EP3942034A1 - Billes de verre fonctionnalisees, leur utilisation pour capter des micro-organismes et les dispositifs correspondants - Google Patents

Billes de verre fonctionnalisees, leur utilisation pour capter des micro-organismes et les dispositifs correspondants

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Publication number
EP3942034A1
EP3942034A1 EP20710190.8A EP20710190A EP3942034A1 EP 3942034 A1 EP3942034 A1 EP 3942034A1 EP 20710190 A EP20710190 A EP 20710190A EP 3942034 A1 EP3942034 A1 EP 3942034A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microorganisms
lysine
polylysine
glass beads
approximately
Prior art date
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Pending
Application number
EP20710190.8A
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German (de)
English (en)
Inventor
Wilfried ABLAIN
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Microbs Sas
Original Assignee
Microbs Sas
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Filing date
Publication date
Application filed by Microbs Sas filed Critical Microbs Sas
Publication of EP3942034A1 publication Critical patent/EP3942034A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
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    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/42—Preservation of non-alcoholic beverages
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    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/70—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter
    • A23L2/80—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter by adsorption
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/27—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification by chemical treatment, by adsorption or by absorption
    • A23L5/273—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification by chemical treatment, by adsorption or by absorption using adsorption or absorption agents, resins, synthetic polymers, or ion exchangers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • Functionalized glass beads their use to capture microorganisms and the corresponding devices.
  • the present invention relates to functionalized glass beads, their preparation process and their use in the capture of microorganisms for the implementation of a process for the elimination of microorganisms or for diagnosis, as well as devices comprising these.
  • functionalized glass beads allowing the implementation of these different processes.
  • microorganisms The capture of microorganisms is of fundamental interest in many types of industry, such as the pharmaceutical, cosmetic or food industries. It can in particular be used for applications which fall into two main areas:
  • the major drawback of heat treatment stems from the fact that the temperature is liable to cause irreversible changes in the product by acting directly on its constituents. Also, at the microbiological level, the heat treatment corresponds to a reduction in the load of microorganisms and it is, for example, capable of reactivating bacterial spores. Regarding membrane filtration, membrane clogging is the main problem that can be encountered. The latter may be due to the concentration of microorganisms in the product as well as to the nature of the product and in particular to the solid particles present within it.
  • Microbiological analysis requires the use of precise techniques for which the time to obtain the shortest possible result is sought. Indeed, the faster the analysis results are obtained, the more it is possible to initiate corrective actions in the event of unsatisfactory or unacceptable results.
  • it is necessary to predict and diagnose the risk of infection the more rapid and precise the diagnosis, the more effective the care of patients and the minimized risk of transmission.
  • a key step for most of these methods for detecting / quantifying microorganisms in liquid or liquid samples is their ability to exceed the detection limit of the evaluation technique used. This is particularly difficult for samples with low concentrations of the microorganisms of interest. An enrichment or concentration step often appears necessary for this type of sample.
  • the pre-enrichment and / or enrichment phase requires the use of culture media, selective or not, which aim to promote the growth of target microorganisms in biological or environmental samples, while limiting the growth of flora non-target.
  • the target population which is often present at low levels compared to the additional flora present in foods, is amplified.
  • Another possibility is to go through a step of concentrating the microorganisms from the liquid or liquid sample.
  • One of the most widely used techniques for the concentration of microorganisms from samples is the use of one or more membrane filters of varying porosity through which the liquid medium is filtered. The microorganisms in the sample are stopped by the membrane and therefore concentrated. Such a technique is generally used for the microbiological analysis of process water, drinking water, or drinking water.
  • microorganisms can be concentrated and separated from the constituent elements of the sample.
  • immunocapture or immunoconcentration methods are widely used in many applications. They very often use supports functionalized with antibodies and make it possible to specifically capture or not the microorganisms contained in the sample. These methods are widely used for the microbiological analysis of human fluids or food samples.
  • New methods also allow the semi-specific capture of microorganisms using functionalized cell surfaces. They use lectin or carbohydrate derivatives, peptides and peptide-mimicking compounds and are applied to the broad spectrum capture and / or specific binding of microorganisms in the sample.
  • antimicrobial peptides linked to insoluble compounds have been used to kill, immobilize and detect microorganisms.
  • polylysine is known for its antimicrobial activity.
  • One of the aims of the invention is to provide functionalized glass beads capable of capturing microorganisms under simple conditions of use.
  • Another object of the invention is to provide a simple process for preparing these glass beads functionalized with lysine or polylysine.
  • Another object of the invention is to provide a device comprising the functionalized glass beads for use in the uptake of microorganisms.
  • Another object of the invention is to provide an efficient method of capturing microorganisms for use in removing microorganisms or in diagnosis.
  • a first object of the present invention is a glass bead functionalized with lysine or polylysine adsorbed on its surface.
  • glass ball is understood to mean an element of spherical shape composed of glass.
  • lysine is understood to mean the amino acid represented by the formula below.
  • polylysine is understood to mean a polymer of lysine.
  • the term “adsorbed” is understood to mean the fact that the lysine or polylysine molecules are attached to the surface of the glass beads by weak bonds of the Van der Waals type without modifying the molecular structure of the glass or of lysine or polylysine.
  • the process for functionalizing the beads used in this invention involves adsorbing a polycation onto a negative surface such as glass.
  • the adsorption process has the advantage of being easy to implement. The latter does not require any particular material or device unlike the implementation of a covalent bond between the polylysine and the glass beads.
  • the invention constitutes a non-specific solution for the capture / elimination of microorganisms in a product without however altering it and then, for diagnostic purposes, to propose an elution solution allowing the release of all the microorganisms. retained on the column and ensuring cell viability. Only these two conditions will make it possible to provide a precise quantification of the living microorganisms contained in the sample analyzed.
  • polylysine is a cationic polymer which improves cell adhesion and absorption of proteins or even nucleic acids by modifying the surface charges of the materials to which it is applied, for example certain plastics such as polystyrene or even glass.
  • Polylysine surface treatments allow many applications including adhesion and spreading of various cell lines, cell differentiation and outgrowth of neurites, adhesion of transfected cell lines and survival of primary neurons in the cell. culture.
  • the invention has many advantages over the techniques of the prior art. First of all, it makes it possible to avoid the use of heat treatment to eliminate microorganisms from potentially contaminated solutions and thus to preserve all the original qualities of the product without causing changes to its constituents.
  • the invention also makes it possible to avoid using membrane filtration and its drawbacks linked, among other things, to clogging.
  • the invention makes it possible to eliminate the microorganisms contained in liquid or liquid samples of large volume, samples which may be of different natures and have, for example, high turbidity or particles or sediments within them.
