JP6587756B2 - 免疫毒素およびチェックポイント阻害剤の併用療法 - Google Patents

Description

本発明は、米国国立保健研究所によって授与されたＣＡ１９７２６４およびＣＡ−１５４２９１の下での政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

発明の技術分野
本発明は免疫療法の領域に関する。特に、本発明は、腫瘍を治療するための併用レジメンと、それらを達成するためのキットおよび医薬とに関する。

発明の背景
神経膠芽腫は、全ての原発性の脳および中枢神経系腫瘍のうちで最も恐ろしい悪性脳腫瘍である。現在の標準の治療でのまたはさらに新規に開発された薬剤での神経膠芽腫患者の生存期間中央値は１５ヶ月未満である。したがって、神経膠芽腫の患者の低い生存の見通しならびにＥＧＦＲ受容体を発現する他の腫瘍を改善するために、高度で効果的な治療方法を開発する差し迫った必要性がある。

本発明の一態様によれば、患者における腫瘍を治療するための方法が提供される。免疫毒素および免疫チェックポイント阻害剤が患者に投与される。免疫毒素は、ＰＥ３８短縮型シュードモナス（Pseudomonas）外毒素に融合された単鎖可変領域抗体を含む。単鎖可変領域抗体は、配列番号６〜１１に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。

本発明の別の態様によれば、腫瘍を治療するためのキットが提供される。キットは、免疫毒素および免疫チェックポイント阻害剤を含む。免疫毒素は、ＰＥ３８短縮型シュードモナス外毒素に融合された単鎖可変領域抗体を含み、この単鎖可変領域抗体は配列番号６〜１１に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する。

本明細書を読んだ際に当業者に明らかであるこれらのおよび他の実施形態は、神経膠芽腫、ならびに上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、即ち、ＥＧＦＲおよびその突然変異体、例えば、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩを発現する他の腫瘍を治療するための治療方法、レジメン、キット、および薬剤を当技術分野に提供する。
[本発明1001]
患者における腫瘍を治療する方法であって、以下の段階を含む、方法：
ＰＥ38短縮型シュードモナス（Pseudomonas）外毒素に融合された単鎖可変領域抗体を含む免疫毒素を前記患者に投与する段階であって、単鎖可変領域抗体が配列番号6〜11に示されるＣＤＲ1、ＣＤＲ2、およびＣＤＲ3領域を有する、段階；および
前記患者に免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階。
[本発明1002]
前記腫瘍が悪性神経膠腫である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記腫瘍が乳がんである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記腫瘍が頭頚部扁平上皮細胞がんである、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記腫瘍が肺がんである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記免疫毒素が前記腫瘍に直接投与される、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記免疫チェックポイントが、ＰＤ−1、ＰＤ−Ｌ1、ＣＴＬＡ−4、ＬＡＧ−3、ＴＩＭ−3、およびＣＳＦ−1Ｒからなる群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−1抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−Ｌ1抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＣＴＬＡ4抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＬＡＧ−3抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＴＩＭ−3抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＣＳＦ−1Ｒ抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記チェックポイント阻害剤がＩＤＯの小分子阻害剤である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記チェックポイント阻害剤がＣＳＦ−1Ｒの小分子阻害剤である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記免疫チェックポイント阻害剤が前記免疫毒素の投与の30日以内に投与される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記免疫チェックポイント阻害剤が前記免疫毒素の投与の7日以内に投与される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記ＰＥ38短縮型シュードモナス外毒素がＫＤＥＬペプチドに融合されている、本発明1001の方法。
[本発明1019]
腫瘍を治療するためのキットであって、以下を含む、キット：
ＰＥ38短縮型シュードモナス外毒素に融合された単鎖可変領域抗体を含む免疫毒素であって、単鎖可変領域抗体が配列番号6〜11に示されるＣＤＲ1、ＣＤＲ2、およびＣＤＲ3領域を有する、免疫毒素；および
免疫チェックポイント阻害剤。
[本発明1020]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−1抗体である、本発明1019のキット。
[本発明1021]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤＬ−1抗体である、本発明1019のキット。
[本発明1022]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＣＴＬＡ4抗体である、本発明1019のキット。
[本発明1023]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＬＡＧ−3抗体である、本発明1019のキット。
[本発明1024]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＴＩＭ−3抗体である、本発明1019のキット。
[本発明1025]
前記チェックポイント阻害剤が抗ＣＳＦ−Ｒ1抗体である、本発明1019のキット。
[本発明1026]
前記チェックポイント阻害剤がＩＤＯの小分子阻害剤である、本発明1019のキット。
[本発明1027]
前記チェックポイント阻害剤がＣＳＦ−Ｒ1の小分子阻害剤である、本発明1019のキット。
[本発明1028]
前記ＰＥ38短縮型シュードモナス外毒素がＫＤＥＬペプチドに融合されている、本発明1019のキット。

