 및 방사선 간에 나타나는 상승작용에 전적으로 관여하지는 않음을 시사한다.
본 연구에서, 방사선과 조합된 항-CTLA4 차단 또는 항-OX40 작용제 치료법의 이상적 시점은 이들의 다양한 작용 기전에 따라 변한다. 방사선이 뒤따르는 항-CTLA4 차단을 이용한 종양 사전컨디셔닝은 뮤린 결장직장 종양의 제거를 일으키는 것으로 나타났다. 이들 결과는 이후 완화적 방사선을 투여받으며 장기 무질환 생존과 함께 전신 앱스코팔(abscopal) 반응을 가지는 이필리무맙 치료법을 받은 전이성 흑색종 환자로부터의 증례 보고와 일치한다(Postow et al., The New England journal of medicine, 2012. 366(10): 925-31; Hiniker et al., Translational Oncology, 2012. 5(6): 404-407). 또한, 완화적 방사선을 겪은, 이필루미맙을 투여받은 환자의 후향적 검토는 방사선이 이필루미맙 유도 대 이필루미맙 유지 동안 전달되는 경우 개선된 전반적 생존을 가져서, 사전컨디셔닝이 결과를 개선하였음이 추가로 입증되었다(Barker et al., Cancer Immunol Res, 2013. 1(2): 92-8). 뮤린 모델에서, 항-CTLA4를 이용한 동시적 및 RT-이후 치료는 종양 성장을 제어하는 것으로 나타났지만(Demaria et al., Clin Cancer Res, 2005. 11(2 Pt 1): 728-34; Dewan et al., Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 2009. 15(17): 5379-88), 항-CTLA4 및 RT와 조합되어 0%(Pilones et al, Clin Cancer Res, 2009. 15(2): 597-606)부터 20%(Belcaid et al, PLoS One, 2014. 9(7): e101764) 전반적 생존까지의 범위로, 전반적 생존에 제한된 영향을 가지는 것으로 나타났다. 항-CTLA4의 작용 기전은 종양에서 T 조절 세포를 소모시키는 그 능력과 연관되었으며(Simpson, T.R., F. Li, W. Montalvo-Ortiz, M.A. Sepulveda, K. Bergerhoff, F. Arce, C. Roddie, J.Y. Henry, H. Yagita, J.D. Wolchok, K.S. Peggs, J.V. Ravetch, J.P. Allison, and S.A. Quezada, Fc-dependent depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells co-defines the efficacy of anti-CTLA-4 therapy against melanoma. J Exp Med, 2013. 210(9): 1695-710), 동시적 또는 RT-이후의 T 조절 세포의 소모는 방사선 치료법에 의한 종양 제어를 개선하는 것으로 나타났다(Bos et al., J Exp Med, 2013. 210(11): 2435-66; Sharabi et al., Cancer Immunol Res, 2014). 본원에 기재된 결과는 방사선에 뒤따르는 항-CTLA4 차단이 방사선 효능을 개선하였지만, 사전치료와 동일한 정도는 아니었으며, T 조절 세포의 사전치료 소모도 방사선에 대한 반응을 개선할 수 있었음을 나타낸다. 이들 결과는 이필리무맙 및 방사선을 조합하는 대부분의 진행 중인 임상 시험이 이필리무맙을 동시에 및/또는 방사선 이후 전달한다는 점에서 중요하며, 이는 개선된 결과를 일으킬 수 있지만, 상승작용을 위한 잠재성을 완전히 최대화하지 않을 수 있다.
