FR2926560A1

FR2926560A1 - Procede d'extraction et de purification d'acides nucleiques sur membrane

Info

Publication number: FR2926560A1
Application number: FR0850360A
Authority: FR
Inventors: Roxana Isac; Frederic Marc
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 2008-01-21
Filing date: 2008-01-21
Publication date: 2009-07-24
Also published as: US20100305312A1; WO2009093142A1; US20090226910A1; CN101978058A; EP2245157A1; JP2011509669A; US20110065110A1

Abstract

L'invention a trait à un procédé d'extraction et de détection des acides nucléiques sur membrane permettant d'identifier des microorganismes présent en faible concentration dans un milieu liquide ou gazeux, ainsi qu'à une nouvelle composition de lyse comprenant du chlorure de guanidium et entre 0,1 et 1 % de N-Lauroyl-Sarcosine (NLS) permettant la mise en oeuvre de ce procédé.

Description

La présente invention concerne un procédé d'extraction d'acides nucléiques pouvant s'appliquer à un nombre très réduit de microorganismes filtrés sur une membrane, mettant en oeuvre une composition de lyse comprenant l'association d'un sel de guanidium et de N-Lauroyl-sarcosine (NLS).

Ce procédé permet de recueillir les acides nucléiques desdits microorganismes sous une forme apte à être détectés de manière spécifique par hybridation ou par amplification. Le contrôle de la qualité microbiologique de l'eau et de l'air, ainsi que des outils et matériaux utilisés ou rejetés, dans le cadre d'activités industrielles ou médicales, répond aujourd'hui à des normes de plus en plus strictes. De ce fait, les acteurs industriels et les autorités sanitaires doivent pouvoir disposer d'outils permettant de détecter le plus tôt possible les contaminations microbiologiques, afin de pouvoir y remédier dans les meilleurs délais et à coût réduit.

Traditionnellement le suivi microbiologique se pratique sur milieu de culture gélosé. Ce type de cultures, simple à mettre en oeuvre, permet de faire une énumération des germes à l'oeil nu. Il permet également de conserver vivants les microorganismes, et de pratiquer, le cas échéant, des tests de caractérisation visant à définir le genre ou l'espèce des différents germes en présence Ces tests de caractérisation consistent généralement à extraire les acides nucléiques contenus dans les microorganismes et à amplifier lesdits acides nucléiques de manière spécifique, par une des nombreuses techniques de réactions en chaîne (PCR : réaction de polymérisation en chaîne ou LCR : réaction de ligature en chaîne) connues de l'homme du métier.

Toutefois, bien que les tests de caractérisation par amplification d'acides nucléiques soient d'une très grande fiabilité, les étapes consistant à cultiver les microorganismes, à en extraire les acides nucléiques, et à mettre en oeuvre la technique de PCR, sont longues à réaliser. Pour être visibles à l'oeil nu, il faut laisser les microorganismes en culture au moins pendant 24 heures, et parfois davantage pour des microorganismes à croissance plus lente comme methylobacterium sp. ou parce que les germes ont été stressés par les conditions environnementales. 2

En outre, l'extraction des acides nucléiques ne peut se pratiquer directement sur la gélose, ce qui implique de devoir prélever les microorganismes avant d'en extraire les acides nucléiques. Dans ce cas, la détection devient qualitative et non plus quantitative.

Le développement récent des laboratoires sur puce, qui s'appuient sur des technologies d'hybridation avec des sondes d'acides nucléiques fixées sur support solide, pourrait permettre un gain de temps pour l'étape de caractérisation des microorganismes. Cependant ces techniques ont un coût de revient encore élevé et ne permettent pas de s'affranchir complètement des étapes d'extraction des acides nucléiques et de transfert des acides nucléiques. Dans ces conditions, il faut encore compter plus de 24 heures pour que les microorganismes puissent être dénombrés et caractérisés, ce qui est beaucoup trop long dans un contexte industriel où il faut assurer un suivi permanent de la qualité des produits.

Pour accélérer la détection des microorganismes présents dans des milieux liquides ou gazeux, ou bien encore sur des surfaces, la demanderesse (Millipore Corporation) a développé depuis plusieurs années un procédé de détection universel de microorganismes commercialisé sous le nom Milliflex Rapid.

Ce procédé est décrit dans la demande WO 92-00145. Il consiste en ce que les microorganismes contenus dans une solution ou dans l'air sont retenus à la surface d'une membrane par passage du liquide ou de l'air à travers celle-ci. Les microorganismes sont cultivés à la surface de la membrane au contact d'un milieu de culture gélosé, le temps nécessaire pour former une microcolonie non visible à l'oeil nu. Les cellules formant la microcolonie sont alors lysées afin de libérer leur contenu en adénosine triphosphate (ATP). L'ATP libéré est utilisé comme marqueur pour identifier et quantifier les cellules vivantes par ATP-bioluminescence. L'ATP sert de substrat à une enzyme produisant une réaction de chimioluminescence par laquelle un signal lumineux est obtenu, puis détecté à l'aide d'une interface vidéo appropriée (ex : camera LCD). Le signal obtenu, mis sous forme d'image, permet de visualiser in-situ l'endroit de la membrane où le germe s'est développé, de manière analogue à un dénombrement classique 3

effectué sur une boîte de Pétri en milieu gélosé. Cette interface permet également de quantifier le nombre de microorganismes présents initialement dans l'échantillon liquide ou gazeux analysé. La détection des microorganismes dans le système Milliflex est dite universelle car elle utilise l'ATP (adénosine triphosphate), qui est un substrat contenu dans toutes les cellules vivantes. Cette technologie permet de détecter rapidement la présence de contaminants quelque soit les microorganismes concernés, même à des concentrations très faibles, par exemple dans une chaîne de production industrielle ou dans une salle blanche, de sorte à pouvoir prendre les dispositions de décontamination qui s'imposent, en temps limité. Cependant, la mise en oeuvre du système Milliflex ne permet pas actuellement de disposer, en parallèle, d'une information fiable sur l'identité des microorganismes détectés. Cette identification serait pourtant utile pour déterminer plus précisément l'origine de la contamination et définir les moyens d'y remédier. Le principal obstacle à cette identification réside dans le fait que la détection par ATP-bioluminescence, mise en oeuvre dans le système Milliflex , est destructrice des microorganismes concernés. En effet, au cours de la réaction de détection par bioluminescence, les microorganismes sont traités dans un premier temps à l'aide d'une solution à base d'éthanol, afin d'extraire les molécules d'ATP, puis dans un second temps par des réactifs de bioluminescence. En outre, la membrane est séchée entre ces deux étapes pour effectuer la réaction de bioluminescence. Il résulte de ces traitements que les microorganismes sont tués, ce qui rend impossible leur culture subséquente en vue de pratiquer des tests classiques de caractérisation (résistance aux antibiotiques, marqueurs métaboliques, réactions de gram, etc...). Les inventeurs ont donc entrepris, selon la présente invention, de caractériser les microorganismes détectés en récupérant les acides nucléiques des microorganismes traités en bioluminescence afin de procéder à leur détection spécifiques, par hybridation ou par amplification, notamment par PCR. 4

Cependant les techniques d'amplification ou d'hybridation des acides nucléiques nécessitent des échantillons d'ADN ou d'ARN purifiés, suffisamment concentrés, pour pouvoir procéder, de manière fiable, aux réactions de détection souhaitées.

