PT2769737T - Combinação de um anticorpo anti-ctla4 com etopósido para o tratamento sinérgico de doenças proliferativas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMBINAÇÃO DE UM ANTICORPO ΑΝΤΙ-CTLA4 COM ETOPÓSIDO PARA O TRATAMENTO SINERGICO DE DOENÇAS PROLIFERATIVAS

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se aos campos de oncologia e regimes terapêuticos melhorados,

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O National Cancer Institute estimou que somente nos Estados Unidos, 1 em 3 pessoas sofrerão de cancro ao longo da sua vida. Além disso, aproximadamente 50% a 60Ê das pessoas que contraiam cancro sucumbirão eventualmente à doença. A ocorrência generalizada desta doença ressalta a necessidade de regimes anti cancro melhorados para o tratamento da malignidade.

Devido à ampla variedade de cancros observados atualmente, foram desenvolvidos numerosos agentes anti cancro para destruir o cancro no interior do organismo. Estes compostos são administrados a pacientes com cancro com o objetivo de destruir ou de outra forma inibir o crescimento de células malignas enquanto deixando as células normais e saudáveis intactas. Os agentes anti cancro foram classificados com base no seu mecanismo de ação,

Um tipo de quimioterapêutico é referido como um complexo de coordenação metálica. Acredita-se que este tipo de quimioterapêutica forma predominantemente reticulações de ADN inter-cadeia nos núcleos das células, prevenindo como tal a replicação celular. Como um resultado, o crescimento tumoral é inicialmente reprimido, e posteriormente revertido. Outro tipo de quimioterapêutico é referido como um agente alquilante. Estes compostos funcionam inserindo composições ou moléculas estranhas no ADN de células cancerígenas em divisão. Como um resultados destas frações estranhas, as funções normais das células cancerígenas são interrompidas e a proliferação é prevenida. Outro tipo de quimioterapêutico é um agente antineoplásico. Este tipo de agente previne, mata, ou bloqueia o crescimento e dispersão das células cancerígenas. Ainda outros tipos de agentes anti cancro incluem inibidores de aromastase não esteroides, agentes alquilantes bifuncionais, etc. A quimioimunoterapêutica, a combinação de agentes quimioterapêuticos e imunoterapêuticos, é uma nova abordagem para o tratamento do cancro que combina os efeitos dos agentes que atacam diretamente as células tumorais produzindo necrose ou apoptose das células tumorais, e agentes que modulam as respostas imunes do hospedeiro ao tumor. Os agentes quimioterapêuticos poderiam potenciar o efeito da imunoterapêutica gerando antigénios tumorais para seres apresentados por células apresentadoras de antigénio criando uma vacina de células tumorais "polivalente", e distorcendo a arquitetura do tumor, consequentemente facilitando a penetração dos agentes imunoterapêuticos bem como da população imune expandida. 0 ipilimumab é um anticorpo humano anti-CTLA-4 humano que bloqueia a ligação de CTLA-4 a CD80 e CD86 expressos em células apresentadoras de antigénio e como tal, bloqueando a regulação negativa das respostas imunes eliciadas pela interação destas moléculas. Dado que o ipilimumab não reconhece CTLA-4 de ratinho, foi utilizado um anticorpo CTLA-4 anti-ratinho (clone UC10-4F10) nos estudos apresentados aqui para investigar o efeito do bloqueamento de CTLA-4 com agentes quimioterapêuticos. Ξ habitualmente utilizado dasatinib (SPRYCEL®) para o tratamento de vários tipos de cancro e representa uma classe atrativa de agentes para combinar com o bloqueamento de CTLA-4.

Sao habitualmente utilizados agentes estabilizadores de microtúbulos, tais como ixabepilona (IXEMPRA™) e paclitaxel (TAXOL®), para o tratamento de vários tipos de cancro e representa uma classe atrativa de agentes para combinar com o bloqueamento de CTLA-4.

Os análogos de nucleósidos, tais como gemcitabina, são também habitualmente utilizados para o tratamento de vários tipos de cancros. A gemcitabina é um análogo de nucleósido antimetabolito (2',2'-difluorodesoxicitidina) que e torna ativa após fosforilação intracelular pela desoxicitidina quinase dado que somente as suas formas di e trifosfato possuem atividade citotóxica. Especificamente, a forma trifosfato compete com a desoxicitidina trifosfato para incorporação no ADN como uma base inativa, e a forma difosfato inibe a ribonucleótido redutase, uma enzima que é essencial para a síntese de ADN normal. A gemcitabina foi estudada numa ampla variedade de malignidades, tanto como um agente único como em combinação com outros fãrmacos citotóxicos. Além disso é aprovada em vários países para o tratamento de uma variedade de neoplasias no ser humano, incluindo carcinoma pancreãtico, ovãrico, pulmonar de células não pequenas, da bexiga e da mama. A sua utilização terapêutica nestes tumores é também suportada por um perfil de toxicidade favorável.

Outro mecanismo comum de inibição de células cancerígenas é a indução de quebras de ADN. Tais quebras de ADN matam especificamente células em divisão rápida tais como células cancerígenas. 0 etopósido é um fármaco do cancro que induz quebras de cadeia no ADN celular inibindo a reunião por topoisomerase II (topoll) das moléculas de ADN clivadas. Embora a clivagem do ADN pela topoisomerase II produza sempre quebras de ADN de cadeia dupla ligado pela topoisomerase II (DSBs), a ação do etopósido também resulta em quebras das cadeias simples (SSBs), dado que a reunião das duas cadeias é independentemente inibida pelo etopósido.

Os documentos US 2005/226875 A1 e WO 2007/113648 A2 descrevem o tratamento do cancro através da administração de um anticorpo anti-CTLA4 e um agente quimioterapêutico. 0 documento US 2009/117132 AI descreve uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA.4, outro agente e, opcionalmente, etopósido. 0 documento US 2007/160619 AI descreve um regime de dosagem de um anticorpo CTLA4 e um agente quimioterapêutico. 0 documento US 2004/005318 AI descreve uma composição de um anticorpo anti-CTLA4 e agente quimioterapêutico.

Nos estudos descritos no presente documento, a combinação de dasatinib, paclitaxel, etopósido e gemeitabina; individualmente com um inibidor de CTLA-4 foram investigadas em vários modelos de tumor com diferente sensibilidade a cada agente.

Os presentes inventores descobriram pela primeira vez o benefício sinérgico de combinar um inibidor de proteína tirosina quinase, tal como dasatinib, com um inibidor anti-CTLA-4 para o tratamento de doenças proliferativas. Adicionalmente, os presentes inventores descobriram pela primeira vez o benefício sinérgico de combinar um agente estabilizador de microtubulina, tais como paclitaxel, com um inibidor anti-CTLA-4 para o tratamento de doenças proliferativas. Adicionalmente, os presentes inventores descobriram pela primeira vez o benefício sinérgico de combinar um análogo de nucleósido, tal como gemeitabina, com um inibidor anti-CTLA-4 para o tratamento de doenças proliferativas. Adicionalmente, os presentes inventores descobriram pela primeira vez o benefício sinérgico de combinar um agente indutor de cadeias duplas de ADN, tal como etopósido, com um inibidor anti-CTLA-4 para o tratamento de doenças proliferativas. É um objeto da invenção proporcionar regimes de tratamento quimioterapêutico de combinação eficazes em que um ou mais dos seguintes: um inibidor de proteína tirosina quinase, um agente estabilizador de microtubulina, um análogo de nucleõsido, ou um agente indutor de cadeias duplas de ADN é combinado com um ou mais agentes anti-CTLA4 para o tratamento de doenças proliferativas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção prefere-se a um anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para utilização num método para o tratamento do cancro, que compreende administrar a um mamífero com necessidade do mesmo uma quantidade sinérgica terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CTLA-4 com 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo.

Num aspeto, o cancro é um ou mais tumores sólidos cancerosos tais como cancro de pulmão, cancro pancreãtico, cancro do cólon, cancro de próstata, e/ou CML ou leucemia. Noutro aspeto, o cancro é um ou mais tumores refratários. Ainda noutro aspeto, o anticorpo anti-CTLA-4 é ipilimumab ou tremeiimumab.

Anticorpos anti-CTLA4 adequados incluem anticorpos anti-CTLA4, anticorpos anti-CTLA4 humanos, anticorpos anti-CTLA4 de ratinho, anticorpos anti-CTLA4 de mamíferos, anticorpos anti-CTLA4 humanizados, anticorpos anti-CTLA4 monoclonais, anticorpos anti-CTLA4 policlonais, anticorpos anti-CTLA4 quiméricos, MDX-010 (ipilimumab), tremelimumab, adnectinas anti-CTLA4, anticorpos de domínio anti-CTLA4, fragmentos anti-CTLA4 de cadeia simples, fragmentos anti-CTLA4 de cadeia pesada, fragmentos anti-CTLA4 de cadeia leve, os anticorpos divulgados na Publicação PCT N.° W0 2001/014424, os anticorpos divulgados na Publicação PCT N.0 WO 2004/035607, os anticorpos divulgados na Publicação U.S. N.° 2005/0201994, e os anticorpos divulgados na Patente

Europeia concedida N.° ΞΡ 1212422 BI. São descritos anticorpos anti-CTLA-4 adicionais nas Patentes U.S. N.°s 5.811.097, 5.855.887, 6.051.227, e 6.984.720; nas Publicações PCT N.°s WO 01/14424 e WO 00/37504; e nas Publicações U.S. N.°s 2002/0039581 e 2002/086014. Outros anticorpos anti-CTLA-4 que podem ser utilizados incluem, por exemplo, aqueles divulgados em: documento WO 98/42752; Patentes U.S. N,°s 6.682.736 e 6.207.156; Hurwitz et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 95(17):10067-10071 (1998); Camacho et al., J. Clin. Ontology, 22(145): Resumo N.° 2505 (2004) (anticorpo CP-675206); Mokyr et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998), e Patentes U.S. N°s 5.977.318, 6.682.736, 7.109.003 e 7.132.281.

Cada uma destas referências descreve anticorpos anti-CTLA-4. Um anticorpo anti-CTLA-4 clínico preferido é o anticorpo monoclonal humano 10D1 (também referido como MDX-010 e ipilimumab e disponível da Medarex, Inc., Bloomsbury, NJ) é divulgado no documento WO 01/14424.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1A-1B ilustra resultados mostrando que o tratamento concomitante com mAb CTLA-4 e dasatinib produziu efeitos sinérgicos no modelo de tumor de fibrossarcoma SA1N. Foi administrado desatinib diariamente durante 11 dias ("A") ou durante 15 dias após um regime intermitente (5 dias sim/2 dias não) "by"). A FIG. 2 ilustra resultados mostrando que o tratamento concomitante com dasatinib e mAb CTLA-4 produziu efeitos sinérgicos no modelo de tumor CT-26. A FIG- 3A-3C ilustra resultados mostrando que o tratamento com dasatinib aumenta a atividade citolítica do mAb CTLA-4. Ratinhos portando tumores do cólon CT26 subcutâneos foram tratados com dasatinib (30 mg/kg, qldxl4, b.i.d., nos dias 4-18 após a implantação das células tumorais), CTLA-4 mAb (20 mg/kg, q4dx3, nos dias 4, 8, 12 após a implantação das células tumorais) ou a combinação de ambos agentes. Dois (A), 7 (B) e 14 (C) dias após o tratamento final, os ratinhos (N=5/grupo) foram injetados com esplenócitos singénicos etiquetados com CFSE pulsados com péptidos específicos de CT2 6 (AH-1). Dezoito horas mais tarde, os esplenócitos foram isolados e a atividade citolítica foi determinada medindo a razão de células pulsadas com CFSE (CFSE elevado = péptido pulsado, CFSE baixo = não pulsado). A combinação de dasatinib e CTLA-4 mostrou potenciamento da lise de esplenócitos pulsados com péptido que alcançou significância estatística no dia 14 (p=0,055). A FIG. 4A-4B ilustra resultados mostrando que o tratamento combinatório com dasatinib e mAb CTLA-4 resulta num aumento da razão de células T ativadas com CD8 (CD8+CD69+, células T efetoras) sobre A) células T reguladoras (CD4+CD25+FoxP3+, células T supressoras) e B) células T CD4+ ativadas em nódulos linfáticos de drenagem de tumores (TDLN). Ratinhos portando tumores do cólon CT26 subcutâneos foram tratados com dasatinib (30 mg/kg, qldxl4, b.i.d., nos dias 4-18 após a implantação das células tumorais), CTLA-4 mAb (20 mg/kg, q4dx3, nos dias 4, 8, 12 após a implantação das células tumorais) ou a combinação de ambos agentes. Foram recolhidos TLDN 2 dias após o tratamento final, e submetidos a caracterização imunofenotípica através de citometria de fluxo. A FIG. 5 ilustra que o tratamento concomitante com SPRYCEL® e mAb CTLA-4 produziu efeitos potenciados num modelo de tumor P815. Foi administrado SPRYCEL® P.O. nos dias 9-13, 16-20, 23-27 após a implantação do tumor enquanto foi doseado mAb anti-CTLA-4 I.P. nos dias 10, 14, 18. A FIG. 6 mostra que a atividade de bloqueamento de CTLA-4 não foi abolida pelo tratamento concomitante com etopósido, paclitaxel, ou gemcitabina. A FIG. 7 mostra que o mAb de bloqueamento de CTLA-4 em combinação com gemcitabina produziu efeitos sinérgicos. Os ratinhos que alcançaram resposta completa ("CR") rejeitaram um segundo desafio com células CT-26 vivas, sugerindo que este tratamento de combinação eliciou uma resposta imune de memória. A FIG. 8 mostra que o mAb de bloqueamento de CTLA-4 em combinação com etopósido produziu efeitos sinérgicos. A FIG. 9 mostra que o mAb de bloqueamento de CTLA-4 em combinação com agente(s) estabilizadores de microtúbulos produziu efeito sinérgico. A FIG. 10 mostra a ordem na qual o mAb de bloqueamento de CTLA-4 e o agente quimioterapêutico de combinação são administrados tem relevância para inibir a proliferação. Conforme mostrado, a coadministração de gemcitabina concomitante com o mAb de bloqueamento de CTLA-4 mostrou o maior efeito anti proliferativo conforme comparado com a administração sequencial. A FIG. 11 mostra a expansão de células T CD8+ citotóxicas através de tratamento com mAb CTLA-4 e ixabepilona. mAb CTLA-4 + ixabepilona produziram expansão de células T citotóxicas (CD8+CD107+) neste modelo, mas não em combinação com paclitaxel. A FIG. 12 mostra que a gemcitabina e o etopósido promovem a citotoxicidade in vivo. A FIG. 13 mostra que a gemcitabina modula a composição das células imunes em nódulos linfáticos de drenagem de tumores. A FIG. 14 mostra que o bloqueamento de gemcitabina + CTLA-4 modulou a expressão dos genes envolvidos na regulação imune.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção prefere-se a um anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)- etilideno-p-D-glucopiranõsido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para utilização num método para o tratamento do cancro, que compreende administrar a um mamífero com necessidade do mesmo uma quantidade sinérgica terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CTLA-4 com 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranõsido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo. A ativação ótima de células T requer interação entre o recetor de células T e antigénio específico (Bretscher, P. et al. , Science, 169:1042-1049 (1970)) (o primeiro sinal) e acoplamento de recetores coestimulatórios na superfície da células T com ligandos coestimulatórios expressos pela célula apresentadora de antigénio (APC) (o segundo sinal). A falha da célula T em receber um segundo sinal pode levar a anergia clonal (Schwartz, R.H., Science, 248:1349-1356 (1990) ). Dois recetores coestimulatórios de células T importantes são CD28 e o antigénio associado a linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4, CD152) cujos ligandos em APC são B7-1 e B7-2 (Linsley, P.S. et al. , J. Exp. Med., 173:721-730 (1991) ; Linsley, P.S. et al. , J. Exp. Med., 174:561-569 (1991)). Embora CF28 e CTLA-4 sejam membros estreitamente relacionados da superfamília das Ig (Brunet, J.F. et al., Nature, 328:267-270 (1987)), funcionam antagonisticamente. CD28 é constitutivamente expresso na superfície das células T (Gross, J.A. et al., J. Immunol., 149:380-388 (1992)), e após acoplamento com B7-1 ou B7-2, potência o sinal recetor-péptido-MHC de células T para promover a ativação, proliferação, e produção de IL-2 por parte de células T (Linsley, P.S. et al. , J. Exp. Med., 173:721-730 (1991); Alegre, M.L. et al., Nat. Rev. Immunol., 1(3):220-228 (dez. 2001)). CTLA-4 não é encontrado em células T em repouso mas é regulado positivamente durante 2-3 dias após a ativação das células T (Lindsten, T. et al., J. Immunol., 151:3489-3499 (1993); Walunas, T.L. et al. , Immunity, 1.405-413 (1994)) . CTLA-4 também liga a B7-1 e B7-2 mas com maior afinidade do que CD28 (Linsley, P.S. et al. , Immunity, 1:793-801 (1994)) e antagoniza a ativação de células T, interfere com a produção de IL-2 e a expressão de recetor de IL-2, e interrompe a progressão do ciclo celular das células T ativadas (Walunas, T. L. et al. , J. Exp, Med. , 183:2541-2550 (1996); Krummel, M.F. et al. , J. Exp. Med., 183:2533-2540 (1996); Brunner, M.C. et al. , J. Immunol., 162:5813-5820 (1999); Greenwald, R.J, et al. , Eur. J. Immunol., 32:366-373 (2002)). A resposta global das células T é determinada pela integração de todos os sinais, estimulatorios e inibitórios.