  • the present invention relates in particular to a method for capturing and concentrating at least one microorganism likely to be present in a sample with a view to detecting it, quantifying it or evaluating its viability.
  • a very low number of microorganisms is detectable which makes it possible to avoid carrying out an enrichment and thus to considerably reduce the analysis time but also to be able to quantify the initial target population.
  • the invention solves the problems of mortality which can be induced by the use of polylysine in the context of a diagnosis and makes it possible to maintain the microorganism in its initial physiological state (dead or alive).
  • the microorganism can here be a bacterium, a Fungi (for example a yeast or a mold) or a virus. This process is particularly applicable to microorganisms contained in complex media. These media corresponding to biological samples can be of human, food, cosmetic, veterinary or pharmaceutical origin.
  • One of the major advantages of the present invention lies in the fact that the product does not undergo any modification on contact with the functionalized glass beads and that this also makes it possible to overcome problems of clogging.
  • Another major advantage of the present invention is the possibility of using the device for capturing microorganisms in continuous flow, without enrichment steps, even if the quantity of microorganisms is low.
  • this device allows a considerable saving of time over methods involving an enrichment step.
  • the present invention relates to a glass bead functionalized by poly lysine adsorbed on its surface.
  • the present invention relates to a glass bead as described above having a diameter of approximately 20 to approximately 1000 ⁇ m, in particular of approximately 20 to 30 ⁇ m, of approximately 30 to 40 ⁇ m, about 40 to 50 ⁇ m, about 50 to 75 ⁇ m, about 75 to 100 ⁇ m, about 100 to 200 ⁇ m, about 200 to 300 ⁇ m, about 300 to 400 ⁇ m, about 400 to 500 ⁇ m, about 500 to 600 ⁇ m, about 600 to 700 ⁇ m, about 700 to 800 ⁇ m, about 800 to 900 ⁇ m, about 900 to 1000 ⁇ m.
  • the size of the glass beads is less than 20 ⁇ m, the beads pass through the frit intended to retain them. On the other hand, for beads larger than 1000 ⁇ m, the uptake rates obtained are low. The reduction in the size of the balls combined with a greater number of balls makes it possible to have a higher contact surface.
  • the larger the size of the beads the greater the number of beads must be in order to maintain a constant uptake rate.
  • the present invention relates to a glass bead as described above, in which the glass is of the soda-lime or borosilicate type.
  • the type of glass used for the present invention especially soda-lime glass, has an advantage in terms of cost which is low.
  • silica-lime-type glass is understood to mean a glass based on silica (Si0 2 ), calcium and sodium.
  • borosilicate type glass means a glass based on silica (Si0 2 ) and on boron trioxide (B 2 0 3 ).
  • the present invention relates to a glass bead as described above having a mass of approximately 10 ng to approximately 2 mg, in particular of approximately 10 to 50 ng, of approximately 50 to 100 ng, about 100 to 200 ng, about 200 to 500 ng, about 500 ng to 1 pg, about 1 to 5 pg, about 5 to 10 pg, about 10 to 20 pg, d 'about 20 to 50 pg, about 50 to 100 pg, about 100 to 200 pg, about 200 to 500 pg, about 500 pg to 1 mg, about 1 to 1.5 mg, about 1.5 to 2 mg.
  • the present invention relates to a glass bead as described above, in which the lysine or polylysine has a molecular weight of approximately 146 to approximately 146,000 Da, in particular of approximately 146 to approximately 292 Da, from about 292 to about 1460 Da, from about 1460 to about 2920 Da, from about 2920 to about 4380 Da, from about 4380 to about 7300 Da, from about 7300 to about 14,600 Da, from about 14,600 to about 36,500 Da, about 36,500 to about 58,400 Da, about 58,400 to about 80,300 Da, about 80,300 Da to about 87,600 Da, about 87,600 Da to about 16,800 Da, around 116,800 to around 146,000 Da.
  • the lysine or polylysine has a molecular weight of approximately 146 to approximately 146,000 Da, in particular of approximately 146 to approximately 292 Da, from about 292 to about 1460 Da, from about 1460 to about 2920 Da, from about 2920 to about 4380 Da, from about 4380 to
  • the size of the polylysine can range from 292 to about 146,000 Da.
  • the present invention relates to a glass bead as described above, in which the polylysine consists of a sequence of 2 to 1000 lysine units, in particular from 2 to 10, from 10 to 20, from 20 to 30, from 30 to 50, from 50 to 100, from 100 to 250, from 250 to 400, from 400 to 550, from 550 to 600, from 600 to 800, from 800 to 1000 lysine units.
  • the present invention relates to a glass bead functionalized with lysine or polylysine in which the lysine or polylysine has a molecular weight of approximately 146 to approximately 80,300 Da, in particular of approximately 146 at about 292 Da, from about 292 to about 1460 Da, from about 1460 to about 2920 Da, from about 2920 to about 4380 Da, from about 4380 to about 7300 Da, from about 7300 to about 14,600 Da, from about 14,600 to about 36,500 Da, from about 36,500 to about 58,400 Da, from about 58,400 to about 80,300 Da.
  • the size of the polylysine can range from 292 to about 80,300 Da.
  • the present invention relates to a glass bead functionalized with lysine or polylysine in which the polylysine consists of a sequence of 2 to 550 lysine units, in particular from 2 to 10, from 10 to 20, 20 to 30, 30 to 50, 50 to 100, 100 to 250, 250 to 400, 400 to 550 lysine units.
  • the present invention relates to a glass bead as described above, in which the lysine is L-lysine or D-lysine or a mixture of L-lysine and D-lysine , or the polylysine is of type a or e-poly-L-lysine or of type a or e-poly-D-lysine or a mixture of a or e-poly-L-lysine and a or e-poly-D- lysine, linear or branched, optionally in the form of a salt, in particular hydrobromide or hydrochloride.
  • L-lysine and D-lysine is understood to mean the enantiomers represented by the formulas below.
  • linear is understood to mean a polymer in which the sequence of the monomer units is carried out linearly.
  • branched means a polymer in which the sequence of monomer units has branches.
  • the present invention relates to a glass bead having a diameter of about 20 to about 1000 ⁇ m, and a mass of about 10 ng to about 2 mg, in which the glass is of the soda-lime or borosilicate type.
  • lysine or polylysine functionalized by lysine or polylysine adsorbed to its surface, in which the lysine or polylysine has a molecular weight of about 146 to about 146,000 Da, is L-lysine or D-lysine or a mixture of L-lysine and D-lysine, or a or s-poly-L-lysine or a or s -poly-D -lysine or a mixture of a or e-poly-L-lysine and a or s -poly-D-lysine, linear or branched, optionally in the form of a salt, in particular hydrobromide or hydrochloride.