局所細胞傷害性療法および免疫チェックポイント遮断の組み合わせに関して考えられる機構を示す図である。細胞傷害性療法は、原発性腫瘍の標的化破壊および「インサイチューワクチン」効果を生じ得る。免疫チェックポイント受容体ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、および／またはＣＳＦ−１Ｒの同時に起こる遮断は、ワクチン媒介性免疫を増強し得る。ＡＰＣ：抗原提示細胞；ＰＤ１：プログラム死分子１；ＰＤ−Ｌ１：プログラム死リガンド１；ＴＩＭ−３：Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン−３；ＬＡＧ−３：リンパ球活性化遺伝子−３；ＣＳＦ−１Ｒ：コロニー刺激因子１受容体；ＮＫ／ＮＫＴ：ナチュラルキラー／ナチュラルキラーＴ細胞。 ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞系のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞における（図２Ａ）マウスＨ−２Ｋｂ（ＭＨＣクラスＩ）発現。 ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞系のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞における（図２Ｂ）マウスＨ−２Ｄｂ（ＭＨＣクラスＩ）発現。 ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞系のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞における（図２Ｃ）マウスＰＤ−Ｌ１発現。 ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞系のフローサイトメトリー分析を示す図である。ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞における（図２Ｄ）Ｄ２Ｃ７−ＩＴ標的抗原ｍＥＧＦＲｖＩＩＩ発現。 ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞におけるＤ２Ｃ７−ＩＴのインビトロ細胞傷害性を示す図である。ＷＳＴ１アッセイを用いて、ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞におけるＤ２Ｃ７−ＩＴのインビトロ細胞傷害性を決定した。ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞におけるＤ２Ｃ７−ＩＴのＩＣ_５０は、陰性対照免疫毒素、Ｐ５８８−ＩＴ（上の線、ＩＣ_５０＞１０００ｎｇ／ｍｌ）のＩＣ_５０と比較して、０．４７ｎｇ／ｍｌ（下の線）であった。 ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞を頭蓋内に注入したＣ５７ＢＬ／６マウスの生存期間を示す図である。 ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７脳腫瘍微小環境に分布する免疫細胞の表現型プロファイルを示す図である。図５Ａ 対照の脳。（Ｆ４８０ｌｏ＋Ｆ４８０ｉｎｔ＋Ｆ４８０ｈｉ）＝マクロファージ ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７脳腫瘍微小環境に分布する免疫細胞の表現型プロファイルを示す図である。図５Ｂ ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７腫瘍。（Ｆ４８０ｌｏ＋Ｆ４８０ｉｎｔ＋Ｆ４８０ｈｉ）＝マクロファージ Ｄ２Ｃ７−ＩＴ、ＢＬＺ９４５併用療法に関する実験概要を示す図である。 頭蓋内ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫モデルに対するＤ２Ｃ７−ＩＴおよびＢＬＺ９４５の併用療法の抗腫瘍有効性を示す図である。 皮下ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫を保持するＣ５７ＢＬ／６免疫適格性マウスにおけるＤ２Ｃ７−ＩＴ＋（αＣＴＬＡ−４またはαＰＤ−１）ｍＡｂ併用療法のインビボ有効性を示す図である。図８Ａは、３５日目まで追跡した全ての処置群を示す。図８Ｂは、最初の腫瘍接種後６２日目まで追跡した処置群Ｇ４〜Ｇ６を示す。処置群Ｇ５およびＧ６のみでそれぞれ１０匹のうち４匹および１０匹のうち５匹が治癒したことに留意されたい。 併用の処置群（Ｇ５およびＧ６）における治癒マウスに関する腫瘍再チャレンジ研究を示す図である。図９Ａ．治癒マウスは７２日目に左側腹部に１０^６ＣＴ２Ａ親細胞で最初に再チャレンジされた。図９Ｂは、右側腹部における最初のＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞接種後１２６日目での、脳中の３×１０^５ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞での次のチャレンジを示す。全てのナイーブマウス（Ｇ０）で腫瘍が成長したが、治癒マウス（Ｇ５およびＧ６）で腫瘍は成長しなかった。 両側皮下ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫を保持するＣ５７ＢＬ／６免疫適格性マウスにおけるＤ２Ｃ７−ＩＴ＋（αＣＴＬＡ−４またはαＰＤ−１）ｍＡｂ併用療法のインビボ有効性を示す図である。図１０Ａは、右側の（処置された）腫瘍に対する腫瘍成長曲線を示し、それは前の片側モデルに類似していた。図１０Ｂは、左側の（未処置）腫瘍に対する腫瘍成長曲線を示し、それは右側における併用の療法が遠位の左側の腫瘍での抗腫瘍効果を有し得ることを示した。 最初の腫瘍接種後３５日目および４３日目における処置群での左側の腫瘍体積を示す図である。図１１Ａ．３５日目に、処置群Ｇ１と比較して、左側の腫瘍の成長は他の処置群すべてで有意に遅延し、処置群Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４ではｐ＜０．０５であり、処置群Ｇ５およびＧ６ではｐ＜０．０１であった。図１１Ｂ．４３日目に、左側の腫瘍の成長は右側の腫瘍におけるＤ２Ｃ７−ＩＴ単独療法と比較して併用の療法によって有意に遅延し、ｐ＜０．０５であった。

発明の詳細な説明
発明者らは、Ｄ２Ｃ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、任意でＫＤＥＬペプチドと融合される、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）と融合することにより、標的指向免疫毒素（ＩＴ）、即ちＤ２Ｃ７−（ｓｃｄｓＦｖ）−ＰＥ３８ＫＤＥＬ（Ｄ２Ｃ７−ＩＴ）を開発した。Ｄ２Ｃ７−ＩＴは、野生型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｗｔ）およびＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）の両方（これら２つのタンパク質は神経膠芽腫で過剰発現している）と反応する。Ｄ２Ｃ７−ＩＴの強力な抗腫瘍有効性は、免疫不全マウスでの同所性神経膠腫異種移植片モデルにおいてＰＥにより仲介される。直接的な腫瘍細胞死滅に加えて、免疫毒素単独療法は、Ｔ細胞の関与により二次抗腫瘍免疫応答を誘発する。免疫毒素が免疫チェックポイント阻害剤とともに併用レジメンで投与される場合、改善された相乗的な結果が観察される。