Dado que CTLA-4 aparenta minar a ativação de células T, foram realizadas tentativas de bloquear a atividade de CTLA-4 em modelos de ratinho de imunoterapêutica de cancro. Em ratinhos implantados com tumores imunogénicos, a administração de Ab anti-CTLA-4 potenciou a rejeição de tumores (Leach, D.R. et al., Science, 271:1734-1736 (1996)), embora tenha sido visto pouco efeito com tumores pouco imunogénicos tais como o carcinoma mamário SM1 ou o melanoma B16. Foi observada atividade anti tumoral potenciada quando foi administrado Ab anti-CLTA-4 com vacina de células B16 transduzida com fator de estimulação de colónias de macrõfagos granulõcitos (GM-CSF) e foi associada com despigmentação, sugerindo que pelo menos parte da resposta anti tumoral era específica de antigénio contra antigénios de diferenciação de melanócitos "próprios" (van Elsas, A. et al., J. Exp. Med., 190:355-366 (1999); van Elsas, A. et al., J. Exp. Med., 194:481-489 (2001)). Num modelo de ratinho transgénico de cancro de próstata primário, a administração de Ab anti-CTLA-4 mais células de cancro da próstata expressando GM-CSF reduziu a incidência e gravidade histológica do cancro da próstata e levou a prostatite em ratinhos normais, novamente sugerindo uma resposta imune específica de antigénio contra auto antigénios na rejeição tumoral (Hurwitz, A.A. et al, ,

Cancer Res., 50:2444-2448 (2000)). Adicionalmente, dado que vários antigénios tumorais são auto antigénios normais, romper a auto tolerância pode ser crítico para o êxito da imunoterapêutica do cancro. As respostas tumorais favoráveis a partir do bloqueamento de CTLA-4 em conjunto com vacinas tumorais em modelos de ratinho levou a interesse na utilização do bloqueamento de CTLA-4 na imunoterapêutica do cancro humana. A quimioimunoterapêutica, a combinação de agentes quimioterapêuticos e imunoterapêuticos, é uma nova abordagem para o tratamento do cancro que combina os efeitos dos agentes que atacam diretamente as células tumorais produzindo necrose ou apoptose das células tumorais, e agentes que modulam as respostas imunes do hospedeiro ao tumor. Os agentes quimioterapêuticos poderiam potenciar o efeito da imunoterapêutica gerando antigénios tumorais para seres apresentados por células apresentadoras de antigénio criando uma vacina de células tumorais "polivalente", e distorcendo a arquitetura do tumor, consequentemente facilitando a penetração dos agentes imunoterapêuticos bem como da população imune expandida. A presente invenção proporciona o tratamento sinérgico de tumores cancerosos. Vantajosamente, a sinergia reduz o desenvolvimento de tumores, reduz a carga tumoral, ou produz regressão tumoral num hospedeiro mamífero. A combinação do agente indutor de cadeia dupla de ADN etopósido com pelo menos um anticorpo anti-CTLA4, pode também incluir a adição de um agente citotóxico antiproliferative quer por si só ou em combinação com terapêutica de radiação.

Outros agentes citotóxicos anti-proliferativos são navelbeno, CPT-11, anastrozol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida, e droloxafina.

Produtos naturais e os seus derivados (por exemplo, alcaloides da vinca, antibióticos anti tumorais, enzimas, linfocinas e epipodofilotoxinas): vinblastina, vincristina, vindesina, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, Ara-C, paclitaxel (o paclitaxel está comercialmente disponível como TAXOL®) , mitramicina, desoxicoformicina, mit.omicina-C, L-asparaginase, interferões (especialmente IFN-a), etopósido, e tenipõsido. A frase "terapêutica de radiação" inclui raios x ou raios gama que são administrados a partir ou de uma fonte aplicada externamente tal como um raio ou através de implantação de pequenas fontes radioativas.

Conforme utilizado na presente memória descritiva e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referentes plurais a não ser que o conteúdo claramente dite o contrário. Consequentemente, por exemplo, referência a "um péptido" inclui uma combinação de dois ou mais péptidos, e semelhantes. "Cerca" conforme utilizado no presente documento referindo-se a um valor mensurável tal como uma quantidade, uma duração temporária, e semelhantes, destina-se a abranger variações de +20% ou +10%, mais preferentemente +5%, ainda mais preferentemente +l%,e mais preferentemente ainda +0,1% a partir do valor especificado, dado que tias variações são adequadas para realizar os métodos divulgados.

Conforme é conhecido na técnica, o dasatinib é também referido como N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino] -5-tiazolcarboxamida e descreve um composto tendo a seguinte estrutura (I):

(I) 0 Composto (I) pode também ser referido como N- (2-cloro-6-metilfenil)-2-((6-(4-(2-hidroxetil)-1-piperazinil)-2-metil-4-pirimidinil) amino)-1,3-tiazol-5-carboxamida de acordo com a nomenclatura IUPAC. A utilização do termo !!N-(2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxiet.il) -1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino] -5-tiazolcarboxamida" abrange (a menos que indicado de outra forma) solvatos (incluindo hidratos) e formas polimórficas do composto (I) ou us seus sais (tais como a forma de monidrato de (I) descrita no documento USSN 11/051.208, depositada a 4 de fevereiro de 2005). Composições farmacêuticas de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida e um ou mais diluentes, veículos e/ou excipientes, tais como aquelas composições divulgadas no documento USSN 11/402,502, depositado a 12 de abril de 2006. Um exemplo de uma composição farmacêutica compreendendo N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2- hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazotecarboxamida é SPRYCEL® (Bristol-Myers Squibb Company). SPRYCEL® compreende N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida como o ingrediente ativo, também referido como dasatinib, e como ingredientes inativos ou excipientes, monoidrato de lactose, celulose microcristalina, croscarmelose de sódio, hidoxipropilcelulose, e estearato de magnésio num comprimido compreendendo hipromelose, diõxido de titânio, e polietilenoglicol.

Conforme é conhecido na técnica, Ipilimimab refere-se a um anticorpo anti-CTLA-4, e é um anticorpo IgGiK completamente humano derivado a partir de ratinhos transgénicos tendo genes humanos codificando cadeias pesadas e leves para gerar um repertório humano funcional. 0 ipilimumab pode também ser referido pelo seu Registo CAS N.° 477202-00-9, e é divulgado como anticorpo 10DI na Publicação PCT N.° WO 01/14424. Especificamente, o ipilimumab descreve um anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antigénio do mesmo que liga especificamente a CTLA4, compreendendo uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada tendo uma região variável de cadeia leve compreendida pela SEQ ID NO: 1, e compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendida pela SEQ ID NO:2. As composições farmacêuticas de ipilimumab incluem todas as composições farmaceuticamente aceitáveis compreendendo ipilimumab e um ou mais diluentes, veículos e/ou excipientes. São proporcionados exemplos de uma composição farmacêutica compreendendo ipilimumab na Publicação PCT N.° WO 2007/67959. 0 ipilimumab pode ser administrado por via I.V. Região variável de cadeia leve para ipilimumab: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFS RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 1)

Região variável de cadeia pesada para ipilimumab: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFIS YD GNNK Y Y AD S VKGRFTISRDN SKNT L YLQMN SLR A EDTA ÍY Y CART GWLG PFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NG:2)

Conforme é conhecido na técnica, paclitaxel refere-se a um composto tendo a seguinte estrutura (II):

(II). 0 composto(II)pode também ser referido como 5beta,20-Epõxi-1,2alfa,4,7beta,lObeta,13alfa-hexahidroxitax-11-en-9-ona 4.10- diacetato 2-benzoato 13-éster com (2R,3S)-N-benzoil-3- fenilisosserina de acordo com a nomenclatura IUPAC. A utilização do termo "5beta,20-Epóxi-l,2alfa,4,7beta, lObeta, 13alfa-hexahidroxit.ax-ll-en-9-ona 4,10-diacetato 2-benzoato 13-éster com (2R,3S)-N-benzoil-3-fenilisosserina" abrange (a menos que indicado de outra forma) solvatos (incluindo hidratos) e formas polimórficas do composto (II) ou os seus sais, tais como as formas de (II) descritas na Patente U.S. N.° 5.504.102, publicada a 2 de abril de 1996. Composições farmacêuticas de 5beta,20-Epóxi- 1,2alfa, 4,7beta,lObeta,13alfa-hexahidroxitax-11-en-9-ona 4.10- diacetato 2-benzoato 13-éster com (2R,3S)-N-benzoil-3- fenilisosserina incluem todas as composições farmaceuticamente aceitáveis compreendendo 5beta,20-Epóxi-1,2alfa,4,7beta,lObeta,13alfa-hexahidroxitax-11-en-9-ona 4.10- diacetato 2-benzoato 13-éster com (2R,3S)-N-benzoil-3-fenilisosserina e um ou mais diluentes, veículos e/ou excipientes. Um exemplo de uma composição farmacêutica compreendendo 5beta,20-Epóxi-l,2alfa,4,7beta,lObeta,13alfa-hexahidroxitax-11-en-9-ona 4,10-diacetato 2-benzoato 13-éster com (2R,3S)-N-benzoil-3-fenilisosserina é TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Company). TAXOL® compreende 5beta,20-Epóxi-l, 2alfa,4,7beta,lObeta,13alfa-hexahidroxitax-ll-en-9-ona 4,10-diacetato 2-benzoato 13-éster com (2R,3S)-N-benzoil-3-fenilisosserina como o ingrediente ativo, também referido como paclitaxel, para infusão I.V. incluindo ingredientes inativos na forma de um diluente consistindo numa injeção de cloreto de sódio a 0,9% estéril, USP, injeção de dextrose a 5%, USP, injeção de cloreto de sódio a 0,9% e dextrose a 5%, ou injeção de dextrose a 5% em solução de Ringer até uma concentração final de 0,3 a 1,2 mg/ml.

Conforme é conhecido na técnica, gencitabina refere-se a um composto tendo a seguinte estrutura (III) :

(III), 0 composto (III) pode também ser referido como monocloridrato de 2 ' -desoxi-2 ' ,2'-difluorocitidina (isómero β) de acordo com a nomenclatura IUPAC. A utilização do termo "2'-desoxi-22'-difluorocitidina monocloridrato (isómero β)" abrange (a menos que indicado de outra forma) solvatos (incluindo hidratos) e formas polimõrficas do composto (III) ou os seus sais. Composições farmacêuticas de 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina monocloridrato (isómero β) e um ou mais diluentes, veículos e/ou excipientes. Um exemplo de uma composição farmacêutica compreendendo 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina monocloridrato (isómero β) é GEMZAR® (gemcitabina HC1) . GEMZAR® compreende 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina monocloridrato (isómero β) como o ingrediente ativo, para infusão I.V. incluindo ingredientes inativos numa forma estéril somente para utilização intravenosa. Os frascos de GEMZAR® contêm ou 200 mg ou 1 g de gemcitabina HC1 (expressa como base livre) formulada com manitol (200 mg ou 1 g, respetivamente) e acetato de sódio (12,5 mg ou 62,5 mg, respetivamente) como um pó liofilizado estéril. Podem ter sido adicionados ácido clorídrico ou hidróxido de sódio para ajuste do pH.

Conforme é conhecido na técnica, etopõsido refere-se a um composto tendo a seguinte estrutura (IV):

(III). 0 composto (IV) pode também ser referido como 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D- glucopiranõsido], 4'-(dihidrogenofosfato) de acordo com a nomenclatura IUPAC. A utilização do termo "4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D- glucopiranõsido], 4'-(dihidrogenofosfato)" abrange (a menos que indicado de outra forma) solvatos (incluindo hidratos) e formas polimórficas do composto (IV) ou os seus sais. Composições farmacêuticas de 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-3~D-glucopiranósido], 4'- (dihidrogenofosfato) e um ou mais diluentes, veículos e/ou excipientes. Um exemplo de uma composição farmacêutica compreendendo 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-3-D-glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) é ETGPOPHOS (etopósido fosfato). ETOPOPHOS compreende 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9 -[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4 ' -(dihidrogenofosfato) como o ingrediente ativo, para infusão I.V. incluindo ingredientes inativos numa forma estéril somente para utilização intravenosa, em frascos de dose única contendo etopósido fosfato equivalente a 100 mg de etopósido, 32,7 mg de citrato de sódio USP, e 300 mg de dextrano 40.

Agentes antiproliferativos adequados, incluem, sem limitação, taxanos, paclitaxel (o paclitaxel está comercialmente disponível como TAXOL®), docetaxel, discodermolida (DDM), dictiostatina (DCT) , Pelorusida A, epotilonas, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, epotilona E, epotilona F, furanoepotilona D, desoxiepotilona Bl, [17]-desidrodesoxiepotilona B, [18]desidrodesoxiepotilonas B, C12,13-ciclopropil-epotilonas A, epotilona A com ponte C6-C8, trans-9,10-desidroepotilona D, cis-9,10-desidroepotilona D, 16-desmetilepotilona B, epotilona B10, discodermolida, patupilona (ΞΡΟ-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, BMS-310705, ABJ-789, XAA296A (Discodermolida), TZT-1027 (soblidotina), ILX-651 (cloridrato de tasidotina), Halicondrina B, Mesilato de eribulina (E-7389), Hemiasterlina (HTI-286), E-7974, Criptoficinas, LY-355703, imunoconjugados de maitansinoide (DM-1), MKC-1, ABT-751, Tl-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesib), SB-743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobina, 17beta-acetoxi-2-etoxi-6-oxo-B-homo-estra-1,3,5(10)-trien-3-ol, ciclostreptina, isolaulimalida, laulimalida, 4-epi-7-desidroxi-14,16 -didesmetil-(+)-discodermolidas, e criptotilona 1, para além de outros agentes estabilizadores de microtubulina conhecidos na técnica. A frase "inibidor de proteína tirosina quinase" destina-se a referir agentes que inibem um ou mais membros da família das proteínas tirosina quinases. Exemplos não limitantes de inibidores de proteína tirosina quinase incluem dasatinib, imatinib, nilotinib, PD180970, GGP76030, AP23464, SKI 606, NS-187, e/ou AZD0530. Tais inibidores de proteínas tirosina quinase podem ser administrados quer por si sós ou em combinação com outras moléculas, tais como inibidores de T315I. A frase "agente modulador de microtubulina" destina-se a referir agentes que ou estabilizam a microtubulina ou desestabilizam a síntese e/ou polimerização da microtubulina.

Conforme referido no presente documento, o pelo menos um agente antiproliferativo pode ser um agente que afeta os microtúbulos. Um agente que afeta os microtúbulos interfere com a mitose celular e é bem conhecido na técnica pela sua atividade citotóxica antiproliferativa. Agentes que afetam os microtúbulos incluem, alocolchicina (NSC 406042), Halicondrina B (NSC 609395) , colchicina (NSC 757) , derivados da colchicina (por exemplo, NSC 33410), dolastatina 10 (NSC 376128) , maitansina (NSC 153858) , rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (TAXOL®, NSC 125973), derivados de TAXOL® (por exemplo, derivados (por exemplo, NSC 608832), tiocolchicina (NSC 361792), tritilo cisteína (NSC 83265) , sulfato de vinblastina (NSC 49842), sulfato de vincristina (NSC 67574), epotilonas naturais e sintéticas incluindo epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, desoxíepotilona A, desoxiepotilona B, [1S-[1R* , 3R* (E) , 7R* , 10S* , HR*, 12R* , 16S*3 ] -7-11-dihidroxi-8,8,10,12,16-pentamet.il-3- [l-metil-2 - (2-metil-4-tiazolil)etenil]-4-aza-17 oxabiciclo [14.1.0]heptadecano-5,9-diona (divulgada na Patente U.S.N.0 6.262.094, publicada a 17 de julho de 2001), [1S- [1R* , 3R* (E) , 7R* , 10S* , HR* , 12R* , 16S* ] ] -3 - [2 - [2 - (aminometil) -4-tiazolil]-1-metiletenil]- 7,11-dihidroxi-8,8,10,12,16-pentametil-4-17-dioxabiciclo[14.1.0]-heptadecano-5,9-diona (divulgada no documento USSN 09/506.481 depositado a 17 de fevereiro de 2000, e os exemplos 7 e 8 no presente documento), e derivados dos mesmos; e outros agentes perturbadores de microtúbulos. Agentes antineoplãsicos adicionais incluem, discodermolida (veja-se Service, Science, 274:2009 (1996)) estramustina, nocodazol, MAP4, e semelhantes. São também descritos exemplos de tais agentes na literatura científica e de patente, veja-se, por exemplo, Bulinski, J. Cell Sei., 110:3055-3064 (1997); Panda, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 94:10560-10564 (1997); Muhlradt, Cancer Res., 57:3344-3346 (1997); Nicolaou, Nature, 387:268-272 (1997); Vasquez, Mol. Biol. Cell., 8:9/3-985 (1997) ; Panda, J. Biol. Chem., 271:29807-29812 (1996).