  • a second object of the invention is a process for preparing a glass bead as described above comprising a step of bringing lysine or polylysine into contact with a glass bead to obtain a glass bead functionalized by lysine or polylysine adsorbed on its surface.
  • the adsorption consists of contacting the polylysine at a concentration of 0.1% to 2% with the glass surface for an average period of about ten minutes. A shorter time has also been shown to allow adsorption of polylysine. With or without rinsing, the process makes it possible to effectively capture microorganisms. Rinsing with water nevertheless eliminates excess polylysine, reduces induced mortality and improves possible elution.
  • the beads are functionalized and ready for use.
  • the present invention relates to a preparation process as described above comprising a step of bringing lysine or polylysine into contact with a glass bead for a period of 1 minute to 24 hours, in particular 1 to 5 minutes, 5 to 10 minutes, 10 to 15 minutes, 15 to 20 minutes, 20 to 25 minutes, 25 to 30 minutes, 30 minutes to 1 hour, 1 to 2 hours, 2 to 5 hours, 5 to 10 hours, 10 to 24 hours, to obtain a glass bead functionalized with lysine or adsorbed polylysine.
  • the present invention relates to a preparation process as described above comprising a step of bringing lysine or polylysine into contact with a glass bead for a period of 10 minutes, for obtain a glass bead functionalized with lysine or adsorbed polylysine.
  • the present invention relates to a preparation process as described above comprising a drying step for a period of 1 minute to 12 hours, in particular from 1 to 5 minutes, from 5 to 10 minutes, 10 to 15 minutes, 15 to 20 minutes, 20 to 25 minutes, 25 to 30 minutes, 30 minutes to 1 hour, 1 to 2 hours, 2 to 5 hours, 5 to 12 hours, for obtain a glass bead functionalized with lysine or adsorbed polylysine.
  • the present invention relates to a preparation process as described above comprising a drying step for a period of 10 minutes, to obtain a glass bead functionalized with lysine or polylysine adsorbed.
  • the 10 min drying time corresponds to the duration of the drying step when the latter is accelerated using a vacuum chamber system with the vacuum set to its maximum (-900 mbar at the manometer before opening of the valve).
  • drying means a method of drying in the open or accelerated using a vacuum chamber system, or by lyophilization.
  • the present invention relates to a preparation process as described above in which the drying step is carried out in the open air or accelerated using a vacuum chamber system, or by lyophilization, in particular at a temperature ranging from room temperature to 60 ° C, in particular from room temperature to 30 ° C, from 30 ° C to 40 ° C, from 40 ° C to 50 ° C and from 50 ° C at 60 ° C.
  • room temperature is meant a temperature ranging from about 20 ° C to about 25 ° C.
  • the present invention relates to a preparation process as described above comprising a step of rinsing with an aqueous solution, in particular water, prior to the drying step, in order to remove the non-polylysine. adsorbed during the contacting step.
  • aqueous solution means a liquid phase containing water.
  • aqueous solutions that can be used are water, aqueous solutions of 150 mM NaCl, 200 mM NaCl and 0.01N HCl.
  • the objective during the rinsing can be to lower the pH using an acid solution in order to maximize the positive charges on the surface of the polylysine, it is possible in this case to use acids such as acid citric or acetic acid.
  • a third object of the invention is a device comprising a container containing glass beads as described above.
  • This device can be used in static or in flow.
  • the static mode makes it possible to increase the contact time between the glass beads functionalized by lysine or polylysine and the contaminated liquid and therefore to maximize the probability of encounter between the beads and the microorganisms. This probability of encounter can be further improved by carrying out manual or mechanical agitation.
  • the disadvantage of this technique concerns large volumes of solution to be analyzed or to be debacterized (100 mL, 250 mL) since they require a large amount of beads, and therefore a higher hit than for the flow method.
  • the flow method it is possible to pass large volumes in a small space to force, in a way, the microorganisms to meet the polylysine adsorbed from the beads (the quantity of beads used may be 1g) .
  • the static method can be used for small volumes but not for large volumes.
  • the term “container” means an object intended to receive the glass beads.
  • the present invention relates to a device as described above in which the container is in the form of a tube, a flask, a beaker or a jar.
  • the present invention relates to a device as described above, in which the container is in the form of a column optionally comprising a frit.
  • the column and the frit can be two elements of the same set, or two separate elements which can be assembled.
  • the present invention relates to a device as described above, in which the column has a volume of approximately 0.5 mL to approximately 1 L, in particular of approximately 0.1 mL to 1 mL. , about 1 mL to 2 mL, about 2 mL to 5 mL, about 5 mL to 10 mL, about 10 mL to 50 mL, about 50 mL to 100 mL, about 100 mL to 200 mL, about 200 mL to 500 mL, about 500 mL to 1 L, and the frit has a porosity less than the size of the glass beads used.
  • the present invention relates to a device as described above, in which the total mass of the glass beads is approximately 10 mg to approximately 1 kg, in particular approximately 10 to 50 mg, d about 50 to 100 mg, about 100 to 200 mg, about 200 to 500 mg, about 500 mg to 1 g, about 1 to 2 g, about 2 to 5 g, of about 5 to 10 g, about 10 to 50 g, about 50 to 100 g, about 100 to 200 g, about 200 to 500 g, about 500 g to 1 kg.
  • the present invention relates to a device as described above, comprising a container containing glass beads functionalized with lysine or polylysine adsorbed on its surface, said container being in particular in the form of a column.
  • a frit optionally comprising a frit, said column having in particular a volume of approximately 0.5 mL to approximately 1 L, and said frit having in particular a porosity less than the size of the glass beads used.
  • the present invention relates to a device as described above, in which the lysine or polylysine has a molecular weight of approximately 146 to approximately 146,000 Da, in particular of approximately 146 to approximately 292 Da. , from about 292 to about 1460 Da, from about 1460 to about 2920 Da, from about 2920 to about 4380 Da, from about 4380 to about 7300 Da, from about 7300 to about 14 600 Da , from about 14,600 to about 36,500 Da, from about 36,500 to about 58,400 Da, from about 58,400 to about 80,300 Da, from about 80,300 Da to about 87,600 Da, from about 87,600 Da to about 116,800 Da, from about 116,800 to about 146,000 Da, and / or in which the polylysine consists of a chain of 2 to 1000 lysine units, especially 2 to 10, 10 to 20, 20 to 30, 30 to 50, 50 to 100, 100 to 250, 250 to 400, 400 to 550, 550 to 600,
  • the present invention relates to a device as described above, in which the lysine or polylysine has a molecular weight of approximately 146 to approximately 80,300 Da, in particular of approximately 146 to approximately 292 Da , from about 292 to about 1460 Da, from about 1460 to about 2920 Da, from about 2920 to about 4380 Da, from about 4380 to about 7300 Da, from about 7300 to about 14 600 Da, from about 14,600 to about 36,500 Da, from about 36,500 to about 58,400 Da, from about 58,400 to about 80,300 Da, and / or in which the polylysine consists of a chain of 2 to 1000 lysine units, in particular from 2 to 10, from 10 to 20, from 20 to 30, from 30 to 50, from 50 to 100, from 100 to 250, from 250 to 400, from 400 to 550 lysine units.
