KR101733255B1 - 증식성 질환의 상승작용적 치료를 위한 항­ｃｔｌａ４ 항체와 다양한 치료 요법의 조합 - Google Patents

Abstract

본원은 증식성 장애의 치료 및 예방에 유용한 조성물 및 방법을 개시한다. 이같은 조성물은 그 중에서도 항-CTLA-4 작용제, 예를 들어 이필리무맙 또는 트레멜리무맙을 다른 화학요법제, 예컨대 다사티닙, 이마티닙, 파클리탁셀, 겜시타빈, 시스플라틴 또는 에토포시드와 함께 포함한다.

Description

증식성 질환의 상승작용적 치료를 위한 항­ＣＴＬＡ４ 항체와 다양한 치료 요법의 조합 {COMBINATION OF ANTI-CTLA4 ANTIBODY WITH DIVERSE THERAPEUTIC REGIMENS FOR THE SYNERGISTIC TREATMENT OF PROLIFERATIVE DISEASES}

본 출원은 2009년 7월 30일자로 출원된 정규 출원 미국 일련 번호 12/462168; 2009년 7월 30일자로 출원된 PCT 국제 일련 번호 PCT/US2009/052209; 2008년 8월 1일자로 출원된 가출원 미국 일련 번호 61/085,466; 및 2009년 7월 20일자로 출원된 가출원 미국 일련 번호 61/226,910에 대해 35 U.S.C. 119(e) 하에서 우선권을 주장하는 일부 계속 출원이다. 상기 인용된 출원의 전체 교시내용은 본원에 참고로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 종양학 분야 및 개선된 치료 요법에 관한 것이다.

미국 국립 암 연구소는 미국에서만 3명 중 1명이 일생 동안 암에 걸리는 것으로 추정하고 있다. 더욱이, 암에 걸린 사람들의 대략 50％ 내지 60％는 결국 질환으로 사망할 것이다. 이 질환의 광범위한 발생은 악성종양의 치료를 위한 개선된 항암 요법에 대한 필요성을 강조한다.

현재 관찰되는 광범위하게 다양한 암으로 인해, 체내의 암을 파괴하기 위한 수많은 항암제가 개발되어 왔다. 이들 화합물은 정상적인 건강한 세포를 영향받지 않은 상태로 두면서 악성 세포를 파괴시키거나 또는 다르게는 악성 세포의 성장을 억제시킬 목적으로 암 환자에게 투여된다. 항암제는 작용 메카니즘을 기준으로 하여 분류되어 왔다.

한 유형의 화학요법제는 금속 배위 착물이라고 지칭된다. 이 유형의 화학요법제는 주로 세포의 핵에서 가닥간 DNA 가교결합을 형성하며, 이에 의해 세포 복제를 방지하는 것으로 믿어진다. 결과로서, 종양 성장이 초기에 억압되며 이어서 역전된다. 다른 유형의 화학요법제는 알킬화제라고 지칭된다. 이들 화합물은 외래 조성물 또는 분자를 분열하는 암 세포의 DNA에 삽입시킴으로써 기능한다. 이들 외래 모이어티의 결과로서, 암 세포의 정상적인 기능이 붕괴되고 증식이 방지된다. 다른 유형의 화학요법제는 항신생물제이다. 이 유형의 화학요법제는 암 세포의 성장 및 산포를 방지하거나, 사멸시키거나 차단한다. 또 다른 유형의 항암제는 비스테로이드계 아로마타제 억제제, 이관능성 알킬화제 등을 포함한다.

화학요법제 및 면역요법제의 조합인 화학면역요법은, 종양 세포를 직접 공격하여 종양 세포 괴사 또는 아폽토시스를 야기하는 작용제, 및 종양에 대한 숙주 면역 반응을 조정하는 작용제의 효과를 조합한, 암 치료를 위한 신규 접근법이다. 화학요법제는 "다가" 종양 세포 백신을 생성하는 항원 제시 세포에 의해 제시되는 종양 항원을 생성시키고, 종양 구조를 파괴시켜, 따라서 면역요법제의 침투 뿐만 아니라 증식되는 면역 집단을 촉진시켜 면역요법의 효과를 향상시킬 수 있다.

이필리무맙은 항원 제시 세포 상에 발현된 CD80 및 CD86에 CTLA-4가 결합하는 것을 차단함으로써 이들 분자의 상호작용에 의해 발휘되는 면역 반응의 음성 하향조절을 차단하는 인간 항-인간 CTLA-4 항체이다. 이필리무맙은 마우스 CTLA-4를 인식하지 않기 때문에, 화학요법제와 CTLA-4 차단제의 효과를 연구하기 위해 본원에 제공된 연구에서 항-마우스 CTLA-4 항체 (클론 UC10-4F10)가 사용되었다.

다사티닙 (스프리셀(SPRYCEL)®)은 많은 유형의 암의 치료에 통상적으로 사용되며, CTLA-4 차단제와 조합하기 위한 매력적인 부류의 작용제를 대표한다.

미세소관 안정화제, 예컨대 익사베필론 (익셈프라(IXEMPRA)™) 및 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®)은 많은 유형의 암의 치료에서 통상적으로 사용되고, CTLA-4 차단제와 조합하기 위한 매력적인 부류의 작용제를 대표한다.

뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈도 또한 많은 유형의 암의 치료에 흔히 사용된다. 겜시타빈은 단지 그의 디- 및 트리-포스페이트 형태만이 세포독성 활성을 소유하기 때문에 데옥시시티딘 키나제에 의해 세포내 인산화된 후 활성을 갖게 되는 항대사물 뉴클레오시드 유사체 (2',2'-디플루오로데옥시시티딘)이다. 특히, 트리포스페이트 형태는 불활성 염기로서 DNA에 혼입되는데 데옥시시티딘 트리포스페이트와 경쟁하며, 디포스페이트 형태는 정상 DNA 합성에 본질적인 효소인 리보뉴클레오티드 리덕타제를 억제한다.

겜시타빈은 다양한 악성종양에서 단일 작용제로서, 그리고 다른 세포독성 약물과의 조합물로서 연구되었다. 게다가, 이는 많은 나라에서 췌장 암종, 난소 암종, 비소세포 폐 암종, 방광 암종 및 유방 암종을 비롯한 인간의 다양한 신생물을 치료하기 위해 승인을 받았다. 이들 종양에서의 이의 치료 용도는 또한 바람직한 독성 프로파일에 의해 지지된다.

암 세포를 억제하는 또 다른 통상의 메카니즘은 이중 가닥 DNA 파괴를 유도하는 것이다. 이같은 DNA 파괴는 특히 암 세포와 같은 분열 세포를 신속하게 사멸시킨다. 에토포시드는 절단된 DNA 분자의 토포이소머라제 II (topoII) 재결찰을 방해함으로써 세포성 DNA의 가닥 파괴를 유도하는 암 약물이다. 토포이소머라제 II에 의한 DNA 절단이 항상 토포이소머라제 II-연결된 DNA 이중 가닥 파괴 (DSB)를 야기하지만, 2개의 가닥의 재결찰이 에토포시드에 의해 독립적으로 방해받기 때문에, 에토포시드의 작용 역시 단일-가닥 파괴 (SSB)를 야기한다.

본원에서 기재하는 연구에서는, 다사티닙, 파클리탁셀, 에토포시드, 및 겜시타빈을 개별적으로 CTLA-4 억제제와 함께 조합한 것을 각 작용제에 대해 다른 민감도를 갖는 여러 종양 모델에서 연구하였다.

본 발명자들은 증식성 질환의 치료에 있어서, 단백질 티로신 키나제 억제제, 예컨대 다사티닙을 항-CTLA-4 억제제와 조합한 것의 상승작용 이익을 처음으로 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 증식성 질환의 치료에 있어서, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀을 항-CTLA-4 억제제와 조합한 것의 상승작용 이익을 처음으로 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 증식성 질환의 치료에 있어서, 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈을 항-CTLA-4 억제제와 조합한 것의 상승작용 이익을 처음으로 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 증식성 질환의 치료에 있어서, DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드를 항-CTLA-4 억제제와 조합한 것의 상승작용 이익을 처음으로 발견하였다. 본 발명의 목적은 효과적인 조합 화학요법적 치료 요법을 제공하는 것으로, 증식성 질환의 치료를 위해 1종 이상의 단백질 티로신 키나제 억제제, 미세소관 안정화제, 뉴클레오시드 유사체, 또는 DNA 이중 가닥 유도제를 1종 이상의 항-CTLA4 작용제와 조합한다.

발명의 개요

본 발명은 암을 비롯한 항증식성 질환의 치료를 필요로 하는 포유동물 종에게 상승작용적 치료 유효량의 (1) 단백질 티로신 키나제 억제제, 예컨대 다사티닙, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드로 이루어진 군의 구성원; 및 (2) 공동 자극 경로 조절제, 예컨대 항-CTLA4 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 비롯한 항증식성 질환의 치료를 위한 상승작용적 방법을 제공한다.

한 측면에서, 증식성 질환은 폐암, 췌장암, 결장암, 전립선암, 및/또는 CML 또는 백혈병과 같은 하나 이상의 암성 고형 종양이다. 또 다른 측면에서, 증식성 질환은 하나 이상의 불응성 종양이다. 또 다른 측면에서, CTLA-4 항체는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙이다. 또 다른 측면에서, 단백질 티로신 키나제 억제제는 스프리셀®, 글리벡(GLEEVEC)®, 또는 닐로티닙이다. 또 다른 측면에서, 미세소관 안정화제는 파클리탁셀, 탁솔®, 에포틸론 A, 에포틸론 B, 에포틸론 C, 에포틸론 D, 또는 익사베필론이다. 또 다른 측면에서, 뉴클레오시드 유사체는 겜시타빈이다. 또 다른 측면에서, DNA 이중 가닥 유도제는 에토포시드, 칼리케아미신, 블레오마이신, 네오카르지노스타틴, 술포라판, 또는 이다루비신이다. 또 다른 측면에서, 뉴클레오시드 유사체는 겜시타빈, BCH-4556, 클로파라빈, 플루다라빈, 클라드리빈, 시타라빈, 퓨로마이신, 및 플루오로우라실이다.

본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 항-CTLA4 길항제에는, 비제한적으로 항-CTLA4 항체, 인간 항-CTLA4 항체, 마우스 항-CTLA4 항체, 포유동물 항-CTLA4 항체, 인간화 항-CTLA4 항체, 모노클로날 항-CTLA4 항체, 폴리클로날 항-CTLA4 항체, 키메라 항-CTLA4 항체, MDX-010 (이필리무맙), 트레멜리무맙, 항-CD28 항체, 항-CTLA4 애드넥틴, 항-CTLA4 도메인 항체, 단일 쇄 항-CTLA4 단편, 중쇄 항-CTLA4 단편, 경쇄 항-CTLA4 단편, 공동 자극 경로를 작동시키는 CTLA4의 억제제, PCT 공보 번호 WO 2001/014424에 개시되어 있는 항체, PCT 공보 번호 WO 2004/035607에 개시되어 있는 항체, 미국 공보 번호 2005/0201994에 개시되어 있는 항체, 및 허여된 유럽 특허 번호 EP 1212422 B1에 개시되어 있는 항체가 포함된다. 추가의 CTLA-4 항체가 미국 특허 번호 5,811,097, 5,855,887, 6,051,227, 및 6,984,720; PCT 공보 번호 WO 01/14424 및 WO 00/37504; 및 미국 공보 번호 2002/0039581 및 2002/086014에 기재되어 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 그 밖의 항-CTLA-4 항체에는, 예를 들어 WO 98/42752; 미국 특허 번호 6,682,736 및 6,207,156; 문헌 [Hurwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17):10067-10071 (1998)]; [Camacho et al., J. Clin. Oncology, 22(145):Abstract No. 2505 (2004) (antibody CP-675206)]; [Mokyr et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)], 및 미국 특허 번호 5,977,318, 6,682,736, 7,109,003, 및 7,132,281에 개시되어 있는 것들이 포함된다.

추가의 항-CTLA4 길항제에는 CD28 항원이 그의 동족 리간드에 결합하는 능력을 교란시키고, CTLA4가 그의 동족 리간드에 결합하는 능력을 억제하고, 공동자극 경로를 통한 T 세포 반응을 증대시키고, B7이 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 교란시키고, B7이 공동자극 경로를 활성화시키는 능력을 교란시키고, CD80이 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 교란시키고, CD80이 공동자극 경로를 활성화시키는 능력을 교란시키고, CD86이 CD28 및/또는 CTLA4에 결합하는 능력을 교란시키고, CD86이 공동자극 경로를 활성화시키는 능력을 교란시키고, 공동자극 경로를 교란시킬 수 있는 (일반적으로 활성화되는 것을 억제할 수 있는) 임의의 억제제가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이는 필수적으로 다른 항-CTLA4 길항제 중에서, 공동자극 경로의 다른 구성원 중에서 CD28, CD80, CD86, CTLA4의 소분자 억제제; 공동자극 경로의 다른 구성원 중에서 CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대한 항체; 공동자극 경로의 다른 구성원 중에서 CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대한 안티센스 분자; 공동자극 경로의 다른 구성원 중에서 CD28, CD80, CD86, CTLA4에 대한 애드넥틴, 공동자극 경로의 다른 구성원 중에서 CD28, CD80, CD86, CTLA4의 RNAi 억제제 (단일 가닥 및 이중 가닥 둘 모두)를 포함한다.

참고문헌들 각각은 구체적으로 CTLA-4 항체의 기재를 위해 본원에 참고로 도입된다. 바람직한 임상 CTLA-4 항체는 인간 모노클로날 항체 10Dl (또한 MDX-010 및 이필리무맙이라고 지칭되고, 미국 뉴저지주 브룸스버리 소재의 메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.)로부터 이용가능함)이고, 이는 WO 01/14424에 개시되어 있다.