Em casos onde é desejável tornar as células aberrantemente proliferativas quiescentes em conjunto com ou antes do tratamento com os métodos quimioterapêuticos, podem também ser administrados ao paciente hormonas e esteroides (incluindo análogos sintéticos): 17a-Etinilestradiol, Dietilstilbestrol, Testosterona, Prednisona, Fluoximesterona, Propionato de dromostalonona, Testolactona, Megestrolacetato, Metilprednisolona, Metiltestosterona, Prednisolona, Triamcinolona, Clorotrianiseno, Hidroxiprogesterona, Aminoglutetimida, Estramustina, Acetato de medroxiprogesterona, Leuprólido, Flutamida, Toremifeno, ZOLADEX®.

Também sâo adequados para utilização nos métodos quimioterapêuticos de combinação anti angiogénicos tais como inibidores de metaloproteinase de matriz, e outros inibidores de VEGF, tais como anticorpos anti-VEGF e também estão incluídas moléculas pequenas tais como ZD6474 e SU6668. Podem também ser utilizados anticorpos anti-Her2 da Genetech. Um inibidor de EGFR adequado é EKB-569 (um inibidor irreversível). Também são incluídos anticorpo Imclone C225 imunoespecífico para EGFR, e inibidores src.

Também é adequado para utilização como um antiproliferativo CASODEX® que produz carcinomas dependentes de androgénios não proliferativos. Ainda outro exemplo de um agente citostãtico é o anti estrogénio Tamoxifen que inibe a proliferação ou crescimento de cancro da mama dependente de estrogénio. Os inibidores da transdução de sinais proliferativos celulares são agentes citostãticos. Exemplos são inibidores do fator de crescimento epidérmico, inibidores de Her-2, inibidores de MEK-1 quinase, inibidores de ΜΆΡΚ quinase, inibidores de PI3, inibidores de Src quinase, e inibidores de PDGF.

Conforme mencionado, determinados agentes antiproliferativos são agentes anti angiogénicos e anti vasculares e, ao interromper o fluxo sanguíneo para tumores sólidos, tornam as células cancerígenas quiescentes ao privá-las de nutrição. Pode também ser utilizada castração, que torna os carcinomas dependentes de androgénio não proliferativos. A privação por meios para além da interrupção cirúrgica do fluxo sanguíneo é outro exemplo de um agente citostãtico. Um tipo particularmente preferido de agentes citostãticos vasculares são as combrestatinas. Outros agentes citostãticos exemplares incluem inibidores de MET quinase, inibidores de MAP quinase, inibidores de tirosina quinases recetoras e não recetoras, inibidores de sinalização de integrinas, e inibidores de recetores de fator de crescimento de tipo insulina. Um inibidor de proteína tirosina quinase, um agente estabilizador de microtubulina, tal como paclitaxel; um análogo de nucleósido, tal como gemeitabina; ou um agente indutor de ADN de cadeia dupla, tal como etopõsido, podem ser administrados em combinação(ões) sinérgica(s) com pelo menos um modulador de vias coestimulatório, particularmente um agente anti-CTLA4, para o tratamento e prevenção de um distúrbio proliferativo, para além de um distúrbio associado com BCR-ABL, um distúrbio associado com BCR-ABL mutante, e/ou um distúrbio associado com proteína tirosina quinase, e um distúrbio associado com a presença de utna mutação de BCR-ABL resistente a imatinib, uma mutação de BCR-ABL resistente a dasatinib, CML, CML resistente a imatinib, e/ou CML intolerante a imatinib, 0 termo "BCR-ABL" conforme utilizado no presente documento inclui BCR-ABL tanto de tipo selvagem como mutante. "Distúrbios associados a BCR-ABL" são aqueles distúrbios que resultam a partir da atividade de BCR-ABL, incluindo atividade de BCR-ABL mutante, e/ou que são aliviados pela inibição da expressão e/ou atividade de BCR-ABL, incluindo BCR-ABL mutante. Uma translocação recíproca entre os cromossomas 9 e 22 produz a proteína de fusão BCR-ABL oncogénica. A frase "distúrbios associados a BCR-ABL" inclui "distúrbios associados a BCR-ABL mutante".

Os distúrbios incluem, por exemplo, leucemias, incluindo, por exemplo, leucemia mieloide crónica, leucemia 1infoblastica aguda, e leucemia linfoblastica aguda positiva para o cromossoma Philadelphia (Ph+ ALL), carcinoma de células escamosas, cancro pulmonar de células pequenas, cancro pulmonar de células não pequenas, glioma, cancro gastrointestinal, cancro renal, cancro ovãrico, cancro do fígado, cancro colorretal, cancro do endométrio, cancro renal, cancro de próstata, cancro de tiroide, neuroblastoma, cancro pancreãtico, glioblastoma multiforme, cancro do colo do útero, cancro do estômago, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, carcinoma do cólon, e cancro da cabeça e pescoço, cancro gástrico, tumor de células germinativas, sarcoma pediátrico, linfoma de células natural killer sinonasal, mieloma múltiplo, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica crónica, mastocitose e qualquer sintoma associado com mastocitose. Adicionalmente, os distúrbios incluem urticãria pigmentosa, mastocitoses tais como mastocitose cutânea difusa, mastocitoma solitário em seres humanos, bem como mastocitoma canino e alguns subtipos raros tais como mastocitose bolhosa, eritrodérmica e telangiectásica, mastocitose com um distúrbio hematológico associado, tal como uma síndrome mieloproliferativa ou mielodisplãsica, ou leucemia aguda, distúrbio mieloproliferativo associado com mastocitose, e leucemia de mastócitos. São também incluídos vários cancros adicionais dentro do âmbito de distúrbios associados com proteína tirosina quinase incluindo, por exemplo, os seguintes: carcinoma, incluindo da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, estômago, colo do útero, tiroide, testículos, particularmente seminomas testiculares, e pele; incluindo carcinoma de células escamosas; tumores estromais gastrointestinais ("GIST"); tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma de células pilosas e linfoma de Burkitt; tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide, incluindo leucemias mielogénicas crónicas e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimática, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistemas nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, e schwannomas; tumores de origem mesenquimática, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentosum, queratoactantoma, seminoma, cancro folicular de tiroide, teratocarcinoma, tumores de células germinativas não seminomatosas refratárias por quimioterapia, e sarcoma de Kaposi. Em determinadas formas de realização preferidas, o distúrbio é leucemia, cancro da mama, cancro de próstata, cancro de pulmão, cancro do cólon, melanoma, ou tumores sólidos. Em determinadas formas de realização preferidas, a leucemia é leucemia mieloide crónica (CML), Ph+ ALL, AML, CML resistente a imatinib, CML intolerante a imatinib, CML acelerada, CML de fase de blasto linfoide.

Um "tumor sólido" inclui, por exemplo, sarcoma, melanoma, carcinoma, carcinoma da próstata, carcinoma pulmonar, carcinoma do cólon, ou outro cancro de tumor sólido. 0 termo "cancro”, "canceroso" ou "maligno" refere-se ou descreve a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem, por exemplo, leucemia, linfoma, blastoma, carcinoma e sarcoma. Exemplos mais particulares de tais cancros incluem leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda positiva para o cromossoma Philadelphia (Pin- ALL), carcinoma de células escamosas, cancro pulmonar de células pequenas, cancro pulmonar de células não pequenas, glioma, cancro gastrointestinal, cancro renal, cancro ovárico, cancro do fígado, cancro colorretal, cancro do endométrio, cancro renal, cancro de próstata, cancro de tiroide, neuroblastoma, cancro pancreático, glioblastoma multiforme, cancro do colo do útero, cancro do estômago, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, carcinoma do cólon, e cancro da cabeça e pescoço, cancro gástrico, tumor de células germinativas, sarcoma pediátrico, linfoma de células natural killer sinonasal, mieloma múltiplo, leucemia mielogénica aguda (AML) e leucemia linfocítica crónica (CML). "Leucemia" refere-se a doenças progressivas malignas dos órgãos produtores de sangue e é geralmente caracterizada por uma proliferação e desenvolvimento distorcido de leucócitos e dos seus precursores no sangue e medula óssea. A leucemia é geralmente clinicamente classificada na base de (1) a duração e carácter da doença aguda ou crónica; (2) o tipo de célula envolvida; mieloide (mielogénica), linfoide (linfogénica), ou monocítica; e (3) o aumento ou não aumento do número de células anormais no sangue - leucémica ou aleucémica (subleucémica). A leucemia inclui, por exemplo, leucemia não linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crónica, leucemia promielocítica aguda, leucemia de células T adultas, leucemia aleucémica, leucemia aleucocitémica, leucemia basofílica, leucemia de blastócitos, leucemia bovina, leucemia mielocítica crónica, leucemia cutis, leucemia embrionãria, leucemia eosinofílica, leucemia de Gross, leucemia de células pilosas, leucemia hemoblãstica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia de células estaminais, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopénica, leucemia linfática, leucemia linfoblãstica, leucemia linfocítica, leucemia linfogénica, leucemia linfoide, leucemia de células de linfossarcoma, leucemia de mastócitos, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblãstica, leucemia monocítica, leucemia mieloblãstica, leucemia mielocítica, leucemia granulocítica mieloide, leucemia mielomonocítica, leucemia de Naegeli, leucemia de células plasmãticas, leucemia plasmacítica, leucemia promielocítica, leucemia de células de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células estaminais, leucemia subleucémica, e leucemia de células indiferenciadas. Em determinados aspetos, a presente invenção proporciona tratamento para leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblãstica aguda, e/ou leucemia linfoblãstica aguda positiva para o cromossoma Philadelphia (Ph+ ALL).

Uma "BCR-ABL mutante" abrange uma tirosina quinase BCR-ABL com uma sequência de aminoácidos que difere da tirosina quinase BCR-ABL de tipo selvagem por uma ou mais substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Por exemplo uma substituição do aminoácido na posição 507 da SEQ ID MO:2 com outro aminoácido resultaria numa tirosina quinase BCR-ABL mutante.

"Distúrbio associado a BCR-ABL mutante" é utilizado para descrever um distúrbio associado a BCR-ABL no qual as células envolvidas no dito distúrbio são ou se tornam resistentes a tratamento com um inibidor de quinase utilizado para tratar o dito distúrbio como um resultado de uma mutação em BCR-ABL. Por exemplo, pode ser utilizado um composto inibidor de quinase para tratar uma condição cancerosa, cujo composto inibe a atividade de BCR-ABL de tipo selvagem que irã inibir a proliferação e/ou induzir a apoptose de células cancerosas. Ao longo do tempo, pode ser introduzida uma mutação no gene codificando BCR-ABL quinase, o que pode alterar a sequência de aminoácidos da BCR-ABL quinase e causar que as células cancerosas se tornem resistentes, ou pelo menos parcialmente resistentes, ao tratamento com o composto. Alternativamente, pode já estar presente uma mutação dentro do gene codificando BCR-ABL quinase, quer geneticamente ou como uma consequência de um evento oncogénico, independente do tratamento com um inibidor de proteína tirosina quinase, que pode ser um fator resultando na propensão destas células de se diferenciarem num estado proliferativo canceroso, e também resultar nestas células sendo menos sensíveis ao tratamento com um inibidor de proteína tirosina quinase. Tais situações são esperadas como resultando, quer direta ou indiretamente, num "distúrbio associado a BCR-ABL quinase mutante" e o tratamento de tal condição irã requerer um composto que seja pelo menos parcialmente eficaz contra a BCR-ABL mutante, preferentemente contra tanto BCR-ABL de tipo selvagem como BCR-ABL mutante. No caso onde um indivíduo desenvolver resistência pelo menos parcial ao inibidor de quinase imatinib, o distúrbio associado a BCR-ABL mutante é um que resulta a partir de uma mutação de BCR-ABL resistente a imatinib, ou uma mutação de BCR-ABL resistente a inibidor de proteína tirosina quinase. De forma semelhante, no caso onde um indivíduo desenvolver resistência pelo menos parcial ao inibidor de quinase N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, o distúrbio associado a BCR-ABL mutante é um que resulta a partir de uma mutação de BCR-ABL resistente a N- (2-cloro-6-metilfen.il)-2-[ [6-[4-(2- hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, ou uma mutação de BCR-ABL resistente a inibidor de proteína tirosina quinase. Os presentes inventores descobriram que após tratamento com N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, determinados indivíduos desenvolveram mutações de E507G. São descritos métodos de tratar distúrbios associados a BCR-ABL mutante e métodos de identificar se um indivíduo tem um distúrbio associado a BCR-ABL mutante. "Distúrbios associados a proteína tirosina quinase" de particular interesse no presente documento são aqueles distúrbios que resultam, pelo menos em parte, a partir de atividade de SRC ou BCR-ABL (WT ou mutante) aberrante e/ou que são aliviados pela inibição da atividade de SRC ou BCR-ABL (WT ou mutante) referida no presente documento como "distúrbios associados a SRC, "cancro associado a SRC", ou "distúrbios associados a BCR-ABL", "cancro associado a BCR-ABL" "Mutação de BCR-ABL resistente a imatinib" refere-se a uma mutação específica na sequência de aminoãcidos de BCR-ABL que confere às células que expressam a dita mutação resistência ao tratamento com imatinib. Conforme discutido no presente documento tais mutações podem incluir mutações na posição T3151 de BCR-ABL. Mutações adicionais que podem tornar uma proteína BCR-ABL pelo menos parcialmente resistente a imatinib podem incluir, por exemplo, E279K, F359C, F359I, L364I, L387M, F486S, D233H, T243S, M244V, G249D, G250E, G251S, Q252H, Y253F, Y253H, E255K, E255V, V256L, Y257F, Y257R, F259S, K262E, D263G, K264R, S265R, V268A, V270A, T272A, Y274C, Y274R, D276N, T277P, M278K, E279K, E282G, F283S, A288T, A288V, M290T, K291R, E292G, I293T, P296S, L298M, L298P, V299L, Q300R, G303E, V304A, V304D, C305S, C305Y, T306A, F311L, I314V, T315I, T315A, E316G, F317L, F317I, M318T, Y320C, Y320H, G321E, D325H, Y326C, L327P, R328K, E329V, Q333L, A337V, V339G, L342E, M343V, M343T, A344T, A344V, I347V, A350T, M351T, E352A, E352K, E355G, K357E, N358D, N358S, F359V, F359C, F359I, I360K, I360T, L364H, L364I, E373K, N374D, K378R, V379I, A380T, A3 8OV, D381G, F382L, L387M, M388L, T389S, Τ392Α, Τ394Α, A395G, Η396Κ, H396R, A399G, Ρ402Τ, Τ406Α, S417Y, F486S e E507G, Mutações de BCR-ABL resistente a Imatinib adicionais podem também incluir outras mutações de BCR-ABL divulgadas noutro ponto do presente documento. "Mutação de BCR-ABL resistente a dasatinib" refere-se a uma mutação específica na sequência de aminoácidos de BCR-ABL que confere às células que expressam a dita mutação resistência pelo menos parcial ao tratamento com dasatinib. Conforme discutido no presente documento tais mutações podem incluir mutações na posição T315I, T315A, F317A, F317I, e E507G de BCR-ABL, Mutações de BCR-ABL resistente a dasatinib adicionais podem também incluir outras mutações de BCR-ABL divulgadas noutro ponto do presente documento. "CML resistente a imatinib" refere-se a uma CML no qual as células envolvidas em CML são resistentes ao tratamento com imatinib. Geralmente é um resultado de uma mutação em BCR-ABL. "CML intolerante a imatinib" refere-se a uma CML no qual o indivíduo tendo a CML é intolerante ao tratamento com imatinib, isto é, os efeitos secundários tóxicos e/ou prejudiciais do imatinib superam quaisquer efeitos terapeuticamente benéficos. A combinação sinérgica de um inibidor de proteína tirosina quinase, agente estabilizador de microtubulina, tal como paclitaxel; um análogo de nucleósido, tal como gemcitabina; ou um agente indutor de ADN de cadeia dupla, tal como etopósido com um modulador de vias coestimulatório pode também incluir a adição de um ou mais compostos adicionais, que incluem os seguintes: um agente estabilizador de tubulina (por exemplo, pacitaxol, epotilona, taxano, etc.); um inibidor de farnesil transferase (por exemplo, (R)-2,3,4,5-tetrahidro-1-(1H-imidazol-4-ilmetil)-3-(fenilmetil)-4-(2-tienilsulfonil)-1H-1,4-benzodiazepino-7-carbonitrilo, sal de cloridato); outro inibidor de proteína tirosina quinase; um regime de frequência de dosagem aumentada de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida; 0 inibidor de ATP não competitivo ONO12380 inibidor de Aurora quinase VX-680; inibidor de p38 MAP quinase BIRB-796; e qualquer outra combinação ou regime de dosagem compreendendo N- (2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida divulgado no presente documento, ou qualquer outra combinação divulgada no presente documento.