  • the polylysine consists of a chain of 2 to 1000 lysine units, in particular from 2 to 10, from 10 to 20, from 20 to 30, from 30
  • the present invention relates to a device as described above, comprising glass beads having a diameter of about 20 to about 1000 ⁇ m, and / or having a mass of about 10 ng to about 2 mg, and / or in which the glass is of the soda-lime or borosilicate type.
  • the present invention relates to a device as described above, in which the lysine is L-lysine or D-lysine or a mixture of L-lysine and D-lysine, or the polylysine is a or e-poly-L-lysine or a or e-poly-D-lysine or a mixture of a or s-poly-L-lysine and a or e-poly-D-lysine, linear or branched, optionally in the form of a salt, in particular hydrobromide or hydrochloride.
  • the present invention relates to a device as described above, comprising a container containing glass beads as described above, said container being in particular in the form of a column optionally comprising a frit, said column having in particular a volume of about 0.5 mL to about 1 L, and said frit having in particular a porosity less than the size of the glass beads used.
  • One of the first applications of the process is the elimination of microorganisms: thanks to capture, the sample is depleted of the microorganisms initially present.
  • a second envisaged application is the diagnosis: the capture is then used as a means for concentrating the microorganisms for a diagnosis.
  • the latter can be qualitative, of the presence / absence type, or quantitative. It may or may not be specific to the type of microorganism, and whether or not to differentiate living cells from dead cells.
  • the analysis of the microorganisms captured can be done directly after capture on beads. These tests can for example be based on the detection of the whole cell or the detection / quantification of one of its constituents (DNA, RNA, ATP, enzymes and their activities or more broadly proteins, etc.). To do this, it is possible to elute the microorganisms or else to lyse them.
  • cytometry flow or solid phase cytometry, colorimetry, spectroscopy, microscopy, ATPmetry (ATP: Adenosine triphosphate), PCR (Polymerase Chain Reaction or chain reaction by polymerase), RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction or polymerase chain reaction after reverse transcription), isothermal amplification or even immunological detection.
  • PCR Polymerase Chain Reaction or chain reaction by polymerase
  • RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction or polymerase chain reaction after reverse transcription
  • isothermal amplification isothermal amplification or even immunological detection.
  • a fourth object of the invention is the use of glass beads as described above or of a device as described above, for the capture of microorganisms for the purpose of diagnosis.
  • microorganism is understood to mean any prokaryotic or eukaryotic microscopic organism such as bacteria, yeasts, fungi and viruses. These microorganisms can be alive or dead. They are made up of DNA, a plasma membrane and different cell organelles. Red blood cells, presenting a plasma membrane, are excluded from this definition.
  • the term “diagnostic” means the detection of the microorganisms captured.
  • diagnostic techniques are in particular flow or solid phase cytometry, colorimetry, spectroscopy, microscopy, ATPmetry (ATP: Adenosine triphosphate), PCR (Polymerase Chain Reaction or chain reaction by polymerase), RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction or polymerase chain reaction after reverse transcription), isothermal amplification, or immunological detection.
  • flow or solid phase cytometry colorimetry, spectroscopy, microscopy
  • ATPmetry ATP: Adenosine triphosphate
  • PCR Polymerase Chain Reaction or chain reaction by polymerase
  • RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction or polymerase chain reaction after reverse transcription
  • isothermal amplification or immunological detection.
  • the present invention relates to a use as described above, for the capture of microorganisms with a view to eliminating or reducing the charge of microorganisms from liquid or viscous samples. likely to contain said microorganisms.
  • the term “elimination or reduction of the load of microorganisms” means the action of reducing the quantity of microorganisms present in a sample.
  • the present invention relates to a use of glass beads functionalized with lysine or polylysine adsorbed on their surface, for the capture of microorganisms with a view to diagnosis, or with a view to lysine. elimination or reduction of the load of microorganisms from liquid or viscous samples liable to contain said microorganisms.
  • the present invention relates to a use as described above of a device comprising glass beads functionalized with lysine or polylysine and as defined above, for the capture of microorganisms.
  • a device comprising glass beads functionalized with lysine or polylysine and as defined above, for the capture of microorganisms.
  • -organisms with a view to diagnosis, or with a view to eliminating or reducing the load of microorganisms from liquid or viscous samples liable to contain said microorganisms.
  • the present invention relates to a use as described above, in which the lysine or polylysine has a molecular weight of approximately 146 to approximately 146,000 Da, in particular of approximately 146 to approximately 292 Da, about 292 to about 1460 Da, about 1460 to about 2920 Da, about 2920 to about 4380 Da, about 4380 to about 7300 Da, about 7300 to about 14,600 Da, about 14 600 to approximately 36,500 Da, approximately 36,500 to approximately 58,400 Da, approximately 58,400 to approximately 80,300 Da, approximately 80,300 Da to approximately 87,600 Da, approximately 87,600 Da to approximately 116 800 Da, from approximately 116,800 to approximately 146,000 Da, and / or in which the polylysine consists of a chain of 2 to 1000 lysine units, in particular from 2 to 10, from 10 to 20, from 20 to 30, from 30 to 50, from 50 to 100, from 100 to 250, from 250 to 400, from 400 to 550, from 550 to 600, from 600 to 800
  • microorganisms for the capture of microorganisms for the purpose of diagnosis, or for the elimination or reduction of the load of microorganisms from liquid or viscous samples which may contain said microorganisms.
  • the present invention relates to a use as described above, in which the lysine or polylysine has a molecular weight of approximately 146 to approximately 80,300 Da, in particular of approximately 146 to approximately 292 Da, from about 292 to about 1460 Da, from about 1460 to about 2920 Da, from about 2920 to about 4380 Da, from about 4380 to about 7300 Da, from about 7300 to about 14,600 Da, from about 14,600 to about 36,500 Da, about 36,500 to about 58,400 Da, about 58,400 to about 80,300 Da, and / or in which the polylysine consists of a sequence of 2 to 1000 lysine units, especially 2 to 10, 10 to 20, 20 to 30, 30 to 50, 50 to 100, 100 to 250, 250 to 400, 400 to 550 lysine units ,
  • microorganisms for the capture of microorganisms for the purpose of diagnosis, or for the elimination or reduction of the load of microorganisms from liquid or viscous samples which may contain said microorganisms.