抗体に付加し得る他の部分としては、更なる有益な特性をもたらすものが挙げられる。例えば、ＫＤＥＬ（ｌｙｓ−ａｓｐ−ｇｌｕ−ｌｅｕ）テトラペプチドが、小胞体中への保持をもたらすためにタンパク質のカルボキシ末端で付加され得る。同様に機能する変異体、例えば、ＤＫＥＬ、ＲＤＥＬ、およびＫＮＥＬもまた使用できる。

治療し得る腫瘍は、Ｄ２Ｃ７抗体と反応する任意のものである。これらの腫瘍としては、少なくとも１つのＥＧＦＲｖＩＩＩ対立遺伝子が存在するものが挙げられるが、これらに限定されない。これらは、乳房、頭頚部、脳、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、肺、または他の腫瘍に見出され得る。治療の前にかかる対立遺伝子の存在を決定することが望ましい場合がある。これは、ＰＣＲなどの、オリゴヌクレオチドベースの手法を用いて、または免疫組織化学などの、免疫学的手法を用いて行うことができる。ＥＧＦＲおよび／またはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍中の細胞の量、比、比率、または割合を決定することが望ましい場合がある。ＥＧＦＲを表面上に発現している細胞が多ければ多いほど、かかる抗体療法はより有益であり得る。ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現が皆無かほとんどない腫瘍でさえ、野生型ＥＧＦＲに結合する抗体の能力により治療され得る。適宜、腫瘍は、治療の前にＤ２Ｃ７抗体との反応性に関して試験され得る。免疫毒素自体を、治療の前、治療中、または治療の後に、免疫組織化学剤として使用し得る。二次試薬を免疫毒素と共に検出のために使用し得る。二次試薬は、例えば、シュードモナス構成要素の免疫毒素を認識し得る。

免疫毒素は、当技術分野で公知の任意の手法によって投与され得る。コンパートメント送達が、ＥＧＦＲを発現する正常組織に対する細胞傷害性を避けるために望ましい場合がある。好適なコンパートメント送達法としては、脳への送達、外科的に形成された腫瘍切除腔への送達、自然の腫瘍嚢胞への送達、および腫瘍実質への送達が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の方法によって治療し得る腫瘍は、野生型、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、または他の変異体であるかに係わらず上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する任意のものである。好ましくは、腫瘍は、正常組織による発現をはるかに超える量で受容体を発現する。高レベル発現の機構は、遺伝子増幅による場合、遺伝子または後成的または翻訳後修飾であるかに係わらず他の変化による場合がある。例示の治療し得る腫瘍としては、悪性神経膠腫、乳がん、頭頚部扁平上皮細胞がん、肺がんが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｔ細胞免疫チェックポイント受容体の遮断は、これらに限定されないが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、およびＣＳＦ−１Ｒならびにかかるチェックポイント阻害剤の組み合わせを含む、任意のかかる標的に対して実施され得る。免疫チェックポイント受容体は、これらに限定されないが、腫瘍細胞または免疫細胞、例えばＴ細胞、単球、ミクログリア、およびマクロファージ上にあってよい。免疫チェックポイント遮断を示す薬剤は、二重特異性抗体および二特異性抗体を含むがこれらに限定されない、小化学物質もしくはポリマー、抗体、抗体フラグメント、単鎖抗体または他の抗体構築物であり得る。

本発明に従って使用され得る免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍細胞の阻害性相互作用を妨げる任意のものを含む。これらには、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＴＩＭ−３抗体が挙げられるが、これらに限定されない。阻害剤は抗体である必要はなく、小分子または他のポリマーであってもよい。阻害剤が抗体である場合、それはポリクローナル、モノクローナル、フラグメント、単鎖、または他の抗体変異体構築物であってよい。阻害剤は、当技術分野で公知の任意の免疫チェックポイントを標的にでき、免疫チェックポイントとしては、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ １、ＣＨＫ２、ＩＤＯ、Ａ２ａＲ、およびリガンドのＢ−７ファミリーが挙げられるが、これらに限定されない。単一標的免疫チェックポイントに対する阻害剤または異なる免疫チェックポイントに対する異なる阻害剤の組み合わせを用いることができる。

免疫毒素との併用療法において用いることができるＣＳＦ−１Ｒの阻害剤の例としては、臨床開発中の以下の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＬＸ３３９７、ＰＬＸ４８６、ＲＧ７１５５、ＡＭＧ８２０、ＡＲＲＹ−３８２、ＦＰＡ００８、ＩＭＣ−ＣＳ４、ＪＮＪ−４０３４６５２７、およびＭＣＳ１１０。

免疫チェックポイント阻害剤は、免疫毒素と同時に、前に、または後に投与できる。典型的には、２つの薬剤はお互いの３０、２８、２１、１４、７、４、２、または１日以内に投与される。薬剤は、連続でまたは第１の薬剤および第２の薬剤のサイクルのいずれかで繰り返し投与できる。チェックポイント阻害剤の前にワクチンを投与することは、必須ではないが、有利である場合がある。しかし、逆の順もまた用いてよい。免疫毒素による細胞傷害性Ｔリンパ球応答のプライミングは約５日〜約１４日かかる場合がある。チェックポイント阻害剤の投与は、有利には、プライミング期間の間またはその後に開始し得る。

免疫チェックポイント阻害剤は、特定の阻害剤に関して当技術分野で公知の任意の適当な手段により投与され得る。これらの手段としては、静脈内、経口、腹腔内、舌下、くも膜下腔内、腔内、筋肉内、および皮下のものが挙げられる。