도 1a-1b는 CTLA-4 mAb 및 다사티닙의 동시 처리가 SA1N 섬유육종 종양 모델에서 상승작용 효과를 야기함을 보여주는 결과를 나타낸다. 다사티닙을 11일 동안 매일 ("A") 또는 15일 동안 간헐적 스케줄 (5일 온/2일 오프)에 따라 ("B") 투여하였다.
도 2는 다사티닙 및 CTLA-4 mAb의 동시 처리가 CT-26 종양 모델에서 상승작용 효과를 야기함을 보여주는 결과를 나타낸다.
도 3a-3c는 다사티닙 처리가 CTLA-4 mAb의 세포적 활성을 증가시킴을 보여주는 결과를 나타낸다. 피하 CT26 결장 종양을 보유한 마우스를 다사티닙 (30 mg/kg, q1dx14, bid, 종양 세포 이식 후 제4일-제18일), CTLA-4 mAb (20 mg/kg, q4dx3, 종양 세포 이식 후 제4일, 제8일, 제12일) 또는 이들 두 작용제의 조합물로 처리하였다. 최종 처리한 지 2 (A), 7 (B) 및 14 (C)일 후에, 마우스 (n=5/군)에 CT26-특이적 펩티드 (AH-1)로 감작된 CFSE-표지된 동종 비장세포를 주사하였다. 18시간 후에, 비장세포를 단리하고, CFSE-표지된 세포의 비를 측정함으로써 (CFSE 높음 = 펩티드 감작됨, CFSE 낮음 = 감작되지 않음) 세포적 활성을 결정하였다. 다사티닙 및 CTLA-4의 조합물은 펩티드 감작된 비장세포 용해를 증강시키는 것으로 나타났고, 이는 제14일 째에 통계학적으로 유의한 수치에 이르렀다 (p=0.055).
도 4a-4b는 다사티닙 및 CTLA-4 mAb의 조합 처리가 종양 배수 림프절 (TDLN)에서 A) T 조절 세포 (CD4+CD25+FoxP3+, T 억제 세포) 및 B) 활성화된 CD4+T 세포에 비해 CD8 활성화된 T 세포 (CD8+CD69+, T 이펙터 세포)의 비를 증가시킴을 보여주는 결과를 나타낸다. 피하 CT26 결장 종양을 보유하는 마우스를 다사티닙 (30 mg/kg, q1dx14, bid, 종양 세포 이식 후 제4일-제18일), CTLA-4 mAb (20 mg/kg, q4dx3, 종양 세포 이식 후 제4일, 제8일, 제12일) 또는 이들 두 작용제의 조합물로 처리하였다. TDLN을 최종 처리한지 2일 후에 수집하고, 유동 세포측정법에 의해 면역표현형을 특성화하였다.
도 5는 스프리셀® 및 CTLA-4 mAb의 동시 처리가 P815 종양 모델에서 증강된 효과를 야기함을 나타낸다. 스프리셀®은 종양 이식 후 제9일-제13일, 제16일-제20일, 제23일-제27일 째에 P.O.투여하였고, 항-CTLA-4 mAb는 제10일, 제14일, 제18일 째에 IP 투약하였다.
도 6은 CTLA-4 차단제 활성이 에토포시드, 파클리탁셀 또는 겜시타빈에 의한 동시 처리에 의해 사라지지 않음을 보여준다.
도 7은 CTLA-4 차단 mAb가 겜시타빈과 함께 상승작용 효과를 야기함을 보여준다. 완전한 반응 ("CR")을 달성한 마우스는 생 CT-26 세포의 2차 재이식에 대해 거부반응을 보였는데, 이는 이러한 조합 처리가 기억 면역 반응을 도출함을 시사한다.
도 8은 CTLA-4 차단 mAb가 에토포시드와 함께 상승작용 효과를 야기함을 보여준다.
도 9는 CTLA-4 차단 mAb가 미세소관 안정화제(들)와 함께 상승작용 효과를 야기함을 보여준다.
도 10은 CTLA-4 차단 mAB 및 화학요법제 조합물의 투여 순서가 증식을 억제하는 것과 관련이 있음을 보여준다. 도시된 바와 같이, 겜시타빈을 CTLA-4 차단 mAb와 동시에 투여하는 것은, 순차적으로 투여하는 것에 비해 최대의 항-증식 효과를 나타낸다.
도 11은 CTLA-4 mAb 및 익사베필론의 처리에 의한 세포독성 CD8+ T-세포의 증식을 보여준다. CTLA-4 mAb + 익사베필론은 이 모델에서 세포독성 T-세포 (CD8+CD107+)의 증식을 야기하였지만, 파클리탁셀과의 조합물은 그렇지 않았다.
도 12는 겜시타빈 및 에토포시드가 생체내 세포독성을 촉진함을 보여준다.
도 13은 겜시타빈이 종양 배수 림프절에서 면역 세포의 조성을 조절함을 보여준다.
도 14는 겜시타빈 + CTLA-4 차단체 조절된 유전자 발현이 면역 조절과 관련됨을 보여준다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 암을 비롯한 항증식성 질환의 치료를 필요로 하는 포유동물 종에게 상승작용적 치료 유효량의 (1) 단백질 티로신 키나제 억제제, 예컨대 다사티닙, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드로 이루어진 군의 구성원; 및 (2) 공동 자극 경로 조절제, 예컨대 항-CTLA4 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 비롯한 항증식성 질환의 치료를 위한 상승작용적 방법을 제공한다.

최적의 T 세포 활성화는 T 세포 수용체와 특이적 항원 간의 상호작용 (문헌 [Bretscher, P. et al., Science, 169:1042-1049 (1970)]) (1차 신호) 및 항원 제시 세포 (APC)에 의해 발현된 공동자극 리간드와 T 세포의 표면 상의 공동자극 수용체의 결착 (2차 신호)을 필요로 한다. T 세포가 2차 신호를 수용하지 못하면, 클론 무반응(anergy)이 초래될 수 있다 (문헌 [Schwartz, R.H., Science, 248:1349-1356 (1990)]). 2개의 중요한 T 세포 공동자극 수용체는 APC 상의 리간드가 B7-1 및 B7-2인 CD28 및 세포독성 T 림프구-관련 항원 4 (CTLA-4, CD152)이다 (문헌 [Linsley, P.S. et al., J. Exp. Med., 173:721-730 (1991)]; [Linsley, P.S. et al., J. Exp. Med., 174:561-569 (1991)]). CD28 및 CTLA-4는 Ig 슈퍼패밀리의 밀접하게 관련된 구성원이나 (문헌 [Brunet, J.F. et al., Nature, 328:267-270 (1987)]), 이들은 길항적으로 기능한다. CD28은 T 세포의 표면 상에 구성적으로 발현되고 (문헌 [Gross, J.A. et al., J. Immunol., 149:380-388 (1992)]), B7-1 또는 B7-2와 결착시 T 세포 수용체-펩티드-MHC 신호가 T 세포 활성화, 증식 및 IL-2 생성을 촉진하도록 증진시킨다 (문헌 [Linsley, P.S. et al., J. Exp. Med., 173:721-730 (1991)]; [Alegre, M.L. et al., Nat. Rev. Immunol., 1(3):220-228 (Dec. 2001)]). CTLA-4는 휴지 T 세포 상에서는 발견되지 않으나, T 세포 활성화후 2 내지 3일 동안 상향조절된다 (문헌 [Lindsten, T. et al., J. Immunol., 151:3489-3499 (1993)]; [Walunas, T.L. et al., Immunity, 1, 405-413 (1994)]). CTLA-4는 또한 CD28보다 훨씬 더 큰 친화도로 B7-1 및 B7-2에 결합하고 (문헌 [Linsley, P.S. et al., Immunity, 1:793-801 (1994)]), T 세포 활성화를 길항하며, IL-2 생성 및 IL-2 수용체 발현을 방해하고, 활성화된 T 세포의 세포 주기 진행을 방해한다 (문헌 [Walunas, T.L. et al., J. Exp. Med., 183:2541-2550 (1996)]; [Krummel, M.F. et al., J. Exp. Med., 183:2533-2540 (1996)]; [Brunner, M.C. et al., J. Immunol., 162:5813-5820 (1999)]; [Greenwald, R.J. et al., Eur. J. Immunol., 32:366-373 (2002)]). 전체 T 세포 반응은 모든 신호 (자극 및 억제)의 통합에 의해 결정된다.

CTLA-4가 T 세포 활성화를 약화시키는 것으로 보이기 때문에, 암 면역요법의 뮤린 모델에서 CTLA-4 활성을 차단하는 시도가 있었다. 면역원성 종양이 이식된 마우스에서, 항-CTLA-4 Ab의 투여는 종양 거부를 증진시켰으나 (문헌 [Leach, D.R. et al., Science, 271:1734-1736 (1996)]), 면역원성이 거의 없는 종양, 예컨대 SM1 유방 암종 또는 B16 흑색종에서는 거의 효과가 나타나지 않았다. 항-CTLA-4 Ab가 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)-형질도입 B16 세포 백신과 함께 제공된 경우 증진된 항종양 면역성이 나타났고, 탈색과 관련되었으며, 이는 항종양 반응의 적어도 일부가 "자가" 멜라닌세포 분화 항원에 대해 항원-특이적이었음을 시사한다 (문헌 [van Elsas, A. et al., J. Exp. Med., 190:355-366 (1999)]; [van Elsas, A. et al., J. Exp. Med., 194:481-489 (2001)]). 원발성 전립선암의 트랜스제닉 뮤린 모델에서, 항-CTLA-4 Ab + GM-CSF-발현 전립선암 세포의 투여는 전립선암의 발병율 및 조직학 중증도를 감소시켰고, 정상 마우스에서 전립선염을 야기하였으며, 이는 다시 종양 거부에서 자가-항원에 대한 항원-특이적 면역 반응을 시사한다 (문헌 [Hurwitz, A.A. et al., Cancer Res., 60:2444-2448 (2000)]). 또한, 많은 인간 종양 항원이 정상적인 자가-항원이기 때문에, 자가에 대한 내성 파괴가 암 면역요법의 성공에 중요할 수 있다. 뮤린 모델에서 종양 백신과 함께 CTLA-4 차단제로부터의 바람직한 종양 반응은 인간 암 면역요법에서 CTLA-4 차단제를 사용하는 것에 대한 관심을 유도하였다.

화학요법제 및 면역요법제의 조합인 화학면역요법은, 종양 세포를 직접 공격하여 종양 세포 괴사 또는 아폽토시스를 야기하는 작용제, 및 종양에 대한 숙주 면역 반응을 조정하는 작용제의 효과를 조합한, 암 치료를 위한 신규 접근법이다. 화학요법제는 "다가" 종양 세포 백신을 생성하는 항원 제시 세포에 의해 제시되는 종양 항원을 생성시키고, 종양 구조를 파괴시켜, 면역요법제의 침투 뿐만 아니라 증식되는 면역 집단을 촉진시켜 면역요법의 효과를 향상시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 다양한 암을 치료하기 위한, 단백질 티로신 키나제 억제제와 적어도 1종의 항-CTLA4 작용제의 상승작용적 조합물(들)을 투여하는 방법을 제공한다: 방광 암종 (가속성 및 전이성 방광암 포함), 유방 암종, 결장 암종 (결장직장암 포함), 신장 암종, 간 암종, 폐 암종 (소세포 및 비소세포 폐암 및 폐 선암종 포함), 난소 암종, 전립선 암종, 고환 암종, 비뇨생식관 암종, 림프계 암종, 직장 암종, 후두 암종, 췌장 암종 (외분비 췌장 암종 포함), 식도 암종, 위 암종, 담낭 암종, 자궁경부 암종, 갑상선 암종 및 피부 암종 (편평 세포 암종 포함)을 비롯한 암종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종, 조직구성 림프종 및 버킷 림프종을 비롯한 림프계의 조혈 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병 및 전골수구성 백혈병을 비롯한 골수계 조혈 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 슈반세포종을 비롯한 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 비롯한 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포성암 및 기형암종을 비롯한 기타 종양; 흑색종, 절제불가능한 III기 또는 IV기 악성 흑색종, 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 위장암, 신암, 난소암, 간암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 교모세포종, 자궁경부암, 위암, 방광암, 간암, 유방암, 결장 암종 및 두경부암, 위암, 배세포 종양, 골암, 골 종양, 골의 성인 악성 섬유성 조직구종; 골의 소아 악성 섬유성 조직구종, 육종, 소아 육종, 부비동비강 자연 킬러, 신생물, 형질 세포 신생물; 골수이형성 증후군; 신경모세포종; 고환 배세포 종양, 안내 흑색종, 골수이형성 증후군; 골수이형성/골수증식성 질환, 활막 육종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 필라델피아 염색체 양성 급성 림프모구성 백혈병 (Ph+ ALL), 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 비만세포증 및 비만세포증과 관련된 임의의 증상, 및 이들의 임의의 전이. 또한, 장애에는 다른 암 이외에 색소성 두드러기, 비만세포증, 예컨대 확산 피부 비만세포증, 인간에서의 단리성 비만세포종, 뿐만 아니라 개 비만세포종 및 몇몇 희귀 아형, 예컨대 수포성, 홍피성 및 모세혈관확장성 비만세포증, 혈액학 장애와 관련된 비만세포증, 예컨대 골수증식성 또는 골수이형성 증후군, 또는 급성 백혈병, 비만세포증과 관련된 골수증식성 장애, 비만세포 백혈병이 포함된다. 또한, 하기를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 기타 암이 장애의 범주에 포함된다: 방광 암종, 요로상피 암종, 유방 암종, 결장 암종, 신장 암종, 간 암종, 폐 암종, 난소 암종, 췌장 암종, 위 암종, 자궁경부 암종, 갑상선 암종, 고환 암종, 특히 고환 정상피종 및 피부 암종을 비롯한 암종; 편평 세포 암종을 비롯한 암종; 위장관 기질적 종양 ("GIST"); 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종 및 버킷 림프종을 비롯한 림프계 조혈 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수구성 백혈병을 비롯한 골수계 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 비롯한 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 정상피종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경교종을 비롯한 기타 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 슈반세포종을 비롯한 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 비롯한 중간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포성 암, 기형암종, 화학요법 불응성 비정상피종성 배세포 종양 및 카포시 육종을 비롯한 기타 종양, 및 이들의 임의의 전이. 바람직하게는, 본 발명의 치료 요법에 의한 이같은 암 치료 방법은 항-CTLA 작용제-유도된 결장염의 발생 정도를 감소시킬 것이다.

단백질 티로신 키나제 억제제와 적어도 1종의 공동 자극 경로 조절제, 바람직하게는 항-CTLA4 작용제의 조합물은 또한 항-증식성 세포독성제의 부가를 포함할 수 있다. 항-증식성 세포독성제로서 사용가능한 화합물 부류에는 다음과 같은 것이 포함된다:

알킬화제 (질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠이 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아님): 우라실 머스타드, 클로르메틴, 시클로포스파미드 (시톡산®), 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포르아민, 부술판, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 다카르바진 및 테모졸로미드.

항대사물 (폴산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나제 억제제가 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아님): 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 플록수리딘, 시타라빈, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴 및 겜시타빈.

본 발명의 목적상, 공동 자극 경로 조절제에는 항-CTLA4 작용제, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 및 트레멜리무맙 중 하나 이상이 포함된다.

단독으로 또는 본원에서 개시하는 다른 공동 자극 경로 조절제와 추가로 조합되어, 또는 본원에서 개시하는 기타 화합물과 조합되어, 단백질 티로신 키나제 억제제와 함께 사용될 수 있는 본 발명의 기타 공동 자극 경로 조절제에는 아가톨리모드, 벨라타셉트, 블리나투모맙, CD40 리간드, 항-B7-1 항체, 항-B7-2 항체, 항-B7-H4 항체, AG4263, 에리토란, 항-OX40 항체, ISF-154 및 SGN-70; B7-1, B7-2, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD48, LFA-3, CD30 리간드, CD40 리간드, 열 안정성 항원, B7h, OX40 리간드, LIGHT, CD70 및 CD24가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 암성 종양의 상승작용적 치료 방법이 제공된다. 유리하게는, 본 발명의 상승작용적 방법은 포유동물 숙주에서 종양 발병을 감소시키거나, 또는 종양 부담을 감소시키거나, 또는 종양 퇴행을 유발한다.

단백질 티로신 키나제 억제제, 예컨대 다사티닙, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드와 적어도 1종의 항-CTLA4 작용제의 조합물은 또한 단독으로 또는 방사선 요법과 함께, 항-증식성 세포독성제의 부가를 포함할 수 있다.

다른 항증식성 세포독성제는 나벨빈, CPT-11, 아나스트라졸, 레트라졸, 카페시타빈, 렐록사핀, 시클로포스파미드, 이포사미드 및 드롤록사핀이다.

천연 생성물 및 그의 유도체 (예를 들어, 빈카 알칼로이드, 항종양 항생제, 효소, 림포킨 및 에피포도필로톡신): 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 아라-C, 파클리탁셀 (파클리탁셀은 탁솔®로서 시판됨), 미트라마이신, 데옥시코포르마이신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 인터페론 (특히, IFN-a), 에토포시드 및 테니포시드.

적어도 1종의 공동자극 경로 조절제, 바람직하게는 항-CTLA4 작용제와의 다른 조합물에는, 공동자극 경로 효능제 (즉, 면역자극제), 튜불린 안정화제 (예를 들어, 파시탁솔, 에포틸론, 탁산 등), 익셈프라™, 다카르바진, 파라플라틴®, 도세탁셀, 하나 이상의 펩티드 백신, MDX-1379 흑색종 펩티드 백신, 하나 이상의 gp100 펩티드 백신, 계두-PSA-트리콤(TRICOM)™ 백신, 백시니아-PSA-트리콤™ 백신, MART-1 항원, 사르그라모스팀, 트레멜리무맙, 조합 안드로겐 절제 요법의 조합물; 이필리무맙 및 또 다른 공동자극 경로 효능제의 조합물; 이필리무맙 및 튜불린 안정화제 (예를 들어, 파시탁솔, 에포틸론, 탁산 등)의 조합물; 이필리무맙 및 익셈프라™의 조합물, 이필리무맙과 다카르바진의 조합물, 이필리무맙과 파라플라틴®의 조합물, 이필리무맙과 도세탁셀의 조합물, 이필리무맙과 하나 이상의 펩티드 백신의 조합물, 이필리무맙과 MDX-1379 흑색종 펩티드 백신의 조합물, 이필리무맙과 하나 이상의 gp100 펩티드 백신의 조합물, 이필리무맙과 계두-PSA-트리콤™ 백신의 조합물, 이필리무맙과 백시니아-PSA-트리콤™ 백신의 조합물, 이필리무맙과 MART-1 항원의 조합물, 이필리무맙과 사르그라모스팀의 조합물, 이필리무맙과 트레멜리무맙의 조합물, 및/또는 이필리무맙과 조합 안드로겐 절제 요법의 조합물이 포함될 수 있다. 본 발명의 조합물은 또한 치료될 상태에 대한 특정 유용성을 위해 선택된 다른 익히 공지된 요법과 함께 사용될 수 있다.