Um "inibidor de farnesil transferase" pode ser qualquer composto ou molécula que inibe a farnesil transferase. O inibidor de farnesil transferase pode ter fórmula (II), (R)-2,3,4,5-tetrahidro-1-(1H-imidazol-4 - ilmetil)-3-(fenilmetil)-4-(2-tienilsulfonil)-1H-1,4-benzodiazepino-7-carbonitrilo, sal de cloridrato. o composto de fórmula (V) é um inibidor de FT citotóxico que é conhecido como matando células cancerígenas não proliferativas preferentemente, o composto de fórmula (V) pode adicionalmente ser útil na morte de células estaminais.

0 composto de fórmula (V) , a sua preparação, e utilizações do mesmo são descritos na Patente U.S. N.° 6.011.029. São também descritas utilizações do composto de fórmula (II) no documento WO 2004/015130, publicado a 19 de fevereiro de 2004 . A frase "proteína tirosina quinase" conforme utilizada no presente documento inclui enzimas que catalisam a transferência do fosfato terminal da adenosina trifosfato (ATP) a resíduos de tirosina em substratos de proteínas. Exemplos não limitantes de tirosina quinases incluem tirosina quinases recetoras tais como EGFR (por exemplo, EGFR./HER1 / ErbB 1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4,/ErbB4) , INSR (recetor de insulina), IGF-IR, IGF-II1R, IRR recetor relacionado com recetor de insulina), PDGFR (por exemplo, PDG FRA, PDGFRB) , c-KIT/SCFR, VEGFR-l/FLT-1, VEGFR- 2/FLK-1/KDR, VEGFR-3/FLT-4, FLT-3/FLK-2, CSF-1R, FGFR 1-4, CCK4 , TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, LTK (tirosina quinase de leucócitos), ALK (linfoma quinase anaplãsica) , ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, e RTK 106; e tirosina quinases não recetoras tais como BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, e LIMK. Um perito na especialidade conhecerá outras tirosina quinases recetoras e/ou não recetoras que podem ser visadas utilizando os inibidores descritos no presente documento. O termo "inibidor de tirosina quinase" inclui qualquer de uma variedade de agentes ou fãrmacos terapêuticos que atuam como inibidores seletivos ou não seletivos de tirosina quinases recetoras e/ou não recetoras. Sem estar ligado a qualquer teoria particular, os inibidores de tirosina quinase inibem geralmente tirosina quinases alvo ligando ao sítio de ligação a ATP da enzima.

Exemplos de inibidores de tirosina quinase incluem gefitinib (IRESSA®), sunitinib (SUTENT®; SU11248), erlotinib (TARCEVA®; OSI-1774), lapatinib (GW572016; GW2Q16), canertinib (Cl 1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK222584), sorafenib (BAY 43-9006), imatinib (GLEEVEC®; STI571) , dasatinib (BMS-354825) , leflunomida (SU101), vandetanib (ZACTIMA®; ZD6474), nilotinib, derivados dos mesmos, análogos dos mesmos, e combinações dos mesmos. São descritos inibidores de tirosina quinase adicionais em, por exemplo, Patentes U.S. N.°s 5.618.829, 5.639.757, 5.728.868, 5.804.396, 6.100.254, 6.127.374, 6.245.759, 6.306.874, 6.313.138, 6.316.444, 6.329.380, 6.344.459, 6.420.382, 6.479.512, 6.498.165, 6.544.988, 6.562.818, 6.586.423, 6.586.424, 6.740.665, 6.794.393, 6.875.767, 6.927.293 e 6.958.340. Um perito na especialidade conhecerá outros inibidores de tirosina quinase adequados para utilização na presente invenção

Os métodos para a administração segura e eficaz da maioria destes agentes quimioterapêuticos são conhecidos para os peritos na especialidade. Adicionalmente, a sua administração é descrita na literatura padrão.

Por exemplo, a administração de muitos dos agentes quimioterapêuticos é descrita em Physicians' Desk Reference (PDR), por exemplo, edição de 1996 (Medical Economics Company, Montvale, NJ 07645-1742, EUA).

As composições podem adicionalmente compreender um ou mais ingrediente(s) farmaceuticamente aceitável(is) tal(is) como alúmen, estabilizantes, agentes antimicrobianos, tampões, agentes corantes, agentes aromatizantes, adjuvantes, e semelhantes. As composições farmacêuticas podem ser administradas por via oral ou parentérica incluindo as vias de administração intravenosa, intramuscular, intraperitoneais, injeção subcutânea, retal e tópica.

Para utilização oral, as composições farmacêuticas, podem ser administradas, por exemplo, na forma de comprimidos ou cápsulas, pós, grânulos dispersáveis, ou saquetas, ou como soluções ou suspensões aquosas. No caso de comprimidos para utilização oral, são habitualmente adicionados portadores que são habitualmente utilizados incluem lactose, amido de milho, carbonato de magnésio, talco, e açúcar, e agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio. Para administração oral na forma de uma cápsula, portadores úteis incluem lactose, amido de milho, carbonato de magnésio, talco, e açúcar. Quando são desejadas suspensões aquosas para administração oral, são habitualmente adicionados emulsificantes e/ou agentes de suspensão.

Adicionalmente, podem ser adicionados agentes adoçantes e/ou aromatizantes às composições orais. Para utilização intramuscular, intraperitoneal, subcutânea e intravenosa, são habitualmente empregues soluções estéreis do(s) ingrediente(s) ativo(s), e o pH das soluções deve ser adequadamente ajustado e tamponado. Para utilização intravenosa, a concentração total do(s) soluto(s) deve ser controlada de modo a tornar a preparação isotõnica.

Para a preparação de supositórios, é primeiro fundida uma cera de fusão lenta tal como uma mistura de glicerídeos de ácido gordo ou manteiga de cacau, e o ingrediente ativo é disperso de forma homogénea na cera, por exemplo através de agitação. A mistura homogénea fundida é então vertida em moldes convenientemente medidos e deixada arrefecer e como tal solidificar.

As preparações líquidas incluem soluções, suspensões e emulsões. Tais preparações são exemplificadas por soluções de água ou ãgua/propilenoglicol para injeção parentérica. As preparações líquidas podem também incluir soluções para administração intranasal.

Preparações de aerossol adequadas para inalação podem incluir soluções e sólidos em forma de pó, que podem estar em combinação com um portador farmaceuticamente aceitável, tal como um gãs comprimido inerte. São descritas preparações sólidas que são destinadas a conversão, brevemente antes da utilização, em preparações líquidas para administração oral ou parentérica. Tais formas líquidas incluem soluções, suspensões e emulsões. 0 modulador de vias coestimulatório, preferentemente um agente anti-CTLA4, descrito no presente documento pode também ser administrado por via transdérmica. As composições transdérmicas podem adquirir a forma de cremes, loções, aerossóis e/ou emulsões e podem ser incluídas num emplastro transdérmico de tipo matriz ou reservatório conforme é convencional na técnica para este propósito.

Se formulados como uma dose fixa, os ingredientes ativos das composições de combinação farmacêutica são empregues dentro dos intervalos de dosagem descritos abaixo. Alternativamente, o modulador de vias coestimulatório e o inibidor de proteína tirosina quinase podem ser administrados separadamente nos intervalos de dosagem descritos abaixo. 0 modulador de vias coestimulatório pode ser administrado no intervalo de dosagem descrito abaixo após ou simultaneamente com a administração do inibidor de proteína tirosina quinase no intervalo de dosagem descrito abaixo. 0 seguinte estabelece combinações terapêuticas preferidas e dosagens exemplares.

Embora este quadro proporcione regimes de dosagem exemplares do inibidor de proteína tirosina quinase, preferentemente SPRYCEL®, um modulador de vias coestimulatório, preferentemente anticorpo anti-CTLA4, e./ou agentes de vacina anti cancro, ao formular as composições farmacêuticas o profissional clínico pode utilizar dosagem preferidas conforme necessário pela condição do paciente a ser tratado. 0 anticorpo anti-CTLA4 pode preferentemente ser administrado a cerca de 0,3-10 mg/kg, ou a dose máxima tolerada. Numa forma de realização, é administrada uma dosagem de anticorpo anti-CTLA-4 cerca de cada três semanas. Alternativamente, o anticorpo anti-CTLA-4 pode ser administrado por um regime de dosagem escalonado incluindo administrar uma primeira dosagem de anticorpo anti-CTLA-4 a cerca de 3 mg/kg, uma segunda dosagem de anticorpo CTLA-4 a cerca de 5 mg/kg, e um terceira dosagem de anticorpo CTLA-4 a cerca de 9 mg/kg.

Igualmente, o inibidor de proteína tirosina quinase, preferentemente SPRYCEL®, pode preferentemente ser administrado a cerca de 2 vezes por dia a 7 0 mg. Alternativamente, pode ser doseado a, por exemplo, cerca de 50, cerca de 70, cerca de 90, cerca de 100, 110, ou 120 BID, ou 100, 140, ou 180 uma vez por dia, ou a dose máxima tolerada, A dose de um inibidor de proteína tirosina quinase pode depender de uma série de fatores, incluindo estádio da doença, a presença de uma ou mais mutações na proteína tirosina quinase visada, 1 Cada combinação listada no presente documento inclui a administração de uma vacina anti cancro desde cerca de 0,001-100 mg. mutações de BCR-ABL, etc, A dose específica que deve ser administrada com base na presença de um ou mais de tais fatores encontra-se dentro da habilidade do perito na especialidade.

Igualmente, pode ser preferentemente administrado etopósido a cerca de 50 mg até cerca de 900 mg por dia. 0 etopósido encontra-se disponível para infusão intravenosa como um liófilo estéril em frascos de dose única contendo etopósido fosfato equivalente a 100 mg de etopósido, 32,7 mg de citrato de sódio USP, e 300 mg de dextrano 40. Alternativamente, pode ser doseado a, por exemplo, cerca de 50, cerca de 70, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 200, cerca de 300, cerca de 400, cerca de 500, cerca de 600, cerca de 700, cerca de 800 ou cerca de 900 diariamente, ou a dose máxima tolerada.

Igualmente, pode ser preferentemente administrada gemcitabina a cerca de 200 mg/m até cerca de 1250 mg/m por dia através de I.V. durante infusão e 30 a 90 minutos. A gemcitabina está disponível para infusão intravenosa contendo desde cerca de 200 mg até cerca de 1250 g de gemcitabina HC1 (expressa como base livre) formulada com manitol (200 mg ou 1 g, respetivamente) e acetato de sódio (12,5 mg ou 62,5 mg, respetivamente) como um pó liofilizado estéril. Alternativamente, pode ser doseado a, por exemplo, cerca de 50, cerca de 100, cerca de 200, cerca de 300, cerca de 400, cerca de 500, cerca de 600, cerca de 700, cerca de 800, cerca de 900, cerca de 1000, cerca de 1100, cerca de 1200 ou cerca de 1250 diariamente, ou a dose máxima tolerada.

As combinações da presente invenção podem também ser utilizadas em conjunto com outras terapêuticas bem conhecidas que são selecionadas pela sua utilizada particular contra a condição que está a ser tratada. 0 anticorpo anti-CTLA4 pode preferentemente ser administrado a cerca de 0,3 - 10 mg/kg, ou a dose máxima tolerada. Numa forma de realização da invenção, é administrada uma dosagem de anticorpo anti-CTLA-4 cerca de cada três semanas. Alternativamente, o anticorpo anti-CTLA-4 pode ser administrado por um regime de dosagem escalonado incluindo administrar uma primeira dosagem de anticorpo anti-CTLA-4 a cerca de 3 mg/kg, uma segunda dosagem de anticorpo CTLA-4 a cerca de 5 mg/kg, e um terceira dosagem de anticorpo CTLA-4 a cerca de 9 mg/kg.

Numa outra forma de realização específica, o regime de dose escalonada inclui administrar uma primeira dosagem de anticorpo CTLA-4 a cerca de 5 mg/kg e um segunda dosagem de anticorpo CTLA-4 a cerca de 9 mg/kg.

Adicionalmente, a presente invenção proporciona um regime de dose escalonada, que inclui administrar uma dosagem em aumento de anticorpo CTLA-4 a aproximadamente cada seis semanas.

Num aspeto da presente invenção, é proporcionado um regime de dose escalonada por etapas, que inclui administrar uma primeira dosagem de anticorpo anti-CTLA-4 de cerca de 3 mg/kg, uma segunda dosagem de anticorpo anti-CTLA-4 de cerca de 3 mg/kg, uma terceira dosagem de anticorpo anti-CTLA-4 de cerca de 5 mg/kg, uma quarta dosagem de anticorpo anti-CTLA-4 de cerca de 5 mg/kg, e uma quinta dosagem de anticorpo anti-CTLA-4 de cerca de 9 mg/kg. Noutro aspeto da presente invenção, é proporcionado um regime de dose escalonada por etapas, que inclui administrar uma primeira dosagem de 5 mg/kg, uma segunda dosagem de 5 mg/kg, e uma terceira dosagem de 9 mg/kg. A dosagem real empregue pode ser variada dependendo dos requerimentos do paciente e da gravidade da condição a ser tratada. A determinação da dosagem adequada para uma situação particular está dentro da habilidade da técnica. Em geral, o tratamento é iniciado com dosagens mais pequenas que são menores do que a dose ótima do composto. Posteriormente, a dosagem é aumentada em pequenas quantidades até ser alcançado o efeito ótimo sob as circunstâncias. Para conveniência, a dosagem diária total pode ser dividida e administrada em porções durante o dia se desejado. Pode ser empregue terapêutica intermitente (por exemplo, uma semana de entre três semanas ou três semanas de entre quatro semanas).

Ao empregar as composições da presente invenção, podem também ser administrados outros agentes utilizados na modulação do crescimento tumoral ou metástase num cenário clínico, tais como antieméticos, conforme desejado.

As combinações da presente invenção podem também ser coadministradas com outros agentes terapêuticos bem conhecidas que são selecionadas pela sua utilizada particular contra a condição que está a ser tratada. Podem alternativamente ser utilizadas combinações da presente invenção sequencialmente com agente(s) farmaceuticamente aceitável(is) conhecido(s) quando uma formulação de combinação múltipla é inadequada. 0(s) agente(s) quimioterapêutico(s) e/ou terapêutica de radiação podem ser administrados de acordo com protocolos terapêuticos bem conhecidos na técnica. Será aparente para os peritos na especialidade que a administração do(s) agente(s) quimioterapêutico(s) e/ou terapêutica de radiação podem ser variados dependendo da doença a ser tratada e dos efeitos conhecidos do(s) agente(s) quimioterapêutico(s) e/ou terapêutica de radiação sobre essa doença. Igualmente, de acordo com o conhecimento do clínico perito, os protocolos terapêuticos (por exemplo, quantidades de dosagem e tempos de administração) podem ser variados em vista dos efeitos observados dos agentes terapêuticos administrados (isto é, agente(s) anti-CTLA4 e inibidor de proteína tirosina quinase) sobre o paciente, e em vista das respostas observadas da doença aos agentes terapêuticos administrados.

Um inibidor de proteína tirosina quinase, tal como dasatinib, um agente estabilizador de microtubulina, tal como paclitaxel; um análogo de nucleõsido, tal como gemcitabina; ou um agente indutor de ADN de cadeia dupla, tal como etopósido podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente (antes ou depois) com um agente anti-CTLA4. Consequentemente, não é necessário que o(s) agente(s) terapêutico(s) anti-CTLA4 e um agente estabilizador de microtubulina, tal como paclitaxel; um análogo de nucleõsido, tal como gemcitabina; ou um agente indutor de ADN de cadeia dupla, tal como etopósido sejam administrados simultaneamente ou essencialmente simultaneamente. A vantagem de uma administração simultânea ou essencialmente simultânea ou sequencial (antes ou depois) encontra-se bem dentro da determinação do clínico per i to.