治療レジメンとしては、免疫毒素および免疫チェックポイント阻害剤（複数可）の送達に加えて、腫瘍の外科的除去、腫瘍の外科的縮小、化学療法、生物療法、放射線療法が挙げられる。これらの様式は多くの病態における標準治療であり、患者が標準治療を受けられない必要はない。免疫毒素および免疫チェックポイント阻害剤（複数可）は標準治療の前に、間に、または後に投与され得る。免疫毒素および免疫チェックポイント阻害剤（複数可）は標準治療の失敗の後に投与され得る。

キットは、単一の分割されたまたは分割されていない容器中に、免疫毒素またはその構成要素もしくはそのコードＤＮＡおよび免疫チェックポイント阻害剤または免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせを含み得る。保存安定性は２つの薬剤の間で変わり得るので、別々の容器を使用してもよい。適宜、一方または両方の薬剤を凍結乾燥または冷凍してもよい。

免疫毒素は、高レベルの標的腫瘍抗原を発現するがん細胞を直接死滅させることができる。免疫毒素単独療法は、免疫不全マウスでの悪性脳腫瘍異種移植片モデルにおいて、ＥＧＦＲｗｔおよび／またはその短縮型変異体、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等の標的エピトープを発現している腫瘍細胞を効果的かつ直接的に破壊できる。免疫毒素療法はマウスモデルにおいて二次抗腫瘍免疫応答を誘発でき、これは直接的な死滅機構とは異なり、免疫系の協力を必要とする。悪性脳腫瘍は常に異種の集団であるため、一部の腫瘍細胞は、エピトープの欠如のために、免疫毒素療法の直接的な標的攻撃から逃れられる可能性がある。このため、免疫毒素によって刺激される二次抗腫瘍免疫応答は、直接標的とされない腫瘍細胞の排除において重要な役割を果たし得る。

最近、いくつかの研究は、腫瘍退縮および生存期間の有意な改善が、ＣＴＬＡ４、ＣＳＦ−１Ｒ、ＩＤＯ、およびＰＤ１等の共阻害性分子を抑制することによりマウス神経膠腫モデルで達成されたことを成功裏に示した。有望な前臨床データに基づいて、いくつかの臨床試験が、単独療法または他の抗腫瘍剤との組み合わせ療法のいずれかとして、悪性脳腫瘍を治療するための免疫チェックポイント阻害剤の利用を研究するために開始された。

しかしながら、神経膠芽腫を含む悪性神経膠腫は、比較的低い突然変異率を有し、これはより少なく捕捉しがたい腫瘍抗原を生じる場合があり、免疫療法によく応答する他の腫瘍型、例えば、黒色腫およびＮＳＣＬＣと比較して相対的に低い基底免疫原性をもたらす。したがって、標的化細胞傷害性免疫療法および免疫チェックポイント阻害剤の併用は相乗的な抗腫瘍効果をもたらし得る。

理想的な組み合わせ療法は、その副作用を限定するためにより低い用量の標的化細胞傷害性免疫療法を有し、かつ長期抗腫瘍免疫を達成し得る。免疫毒素療法は、その特有の細胞傷害性機構により高レベルの標的抗原を発現するがん細胞を効果的にかつ直接的に殺すことができる。限局性免疫毒素療法によって破壊されたがん細胞は腫瘍抗原および／または他の新生抗原を放出する。これらの抗原はその後、局所流入領域リンパ節中の宿主Ｔ細胞にＡＰＣによって提示され得、これがＣＴＬを活性化して遊走させ腫瘍部位で特定の腫瘍抗原を発現している残存腫瘍細胞または再発腫瘍細胞を除去する。この過程を通して、Ｔ細胞とＡＰＣとの間および／またはＴ細胞と腫瘍細胞との間の様々な共阻害性チェックポイント経路が異なる機構の引き金を引いてＴ細胞を不活性化し、かつ抗腫瘍免疫の継続および強度を調節し得る。免疫チェックポイント阻害剤、例えば抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１ ｍＡｂは、これらの免疫抑制経路を遮断でき、したがって標的免疫毒素療法によって活性化されたリンパ球によって引き起こされる腫瘍細胞死を増強する。

本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６免疫適格性マウスで、皮下ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫マウスモデルを６つの群で確立し、腫瘍がある特定の大きさに成長した後αＣＴＬＡ４またはαＰＤ１阻害剤と組み合わせて、対照免疫毒素Ｐ５８８−ＩＴまたはＤ２Ｃ７−ＩＴでマウスを処置した。このインビボ皮下ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫モデルにおいて、αＣＴＬＡ４またはαＰＤ１ではなく低用量Ｄ２Ｃ７−ＩＴの単独療法、およびＤ２Ｃ７−ＩＴ＋αＣＴＬＡ−４またはαＰＤ−１の組み合わせ療法の４回の投与は、対照免疫毒素Ｐ５８８−ＩＴ処置群と比較して、腫瘍の成長の有意な遅延を生じた（図８Ａおよび図８Ｂ）。重要なことに、Ｄ２Ｃ７−ＩＴ単独療法も腫瘍の成長を有意に遅延できたが、完全な治癒は、Ｄ２Ｃ７−ＩＴ＋αＣＴＬＡ４（ｎ＝４／１０）組み合わせ療法群およびＤ２Ｃ７−ＩＴ＋αＰＤ−１（ｎ＝５／１０）組み合わせ療法群（図８Ａおよび図８Ｂ）においてのみ観察された。これらの結果は、低用量の細胞傷害性免疫毒素療法は、有意に腫瘍の成長を遅延できるが、腫瘍保持マウスを治癒できないことを示した。免疫チェックポイント阻害剤との併用によって、細胞傷害性免疫毒素療法は、低用量免疫毒素療法の初期治癒率を０％から４０％超へ増加させ得る。さらに、全ての治癒マウスは、ｍＤ２Ｃ７陰性腫瘍の一次皮下再チャレンジを拒絶したが、未処置ナイーブマウスにおいて腫瘍は成長し、組み合わせ処置が、ｍＤ２Ｃ７陰性親細胞にもさらに及んだ、長く持続する抗腫瘍免疫をもたらしたことを示唆する（図９Ａ）。９匹の治癒マウスはすべて、脳でのＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７の二次頭蓋内再チャレンジをその後拒絶したが、未処置ナイーブマウスで腫瘍は成長し、組み合わせ処置が、離れた免疫特権ＣＮＳにも及んだ、長く持続する抗腫瘍免疫（ここでセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）が重要な役割を果たし得る）ももたらしたことを示す（図９Ｂ）。