어구 "방사선 요법"은 광선과 같은 외용원으로부터 또는 소량의 방사능원의 이식에 의해 전달되는 감마선 또는 X선을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 명세서 및 하기하는 특허청구범위에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 달리 분명하게 언급하지 않는 한 복수개의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "펩티드"에 대한 언급은 2개 이상의 펩티드의 조합물 등을 포함한다.

"약"은 양, 지속 시간 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때 본원에 사용된 바와 같이 명시된 값으로부터 ±20％ 또는 ±10％, 보다 바람직하게는 ±5％, 보다 더 바람직하게는 ±1％, 훨씬 더 바람직하게는 ±0.1％의 편차를 포함하는 것을 의미하고, 그러한 편차는 개시된 방법을 수행하기 위해 적절하다.

당업계에 공지된 바와 같이, 다사티닙은 또한 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드로 지칭되며, 하기 화학식 I을 갖는 화합물로 표현된다:

<화학식 I>

화합물 I은 또한 IUPAC 명명법에 따라 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-((6-(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐)-2-메틸-4-피리미디닐)아미노)-1,3-티아졸-5-카르복스아미드로 지칭될 수도 있다. 사용상 용어 "N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드"는 (달리 나타내지 않는 한), 화합물 I의 용매화물 (수화물 포함) 및 다형체 형태 또는 그의 염 (예컨대, 2005년 2월 4일자로 출원된 USSN 11/051,208 (이는 전체 목적상 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있는 I의 1수화물 형태)을 포함한다. N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드의 제약 조성물은 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드 및 1종 이상의 희석제, 비히클 및/또는 부형제를 포함하는 모든 제약상 허용되는 조성물, 예컨대 2006년 4월 12일자로 출원된 USSN 11/402,502 (이는 전체 목적상 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있는 조성물을 포함한다. N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드를 포함하는 제약 조성물의 한 예는 스프리셀® (브리스톨-마이어스 스퀴브 캄파니(Bristol-Myers Squibb Company)이다. 스프리셀®은 히프로멜로스, 이산화티탄 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 정제 내에 활성 성분으로서 다사티닙이라고도 불리는 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드, 및 불활성 성분 또는 부형제로서 락토스 1수화물, 미세결정질 셀룰로스, 크로스카르멜로스 나트륨, 히드록시프로필 셀룰로스 및 스테아르산마그네슘을 포함한다.

본 발명은 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한되지 않으며, 이들은 물론 달라질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 오직 특정한 측면을 기술하기 위한 것이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다.

당업계에 공지된 바와 같이, 이필리무맙은 항-CTLA-4 항체를 지칭하고, 기능성 인간 레퍼토리를 생성하기 위한 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 인간 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 완전 인간 IgG₁κ 항체이다. 이필리무맙은 또한 그의 CAS 등록 번호 477202-00-9로 지칭될 수 있고, 전체 목적상 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 PCT 공보 번호 WO 01/14424에 항체 10DI로서 개시되어 있다. 구체적으로, 이필리무맙은 서열 1로 구성된 경쇄 가변 영역을 갖고 서열 2로 구성된 중쇄 영역을 포함하는, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는, CTLA4에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 기술한다. 이필리무맙의 제약 조성물은 이필리무맙 및 1종 이상의 희석제, 비히클 및/또는 부형제를 포함하는 모든 제약상 허용되는 조성물을 포함한다. 이필리무맙을 포함하는 제약 조성물의 예는 PCT 공보 번호 WO 2007/67959에 제공되어 있다. 이필리무맙은 I.V.에 의해 투여될 수 있다.

이필리무맙의 경쇄 가변 영역:

이필리무맙의 중쇄 가변 영역:

본원의 다른 부분에서 주목되는 바와 같이, 하나 이상의 항-CTLA4 길항제는 단독으로 또는 본원에 개시된 항증식제 이외에 펩티드 항원 (예를 들어, gp100)과 함께 투여될 수 있다. 펩티드 항원의 비제한적 예는 IMDQVPFSV (서열 3) 및 YLEPGPVTV (서열 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 (또는 다르게는 이로 이루어진) gp100 펩티드일 것이다. 이러한 펩티드는 경구로, 또는 바람직하게는 s.c. 주사에 의해 투여될 수 있으며, 불완전 프로인트 아주반트 (IFA)에 유화된 1 mg이 한 사지에 s.c. 주사되고 IFA에 유화된 동일하거나 상이한 펩티드 1 mg은 다른 사지에 주사될 수 있다.

당업계에 공지된 바와 같이, 파클리탁셀은 하기 화학식 II를 갖는 화합물로 지칭된다:

<화학식 II>

화합물 II는 또한 IUPAC 명명법에 따라 (2R,3S)-N-벤조일-3-페닐이소세린을 갖는 5베타,20-에폭시-1,2알파,4,7베타,10베타,13알파-헥사히드록시탁스-11-엔-9-온 4,10-디아세테이트 2-벤조에이트 13-에스테르로 지칭될 수 있다. 사용상 용어 "(2R,3S)-N-벤조일-3-페닐이소세린을 갖는 5베타,20-에폭시-1,2알파,4,7베타,10베타,13알파-헥사히드록시탁스-11-엔-9-온 4,10-디아세테이트 2-벤조에이트 13-에스테르"는 (달리 나타내지 않는 한), 화합물 II의 용매화물 (수화물 포함) 및 다형체 형태 또는 그의 염, 예컨대 1996년 4월 2일자로 허여된 미국 특허 번호 5,504,102 (이는 전체 목적상 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있는 II의 형태를 포함한다. (2R,3S)-N-벤조일-3-페닐이소세린을 갖는 5베타,20-에폭시-1,2알파,4,7베타,10베타,13알파-헥사히드록시탁스-11-엔-9-온 4,10-디아세테이트 2-벤조에이트 13-에스테르의 제약 조성물은 (2R,3S)-N-벤조일-3-페닐이소세린을 갖는 5베타,20-에폭시-1,2알파,4,7베타,10베타,13알파-헥사히드록시탁스-11-엔-9-온 4,10-디아세테이트 2-벤조에이트 13-에스테르 및 1종 이상의 희석제, 비히클 및/또는 부형제를 포함하는 모든 제약상 허용되는 조성물을 포함한다. (2R,3S)-N-벤조일-3-페닐이소세린을 갖는 5베타,20-에폭시-1,2알파,4,7베타,10베타,13알파-헥사히드록시탁스-11-엔-9-온 4,10-디아세테이트 2-벤조에이트 13-에스테르를 포함하는 제약 조성물의 한 예는 탁솔® (브리스톨-마이어스 스퀴브 캄파니)이다. 탁솔®은 멸균 0.9％ 염화나트륨 주사액, USP, 5％ 덱스트로스 주사액, USP, 0.9％ 염화나트륨 및 5％ 덱스트로스 주사액, USP, 또는 링거 주사액 중 5％ 덱스트로스로 이루어진 희석제 형태의 불활성 성분을 비롯하여, IV 주입을 위해 활성 성분으로서 파클리탁셀이라고도 불리는 (2R,3S)-N-벤조일-3-페닐이소세린을 갖는 5베타,20-에폭시-1,2알파,4,7베타,10베타,13알파-헥사히드록시탁스-11-엔-9-온 4,10-디아세테이트 2-벤조에이트 13-에스테르를 0.3 내지 1.2 mg/ml의 최종 농도로 포함한다.

당업계에 공지된 바와 같이, 겜시타빈은 하기 화학식 III을 갖는 화합물로 지칭된다:

<화학식 III>

화합물 III은 또한 IUPAC 명명법에 따라 2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘 모노히드로클로라이드 (β-이성질체)로 지칭될 수 있다. 사용상 용어 "2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘 모노히드로클로라이드 (β-이성질체)"는 (달리 나타내지 않는 한), 화합물 III의 용매화물 (수화물 포함) 및 다형체 형태 또는 그의 염을 포함한다. 2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘 모노히드로클로라이드 (β-이성질체) 및 1종 이상의 희석제, 비히클 및/또는 부형제의 제약 조성물. 2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘 모노히드로클로라이드 (β-이성질체)를 포함하는 제약 조성물의 한 예는 겜자르® (겜시타빈 HCl)이다. 겜자르®는 정맥내 사용만을 위한 멸균 형태의 불활성 성분을 비롯하여, IV 주입을 위해 활성 성분으로서 2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘 모노히드로클로라이드 (β-이성질체)를 포함한다. 겜자르® 바이알은 멸균 동결건조된 분말로서 만니톨 (각각 200 mg 또는 1 g) 및 아세트산나트륨 (각각 12.5 mg 또는 62.5 mg)과 함께 제제화된 200 mg 또는 1 g의 겜시타빈 HCl (유리 염기로서 표출됨)을 함유한다. 염산 및/또는 수산화나트륨은 pH 조정을 위해 첨가될 수 있다.

당업계에 공지된 바와 같이, 에토포시드는 하기 화학식 IV를 갖는 화합물로 지칭된다:

<화학식 IV>

화합물 IV는 또한 IUPAC 명명법에 따라 4'-데메틸에피포도필로톡신 9-[4,6-O-(R)-에틸리덴-β-D-글루코피라노시드], 4'-(디히드로겐 포스페이트)로 지칭될 수 있다. 사용상 용어 "4'-데메틸에피포도필로톡신 9-[4,6-O-(R)-에틸리덴-β-D-글루코피라노시드], 4'-(디히드로겐 포스페이트)"는 (달리 나타내지 않는 한), 화합물 IV의 용매화물 (수화물 포함) 및 다형체 형태 또는 그의 염을 포함한다. 4'-데메틸에피포도필로톡신 9-[4,6-O-(R)-에틸리덴-β-D-글루코피라노시드], 4'-(디히드로겐 포스페이트) 및 1종 이상의 희석제, 비히클 및/또는 부형제의 제약 조성물. 4'-데메틸에피포도필로톡신 9-[4,6-O-(R)-에틸리덴-β-D-글루코피라노시드], 4'-(디히드로겐 포스페이트)를 포함하는 제약 조성물의 한 예는 에토포포스(ETOPOPHOS) (에토포시드 포스페이트)이다. 에토포포스는 100 mg 에토포시드와 동등한 에토포시드 포스페이트, 32.7 mg 시트르산나트륨 USP, 및 300 mg 덱스트란 40을 함유하는 단일 용량 바이알 내에 정맥내 사용만을 위한 멸균 형태의 불활성 성분을 비롯하여, IV 주입을 위한 활성 성분으로서 4'-데메틸에피포도필로톡신 9-[4,6-O-(R)-에틸리덴-β-D-글루코피라노시드], 4'-(디히드로겐 포스페이트)를 포함한다.

본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 항증식제에는 당업계에 공지된 미세소관 안정화제 이외에, 탁산, 파클리탁셀 (파클리탁셀은 탁솔®로서 시판됨), 도세탁셀, 디스코데르몰리드 (DDM), 딕티오스타틴 (DCT), 펠로루시드 A, 에포틸론, 에포틸론 A, 에포틸론 B, 에포틸론 C, 에포틸론 D, 에포틸론 E, 에포틸론 F, 푸라노에포틸론 D, 데스옥시에포틸론 Bl, [17]-데히드로데스옥시에포틸론 B, [18]데히드로데스옥시에포틸론 B, C12,13-시클로프로필-에포틸론 A, C6-C8 가교된 에포틸론 A, 트랜스-9,10-데히드로에포틸론 D, 시스-9,10-데히드로에포틸론 D, 16-데스메틸에포틸론 B, 에포틸론 B10, 디스코데로몰리드, 파투필론 (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, BMS-310705, ABJ-789, XAA296A (디스코데르몰리드), TZT-1027 (소블리도틴), ILX-651 (타시도틴 히드로클로라이드), 할리콘드린 B, 에리불린 메실레이트 (E-7389), 헤미아스텔린 (HTI-286), E-7974, 크립토피신, LY-355703, 메이탄시노이드 면역접합체 (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (이스피네시브), SB-743921, MK-0731, STA-5312, 엘레우테로빈, 17베타-아세톡시-2-에톡시-6-옥소-B-호모-에스트라-1,3,5(10)-트리엔-3-올, 시클로스트렙틴, 이소라울리말리드, 라울리말리드, 4-에피-7-데히드록시-14,16-디데메틸-(+)-디스코데르몰리드 및 크립토틸론 1이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

어구 "단백질 티로신 키나제 억제제"는 단백질 티로신 키나제 패밀리 중 하나 이상의 구성원을 억제하는 작용제를 지칭하는 것으로 의도된다. 단백질 티로신 키나제 억제제의 비제한적 예에는 다사티닙, 이마티닙, 닐로티닙, PD180970, GGP76030, AP23464, SKI 606, NS-187 및/또는 AZD0530이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 단백질 티로신 키나제 억제제는 단독으로 또는 다른 분자, 예컨대 T315I 억제제와 함께 투여될 수 있다.

어구 "미세소관 조절제"는 미세소관을 안정화시키거나 미세소관 합성 및/또는 중합을 불안정화시키는 작용제를 지칭하는 것으로 의도된다.

본원에서 언급되는 적어도 하나의 항증식제는 미세소관 침범제(affecting agent)일 수 있다. 미세소관 침범제는 세포의 유사분열을 방해하며, 그의 항증식성 세포독성 활성에 대해서는 당업계에 익히 공지되어 있다. 본 발명에 유용한 미세소관 침범제에는 알로콜히친 (NSC 406042), 할리콘드린 B (NSC 609395), 콜히친 (NSC 757), 콜히친 유도체 (예를 들어, NSC 33410), 돌라스타틴 10 (NSC 376128), 메이탄신 (NSC 153858), 리족신 (NSC 332598), 파클리탁셀 (탁솔®, NSC 125973), 탁솔® 유도체 (예를 들어, 유도체 (예를 들어, NSC 608832), 티오콜히친 NSC 361792), 트리틸 시스테인 (NSC 83265), 빈블라스틴 술페이트 (NSC 49842), 빈크리스틴 술페이트 (NSC 67574), 에포틸론 A, 에포틸론 B, 에포틸론 C, 에포틸론 D, 데스옥시에포틸론 A, 데스옥시에포틸론 B, [1S-[1R^*,3R^*(E),7R^*,10S^*,11R^*,12R^*,16S^*]]-7-11-디히드록시-8,8,10,12,16-펜타메틸-3-[1-메틸-2-(2-메틸-4-티아졸릴)에테닐]-4-아자-17-옥사비시클로[14.1.0]헵타데칸-5,9-디온 (2001년 7월 17일자로 허여된 미국 특허 6,262,094에 개시됨), [1S-[1R^*,3R^*(E),7R^*,10S^*,11R^*,12R^*,16S^*]]-3-[2-[2-(아미노메틸)-4-티아졸릴]-1-메틸에테닐]-7,11-디히드록시-8,8,10,12,16-펜타메틸-4-17-디옥사비시클로[14.1.0]-헵타데칸-5,9-디온 (2000년 2월 17일자로 출원된 USSN 09/506,481 및 본원의 실시예 7 및 8에 개시됨) 및 그의 유도체를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 천연 및 합성 에포틸론; 및 다른 미세소관-붕괴제를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 추가 항신생물제에는 디스코더몰리드 (문헌 [Service, Science, 274:2009 (1996)] 참조), 에스트라무스틴, 노코다졸, MAP4 등이 포함된다. 이러한 작용제의 예는 또한 과학 및 특허 문헌에 기재되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Bulinski, J. Cell Sci., 110:3055-3064 (1997)]; [Panda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:10560-10564 (1997)]; [Muhlradt, Cancer Res., 57:3344-3346 (1997)]; [Nicolaou, Nature, 387:268-272 (1997)]; [Vasquez, Mol. Biol. Cell., 8:973-985 (1997)]; [Panda, J. Biol. Chem., 271:29807-29812 (1996)]을 참조한다.