여러 화학치료제가 고유 기전을 통해 작용하는 것과 같이, 면역치료제는 상이한 작용 기전을 갖는다. 상이한 클래스의 면역치료제가 상이한 이상적 시점을 일으킬 수 있는지를 조사하였다. T 세포 공동-자극제로서 작용하는 항-OX40 작용제 항체는 방사선 직후 전달되는 경우, 방사선 효능을 개선하는 것으로 나타났다. 조합 치료법의 개선된 효능은 저분할된 방사선 이후의 항원 제시 윈도우와 일치한다(Zhang et al., The Journal of experimental medicine, 2007. 204(1): 49-55). OX40 분자는 T 세포 상에서 신속히 항원 관여 후 제한된 시간 동안 상향조절되며, 작용제 항체는 효과적인 T 세포 자극을 위해 그 윈도우 동안 존재해야 한다(Evans et al., J Immunol, 2001. 167(12): 6804-11). OX40이 T 조절 세포 상에서 발현되는 동안, 종양-보유 마우스에 대한 항-OX40의 투여는 종양 T 조절 세포의 소모를 일으키지 않는다(Gough et al., Cancer Res, 2008. 68(13): 5206-15). 항-OX40 항체는 최근에 I상 임상 시험에서 전망을 나타내었고(Curti et al., Cancer Res, 2013. 73(24): 7189-98), 현재 최적 시점을 이용하는 방사선과 조합되어 I상 시험에서 평가되고 있다.
결론적으로, 방사선과 조합된 면역치료법의 시점이 결과에 영향을 미치는 것이 발견되었다. 특정한 면역치료제의 이상적 시점은 이의 작용 기전과 일치하며, 기전에 관한 전임상 데이터가 제제를 조합하고 임상에 반영할 때 고려되어야 한다.
상기 본원에 기재된 결과는 하기 재료 및 방법을 이용해서 수행하였다.
동물 및 세포주
Panc02 뮤린 췌장 선암종 세포주(Priebe et al., 1992, Cancer Chemother Pharmacol; 29:485-9. C57BL/6)는 Dr. Woo(Mount Sinai School of Medicine, NY)로부터 친절하게 제공받았다. 6 내지 8주령 C57BL/6 마우스는 본 실험에서 이용하기 위해 Charles River Laboratories(Wilmington, MA)에서 입수하였다. 모든 동물 프로토콜은 EACRI IACUC(Animal Welfare Assurance No. A3913-01)에 의해 승인받았다.
CT26 뮤린 결장직장 암종(Brattain et al., Cancer Res, 1980. 40(7): 2142-6) 및 4T1 유방암종 세포주(Aslakson. and Miller, Cancer Research, 1992. 52(6): 1399-405)는 ATCC(Manassas, VA)에서 입수하였다. 세포를 HEPES, 비-필수 아미노산, 나트륨 피루베이트, 글루타민, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보강된 RPMI-1640 배지 중에 성장시켰다. 모든 세포주는 미코플라즈마에 대해 음성으로 평가되었다. BALB/c는 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)에서 입수하였다. 모든 동물 프로토콜은 Earle A. Chiles Research Institute IACUC(Animal Welfare Assurance No. A3913-01)에 의해 승인받았다.
면역화학치료법
10 내지 14일령 종양을 보유하는 마우스를 항-OX40(0X86, 250 ㎍ 복강내, BioXcell, West Lebanon, NH), 항-CTLA4(9D9, 250 ㎍ 복강내, BioXcell) 또는 조합으로 치료하였다. 화학치료법은 2주 또는 3주 동안 주 2회 복강내 100 mg/kg 젬시타빈(Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN)으로 구성되었다. 항-인터류킨-4(항-IL-4, 11B11, 100 ㎍ 복강내, BioXcell)는 3주 동안 주 2회 복강내 전달하였다.
항체 및 시약
형광-접합된 항체 CD11b-AF700, Grl-PE-Cy7, IA(주조직적합복합체(MHC) 클래스 II)-e780, Ly6G-PE-Cy7, Ly6C-PerCP-Cy5.5, CD4-e450, CD4-PerCP Cy5.5, FoxP3-e450, CD25-APC 및 CD8-FITC는 eBioscience(San Diego, CA)에서 입수하였다. CD4-v500 및 Ly6G-FITC는 BD Biosciences(San Jose, CA)에서 입수하였다. CD8-PE-TxRD는 Invitrogen(Carlsbad, CA)에서 입수하였다. 래트 항-F4/80은 AbD Serotec(Raleigh, NC)에서 입수하였다. 이용된 웨스턴 블로팅 항체에는 아르기나제 I(BD Biosciences), GAPdH, 항-마우스-홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 및 항-토끼-HRP(모두 Cell Signaling Technology, Danvers, MA)가 포함되었다.