次に、本発明者らは両側皮下神経膠腫マウスモデルを確立して、限局性高用量免疫毒素処置が遠くの領域での腫瘍において全身抗腫瘍効果をもたらし得るかどうか、および免疫チェックポイント阻害剤の併用が限局性免疫毒素療法によって誘発されるこの全身抗腫瘍免疫を増強し得るかどうかを研究した。Ｄ２Ｃ７−ＩＴ単独療法、Ｄ２Ｃ７−ＩＴ＋αＣＴＬＡ４組み合わせ療法、およびＤ２Ｃ７−ＩＴ＋αＰＤ１組み合わせ療法は、右側の腫瘍の有意な成長遅延をもたらし（Ｐ＜０．０１）、それぞれ４／１０、６／１０、および５／１０の右側の腫瘍を治癒した（図１０Ａ）。興味深いことに、右側の腫瘍をＤ２Ｃ７−ＩＴもしくはαＣＴＬＡ−４もしくはαＰＤ−１の単独療法またはＤ２Ｃ７−ＩＴ＋（αＣＴＬＡ−４もしくはαＰＤ−１）の組み合わせ療法によって処置した群において、左側の未処置腫瘍もまた対照群と比較して顕著に遅く成長し（図１０Ｂおよび図１１Ａ）、これは高用量の限局性Ｄ２Ｃ７−ＩＴ単独療法が、全身免疫チェックポイント阻害剤単独療法と比較して、左側の未処置腫瘍で同様の抗腫瘍免疫を達成できることを示す。さらに、右側の腫瘍での併用療法は、マウスにおいて左側の未処置腫瘍の最も顕著に遅延された成長をもたらし（図１０Ｂおよび図１１Ｂ）、これは免疫チェックポイント阻害剤が、限局性免疫毒素療法によって誘発される抗腫瘍免疫を増強して離れた領域での腫瘍の成長を制限できることを示唆する。

本発明者らは、Ｄ２Ｃ７−ＩＴの腫瘍内送達が二次抗腫瘍免疫を誘発し、それがｍＤ２Ｃ７発現腫瘍細胞だけでなく、ｍＤ２Ｃ７を発現しない腫瘍細胞もまた全身レベルで破壊することを示した。Ｄ２Ｃ７免疫毒素の免疫チェックポイント阻害剤との併用は、この免疫毒素誘発性の抗腫瘍免疫を強化して相乗的な長期抗腫瘍効果を達成し得る。

上記開示は本発明を全般的に説明する。本明細書に開示された全ての参考文献は参照によって明示的に組み込まれる。より完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照することによって得ることができるが、これらは例示のためだけに本明細書に提供されているものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１
本発明者らは、マウス神経膠腫細胞系、即ち、Ｄ２Ｃ７−ＩＴ抗原であるマウスＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｍＥＧＦＲｖＩＩＩ）を過剰発現するＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７を確立した。ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞に対するＤ２Ｃ７−ＩＴの反応性および治療有効性を、それぞれフローサイトメトリーおよびインビトロ細胞傷害性アッセイ（ＷＳＴ１）によって決定した。ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞をフローサイトメトリーによりＭＨＣクラスＩおよびＰＤ−Ｌ１発現について更に分析した。Ｄ２Ｃ７−ＩＴもしくはαＣＴＬＡ−４もしくはαＰＤ−１の単独療法またはＤ２Ｃ７−ＩＴ＋αＣＴＬＡ−４もしくはＤ２Ｃ７−ＩＴ＋αＰＤ−１の併用療法のインビボ有効性を、皮下ＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫保持Ｃ５７ＢＬ／６免疫適格性マウスにおいて評価した。

ＷＳＴ−１は、細胞増殖を測定するための試薬である。ＷＳＴ−１は、細胞集団中の細胞増殖および生存率の非放射性の分光光度定量のために用いられる。このアッセイは、細胞ミトコンドリア脱水素酵素による、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１のホルマザンへの開裂に基づく。生細胞数の増加はミトコンドリア脱水素酵素の活性の増加をもたらし、これが今度は形成されるホルマザン色素の量を増加させる。生細胞によって生成されるホルマザン色素はλ＝４４０ｎｍでの吸光度を測定することにより定量され得る。

実施例２
フローサイトメトリー分析によって、Ｄ２Ｃ７モノクローナル抗体のＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞への特異的結合能を確認した（図２Ｄ）。フローサイトメトリーはまた、腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子（図２Ａおよび図２Ｂ）およびＰＤ−Ｌ１（図２Ｃ）の両方の高発現も示した。Ｄ２Ｃ７−ＩＴは、インビトロＷＳＴ１細胞傷害性アッセイにおいてＣＴ−２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞に対して高度に細胞傷害性（ＩＣ５０＝０．４７ｎｇ／ｍＬ）であった（図３）。