Combinações adicionais também abrangidas pela presente invenção, incluem as seguintes: ipilimumab + etopósido + cisplatina ou carboplatina; ipilimumab + pem (cisPlatina, Etopósido e Mitomicina) + cisplatina. Estas combinações podem ser administradas ou sequencialmente (antes ou após cada uma), concomitantemente, ou em qualquer ordem recomendada por um clínico perito.

Igualmente, no geral, um agente estabilizador de microtubulina, tal como paclitaxel; um análogo de nucleõsido, tal como gemcitabina; ou um agente indutor de ADN de cadeia dupla, tal como etopõsido e agente(s) anti-CTLA4 não necessitam ser administrados na mesma composição farmacêutica, e podem, devido a diferentes características físicas e químicas, necessitar ser administrados através de vias diferentes.

Se um agente estabilizador de microtubulina, tal como paclitaxel; um análogo de nucleósido, tal como gemcitabina; ou um agente indutor de ADN de cadeia dupla, tal como etopósido e o(s) agente(s) anti-CTLA4 não forem administrados simultaneamente ou essencialmente simultaneamente, então a ordem inicial de administração de um inibidor de proteína tirosina quinase, tal como dasatinib, um agente estabilizador de microtubulina, tal como paclitaxel; um análogo de nucleósido, tal como gemcitabina; ou um agente indutor de ADN de cadeia dupla, tal como etopõsido e o(s) agente (s) anti-CTLA4 pode ser variada. Consequentemente, por exemplo, um agente estabilizador de microtubulina, tal como paclitaxel; um análogo de nucleósido, tal como gemcitabina; ou um agente indutor de ADN de cadeia dupla, tal como etopõsido pode ser administrado primeiro seguido pela administração do(s) agente(s) anti-CTLA4; ou o(s) agente(s) anti-CTLA4 pode(m) ser administrado(s) primeiro seguido(s) pela administração de um inibidor de proteína tirosina quinase, um agente estabilizador de microtubulina, tal como paclitaxel; um análogo de nucleósido, tal como gemcitabina; ou um agente indutor de ADN de cadeia dupla, tal como etopósido. Esta administração alternada pode ser repetida durante um único protocolo de tratamento. A determinação da ordem de administração, e o número de repetições de administração de cada agente terapêutico durante um protocolo de tratamento, encontra-se bem dentro do conhecimento do clínico perito após a avaliação da doença a ser tratada e da condição do paciente.

Consequentemente, de acordo com a experiência e o conhecimento, o médico praticante pode modificar cada protocolo para a administração de um componente (agente terapêutico - isto é, um inibidor de proteína tirosina quinase, tal como dasatinib, um agente estabilizador de microtubulina, tal como paclitaxel; um análogo de nucleósido, tal como gemeitabina,· ou um agente indutor de ADN de cadeia dupla, tal como etopósido, agente(s) anti-CTLA4),) do tratamento de acordo com as necessidades do paciente individual, à medida que o tratamento prossegue. 0 clínico assistente, ao julgar se o tratamento é eficaz à dosagem administrada, irã considerar o bem-estar geral do paciente bem como sinais mais definitivos tais como alívio de sintomas relacionados com a doença, inibição do crescimento tumoral, encolhimento real do tumor, ou inibição de metástases. 0 tamanho do tumor pode ser medido através de métodos padrão tais como estudos radiológicos, por exemplo, TAC ou ressonância magnética, e podem ser utilizadas medições sucessivas para julgar se o crescimento do tumor foi ou não atrasado ou incluso revertido. 0 alívio de sintomas relacionados com a doença tais como dor, e a melhoria da condição global podem também ser utilizados para auxiliar no julgamento da eficácia do tratamento.

Conforme referido noutro ponto do presente documento, a dose ótima do inibidor de proteína tirosina quinase pode depender de uma série de fatores, incluindo mas limitados à presença de uma ou mais mutações no inibidor de proteína tirosina quinase visado e/ou em BCR-ABL.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um inibidor de uma BCR-ABL quinase mutante pode ser uma função da mutação presente. Por exemplo Shah et al. divulgam que as linhas celulares com determinadas mutações na BCR-ABL quinase são mais sensíveis a N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida do que linhas celulares com diferentes mutações de BCR-ABL quinase. Por exemplo, células compreendendo uma mutação de F317L em BCR-ABL quinase podem requerer uma concentração três a cinco vezes maior de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida do que linhas celulares expressando uma mutação de F317I. Um perito na especialidade irá apreciar a diferença de sensibilidade das células de BCR-ABL mutante e determinar uma dose terapeuticamente eficaz consequentemente.

Exemplos de doses terapeuticamente eficazes de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida que podem ser necessários com base na sensibilidade relativa de mutantes de BCR-ABL quinase a N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil) -1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino] -5-tiazolcarboxamida em comparação com BCR-ABL quinase de tipo selvagem podem ser determinados utilizando vários ensaios bioquímicos in vitro incluindo ensaios de proliferação celular, fosforilação de tirosina de BCR-ABL quinase, fosforilação de substrato peptídico, e/ou autofosforilação. Por exemplo, podem ser calculadas doses terapeuticamente eficazes aproximadas de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[ [6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4- pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida com base na multiplicação da dose típica com a alteração de magnitude da sensibilidade em qualquer um ou mais destes ensaios para cada mutante de BCR-ABL quinase. O'Hare et al. (Cancer Res., 65(11):4500-4505 (2005)) realizaram análise da sensibilidade relativa de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[ [6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida com vários mutantes de BCR-ABL quinase clinicamente relevantes. Por exemplo, o mutante E255V teve uma alteração de magnitude de "1" no ensaio de GST-Abl quinase, enquanto este mesmo mutante teve uma alteração de magnitude de "14" no ensaio de proliferação celular. Consequentemente, uma dose terapeuticamente relevante de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida como o ingrediente ativo para pacientes albergando esta mutação poderia abranger, por exemplo, qualquer magnitude desde 1 até 14 vezes mais elevada do que a dose típica. Consequentemente, doses terapeuticamente relevantes de N-(2-cloro-6- metilfenil)-2- [ [6- [4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida para qualquer dos mutantes de BCR-ABL quinase podem ser, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, ou 300 vezes mais elevadas do que a dose prescrita. Alternativamente, doses terapeuticamente relevantes de N- (2-cloro-6-metilfenil)-2-[ [6- [4- (2-hidroxiet.il) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida podem ser, por exemplo, 0,9x, Q,8x, 0,7x, Q,6x, 0,5x, 0,4x, 0,3x, 0,2x, 0,lx, 0,09x, 0,08x, 0,07x, 0,06x, 0,05x, 0,04x, 0,03x, 0,02x, ou 0,01x da dose prescrita.

De acordo com 0'Hare et al., o mutante M244V teve uma alteração de magnitude de "1,3" no ensaio de GST-Abl quinase, uma alteração de magnitude de "1,1" no ensaio de autofosforilação, e uma alteração de magnitude de "2" no ensaio de proliferação celular; o mutante G250E teve uma alteração de magnitude de "0,5" no ensaio de GST-Abl quinase, uma alteração de magnitude de "3" no ensaio de autofosforilação, e uma alteração de magnitude de "2" no ensaio de proliferação celular; o mutante Q252H teve uma alteração de magnitude de "4" no ensaio de proliferação celular; o mutante Y253F teve uma alteração de magnitude de "0,6" no ensaio de GST-Abl quinase, uma alteração de magnitude de "4" no ensaio de autofosforilação, e uma alteração de magnitude de "4" no ensaio de proliferação celular; o mutante Y253H teve uma alteração de magnitude de "3" no ensaio de GST-Abl quinase, uma alteração de magnitude de "2" no ensaio de autofosforilação, e uma alteração de magnitude de "2" no ensaio de proliferação celular; o mutante E255K teve uma alteração de magnitude de "0,3" no ensaio de GST-Abl quinase, uma alteração de magnitude de "2" no ensaio de autofosforilação, e uma alteração de magnitude de "7" no ensaio de proliferação celular; o mutante F317L teve uma alteração de magnitude de "1,5" no ensaio de GST-Abl quinase, uma alteração de magnitude de "1,4" no ensaio de autofosforilação, e uma alteração de magnitude de "9" no ensaio de proliferação celular; o mutante M351T teve uma alteração de magnitude de "0,2" no ensaio de GST-Abl quinase, uma alteração de magnitude de "2" no ensaio de autofosforilação, e uma alteração de magnitude de "1,4" no ensaio de proliferação celular; o mutante F359V teve uma alteração de magnitude de "0,8" no ensaio de GST-Abl quinase, uma alteração de magnitude de "2” no ensaio de autofosforilação, e uma alteração de magnitude de "3" no ensaio de proliferação celular; o mutante H396R teve uma alteração de magnitude de "1,3" no ensaio de GST-Abl quinase, uma alteração de magnitude de "3" no ensaio de autofosforilação, e uma alteração de magnitude de "2" no ensaio de proliferação celular.

Para pacientes albergando a mutação T315I, quer por si só ou em combinação com outra mutação de BCR-ABL divulgada no presente documento, a administração de doses mais elevadas de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2- hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida, ou combinações de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida e imatinib; uma combinação de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[ [6-[4-(2- hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida e um agente estabilizador de tubulina (por exemplo, pacitaxol, epotilona, taxano, etc.); uma combinação de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2- hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida e um inibidor de farnesil transferase,· uma combinação de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida e outro inibidor de proteína tirosina quinase; quaisquer outras combinações divulgadas no presente documento; um regime de frequência de dosagem aumentada de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2- hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida; e qualquer outra combinação ou regime de dosagem compreendendo N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida divulgado no presente documento, podem ser necessários. Alternativamente, podem também ser necessárias combinações de N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida com um inibidor de T3151. São descritos regimes de dosagem envolvendo N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-[[6-[4-(2-hidroxietil) -1-piperazinil]-2-metil-4-pirimidinil]amino]-5-tiazolcarboxamida no N.° de Série U.S. 10/395.503, depositado a 24 de março de 2003; e Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2004, Volume 104: Resumo 20, "Hematologic and Cytogenetic Responses in imatinib-Resistant Accelerated and Blast Phase Chronic Myeloid Leukemia (CML) Patients Treated with the Dual SRC/ABL Kinase Inhibitor N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazolecarboxamide: Results from a Phase I Dose

Escalation Study", por Moshe Talpaz, et al.

Composições Anti-CTLA4 Adicionais

Um anticorpo anti-CTLA4 preferido é o anticorpo anti-CTLA4 ipilimumab. São abrangidos pela presente invenção outros anticorpos anti-CTLA4 e fragmentos que ligam de forma imunoespecífica um polipéptido, fragmento de polipéptido, ou variante de CTLA4, e/ou um epítopo de CTLA4 (conforme determinado através de ensaios imunolõgicos bem conhecidos na técnica para ensaio de ligação anticorpo-antigénio específica). Os anticorpos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, humanos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos da invenção), e fragmentos de ligação a epítopo de quaisquer dos anteriores, o termo "anticorpo," conforme utilizado no presente documento, refere-se a moléculas de imunoglobulina e porção imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto ê, moléculas que contêm um sítio de ligação a antigénio que liga de forma imunoespecífica a um antigénio. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. Além disso, o termo "anticorpo"(Ab) ou "anticorpo monoclonal" (Mab) destina-se a incluir moléculas intactas, bem como, fragmentos de anticorpo (tais como, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')2) que são capazes de ligar especificamente a proteínas. Os fragmentos Fab e F(ab')2 carecem do fragmento Fc do anticorpo intacto, são eliminados mais rapidamente da circulação do animal ou planta, e podem ter menos ligação a tecido não específico do que um anticorpo intacto (Wahl et al. , J. Nucl. Med., 24:316-32S (1983)). Consequentemente, estes fragmentos são preferidos, bem como os produtos de um FAB ou outra biblioteca de expressão de imunoglobulinas. Além disso, os anticorpos anti-CTLA4 incluem anticorpos quiméricos, de cadeia simples, e humanizados.

Os anticorpos anti-CTLA4 podem ser produzidos através de qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em particular, através de síntese química ou preferentemente, através de técnicas de expressão recombinante.

As adnectinas podem ser fabricadas de acordo com os métodos delineados nas Publicações U.S. de propriedade comum N.°s 2007/0082365 e 2008/0139791.

Podem ser adaptadas técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (Patente U.S. N.° 4.946.778; Bird, Science, 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 85:5879-5883 (1988); e Ward et al. , Nature, 334:544-554 (1989)) para produzir anticorpos de cadeia simples. Os anticorpos de cadeia simples são formados através de ligação dos fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv através de uma ponte de aminoãcidos, resultando num polipéptido de cadeia simples. Podem também ser utilizadas técnicas para a montagem de fragmentos Fv funcionais em E. coli (Skerra et al., Science, 242:1038-1041 (1988)). A expressão recombinante de um anticorpo anti-CTLA4, ou fragmento, derivado ou análogo do mesmo, (por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou um anticorpo de cadeia simples), requer a construção de um vetor de expressão contendo um polinucleótido que codifica o anticorpo. Após ter sido obtido um polinucleótido codificando uma molécula de anticorpo anti-CTLA4 ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou porção da mesma (preferentemente contendo o domínio variável de cadeia pesada ou leve), o vetor para a produção da molécula de anticorpo anti-CTLA4 pode ser produzida através de tecnologia de ADN recombinante utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Consequentemente, são descritos no presente documento métodos para preparar uma proteína através da expressão de um polinucleótido contendo uma sequência de nucleótidos codificando anticorpos. Podem ser utilizados métodos que são bem conhecidos para os peritos na especialidade para construir vetores de expressão contendo sequências codificando anticorpos e sinais de controlo transcricional e traducional adequados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. Consequentemente os vetores replicáveis compreendem uma sequência de nucleótidos codificando um anticorpo anti-CTLA4, ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, operavelmente liga a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleótidos codificando a região constante da molécula de anticorpo (veja-se, por exemplo, as Publicações PCT N.°s WO 86/05807 e WO 89/01036; e a Patente U.S. N.° 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado num tal vetor para expressão da cadeia pesada ou leve inteira. 0 vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira através de técnicas convencionais e as células transfetadas são então cultivadas através de técnicas convencionais para produzir um anticorpo anti-CTLA4. Consequentemente, as célula hospedeiras contêm um polinucleótido codificando um anticorpo anti-CTLA4, ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo, ou um anticorpo de cadeia simples da invenção, ligado operavelmente a um promotor heterólogo. Para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, podem ser coexpressos vetores codificando as cadeias tanto pesada como leve na célula hospedeira para expressão da molécula de imunoglobulina inteira, como detalhado abaixo.

Pode ser utilizada uma variedade de hospedeiro-vetor de expressão para expressar as moléculas de anticorpo anti- CTLA4. Tais sistemas de expressão em hospedeiros representam veículos através dos quais as sequências codificantes de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas representam também células que podem, quando transformadas ou transfetadas com as sequências codificantes de nucleótidos adequadas, expressam uma molécula de anticorpo in situ. Estes incluem microrganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtil is) transformadas com ADN bacteriófago recombinante, vetores de expressão de ADN de plasmídeo ou ADN de cosmídeo contendo sequências codificantes de anticorpos; leveduras (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas com vetores de expressão de leveduras recombinantes contendo sequências codificantes de anticorpos; sistemas de células de insetos com vetores de expressão virais recombinantes (por exemplo, baculovírus) contendo sequências codificantes de anticorpos; sistemas de células vegetais com vetores de expressão virais recombinantes (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão de plasmídeos recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências codificantes de anticorpos; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, COS, CHO, BHK, 293, células 3T3) albergando construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados a partir do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou a partir de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovirus; o promotor 7,5K do vírus vaccinia). Preferentemente, são utilizadas células bacterianas tais como Escherichia coli, e mais preferentemente, células eucarióticas, especialmente para a expressão da molécula de anticorpo recombinante inteira, para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, as células de mamífero tais como células de ovário de hãmster chinês(CHO), em conjunto com um vetor tal como o elemento promotor de gene precoce intermédio principal a partir do citomegalovírus humano são um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al, , Gene, 45:101 (1986); Cockett et al, , Bio/Technology, 8:2 (1990)).