  • the present invention relates to a use as described above of glass beads as described above, said glass beads having a diameter of from about 20 to about 1000 ⁇ m, and / or having a diameter. mass of about 10 ng to about 2 mg, and / or in which the glass is of the soda-lime or borosilicate type, for the uptake of microorganisms with a view to diagnosis, or with a view to elimination or reduction the charge of microorganisms of liquid or viscous samples liable to contain said microorganisms.
  • the present invention relates to a use as described above of glass beads as described above, in which the lysine is L-lysine or D-lysine or a mixture of L -lysine and D-lysine, or polylysine is a or e-poly-L-lysine or a or e-poly-D-lysine or a mixture of a or e-poly-L-lysine and a or e-poly-D-lysine, linear or branched, optionally in the form of a salt, in particular hydrobromide or hydrochloride, for the capture of microorganisms with a view to diagnosis, or with a view to the elimination or the reduction in the load of microorganisms in liquid or viscous samples liable to contain said microorganisms.
  • a salt in particular hydrobromide or hydrochloride
  • the present invention relates to a use as described above in which said glass beads are defined above, for the capture of microorganisms with a view to diagnosis, or with a view to the elimination. or the reduction in the load of microorganisms in liquid or viscous samples liable to contain said microorganisms.
  • Another subject of the invention is a method for capturing microorganisms comprising a step of bringing a liquid or viscous sample containing said microorganisms into contact with glass beads as described above or d a device as described above, under conditions making it possible to create an interaction between said microorganisms and the glass beads, and to obtain said microorganisms captured on the glass beads.
  • the present invention relates to a method as described above, in which the proportion of microorganisms originating from the sample and captured on the glass beads is from 0.001% to 100% for the purpose of removal. microorganisms from said sample.
  • the present invention relates to a method as described above, comprising an additional step of eluting the microorganisms previously captured under conditions allowing the separation of the aforementioned microorganisms captured from the aforesaid glass beads. and the recovery of said microorganisms.
  • the present invention relates to a method as described above, comprising a step of bringing a liquid or viscous sample containing said microorganisms into contact with glass beads functionalized with water. lysine or polylysine, under conditions making it possible to create an interaction between said microorganisms and the glass beads, and to obtain said microorganisms captured on the glass beads, in particular in which the proportion of microorganisms from the sample and captured on the glass beads is from 0.001% to 100% for the elimination of microorganisms from said sample.
  • the present invention relates to a method as described above, comprising a step of bringing a liquid or viscous sample containing said microorganisms into contact with a device comprising functionalized glass beads. with lysine or polylysine and as defined above, under conditions making it possible to create an interaction between said microorganisms and the glass beads, and to obtain said microorganisms captured on the glass beads , in particular in which the proportion of microorganisms originating from the sample and captured on the glass beads is from 0.001% to 100% for the purpose of eliminating microorganisms from said sample.
  • the present invention relates to a process as described above, in which the glass beads are functionalized with lysine or polylysine having a molecular weight of approximately 146 to approximately 14,000 Da, especially from about 146 to about 292 Da, from about 292 to about 1460 Da, from about 1460 to about 2920 Da, from about 2920 to about 4380 Da, from about 4380 to about 7 300 Da, about 7,300 to about 14,600 Da, about 14,600 to about 36,500 Da, about 36,500 to about 58,400 Da, about 58,400 to about 80,300 Da, about 80 300 Da to about 87,600 Da, from about 87,600 Da to about 116,800 Da, from about 116,800 to about 146,000 Da, and / or in which the polylysine consists of a chain of 2 to 1000 lysine units , in particular from 2 to 10, from 10 to 20, from 20 to 30, from 30 to 50, from 50 to 100, from 100 to 250, from 250 to 400, from 400 to 550
  • the glass is of the soda-lime or borosilicate type, for the capture of microorganisms for the purpose of diagnosis, or for the elimination or reduction of the load of microorganisms from liquid or viscous samples liable to contain said microorganisms.
  • the present invention relates to a process as described above, in which the lysine is L-lysine or D-lysine or a mixture of L-lysine and D-lysine, or the polylysine is a or e-poly-L-lysine or a or e-poly-D-lysine or a mixture of a or s-poly-L-lysine and a or e-poly-D-lysine, linear or branched, optionally in the form of a salt, in particular hydrobromide or hydrochloride, for the capture of microorganisms with a view to diagnosis, or with a view to eliminating or reducing the load of microorganisms d liquid or viscous samples likely to contain said microorganisms.
  • a salt in particular hydrobromide or hydrochloride
  • the present invention relates to a process as described above, in which the lysine or polylysine has a molecular weight of approximately 146 to approximately 80,300 Da, in particular of approximately 146 to approximately 292 Da , from about 292 to about 1460 Da, from about 1460 to about 2920 Da, from about 2920 to about 4380 Da, from about 4380 to about 7300 Da, from about 7300 to about 14,600 Da, from about 14,600 to about 36,500 Da, from about 36,500 to about 58,400 Da, from about 58,400 to about 80,300 Da, and / or in which the polylysine consists of a chain from 2 to 1000 lysine units, in particular from 2 to 10, from 10 to 20, from 20 to 30, from 30 to 50, from 50 to 100, from 100 to 250, from 250 to 400, from 400 to 550 lysine units,
  • the present invention relates to a method as described above, comprising glass beads functionalized with lysine or polylysine defined above, comprising a step of bringing a sample into contact. liquid or viscous containing said microorganisms, with a device as described above, under conditions making it possible to create an interaction between said microorganisms and the glass beads, and to obtain said microorganisms captured on the glass beads, in particular in which the proportion of microorganisms originating from the sample and captured on the glass beads is from 0.001% to 100% for the purpose of eliminating microorganisms from said sample.
  • the solution in question must remain in contact with the glass beads on which the microorganisms have been captured for a minimum period of 5 to 40 minutes, in particular 5 to 10, 10 to 15, 15 to 20, 20 to 30, and 30 to 40 minutes.
  • this step is carried out at a temperature which may range from 20 to 55 ° C., preferably under the optimum temperature conditions of the enzyme used.
  • this step is carried out at room temperature.
  • the present invention relates to a method as described above, in which, during the elution step, the proportion of microorganisms separated from the glass beads on which the aforesaid microorganisms had been previously captured and then recovered is from 0.001% to 100%.
  • the present invention relates to a method as described above, in which the recovery of the microorganisms is carried out with a view to a diagnosis.