Dans le cas particulier de la détection sur membrane de filtration, les difficultés sont nombreuses pour récupérer ces acides nucléiques, notamment en raison du fait que : - les microorganismes sont dispersés à la surface de la membrane sous forme d'une ou plusieurs micro-colonies dont chacune comprend un petit nombre de microorganismes, généralement inférieur à 103 cellules; et que - les cellules contenant les acides nucléiques à extraire sont séchés, en plus d'avoir été préalablement traités avec des agents et des sels susceptibles d'inhiber ou de diminuer le rendement des réactions d'hybridation ou de PCR. Ces contraintes impliquent de devoir récupérer les acides nucléiques en solution sur la membrane, de les purifier et de les concentrer. Il existe dans l'art antérieur de nombreuses techniques pour extraire, purifier et concentrer les acides nucléiques contenus dans des cellules, qui diffèrent selon la nature, ARN ou ADN, des acides nucléiques. Ces techniques font appel, en grande majorité, à un traitement initial par un tampon de lyse, puis à une étape de précipitation des acides nucléiques en solution. Le tampon de lyse a pour but de rompre les membranes cellulaires et solubiliser les protéines, tandis que la précipitation permet de séparer les acides nucléiques des autres constituants cellulaires en solution. La méthode la plus courante pour extraire les ARN (plus fragiles que des 25 ADN) est par exemple, celle dite au phénol-chloroforme . Selon cette technique, on place les cellules, dans un premier temps, au contact d'un tampon de lyse comprenant un mélange détergent - protéinase K ayant pour but de dissocier les constituants cellulaires et libérer les acides nucléiques. 30 Le tampon de lyse utilisé comprend généralement comme détergent du dodecyl sulfate de sodium (SDS), qui est l'agent de lyse cellulaire, ainsi qu'un activateur de la protéinase K tel que le sarkosyl, le Tween 20, ou le Nonldet P40. Les acides nucléiques contenu dans le lysat cellulaire obtenu sont ensuite séparés des protéines, en appliquant un mélange de phénol, un puissant 5 agent déprotéinisant, et de chloroforme, qui est un solvant organique. Après centrifugation, les acides nucléiques se retrouvent solubilisés dans la phase organique tandis que les protéines se rassemblent à l'interphase entre la phase aqueuse et la phase organique. Après transfert de la phase aqueuse dans un autre tube, les acides nucléiques sont traités par un mélange chloroforme-alcool isoamylique. Ceci a pour effet d'éliminer les traces de phénol, composé organique qui présente l'inconvénient d'être non seulement un produit toxique mais également un inhibiteur de certaines enzymes dont la polymérase. Les acides nucléiques sont ensuite précipités par l'addition d'un agent de précipitation, typiquement de l'éthanol absolu à -20°C, à raison de 2,5 fois le volume du tampon de lyse, ou bien de l'isopropanol, à raison de 0.7 volume. Un lavage ultérieur à l'éthanol 70% des acides nucléiques précipités est indispensable pour éliminer les sels. Le précipité est ensuite repris dans un tampon à faible force ionique, en 20 général, un tampon Tris-EDTA (10/1 mM). Bien que la méthode au Phénol/chloroforme soit la méthode de référence en matière d'extraction des acides nucléiques, celle-ci présente l'inconvénient de comporter de nombreuses étapes et d'utiliser le phénol et le chloroforme, qui sont, tous deux, des produits volatils et toxiques devant être manipulés avec 25 précaution. La tendance est donc, lorsqu'on cherche à extraire l'ADN génomique, moins fragile que les molécules d'ARN, à utiliser un tampon de lyse qui comprend typiquement entre 4 et 6 M de thiocyanate de guanidium, 10 mM d'EDTA, entre 2 et 6 % de NLS et 50 mM de Tris-Hcl (pH neutre) (Méthode dite de Crude Susan Modifiée) [Chirgwin, J. et al. (1979) Isolation of biologically 30 active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease, Biochem. 18:5294-5299]. Un tel tampon de lyse permet d'effectuer la précipitation des acides nucléiques, sans utilisation de phénol-chloroforme, directement dans le lysat 6

cellulaire [Jeanpierre, M. (1987) A rapid method for the purification of DNA from blood, Nucleic Acids Research 15(22) :9611]. Néanmoins, la qualité des acides nucléiques obtenus dans ces conditions, et le rendement des réactions ne sont pas constants, notamment en raison du volume de la phase aqueuse, plus important, et de la charge en constituants cellulaires, qui est variable selon la nature des microorganismes. Il peut être alors nécessaire de procéder à une seconde précipitation des acides nucléiques pour obtenir un ADN de qualité [De Nedjma, A. (2005) Principe de Biologie Moléculaire en Biologie Clinique, Elsevier & Masson].

Certaines techniques utilisent des micro-colonnes contenant des billes de silices, ou bien une phase d'adsorption solide similaire, afin de faciliter les étapes de lavage et de récupération des acides nucléiques. Cependant, le principe est le même, puisqu'une étape de précipitation des acides nucléiques sur la phase d'adsorption est également requise.

Les techniques susvisées ne sont pas adaptées à la préparation et à la détection de petites quantités d'acides nucléiques. En effet, comme cela est évoqué plus haut, lorsque les acides nucléiques sont très dilués, leur précipitation devient plus aléatoire et le risque est élevé de voir les acides nucléiques se perdre au cours du processus de purification.

Le but de la présente invention est donc de parvenir de manière simple, rapide et efficace, à préparer des acides nucléiques, tant ADN qu'ARN, à partir d'un petit nombre de microorganismes, pour pouvoir ensuite procéder à leur caractérisation. Il est ainsi divulgué dans la présente demande un procédé d'extraction et de purification d'ADN génomique qui peut être appliqué, par exemple, à des cellules filtrées sur une membrane, par lequel on traite les cellules en solution à l'aide de chlorure de guanidium et d'une quantité limitée de NLS. Selon cette méthode, on purifie les acides nucléiques sur membrane, sans procéder à une étape de précipitation, et on récupère l'ADN retenu par la membrane dans un volume d'eau pure ou tamponnée dans une forme apte à être détectée par hybridation ou par PCR. 7

De manière surprenante, c'est à l'aide d'une faible concentration de NLS dans la composition, bien inférieure à ce qu'on trouve habituellement dans les compositions de lyse, que les inventeurs ont d'obtenus les meilleurs résultats de détection. Il a été observé notamment que le NLS, à cette faible concentration, permettait d'éviter les problèmes liés au colmatage de la membrane lors de l'étape de purification, et également de faciliter la récupération des acides nucléiques à la fin du procédé. L'invention a été réalisée plus particulièrement en vue de caractériser, par PCR, un très petit nombre de microorganismes filtrés sur une membrane, jusqu'au seuil de détection de 1CFU du système MiIliflex Rapid. Cependant, l'invention peut être appliquée en dehors du contexte particulier de la microbiologie sur membrane, quelque soit le type de cellules, pour préparer des acides nucléiques, notamment en vue de réaliser des réactions d'hybridation ou d'amplification. Les préparations d'acides nucléiques obtenues peuvent être utilisées, par exemple, pour réaliser des réactions de PCR ou des réactions d'amplification isotherme de type LAMP, ou bien encore des réactions impliquant des molécules d'ARN, comme l'amplification de type NASBA ou TMA, étant entendu que les séquences d'ARN peuvent être transcrites en ADN par une étape de rétro-transcription.