Em sistemas bacterianos, uma série de vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo da utilização pretendida para a molécula de anticorpo a ser expressa. Por exemplo, quando se destina a ser produzida uma grande quantidade de uma tal proteína, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, podem ser desejáveis vetores que dirijam a expressão de níveis elevados de produtos de proteína de fusão que sejam prontamente purificados. Tais vetores incluem o vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J., 2:1791 (1983)), no qual a sequência de codificação de anticorpo pode estar ligada individualmente ao vetor em estrutura com a região de codificação lac Z de modo a ser produzida uma proteína de fusão; vetores pIN (Inouye et al. , Nucleic Acids Res., 13:3101-3109 (1985); Van Heeke et al., J. Biol. Chem., 24:5503-5509 (1989)); e semelhantes. Os vetores pGEX podem também ser utilizados para expressar péptidos estranhos como proteínas de fusão com glutationa-S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purificadas a partir de células lisadas através de adsorção e ligação a microsferas de matriz de glutationa-agarose seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são desenhados para incluir sítios de clivagem de trombina ou protease de fator Xa de modo a que o produto génico alvo clonado possa ser libertado a partir da fração GST.

Num sistema de inseto, é utilizado vírus de poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) como um vetor para expressar genes estranhos. 0 vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo o gene de poliedrina) do vírus e colocada sob o controlo de um promotor de AcNPV (por exemplo o promotor de poliedrina).

Em células hospedeiras de mamíferos, podem ser utilizados uma série de sistemas de expressão à base de vírus. Em casos onde é utilizado um adenovirus como um vetor de expressão, a sequência de codificação do anticorpo anti-CTLA4 pode ser ligada a um complexo de transcrição/'tradução de adenovirus, por exemplo, o promotor tardio e sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovirus através de recombinação in vitro ou in vivo. A inserção de uma região não essencial do genoma virai (por exemplo, região EI ou E3) irã resultar num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infetados, (por exemplo, veja-se Logan et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 81:355-359 (1984)). Podem também ser requeridos sinais de iniciação específicos para tradução eficaz de sequências de codificação de anticorpos inseridas. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Adicionalmente, o codão e iniciação deve estar em fase com a grelha de leitura da sequência de codificação desejada para garantir a tradução da inserção total. Estes sinais de controlo traducional e codões de iniciação exógenos podem ser de uma variedade de origens, tanto naturais como sintéticas. A eficácia de expressão pode ser potenciada pela inclusão de elementos de potenciamento de transcrição adequados, terminadores de transcrição, etc. (veja-se Bitter et al. , Meth. Enzymol., 153 : 516-544(1987)) .

Adicionalmente, pode ser eleita uma estirpe de células hospedeiras que module a expressão das sequências inseridas, ou modifique e processe o produto génico da forma específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) dos produtos proteicos pode ser importante para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-traducional e modificação de proteínas e produtos génicos. Podem ser eleitas linhas celulares ou sistemas de hospedeiros adequados para garantir a modificação e processamento corretos da proteína estranha expressa. Para esta finalidade, podem ser utilizadas células hospedeiras eucarióticas que possuam a maquinaria celular para processamento adequado do transcrito primário, glicosilação, e fosforilação do produto génico. Tais células hospedeiras de mamíferos incluem CEO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, e em particular, linhas celulares de cancro da mama tais como, por exemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, e linhas celulares de glândulas mamárias normais tais como, por exemplo, CRL7030 e Hs578Bst.

Para a produção de proteínas recombinantes a longo prazo e de rendimento elevado, é preferida expressão estável. Por exemplo, podem ser manipuladas linhas celulares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo CTLA4. Em vez de utilizar vetores de expressão que contêm origens de replicação virais, as células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado por elementos de controlo de expressão adequados (por exemplo, promotor, potenciador, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Após a introdução do ADN estranho, as células manipuladas podem ser deixadas crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido, e posteriormente são permutadas para um meio seletivo. 0 marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo nos seus cromossomas e cresçam para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode vantajosamente ser utilizado para manipular linhas celulares que expressam a molécula de anticorpo. Tais linhas celulares manipuladas podem ser particularmente úteis no rastreio e avaliação de compostos que interagem diretamente ou indiretamente com a molécula de anticorpo anti-CTLA4.

Podem ser utilizados uma série de sistemas de seleção, incluindo os genes da timidina quinase do vírus do herpes simplex (Wigler et ai., Cell, 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 48:202 (1992)), e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al. , Cell, 22:817 (1980)) podem ser empregues em células tk, hgprt ou aprt, respetivamente. Igualmente, pode ser utilizada resistência antimetabolito como a base da seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 77:357 (1980); 0'Hare et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 78:1527 (1981)); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 78:2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 Clinicai Pharmacy, 12(7):488-505 (1993); Wu et al., Biotherapy, 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596 (1993); Mulligan, Science, 260:926-932 (1993); e Morgan et al. , Ann. Rev. Biochem., 62:191-217 (1993); TIB TECH, 11(5):155-215 (maio de 1993)); e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al. , Gene, 30:147 (1984)). Podem ser rotineiramente aplicados métodos habitualmente conhecidos na técnica da tecnologia de ADN recombinante para selecionar o clone recombinante desejado, e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et ai., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Ê Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. , eds. , Current Protocols in Human Genetics, John Wiley Ê Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981).

Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo anti-CTLA4 podem ser aumentados através de amplificação de vetor (para uma revisão, veja-se Bebbington et al., "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" em DNA Cloning, Vol. 3, Academic Press, NI (1987)). Quando um marcador no sistema de vetor expressando anticorpo é amplificãvel, o aumento do nível de inibidor presente na cultura de células hospedeiras irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Dado que a região amplificada está associada com o gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al. , Mol. Cell. Biol., 3:257 (1983)) . A célula hospedeira pode ser co-transfetada com dois vetores de expressão, o primeiro vetor codificando um polipéptido derivado a partir de cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipéptido derivado a partir de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que permitem a expressão igual dos polipéptidos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, pode ser utilizado um único vetor que codifica, e é capaz de expressar, polipéptidos tanto de cadeia leve como pesada. Em tais situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, Nature, 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 77:2197 (1980)). As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender ADNc ou ADN genómico.

Após uma molécula de anticorpo ter sido produzida por um animal, quimicamente sintetizada ou expressa recombinantemente, pode ser purificada através de qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, através de cromatografia (por exemplo, permuta iónica, afinidade, particularmente através de afinidade pelo antigénio específico após Proteína A, e cromatografia de coluna de tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, ou através de qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Adicionalmente, os anticorpos anti-CTLA4 ou fragmentos dos mesmos podem ser fusionados com sequências polipeptídicas heterõlogas descritas no presente documento ou de outra forma conhecidas na técnica, para facilitar a puri f icaçao.

As composições podem compreender polipéptidos conjugados com domínios de anticorpo anti-CTLA4 para além das regiões variáveis. Por exemplo, os polipéptidos podem ser fusionados ou conjugados com a região Fc de um anticorpo, ou porção do mesmo. A porção de anticorpo anti-CTLA4fusionada a um polipéptido pode compreender a região constante, região de dobradiça, domínio CHI, domínio CH2, e domínio CH3 ou qualquer combinação de domínios inteiros ou porções dos mesmos. Os polipéptidos podem também ser fusionados ou conjugados às porções de anticorpo acima para formar multímeros. Por exemplo, Porções Fc fusionadas aos polipéptidos da presente invenção podem formar dímeros através de ligações dissulfeto entre as porções Fc. Podem ser fabricadas formas multiméricas superiores fusionando os polipéptidos a porções de IgA e IgM. São conhecidos na técnica métodos para fusionar ou conjugar os polipéptidos da presente invenção a porções de anticorpo. Veja-se, por exemplo, as Patentes U.S. N.°s 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851 e 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; Publicações PCT N.°s WO 96/04388 e WO 91/06570; Ashkenazi et ai. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 88:10535-10539 (1991); Zheng et al. , J. Immunol., 154:5590-5600 (1995); e Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 89:11337-11341 (1992) .

Adicionalmente, um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento do mesmo pode ser conjugado com uma fração terapêutica tal como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostãtico ou citocida, um agente terapêutico ou um ião metálico radioativo, por exemplo, emissores alfa tais como, por exemplo, 213Bi. Um agente de citotoxina ou citostático inclui qualquer agente que seja prejudicial para as células. Exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Agentes terapêuticos incluem antimetabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitõticos (e.g., vincristina e vinblastina).

Os conjugados podem ser utilizados para modificar um determinada resposta biológica, o agente terapêutico ou fração de fármaco não se destina a ser interpretado como limitado a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a fração do fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido que possui uma atividade biológica desejada, tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, ou toxina de difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral, interferão a, interferão β, fator de crescimento dos nervos, fator de crescimento derivado de plaquetas, ativador de plasminogénio tecidual, um agente apoptótico, por exemplo, TNF-alfa, TNF-beta, AIM I (Veja-se a Publicação PCT N.° WO 97/33899), AIM II (Veja-se a Publicação PCT N.° WO 97/34911), Ligando FAS (Takahashi et al., Int. Immunol,, 6:1567-1574 (1994)), VEGI (Veja-se a Publicação PCT N.° WO 99/23105), um agente trombótico ou um agente anti-angiogénico, por exemplo, angiostatina ou endostatina,· ou, modificadores de resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos ("GM-CSF"), fator de estimulação de colónias de granulócitos ("G-CSF"), ou outros fatores de crescimento. São bem conhecidas técnicas para conjugar tal fração a anticorpos, veja-se, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al,, eds., pãgs. 243-256, Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies for Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al. , eds., págs. 623-653, Marcel Dekker, Inc. (1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies 84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al., eds., págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. , eds., pãgs. 303-316, Academic Press (1985), e Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-158 (1982).

Alternativamente, um anticorpo anti-CTLA4 pode ser conjugado a um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpos conforme descrito por Segai na Patente U.S. N.° 4.676.980.

Um anticorpo anti-CTLA4, com ou sem uma fração terapêutica conjugada ao mesmo, administrado por si só ou em combinação com fator(es) citotóxico(s) e/ou citocina(s) pode ser utilizado como um agente terapêutico.

Podem ser criados anticorpos sintéticos direcionados contra os polipéptidos descritos no presente documento. Um exemplo de anticorpos sintéticos é descrito em Radrizzani, SYL , et ai. , Medicina (Aires), 59(6):753-758, (1999)). Recentemente, foi descrita uma nova classe de anticorpos sintéticos e estes são referidos como polímeros molecularmente imprimados (MIPs) (Semorex, Inc.). Os anticorpos, péptidos, e enzima são frequentemente utilizados como elementos de reconhecimento molecular em sensores químicos e biológicos. Contudo, a sua falta de estabilidade e mecanismos de transdução de sinais limita a sua utilização como dispositivos de deteção. Os polímeros molecularmente imprimados (MIPs) são capazes de imitar a função dos recetores biológicos mas com menos restrições de estabilidade. Tais polímeros proporcionam elevada sensibilidade e seletividade enquanto mantendo excelente estabilidade térmica e mecânica. Os MIPs têm a capacidade de ligar a moléculas pequenas e de visar moléculas tais como orgânicas e proteicas com igual ou maior potência do que a dos anticorpos naturais. Estes "super" MIPs têm afinidades mais elevadas pelo seu alvo e consequentemente requerem menores concentrações para ligação eficaz.

Durante a síntese, os MIPs são imprimados de modo a ter o tamanho, forma, carga e grupos funcionais complementares do alvo selecionado ao utilizar a própria molécula alvo (tal como um péptido, anticorpo, etc.) ou uma substância tendo uma estrutura muito semelhante, como a sua "impressão" ou "molde." Os MIPs podem ser derivatizados com os mesmos reagentes administrados a anticorpos. Por exemplo, "super" MIPs fluorescentes podem ser revestidos em microsferas ou poços para utilização em separações altamente sensíveis ou ensaios, ou para utilização no rastreio de alto rendimento de proteínas.

Podem ser empregues uma série de métodos para criar MIPs para um recetor, ligando, polipéptido, péptido, molécula orgânica específicos. São descritos vários métodos preferidos por Esteban et al. em J. Analytical Chem., 370(7):795-802 (2001). São bem conhecidos na técnica métodos adicionais, tais como por exemplo, Hart, B.R. et al., J. Am. Chem. Soc., 123(9):2072-2073 (2001); e Quaglia, M. et. al., J. Am. Chem. Soc., 123(10):2146-2154 (2001).

Os oligonucleótidos anti sentido podem ser de cadeia simples ou dupla. Os ARNs de cadeia dupla podem ser desenhados com base nos ensinamentos de Paddison et al. , Proc. Nat. Acad. Sei., 99:1443-1448 (2002); e Publicações PCT N.°s WO 01/29058, e WO 99/32619.

Os ARNs de cadeia dupla podem também tomar a forma de um inibidor de ARN ("ARNi") de modo a serem competentes para interferência de ARN. Por exemplo, as moléculas de ARNi anti-CTLA4 podem tomar a forma das moléculas descritas por Mello e Fire nas Publicações PCT N.°s WO 1999/032619 e WO 2001/029058; Publicações U.S. N.°s 2003/0051263, 2003/0055020, 2003/0056235, 2004/265839, 2005/0100913, 2006/0024798, 2008/0050342, 2008/0081373, 2008/0248576, e 2008/055443; e/ou Patentes U.S. N.°s 6.506.559, 7.282.564, 7.538.095 e 7.560.438.

Por exemplo, as moléculas de ARNi anti-CTLA4 podem ser ARN de cadeia dupla, e de entre 25 e 400 nucleótidos de comprimento, e complementares com a sequência de nucleótidos de codificação de CTLA4. Tais moléculas de ARNi podem ter cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 45, e cerca de 50 nucleótidos de comprimento. Neste contexto, o termo "cerca" é interpretado como tendo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 nucleótidos de comprimento tanto na direção 5' como 3', ou ambas.

Alternativamente, as moléculas de ARNi anti-CTLA4 podem tomar a forma de moléculas de ARNi de cadeia dupla descritas por Kreutzer nas Patentes Europeias N.°s EP 1144639, e EP 1214945. Especificamente, as moléculas de ARNi anti-CTLA4 podem ser ARN de cadeia dupla que é complementar à região de codificação de CTL4, e tem entre cerca de 15 e cerca de 49 nucleótidos de comprimento, e preferentemente entre cerca de 15 até cerca de 21 nucleótidos de comprimento. Neste contexto, o termo "cerca" é interpretado como tendo cerca del, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleótidos de comprimento tanto na direção 5' como 3', ou ambas. Tais moléculas anti-CTLA-4 podem ser estabilizadas através de ligação química das cadeias de ARN simples.

Alternativamente, as moléculas de ARNi anti-CTLA4 podem tomar a forma de moléculas de ARNi de cadeia dupla descritas por Tuschl na Patente Europeia N.° EP 1309726.

Especificamente, as moléculas anti-CTLA4 de ARNi podem ser de ARN de cadeia dupla que é complementar à região de codificação de CTLA4, e têm de cerca de 21 a cerca de 23 nucleótidos de comprimento, e têm ou extremidades cegas ou contêm um ou mais cadeias suspensas no terminal 5' ou terminal 3' de uma ou ambas cadeias com cada cadeia suspensa tendo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou mais nucleótidos de comprimento. As extremidades de cada cadeia podem ser modificadas através de fosforilação, hidroxilação, ou outras modificações. Adicionalmente, as ligações internucleotídicas de um ou mais dos nucleótidos podem ser modificadas, e podem conter 2'-OH. Neste contexto, o termo "cerca" é interpretado como tendo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleótidos de comprimento tanto na direção 5' como 3', ou ambas. Tais moléculas anti-CTLA-4 podem ser estabilizadas através de ligação química das cadeias de ARN simples.

Alternativamente, o ARNi anti-CTLA4 pode tomar a forma de moléculas de ARNi de cadeia dupla descritas por Tuschl nas Patentes U.S. N.°s 7.056.704 e 7.078.196. Especificamente, as moléculas anti-CTLA4 de ARNi podem ser de ARN de cadeia dupla que é complementar à região de codificação de CTLA4, e têm de cerca de 19 a cerca de 25 nucleótidos de comprimento, e têm ou extremidades cegas ou contêm um ou mais cadeias suspensas no terminal 5' ou terminal 3' de uma ou ambas cadeias com cada cadeia suspensa tendo cerca de 1, 2, 3, 4, ou 5 ou mais nucleótidos de comprimento. As extremidades de cada cadeia podem ser modificadas através de fosforilação, hidroxilação, ou outras modificações. Adicionalmente, as ligações internucleotídicas de um ou mais dos nucleótidos podem ser modificadas, e podem conter 2'-OH. Neste contexto, o termo "cerca" é interpretado como tendo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleótidos de comprimento tanto na direção 5' como 3', ou ambas. Tais moléculas anti-CTLA-4 podem ser estabilizadas através de ligação química das cadeias de ARN simples.