  • This diagnosis can be qualitative, of the presence / absence type, or quantitative. It may or may not be specific to the type of microorganism, and may or may not differentiate living cells from dead cells.
  • the present invention relates to a method as described above, comprising:
  • the present invention relates to a method as described above, in which the elution step is carried out using an elution solution of enzymatic or chemical type.
  • the enzymatic-type elution solutions that can be used are, for example, trypsin, accumulax (ACCUMAX enzymes in Dulbecco PBS (0.2 g / L KC1, 0.2 g / L KH 2 P0 4 , 8 g / L NaCl, and 1.15 g / L Na 2 HP0 4 )).
  • accutase (Accutase enzymes in Dulbecco PBS (0.2 g / L KC1, 0.2 g / L KH 2 P0 4 , 8 g / L NaCl, and 1.15 g / L Na 2 HP0 4 ) containing 0.5 mM EDTA 4Na and 3 mg / L of Phenol Red).
  • the chemical-type elution solutions that can be used are for example: IM NaCl, EDTA 0.1 to 10%, sodium bicarbonate 1%, sodium citrate 10%, acetic acid 0.1 to 10%, methanol 0.1 to 10%, pluronic F-127 0.01 to 0.1% (poloxamer 407, nonionic three-block copolymer: Poly (ethylene glycol) -block-poly (propylene glycol) -block-poly (ethylene glycol)).
  • the present invention relates to a method as described above, in which the bringing of the sample into contact with the glass beads or the device takes place statically or in flow.
  • the term “statically” is understood to mean the fact that the contacting between the sample and the glass beads takes place in a container without there being a continuous movement of the sample and that the sample is renewed during contacting.
  • the static contacting requires that at the end of the contact time the sample is separated from the glass beads. This step can for example be carried out by sucking the liquid through a frit or by removing the liquid.
  • the step of bringing the sample containing the microorganisms into contact with glass beads is carried out over a period of 5 to 15 minutes before the aspiration is triggered and carried out using the vacuum chamber.
  • the term “in flow” is understood to mean the fact that the bringing into contact between the sample and the glass beads takes place in a container making it possible to cause the sample to flow continuously between them.
  • the present invention relates to a method as described above, in which the microorganisms are chosen from bacteria, and Fungi, in particular yeasts and fungi.
  • the present invention relates to a method as described above, in which the Fungi belong in particular to the genera Absidia, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Brettanomyces, Byssochlamys, Candida, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Cryptococcus, Debaryomyces, Emericella, Epicoccum, Eupenicillium, Eurotium, Fusarium, Galactomyces, Geotrichum, Gliocladium, Hanseniaspora, Humicola, Hyphopichia, Kluyveromyces, Lichtheimia, Lodderomyces, Meyerozyma, Monascosestora, Pucadicillomyces, Myascénomyces,
  • the present invention relates to a method as described above, in which the bacteria are Gram + or Gram bacteria.
  • the present invention relates to a method as described above, in which the bacteria belong in particular to the genera Acetobacter, Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes, Alicyclobacillus, Aquaspirillum, Asaia, Bacillus, Bifidobacterium sp., Bordetella, Brachybacterium, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Burkholderia, Buttiauxella, Campylobacter, Carnobacterium, Cellulomona, Citrobacter, Clavibacter Clostridium, Corynebacterium, Cronobacteria, Cupobriacidacteria, Enterlamocacteria, Escapeylobacteria, Enterlamackacterium, Enterlamocacteria, Elizabeth, Enteroccichacterium, Enterlamocacteria, Eskococcinacterium, Enter
  • the present invention relates to a method as described above, in which the liquid or viscous sample is chosen from:
  • a biological sample such as burin, blood, synovial fluid, lymph, tear fluid, secretions, mucous membranes, - a pharmaceutical sample, such as injectable solutions, syrups, vaccines, eye drops, ophthalmic gels,
  • a cosmetic sample such as make-up removers, products for cleaning the skin, deodorants, products intended for shaving, self-tanners, sun protection creams, solvents, shampoos, conditioners,
  • a food sample such as drinks, in particular water (still, sparkling and / or flavored), milk, fruit juices, sodas, alcoholic beverages, tea-based drinks, meats, ready meals, dairy products, egg products.
  • biological sample is understood to mean a sample originating from a body fluid or from a tissue of a human or animal body.
  • biological samples examples include urine, blood, synovial fluid, lymph, tear fluid, secretions, mucous membranes.
  • the term "pharmaceutical sample” means a sample from a pharmaceutical product containing chemical, natural or synthetic substances for human or veterinary use.
  • Examples of pharmaceutical samples which can be used are injectable solutions, syrups, vaccines, eye drops, ophthalmic gels.
  • the term “cosmetic sample” is understood to mean a sample originating from a cosmetic product containing a substance or a mixture intended to be brought into contact with the various surface parts of the human body, in view, exclusively or mainly. , to clean them, to perfume them, to modify their appearance, to protect them, to keep them in good condition or to correct body odor.
  • cosmetic samples which can be used are makeup removers, skin cleansers, deodorants, shaving products, self-tanners, sunscreen creams, solvents, shampoos, conditioners.
  • the term "food sample” means a sample from a food product which can be used as food or drink for a human or animal.
  • Examples of food samples that can be used are beverages including water (still, sparkling and / or flavored), milk, fruit juices, sodas, alcoholic beverages, tea-based beverages, meats, ready meals, dairy products, egg products.
  • Another object of the invention is a kit comprising glass beads, lysine or polylysine and optionally a device in the form of a column and elution solutions of enzymatic or chemical type, for the capture of microorganisms. with a view to diagnosis, or with a view to eliminating or reducing the load of microorganisms from liquid or viscous samples liable to contain said microorganisms.
  • Figure IA General operating principle of capture / elimination of microorganisms in flow mode
  • FIG. 1A represents the general operating principle of the capture / elimination of microorganisms in flow mode.
  • 1 represents the addition of the potentially contaminated solution
  • 2 represents the column
  • 3 represents the glass beads functionalized using lysine or polylysine
  • 4 represents the frit
  • 5 represents the solution devoid of its microorganisms at the outlet of the column
  • 6 represents an enlargement of the microorganisms immobilized in contact with the functionalized beads.
  • Figure IB General operating principle of flow mode elution
  • 1 represents the addition of the eluting solution
  • 2 represents the elution solution at the outlet of the column containing the previously immobilized microorganisms.
  • Figure 2A General operating principle for capturing / eliminating microorganisms in static mode
  • FIG. 2A represents the general principle of operation of the capture / elimination of microorganisms in static mode.