형광 접합된 항체 CD4-e450, CD25-APC, CD4-PerCP는 eBioscience(San Diego, CA)에서 입수하였다. CD8-PE-TxRD는 Invitrogen(Carlsbad, CA)에서 입수하였다. 치료용 항-CTLA4(클론 9D9 또는 UC10), 항-OX40(클론 OX86), 항-CD4(클론 GK1.5) 및 항-CD25(클론 PC.61.5.3) 항체는 BioXcell(Branford, CT)에서 입수하였고, 멸균 PBS 중에 1 mg/mL 농도까지 재현탁하였다.
생체내 방사선 치료법 모델
1x104 CT26 또는 5x104 4T1 세포를 100 ㎕ PBS 중에 면역적격 BALB/c 마우스의 오른쪽 뒷다리에 피하 주사하였다. 항체를 250 ㎍(항-OX40 및 항-CTLA4) 또는 100 ㎍(항-CD4 및 항-CD25)으로 복강내 투여하였다. 항체 치료법을 각각의 절차에 나타낸 지정 시점에 시행하였다. 방사선은 중추 기관을 보호하기 위해 절반-빔 블록으로 종양에 대한 선량을 증가시키기 위해 1.0 cm 볼루스로 임상 선형 가속장치(6 MV 광자, Elekta Synergy 선형 가속장치, Atlanta, GA)를 이용하여 전달하였다. CT26 종양에 있어서, 20 Gy x 1을 14일차에 전달하였다(Young et al., Cancer Immunol Res, 2014); 4T1 종양에 있어서, 20 Gy x 3을 14일 내지 16일차에 전달하였다(Crittenden et al., PLoS One, 2013. 8(7): e69527). CT26 종양이 치유된 마우스에 있어서, 마우스의 반대쪽 측복부에 5x104 4T1 및 1x104 CT26 종양을 재유발접종하여 종양-특이적 면역성을 평가하였다.
면역조직학
면역조직학을 위해, 종양을 Z7 아연계 고정제 중에 하룻밤 고정하였다(Lykidis et al., 2007, Nucleic Acids research; 35:e85). 이어서 조직을 등급별 알코올을 거쳐 자일렌까지 탈수치료하고, 용융 파라핀 중에 인큐베이션한 뒤 파라핀에 포매하였다. 섹션(5 ㎛)을 절단하고 분석을 위해 실장하였다. 항원 회수를 위해 조직 섹션을 적절한 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 완충액 중에 끓였다. 일차 항체 결합을 AlexaFluor 488 접합 이차 항체(미국 오리건주 유진 소재의 Molecular Probes)로 가시화하고 DAPI(Invitrogen)와 함께 실장하여 핵 물질을 염색하였다. 이미지는 Nikon TE2000S 에피형광(epifluorescence) 현미경, Nikon DsFi1 디지털 카메라 및 Nikon NIS-성분 조영 소프트웨어를 이용하여 획득하였다. 종양에 걸쳐 여러 이미지를 고해상으로 찍고 디지털 병합하여 종양의 하나의 경계부터 경계까지의 개관을 만들었다. 원고에 디스플레이된 이미지가 전체 종양 및 이들 각각의 실험 코호트를 대표한다.
종양 대식구의 웨스턴 블로팅
종양 세포 현탁액을 이전에 기재된 바와 같이 CD11b, IA(주조직적합복합체(MHC) 클래스 II) 및 Grl에 특이적인 항체로 염색하고(Gough et al., 2008, Cancer Res; 68:5206-15; Crittenden et al., 2012, PloS one; 7:e39295), CD11b+GrlloIA+ 종양 대식구를 98% 순도 초과까지 BD 형광 활성화 세포 정렬(FACS) Aria 세포 정렬장치를 이용해서 정렬하였다. 세포를 방사선면역침강 검정(RIPA) 완충액 중에 용해시키고 β2-머캅토에탄올을 함유하는 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 로딩 완충액 중에 변성시키고, 10% SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동하고, 니트로셀룰로스로 옮겼다. 차단된 블롯을 일차 항체에 이어 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합 이차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 탐침 치료하였다. Pierce SuperSignal Pico 화학발광 기질(미국 일리노이주 록퍼드 소재의 Thermo Fisher Scientific)을 이용해서 결합을 검출하고 필름에 노출시켰다.