実施例３
Ｄ２Ｃ７−（ｓｃｄｓＦｖ）−ＰＥ３８ＫＤＥＬ免疫毒素の構築、発現、および精製。Ｄ２Ｃ７ Ｖ_Ｈドメインのカルボキシル末端を、１５アミノ酸ペプチド（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーによってＶ_Ｌドメインのアミノ末端に繋げた。安定なＩＴを得るために、再生中にＶ_ＨがＶ_Ｌの近くに確実に位置していることが必須である。このことは、安定化ジスルフィド結合を形成させるために、各鎖中の単一の重要な残基をシステインへと突然変異させることで達成した。分子モデリングを用いる予測および他のｄｓＦｖ組み換えＩＴでの経験的データに基づいて、本発明者らは、各鎖において、システインへと突然変異させるアミノ酸を１つ選んだ。これらは、Ｖ_Ｈのフレームワーク領域２（ＦＲ２）中の残基４４およびＶ_ＬのＦＲ４中の残基１００である（Ｋａｂａｔの番号付けに従う）。このようにして、本発明者らは、ペプチドリンカーと、Ｖ_ＨのＳｅｒ４４およびＶ_ＬのＧｌｙ１００を置き換えるシステイン残基によって生じるジスルフィド結合との両方を含むＦｖを準備した。Ｄ２Ｃ７（ｓｃｄｓＦｖ）ＰＣＲ断片を次にシュードモナス外毒素ＡのドメインＩＩおよびＩＩＩのＤＮＡに融合した。ここで使用したシュードモナス外毒素ＡのバージョンであるＰＥ３８ＫＤＥＬは、改変されたＣ末端を有し、このＣ末端はＰＥ３８ＫＤＥＬの細胞内保持を増大し、ひいてはその細胞傷害性を増強する。Ｄ２Ｃ７−（ｓｃｄｓＦｖ）−ＰＥ３８ＫＤＥＬを、Ｔ７プロモーターの制御下で、大腸菌内で発現させ、封入体として回収した。

実施例４
神経膠芽腫の治療のための腫瘍標的化および腫瘍関連マクロファージ：本発明者らは、免疫適格性神経膠芽腫マウスモデルにおいて、相乗的に機能し効果的な抗腫瘍応答を生じるＤ２Ｃ７−ＩＴおよびＢＬＺ９４５の併用処置の能力を評価した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７に関する頭蓋内成長曲線：頭蓋内ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７腫瘍の成長の経時変化を決定するために、３×１０^５細胞／３μｌを９匹のメスＣ５７ＢＬ／６マウス中に移植し、生存曲線をプロットした（図４）。ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７生存曲線は、腫瘍移植後２５日目で１００％死亡が起こったことを示した。本発明者らの前の研究に基づいて、腫瘍移植後８日目が、Ｄ２Ｃ７−ＩＴ注入を開始するのに最も適した日として選ばれた。

ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７脳腫瘍微小環境に分布する免疫細胞の表現型プロファイル：頭蓋内ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７腫瘍の免疫細胞の表現型を特徴づけるために、Ｃ５７ＢＬ／６免疫適格性マウスに３×１０^５腫瘍細胞を移植した。マウスを、腫瘍の発達を評価するために追跡し、瀕死になった時に安楽死させた。安楽死の際、脳を収集し、腫瘍の免疫細胞の浸潤をフローサイトメトリーによって分析した。ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスから単離された細胞を、対照として使用した。正常な脳内の主要な細胞型は、ミクログリア（８０％）、マクロファージ（Ｆ４８０ｌｏ＋Ｆ４８０ｉｎｔ＋Ｆ４８０ｈｉ＝１１％）、およびＴ細胞（５％）であった（図５Ａ）。しかしながら、腫瘍保持マウスにおいて、ミクログリア（８％）、マクロファージ（Ｆ４８０ｌｏ＋Ｆ４８０ｉｎｔ＋Ｆ４８０ｈｉ＝６３％）、およびＴ細胞（１９％）の割合の顕著な変化があった（図５Ｂ）。

頭蓋内ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫モデルに対するＤ２Ｃ７−ＩＴおよびＢＬＺ９４５の併用療法の抗腫瘍有効性：ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞系に対するＤ２Ｃ７−ＩＴ＋ＢＬＺ９４５併用療法に関する実験概要を図６に示す。Ｄ２Ｃ７−ＩＴもしくはＢＬＺ９４５の単独療法またはＤ２Ｃ７−ＩＴ＋ＢＬＺ９４５併用療法のインビボ有効性を、頭蓋内ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫保持Ｃ５７ＢＬ／６免疫適格性マウスにおいて評価した（図７）。Ｄ２Ｃ７−ＩＴ（全量０．０１８μｇ）を、浸透圧ポンプを用いて対流強化送達（ＣＥＤ、Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）によって、腫瘍接種後８日目〜１１日目に７２時間注入した。ＢＬＺ９４５（２００ｍｇ／ｋｇ）を、７日目および１２日目〜２５日目に強制経口投与によって１日１回送達した。ビヒクル対照でおよびＢＬＺ９４５単独療法で処置されたマウスに関する生存曲線は同じように見えた（生存期間中央値＝２２日〜２４日、図７）。０．０１８μｇの全量で、Ｄ２Ｃ７−ＩＴ単独療法は生存期間中央値を４２日へと延長した（図７）。Ｄ２Ｃ７−ＩＴ＋ＢＬＺ９４５併用療法群に関する生存期間中央値は５３日であった（図７）。意義深いことに、完全な治癒は併用療法群においてのみ観察された（２／６マウス）。この予備データは、神経膠芽腫患者がＤ２Ｃ７−ＩＴおよびＢＬＺ９４５の併用療法から利益を受けるであろうことを示唆する。