  • 1 represents the addition of the potentially contaminated solution
  • 2 represents the container
  • 3 represents the potentially contaminated solution brought into contact with the glass beads
  • 4 represents glass beads functionalized with lysine or polylysine
  • 5 represents an enlargement of the microorganisms immobilized in contact with the functionalized beads
  • 6 represents the recovery or disposal of the solution devoid of its microorganisms.
  • Figure 2B General operating principle of elution in static mode 1 represents the addition of the elution solution; 2 represents the sampling of the elution solution provided with the eluted microorganisms.
  • Example 1 General protocol for adsorption of polv-1-lvsine on glass beads
  • the poly-L-lysine solution was aspirated under vacuum before rinsing with 6 mL (6 x 1 mL) of deionized water was performed for each column.
  • the vacuum pump was set to 700 mbar of vacuum. After rinsing, the columns are functionalized and ready for use.
  • Strains of microorganisms were thawed using a cryobead in an appropriate liquid or solid medium before being placed at a temperature that allowed them to grow for the time required for their growth. Strains were subcultured at least two times at 2% in an appropriate liquid medium or by transfer to solid medium before being used for testing.
  • a small volume (500 ⁇ L to 1 mL) of solution containing a given quantity of microorganisms (20 to ⁇ 10 7 units) was introduced into a column containing 1 g of glass beads functionalized with poly-1-lysine.
  • a contact time of 5 to 15 min was applied before the suction was triggered and carried out using the vacuum chamber, the vacuum of the pump being set at 50 mbar.
  • a given volume (from 500 ⁇ L to 100 mL) of solution containing a given quantity of microorganisms (from 20 to ⁇ 10 7 units) was filtered through a column containing 1 g of glass beads functionalized with poly-1 -lysine .
  • the aspiration was triggered before the introduction of the solution and was carried out using the vacuum chamber, the vacuum of the pump was set at 50 mbar.
  • an elution solution was introduced in order to remove the microorganisms.
  • the amount of elution solution was variable but was at least 500 pL in order to cover all the beads present in the column.
  • the solution was (1) enzymatic, (2) chemical and / or (3) both applied as a mixture or successively.
  • Example 6-1 General enzymatic elution protocol
  • the enzymatic solutions were purchased ready to use, the concentration may vary (eg: Trypsin 0.05% to 2.5%).
  • the aspiration was triggered after a more or less long contact time (minimum 5 min, the longest time tested is 40 min) in order to allow time for the enzymes to act.
  • the incubation temperature applied was from room temperature to 42 ° C depending on the enzyme solution that was used. It was for example possible to make the trypsin act at room temperature or at 42 ° C (37 ° C being the optimum temperature).
  • the filtration was then carried out using the vacuum chamber, the vacuum of the pump was set at 700 mbar.
  • Example 6-2 General chemical elution protocol All chemical solutions (IM NaCl, EDTA 0.1 to 10%, sodium bicarbonate 1%, sodium citrate 10%, acetic acid 0.1 to 10%, methanol 0.1 to 10%, pluronic F-127 0.01 to 0.1%) were prepared. using deionized water and then filtered through a 0.2 ⁇ m filter. The percentages mentioned above correspond to a weight / volume ratio of water (g / 100 mL). The aspiration was triggered before introduction of the solution or after a more or less important contact time (5 minutes minimum tested). Filtration was carried out using the vacuum chamber, the vacuum of the pump being set at 700 mbar.
  • Example 6-3 General enzymatic and / or chemical elution protocol mixed or successively
  • the two types of enzymatic and chemical solutions could also be applied as a mixture (eg: Trypsin-EDTA) or successively (eg: Accumax followed by NaCl). It was necessary to respect a mandatory contact time for the enzyme solutions in order, once again, to allow the enzymes to act.
  • Example 7 General protocol for evaluating the uptake and / or elution rate
  • the evaluation of the capture or elution rate could be carried out in different ways depending on the amount of microorganisms present and the volume of solution to be analyzed.
  • Example 7-1 Evaluation of the uptake and / or elution rate by flow cytometry
  • the flow cytometry required a relatively high concentration of microorganism to obtain a reliable result ( ⁇ 10 5 CFU / mL).
  • the results in terms of uptake and elution rate were obtained as described below.
  • the permeates obtained after capture were analyzed using a cytometer to assess the number of microorganisms not captured. It was thus possible to deduce the number of microorganisms captured on the column given that the quantity of microorganisms introduced beforehand into the column is known (count carried out with a cytometer). For the elution, the number of microorganisms eluted was directly measured using the cytometer.
  • Example 7-2 Evaluation of the rate of uptake and / or elution by filtration on a membrane deposited on agar medium
  • Membrane filtration made it possible to concentrate the microorganisms. It was then possible to deposit this membrane on a medium favorable to their growth at a given temperature and for a defined time.
  • the independent filtrations of the permeates and elutes thus made it possible to calculate the uptake and elution rates in the same way as for flow cytometry. For this it was necessary to count the colonies on the membrane after the incubation time.
  • Example 7-3 Evaluation of the uptake and / or elution rate by membrane filtration for observation under a microscope
  • the membrane filtration made it possible to concentrate the microorganisms and to observe them after labeling directly under a microscope. In the same way as before, it was then necessary to count the microorganisms present on the membrane using a microscope.
  • the markers make it possible to describe the physiological state of microorganisms (living or dead) at a given time, which growth on a membrane in a Petri dish (Example 7-2) or spreading on agar medium does not allow (Example 7-2) or spreading on agar medium ( Example 7-4) for which only viable and cultivable microorganisms are observable, at least 24 hours after deposition.
  • Example 7-4 Evaluation of the uptake and / or elution rate by membrane filtration for spreading on a Petri dish
  • Another method consists of spreading all or part of the permeates and eluates on an agar medium (in a Petri dish) favorable to the growth of microorganisms. This method required a variable incubation time at a given temperature. In the same way as before, it was then necessary to count the microorganisms present on the box in order to deduce the capture and elution rates, the number of microorganisms introduced being known using the same spreading method.
  • Fes 500 pF of suspension which had passed through the column were collected in a tube and then a count was carried out by successive dilutions to tenths in physiological water 0.85% NaCl, by spreading on agar media in a Petri dish. The same microorganisms were tested at high and low concentrations.
  • Table 1 shows the number of Colony Forming Units introduced and the corresponding uptake rate.
  • Table 2 shows the number of Colony Forming Units introduced and the corresponding uptake rate.
  • Table 3 shows the number of Colony Forming Units introduced and the corresponding uptake rate.
  • a count of the mother suspension of E. coli CIP 54.8 tested was carried out by successive dilutions to tenths in physiological water 0.85% NaCl and spreading on agar media in a Petri dish.