본 발명의 화학요법적 방법에 의한 치료와 함께 또는 그 전에 비정상적으로 증식성인 세포를 정지시키는 것이 바람직한 경우, 호르몬 및 스테로이드 (합성 유사체 포함): 17a-에티닐에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론, 프레드니손, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 테스톨락톤, 메게스트롤아세테이트, 메틸프레드니솔론, 메틸-테스토스테론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 클로로트리아니센, 히드록시프로게스테론, 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴, 메드록시프로게스테론아세테이트, 류프롤리드, 플루타미드, 토레미펜, 졸라덱스®가 또한 환자에게 투여될 수 있다.

또한, 항혈관신생제, 예컨대 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제가 본 발명의 조합 화학요법적 방법에서 사용하기에 적합하고, 다른 VEGF 억제제, 예컨대 항-VEGF 항체 및 소분자, 예컨대 ZD6474 및 SU6668이 또한 포함된다. 제넨테크(Genentech)로부터의 항-Her2 항체가 또한 사용될 수 있다. 적합한 EGFR 억제제는 EKB-569 (비가역적 억제제)이다. 또한, EGFR에 대해 면역특이적인 임클론(Imclone) 항체 C225 및 src 억제제가 포함된다.

또한, 안드로겐 의존성 암종을 비증식성으로 만드는 카소덱스(CASODEX)®가 항증식성 세포증식억제제로서 사용하기에 적합하다. 세포증식억제제의 또 다른 예는 에스트로겐 의존성 유방암의 증식 또는 성장을 억제하는 항에스트로겐 타목시펜이다. 세포 증식 신호 도입 억제제가 세포증식억제제이다. 예는 표피 성장 인자 억제제, Her-2 억제제, MEK-1 키나제 억제제, MAPK 키나제 억제제, PI3 억제제, Src 키나제 억제제 및 PDGF 억제제이다.

언급한 바와 같이, 특정 항증식제들은 항혈관신생제 및 항혈관제이고, 고형 종양으로 가는 혈류를 방해함으로써 암 세포에게서 영양소를 빼앗아 암 세포를 정지시킨다. 또한, 안드로겐 의존성 암종을 비증식성으로 만드는 거세도 사용될 수 있다. 외과적 혈류 교란 이외의 수단에 의한 기아는 세포증식억제제의 다른 예이다. 특히 바람직한 부류의 항혈관형성 세포증식억제제는 콤브레타스타틴이다. 다른 예시적인 세포증식억제제에는 MET 키나제 억제제, MAP 키나제 억제제, 비-수용체 및 수용체 티로신 키나제 억제제, 인테그린 신호전달 억제제 및 인슐린-유사 성장 인자 수용체 억제제가 포함된다. 본 발명은 또한 BCR-ABL 관련 장애, 돌연변이체 BCR-ABL 관련 장애, 및/또는 단백질 티로신 키나제 관련 장애 (이마티닙-내성 BCR-ABL 돌연변이, 다사티닙-내성 BCR-ABL 돌연변이, CML, 이마티닙-내성 CML, 및/또는 이마티닙-불내성 CML의 존재와 관련이 있는 장애)에 더하여, 증식성 장애를 치료 및 예방하기 위한, 단백질 티로신 키나제 억제제, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드를 적어도 1종의 공동 자극 경로 조절제, 특히 항-CTLA4 작용제와 상승작용 조합물(들)로 투여하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용된 용어 "BCR-ABL"은 야생형 및 돌연변이체 BCR-ABL을 둘 모두 포함한다.

"BCR-ABL 관련 장애"는 돌연변이체 BCR-ABL 활성을 비롯한 BCR-ABL 활성으로 인한 장애, 및/또는 돌연변이체 BCR-ABL을 비롯한 BCR-ABL 발현 및/또는 활성의 억제에 의해 완화되는 장애이다. 염색체 9 및 22 사이의 상호 전위는 종양원성 BCR-ABL 융합 단백질이 생성되게 한다. 어구 "BCR-ABL 관련 장애"는 "돌연변이체 BCR-ABL 관련 장애"를 포함한다.

본 발명의 범주에 포함되는 장애에는, 예를 들어 백혈병, 예를 들어 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 및 필라델피아 염색체 양성 급성 림프모구성 백혈병 (Ph+ ALL), 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 위장암, 신암, 난소암, 간암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 교모세포종, 자궁경부암, 위암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장 암종, 및 두경부암, 위암, 배세포 종양, 소아 육종, 부비동비강 자연 킬러, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 비만세포증 및 비만세포종 관련 임의의 증상이 포함된다. 또한, 장애에는 색소성 두드러기, 비만세포증, 예컨대 미만성 피부 비만세포증, 인간 단리성 비만세포종, 뿐만 아니라 개 비만세포종 및 몇몇 희귀 아형, 예컨대 수포성, 홍피성 및 모세혈관확장성 비만세포증, 골수증식성 또는 골수이형성 증후군 또는 급성 백혈병과 같은 관련 혈액학적 장애 수반 비만세포증, 비만세포증과 관련된 골수증식성 장애 및 비만 세포 백혈병이 포함된다. 또한, 예를 들어 방광 암종, 유방 암종, 결장 암종, 신장 암종, 간 암종, 폐 암종, 난소 암종, 췌장 암종, 위 암종, 자궁경부 암종, 갑상선 암종, 고환 암종, 특히 고환 정상피종 및 피부 암종을 비롯한 암종; 편평 세포 암종을 비롯한 암종; 위장관 기질적 종양 ("GIST"); 림프계의 조혈 종양, 예를 들어 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종 및 버킷 림프종; 골수계의 조혈 종양, 예를 들어 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수구성 백혈병; 중간엽 기원의 종양, 예를 들어 섬유육종 및 횡문근육종; 다른 종양, 예를 들어 흑색종, 정상피종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경교종; 중추 및 말초 신경계의 종양, 예를 들어 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 슈반세포종; 중간엽 기원의 종양, 예를 들어 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종; 및 다른 종양, 예를 들어 흑색종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포성 암, 기형암종, 화학요법 불응성 비정상피종성 배세포 종양 및 카포시 육종을 비롯한 다양한 추가 암이 단백질 티로신 키나제-관련 장애의 범주 내에 포함된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 장애는 백혈병, 유방암, 전립선암, 폐암, 결장암, 흑색종 또는 고형 종양이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 백혈병은 만성 골수성 백혈병 (CML), Ph+ ALL, AML, 이마티닙-내성 CML, 이마티닙-불내성 CML, 가속성 CML, 림프양 모세포기 CML이다.

"고형 종양"에는 예를 들어, 육종, 흑색종, 암종, 전립선 암종, 폐 암종, 결장 암종 또는 다른 고형 종양 암이 포함된다.

용어 "암", "암성" 또는 "악성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 설명한다. 암의 예에는 예를 들어, 백혈병, 림프종, 모세포종, 암종 및 육종이 포함된다. 이러한 암의 보다 특정한인 예에는 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 필라델피아 염색체 양성 급성 림프모구성 백혈병 (Ph+ ALL), 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 위장관암, 신암, 난소암, 간암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 교모세포종, 자궁경부암, 위암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장 암종, 및 두경부암, 위암, 배세포 종양, 소아 육종, 부비동비강 자연 킬러, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 만성 림프구성 백혈병 (CML)이 포함된다.

"백혈병"은 혈액-형성 기관의 진행성 악성 질환을 지칭하며, 일반적으로 혈액 및 골수에서 백혈구 및 그의 전구체의 기형적 증식 및 발달을 특징으로 한다. 백혈병은 일반적으로 (1) 질환의 지속시간 및 특징 - 급성 또는 만성; (2) 관여되는 세포의 유형; 골수성 (골수성), 림프구양 (림프형성) 또는 단핵구성; 및 (3) 혈액 중 비정상적인 세포의 개수의 증가 또는 비-증가 - 백혈병성 또는 무백혈병성 (비백혈병성)을 기준으로 임상적으로 분류된다. 백혈병에는 예를 들어, 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 무백혈병성 백혈병, 백혈구혈증성 백혈병, 호염기성 백혈병, 모세포 백혈병, 소 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 피부 백혈병, 태아 백혈병, 호산구성 백혈병, 그로스 백혈병, 모발상 세포 백혈병, 혈모세포성 백혈병, 혈구모세포성 백혈병, 조직구성 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 백혈구감소성 백혈병, 림프 백혈병, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프형성 백혈병, 림프양 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만 세포 백혈병, 거대핵세포 백혈병, 소골수모세포성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 골수모구성 백혈병, 골수구성 백혈병, 골수성 과립구 백혈병, 골수단구성 백혈병, 네겔리 백혈병, 형질 세포 백혈병, 형질세포 백혈병, 전골수구성 백혈병, 리이더 세포 백혈병, 쉴링 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 비백혈병성 백혈병 및 미분화 세포 백혈병이 포함된다. 특정 측면에서, 본 발명은 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 및/또는 필라델피아 염색체 양성 급성 림프모구성 백혈병 (Ph+ ALL)의 치료를 제공한다.

"돌연변이체 BCR-ABL"은 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에 의해 야생형 BCR-ABL 티로신 키나제와 다른 아미노산 서열을 갖는 BCR-ABL 티로신 키나제를 포함한다. 예를 들어 서열 2의 위치 507의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하면 돌연변이체 BCR-ABL 티로신 키나제가 될 것이다.

"돌연변이체 BCR-ABL 관련 장애"는 상기 장애와 관련이 있는 세포가 BCR-ABL에서의 돌연변이로 인해 상기 장애를 치료하는데 사용되는 키나제 억제제에 의한 치료에 내성을 갖거나 갖게 된 BCR-ABL 관련 장애를 설명하는데 사용된다. 예를 들어, 키나제 억제제 화합물은 암성 상태를 치료하는데 사용될 수 있고, 이 화합물은 야생형 BCR-ABL의 활성을 억제하여 암성 세포의 증식을 억제하고/거나 아폽토시스를 유도할 것이다. 시간이 지나면서, BCR-ABL 키나제를 코딩하는 유전자에 돌연변이가 도입될 수 있고, 이는 BCR-ABL 키나제의 아미노산 서열을 변경시키고, 암 세포가 상기 화합물에 의한 치료에 대해 내성을 갖거나 또는 적어도 부분적으로 내성을 갖도록 할 수 있다. 이와 달리, 단백질 티로신 키나제 억제제에 의한 치료와는 독립적으로 돌연변이가 유전적으로 또는 종양원성 사건의 결과로서 BCR-ABL 키나제를 코딩하는 유전자 내에 이미 존재할 수 있고, 이는 이들 세포가 암성 또는 증식성 상태로 분화되는 성향을 갖게 하는 한 인자일 수 있으며, 또한 이들 세포가 단백질 티로신 키나제 억제제에 의한 치료에 대해 덜 민감하도록 할 수 있다. 이러한 상황은 직접적으로 또는 간접적으로 "돌연변이체 BCR-ABL 키나제 관련 장애"를 야기할 것으로 예상되고, 이같은 상태의 치료는 돌연변이체 BCR-ABL, 바람직하게는 야생형 BCR-ABL 및 돌연변이체 BCR-ABL 둘 모두에 대해 적어도 부분적으로 효과적인 화합물을 필요로 할 것이다. 개체에서 키나제 억제제 이마티닙에 대해 적어도 부분적인 내성이 생긴 경우, 돌연변이체 BCR-ABL 관련 장애는 이마티닙-내성 BCR-ABL 돌연변이, 또는 단백질 티로신 키나제 억제제 내성 BCR-ABL 돌연변이로 인한 것이다. 유사하게, 개체에서 키나제 억제제 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드에 대해 적어도 부분적인 내성이 생긴 경우, 돌연변이체 BCR-ABL 관련 장애는 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드 내성 BCR-ABL 돌연변이, 또는 단백질 티로신 키나제 억제제 내성 BCR-ABL 돌연변이로 인한 것이다. 본 발명자들은 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드에 의한 치료 이후에, 특정 개체에서 E507G 돌연변이가 발생하는 것을 발견하였다. 본 발명은, 다른 것들 중에서도, 돌연변이체 BCR-ABL 관련 장애를 치료하는 방법 및 개체가 돌연변이체 BCR-ABL 관련 장애를 가질 경우 이를 확인하는 방법을 제공한다.

본원의 특정 관심대상인 "단백질 티로신 키나제-관련 장애"는 적어도 부분적으로 이상 SRC 또는 BCR-ABL (WT 또는 돌연변이체) 활성으로 인한 장애 및/또는 SRC 또는 BCR-ABL (WT 또는 돌연변이체)의 억제에 의해 완화되는 장애로, 본원에서 "SRC 관련 장애", "SRC 관련 암", 또는 "BCR-ABL 관련 장애", "BCR-ABL 관련 암"이라고도 지칭된다.

"이마티닙-내성 BCR-ABL 돌연변이"는 이마티닙에 의한 치료에 대해 내성인 상기 돌연변이를 나타내는 세포에 부여된 BCR-ABL의 아미노산 서열에서의 특정 돌연변이를 지칭한다. 본원에서 논의된 바와 같이, 이같은 돌연변이는 BCR-ABL의 T315I 위치에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. BCR-ABL 단백질이 적어도 부분적으로 이마티닙 내성을 갖게 할 수 있는 추가의 돌연변이에는, 예를 들어

가 포함될 수 있다. 추가의 이마티닙-내성 BCR-ABL 돌연변이에는 또한 본원의 다른 곳에서 개시하는 다른 BCR-ABL 돌연변이가 포함될 수 있다.

"다사티닙-내성 BCR-ABL 돌연변이"는 다사티닙에 의한 치료에 대해 적어도 부분적으로 내성인 상기 돌연변이를 나타내는 세포에 부여된 BCR-ABL의 아미노산 서열에서의 특정 돌연변이를 지칭한다. 본원에서 논의된 바와 같이, 이같은 돌연변이는 BCR-ABL의 T315I, T315A, F317A, F317I, 및 E507G 위치에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가의 다사티닙-내성 BCR-ABL 돌연변이에는 또한 본원의 다른 곳에서 개시하는 다른 BCR-ABL 돌연변이가 포함될 수 있다.

"이마티닙-내성 CML"은 CML 관련 세포가 이마티닙에 의한 치료에 대해 내성인 CML을 지칭한다. 일반적으로, 이는 BCR-ABL에서의 돌연변이의 결과이다.

"이마티닙-불내성 CML"은 CML을 갖는 개체가 이마티닙에 의한 치료에 대해 불내성, 즉 이마티닙의 독성 및/또는 해로운 부작용이 임의의 치료상 유익한 효과를 능가하는 CML을 지칭한다.

단백질 티로신 키나제 억제제, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드와 공동 자극 경로 조절제의 상승작용적 조합물은 또한 하나 이상의 부가적인 화합물의 추가를 포함할 수 있으며, 그러한 것으로는 튜불린 안정화제 (예를 들어, 파시탁솔, 에포틸론, 탁산 등); 파르네실 트랜스퍼라제 억제제 (예를 들어, (R)-2,3,4,5-테트라히드로-1-(1H-이미다졸-4-일메틸)-3-(페닐메틸)-4-(2-티에닐술포닐)-1H-1,4-벤조디아제핀-7-카르보니트릴, 히드로클로라이드 염); 또 다른 단백질 티로신 키나제 억제제; N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드의 증가된 투여 빈도 요법; ATP 비-경쟁적 억제제 ONO12380; 오로라 키나제 억제제 VX-680; p38 MAP 키나제 억제제 BIRB-796; 및 본원에서 개시하는 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드를 포함하는 임의의 다른 조합물 또는 투약 요법, 또는 본원에서 개시하는 임의의 다른 조합물이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

"파르네실 트랜스퍼라제 억제제"은 파르네실 트랜스퍼라제를 억제하는 임의의 화합물 또는 분자일 수 있다. 파르네실 트랜스퍼라제 억제제는 화학식 II, (R)-2,3,4,5-테트라히드로-1-(1H-이미다졸-4-일메틸)-3-(페닐메틸)-4-(2-티에닐술포닐)-1H-1,4-벤조디아제핀-7-카르보니트릴, 히드로클로라이드 염을 가질 수 있다. 하기 화학식 V의 화합물은 비증식성 암 세포를 우선적으로 사멸시키는 것으로 알려져 있는 세포독성 FT 억제제이다. 화학식 V의 화합물은 또한 줄기 세포를 사멸시키는데 유용할 수 있다.