Les figures suivantes illustrent les résultats des exemples de mise en oeuvre de l'invention décrits dans la présente demande. Figure 1: Comparaison de l'efficacité des compositions 1 à 7 de lyse mises en oeuvre pour la détection par PCR des microorganismes. Dans tous les cas, l'ADN a été purifié sur membrane de cellulose contenue dans un tube de centrifugation (Microcon ) suite au traitement des cellules par la composition de lyse correspondante. L'expérience a été réalisée sur des cellules fraiches prélevées en culture (cellules en suspension), sur des cellules fraiches prélevées sur membrane de filtration en PVDF ou sur des cellules prélevées sur membrane en PVDF après traitement en ATP-bioluminescence (selon le procédé MiIliflex Rapid). Pour le témoin d'inhibition de PCR, de l'ADN pur a été introduit dans les compositions de lyse, puis purifié sur membrane comme dans le cas des autres préparations. Les compositions ont été testées, pour chaque expérience, au moins deux fois. Les cellules détectées sont des bactéries E.coli. Les résultats de PCR sont indiqués sous forme de photos, lesquelles montrent la reproductibilité et l'intensité de l'amplification. + : amplification positive ; - : amplification négative, % : absence de reproductibilité ; ND: non réalisé ; NA: résultat négatif sur membrane. Figure 2: Résultats d'évaluation du procédé d'extraction et de détection des acides nucléiques selon l'invention pour ce qui concerne les levures C. albicans et S. cerevisiae. Les gels d'agarose montrent une bonne reproductibilité des amplifications par PCR. Les puits sont numérotés de gauche à droite : 1: témoin PCR positif (ADN pur de C.albicans), 2 à 6 (gel du haut) ou 2 à 5 (gel du bas) : différents échantillons testés ; 7 (premier gel) ou 6 (second gel) : 1000bp plus ladder. Les réactions de PCR sont réalisées avec des amorces universelles permettant de détecter les champignons unicellulaires. Au centre, figurent les images de synthèse de la membrane résultant de la détection universelle par ATP-bioluminescence réalisées pour chaque échantillon testé en PCR. Figure 3: Résultats d'évaluation du procédé d'extraction et de détection d'acides nucléiques selon l'invention pour ce qui concerne l'ADN génomique (A) des bactéries à gram positif S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis (B) des bactéries à gram négatif P. aeruginosa, E.coli, S. enterica. Les puits des gels d'agarose sont numérotés de gauche à droite. 1: témoin PCR positif ; 2 à 4 : PCR réalisées pour 3 échantillons indépendants avec des amorces communes aux bactéries à gram positif ou gram négatif ; 5: 100 pb plus ladder. Au centre, figurent les images de synthèse de la membrane résultant de la détection universelle par ATP-bioluminescence réalisées pour chaque échantillon testé en PCR. Figure 4: Résultats d'évaluation du procédé d'extraction et de détection des acides nucléiques selon l'invention pour ce qui concerne l'ADN génomique de populations de cellules comprenant E.coli et S.epidermis en mélange. A: énumération de l'ensemble des cellules dans trois populations par ATP- bioluminescence suivant le procédé Milliflex . B: détection par amplification PCR selon l'invention, visualisée sur gel d'agarose. 1: témoin positif PCR; 2 à 4: PCR réalisées pour chacune des trois populations; 5: témoin négatif; 6 : 100pb plus 9

ladder. 1ère série : PCR réalisée à l'aide d'amorces universelles sur E.coli et S.epidermis ; 2ème série : PCR réalisée avec des amorces spécifiques sur E.coli ; 3ème série : PCR réalisée avec des amorces spécifiques sur S.epidermis ; 4ème série : PCR réalisée avec des amorces spécifiques sur B.subtilis.

Figure 5: Détection par ATP-bioluminescence (Milliflex Rapid ) puis par PCR et micro-séquençage selon l'invention. A: dénombrement de 13 CFU de S. epidermidis et 9 CFU de B. subtilis. B: visualisation sur gel des produits d'amplification de PCR réalisées sur les extraits d'ADN génomiques purifiés à partir des mêmes cellules de S.epidermis et B.subtilis que celles détectées sur la membrane en A. C: Résultats des micro-séquençages effectués sur les produits d'amplification visualisés en B. Figure 6: Résultats des tests de sensibilité concernant la détection par PCR des champignons unicellulaires et des bactéries selon l'invention. L'ADN génomique correspondant à 1 CFU, d'abord détecté en bioluminescence, est extrait puis détecté par PCR selon le procédé de l'invention. A: Résultat positif de PCR obtenus pour un échantillon bactérien (E. coli) à l'aide d'amorces universelles spécifique des bactéries. B: Résultats positifs de PCR obtenus pour 3 échantillons différents de champignons unicellulaires (S. cerevisiae). Figure 7: Détection par ATP bioluminescence et PCR de la bactérie à gram positif P.acnes. A: Résultat de la détection par ATP bioluminescence dans trois échantillons permettant d'évaluer le nombre des bactéries détectées à 5 et 6 CFU. B: Résultats positifs de PCR obtenus à l'aide des préparations d'acides nucléiques extraits respectivement de ces trois échantillons par la méthode d'extraction selon l'invention.

Figure 8: Profil d'accumulation en temps réel des fragments d'amplification ARN résultant de l'amplification par TMA des ARN contenus dans deux préparations d'acides nucléiques extraits de Pseudomonas aeruginosa selon l'invention. Les préparations correspondent respectivement à un nombre de bactéries d'environ 30 et 300 CFU.

La présente invention a donc pour objet un procédé d'extraction et de détection des acides nucléiques sur membrane permettant d'identifier des 10

microorganismes présents en faible concentration dans un milieu liquide ou gazeux, ou bien présent sur une surface. Le procédé selon l'invention s'adresse plus particulièrement à la détection de microorganismes transférés sur une membrane par filtration d'un échantillon liquide ou gazeux au travers de celle-ci, ou par mise en contact de ladite membrane avec un milieu ou une surface susceptible de contenir ou comporter des microorganismes. Il vise plus particulièrement à résoudre le problème de l'identification de germes dispersés à la surface de la membrane. Le procédé selon l'invention s'inscrit plus particulièrement dans la logique d'identification des microorganismes détectés préalablement sur membrane, par exemple, à l'aide d'une méthode non spécifique telle que I'ATP bioluminescence utilisée dans le procédé Milliflex rapid. Le procédé selon l'invention consiste à extraire et purifier les acides nucléiques d'un petit nombre de cellules, vivantes ou mortes. Il peut être appliqué, en dehors du contexte particulier de la détection des microorganismes sur membrane, à toute cellule dont on cherche à extraire les acides nucléiques de manière rapide et efficace. Ce procédé est particulièrement utile pour obtenir des acides nucléiques ARN et/ou ADN, sous une forme apte à produire les réactions d'hybridation ou d'amplification nécessaires à leur caractérisation.

Ce procédé comprend les étapes suivantes au cours desquelles : a) on traite les cellules avec du chlorure de guanidium et du NLauroyl-sarcosine (NLS) en solution, de sorte à lyser les cellules et libérer les acides nucléiques qu'elles contiennent; b) on sépare les acides nucléiques du lysat cellulaire obtenu par filtration dudit lysat au travers d'une membrane; c) on récupère les acides nucléiques retenus par ladite membrane en solution dans de l'eau ou une solution aqueuse faiblement ionisée. Une cellule est ici définie comme une entité biologique de petite taille comprenant un cytoplasme délimité par une membrane et renfermant du matériel génétique sous forme d'acides nucléiques. Un microorganisme est considéré, au sens de la présente invention, comme une cellule ayant une taille microscopique, c'est-à-dire une taille 11

comprise entre 0,5 et 5 microns, présentant un potentiel métabolique et de reproduction, tels que des algues, des champignons unicellulaires, des protozoaires, des mycètes, des bactéries ou encore des gamètes. Les microorganismes recherchés sont plus particulièrement des bactéries pathogènes à gram positif ou négatif des genres Pseudomonas, Escherichia, Legionella, Salmonella, Listeria, Bacillus, Streptococcus, Vibrio, Yersinia, Staphylococcus, Mycobacterium, Shigella, Clostridium, Campylobacter, ou Aeromonas; les protozoaires du genre Giardia, Entamoeba, Cryptosporidium, Cyclospora; les mycoplasmes du genre Mycoplasma et Uréaplasma, les champignons du genre Saccharomyces, Aspergillus, Candida ou Penicillium. Le traitement des cellules à l'étape a) par le chlorure de guanidium et le N-Lauroyl-sarcosine peut être effectué, par l'un puis l'autre, de ces composés ou bien simultanément. Selon un aspect préféré de l'invention, le traitement est réalisé à l'aide d'une composition de lyse comprenant une concentration en NLS comprise entre 0,1 et 1 % du poids total de la composition. Le chlorure de guanidium est un agent chaotropique qui est utilisé en tant qu'agent de lyse. Il a pour double effet de dénaturer les protéines, notamment les protéines membranaires, et de produire un choc osmotique. Il est utilisé généralement à une concentration comprise entre 3 et 8 moles par litre, plus préférentiellement entre 4 et 6 moles par litre de composition de lyse. Le N-Lauroyl-sarcosine (Sarkosyl NL-97 ou NLS) est un sel sodique de N-methyl-N-(1-oxododecyl)glycine (C15H28NO3Na). Cette molécule est un détergent souvent utilisé dans des tampons de lyse en association avec la protéinase K, à des concentrations de l'ordre de plusieurs moles par litre, pour solubiliser les protéines, notamment les protéines membranaires. Selon la présente invention, le NLS n'est pas utilisé en tant qu'agent de lyse ou du moins pas à titre principal. En effet, selon l'invention, le NLS est utilisé préférentiellement à une concentration comprise entre 0,1 et 1 % en poids final de la composition de lyse, plus préférentiellement entre 0,1 et 0,5 %, c'est-à-dire à une concentration où l'effet sur la lyse des cellules est limité. Comme cela ressort des exemples de la présente demande de brevet (voir en particulier les résultats de la figure 1), l'adjonction de NLS à cette 12

concentration permet d'améliorer le rendement de l'extraction et de la purification, notamment au cours des étapes b) et c) du procédé susvisé, et par conséquent la caractérisation des microorganismes qui peut être effectuée par la suite à l'aide de la préparation d'acides nucléique obtenue.