実施例５
皮下（ＳＣ）ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫モデルにおけるＤ２Ｃ７−ＩＴ＋（抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤ１）阻害剤組み合わせ療法のインビボ有効性
前の試験的研究において、本発明者らは、皮下再チャレンジマウス神経膠腫同種移植片がこれらの腫瘍内（ｉ．ｔ．）免疫毒素療法によって治癒されたＳＣマウス神経膠腫同種移植片を保持する免疫適格性マウスにおいて拒絶されたことを観察し、このことは、ＳＣ免疫毒素療法の後の記憶抗腫瘍免疫応答が存在し得ることを示唆する。この現象は、ＩＬ−１３を標的とする免疫毒素によって処置されたＳＣ黒色腫マウスモデルにおいても報告されており、ここで黒色腫は、ＣＮＳにおける悪性神経膠腫と比較して非常に異なる腫瘍型であるが、ＣＴＬはこの免疫毒素誘発抗腫瘍応答を媒介するのに主要な役割を果たしている。したがって、長く持続する寛解を達成するために、神経膠芽腫に対する免疫毒素によって誘発される二次免疫応答を研究するための適当なマウス神経膠腫モデルを確立することが必要であり、かつ抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤ１抗体（αＣＴＬＡ４またはαＰＤ１）等の免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ療法によってこの応答を増強する方法を決定することが必要である。

本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６免疫適格性マウスで、皮下ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫マウスモデルを６つの群で確立し、ここでマウスを、αＣＴＬＡ４またはαＰＤ１阻害剤と組み合わせた対照免疫毒素Ｐ５８８−ＩＴまたはＤ２Ｃ７−ＩＴで処置した。このインビボ皮下ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫モデルにおいて、αＣＴＬＡ４（１回の投与あたりマウス１匹につき１００μｇ、腹腔内［ｉ．ｐ］）またはαＰＤ１（１回の投与あたりマウス１匹につき２５０μｇ、ｉ．ｐ．）ではなくＤ２Ｃ７−ＩＴ（低用量、１回の投与あたりマウス１匹につき１．５μｇ、ｉ．ｔ．）の単独療法およびＤ２Ｃ７−ＩＴ＋αＣＴＬＡ−４またはαＰＤ−１の組み合わせ療法（免疫チェックポイント阻害剤をＩＴ治療の翌日に投与した）の４回の投与（３日おき）は、対照免疫毒素Ｐ５８８−ＩＴ処置群と比較して腫瘍の成長の有意な遅延を生じた（Ｐ＜０．０１、図８Ａ）。重要なことに、Ｄ２Ｃ７−ＩＴ単独療法も腫瘍の成長を有意に遅延できたが、完全な治癒は、Ｄ２Ｃ７−ＩＴ＋αＣＴＬＡ４（ｎ＝４／１０）組み合わせ療法群およびＤ２Ｃ７−ＩＴ＋αＰＤ−１（ｎ＝５／１０）組み合わせ療法群（図８Ａおよび図８Ｂ）においてのみ観察された。

実施例６
Ｄ２Ｃ７−ＩＴおよび免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ処置群からの治癒マウスについての腫瘍再チャレンジ研究
Ｄ２Ｃ７−ＩＴおよび免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ処置群からの治癒マウスが、防御的抗腫瘍記憶免疫応答を想起し得るかどうか決定するために、最初の腫瘍チャレンジ後７２日目に、９匹の治癒マウスすべてに対し、次いで、左側腹部において１０^６個の用量のＣＴ２Ａ親細胞で最初に皮下に再チャレンジ（１°ＳＣＲ）した。これらのマウスはすべて、ｍＤ２Ｃ７陰性腫瘍を拒絶したが、未処置ナイーブマウスすべてにおいて腫瘍は成長し、組み合わせ処置が、ｍＤ２Ｃ７陰性親細胞にも及んだ、長く持続する抗腫瘍免疫をもたらしたことを示唆する（図９Ａ）。

この防御的抗腫瘍免疫が、離れた免疫特権領域、例えば、脳における腫瘍再チャレンジからマウスを保護し得るかどうか決定するために、９匹の治癒マウスすべてに対し、次いで１２６日目に（最初の皮下腫瘍チャレンジ後）、脳において３×１０^５個の用量のＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７細胞で、２度目に頭蓋内（ＩＣ）で再チャレンジ（２°ＩＣＲ）した。この研究の最後に、全ての生存しているマウスを脳の組織病理学的検査のために安楽死させた。この検査は、脳中に腫瘍を示さなかった（データ示さず）。全てのこれらのマウスは、ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７頭蓋内（ＩＣ）再チャレンジ（２°ＩＣＲ）を拒絶したが、全ての未処置ナイーブマウスにおいて腫瘍は成長し、組み合わせ処置が、離れた免疫特権ＣＮＳにも及んだ、長く持続する抗腫瘍免疫ももたらしたことを示唆する（図９Ｂ）。