<화학식 V>

화학식 V의 화합물, 그의 제조법, 및 그의 용도는 전체 목적상 그 전문이 참고로 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,011,029에 기재되어 있다. 화학식 II의 화합물의 용도는 또한 2004년 2월 19일자로 공개된 WO 2004/015130에 기재되어 있으며, 이는 전체 목적상 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본원에서 사용된 어구 "단백질 티로신 키나제"에는 아데노신 트리포스페이트 (ATP)의 말단 포스페이트를 단백질 기질 내 티로신 잔기로 전달하는 것을 촉매하는 효소가 포함된다. 티로신 키나제의 비제한적인 예에는 수용체 티로신 키나제, 예컨대 EGFR (예를 들어, EGFR/HER1/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), INSR (인슐린 수용체), IGF-IR, IGF-II1R, IRR (인슐린 수용체 관련 수용체), PDGFR (예를 들어, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, VEGFR-1/FLT-1, VEGFR-2/FLK-1/KDR, VEGFR-3/FLT-4, FLT-3/FLK-2, CSF-1R, FGFR 1-4, CCK4, TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, LTK (백혈구 티로신 키나제), ALK (역형성 림프종 키나제), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, 및 RTK 106; 및 비수용체 티로신 키나제, 예컨대 BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, 및 LIMK가 포함된다. 당업자는 본원에서 기재하는 억제제에 의해 표적화될 수 있는 다른 수용체 및/또는 비수용체 티로신 키나제를 알 것이다.

용어 "티로신 키나제 억제제"는 수용체 및/또는 비수용체 티로신 키나제의 선택적 또는 비선택적 억제제로서 작용하는 임의의 다양한 치료제 또는 치료 약물을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 티로신 키나제 억제제는 일반적으로 효소의 ATP-결합 부위에 결합함으로써 표적 티로신 키나제를 억제한다. 본 발명의 방법에 사용하는데 적합한 티로신 키나제 억제제의 예에는, 게피티닙 (이레사®), 수니티닙 (수텐트®; SU11248), 에를로티닙 (타르세바®; OSI-1774), 라파니팁 (GW572016; GW2016), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006), 이마티닙 (글리벡®; STI571), 다사티닙 (BMS-354825), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (작티마®; ZD6474), 닐로티닙, 이들의 유도체, 이들의 유사체 및 이들의 조합이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 사용하는데 적합한 추가의 티로신 키나제 억제제가 예를 들어, 미국 특허 번호 5,618,829, 5,639,757, 5,728,868, 5,804,396, 6,100,254, 6,127,374, 6,245,759, 6,306,874, 6,313,138, 6,316,444, 6,329,380, 6,344,459, 6,420,382, 6,479,512, 6,498,165, 6,544,988, 6,562,818, 6,586,423, 6,586,424, 6,740,665, 6,794,393, 6,875,767, 6,927,293, 및 6,958,340에 기재되어 있다. 당업자는 본 발명의 방법에 사용하는데 적합한 다른 티로신 키나제 억제제를 알 것이다.

대부분의 이들 화학요법제의 안전하고 효과적인 투여 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 그의 투여는 표준 문헌에 기재되어 있다.

예를 들어, 많은 화학요법제의 투여는 문헌 [Physicians' Desk Reference (PDR)], 예를 들어 1996년판 ([Medical Economics Company, Montvale, NJ 07645-1742, USA]에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 추가 성분(들), 예컨대 명반, 안정화제, 항미생물제, 완충제, 착색제, 향미제, 아주반트 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 경구로, 또는 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 직장 및 국소 투여 경로를 비롯하여 비경구로 투여될 수 있다.

경구 사용을 위해, 본 발명의 제약 조성물은 예를 들어 정제 또는 캡슐, 산제, 분산성 과립제 또는 카쉐의 형태로, 또는 수용액 또는 현탁액으로서 투여될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체에는 락토스, 옥수수 전분, 탄산마그네슘, 활석 및 당이 포함되고, 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘이 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 담체에는 락토스, 옥수수 전분, 탄산마그네슘, 활석 및 당이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여를 위해 사용되는 경우, 유화제 및/또는 현탁화제가 일반적으로 첨가된다.

또한, 감미제 및/또는 향미제가 경구 조성물에 첨가될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 사용을 위해, 활성 성분(들)의 멸균 용액이 통상적으로 사용되고, 용액의 pH가 적합하게 조절되고 완충되어야 한다. 정맥내 사용을 위하여, 제제에 등장성을 제공하기 위해서 용질(들)의 총 농도가 제어되어야 한다.

본 발명에 따라 좌제를 제조하기 위하여, 지방산 글리세리드 또는 코코아 버터의 혼합물과 같은 저융점 왁스를 우선 용융시키고, 예를 들어 교반에 의해, 활성 성분을 왁스 내에서 균질하게 분산시킨다. 그 후, 용융된 균질한 혼합물을 통상적인 크기의 몰드에 붓고, 냉각시키고, 이로써 고화시킨다.

액체 제제는 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 이러한 제제의 예로는 비경구 주사용 물 또는 물/프로필렌 글리콜 용액이 있다. 또한, 액체 제제는 비내 투여용 용액을 포함할 수 있다.

흡입용으로 적합한 에어로졸 제제는 불활성 압축 기체와 같은 제약상 허용되는 담체와 조합될 수 있는 용액 및 분말 형태의 고형물을 포함할 수 있다.

또한, 사용 직전에 경구 또는 비경구 투여용 액체 제제로 전환되는 것으로 의도되는 고체 제제가 포함된다. 이러한 액체 형태는, 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다.

본원에서 기재하는 공동 자극 경로 조절제, 바람직하게는 항-CTLA4 작용제는 또한 경피로 전달될 수 있다. 경피 조성물은 크림, 로션, 에어로졸 및/또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 이러한 목적을 위해 당업계에서 통상적인 매트릭스 또는 저장고 유형의 경피 패치 내에 포함될 수 있다.

고정된 용량으로 제제화될 경우, 본 발명의 제약 조합 조성물의 활성 성분은 이하에서 기재하는 투여량 범위 내로 사용된다. 이와 달리, 공동 자극 경로 조절제 및 단백질 티로신 키나제 억제제는 이하에서 기재하는 투여량 범위 내에서 개별적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 공동 자극 경로 조절제는 이하에서 기재하는 투여량 범위 내의 단백질 티로신 키나제 억제제의 투여 이후에, 또는 그와 동시에 이하에서 기재하는 투여량 범위로 투여된다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 바람직한 치료 조합물 및 예시적 투여량을 이하에서 기재한다.

상기 표는 본 발명의 제약 조성물을 제제화할 경우의 단백질 티로신 키나제 억제제, 바람직하게는 스프리셀®, 공동 자극물질 경로 조절제, 바람직하게는 항-CTLA4 항체, 및/또는 항암 백신제의 예시적인 투여량 범위를 제공하지만, 임상의는 치료하고자 하는 환자의 상태에 의해 정당화되는 바람직한 투여량을 이용할 수 있다. 항-CTLA4 항체는 바람직하게는 약 0.3-10 mg/kg 또는 최대 허용 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA-4 항체의 투여량은 약 3주마다 투여된다. 별법적으로, CTLA-4 항체는 약 3 mg/kg의 CTLA-4 항체의 제1 투여량, 약 5 mg/kg의 CTLA-4 항체의 제2 투여량 및 약 9 mg/kg의 CTLA-4 항체의 제3 투여량의 투여를 포함하는 상승 투여 요법에 의해 투여될 수 있다.

유사하게, 단백질 티로신 키나제 억제제, 바람직하게는 스프리셀®은 바람직하게는 70 mg으로 하루에 약 2회 투여될 수 있다. 별법적으로, 이는 예를 들어, 약 50, 약 70, 약 90, 약 100, 110, 또는 120 BID, 또는 100, 140, 또는 180으로 매일 1회, 또는 최대 허용 용량으로 투약될 수 있다. 단백질 티로신 키나제 억제제의 용량은 질환 단계, 표적화된 단백질 티로신 키나제에서의 하나 이상의 돌연변이의 존재, BCR-ABL 돌연변이 등을 비롯한 다수의 인자에 의존적일 수 있다. 이같은 하나 이상의 인자의 존재를 기초로 하여 투여되어야 하는 특정 용량은 당업자의 기술 범위 내에 있다.

유사하게, 에토포시드는 바람직하게는 하루에 약 50 mg 내지 약 900 mg으로 투여될 수 있다. 에토포시드는 100 mg 에토포시드와 동등한 에토포시드 포스페이트, 32.7 mg 시트르산나트륨 USP, 및 300 mg 덱스트란 40을 함유하는 단일 용량 바이알 내의 멸균 동결건조물로서 정맥내 주입용으로 이용가능하다. 별법적으로, 이는 하루에 예를 들어 약 50, 약 70, 약 90, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800 또는 약 900으로, 또는 최대 허용 용량으로 투약될 수 있다.

유사하게, 겜시타빈은 바람직하게는 30 내지 90 분에 걸친 IV 주입에 의해 하루에 약 200 mg/m 내지 약 1250 mg/m으로 투여될 수 있다. 겜시타빈은 멸균 동결건조된 분말로서 만니톨 (각각 200 mg 또는 1 g) 및 아세트산나트륨 (각각 12.5 mg 또는 62.5 mg)과 함께 제제화된 약 200 mg 내지 약 1250 mg의 겜시타빈 HCl (유리 염기로서 표출됨)을 함유하는 정맥내 주입용으로 이용가능하다. 별법적으로, 이는 하루에 예를 들어, 약 50, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1100, 약 1200 또는 약 1250으로, 또는 최대 허용 용량으로 투약될 수 있다.

본 발명의 조합물은 또한 치료될 상태에 대한 특정 유용성을 위해 선택된 다른 익히 공지된 요법과 함께 사용될 수 있다.

항-CTLA4 항체는 바람직하게는 약 0.3-10 mg/kg 또는 최대 허용 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, CTLA-4 항체의 투여량은 약 3주마다 투여된다. 별법적으로, CTLA-4 항체는 약 3 mg/kg의 CTLA-4 항체의 제1 투여량, 약 5 mg/kg의 CTLA-4 항체의 제2 투여량 및 약 9 mg/kg의 CTLA-4 항체의 제3 투여량의 투여를 포함하는 상승 투여 요법에 의해 투여될 수 있다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 상승 투여 요법은 약 5 mg/kg의 CTLA-4 항체의 제1 투여량 및 약 9 mg/kg의 CTLA-4 항체의 제2 투여량의 투여를 포함한다.

또한, 본 발명은 약 6주마다 CTLA-4 항체의 증가하는 투여량의 투여를 포함하는 상승 투여 요법을 제공한다.

본 발명의 측면에서, 약 3 mg/kg의 제1 CTLA-4 항체 투여량, 약 3 mg/kg의 제2 CTLA-4 항체 투여량, 약 5 mg/kg의 제3 CTLA-4 항체 투여량, 약 5 mg/kg의 제4 CTLA-4 항체 투여량 및 약 9 mg/kg의 제5 CTLA-4 항체 투여량의 투여를 포함하는, 단계적 상승 투여 요법이 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 5 mg/kg의 제1 투여량, 5 mg/kg의 제2 투여량 및 9 mg/kg의 제3 투여량의 투여를 포함하는, 단계적 상승 투여 요법이 제공된다.

사용되는 실제 투여량은 환자의 요구사항 및 치료될 상태의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 특정 상황에 따른 적절한 투여량의 결정은 당업계의 기술 범위 내이다. 일반적으로, 치료는 화합물의 최적의 용량보다 더 적은 투여량으로 개시된다. 이후, 주어진 상황에서 최적의 효과가 달성될 때까지 투여량을 소량씩 증가시킨다. 편의상, 원한다면 총 1일 투여량을 나누어 하루 동안 조금씩 투여할 수 있다. 간헐적 요법 (예를 들어, 3주 중 1주 또는 4주 중 3주)이 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 방법 또는 조성물을 사용하는 경우, 임상 환경에서 종양 성장 또는 전이를 조정하는데 사용되는 기타 작용제, 예컨대 항구토제가 또한 필요에 따라 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 조합물은 치료될 상태에 대한 그의 특정 유용성으로 선택된 다른 익히 공지된 치료제와 공동투여될 수 있다. 별법적으로, 다중 조합 제제가 부적절한 경우, 본 발명의 조합물은 공지된 제약상 허용되는 작용제(들)와 함께 순차적으로 사용될 수 있다.

화학요법제(들) 및/또는 방사선요법은 당업계에 익히 공지된 치료 프로토콜에 따라 투여될 수 있다. 화학요법제(들) 및/또는 방사선요법의 투여가 치료될 질환 및 상기 질환에 대한 화학요법제(들) 및/또는 방사선요법의 공지된 효과에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 숙련 임상의의 지식에 따라, 치료 프로토콜 (예를 들어, 투여량 및 투여 시간)은 환자에 대한 투여되는 치료제 (즉, 항-CTLA4 작용제(들) 및 단백질 티로신 키나제 억제제)의 관찰되는 효과, 및 투여되는 치료제에 대한 질환의 관찰되는 반응에 비추어 달라질 수 있다.

본 발명의 방법에서, 단백질 티로신 키나제 억제제, 예컨대 다사티닙, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드는 항-CTLA4 작용제와 동시에 또는 순차적으로 (이전 또는 이후) 투여된다. 따라서, 항-CTLA4 치료제(들) 및 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드를 동시에 또는 본질적으로 동시에 투여하는 것은 필수적인 것은 아니다. 동시 또는 본질적으로 동시 또는 순차 (이전 또는 이후) 투여의 장점은 숙련된 임상의의 결정 내에 있다.

또한 본 발명에 포함되는 추가의 조합물에는, 겜시타빈 + 시스플라틴 + 이필리무맙; 이필리무맙 + 카르보플라틴 + 파클리탁셀; 이필리무맙 + 에토포시드 + 시스플라틴 또는 카르보플라틴; 이필리무맙 + pem (시스플라틴, 에토포시드 및 미토마이신) + 시스플라틴이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이들 조합물은 순차적으로 (서로간 이전 또는 이후에), 동시에, 또는 숙련된 전문의가 권유하는 임의의 순서로 투여할 수 있다.

또한, 일반적으로, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드 및 항-CTLA4 작용제(들)는 동일한 제약 조성물로 투여되어야 하는 것은 아니며, 상이한 물리적 및 화학적 특성으로 인해, 상이한 경로로 투여되어야 할 수 있다.

미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드 및 항-CTLA4 작용제(들)가 동시에 또는 본질적으로 동시에 투여되지 않는 경우, 단백질 티로신 키나제 억제제, 예컨대 다사티닙, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드 및 항-CTLA4 작용제(들)의 처음 투여 순서는 다양할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드가 처음 투여되고, 이어서 항-CTLA4 작용제(들)가 투여될 수 있거나; 또는 항-CTLA4 작용제(들)가 먼저 투여되고, 이어서 단백질 티로신 키나제 억제제, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드가 투여될 수 있다. 이렇게 번갈아서 하는 투여는 단일 치료 프로토콜 동안 반복될 수 있다. 투여 순서의 결정, 및 치료 프로토콜 동안의 각 치료제의 투여 반복 횟수는 치료하고자 하는 질환 및 환자 상태를 평가한 숙련된 의사의 지식 범위 내에 있다.

따라서, 경험 및 지식에 따라, 개업의는 치료를 진행함에 따라서 개별 환자의 필요에 따른 치료의 성분 (치료제 - 즉, 단백질 티로신 키나제 억제제, 예컨대 다사티닙, 미세소관 안정화제, 예컨대 파클리탁셀; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 DNA 이중 가닥 유도제, 예컨대 에토포시드, 항-CTLA4 작용제(들))의 투여를 위해 각 프로토콜을 변형시킬 수 있다.