Le NLS est un détergent anionique qui dénature presque toutes les interactions non covalentes dans les protéines et tend à solubiliser les protéines. Sans être liés par la théorie, les inventeurs pensent que le NLS facilite la séparation de l'ADN et des protéines lors de la filtration du lysat cellulaire à travers la membrane, et le rinçage de l'ADN qui s'ensuit.

Par lysat cellulaire , on désigne ici les cellules lysées se trouvant en solution avec la composition de lyse, à l'issue du traitement de l'étape a). De préférence, la composition de lyse selon l'invention comprend également entre 0,1 et 1 mmol. I-' d'éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA). Bien que LEDTA soit reconnu comme étant une substance capable d'inhiber l'activité de nombreuses enzymes, notamment la polymérase dans les réactions de PCR, il est apparu dans les expériences réalisées par les inventeurs que la présence d'EDTA permettait d'améliorer la lyse des micro-organismes à gram négatif mais aussi à gram positif. L'EDTA permet, en principe, de déstabiliser la membrane des bactéries en séquestrant les ions divalents.

Par membrane , on désigne dans la présente demande un support synthétique présentant deux faces, dont les pores ont un diamètre moyen connu. Une telle membrane présente un rapport surface/volume élevé. L'épaisseur de la membrane est généralement constante, entre 90 et 200 microns. Une telle membrane peut être mono ou multicouche. Elle est en général constituée d'un ou plusieurs matériaux choisis parmi le polytetrafluoroéthylène, le fluorure de poly(vinylidene) (PVDF), le polycarbonate, le polyamide, le polyester, le polyethersulfone, l'acétylcellulose et la nitrocellulose. La membrane désignée à l'étape b) du procédé d'extraction d'ADN selon l'invention est généralement une membrane en cellulose dite d'ultrafiltration, c'est-à-dire une membrane qui présente une limite nominale de poids moléculaire entre 3000 et 100 000 daltons, de préférence entre 50 000 et 100 13

000 daltons. Un exemple de ce type de membrane est celle dont sont munis les tubes de centrifugation microcon (Millipore Corporation). Selon l'invention, la séparation des acides nucléiques du lysat cellulaire est effectuée au travers de la membrane sous l'effet d'une pression négative ou positive. A tires d'exemples le passage du lysat peut être effectué grâce à une dépression sur l'une des faces de la membrane à l'aide d'une pompe à vide. Celui ci peut être également activé sous l'effet d'une centrifugation, c'est à dire en appliquant une force centrifuge sur le lysat cellulaire à la surface de la membrane. L'effet de centrifugation est généralement obtenu en plaçant la membrane sur un support tel qu'un tube de centrifugation, placé dans une centrifugeuse. L'invention prévoit, en outre, qu'entre les étapes b) et c) du procédé, une étape de lavage des acides nucléiques retenus par la membrane puissent être réalisée à l'aide d'une solution de lavage telle que de l'eau ou une solution aqueuse faiblement ionisée. La solution de lavage est éliminée après passage au travers de la membrane. A l'étape c) les acides nucléiques peuvent être facilement récupérés en faisant passer l'eau ou la solution aqueuse faiblement ionisée au travers de la membrane, dans le sens inverse de celui appliqué à l'étape b) ou bien de celui de l'étape de lavage supplémentaire évoquée ci-dessus. Lorsque l'étape c) est facilitée par l'application d'une pression négative ou positive, ou bien par centrifugation, il suffit de placer le support sur lequel la membrane est fixée en sens inverse duquel il se trouvait précédemment, et de placer une goutte de la solution faiblement ionisée à la surface de la membrane.

La force exercée par la pression ou la centrifugation permet de forcer le passage de l'eau à travers les pores de membrane et de décrocher les acides nucléiques de la membrane. Les acides nucléiques sont alors récoltés dans la goutte d'eau projetée dans le culot du tube de centrifugation. Par solution faiblement ionisée, on désigne ici une solution dont la concentration en sels par litre est inférieure à 10-2 moles/L plus préférentiellement inférieure à 5.10-3 moles/L. 14

L'invention vise plus particulièrement un procédé de détection d'une ou plusieurs cellules dans un milieu liquide ou gazeux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on filtre un échantillon du milieu liquide ou gazeux au travers d'une membrane pour retenir les cellules contenues dans ledit échantillon sur ladite membrane ; b) on traite les cellules retenues à l'étape a) avec du chlorure de guanidium et du N-Lauroyl-sarcosine (NLS) en solution, de sorte à obtenir un lysat cellulaire contenant les acides nucléiques libérés desdites cellules; c) on sépare les acides nucléiques du lysat cellulaire obtenu à l'étape b) par filtration dudit lysat au travers de ladite membrane, ou bien au travers d'une autre membrane; d) on récupère les acides nucléiques retenus par la membrane à l'étape c) dans de l'eau ou dans une solution aqueuse faiblement ionisée ; e) on détecte des acides nucléiques récupérés à l'étape d). Les étapes b) à d) dudit procédé de détection correspondent préférentiellement au procédé d'extraction et de purification des acides nucléiques selon l'invention, c'est-à-dire celles effectuées conformément aux étapes a) à c) du procédé décrit plus haut.

Le but du procédé de détection est de dénombrer les cellules, plus particulièrement les microorganismes présents dans un milieu liquide tel que de l'eau, ou gazeux tel que l'air, tout en déterminant, autant que possible, leur identité (famille, genre, espèce...). Par milieu liquide ou gazeux, on entend tout fluide pouvant être filtré en appliquant une différence de pression au travers d'une membrane ayant des pores d'un diamètre moyen compris généralement entre 0,1 et 1,5 microns, de préférence entre 0,15 et 0,8 microns, plus préférentiellement entre 0,2 et 0,6 microns. Un tel fluide peut consister en des solutions pures entrant dans la fabrication de produit stériles mais aussi en des solutions complexes (eau potable, sérum, urines, liquide amniotique...etc..) ou encore en des mélanges gazeux comme l'air atmosphérique. 15

Le présent procédé est applicable dans le domaine du diagnostique pour l'analyse d'échantillons provenant d'animaux ou de patients. A l'étape a) du procédé de détection, le transfert des cellules est effectué généralement sur une membrane dite de filtration, c'est-à-dire une membrane qui est perméable aux milieux liquides ou gazeux mais dont la taille moyenne des pores permet de retenir au moins 80 %, de préférence 90% des cellules ou microorganismes recherchés. Cette membrane est, de préférence, principalement constituée de PVDF (fluorure de poly(vinylidene), de cellulose ou de polyethylenesulfone. Il s'agit plus préférentiellement d'une membrane filtrante en PVDF, du type de celle commercialisée par la firme Millipore sous le nom de marque Milliflex et les références MXHVWP124 ou RMHVMFX24. Selon un aspect préféré de l'invention la membrane utilisée pour séparer les acides nucléiques de la composition de lyse à l'étape c) est différente de celle utilisée à l'étape a). La membrane utilisée à l'étape a) peut d'ailleurs être mise en contact avec un milieu nutritif afin que les cellules ou microorganismes retenus par ladite membrane puissent croître à sa surface entre les étapes a) et b). Le milieu nutritif est alors généralement un milieu gélosé, dont les nutriments parviennent aux cellules par capillarité. En se multipliant à la surface de la membrane, les cellules dont amenées à former des micro-colonies.