実施例７
両側皮下ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫モデルにおけるＤ２Ｃ７−ＩＴ＋（抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤ１）阻害剤組み合わせ療法のインビボ有効性
インビボ両側皮下ＣＴ２Ａ−ｍＤ２Ｃ７神経膠腫モデルにおいて、腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにて両側の側腹部内に同時に、右側では高い密度（３×１０^６細胞）で、左側では低い密度（１０^６細胞）で接種した。大きい方の腫瘍（右側）を、Ｄ２Ｃ７−ＩＴもしくはαＣＴＬＡ４もしくはαＰＤ１の単独療法またはＤ２Ｃ７−ＩＴ＋αＣＴＬＡ４もしくはＤ２Ｃ７−ＩＴ＋αＰＤ１の併用療法（免疫チェックポイント阻害剤を免疫毒素療法と同じ日に投与した）の４回の投与（２日おき）で処置し、一方で左側の腫瘍は未処置であった。Ｄ２Ｃ７−ＩＴ単独療法（高用量、１回の投与あたりマウス１匹につき４．５μｇ、腫瘍内）、Ｄ２Ｃ７−ＩＴ＋αＣＴＬＡ４（１回の投与あたりマウス１匹につき１００μｇ、腹腔内）、およびＤ２Ｃ７−ＩＴ＋αＰＤ１（１回の投与あたりマウス１匹につき２５０μｇ、腹腔内）組み合わせ療法は、右側の腫瘍の有意な成長遅延をもたらし（Ｐ＜０．０１）、それぞれ４／１０、６／１０、および５／１０の右側の腫瘍を治癒した（図１０Ａ）。

興味深いことに、右側の腫瘍をＤ２Ｃ７−ＩＴもしくはαＣＴＬＡ−４もしくはαＰＤ−１の単独療法またはＤ２Ｃ７−ＩＴ＋（αＣＴＬＡ−４もしくはαＰＤ−１）の組み合わせ療法で処置した群において、左側の未処置腫瘍もまた対照群と比較して顕著に遅く成長し（図１０Ｂおよび図１１Ａ）、これは高用量の限局性Ｄ２Ｃ７−ＩＴ単独療法が、全身免疫チェックポイント阻害剤単独療法と比較して、左側の未処置腫瘍において同様の抗腫瘍免疫を達成できることを示す。さらに、右側の腫瘍でのＤ２Ｃ７−ＩＴ＋（αＣＴＬＡ−４またはαＰＤ−１）組み合わせ療法は、マウスにおいて左側の未処置腫瘍の最も顕著に遅延された成長をもたらし（図１０Ｂおよび図１１Ｂ）、これは免疫チェックポイント阻害剤が、免疫毒素によって誘発される抗腫瘍免疫を増強して、離れた領域における腫瘍の成長を制限できることを示唆する。

Claims (21)

1. ＰＥ３８短縮型シュードモナス（Pseudomonas）外毒素に融合された単鎖可変領域抗体を含む免疫毒素であって、単鎖可変領域抗体が配列番号６〜１１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する、免疫毒素；ならびに
   抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、およびＣＳＦ−１Ｒの小分子阻害剤ＢＬＺ９４５からなる群より選択される免疫チェックポイント阻害剤
   を組み合わせてなる、腫瘍を治療するための医薬。
2. ＰＥ３８短縮型シュードモナス（Pseudomonas）外毒素に融合された単鎖可変領域抗体を含む免疫毒素であって、単鎖可変領域抗体が配列番号６〜１１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する、免疫毒素を含み、
   抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、およびＣＳＦ−１Ｒの小分子阻害剤ＢＬＺ９４５からなる群より選択される免疫チェックポイント阻害剤と併用される、
   腫瘍を治療するための医薬。
3. 抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、およびＣＳＦ−１Ｒの小分子阻害剤ＢＬＺ９４５からなる群より選択される免疫チェックポイント阻害剤を含み、
   ＰＥ３８短縮型シュードモナス（Pseudomonas）外毒素に融合された単鎖可変領域抗体を含む免疫毒素であって、単鎖可変領域抗体が配列番号６〜１１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する、免疫毒素と併用される、
   腫瘍を治療するための医薬。
4. 前記腫瘍が悪性神経膠腫である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
5. 前記腫瘍が乳がんである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
6. 前記腫瘍が頭頚部扁平上皮細胞がんである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
7. 前記腫瘍が肺がんである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
8. 前記免疫毒素が前記腫瘍に直接投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬。
9. 前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−１抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬。
10. 前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬。
11. 前記チェックポイント阻害剤が抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬。
12. 前記チェックポイント阻害剤がＣＳＦ−１Ｒの小分子阻害剤ＢＬＺ９４５である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬。
13. 前記免疫チェックポイント阻害剤が前記免疫毒素の投与の３０日以内に投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬。
14. 前記免疫チェックポイント阻害剤が前記免疫毒素の投与の７日以内に投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬。
15. 前記ＰＥ３８短縮型シュードモナス外毒素がＫＤＥＬペプチドに融合されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬。
16. 腫瘍を治療するためのキットであって、以下を含む、キット：
    ＰＥ３８短縮型シュードモナス外毒素に融合された単鎖可変領域抗体を含む免疫毒素であって、単鎖可変領域抗体が配列番号６〜１１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する、免疫毒素；ならびに
    抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、およびＣＳＦ−１Ｒの小分子阻害剤ＢＬＺ９４５からなる群より選択される免疫チェックポイント阻害剤。
17. 前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−１抗体である、請求項１６に記載のキット。
18. 前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１６に記載のキット。
19. 前記チェックポイント阻害剤が抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項１６に記載のキット。
20. 前記チェックポイント阻害剤がＣＳＦ−Ｒ１の小分子阻害剤ＢＬＺ９４５である、請求項１６に記載のキット。
21. 前記ＰＥ３８短縮型シュードモナス外毒素がＫＤＥＬペプチドに融合されている、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のキット。

Images