담당 임상의는 투여된 투여량의 처치가 효과적인지 여부를 판단할 때 환자의 일반적인 웰빙(well-being) 뿐만 아니라 질환-관련 증상의 경감, 종양 성장의 억제, 종양의 실제 수축, 또는 전이의 억제와 같은 보다 뚜렷한 징후를 고려할 것이다. 종양의 크기는 표준 방법, 예컨대 방사선 연구, 예를 들어 CAT 또는 MRI 스캔으로 측정될 수 있고, 연속적인 측정치를 이용하여 종양의 성장이 지연되었거나 심지어 역전되었는지 아닌지의 여부를 판단할 수 있다. 질환-관련 증상, 예컨대 통증의 경감, 및 전반적인 상태에서의 개선 역시 치료 효과를 판단하는데 도움을 줄 수 있다.

본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 단백질 티로신 키나제 억제제의 최적 용량은 표적화된 단백질 티로신 키나제 억제제 및/또는 BCR-ABL에서의 하나 이상의 돌연변이의 존재 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아님)를 비롯한 수많은 인자에 따라 달라질 수 있다.

돌연변이체 BCR-ABL 키나제의 억제제의 "치료 유효량"은 돌연변이 존재의 함수일 수 있다. 예를 들어, 사흐(Shah) 등은 BCR-ABL 키나제에 특정 돌연변이를 갖는 세포주가 다른 BCR-ABL 키나제 돌연변이를 갖는 세포주에 비해 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드에 대해 보다 민감함을 개시하였다. 예를 들어, BCR-ABL 키나제에서 F317L 돌연변이를 포함하는 세포는 F317I 돌연변이를 발현하는 세포주에 비해 3 내지 5배의 더 높은 농도의 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드를 요구할 수 있다. 당업자는 돌연변이체 BCR-ABL 키나제 세포의 민감도에 있어서의 차이를 인식하여 치료 유효 용량을 결정할 것이다.

야생형 BCR-ABL 키나제와 비교하여 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드에 대한 BCR-ABL 키나제 돌연변이체의 상대적 민감도를 기초로 하여 정당화될 수 있는 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드의 치료 유효 용량의 예는 세포 증식, BCR-ABL 티로신 인산화, 펩티드 기질 인산화, 및/또는 자가인산화 검정을 비롯한 다양한 시험관내 생화학적 검정을 이용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드의 대략적인 치료 유효 용량은 전형적인 용량에, 각각의 BCR-ABL 키나제 돌연변이체에 대한 임의의 하나 이상의 이들 검정에서의 민감도에 있어서의 배수 변화를 곱하는 것을 기초로 계산할 수 있다. 전체 목적상 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [O'Hare et al., (Cancer Res., 65(11):4500-4505 (2005)]에서는 몇몇 임상적으로 관련이 있는 BCR-ABL 키나제 돌연변이체를 이용하여 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드의 상대적인 민감도에 대한 분석을 수행하였다. 예를 들어, E255V 돌연변이체는 GST-Abl 키나제 검정에서 배수 변화가 "1"이었고, 반면에 세포 증식 검정에서는 동일한 돌연변이체의 배수 변화가 "14"였다. 따라서, 이러한 돌연변이를 보유한 환자에 대한 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드의 치료상 적절한 용량은 예를 들어 전형적인 용량 보다 1 내지 14배 더 높은 범위일 수 있다. 따라서, 임의의 BCR-ABL 키나제 돌연변이체에 대한 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드의 치료상 적절한 용량은, 예를 들어 처방된 용량 보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 또는 300배 더 높을 수 있다. 이와 달리, N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드의 치료상 적절한 용량은, 예를 들어 처방된 용량의 0.9x, 0.8x, 0.7x, 0.6x, 0.5x, 0.4x, 0.3x, 0.2x, 0.1x, 0.09x, 0.08x, 0.07x, 0.06x, 0.05x, 0.04x, 0.03x, 0.02x, 또는 0.01x 일 수 있다.

문헌 [O'Hare et al.]에 따르면, M244V 돌연변이체는 GST-Abl 키나제 검정에서 배수 변화가 "1.3"이고, 자가인산화 검정에서는 배수 변화가 "1.1"이고, 세포 증식 검정에서 배수 변화가 "2"이며; G250E 돌연변이체는 GST-Abl 키나제 검정에서 배수 변화가 "0.5"이고, 자가인산화 검정에서는 배수 변화가 "3"이고, 세포 증식 검정에서 배수 변화가 "2"이며; Q252H 돌연변이체는 세포 증식 검정에서 배수 변화가 "4"이고; Y253F 돌연변이체는 GST-Abl 키나제 검정에서 배수 변화가 "0.6"이고, 자가인산화 검정에서는 배수 변화가 "4"이며, 세포 증식 검정에서 배수 변화가 "4"이고; Y253H 돌연변이체는 GST-Abl 키나제 검정에서 배수 변화가 "3"이고, 자가인산화 검정에서는 배수 변화가 "2"이며, 세포 증식 검정에서 배수 변화가 "2"이고; E255K 돌연변이체는 GST-Abl 키나제 검정에서 배수 변화가 "0.3"이고, 자가인산화 검정에서는 배수 변화가 "2"이며, 세포 증식 검정에서 배수 변화가 "7"이고; F317L 돌연변이체는 GST-Abl 키나제 검정에서 배수 변화가 "1.5"이고, 자가인산화 검정에에서는 배수 변화가 "1.4"이며, 세포 증식 검정에서 배수 변화가 "9"이고; M351T 돌연변이체는 GST-Abl 키나제 검정에서 배수 변화가 "0.2"이고, 자가인산화 검정에서는 배수 변화가 "2"이며, 세포 증식 검정에서 배수 변화가 "1.4"이고; F359V 돌연변이체는 GST-Abl 키나제 검정에서 배수 변화가 "0.8"이고, 자가인산화 검정에서는 배수 변화가 "2"이며, 세포 증식 검정에서 배수 변화가 "3"이며; H396R 돌연변이체는 GST-Abl 키나제 검정에서 배수 변화가 "1.3"이고, 자가인산화 검정에서는 배수 변화가 "3"이며, 세포 증식 검정에서 배수 변화가 "2"이다.

T315I 돌연변이를 단독으로 또는 본원에서 개시하는 또 다른 BCR-ABL 돌연변이와 함께 보유하는 환자의 경우, 보다 높은 용량의 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드, 또는 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드 및 이마티닙의 조합물; N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드 및 튜불린 안정화제 (예를 들어, 파시탁솔, 에포틸론, 탁산 등)의 조합물; N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드 및 파르네실 트랜스퍼라제 억제제의 조합물; N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드 및 또 다른 단백질 티로신 키나제 억제제의 조합물; 본원에서 개시하는 임의의 다른 조합물의 투여; N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드의 증가된 투여 빈도 요법; 및 본원에서 개시하는 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드를 포함하는 임의의 다른 조합물 또는 투약 요법이 정당화될 수 있다. 이와 달리, N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드와 T315I 억제제의 조합물이 또한 정당화될 수 있다.

본 발명을 수행하는데 유용한 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-[[6-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-메틸-4-피리미디닐]아미노]-5-티아졸카르복스아미드를 수반하는 투여 요법은 전체 목적상 그 번문이 본원에 참고로 포함되는 2003년 3월 24일자로 출원된 미국 연속 번호 10/395,503; 및 문헌 [Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2004, Volume 104: Abstract 20, "Hematologic and Cytogenetic Responses in imatinib-Resistant Accelerated and Blast Phase Chronic Myeloid Leukemia (CML) Patients Treated with the Dual SRC/ABL Kinase Inhibitor N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazolecarboxamide: Results from a Phase I Dose Escalation Study", by Moshe Talpaz, et al.]에 기재되어 있다.

추가의 항-CTLA4 조성물

본 발명은 또한 항-CTLA-4 항체, 항-CTLA-4 애드넥틴, 항-CTLA-4 RNAi, 단일 쇄 항-CTLA-4 항체 단편, 도메인 항-CTLA-4 항체 단편, 및 항-CTLA-4 안티센스 분자를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아닌 추가의 항-CTLA-4 작용제를 포함한다.

바람직한 본 발명의 항-CTLA4 작용제는 항-CTLA4 항체 이필리무맙이다. 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 또는 CTLA4 변이체, 및/또는 CTLA4의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 다른 항-CTLA4 항체 및 단편 (특이적 항체-항원 결합을 검정하기 위해 당업계에 널리 공지되어 있는 면역검정에 의해 결정됨)이 본 발명에 포함된다. 항체에는 폴리클로날, 모노클로날, 1가, 이중특이적, 이종접합체, 다중특이적, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체를 포함) 및 상기 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는, 이뮤노글로불린 분자 및 이뮤노글로불린 분자의 면역적으로 활성인 부분, 즉 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 본 발명의 이뮤노글로불린 분자는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 또한, 용어 "항체" (Ab) 또는 "모노클로날 항체" (Mab)는 무손상 분자, 뿐만 아니라 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편 (예컨대, 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편)을 포함하는 것으로 의도된다. Fab 및 F(ab')2 단편은 무손상 항체의 Fc 단편이 결여된 것으로, 동물 또는 식물의 순환계에서 보다 신속하게 소실되고, 무손상 항체에 비해 비-특이적인 조직 결합이 덜할 수 있다 (문헌 [Wahl et al., J. Nucl. Med., 24:316-325 (1983)]). 따라서, 이들 단편, 및 또한 FAB 또는 다른 이뮤노글로불린 발현 라이브러리의 생성물이 바람직하다. 또한, 항-CTLA4 항체는 키메라, 단일 쇄, 및 인간화 항체를 포함한다.

항-CTLA4 항체는 항체 합성법에 대해 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법, 특히 화학적 합성법, 또는 바람직하게는 재조합 발현 기술에 의해 생산될 수 있다.

본 발명의 애드넥틴은 공동 소유인 미국 공보 번호 2007/0082365 및 2008/0139791에 개략되어 있는 방법에 따라 제조할 수 있다.

단일 쇄 항체의 생산에 대해 기재된 기술 (미국 특허 번호 4,946,778; 문헌 [Bird, Science, 242:423-442 (1988)]; [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)]; 및 [Ward et al., Nature, 334:544-554 (1989)])을 변형하여 단일 쇄 항체를 생산할 수 있다. 단일쇄 항체는 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 아미노산 가교를 통해 연결시켜 단일 쇄 폴리펩티드를 생성함으로써 형성한다. 이. 콜라이에서 기능적 Fv 단편을 어셈블리하기 위한 기술을 또한 사용할 수 있다 (문헌 [Skerra et al., Science, 242:1038-1041 (1988)]).

항-CTLA4 항체, 또는 그의 단편, 유도체 또는 유사체 (예를 들어, 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 본 발명의 단일 쇄 항체)의 재조합 발현은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구축을 필요로 한다. 항-CTLA4 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 일부 (바람직하게는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 함유함)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 당업계에 널리 공지되어 있는 기술을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 항-CTLA4 항체 분자를 생산하기 위한 벡터를 생성할 수 있다. 따라서, 항체 코딩 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 단백질을 제조하는 방법을 본원에서 기재한다. 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법에는, 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 항-CTLA4 항체, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 이같은 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고 (예를 들어, PCT 공보 번호 WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국 특허 번호 5,122,464 참조), 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위한 이같은 벡터로 클로닝될 수 있다.

발현 벡터는 통상의 기술에 의해 숙주 세포로 전달되고, 이어서 형질감염된 세포는 통상의 기술에 의해 배양되어 항-CTLA4 항체를 생산한다. 따라서, 본 발명은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 항-CTLA4 항체, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄, 또는 본 발명의 단일 쇄 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 이중 가닥 항체의 발현을 위한 바람직한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 코딩하는 벡터는 이하에서 상술하는 바와 같이, 전체 이뮤노글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포 내에서 공동 발현될 수 있다.

다양한 숙주 발현 벡터 시스템을 이용하여 항-CTLA4 항체 분자를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심있는 코딩 서열을 생성시킨 다음 후속 정제시킬 수 있는 비히클을 나타낼 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염시킨 경우에, 계내에서 본 발명의 항체 분자를 발현시킬 수 있는 세포를 나타낸다. 그러한 것으로는 미생물, 예컨대 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이, 비. 서브틸리스(B. subtilis)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV); 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)가 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 박테리아 세포, 예컨대 에스케리키아 콜라이, 및 보다 바람직하게는, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현을 위해 사용된다. 예를 들어, 인간 시토메갈로바이러스로부터의 주요 초기 매개 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 연계된 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)가 효과적인 항체 발현 시스템이다 (문헌 [Foecking et al., Gene, 45:101 (1986)]; [Cockett et al., Bio/Technology, 8:2 (1990)]).

박테리아 시스템에서, 발현될 항체 분자에 대해 의도된 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자를 포함하는 제약 조성물의 제조를 위해 많은 양의 단백질이 생성되어야 하는 경우, 용이하게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터에는 이. 콜라이 발현 벡터 pUR278 (문헌 [Ruther et al., EMBO J., 2:1791 (1983)]) (여기서, 항체 코딩 서열을 lac Z 코딩 영역과 함께 인 프레임으로 벡터에 개별적으로 라이게이션시켜 융합 단백질을 생성할 수 있음); pIN 벡터 (문헌 [Inouye et al., Nucleic Acids Res., 13:3101-3109 (1985)]; [Van Heeke et al., J. Biol. Chem., 24:5503-5509 (1989))]; 등이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, pGEX 벡터를 사용하여 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착 및 결합에 이어 유리 글루타티온의 존재하의 용리에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.

곤충 시스템에서는, 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다면증 바이러스 (AcNPV)를 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용할 수 있다. 이 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열을 바이러스의 비-필수 영역 (예를 들어, 폴리헤드린 유전자) 내로 개별적으로 클로닝시키고, AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 위치시킬 수 있다.

포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템을 사용할 수 있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로서 사용하는 경우, 항-CTLA4 항체 코딩 서열을 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 3분된 리더 서열에 라이게이션시킬 수 있다. 이러한 키메라 유전자를 이어서 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입시킬 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역 (예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에의 삽입은 감염된 숙주 내에서 생육가능하고 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 생성할 것이다. (예를 들어, 문헌 [Logan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:355-359 (1984)] 참조). 삽입된 항체 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 또한 특정 개시 신호가 필요할 수 있다. 이러한 신호에는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 포함된다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역이 보장되도록 목적하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 같은 상 내에 존재하여야 한다. 이러한 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 다양한 기원 (천연 및 합성 둘 모두)의 것일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결인자 등을 포함시켜 증강시킬 수 있다 (문헌 [Bitter et al., Meth. Enzymol., 153:516-544 (1987)] 참조).

또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 유전자 생성물을 목적하는 특이적 방식으로 변형시키고 프로세싱하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 이러한 단백질 생성물의 변형 (예를 들어 글리코실화) 및 프로세싱 (예를 들어 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 해독 후 프로세싱과 변형에 대해 특징적이면서도 특이적인 메카니즘을 갖고 있다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형과 프로세싱을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이를 위하여, 일차 전사체의 적절한 프로세싱, 유전자 생성물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포성 기구를 보유하고 있는 진핵성 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포에는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, 및 특히, 유방암 세포주, 예컨대, 예를 들어 BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, 및 정상 유선 세포주, 예컨대, 예를 들어 CRL7030 및 Hs578Bst가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

재조합 단백질을 장기간 고 수율로 생성시키기 위해서는, 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항-CTLA4 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스성 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 숙주 세포를 적절한 발현 제어 요소 (예를 들어 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등), 및 선별성 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입 이후, 조작된 세포를 보강 배지 중에서 1 내지 2 일 동안 성장시키고, 그 후 선택 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드 내의 선별성 마커는 선별에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그의 염색체 내로 안정적으로 통합시켜 성장하여 집락을 형성하도록 하며, 이는 궁극적으로 클로닝되어 세포주를 증식시킬 수 있다. 이러한 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 특히 항-CTLA4 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에 유용할 수 있다.