종양, 혈액 및 림프절의 유세포 측정
종양-침윤 세포의 분석을 위해, 종양을 대략 2 mm 단편으로 절제한 뒤, 실온에서 1시간 동안 PBS 중 1 mg/mL 콜라게나제(Invitrogen), 100 ㎍/mL 히알루로니다제(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma) 및 20 mg/mL DNase(Sigma) 중에 아지테이션(agitation)시켰다. 분해물을 100 ㎛ 나일론 메쉬를 통해 여과하여 거시적 파편을 제거하였다. 침윤 세포의 유세포 측정 분석을 위해, 세포 현탁액을 세척하고 직접 접합된 형광 항체로 염색하였다. 림프절의 분석을 위해, 림프절을 분쇄하고, 세척하고, 표면 염색한 뒤, 세포를 세척하고 T 조절 세포 염색 키트(EBioscience)를 이용해서 고정하고, 전사 인자에 대해 염색하였다. 사이토카인 반응을 측정하기 위해, 림프절 세포를 Golgiplug(BD biosciences)의 존재 하에 4시간 동안 1 ㎍/ml 항-CD3으로 사전-코팅된 웰에 접종하였다. 이어서 세포를 표면 염색하고, 세척하고, 세포내 사이토카인 염색 전에 T 조절 세포 염색 키트(EBioscience)를 이용해서 고정하였다. 혈액 중 세포수의 분석을 위해, 복재 정맥을 통해 살아있는 마우스로부터의 전혈을 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 튜브 내로 수확하고, 5 내지 25 ㎕의 신선 혈액을 형광 항체 칵테일로 직접 염색하였다(Crittenden et al., PLoS One, 2013. 8(7): e69527 참고). 공지된 수의 AccuCheck 형광 비드(Invitrogen)를 각각의 샘플로 첨가한 뒤, 적혈구를 Cal-Lyse 전혈 용해 용액(Invitrogen)으로 용해시키고, 샘플을 BD LSRII 유세포 측정장치 상에서 분석하였다. 세포 이벤트와 비드 이벤트의 비교에 기반하여 샘플 중 세포의 절대수(세포/㎕)를 결정하였다.
통계
데이터를 분석하고 Prism(미국 캘리포니아주 라호야 소재의 GraphPad Software)을 이용하여 그래프화하였다. 개별 데이터 세트를 Student T-평가를 이용해서 비교하였다. Tukey 비교를 이용해서 개별 군을 평가하며 다수의 군에 걸친 분석을 ANOVA를 이용하여 수행하였다. Kaplan Meier 생존 곡선을 log-순위 평가를 이용해서 비교하였다.
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Figure pct00030
다른 구현예
상기 기재로부터, 변이 및 변형이 이를 다양한 용도 및 조건에 채택하기 위해 본원에 기재된 발명에 수행될 수 있음이 자명할 것이다. 이러한 구현예도 하기 청구범위의 범위 내에 있다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 요소 목록의 인용에는 기재된 요소의 임의의 단일 요소 또는 조합(또는 하위조합)으로서의 그 변수의 정의가 포함된다. 본원에서 구현예의 인용에는 임의의 단일 구현예로서 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 일부와 조합되는 그 구현예가 포함된다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 문헌은 각각의 독립적 특허 및 문헌이 참조로 도입되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> PROVIDENCE HEALTH & SERVICES-OREGON <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING THE EFFICACY OF CANCER THERAPY <130> OX40-301WO1 <140> <141> <150> 62/131,562 <151> 2015-03-11 <160> 108 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asp Leu Asp Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Arg Ala Ser 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln 1 5 10 15 Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu Gln 1 5 10 15 Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 20 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln 1 5 10 15 Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 21 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln 1 5 10 15 Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 34 caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggcagcac 120 cccggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat caccatcaac cccgacacca gcaagaacca gttctccctg 240 cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tct 363 <210> 35 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 38 caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120 cccggcaagg gcctggaata catgggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240 cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tct 363 <210> 39 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 39 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr 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acggcatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gttctccctg 240 cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact tctgcgcccg gtacagatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tct 363 <210> 43 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 44 caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgtgccg tgtacggcga cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120 cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240 cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tct 363 <210> 45 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Asp Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 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caccgtgtcc 360 tct 363 <210> 49 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 50 caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120 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363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120 cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240 cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tct 363 <210> 53 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn 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tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120 cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240 cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacagatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tct 363 <210> 59 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 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63 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 64 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 64 caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120 cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca gcggcatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240 cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tct 363 <210> 65 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Phe Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 66 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 66 gaggtgcagc tgcaggaaag cggccccagc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgcagcg tgaccggcga cagcttcacc agcggctact ggaactggat ccggaagttc 120 cccggcaacc ggctcgagta catgggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat cagcatcacc cgggacacca gcaagaacca ctactacctg 240 cagctgaaca gcgtgaccac cgaggacacc gccacctact tttgcgcccg gtacagatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tct 363 <210> 67 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Lys Tyr Asp 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cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtctacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagct taagcctgtc tccgggtaaa 990 <210> 71 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu 65 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acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120 cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240 cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tctgcgtcga ccaagggccc atccgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcctggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctaca ccctgccccc atcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcttaagcct gtctccgggt aaa 1353 <210> 73 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys 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60 acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120 cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240 cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tctgcgtcga ccaagggccc atccgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcctggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga attcgagggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cctccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctaca ccctgccccc atcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 77 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Ala Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys 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60 acctgtgccg tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120 cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acgccatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240 cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tctgcgtcga ccaagggccc atccgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcctggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga attcgagggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cctccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctaca ccctgccccc atcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 81 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys 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tgtacggcgg cagcttcagc agcggctact ggaactggat ccggaagcac 120 cccggcaagg gcctggaata catcggctac atcagctaca acggcatcac ctaccacaac 180 cccagcctga agtcccggat caccatcaac cgggacacca gcaagaacca gtactccctg 240 cagctgaaca gcgtgacccc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtacaaatac 300 gactacgacg gcggccacgc catggactac tggggccagg gcaccctggt caccgtgtcc 360 tctgcgaaga cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 420 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 480 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 540 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 600 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 660 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt accgtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 720 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 780 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 840 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 900 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 960 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1020 ccgaaggctc cacaggtgta taccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1080 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1140 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1200 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1260 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1320 cactctcctg gtaaa 1335 <210> 83 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 83 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 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gcagcggctc cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ggctccgccc tgccctggac ctttggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa gcgggctgat gcggcgccaa ctgtatccat cttcccacca 360 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt 642 <210> 85 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 85 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Asn Leu His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Met Arg Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys 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Ala Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln 85 90 95 Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala 115 120 125 Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met 130 135 140 Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150 <210> 95 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Ala Pro Leu Ala Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Leu Leu Gly Gly Gly Ser Ile 225 230 235 240 Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His 245 250 255 Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg Gly 260 265 270 His Gly Gly Gly Ser Asn Ser Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Phe 275 280 285 Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe 290 295 300 Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn 305 310 315 320 Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly 325 330 335 Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu 340 345 350 Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met 355 360 365 Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr 370 375 380 Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile 385 390 395 400 Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu 405 410 <210> 96 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg 1 5 10 15 Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln 20 25 30 Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser 35 40 45 Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val 50 55 60 Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln 65 70 75 80 Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn 85 90 95 Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu 100 105 110 Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln 115 120 125 Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr 130 135 140 Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu 145 150 155 160 Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn 165 170 175 Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu 180 <210> 97 <211> 1206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 97 gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggacct 60 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 120 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt taattggtac 180 gtggacggcg tggaagtgca taacgccaag accaagccca gagaggagca gttcaacagc 240 acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300 tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg cctagcagca tcgagaagac catcagcaag 360 gccaagggcc agccacggga gccccaggtc tacaccctgc cacctagcca agaggagatg 420 accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaaaggct tctatcccag cgatatcgcc 480 