Comme cela est également prévu dans la technologie Milliflex, une étape de détection permettant le dénombrement des microorganismes sur la membrane peut être préalablement mise en oeuvre avant la lyse des cellules de l'étape b), par exemple, en extrayant I'ATP des cellules entre l'étape a) et l'étape b), et en faisant réagir cet ATP avec un réactif bioluminescent comprenant de la luciférine et de la luciférase. Selon l'invention, les acides nucléiques extraits sont constitués d'ARN et d'ADN, notamment d'ARN messagers et ribosomaux et d'ADN génomique. Le procédé selon l'invention présente l'avantage de pouvoir mettre en oeuvre les ARN aussi bien que les ADN extraits des cellules par le procédé selon l'invention. La détection des acides nucléiques à l'étape e) s'effectue préférentiellement par une hybridation spécifique de tout ou partie des acides 16

nucléiques récupérés à l'étape d) à l'aide d'une amorce ou d'une sonde pouvant être spécifiquement marquée. Par sonde, on entend selon l'invention des macromolécules capables de reconnaître et de s'associer avec l'une des catégories d'acides nucléiques susvisées permettant ainsi leur marquage. Par amorce, on entend selon l'invention des macromolécules capables de reconnaître et de s'associer avec l'une des catégories d'acides nucléiques susvisées afin d'initier des réactions d'amplification desdits acides nucléiques. La sonde ou l'amorce utilisée est généralement une macromolécule capable de s'hybrider avec des séquences d'ADN ou d'ARN présentes parmi les acides nucléiques extraits avec un certain degré de spécificité. L'invention prévoit tout type de sonde ou d'amorces connu de l'homme du métier pouvant donner lieu à une hybridation spécifique avec des acides nucléiques, tel que, par exemple des oligonucléotides simples, des oligonucléotides de type 2'O-méthyl- ARN, des sondes ou amorces de type PNA (sondes constituées d'une chaîne polypeptidique substituées par des bases puriques et pyrimidiques) [Nielsen P.E. et al. Science (1991) 254 :1497-1500] ou LNA (oligonucléotides comprenant un ou plusieurs monomères de 2'-0-4'-C-methylène-(3-D-ribofuranosyl) telles que décrites dans le brevet EP 1 013 661.

Par réaction d'amplification, on désigne des réactions enzymatiques permettant de synthétiser, à partir desdits acides nucléiques, des macromolécules dont on peut détecter la présence par des méthodes usuelles, par exemple par chromatographie sur gel d'agarose ou d'acrylamide, micro-séquençage ou fluorescence.

Le procédé selon l'invention peut donc comprendre à l'étape e) une étape d'amplification de tout ou partie des acides nucléiques récupérés à l'étape d) par l'une des techniques connues de l'homme du métier telle que la PCR (Réaction de polymérisation en chaine) ou encore une réaction d'amplification effectuée de manière isotherme selon les techniques bien connues de l'homme du métier telles que, par exemple, les amplifications de type NASBA [Compton, J., Nature (1991) 350 :91-92 ] TMA ou de type LAMP [Notomi T., Nucleic Acids Research (2000), 28(12): e63]. 17

Une telle étape d'amplification peut s'avérer utile pour une détection optimale des microorganismes en augmentant la quantité des acides nucléiques disponibles aux fins de la détection. Si cette étape d'amplification est hautement spécifique, elle permet par ailleurs d'identifier les microorganismes avec davantage de sélectivité. Les préparations d'acides nucléiques obtenues selon le procédé de l'invention sont particulièrement adaptées pour la mise en oeuvre d'une détection des acides nucléiques par amplification.

L'invention a également pour objet un kit d'extraction d'acides nucléiques, caractérisé en ce qu'il comprend : - une membrane, de préférence en cellulose ou en PVDF. - une composition de lyse telle que définie précédemment. Avantageusement, ce kit comprend en outre, une ou plusieurs sondes ou amorces spécifiques pour réaliser la détection des acides nucléiques extraits, notamment par hybridation ou par PCR. Optionnellement, ce kit peut également comprendre une seconde membrane pour la filtration d'un milieu liquide ou gazeux. Ce kit permet la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Un tel kit est particulièrement utile pour mettre en oeuvre les procédés d'extraction et de purification de l'ADN, et de manière subséquente, identifier des cellules ou microorganismes dans les conditions définies précédemment. Les exemples qui suivent ont pour but de compléter la description de la présente invention sans y apporter de limitation.25 Matériel et Méthodes

Microorganismes testés Les microorganismes utilisés dans les tests de détection décrits ci- après ont été obtenus auprès de la collection américaine de microorganismes 5 ATCC. Le numéro de référence des souches est indiqué dans le tableau 1. Table 1: Microorganismes utilisés Microorganismes Gram ATCC Escherichia coli - 8739 25922 Pseudomonas aeruginosa - 9027 Salmonella enterica - 13314 Staphylococcus aureus + 6538 Staphylococcus epidermidis + 14990 Bacillus subtilis + 6633 Propionibacterium acnes + 6919 Ces souches ont été conservées à -80°C dans un milieu adapté (Sigma, 10 ref C6039). Elles ont été ensuite cultivées et diluées dans un milieu à base de peptone (Biomerieux, ref. 42111) afin d'obtenir la densité souhaitée. Dénombrement de la flore totale Les microorganismes ont été dénombrés selon deux méthodes : 1 - Méthode d'énumération sur milieu qélosé: 15 Des boites de Pétri contenant un milieu gélosé inoculé avec 100pI d'une culture diluée sont mises en incubation pendant 24 à 48 heures à 35°+/-2.5°C pour les bactéries, 48 à 72h à 25°+/-2.5°C pour les levures et les moisissures. Les colonies sont visuellement énumérées sur trois boîtes différentes afin de déterminer la concentration des cultures diluées ayant servi à leur inoculation. 20 2 -Méthode par filtration : Le matériel et consommable associé au système Milliflex commercialisé par Millipore a été utilisé pour filtrer les mêmes 100pI de culture diluée sur une 18 19

membrane en cellulose (MCE) (Millipore, ref. MXHAWG124) ou en polyvinylidene fluoride (PVDF)(Millipore, ref. RMHVWP124), dont le diamètre moyen des pores est 0.45 pm. On procède, en condition stérile, de la manière suivante: 1. on introduit 50 mL d'une solution stérile comprenant 0.9% de NaCl dans l'entonnoir ; 2. on introduit les 100 pl de culture diluée à la suite; 3. on introduit à nouveau 50 mL d'une solution stérile comprenant 0.9% de NaCl pour homogénéiser ; 4. on filtre à l'aide d'une pompe à vide à travers la membrane en cellulose et on transfère la membrane sur une cassette de milieu gélosé ; 5. on laisse se développer les microorganismes sur la membrane soit pendant quelques heures en vue d'un dénombrement par ATP bioluminescence (microbiologie rapide) soit pendant 1 ou 2 jours en vue d'un dénombrement à l'oeil nu. Le système de détection rapide automatisé (Milliflex Rapid Microbiology Detection system) est ensuite utilisé pour détecter les microcolonies qui se développent sur la membrane en PVDF par la technique d'ATP bioluminescence. Cette technique utilise un réactif de lyse pour libérer l'ATP des cellules et un réactif de bioluminescence comprenant de la luciférase et de la luciférine utilisant l'ATP comme substrat de réaction. Les membranes sont traitées par pulvérisation de 35pl de chacun des réactifs en utilisant un pulvérisateur adapté (Milliflex Rapid Autospray Station ; Millipore, ref. MXRP SPRKT). Les photons produits par la réaction entre l'ATP et le réactif de bioluminescence sont détectés dans une chambre noire par une caméra CCD reliée à une interface gérée par un logiciel permettant de reconstituer la membrane en image de synthèse (Milliflex Rapid software v3.0). La concentration minimale d'ATP mesurée est de 200 attomoles, soit l'équivalent de la quantité d'ATP extrait d'une levure ou bien de 100 bactéries.