다양한 선별 시스템을 사용할 수 있으며, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (문헌 [Wigler et al., Cell, 11:223 (1977)]), 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (문헌 [Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202 (1992)]), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (문헌 [Lowy et al., Cell, 22:817 (1980)]) 유전자를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 것을 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 각각 사용할 수 있다. 또한, 항대사물 내성을 하기 유전자에 대한 선별의 기초로 이용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (문헌 [Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357 (1980)]; [O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527 (1981)]); 미코페놀산에 대해 내성을 부여하는 gpt (문헌 [Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072 (1981)]); 아미노글리코시드 G-418에 대해 내성을 부여하는 neo (문헌 [Clinical Pharmacy, 12(7):488-505 (1993)); [Wu et al., Biotherapy, 3:87-95 (1991)]; [Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596 (1993)]; [Mulligan, Science, 260:926-932 (1993)]; 및 [Morgan et al., Ann. Rev. Biochem., 62:191-217 (1993)]; [TIB TECH, 11(5):155-215 (May 1993)]); 및 히그로마이신에 대해 내성을 부여하는 hygro (문헌 [Santerre et al., Gene, 30:147 (1984)]). 재조합 DNA 기술로 당업계에 흔히 공지되어 있는 방법을 통상적으로 적용하여 목적하는 재조합 클론을 선별할 수 있으며, 이같은 방법은 그 전문이 본원에 참고로 포함되는, 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]; 및 [Chapters 12 and 13, Dracopoli et al., eds., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)]; [Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)]에 기재되어 있다.

항-CTLA4 항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다 (검토를 위해, 문헌 [Bebbington et al., "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" in DNA Cloning, Vol. 3, Academic Press, NY (1987)] 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포 배양물에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 관련이 있기 때문에, 항체의 생성 또한 증가할 것이다 (문헌 [Crouse et al., Mol. Cell. Biol., 3:257 (1983)]).

숙주 세포를 두 가지 발현 벡터로 공동-형질감염시킬 수 있는데, 제1 벡터는 중쇄 유래의 폴리펩티드를 코딩하고 제2 벡터는 경쇄 유래의 폴리펩티드를 코딩한다. 이들 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 등가 발현시켜 줄 수 있는 동일한 선별성 마커를 함유할 수 있다. 또 다른 한편, 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 코딩하고 발현할 수 있는 단일 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 상황에서는, 경쇄를 중쇄 앞에 위치시켜 독성 무함유 중쇄의 과잉을 피해야 한다 (문헌 [Proudfoot, Nature, 322:52 (1986)]; [Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2197 (1980)]). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.

일단 본 발명의 항체 분자가 동물에 의해 생성되거나, 화학적으로 합성되거나 또는 재조합적으로 발현되면, 이를 이뮤노글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 다음의 특이적 항원에 대한 친화성, 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도, 또는 단백질을 정제하기 위한 기타 임의의 표준 기술에 의해 정제할 수있다. 또한, 항-CTLA4 항체 또는 그의 단편을 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 이종 폴리펩티드 서열과 융합시켜 정제를 촉진시킬 수 있다.

본 발명은 추가로 폴리펩티드를 포함하거나 가변 영역 이외의 항-CTLA4 항체 도메인에 접합된 조성물을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드를 항체 Fc 영역 또는 그의 일부와 융합시키거나 또는 그에 접합시킬 수 있다. 폴리펩티드에 융합된 항-CTLA4 항체 부분은 불변 영역, 힌지 영역, CH1 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인 또는 전체 도메인 또는 그의 일부의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩티드를 상기 항체 부분에 융합시키거나 접합시켜 다량체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 Fc 부분은 Fc 부분 간의 디술피드 결합을 통해 이량체를 형성할 수 있다. 보다 다량체인 형태는 폴리펩티드를 IgA 및 IgM의 일부와 융합시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 항체 부분과 융합 또는 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 및 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; PCT 공보 번호 WO 96/04388 및 WO 91/06570; 문헌 [Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10535-10539 (1991)]; [Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600 (1995)]; 및 [Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341(1992)]을 참조한다 (상기 참조문헌들은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨).

또한, 항-CTLA4 항체 또는 그의 단편을 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 예를 들어, 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예를 들어, 알파-방사체, 예컨대, 예를 들어, 213Bi에 접합시킬 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 임의의 작용제를 포함한다. 예로는 파클리탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 치료제에는 항대사물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 접합체는 당해 생물학적 반응을 변형시키는데 사용될 수 있으며, 치료제 또는 약물 모이어티는 전형적인 화학적 치료제로 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질에는, 예를 들어 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스제, 예를 들어 TNF-알파, TNF-베타, AIM I (PCT 공보 번호 WO 97/33899 참조), AIM II (PCT 공보 번호 WO 97/34911 참조), Fas 리간드 (문헌 [Takahashi et al., Int. Immunol., 6:1567-1574 (1994)]), VEGI (PCT 공보 번호 WO 99/23105 참조); 혈전제 또는 항-혈관형성제, 예를 들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 생물학적 반응 변형제, 예컨대 림포킨, 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 다른 성자 인자가 포함될 수 있다.

이같은 치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al., eds., pp. 243-256, Alan R. Liss, Inc (1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies for Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., pp. 623-653, Marcel Dekker, Inc (1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al., eds., pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al., eds., pp. 303-316, Academic Press (1985)], 및 [Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-158 (1982)]을 참조한다.

별법적으로, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 번호 4,676,980 (Segal)에 기재되어 있는 바와 같이, 항-CTLA4 항체를 제2 항체에 접합시켜 항체 이종접합체를 형성할 수 있다.

치료 모이어티가 접합되었거나 접합되지 않은 항-CTLA4 항체를 단독으로 또는 세포독성 인자(들) 및/또는 시토카인(들)과 함께 투여하여 치료제로서 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대해 지시된 합성 항체의 제조를 포함한다. 합성 항체의 한 예가 문헌 [Radrizzani, M., et al., Medicina (Aires), 59(6):753-758, (1999)]에 기재되어 있다. 최근, 새로운 클래스의 합성 항체가 기재된 바 있으며, 분자 각인 고분자 (MIP) (세모렉스, 인크.(Semorex, Inc.))라 불린다. 항체, 펩티드 및 효소가 화학 및 생물학적 센서의 분자 인식 요소로서 종종 사용된다. 그러나, 이들은 안정성 및 신호 전달 메카니즘이 결여되어 있어 감지 장치로서 사용하는데 한계가 있다. 분자 각인 고분자 (MIP)는 생물학적 수용체의 기능은 모방할 수 있지만, 안정성 제약은 덜하다. 이같은 고분자는 우수한 열적 및 물리적 안정성을 유지하면서 높은 민감도 및 선택성을 제공한다. MIP는 소분자에 결합할 수 있고, 천연 항체의 그것과 동일하거나 더 높은 효능으로 유기 분자 및 단백질 분자와 같은 분자를 표적으로 할 수 있다. 이러한 "슈퍼" MIP는 그의 표적에 대해 보다 높은 친화도를 가지므로, 효과적인 결합에 보다 낮은 농도가 요구된다.

합성하는 동안, MIP는 표적 분자 그 자체 (예컨대 폴리펩티드, 항체 등) 또는 그의 "프린트" 또는 "주형"으로서 매우 유사한 구조를 갖는 물질을 이용함으로써 선택된 표적의 보완적인 크기, 형상, 전하 및 관능기를 갖도록 각인된다. MIP는 항체를 수득할 때와 동일한 시약에 의해 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 형광 '슈퍼' MIP를 고감도의 분리 또는 검정에서 사용하기 위해, 또는 단백질의 고처리량 스크리닝에서 사용하기 위해 비드 또는 웰에 코팅시킬 수 있다.

다양한 방법을 이용하여 특정 수용체, 리간드, 폴리펩티드, 펩티드, 유기 분자에 대한 MIP를 제작할 수 있다. 몇몇 바람직한 방법들이 문헌 [Esteban et al., in J. Analytical Chem., 370(7):795-802 (2001)]에 기재되어 있고, 상기 문헌은 거기에서 언급된 임의의 참고문헌들에 더하여 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 추가의 방법들이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Hart, B.R. et al., J. Am. Chem. Soc., 123(9):2072-2073 (2001)]; 및 [Quaglia, M. et al., J. Am. Chem. Soc., 123(10):2146-2154 (2001)]와 같은 것들이 본 발명에 포함된다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 RNA는 문헌 [Paddison et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 99:1443-1448 (2002)]; 및 PCT 공보 번호 WO 01/29058, 및 WO 99/32619의 교시내용에 기초하여 설계할 수 있고, 상기 문헌들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

이중 가닥 RNA는 또한 RNA 억제제 ("RNAi")의 형태를 취할 수 있고, 따라서 이는 RNA 간섭에 능숙하다. 예를 들어, 항-CTLA4 RNAi 분자는 멜로(Mello) 및 파이어(Fire)의 PCT 공보 번호 WO 1999/032619 및 WO 2001/029058; 미국 공보 번호 2003/0051263, 2003/0055020, 2003/0056235, 2004/265839, 2005/0100913, 2006/0024798, 2008/0050342, 2008/0081373, 2008/0248576, 및 2008/055443; 및/또는 미국 특허 번호 6,506,559, 7,282,564, 7,538,095, 및 7,560,438에 기재되어 있는 분자의 형태를 취할 수 있다. 상기 특허 및 특허 출원의 교시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

예를 들어, 항-CTLA4 RNAi 분자는 이중 가닥 RNA이며, 길이가 약 25 내지 400 뉴클레오티드이고, CTLA4의 코딩 뉴클레오티드 서열에 상보적일 수 있다. 이같은 RNAi 분자는 길이가 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 45, 및 약 50 뉴클레오티드일 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "약"은 5' 또는 3' 방향, 또는 둘 모두로 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 뉴클레오티드 더 긴 것으로 해석된다.

이와 달리, 본 발명의 항-CTLA4 RNAi 분자는 크레우체르(Kreutzer)의 유럽 특허 번호 EP 1144639, 및 EP 1214945에 기재되어 있는 이중 가닥 RNAi 분자의 형태를 취할 수 있다. 상기 특허 및 특허 출원의 교시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 구체적으로, 본 발명의 항-CTLA4 RNAi 분자는 CTLA4의 코딩 영역에 상보적인 이중 가닥 RNA일 수 있으며, 길이가 약 15 내지 약 49 뉴클레오티드, 바람직하게는 길이가 약 15 내지 약 21 뉴클레오티드이다. 이와 관련하여, 용어 "약"은 5' 또는 3' 방향, 또는 둘 모두로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드 더 긴 것으로 해석된다. 이같은 항-CTLA-4 분자는 단일 RNA 가닥의 화학적 연결에 의해 안정될 수 있다.

이와 달리, 본 발명의 항-CTLA4 RNAi 분자는 투츨(Tuschl)의 유럽 특허 번호 EP 1309726에 기재되어 있는 이중 가닥 RNAi 분자의 형태를 취할 수 있다. 상기 특허 및 특허 출원의 교시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 구체적으로, 본 발명의 항-CTLA4 RNAi 분자는 CTLA4의 코딩 영역에 상보적인 이중 가닥 RNA일 수 있으며, 길이가 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드이고, 블런트 말단을 가지거나 또는 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단 중 한쪽 또는 양쪽 상에 하나 이상의 오버행을 함유한다 (각각의 오버행은 길이가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 뉴클레오티드임). 각 가닥의 말단은 인산화, 히드록실화, 또는 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 또한, 하나 이상의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결도 변형될 수 있으며, 2'-OH를 함유할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "약"은 5' 또는 3' 방향, 또는 둘 모두로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드 더 긴 것으로 해석된다. 이같은 항-CTLA-4 분자는 단일 RNA 가닥의 화학적 연결에 의해 안정될 수 있다.

이와 달리, 본 발명의 항-CTLA4 RNAi 분자는 투츨의 미국 특허 번호 7,056,704 및 7,078,196에 기재되어 있는 이중 가닥 RNAi 분자의 형태를 취할 수 있다. 상기 특허 및 특허 출원의 교시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 구체적으로, 본 발명의 항-CTLA4 RNAi 분자는 CTLA4의 코딩 영역에 상보적인 이중 가닥 RNA일 수 있으며, 길이가 약 19 내지 약 25 뉴클레오티드이고, 블런트 말단을 가지거나 또는 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단 중 한쪽 또는 양쪽 상에 하나 이상의 오버행을 함유한다 (각각의 오버행은 길이가 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 그 이상의 뉴클레오티드임). 각 가닥의 말단은 인산화, 히드록실화, 또는 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 또한, 하나 이상의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결도 변형될 수 있으며, 2'-OH를 함유할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "약"은 5' 또는 3' 방향, 또는 둘 모두로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드 더 긴 것으로 해석된다. 이같은 항-CTLA-4 분자는 단일 RNA 가닥의 화학적 연결에 의해 안정될 수 있다.

추가로, 본 발명의 항-CTLA4 RNAi 분자는 크루케(Crooke)의 미국 특허 번호 5,898,031, 6,107,094, 7,432,249, 및 7,432,250, 및 유럽 출원 번호 EP 0928290에 기재되어 있는 RNA 분자의 형태를 취할 수 있다. 상기 특허 및 특허 출원의 교시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 구체적으로, 항-CTLA4 분자는 비변형된 올리고리보뉴클레오티드의 RNA 표적에 대한 결합 친화도와 비교했을 때 미리 선택된 RNA 표적에 대한 상기 화합물의 결합 친화도가 개선되도록 변형된 적어도 하나의 리보푸라노실 뉴클레오시드 서브유닛을 갖는 제1 절편; 및 2'-히드록실 모이어티를 갖는 적어도 4개의 연속적인 리보푸라노실 뉴클레오시드 서브유닛을 포함하는 제2 절편을 함유하는 단일 가닥 RNA일 수 있고; 상기 올리고머 화합물의 상기 뉴클레오시드 서브유닛은 포스포디에스테르 연결에 비해 분해로부터 안정하도록 변형된 뉴클레오시드간 연결에 의해 연결된다. 바람직하게는, 이같은 RNA 분자는 길이가 약 15 내지 25 뉴클레오티드, 또는 길이가 약 17 내지 약 20 뉴클레오티드이다. 바람직하게는 이같은 분자는 CTLA4 RNA의 절단을 야기하는 이중 가닥 RNAse 효소를 활성화시키는데 유능하다. 이와 관련하여, 용어 "약"은 5' 또는 3' 방향, 또는 둘 모두로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드 더 긴 것으로 해석된다. 이같은 항-CTLA-4 분자는 단일 RNA 가닥의 화학적 연결에 의해 안정될 수 있다.

본 발명에서는 SiRNA 시약이 특히 고려된다. 이같은 시약은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제시키는데 유용하며, 치료 효능을 가질 수 있다. siRNA 시약을 투여하는 것에 의해 장애를 치유적으로 치료하는 몇몇 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이같은 방법 중 한 가지는 문헌 [Tiscornia et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 100(4):1844-1848 (2003)]; 2003년 7월 18일자로 출원된 WO 04/09769; 및 문헌 [Reich, S.J. et al., Mol. Vis., 9:210-216 (May 30, 2003)]에 기재되어 있고, 이들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 추가 이해를 용이하게 하기 위해, 주로 보다 구체적인 본 발명의 세부사항을 예시하기 위한 목적으로 하기 실시예가 제공된다. 본 발명의 범위는 실시예에 의해 제한되는 것으로 간주되어서는 안되나, 청구항에 의해 정의되는 모든 대상물을 포함한다.