Adicionalmente, as moléculas de ARNi anti-CTLA4 pode tomar a forma de moléculas de ARN descritas por Crooke nas Patentes U.S. N.°s 5.898.031 e 6.107.094, 7.432.249, e 7.432.250, e Pedido de Patente Europeu N.° EP 0928290. Especificamente, as moléculas anti-CTLA4 podem ser ARN de cadeia simples, contendo um primeiro segmento tendo pelo menos uma primeira subunidade de nucleosídeo de ribofuranosilo que é modificada para melhorar a afinidade de ligação do dito composto ao alvo de ARN pré-selecionado quando comparado com a afinidade de ligação de um oligorribonucleótido não modificado ao alvo de ARN; e um segundo segmento compreendendo pelo menos quatro subunidades de nucleosídeo de ribofuranosilo consecutivas tendo frações 2'-hidroxilo no mesmo; as ditas subunidades de nucleosídeo do dito composto oligomérico estando unidas por ligações internucleosídicas que são modificadas para estabilizar as ditas ligações contra a degradação conforme comparado com ligações fosfodiéster. Preferentemente, tais moléculas de ARN têm cerca de 15 a 25 nucleótidos de comprimento, ou cerca de 17 a cerca de 20 nucleótidos de comprimento. Preferentemente as ditas moléculas são competentes para ativar uma enzima ARNase de cadeia dupla para efetuar clivagem do ARN de CTLA4. Neste contexto, o termo "cerca" é interpretado como tendo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleótidos de comprimento tanto na direção 5' como 3', ou ambas. Tais moléculas anti-CTLA-4 podem ser estabilizadas através de ligação química das cadeias de ARN simples.

Os reagentes ARNsi são úteis para inibir a expressão dos polinucleótidos e podem ter eficácia terapêutica. São conhecidos vários métodos na técnica para o tratamento terapêutico de distúrbios através da administração de reagentes ARNsi. Um tal método é descrito por Tiscornia et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 100(4):844-1848 (2003)); documento WO 04/09769, depositado a 18 de julho de 2003; e Reich, S.J. et al. , Mol. Vis., 9:210-216 (30 de maio de 2003) .

De modo a facilitar uma compreensão adicional da invenção, os seguintes exemplos são apresentados primariamente para o propósito de ilustrar detalhes mais específicos da mesma.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 - MÉTODO DE AVALIAR 0 EFEITO DA COMBINAÇÃO DE UM INIBIDOR DE PROTEÍNA TIROSINA QUINASE COM UM MODULADOR DE VIAS CQESTIMULATÕRIO SOBRE 0 CRESCIMENTO TUMORAL EM TRÊS MODELOS DE TUMOR DE RATINHO O efeito de dasatinib sobre a função imune tem sido o objeto de investigações recentes. Alguns relatórios demonstraram que in vitro, o dasatinib (concentrações de 10-50 nM) , inibe a função de células T, conforme medido através de inibição da secreção e desgranulação de citoquinas (Weischel et al. , 2008) que foi postulada como sendo o resultado da inibição de Lck. Outros relatórios demonstraram que o dasatinib produziu bloqueamento da ativação de células T (Schade et al., 2007). Contudo, o tratamento com dasatinib pode também ter efeitos imunomodulatórios com base na sua potente inibição de STAT3, o que pode resultar na maturação de células dendríticas e modulação das respostas de células T (Yu, H. et al., 2007), e na sensibilidade diferencial dos efetores T e células regulatórias T à inibição da sinalização de células T (Siggs et al., 2007). Adicionalmente, foram detetados linfócitos granulares de grande tamanho em efusões pleurais a partir de pacientes tratados com dasatinib, e de interesse, todos estes pacientes tinham pelo menos um alelo HLA-A2 (Mustojski et al. , 2008). É colocada a hipótese de que a infiltração de LGL possa ser o resultado de imunoestimulação. Consequentemente, existiu um interesse em determinar se uma potenciação de uma resposta imune anti tumoral poderia ser alcançada através da combinação de um mAb de bloqueamento de CTLA-4 e dasatinib em modelos onde o dasatinib tem efeito mínimo.

Foram levados a cabo estudos de eficácia em 3 modelos: fibrossarcoma SA1N, carcinoma do cólon CT26 e carcinoma pulmonar M109. Os primeiros 2 modelos são sensíveis ao efeito do bloqueamento de CTLA-4, enquanto o dasatinib mostrou atividade anti tumoral modesta no modelo SA1N mas atividade mínima contra os modelos CT 26 e M109. Conforme mostrado na FIG. 1A-1B e FIG. 2 o tratamento concomitante com mAb CTLA-4 + dasatinib resultou em efeitos sinérgicos. Foi observada sinergia quando foi administrado dasatinib a 30 mg/kg ou num regime de dosagem diário ou após um regime intermitente (5 dias sim/2 dias não) . Não foi observada sinergia no modelo de tumor M109.

Foram levados a cabo estudos adicionais no modelo de tumor CT2 6 para determinar se o efeito da combinação foi devido a uma expansão de células T citotóxicas e para determinar se os tratamentos alteravam a composição das células imunes nos nódulos linfáticos de drenagem de tumores. Foi observada atividade citolítica aumentada em animais tratados com o tratamento de combinação em comparação com animais tratados com tratamentos únicos (FIG. 3A-3C). Adicionalmente, quando a razão de células T efetoras/células T regulatórias (população supressora) foi medida, o grupo tratado com tratamento de combinação e com dasatinib mostraram uma razão aumentada, indicando um número mais elevado de células T efetoras sobre células T regulatórias. Com base nos resultados obtidos no modelo CT-26 é provável que a adição de dasatinib à terapêutica de CILA-4 reduza o número de células T regulatórias enquanto expandindo a percentagem de células T efetoras resultando num potenciamento da resposta imune anti tumoral desencadeada pela monoterapêutica anti-CTLA-4. EXEMPLO 2 - MÉTODO DE AVALIAR 0 EFEITO DA COMBINAÇÃO DE UM INIBIDOR DE PROTEÍNA TIROSINA QUINASE COM UM MODULADOR DE VIAS COESTIMULATÓRIO SOBRE 0 CRESCIMENTO TUMORAL NUM MODELO DE TUMOR DE MASTOCITOMA DE RATINHO P815

Foi avaliado o tratamento concomitante com SPRYCEL® e anticorpo anti-CTLA-4 num modelo de tumor de mastocitoma de ratinho P815. Os métodos utilizados foram essencialmente conforme delineado no Exemplo 1 no presente documento. SPRYCEL® mostrou atividade anti tumoral modesta no modelo P815. Conforme mostrado na Figura 5, o tratamento concomitante com mAb CTLA-4 + SPRYCEL® resultou em efeitos sinérgicos. Foi observada sinergia quando foi administrado SPRYCEL® a 30 mg/kg ou num regime de dosagem diário ou após um regime intermitente (5 dias sim/'2 dias não) .

Estes resultados foram consistentes com os resultados observados nos modelos de tumor SAIN e CT2 6 (veja-se as

Figuras 1A-B e 2), e confirmam que a administração de um inibidor de proteína tirosina quinase em combinação com um anticorpo CTLA-4 resulta na redução sinérgica da proliferação tumoral.

EXEMPLO 3 -MÉTODO DE AVALIAR A ATIVIDADE ANTITUMORAL DO BLOQUEAMENTO DO ANTIGÉNIO DE LINFÓCITOS T CITOTÓXICQ 4 (CTLA-4) POR SI SÓ OU EM COMBINAÇÃO COM PACLITAXEL (PAC) , ETOPÓSIDO (ETO), OU GEMCITABINA (GEM) EM MODELOS DE RATINHO

Para determinar se a atividade anti tumoral de um anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 (mAb CTLA-4) é sinérgica ou inibida pela adição de agentes quimioterapêuticos, o mAb CTLA-4 foi avaliado por si só e em combinação com Pac, Eto, ou Gem em modelos de tumor de ratinho. Os modelos de carcinoma pulmonar MIO9, fibrossarcoma SA1N, e carcinoma do cólon CT26 foram eleitos com base em diferente sensibilidade aos agentes quimioterapêuticos e bloqueamento de CTLA-4.

Todos os compostos foram testados na sua dose e regime ótimos. Quando utilizado em combinação, o mAb CTLA-4 foi iniciado um dia após a primeira dose de quimioterapia. Foram utilizados a percentagem de inibição do crescimento tumoral e o número de dias até alcançar o tamanho tumoral alvo para avaliar a eficácia. A atividade anti tumoral foi pontuada como: regressão completa (CR; tumor não palpável durante > 2 avaliações) ou regressão parcial (PR; 50% de redução do volume tumoral durante > 2 avaliações) . A sinergia foi definida como atividade anti tumoral significativamente superior (p<0,05) à atividade de monoterapêutica com cada agente.

No modelo de tumor subcutâneo M109, que é insensível ao bloqueamento de CTLA-4 e modestamente sensível a Pac, Eto, e Gem, foi evidente sinergia limite com a combinação de mAb CTLA-4 e Pac, enquanto não foi observado qualquer efeito com Eto. A monoterapêutica com Gem não produziu atividade anti tumoral de M109 significativa; contudo, a combinação de Gem com mAb CTL-4 resultou em sinergia. No modelo de metástase de pulmão M109, foi detetada sinergia para mAb CTLA-4 em combinação com Eto, foi constatada sinergia limite com Gem, e Pac não potenciou a atividade. 0 fibrossarcoma SA1N é sensível ao bloqueamento de CTLA-4 e às três quimioterapias. Pac, Eto, e Gem potenciaram a atividade do mAb CTLA-4 neste modelo,, mas somente foi observada sinergia com Eto. 0 mAb CTLA-4 e Pac foram ineficazes contra os tumores de carcinoma do cólon CT26 estabelecidos, mas sinérgicos quando a carga tumoral era mínima. Tanto Eto como Gem foram eficazes como agentes únicos neste modelo e a atividade de ambos foi significativamente sinergizada pelo mAb CTLA-4.

Em resumo, a adição do mAb CTLA-4 a Eto, Gem, ou Pac resultou em atividades sinérgicas dependentes de modelo. Foi observada sinergia independentemente da imunogenicidade do tumor e somente quando pelo menos uma das terapêuticas era ativa. Todos os regimes de combinação foram bem tolerados e as quimioterapias não pareceram inibir a atividade do mAb CTLA-4 no modelo de tumor SA1N. De particular importância, foi observada sinergia em tumores não responsivos ao mAb CTLA-4 por si só, sugerindo que os agentes quimioterapêuticos podem ter induzido a morte celular imunogénica. Estas constatações proporcionam suporte para a avaliação de combinações de quimioimunoterapêutica em ensaios clínicos. Os dados para combinações em cada modelo de ratinho são delineados individualmente nos seguintes exemplos.

EXEMPLO 4 - MÉTODO DE AVALIAR A ATIVIDADE ANTITUMORAL DO BLOQUEAMENTO DO ANTIGÉNIO DE LINFÓCITOS T CITOTÓXICO 4 (CTLA-4) POR SI SÓ OU EM COMBINAÇÃO COM PACLITAXEL (PAC), ETOPÓSIDO (ETO) , OU GEMCITABINA (GEM) NUM MODELO DE TUMOR SUBCUTÂNEO Ml09 DE RATINHO 0 efeito de paclitaxel, etopósido e gemcitabina em combinação com o bloqueamento de CTLA-4 foi avaliado num modelo de tumor de carcinoma pulmonar M1G9 subcutâneo para estabelecer a eficácia de cada combinação de tratamento.

Os tumores M109 são insensíveis ao bloqueamento de CTLA-4 e modestamente sensíveis a paclitaxel, etopósido e gemcitabina. A combinação de CTLA-4 + Paclitaxel produziu atividade anti tumoral potenciada em comparação com cada agente por si só, enquanto não foi observado qualquer potenciamento com Etopósido. Por outro lado, muito embora Gemcitabina como agente único não produzisse atividade anti tumoral significativa, Gemcitabina mais mAb CTLA-4 produziu efeitos sinérgicos (Quadro 1). _QUADRO 1_

Atividade Antitumoral do mAb CTLA-4 em Combinação com Paclitaxel, Etopósido e Gemcitabina no Modelo de Tumor de

Carcinoma Pulmonar Ml09

Tratamento Dose Regime % TGI T-C PR CR Resultado (mg (Dias de (Média) (1000 / Estudo) mm3) __kg)_______ mAb CTLA-4 20 8,12,16 0 000 (clone UC10)________

Paclitaxel 24 7,11,15__45__5 0__0__

Paclitaxel + 24 7,11,15 62 8 00 Sinergia mAb CTLA-4 20 8,12,16 Limite

Etopósido 50 7,14,21 59 900

Etopósido + 50 7,14,21 65 11 0 0 mAb CTLA-4 20 8,12,16______

Gemcitabina 120 7,11,15 32 2,2 0 0

Gemcitabina 120 14,18,22 62 11 0 0 Sinergia + mAb CTLA-4 20 8,12,16 TVDT = 5,4 dias EXEMPLO 5 -MÉTODO DE AVALIAR A ATIVIDADE ANTITUMORAL DO BLOQUEAMENTO DO ANTIGÉNIO DE LINFÓCITOS T CITOTÓXICQ 4 (CTLA-4) POR SI SÓ OU EM COMBINAÇÃO COM PACLITAXEL (PAC) ,

ETGPÓSIDO (ETO) , OU GEMCITABINA (GEM) NUM MODELO DE TUMOR DE METASTASE PULMONAR Ml09 DE RATINHO EXPERIMENTAL O efeito de paclitaxel, etopósido e gemcitabina em combinação com o bloqueamento de CTLA-4 foi avaliado num modelo de tumor de metãstase pulmonar M109 experimental para estabelecer a eficácia de cada combinação de tratamento.

No modelo de metástase de pulmão M019, Etopósido e mAb CTLA-4 mostraram atividade sinérgica enquanto a combinação com Gemcitabina teve sinergia limite (Quadro 2). QUADRO 2

Efeito do mAb CTLA-4 em Combinação com Agentes Quimioterapêuticos no Modelo de Carcinoma de Pulmão M019 de Metãstase Pulmonar Experimental

Dose Regime Tempo Médio Efeito de (mg / (Dias de de Combinação kg) Estudo) Sobrevivênci a (dias)

Veículo de 32 controlo_____ mAb CTLA-4__20___33__

Gemcitabina__150___42__

Gemcitabina + 150 4,8,12 47 Sinergia mAb CTLA-4 20 5,9,13 Limite

Etopósido 50 4,11,18 34

Etopósido + mAb 50 4,11,18 43 Sinergia CTLA-4__20____

Paclitaxel 24 38

Paclitaxel + mAb 24 39 CTLA-4_ 20 ___

EXEMPLO 6 -MÉTODO DE AVALIAR A ATIVIDADE ANTITUMORAL DO BLOQUEAMENTO DO ANTIGÉNIO DE LINFÓCITOS T CITOTÓXICO 4 (CTLA-4) POR SI SÓ OU EM COMBINAÇÃO COM PACLITAXEL (PAC) , ETOPÓSIDO (ETO) , OU GEMCITABINA (GEM) NUM MODELO DE TUMOR

SUBCUTÂNEO DE FIBROSSARCOMA SA1N DE RATINHO O efeito de paclitaxel, etopósido e gemcitabina em combinação com o bloqueamento de CTLA-4 foi avaliado num modelo de tumor de fibrossarcoma SA1N subcutâneo de ratinho para estabelecer a eficácia de cada combinação de tratamento. SA1N é uma linha tumoral imunogénica sensível ao mAb CTLA-4 e a quimioterapia. Enquanto os 3 agentes quimioterapêuticos potenciaram a atividade do mAb CTLA-4, somente foi observada sinergia com Etopósido (Quadro 3). QUADRO 3

EXEMPLO 7 -MÉTODO DE AVALIAR A ATIVIDADE ANTITUMORAL DO BLOQUEAMENTO DO ΑΝΤΙGÉNIO DE LINFÓCITOS T CITOTÓXICQ 4 (CTLA-4) POR SI SÓ OU EM COMBINAÇÃO COM PACLITAXEL (PAC) ,

ETGPÓSIDO (ETO) , OU GEMCITABINA (GEM) NUM MODELO DE TUMOR DE CARCINOMA DO CÓLON CT26 DE RATINHO O efeito de paclitaxel, etopósido e gemcitabina em combinação com o bloqueamento de CTLA-4 foi avaliado num modelo de tumor de carcinoma do cólon CT26 de ratinho para estabelecer a eficácia de cada combinação de tratamento. CTLA-4 e Paclitaxel são terapêuticas ineficazes contra os tumores de carcinoma do cólon CT26; a sua combinação foi ineficaz contra tumores estabelecidos, mas sinérgica contra carga tumoral mínima. Conforme mostrado no Quadro 4, tanto Etopósido como Gemcitabina foram eficazes como agentes únicos, mas a sua atividade foi significativamente potenciada pela adição do mAb CTLA-4. QUADRO 4

Em resumo, a adição de mAb CTLA-4 a agentes quimioterapêuticos tais como Etopósido, Gemcitabina, Paclitaxel, e Ixabepilona, resultou em atividade sinérgica em vários modelos de tumor. Todos os regimes de combinação foram bem tolerados. De notar, foi observada sinergia em tumores que não responderam a CTLA-4 por si só sugerindo que os agentes quimioterapêuticos podem ter induzido a morte celular imunogénica. Gemcitabina, etopósido, paclitaxel, e ixabepilona como monoterapêutica parecem induzir uma assinatura imunogénica e modulação da resposta imune. De forma importante, os resultados sugerem, que, devido à sua curta semiviva, estes agentes não afetarão a função de células T efetoras. Adicionalmente, pode ser observada sinergia de gemcitabina, etopósido, paclitaxel, e ixabepilona em combinação com o bloqueamento de CTLA-4 em cenários donde o agente quimioterapêutico não induz regressão. Para pelo menos gemcitabina, o tempo de administração foi crítico para o efeito sinérgico somente sendo eficaz o tratamento concomitante com gemcitabina. Estes resultados sugerem que a coadministraçâo de agentes quimioterapêuticos com inibição de CTLA-4 pode ser ótima para o efeito sinérgico. Por último, os ratinhos com resposta completa ("CR") foram capazes de rejeitar um novo desafio com tumor, sugerindo que a geração de uma resposta imune de memória não foi comprometida pelos agentes quimioterapêuticos.