Extraction des acides nucléiques contenus à la surface de la membrane Milliflex Les cellules présentes sur la membrane de PVDF après l'étape de détection par bioluminescence décrite ci-dessus au point 1.2 sont reprises dans 20

un tampon de lyse. Plusieurs Tampons de lyse ont été testés. Ces tampons ont été formulés à partir d'un ou plusieurs des produits vendus par la société SIGMA, choisis parmi les suivants, à différentes concentrations : thiocyanate de guanidium (Ref. 50980), hydrochlorure de guanidium (Ref. G9284), Tris EDTA buffer (Ref. 86377), Triton X100 (Ref. T8787), Tween 20 (Ref. P-7949) and N-lauroyl sarcosine (Ref. L 7414). Le protocole de lyse est le suivant : 1. La membrane du Milliflex est placée sur une cassette (ref Millipore cat number MPRBLB100) de manière à former un ensemble hermétique à l'intérieur duquel est injecté à l'aide d'une seringue 1 à 1.5 ml de la composition de lyse. 2. La membrane est maintenue au contact de la composition de lyse pendant 1h à 55°C sous agitation faible à 10-12 rpm. 3. le lysat cellulaire est récupéré à l'aide de la seringue.

Purification des acides nucléiques Deux méthodes ont été employées : la méthode traditionnelle basée sur une précipitation des acides nucléiques à l'isopropyl alcool (IPA, Sigma ref. 19030) puis un traitement à l'éthanol (Prolabo, ref.20 824.365) dite méthode "Crude Susan modifiée". Selon cette méthode que les inventeurs ont modifiée, les cellules sont traitées en l'absence de protéinase K avec une composition de lyse comprenant :

L'isopropyl alcool est ajouté au lysat cellulaire ainsi traité, volume à volume. Le mélange obtenu est centrifugé 30 min à 13200 rpm à 15°C. Le surnageant est ensuite retiré du tube de centrifugation, le culot formé par le précipité est rincé avec 400pl d'éthanol à 70%, puis à nouveau centrifugé pendant 10 min à 13200 rpm à 15°C. Le surnageant est jeté et le culot séché à Thiocyanate de guanidium 4M NLS 2% Tris, pH = 7, 6 50 mM EDTA 10 mM R-mercaptoéthanol Io/o 21

température ambiante pendant 20 minutes. Enfin, le précipité d'acide nucléique est dissout dans 50pl d'eau pure. L'autre méthode, selon l'invention, consiste à utiliser une membrane d'ultra-filtration logée dans un tube de centrifugation. Ce type de membrane est disponible sous le nom commercial de filtre Microcon (Millipore, ref. 42413). Le filtre Microcon contient une membrane de cellulose régénérée dont les pores permettent le passage de molécule de poids moléculaire nominal inférieur à 100 000 da (MWCO). Le consommable a une capacité de 500pl. Le protocole de purification des acides nucléiques est le suivant: 1. 500pl de lysat cellulaire sont placés dans le filtre sur la membrane, lequel est soumis à une centrifugation de 500 x g pendant 25 à 30 minutes à température ambiante ; 2. le lysat cellulaire ayant traversé la membrane est jeté ; 3. un volume de 450pl d'eau (MilliQ) purifiée à 55°C est placé dans le filtre sur la membrane ; 4. la filtre est à nouveau soumis à une centrifugation pendant 20 minutes à 500 x g à température ambiante; 5. l'eau ayant traversé la membrane est jetée; 6. la même opération qu'en 4. et 5. est renouvelée; 7. le volume d'eau restant en surface de la membrane est ajusté à 50pl; 8. le filtre est agité dans un vortex quelques secondes ; 9. le filtre est retourné et placé dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 ml; 10. Le filtre est centrifugé pendant 3 minutes à 1,000 x g ; 11. les acides nucléiques sont récupérés dans la solution aqueuse présente dans le tube de 1,5 ml. Il est recommandé que la membrane ne sèche pas au cours de ces opérations.30 22

Amplification des ADN par PCR Les amplifications par PCR ont été réalisées au moyen du kit Qiagen PCR kit (Ref. 201223) en suivant les instructions du fabriquant. Les volumes de réactifs utilisés sont indiqués dans le tableau 2. La séquence des amorces fabriquées par Eurogentec est indiquée dans le tableau 3, ainsi que la température d'hybridation de celles-ci.

Tableau 2: réactifs de PCR utilisés Mix components Concentration Volume Taq buffer 10x 2.5 pl dNTP 10 mM 1 pl Primer forward(1/10) 100 pM 1 pl Primer reverse (1/10) 100 pM 1 pl Taq DNA polymerase 5 U/pl 0.2 pl DNA Template 19.3pl QSP 25pl Tableau 3: sequence des amorces et cible des amorces. Amorces Séquences ADN cible Hybridation 5' > 3' T°C Bact-F AGASTTTGATYMTGGCTCAG 16S 52°C Bact-R CCGTCAATTCMTTTGAGTTT ADNribosomal YM-F AGACCGATAGCGAACAAGTA 16S 47°C YM-R CTTGGTCCGTGTTTCAAGACGG ADNribosomal S.epi-F CGTAAACGATGAGTGCTAAGTG S.epidermidis 64°C S.epi-R AAGGGGCATGATGATTTGAC 16S ADNr B.sub-F AAGTCGAGCGGACAGATGG B. subtilis 60°C B.sub-R CCAGTTTCCAATGACCCTCCCC 16S ADNr E.coli-F ACCTTTGCTCATTGACGTTACC E.coli 62°C E.coli-R CAAGACCAGGTAAGGTTCTTCG 16S ADNr Les conditions de PCR pour Bact-F and Bact-R sont les suivantes : (Détection universelle pour les bactéries) - 1 cycle à 95°C pendant 05:00 minutes ; 23

- 35 cycles (94°C pendant 00:30, 52 °C pendant 00:40, 72°C pendant 01:10) ; - 1 cycle à 72°C pendant 20:00 minutes. Les conditions de PCR pour YM-F and YM-R sont les suivantes : (Détection universelle pour les levures) - 1 cycle à 95°C pendant 05:00 minutes ; - 35 cycles (94°C pendant 01:00, 52 °C pendant 01:00, 72°C pendant 01:00) ; - 1 cycle à 72°C pendant 20:00 minutes.

Les conditions de PCR pour la détection commune spécifique d'E.coli, B.subtilis et S.epidermidis sont les suivantes: - 1 cycle à 95°C pendant 05:00 minutes; - 35 cycles (94°C pendant 01:00, 62°C/60°C/64°C respectivement pendant 00:40, 72°C pendant 01:10); - 1 cycle à 72°C pendant 20:00 minutes. Les conditions de PCR pour la détection spécifique en PCR nichée : - 1 cycle à 95°C pendant 05:00 minutes; - 35 cycles (94°C pendant 01:00, 60°C pendant 00:40, 72°C pendant 01:10); - 1 cycle à 72°C pendant 20:00 minutes. Les produits de PCR sont analysés en gel d'agarose par comparaison avec une échelle connue DNA ladder (Gel Pilot 1Kb or 100 bp Plus Ladder, Qiagen, Ref. 239045).