실시예

실시예 1 - 3종의 뮤린 종양 모델에서 종양 성장에 대한 단백질 티로신 키나제 억제제와 공동 자극 경로 조절제의 조합물의 효과를 평가하는 방법

면역 기능에 대한 다사티닙의 효과가 최근 조사의 대상이다. 몇몇 보고서는 Lck 억제의 결과인 것으로 가정되는 시토카인 분비 및 탈과립화의 억제에 의해 측정된 바와 같이, 시험관내에서 다사티닙 (농도 10-50 nM)이 T-세포 기능을 억제함을 입증하였다 (문헌 [Weischel et al., 2008]). 다른 보고서는 다사티닙이 T-세포 활성화를 차단시킴을 입증하였다 (문헌 [Schade et al., 2007]). 그러나, 다사티닙에 의한 처리는 또한 그의 강력한 STAT3 억제를 기초로 하는 면역조절 효과를 가질 수 있으며, 이는 수지상 세포를 성숙시키고, T-세포 반응 (문헌 [Yu, H. et al., 2007]), 및 T 이펙터 및 T 조절 세포의 T-세포 신호전달의 억제에 대한 상이한 민감도 (문헌 [Siggs et al., 2007])를 조정할 수 있다. 또한, 거대 과립 림프구가 다사티닙을 처리한 환자로부터의 흉막 삼출에서 검출되었고, 흥미롭게도 이들 환자는 모두 적어도 하나의 HLA-A2 대립유전자를 가지고 있었다 (문헌 [Mustojski et al., 2008]). LGL 침윤이 면역자극의 결과일 수 있음이 가정된다. 따라서, 항종양 면역 반응의 강화가 다사티닙이 최소한의 효과를 갖는 모델에서 CTLA-4 차단 mAb 및 다사티닙의 조합물에 의해 달성될 수 있는지를 결정하는 것이 관심 대상이다.

3종의 모델에서 효능 연구를 수행하였다: SA1N 섬유육종, CT26 결장 암종 및 M109 폐 암종. 처음 2종의 모델은 CTLA-4 차단제의 효과에 민감한 반면, 다사티닙은 SA1N 모델에서 보통의 항종양 활성을 나타내었지만 CT 26 및 M109 모델에 대해서는 최소한의 활성을 나타내었다. 도 1a-1b 및 도 2에 도시된 바와 같이, CTLA-4 mAb + 다사티닙의 동시 처리는 상승작용 효과를 야기하였다. 상승작용은 다사티닙을 매일 투약 요법으로 또는 간헐적인 스케줄 (5일 온/2일 오프)에 따라 30 mg/kg으로 투여한 경우에 관찰되었다. M109 종양 모델에서는 어떤 상승작용도 관찰되지 않았다.

조합물의 효과가 세포독성 T 세포의 증식으로 인한 것인지를 결정하고, 처리가 종양 배수 림프절 내 면역 세포의 조성을 변경시키는지 여부를 결정하기 위해, CT26 종양 모델에서 추가의 연구를 수행하였다. 단일물 처리로 처리한 동물에 비해 조합물 처리로 처리한 동물에서 증가된 세포적 활성이 관찰되었다 (도 3a-3c). 또한, T 이펙터 세포/T 조절 세포 (억제 집단)의 비를 측정했을 때, 조합물 처리 및 다사티닙 처리 군이 증강된 비를 나타내었는데, 이는 T 조절 세포에 비해 T 이펙터 세포의 수가 더 많음을 나타낸다. CT-26 모델에서 얻은 결과를 기초로 하면, 다사티닙을 CTLA-4 요법에 추가하는 것은 T 조절 세포의 수를 감소시키면서 T 이펙터 세포의 백분율을 증대시켜, 항-CTLA-4 단독요법에 의해 도출된 항종양 면역 반응을 향상시키는 것으로 보인다.

실시예 2 - P815 비만세포종 뮤린 종양 모델에서 종양 성장에 대한 단백질 티로신 키나제 억제제와 공동 자극 경로 조절제의 조합물의 효과를 평가하는 방법

P815 비만세포종 뮤린 종양 모델에서 스프리셀® 및 CTLA-4 항체의 동시 처리를 평가하였다. 사용된 방법은 본원의 실시예 1에서 개략한 것과 본질적으로 같다.

스프리셀®은 P815 모델에서 보통의 항종양 활성을 나타내었다. 도 5에 도시된 바와 같이, CTLA-4 mAb + 스프리셀®의 동시 처리는 상승작용 효과를 야기하였다. 상승작용은 스프리셀®을 매일 투약 요법으로 또는 간헐적인 스케줄 (5일 온/2일 오프)에 따라 30 mg/kg으로 투여한 경우에 관찰되었다.

이러한 결과는 SA1N 및 CT26 종양 모델에서 관찰된 결과와 일치하였고 (도 1a-b 및 2 참조), 단백질 티로신 키나제 억제제를 CTLA-4 항체와 함께 투여하는 것은 종양 증식을 상승작용적으로 감소시킴을 확인하였다.

실시예 3 - 뮤린 모델에서 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 차단제 단독, 또는 파클리탁셀 (PAC), 에토포시드 (ETO), 또는 겜시타빈 (GEM)과 조합한 것의 항종양 활성을 평가하는 방법

항-CTLA-4 모노클로날 항체 (CTLA-4 mAb)의 항종양 활성이 화학요법제의 첨가에 의해 상승되는지 또는 억제되는지를 결정하기 위해, CTLA-4 mAb를 단독으로, 그리고 Pac, Eto, 또는 Gem과 조합하여 뮤린 종양 모델에서 평가하였다. M109 폐 암종, SA1N 섬유육종, 및 CT26 결장 암종 모델은 화학요법제 및 CTLA-4 차단제에 대한 상이한 민감도를 기초로 선택되었다.

모든 화합물을 그들의 최적의 용량 및 스케줄로 시험하였다. 조합하여 사용한 경우, CTLA-4 mAb는 화학요법을 처음 투여하고 1일 후에 개시되었다. 종양 성장 억제 퍼센트 및 표적 종양 크기에 도달하기까지의 일수를 이용하여 효능을 평가하였다. 항종양 활성을 다음과 같이 스코어링하였다: 완전 관해 (CR; ≥ 2 평가치에 대해 종양의 감지가 불가능) 또는 부분 관해 (PR; ≥ 2 평가치에 대해 종양 부피의 50％ 감소). 상승작용은 각 작용제를 이용한 단독요법 활성에 비해 유의하게 우수한 (p<0.05) 항종양 활성으로 정의하였다.

CTLA-4 차단제에 대해 둔감하고, Pac, Eto, 및 Gem에 대해서는 보통의 정도로 민감한 M109 피하 종양 모델에서, CTLA-4 mAb 및 Pac의 조합물에 의해 경계선상 상승작용이 입증된 반면, Eto에 의해서는 어떤 효과도 관찰되지 않았다. Gem 단독요법은 유의한 M109 항종양 활성을 야기하지 않았지만; Gem을 CTLA-4 mAb와 조합한 경우 상승작용이 야기되었다. M109 폐 전이 모델에서, CTLA-4 mAb를 Eto와 조합한 경우에 상승작용이 검출되었고, Gem에 의해서는 경계선상 상승작용이 관찰되었으며, Pac은 활성을 향상시키지 않았다.

SA1N 섬유육종은 CTLA-4 차단제 및 모든 3종의 화학요법에 대해 민감하였다. Pac, Eto, 및 Gem은 이 모델에서 CTLA-4 mAb의 활성을 향상시켰지만, 상승작용은 단지 Eto에 의해서만 관찰되었다. CTLA-4 mAb 및 Pac은 확립된 CT26 결장 암종 종양에 대해서는 효과가 없었지만, 종양 부담이 최소인 경우 상승작용적이었다. Eto 및 Gem은 둘 모두 이 모델에서 단일 작용제로서 효과가 있었고, 둘 모두의 활성은 CTLA-4 mAb에 의해 유의하게 상승되었다.

요약하면, Eto, Gem, 또는 Pac에의 CTLA-4 mAb의 첨가는 모델 의존적인 상승작용 활성을 야기하였다. 상승작용은 종양의 면역원성과는 관계없이 요법 중 적어도 하나가 활성이 있을 때만 관찰되었다. 모든 조합 요법은 잘 용인되었고, SA1N 종양 모델에서 화학요법은 CTLA-4 mAb 활성을 억제하는 것으로 보이지 않았다. 특히 중요한 것은 상승작용이 CTLA-4 mAb 단독에 대해서는 반응을 보이지 않은 종양에서 관찰되었다는 것인데, 이는 화학요법제가 면역원성 세포 사멸을 유도할 수 있음을 시사한다. 이러한 관찰은 임상 시험에서 화학면역요법 조합을 평가하는데 뒷받침을 제공한다. 각 뮤린 모델에서의 조합물에 관한 데이터는 이하의 실시예에서 개별적으로 개략한다.

실시예 4 - 피하 M109 뮤린 종양 모델에서 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 차단제 단독, 또는 파클리탁셀 (PAC), 에토포시드 (ETO), 또는 겜시타빈 (GEM)과 조합한 것의 항종양 활성을 평가하는 방법

각 치료 조합물의 효능을 확립하기 위해, 파클리탁셀, 에토포시드 및 겜시타빈의 CTLA-4 차단제와의 조합 영향을 피하 M109 폐 암종 종양 모델에서 평가하였다.

M109 종양은 CTLA-4 차단제에 대해서는 둔감하였고, 파클리탁셀, 에토포시드 및 겜시타빈에 대해서는 보통의 정도로 민감하였다. CTLA-4 + 파클리탁셀 조합물은 각 작용제 단독에 비해 향상된 항종양 활성을 야기하였지만, 에토포시드에 의해서는 어떤 향상도 관찰되지 않았다. 한편, 겜시타빈은 단일 작용제로서는 유의한 항종양 활성을 야기하지 않았지만, 겜시타빈 + CTLA-4 mAb는 상승작용 효과를 야기하였다 (표 1).

실시예 5 - 실험적 폐 전이 M109 뮤린 종양 모델에서 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 차단제 단독, 또는 파클리탁셀 (PAC), 에토포시드 (ETO), 또는 겜시타빈 (GEM)과 조합한 것의 항종양 활성을 평가하는 방법

각 치료 조합물의 효능을 확립하기 위해, 파클리탁셀, 에토포시드 및 겜시타빈의 CTLA-4 차단제와의 조합 영향을 실험적 M109 폐 전이 종양 모델에서 평가하였다.

M019 폐 전이 모델에서, 에토포시드 및 CTLA-4 mAb는 상승작용적 활성을 나타낸 반면, 겜시타빈과의 조합물은 경계선상 상승작용을 나타내었다 (표 2).

실시예 6 - SA1N 섬유육종 피하 뮤린 종양 모델에서 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 차단제 단독, 또는 파클리탁셀 (PAC), 에토포시드 (ETO), 또는 겜시타빈 (GEM)과 조합한 것의 항종양 활성을 평가하는 방법

각 치료 조합물의 효능을 확립하기 위해, 파클리탁셀, 에토포시드 및 겜시타빈의 CTLA-4 차단제와의 조합 영향을 SA1N 섬유육종 피하 뮤린 종양 모델에서 평가하였다.

SA1N은 CTLA-4 mAb 및 화학요법에 민감한 면역원성 종양 세포주이다. 처리된 3종의 화학요법제는 CTLA-4 mAb의 활성을 향상시켰지만, 상승작용은 에토포시드에 의해서만 관찰되었다 (표 3).

실시예 7 - CT26 결장 암종 뮤린 종양 모델에서 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 차단제 단독, 또는 파클리탁셀 (PAC), 에토포시드 (ETO), 또는 겜시타빈 (GEM)과 조합한 것의 항종양 활성을 평가하는 방법

각 치료 조합물의 효능을 확립하기 위해, 파클리탁셀, 에토포시드 및 겜시타빈의 CTLA-4 차단제와의 조합 영향을 CT26 결장 암종 뮤린 종양 모델에서 평가하였다.

CTLA-4 및 파클리탁셀은 CT26 결장 암종 종양에 대해 비효과적인 요법이었고; 이들 조합물은 확립된 종양에 대해서는 비효과적이었지만, 최소 종양 부담에 대해서는 상승작용적이었다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 에토포시드 및 겜시타빈은 둘 모두 단일 작용제로서 효과적이었지만, 이들의 활성은 CTL-4 mAb를 첨가하는 것에 의해 유의하게 강력해졌다.

요약하면, 에토포시드, 겜시타빈, 파클리탁셀, 및 익사베필론과 같은 화학요법제에 CTLA-4 mAb를 첨가하는 것은 다수의 종양 모델에서 상승작용적인 활성을 야기하였다. 모든 조합 요법은 잘 용인되었다. 주목할 것은 CTLA-4 단독에 대해서는 반응을 보이지 않은 종양에서 상승작용이 관찰된 것으로, 이는 화학요법제가 면역원성 세포 사멸을 유도할 수 있음을 시사한다. 겜시타빈, 에토포시드, 파클리탁셀, 및 익사베필론은 단독요법으로서 면역원성 발현(immunogenic signature) 및 면역 반응에 대한 조정을 유도하는 것으로 보인다. 중요한 것은, 이러한 결과는 이들의 짧은 반감기로 인해, 이들 작용제가 이펙터 T-세포 기능에 영향을 미치지 못할 것임을 시사한다. 또한, CTLA-4 차단제와 조합된 겜시타빈, 에토포시드, 파클리탁셀, 및 익사베필론의 상승작용은 화학요법제가 관해를 유도하지 않는 경우에 관찰될 수 있다. 적어도 겜시타빈의 경우에는, 겜시타빈과 동시 처리한 경우에만 효과적이므로, 상승작용 효과를 위해서는 투여 시점이 중요하다. 이러한 결과는 화학요법제와 CTLA-4 억제제의 동시 투여가 상승작용 효과에 최적일 수 있음을 시사한다. 마지막으로, 완전한 반응 ("CR")을 나타낸 마우스는 종양 재이식을 거부할 수 있는데, 이는 기억 면역 반응의 생성이 화학요법제에 의해 손상되지 않았음을 시사한다.

결론적으로, 이러한 관찰은 화학요법제 및 이필리무맙 상동체 CTLA-4-차단 mAb의 조합물이 효과적이고 장기적인 항종양 효과를 도출하며, 임상 시험에서 화학요법제와 함께 이필리무맙을 조사하는 것이 정당하다는 증거를 제공한다.

본 발명은 상기 구체적으로 기재된 실시양태로 제한되지 않으나, 하기하는 특허청구범위의 범주에서 벗어나지 않으면서 변화 및 변형이 가능하다.

본 발명이 상기 기재 및 실시예에 구체적으로 기재된 것과 다른 방법으로 실시될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 상기 교시내용에 비추어 본 발명의 수많은 변형 및 변화가 가능하며, 따라서 하기하는 특허청구범위의 범주 내에 포함된다.

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SEQUENCE LISTING <110> Bristol-Myers Squibb Company <120> COMBINATION OF ANTI-CTLA4 ANTIBODY WITH DIVERSE THERAPEUTIC REGIMENS FOR THE SYNERGISTIC TREATMENT OF PROLIFERATIVE DISEASES <130> 11333 PCT CIP <140> PCT/US2009/062519 <141> 2009-10-29 <150> US 61/226,910 <151> 2009-07-20 <150> US 12/462168 <151> 2009-07-30 <150> PCT/US2009/052209 <151> 2009-07-30 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ile Met Asp Gln Val Pro Phe Ser Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Val 1 5

Claims (19)

1. 동시에 또는 순차적으로 투여되는 4'-데메틸에피포도필로톡신 9-[4,6-O-(R)-에틸리덴-β-D-글루코피라노시드], 4'-(디히드로겐 포스페이트) 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물과 조합하여 육종, 결장암 또는 폐암을 치료하기 위한, 0.3-10 mg/kg의 이필리무맙을 포함하는 제약 조성물.
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7. 제1항에 있어서, 상기 디히드로겐 포스페이트 작용제가 이필리무맙의 투여 전에 투여되는 것인 제약 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 디히드로겐 포스페이트 작용제가 이필리무맙의 투여와 동시에 투여되는 것인 제약 조성물.
9. 제1항에 있어서, 항-증식성 세포독성제 단독 또는 방사선 요법과 조합된 항-증식성 세포독성제와 추가로 조합되는 제약 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 항-증식성 세포독성제가 시스플라틴인 제약 조성물.
11. 제9항에 있어서, 상기 항-증식성 세포독성제가 파라플라틴인 제약 조성물.
12. 제1항에 있어서, 상기 디히드로겐 포스페이트 작용제가 50 mg의 용량으로 투여되는 것인 제약 조성물.
13. 제1항에 있어서, 상기 디히드로겐 포스페이트 작용제가 100 mg의 용량으로 투여되는 것인 제약 조성물.
14. 제1항에 있어서, 상기 디히드로겐 포스페이트 작용제가 매일 투여되는 것인 제약 조성물.
15. 제1항에 있어서, 이필리무맙이 3주마다 투여되는 것인 제약 조성물.
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