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540 gacagcgacg gcagcttctt cctgtactcc agactgaccg tggacaagtc cagatggcag 600 gagggcaacg tcttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660 aagtccctga gcctgagcct gggcaaggac caggataaga tcgaggctct gtcctccaag 720 gtgcagcagc tggaacggtc catcggcctg aaggacctgg ccatggctga cctggaacag 780 aaagtgctgg aaatggaagc ctccacacag gtgtcacaca gatacccccg gatccagtcc 840 attaaggtgc agttcaccga gtacaagaaa gagaagggct ttatcctgac ctcccagaaa 900 gaggacgaga tcatgaaggt gcagaacaac tccgtgatca tcaactgcga cgggttctac 960 ctgatctccc tgaagggcta cttcagccag gaagtgaaca tctccctgca ctaccagaag 1020 gacgaggaac ccctgttcca gctgaagaaa gtgcggagcg tgaactccct gatggtggcc 1080 tctctgacct acaaggacaa ggtgtacctg aacgtgacca ccgacaacac ctccctggac 1140 gacttccacg tgaacggcgg cgagctgatc ctgatccacc agaaccctgg cgagttctgc 1200 gtgctg 1206 <210> 98 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 98 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys Asp Gln Asp Lys Ile Glu Ala Leu Ser Ser Lys 225 230 235 240 Val Gln Gln Leu Glu Arg Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Ala Met Ala 245 250 255 Asp Leu Glu Gln Lys Val Leu Glu Met Glu Ala Ser Thr Gln Val Ser 260 265 270 His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr 275 280 285 Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile 290 295 300 Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr 305 310 315 320 Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu 325 330 335 His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg 340 345 350 Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val 355 360 365 Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val 370 375 380 Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys 385 390 395 400 Val Leu <210> 99 <211> 1206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 99 gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggacct 60 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 120 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt taattggtac 180 gtggacggcg tggaagtgca taacgccaag accaagccca gagaggagca gttcaacagc 240 acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300 tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg cctagcagca tcgagaagac catcagcaag 360 gccaagggcc agccacggga gccccaggtc tacaccctgc cacctagcca agaggagatg 420 accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaaaggct tctatcccag cgatatcgcc 480 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540 gacagcgacg gcagcttctt cctgtactcc agactgaccg tggacaagtc cagatggcag 600 gagggcaacg tcttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660 aagtccctga gcctgagcct gggcaaggac caggataaga tcgaggctct gtcctccaag 720 gtgcagcagc tggaacggtc catcggcctg aaggacctgg ccatggctga cctggaacag 780 aaagtgctgg aaatggaagc ctccacacag gtgtcacaca gatacccccg gatccagtcc 840 attaaggtgc agttcaccga gtacaagaaa gagaagggct ttatcctgac ctcccagaaa 900 gaggacgaga tcatgaaggt gcagaacaac tccgtgatca tcaactgcga cgggttctac 960 ctgatctccc tgaagggcta cttcagccag gaagtgaaca tctccctgca ctaccagaag 1020 gacgaggaac ccctgttcca gctgaagaaa gtgcggagcg tgaactccct gatggtggcc 1080 tctctgacct acaaggacaa ggtgtacctg aacgtgacca ccgacaacac ctccctggac 1140 gacttccacg tgaacggcgg cgagctgatc ctgatccacc agaaccctgg cgaggcctgc 1200 gtgctg 1206 <210> 100 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 100 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys Asp Gln Asp Lys Ile Glu Ala Leu Ser Ser Lys 225 230 235 240 Val Gln Gln Leu Glu Arg Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Ala Met Ala 245 250 255 Asp Leu Glu Gln Lys Val Leu Glu Met Glu Ala Ser Thr Gln Val Ser 260 265 270 His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr 275 280 285 Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile 290 295 300 Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr 305 310 315 320 Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu 325 330 335 His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg 340 345 350 Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val 355 360 365 Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val 370 375 380 Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Ala Cys 385 390 395 400 Val Leu <210> 101 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 101 Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 20 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn 35 40 45 Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu 85 90 95 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 <210> 102 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 102 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys 20 25 30 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 85 90 95 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 100 105 110 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 115 120 125 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5 10 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 <210> 105 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 106 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 108 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5

Claims (39)

  1. 종양을 갖는 대상체에서 화학치료법 또는 방사선치료법 효능의 증강 방법으로서, 화학치료법 또는 방사선치료법 전에, 동안 또는 후에 OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 종양을 갖는 대상체의 치료 방법으로서,
    (a) OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계;
    (b) 대상체에서 대식구 분화 감소를 나타내는 세포 측정치를 수득하는 단계; 및
    (c) 화학치료법 또는 방사선치료법을 대상체에 시행하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 종양을 갖는 대상체의 치료 방법으로서,
    (a) OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계;
    (b) 대상체에서 대식구 분화 감소를 나타내는 세포 측정치를 수득하는 단계; 및
    (c) 항-IL4 항체 및 화학치료법 또는 방사선치료법을 대상체에 시행하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 종양을 갖는 대상체의 치료 방법으로서,
    (a) OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계;
    (b) 대상체에서 대식구 분화 감소를 나타내는 세포 측정치를 수득하는 단계;
    (c) 화학치료법을 대상체에 시행하는 단계;
    (d) OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계; 및
    (e) 화학치료법 또는 방사선치료법을 대상체에 시행하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단계 (b) 및 단계 (d)가 항-IL-4 항체의 공동-투여를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 화학내성 또는 방사선치료법 내성 종양을 갖는 것으로 확인되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 종양 성장을 지연시키거나 감소시키고/시키거나, 종양 크기를 감소시키고/시키거나 생존을 증강시키는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 화학내성 또는 방사선치료법 내성인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 비-면역원성이거나 면역원성이 약한 방법.