Em conclusão, estas constatações proporcionam evidência de que a combinação de agentes quimioterapêuticos e um mAb de bloqueamento de CTLA-4 homólogo de ipilimumab elicia efeitos anti tumorais eficazes e de longa duração, e que a investigação de ipilimumab em combinação com um agente quimioterapêutico em ensaios clínicos é necessária.

Será claro que a invenção pode ser praticada de outra forma para além de conforme particularmente descrito na descrição e exemplos anteriores. São possíveis numerosas modificações e variações da presente invenção à luz dos ensinamentos acima.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Bristol-Myers Squibb Company

<120> COMBINAÇÃO DE UM ANTICORPO ΑΝΤΙ-CTLA4 COM DIVERSOS REGIMES TERAPÊUTICOS PARA 0 TRATAMENTO SINÉRGICO DE DOENÇAS PROLIFERATIVAS

<130> M/52523-EP-DIV <140> EP 09749268.0 <141> 29-10-2009 <150> US 61/226.910 <151> 20-07-2009 <150> US 12/462168 <151> 30-07-2009 <150> PCT/US2009/052209 <151> 30-07-2009 <16 0 >4 <170> Patentln versão 3.5

<210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Gly Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105

< 210 >2 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Thr Phe lie Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210>3 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>3

He Met Asp Gin Val Pro Phe Ser Val 1 5

<210>4 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Val 1 5

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 2005226875 AI [0012] • WO 2007113648 A2 [0012] • US 2009117132 AI [0012] • US 2007160619 AI [0012] • US 2004005318 AI [0012] • WO 2001014424 A [0017] • WO 2004035607 A [0017] • US 20050201994 A [0017] • EP 1212422 BI [0017] • US 5811097 A [0017] • US 5855887 A [0017] • US 6051227 A [0017] • US 6984720 B [0017] • WO 0114424 A [0017] [0032] • WO 0037504 A [0017] • US 20020039581 A [0017] • US 2002086014 A [0017] • WO 9842752 A [0017] ® US 6682736 B [0017] • US 6207156 B [0017] • US 5977318 A [0017] • US 7109003 B [0017] • US 7132281 B [0017] • US SN11051208 A [0031] • US SN11402502 A [0031] • WO 200767959 A [0032] • US 5504102 A [0033] • US 6262094 B [0039] • US SN09506481 A [0039] • US 6011029 A [0058] • WO 2004015130 A [0058] • US 5618829 A [0060] • US 5639757 A [0060] • US 5728868 A [0060] • US 5804396 A [0060] • US 6100254 A [0060] • US 6127374 A [0060] • US 6245759 B [0060] • US 6306874 B [0060] • US 6313138 B [0060] • US 6316444 B [0060] • US 6329380 B [0060] • US 6344459 B [0060] • US 6420382 B [0060] • US 6479512 B [0060] • US 6498165 B [0060] • US 6544988 B [0060] • US 6562818 B [0060] • US 6586423 B [0060] • US 6586424 B [0060] • US 6740665 B [0060] • US 6794393 B [0060] • US 6875767 B [0060] ® US 6927293 B [0060] • US 6958340 B [0060] • US 10395503 B [0097] • US 20070082365 A [0100] • US 20080139791 A [0100] • US 4946778 A [0101] • WO 8605807 A [0102] • WO 8901036 A [0102] • US 5122464 A [0102] • US 5336603 A [0114] • US 5622929 A [0114] • US 5359046 A [0114] • US 5349053 A [0114] • US 5447851 A [0114] • US 5112946 A [0114] • EP 307434 A [0114] • EP 367166 A [0114] • WO 9604388 A [0114] • WO 9106570 A [0114] • WO 9733899 A [0116] • WO 9734911 A [0116] • WO 9923105 A [0116] • US 4676980 A, Segal [0118] • WO 0129058 A [0123] • WO 9932619 A [0123] • WO 1999032619 A, Mello and Fire [0124] • WO 2001029058 A [0124] • US 20030051263 A [0124] • US 20030055020 A [0124] • US 20030056235 A [0124] • US 2004265839 A [0124] • US 20050100913 A [0124] • US 20060024798 A [0124] • US 20080050342 A [0124] • US 20080081373 A [0124] ® US 20080248576 A [0124] • US 2008055443 A [0124] • US 6506559 B [0124] • US 7282564 B [0124] • US 7538095 B [0124] • US 7560438 B [0124] • EP 1144639 A, Kreutzer [0126] • EP 1214945 A [0126] • EP 1309726 A, Tuschl [0127] • US 7056704 B, Tuschl [0128] • US 7078196 B [0128] • US 5898031 A, Crooke [01293 • US 6107094 A [0129] • US 7432249 B [0129] • US 7432250 B [0129] • EP 0928290 A [0129] • WO 0409769 A [0130] • EP 09749268 A [0154] • US 61226910 B [0154] • US 12462168 B [0154] • US 2009052209 W [0154]

Documentos de não patente citados na descrição • HURWITZ et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, vol. 95 (17), 10067-10071 [0017] • CAMACHO et al. J. Cl in. Ontology, 2004, vol. 22 (145 [0017] • MOKYR et al. Cancer Res, 1998, vol. 58, 5301-5304 [0017] • BRETSCHER, P. et al. Science, 1970, vol. 169, 1042-1049 [0020] • SCHWARTZ, R.H. Science, 1990, vol. 248, 1349-1356 [0020] • LINSLEY, P.S. et al. J. Exp. Med, 1991, vol. 173, 721-730 [0020] • LINSLEY, P.S. et al. J. Exp. Med, 1991, vol. 174, 561-569 [0020] • BRUNET, J.F. et al. Nature, 1987, vol. 328, 267-270 [0020] • GROSS, J. A. et al. J. Immunol, 1992, vol. 149, 380-388 [0020] • LINSLEY, P.S. et al. J. Exp. Med, 1991, vol. 173, 721-730 [0020] • ALEGRE, M.L et al. Nat. Rev. Immunol. , December 2001, vol. 1 (3), 220-228 [0020] • LINDSTEN, T. et al. J. Immunol, 1993, vol. 151, 3489-3499 [0020] • WALUNAS, T. L. et al. Immunity, 1994, vol. 1, 405-413 [0020] • LINSLEY, P.S. et al. Immunity, 1994, vol. 1,793-801 [0020] • WALUNAS, T.L. et al. J. Exp. Meã. , 1996, vol. 183, 2541- 2550 [0020] • KRUMMEL, M.F. et al. J. Exp. Meã., 1996, vol. 183, 2533- 2540 [0020] • BRUNNER, M.C et al. J. Immunol, 1999, vol. 162, 5813-5820 [0020] • GREENWALD, R.J et al. Eur. J. Immunol, 2002, vol. 32, 366-373 [0020] • LEACH, D.R. et al. Science, 1996, vol. 271, 1734-1736 [0021] • VAN ELSAS, A. et al. J. Exp. Meã, 1999, vol. 190, 355-366 [0021] • VAN ELSAS, A. et al. J. Exp. Meã. , 2001, vol . 194, 481- 489 [0021] • HURWITZ, A.A. et al. Cancer Res, 2000, vol. 60, 2444-2448 [0021] • Science, 1996, vol. 274, 2009 [0039] • BULINSKI. J. Cell Sei., 1997, vol . 110, 3055-3064 [0039] ® PANDA. Proc. Natl. Acad. Scí. USA, 1997, vol. 94, 10560- 10564 [0039] • MUHLRADT. Cancer Res, 1997, vol. 57, 3344-3346 [0039] • NICOLAOU. Nature, 1997, vol. 387, 268-272 [0039] • VASQUEZ. Mol. Biol. Cell, 1997, vol . 8, 973-985 [0039] • PANDA. J. Biol. Chem, 1996, vol. 271,29807-29812 [0039] • O'HARE et al. Cancer Res, 2005, vol. 65 (11), 4500-4505 [0094] • MOSHE TALPAZ. Hematologic and Cytogenetic Responses in imatinib-Resistant Accelerated and Blast Phase Chronic Myeloid Leukemia (CML) Patients Treated with the Dual SRC/ABL Kinase Inhibitor N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazolecarboxamide: Results from a Phase I Dose Escalation Study. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), 2004, vol. 104 [0097] • WAHL et al. J. Nucl. Med., 1983, vol. 24, 316-32S [0098] • BIRD. Science, 1988, vol. 242, 423-442 [0101] • HUSTON et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 5879-5883 [0101] • WARD et al. Nature, 1989, vol. 334, 544-554 [0101] • SKERRA et al. Science, 1988, vol. 242, 1038-1041 [0101] • FOECKING et al. Gene, 1986, vol. 45, 101 [0104] • COCKETT et al. Bio/Technology, 1990, vol. 8, 2 [0104] • RUTHER et al. EMBO J, 1983, vol. 2, 1791 [0105] • INOUYE et al. Nucleic Acids Res, 1985, vol. 13, 3101-3109 [0105] • VAN ΗΕΞΚΕ et al. J. Biol. Chem, 1989, vol. 24, 5503-5509 [0105] • LOGAN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 355-359 [0107] • BITTER et al. Meth. Enzymol. , 1987, vol . 153, 516-544 [0107] • WIGLER et al. Cell, 1977, vol. 11,223 [0110] • SZYBALSKA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 48, 202 [0110] • LOWY et al. Cell, 1980, vol. 22, 817 [0110] • WIGLER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 357 [0110] • O' HARE et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, vol. 78, 1527 [0110] • MULLIGAN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, vol. 78, 2072 [0110] • Clinical Pharmacy, 1993, vol. 12 {1), 488-505 [0110] • WU et al. Biotherapy, 1991, vol. 3, 87-95 [0110] • TOLSTOSHEV. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1993, vol. 32, 573-596 [0110] • MULLIGAN. Science, 1993, vol. 260, 926-932 [0110] • MORGAN et al. Ann. Rev. Biochem, 1993, vol. 62, 191-217 [0110] • TIB TECH, May 1993, vol. 11 (5), 155-215 [0110] • SANTERRE et al. Gene, 1984, vol. 30, 147 [0110] • Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley Ê Sons, 1993 [0110] • KRIEGLER. Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual. Stockton Press, 1990 [0110] ® Current Protocols in Human Genetics. John Wiley Ê Sons, 1994 [0110] • COLBERRE-GARAPIN et al. J. Mol. Biol., 1981, vol. 150, 1 [0110] ® The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells. BEBBINGTON et al. DNA Cloning. Academic Press, 1987, vol. 3 [0111] • CROUSE et al. Mol. Cell. Biol., 1983, vol. 3, 257 [0111] • PROUDFOOT. Nature, 1986, vol. 322, 52 [0112] • KOHLER. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 2197 [0112] • ASHKENAZI et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 10535-10539 [0114] • ZHENG et al. J. Immunol., 1995, vol. 154, 5590-5600 [0114] • VIL et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 11337-11341 [0114] • TAKAHASHI et al. Int. Immunol., 1994, vol. 6, 1567-1574 [0116] • Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy. ARNON et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. Alan R. Liss, Inc, 1985, 243-256 [0117] • Antibodies for Drug Delivery. HELLSTROM et al. Controlled Drug Delivery. Marcel Dekker, Inc, 1987, 623-653 [0117] • Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review. THORPE et al. Monoclonal Antibodies 84: Biological and Clinical Applications. 1985, 475-506 [0117] • Analysis, Results, and Future Prospective of the

Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy. Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy. Academic Press, 1985, 303-316 [0117] • THORPE et al. The Preparation and Cytotoxic Properties of

Antibody-Toxin Conjugates. Immunol. Rev., 1982, vol. 62, 119-158 [0117] • RADRIZZANI, M. et al. Medicina (Aires) , 1999, vol. 5 9 (6), 753-758 [0120] • ESTEBAN et al. J. Analytical Chem, 2001, vol. 370 {1), 795-802 [0122] • HART, B.R. et al. J. Am. Chem. Soc, 2001, vol. 123 (9) , 2072-2073 [0122] • QUAGLIA, M. et al. J. Am. Chem. Soc, 2001, vol. 123 (10) , 2146-2154 [0122] • P ADDISON et al. Proc. Nat. Acad. Sci, 2002, vol. 99, 1443-1448 [0123] • TISCORNIA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. , 2003, vol. 100 (4), 844-1848 [0130] • REICH, S. J. et al. Mol. Vis. , 30 May 2003, vol. 9, 210- 216 [0130]

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Um anticorpo anti-CTLA-4 e 4'- Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D- glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para utilização num método para o tratamento do cancro, que compreende administrar a um mamífero com necessidade do mesmo uma quantidade sinérgica terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CTLA-4 com 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4' - (dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo.

2. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4'- (dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo anti-CTLA-4 é selecionado a partir do grupo consistindo em anticorpos de ipilimumab e tremeiimumab.

3. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9- [4,6-0- (R) -etilideno^-D-glucopiranósido] , 4' - (dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo anti-CTLA-4 é ipilimumab.

4. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9- [4,6-0- (R) -etilideno^-D-glucopiranósido] , 4' - (dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o dito cancro é um tumor sólido.

5. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4' -(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com a reivindicação 4, em que odito tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em: cancro pulmonar, sarcoma, fibrossarcoma, cancro pancreático, cancro da próstata, e cancro do cólon.

6. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4' -(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o dito método se destina ao tratamento de um tumor refratário para 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo.

7. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que é administrado 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9 - [4,6-0-(R) -etilideno-β-D-glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo antes da administração do dito anticorpo anti-CTLA4.

8. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9- [4,6-0- (R) -etilideno^-D-glucopiranósido] , 4' - (dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que é administrado 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4-,6-0-(R)- etilideno-p-D-glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo essencialmente simultaneamente com a administração do dito anticorpo anti-CTLA4.

9. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-p-D-glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o dito tratamento do cancro compreende adicionalmente um agente citotõxico anti-prolif erativo quer por si só ou em combinação com terapêutica de radiação.

10. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4' -(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o dito agente citotóxico antiproliferativo é cisplatina.

11. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-p-D-glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o dito agente antiproliferativo é carboplatina.

12. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido] , 4 ' -(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que é administrado 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido] , 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo a uma dose de cerca de 50 mg.

13. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4' -(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que é administrado 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-p-D-glucopiranõsido], 4(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo através de infusão intravenosa como um liõfilo estéril em frascos de dose única contendo etopõsido fosfato equivalente a 100 mg de etopõsido, 32,7 mg de citrato de sódio USP, e 300 mg de dextrano 40.

14. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o dito anti-CTLA4 é administrado cerca de cada três semanas.

15. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranósido] , 4 ' -(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o cancro é cancro de pulmão de células pequenas.

16. 0 anticorpo anti-CTLA-4 e 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno--D-glucopiranósido], 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo, para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que é administrado 4'-Desmetilepipodofilotoxina 9-[4,6-0-(R)-etilideno-β-D-glucopiranõsido] , 4'-(dihidrogenofosfato) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, ou hidrato do mesmo a cerca de 50 mg até cerca de 900 mg por dia, preferentemente a cerca de 100 mg por dia.