Résultats Influence des compositions de lyse sur la quantité et la qualité de l'ADN purifié sur membrane Une première approche a consisté à utiliser des kits commerciaux comme ceux par exemple de Qiagen ou de Dynal . Néanmoins, leur utilisation n'a pas permis de purifier une quantité suffisante d'acides nucléiques à partir des 24

microorganismes retenus à la surface de la membrane de filtration permettant une amplification par PCR détectable sur un gel d'agarose (le nombre de cellules contenu dans une micro-colonie détectable par le système Milliflex Rapid correspond à 100-1000 cellules bactériennes) Une seconde approche a consisté à utiliser une composition de lyse ayant pour formulation : - guanidine thiocyanate 4M, - Tris 50mM - EDTA 25mM Cette composition a été testée sur différentes souches de microorganismes, puis l'ADN génomique purifié selon les deux méthodes : - précipitation selon la méthode de Crude Susan Modifiée; ou - par filtration sur membrane de cellulose. Les résultats obtenus selon la méthode de Crude Susan Modifiée se sont montrés décevants en raison d'une faible reproductibilité des résultats : d'une préparation sur l'autre les amplifications PCR étaient d'une intensité variable, sans doute en raison d'une perte de matériel génétique au cours de l'étape de précipitation. La purification sur membrane Microcon a, de son côté, échoué car la composition de lyse a perforé la membrane de cellulose, en raison d'une concentration en thiocyanate de guanidium vraisemblablement trop élevée (4M). En raison des résultats obtenus, le thiocyanate de guanidium n'a pas été réutilisé par la suite. Une troisième approche a consisté à élaborer et tester une série de compositions comprenant du chlorure de guanidium (GHCI). Dans certaines de ces compositions des détergents ont été ajoutés (Tween, Triton, NLS) et de l'EDTA. Ces compositions ont été testées deux fois indépendamment, sur des cellules de la bactérie E.coli (gram négatif). Les extractions d'ADN génomique ont été réalisées à partir soit de cellules fraiches provenant d'une culture diluée, soit de cellules fraiches provenant de micro-colonies après filtration sur membrane, soit de micro-colonies filtrées sur membrane puis traitées en bioluminescence selon le procédé Milliflex , c'est-à-dire de cellules mortes. Dans 25

tous les cas, l'ADN génomique contenu dans les lysats cellulaires a été purifié sur membrane de cellulose Microcon , puis amplifié par PCR en utilisant les amorces dites universelles.

Composition 1 Chlorure de guanidium 6M Tris 10 mM EDTA 1 mM Composition 2 Chlorure de guanidium 6M Tris 10 mM EDTA 1 mM Triton X100 10/0 final Composition 3 Chlorure de guanidium 6M Tris 10 mM EDTA 1 mM Tween 20 1% final

Composition 4 Chlorure de guanidium 6M Tris 10 mM EDTA 1 mM N-lauroyl-sarcosine (NLS) 10/0 final

Composition 5 Chlorure de guanidium 6M Tris 10 mM EDTA 1 mM N-lauroyl-sarcosine (NLS) 0,5% final 26 Composition 6 Chlorure de guanidium 6M Tris 10 mM EDTA 0,5 mM N-lauroyl-sarcosine (NLS) 10/0 final Composition 7 Chlorure de guanidium 6M Tris 10 mM EDTA 0,5 mM N-lauroyl-sarcosine (NLS) 0,5% final Les résultats d'amplification sont présentés sur le tableau de la Figure 1. 15 Les témoins utilisés pour tester l'effet d'inhibition des compositions de lyse sur la PCR (témoin inhibition PCR) résultent d'échantillons dans lesquels de l'ADN pur de bactérie a été introduit avant purification sur membrane. Ces résultats indiquent que seule la composition 7 a permis d'obtenir des résultats satisfaisants et reproductibles en ce qui concerne les cellules filtrées sur 20 membrane. Cela est vérifié pour un nombre de cellules compris entre 10 et 100 traitées ou non préalablement en bioluminescence, c'est-à-dire vivantes ou mortes au moment de la lyse cellulaire. Ces expériences montrent l'influence marquante de la composition de lyse sur l'efficacité de la purification de l'ADN sur membrane et son amplification par PCR. 25 Universalité, spécificité et sensibilité de la détection Le protocole d'extraction et de détection d'ADN génomique développé à l'aide de la composition n°7 de lyse décrit ci-dessus a été appliqué à différents microorganismes: Moisissures, Levures, Bactéries gram+ et gram-, pour vérifier 30 la spécificité et l'universalité du procédé selon l'invention. 10 27

Universalité Les résultats de détection réalisés sont présentés dans les Figure 2 et 3A et 3B. Ces résultats montrent qu'une détection de tous les microorganismes testés peut être obtenue en utilisant des amorces universelles de PCR, et ce avec un niveau de signal d'amplification comparable. Les acides nucléiques de la bactérie Propionibacterium acnes ATCC 6919 (entre 5 et 6 CFU incubés sur milieu TSA à 32,5 °C en anaérobiose pendant 39 heures) ont été extraits en suivant la même méthode. Les ADN contenus dans cette préparation d'acides nucléiques ont été amplifiés par PCR de la même façon qu'indiqué ci-dessus, en utilisant les oligonucléotides Bact-F and Bact-R, qui permettent une détection universelle des bactéries. Les résultats des amplifications pour les trois préparations d'acides nucléiques testées sont représentés dans la figure 7.

Spécificité Des PCR utilisant des amorces internes spécifiques des microorganismes suivants : B. subtilis ATCC 6633, S. epidermidis ATCC 14990, and E. coli ATCC 25922 ont été effectuées pour vérifier la spécificité de la détection, notamment lorsque plusieurs type de cellules sont en mélange.

Une population de cellules composées de ces trois espèces bactériennes a ainsi été préparée puis filtrée sur une membrane du système Milliflex Rapid permettant leur détection par ATP bioluminescence. Les résultats de détection en ATP-bioluminescence sont représentés dans la figure 4A pour 3 prélèvements de cellules différents. Ensuite, les cellules ont été traitées par une composition de lyse selon l'invention (composition N°7) et leur ADN génomique purifié sur une membrane de cellulose comme décrit précédemment. Les résultats obtenus en PCR avec les amorces universelles et chaque couple d'amorces spécifiques sont présentés dans la figure 4B. Dans une autre expérience, deux cultures cellulaires l'une de B. subtilis ATCC 6633 et l'autre de S. epidermidis ATCC 14990 ont été traitées selon le protocole de détection Milliflex Rapid décrit précédemment (résultats Figure 5A). L'ADN des bactéries a été ensuite extrait et purifié sur membrane en 28

utilisant la composition de lyse N°7 décrite précédemment, puis amplifié par PCR en utilisant les amorces universelles (résultats Figure 5B). Les produits d'amplification ont ensuite fait l'objet d'un micro- séquençage. Les résultats du micro-séquençage (Figure 5C) montrent que 100% des produits d'amplifications correspondent au microorganisme en culture. Sensibilité de la détection Pour déterminer le seuil de détection du procédé selon l'invention, 1 CFU de la bactérie E.coli et de la levure S. cerevisiae a été déposé sur des membranes séparées. Les membranes ont été énumérées par ATP bioluminescence à l'aide du système Milliflex rapid, puis l'ADN génomique a été extrait et amplifié, comme indiqué précédemment. Les résultats représentés dans la figure 6 montrent qu'un nombre de cellules aussi faible que celui représenté par 1 CFU peut être amplifié par PCR suite au procédé d'extraction de l'ADN selon l'invention. Cette sensibilité est atteinte aussi bien pour la bactérie que pour la levure.