  10. 제9항에 있어서, 종양이 CD8 T 세포의 약한 침윤을 갖는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 췌장암 또는 췌장 선암종을 갖는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 췌장암 또는 췌장 선암종인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료법이 젬시타빈의 투여를 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, OX40 작용제가 항-OX40 항체인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항-OX40 항체가 OX86, 인간화 항-OX40 항체 및 9B12 중 하나 이상인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, OX40 작용제가 OX40 융합 단백질인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CTLA4 항체가 9D9 및 트레멜리무맙 중 하나 이상인 방법.
  18. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포 분화가 종양 환경에서 감소되는 경우 상기 치료법이 시행되는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 면역 세포가 대식구 또는 T 세포 중 하나 이상인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 대식구 분화 감소가 대식구에서 아르기나제 발현 감소에 의해 결정되는 방법.
  21. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료법 또는 방사선치료법이 OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일 후에 시행되는 방법.
  22. 제3항 또는 제5항에 있어서, 항-IL4 항체가 종양 환경에서 CD4 T 세포 분화를 감소시키는 방법.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, OX40 작용제, 항-CTLA4 항체 및 상기 치료법을 대상체에 2회 이상 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 화학치료법 전에 OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 방사선치료법 전에 OX40 작용제 및 항-CTLA4 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 결장직장암을 갖는 방법.
  27. 결장직장암을 갖는 대상체에서 화학치료법 또는 방사선치료법의 효능 증강 방법으로서, 화학치료법 또는 방사선치료법 전에, 동안 또는 후에 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 결장직장암을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 항-CTLA4 항체를 대상체에 투여하는 단계; 및
    (b) 방사선치료법을 대상체에 시행하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 항-CTLA4 항체가 9D9 및 트레멜리무맙 중 하나 이상인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료법 또는 방사선치료법이 항-CTLA4 항체의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 후 시행되는 방법.
  31. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료법 또는 방사선치료법이 항-CTLA4 항체의 투여 1일, 2일, 3일 또는 4일 전에 시행되는 방법.
  32. 결장직장암을 갖는 대상체에서 화학치료법 또는 방사선치료법 효능의 증강 방법으로서, 화학치료법 또는 방사선치료법 전에, 동안 또는 후에 OX40 작용제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 결장직장암을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 방사선치료법을 대상체에 시행하는 단계; 및
    (b) OX40 작용제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, OX40 작용제가 항-OX40 항체인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 항-OX40 항체가 OX86, 인간화 항-OX40 항체 및 9B12 중 하나 이상인 방법.
  36. 제32항 또는 제33항에 있어서, OX40 작용제가 Ox40 융합 단백질인 방법.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, OX40 작용제가 화학치료법 또는 방사선치료법의 시행 1일 또는 2일 후 투여되는 방법.
  38. 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 결장직장 종양을 갖는 방법.
  39. 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 대상체에서 종양 성장을 지연시키거나 감소시키고/시키거나, 종양 크기를 감소시키고/시키거나 생존을 증강시키는 방법.
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