Détection des ARN contenus dans les préparations d'acides nucléiques Méthode HPA (Hybridization Protection Assay) Les ARN contenus dans une préparation d'acides nucléiques préparée à partir de 1,6.108 CFU de Propionibacterium acnes selon la méthode indiquée précédemment, ont été détectés par bioluminescence en suivant la méthode HPA. Cette méthode est mise en oeuvre à l'aide du kit MTC-NI RAPID DETECTION SYSTEM de Gen- Probe (104574 Rev.C). Ce kit permet la quantification de la concentration de l'ARN ribosomal de P. acnes disponible après lyse cellulaire. La présence d'ARN permet la protection d'un ADN simple brin, qui comporte des molécules d'ester d'acridine, durant la phase d'hybridation. Des ions peroxyde sont ensuite ajoutés et la lecture est réalisée. Les ions peroxyde viennent réagir avec les molécules d'ester d'acridine ce qui provoque l'émission de photons. La quantité de photons émis est proportionnelle à la quantité d'ARN initialement ajoutée. La lumière émise est mesurée à l'aide d'un luminomètre et les résultats sont fournis en unité relative de lumière. 29

Le tableau 4 compare les résultats obtenus pour la préparation extraite à l'aide de la composition de lyse n°7 selon l'invention, la préparation obtenue à l'aide de la composition de lyse fournie avec le kit MTC-NI, et pour les contrôles négatifs et positifs fournis dans le kit MTC-NI. Tableau 4: Résultats de détection de l'ARN par luminescence HPA Echantillon Unité relative de lumière Contrôle négatif 769 (Tampon d'hybridation seul) Contrôle positif (contrôle interne du kit) Lyse de P. acnes avec la composition du kit MTC-NI

.......................................................................... DTD: .................................. Lyse de P. acnes avec la composition [Guanidium HCI 6M, Tris 5mM, EDTA 33,438 0.5mM, NLS 0.5%]..DTD: Ces résultats montrent que la préparation d'acides nucléiques obtenue à l'aide de la composition de lyse selon l'invention permet d'obtenir une meilleure 10 détection que celle obtenue à l'aide de la composition de lyse fournie dans le kit MTC-NI. Méthode d'amplification TMA (Transcription Mediated Amplification) : Les ARN contenus dans des préparations d'acides nucléiques préparées à partir de 30 et 300 CFU de Propionibacterium acnes selon la 15 méthode indiquée précédemment, ont été amplifiés et détectés par la technique TMA décrite par Craig S Hill et al. [Molecular diagnostic testing for infectious diseases using TMA technology (2001) Expert Rev Mol Diagn. 1(4):445-55]. Cette technique consiste, au cours d'une première étape, à rétro-transcrire les molécules d'ARN présentes dans l'échantillon, puis dans une seconde étape, à 20 synthétiser des fragments d'ARN (étape d'amplification isotherme) par transcription à partir de l'ADN produit à la première étape. 65,097 9,923 30

La technique TMA a été mise en oeuvre à l'aide des réactifs du kit Milliprobe Pseudomonas aeruginosa detection kit (Millipore ref. GPPAE0100). La figure 8 représente la détection en temps réel des produits d'amplification synthétisés dans le milieu de réaction pour chacune des préparations d'acides nucléiques selon l'invention (30 et 300 CFU). La préparation d'acides nucléiques correspondant à 30 CFU permet une amplification satisfaisante presque équivalente à celle correspondant à 300 CFU, ce qui rend compte d'une très bonne efficacité de l'extraction des ARN de P. aeruginosa par la composition de lyse N°7.10

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition de lyse caractérisée en ce qu'elle comprend du chlorure de guanidium et du N-Lauroyl-Sarcosine (NLS), la concentration en NLS étant comprise entre 0,1 et 1 % par rapport au poids total de ladite composition.

2. Composition de lyse selon la revendication 1, caractérisée en ce 10 que la concentration en Chlorure de Guanidium est comprise entre 3 et 8 mol.l 1.

3. Composition de lyse selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre de l'EDTA.

4. Composition de lyse selon la revendication 3, caractérisée en ce que la concentration de ladite composition en EDTA est comprise entre 0,1 et 1 mmol. 1-1. 20

5. Composition de lyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme d'une solution.

6. Procédé d'extraction d'acides nucléiques d'une ou plusieurs cellules, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 25 a) on traite les cellules avec du chlorure de guanidium et du N-Lauroyl-sarcosine (NLS) en solution, de sorte à lyser les cellules et libérer les acides nucléiques qu'elles contiennent; b) on sépare les acides nucléiques du lysat cellulaire obtenu en a) par filtration dudit lysat au travers d'une membrane ; 30 c) on récupère les acides nucléiques retenus par ladite membrane en solution dans de l'eau ou une solution aqueuse faiblement ionisée. 15

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le NLS est utilisé en solution à une concentration comprise entre 0,1 et 1 %.

8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que le chlorure de guanidium et le NLS sont utilisés simultanément dans une composition de lyse selon la revendication 5. 10

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que la membrane utilisée à l'étape b) pour séparer les acides nucléiques du lysat cellulaire est une membrane en cellulose.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, 15 caractérisée en ce que la membrane utilisée à l'étape b) présente une limite nominale de poids moléculaire entre 3000 et 100 000 daltons, de préférence entre 50 000 et 100 000 daltons.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, 20 caractérisé en ce que la séparation des acides nucléiques du lysat cellulaire est effectuée au travers de la membrane sous l'effet d'une pression négative ou positive.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, 25 caractérisé en ce que la séparation des acides nucléiques du lysat cellulaire est effectuée au travers de la membrane sous l'effet d'une centrifugation.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, entre les étapes b) et c), une étape 30 de lavage des acides nucléiques retenus par la membrane à l'aide d'une solution de lavage telle que de l'eau ou une solution aqueuse faiblement5 33 ionisée, cette solution de lavage étant éliminée après passage au travers de la membrane.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 13, caractérisé en ce qu'à l'étape c), les acides nucléiques sont récupérés en faisant passer l'eau ou la solution aqueuse faiblement ionisée au travers de la membrane dans le sens inverse de celui appliqué à l'étape b), de préférence sous l'effet d'une pression négative ou positive, ou d'une centrifugation.

15. Procédé de détection d'une ou plusieurs cellules dans un milieu liquide ou gazeux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on filtre un échantillon du milieu liquide ou gazeux au travers d'une membrane pour retenir les cellules contenues dans ledit échantillon sur ladite membrane ; b) on traite les cellules retenues à l'étape a) avec du chlorure de guanidium et du N-Lauroyl-sarcosine (NLS) en solution, de sorte à obtenir un lysat cellulaire contenant les acides nucléiques libérés desdites cellules; c) on sépare les acides nucléiques du lysat cellulaire obtenu à l'étape b) par filtration dudit lysat au travers de ladite membrane, ou bien au travers d'une autre membrane; d) on récupère les acides nucléiques retenus par la membrane à l'étape c) dans de l'eau ou dans une solution aqueuse faiblement ionisée ; e) on détecte des acides nucléiques récupérés à l'étape d).

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la détection des acides nucléiques à l'étape e) s'effectue par hybridation spécifique de tout ou partie des acides nucléiques récupérés à l'étape d) à l'aide d'une sonde ou d'une amorce spécifique marquée.

17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que la détection des acides nucléiques à l'étape e) comprend une étape d'amplification de tout ou partie des acides nucléiques récupérés à l'étape d).

18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite étape d'amplification consiste en une réaction de polymérisation en chaine (PCR).

19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite étape d'amplification consiste en une amplification isotherme telle qu'une amplification de type LAMP, NASBA ou TMA.

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que la détection des acides nucléiques à l'étape e) comprend une étape de rétrotranscription de l'ARN en ADN.

21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 20, caractérisé en ce que la membrane utilisée pour séparer les acides nucléiques de la composition de lyse à l'étape c) est différente de celle utilisée à l'étape a).

22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 21, caractérisé en ce que les étapes b) à d) sont effectuées conformément aux étapes a) à c) du procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 14.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, caractérisé en ce que ladite membrane utilisée à l'étape a) est mise en contact avec un milieu nutritif afin que les microorganismes puissent croître à la surface de ladite membrane entre les étapes a) et b).

24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 23, caractérisé en ce qu'une étape de détection permettant le dénombrement des 35 microorganismes est effectuée entre les étapes a) et b), en faisant réagir l'ATP extrait des microorganismes avec un réactif bioluminescent, tel qu'un réactif comprenant de la luciférine et de la luciférase.

25. Kit d'extraction d'acides nucléiques, caractérisé en ce qu'il comprend : - une membrane de filtration; - une composition de lyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.

26. Kit de détection de microorganismes caractérisé en ce qu'il comprend : - une membrane de filtration ; - une composition de lyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 5; - une ou plusieurs amorces spécifiques pour réaliser la détection des acides nucléiques extrait par hybridation ou par PCR.