  • 500 ⁇ L of suspension at the desired concentration were added per column and sucked as a flow through the column using the vacuum chamber (50 mbar) and pump system.
  • a count of the permeates was carried out by successive dilutions to the tenth in physiological water 0.85% NaCl and spreading on agar media in a Petri dish.
  • Table 5 shows the column and the corresponding elution rate.
  • Elution protocol 2 successive eludons with 0.05% trypsin - EDTA IX (in PBS without Calcium, without Magnesium, with Phenol Red) of 500 ⁇ L each were carried out per column.
  • the first elution was carried out respecting a contact time of 15 min at 37 ° C.
  • the following was carried out in a flow without prolonged contact time of the solution and at 50 mbar of vacuum.
  • the eluates were collected in a tube using the vacuum chamber system.
  • Table 6 shows the number of Colony Forming Units introduced and the corresponding uptake rate.
  • Table 7 shows the column, the microorganism and the corresponding elution rate.
  • Micro-organism capture / elimination protocol First, a count of the mother suspension of Staphylococcus aureus tested was carried out by successive dilutions to tenths in physiological water 0.85% NaCl, by cytometry. 500 ⁇ L of suspension at the desired concentration were added per column and sucked as a flow through the column using the vacuum chamber (50 mbar) and pump system. A count of the permeates was carried out by cytometry.
  • Table 8 shows the number of Colony Forming Units introduced and the corresponding uptake rate.
  • Table 9 shows the column, the microorganism and the corresponding elution rate.
  • Elution 1 Sodium citrate 1% - EDTA 0.1% (3.5 mL) then physiological water 0.85% NaCl (0.5 mL)
  • Elution 2 Trypsin 2.5% (0.5 mL, 30 min at room temperature)
  • the aspiration was carried out at 50 mbar of vacuum.
  • the eluates were collected in different tubes using the vacuum chamber system.
  • Table 10 shows the number of Colony Forming Units introduced and the corresponding uptake rate.
  • Table 11 shows the column, the microorganism and the corresponding elution rate.
  • 300 mg of glass beads with a diameter of 30-50 mih are distributed in 0.8 mL columns. 142.8 ⁇ L of 0.5% (w / v) poly-L-lysine (10 lysines per poly-L-lysine chain) are added to each column. A contact time of 5 min is observed between the beads and the polylysine.
  • the solution is then removed using a vacuum chamber system and a pump set to 50 mbar of vacuum. Rinsing of the column is carried out using 1 mL of molecular biology water with the same depression. The pump is then set to 700 mbar of vacuum for drying for 5 min. After this step, the poly-L-lysine functionalized glass beads are ready for use.
  • the stock suspension of Fusarium oxysporum (UBOCC-A-112042) was diluted to 10 th in physiological saline 0.85% NaCl and then enumerated by flow cytometry. 500 ⁇ L of suspension at the desired concentration were added per column and sucked as a flow through the column using the vacuum chamber (50 mbar) and pump system. A count of the permeates was carried out by cytometry.
  • Table 12 shows the number of Colony Forming Units introduced and the corresponding uptake rate.
  • Table 13 shows the column, the microorganism and the corresponding elution rate.
  • Example 16 fungus Mucor racemosus
  • Mother suspension Mucor racemosus (ATCC 42647) was diluted to 10 th in physiological saline 0.85% NaCl and then enumerated by flow cytometry. 500 ⁇ L of suspension at the desired concentration were added per column and sucked as a flow through the column using the vacuum chamber (50 mbar) and pump system. A count of the permeates was carried out by cytometry.
  • Table 14 shows the number of Colony Forming Units introduced and the corresponding uptake rate.
  • Table 15 shows the column, the microorganism and the corresponding elution rate.

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Abstract

Billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine et leur utilisation dans la captation de micro-organismes

Description

Billes de verre fonctionnalisées, leur utilisation pour capter des micro-organismes et les dispositifs correspondants.
La présente invention concerne des billes de verre fonctionnalisées, leur procédé de préparation et leur utilisation dans la captation de micro-organismes pour la mise en œuvre d’un procédé d’élimination de micro-organismes ou de diagnostic, ainsi que les dispositifs comprenant ces billes de verre fonctionnalisées permettant la mise en œuvre de ces différents procédés.
La captation de micro-organismes présente un intérêt fondamental dans de nombreux types d’industrie, tels que les industries pharmaceutique, cosmétique ou alimentaire. Elle peut notamment être utilisée pour des applications qui se découpent en deux grands domaines :
- L’élimination de micro-organismes de solutions potentiellement contaminées,
- L’analyse sous la forme d’un diagnostic permettant d’évaluer la qualité microbiologique d’une solution.
Pour éliminer des micro-organismes présents au sein de solutions potentiellement contaminées, les techniques utilisées font généralement appel au traitement thermique (Magali, WAGNER, Anne Gaëlle MELLOUET, et François ZUBER. 2016. “Traitement thermique en continu de produits pompables.”“Agroalimentaire.” Techniques de l’Ingénieur, 10 Septembre 2016) et/ou à la fdtration membranaire (Christel, CAUSSERAND, Claire ALBASI, et Hélène ROUX DE BALMANN. 2017. “Filtration membranaire (OI, NF, UF, MF) - Applications en traitement des eaux.”“Technologies de l’eau.” Techniques de l’Ingénieur, 10 Août 2017). L’inconvénient majeur du traitement thermique provient du fait que la température est susceptible d’engendrer des modifications irréversibles du produit en agissant directement sur ses constituants. Egalement, au niveau microbiologique, le traitement thermique correspond à une réduction de la charge en microorganismes et il est par exemple susceptible de réactiver des spores bactériennes. Concernant la filtration membranaire, le colmatage de la membrane est le principal problème pouvant être rencontré. Ce dernier peut être dû à la concentration en micro-organismes dans le produit autant qu’à la nature du produit et en particulier aux particules solides présentes en son sein.
L'analyse microbiologique, nécessite l’utilisation de techniques précises pour lesquelles le temps d'obtention du résultat le plus court possible est recherché. En effet, plus les résultats d’analyse sont obtenus rapidement, plus il est possible d'engager des actions correctives en cas de résultats non satisfaisants ou non acceptables. En particulier, dans le domaine médical, il est nécessaire de prévoir et diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimisé. Cependant, pour mettre en évidence la présence de microorganismes, il est nécessaire de réaliser des prélèvements suffisamment importants afin de s'assurer de récupérer une quantité minimale de microorganismes. Il faut ensuite augmenter leur concentration, les isoler et les identifier.
Une étape clé pour la plupart de ces méthodes de détection/quantification de microorganismes dans les échantillons liquides ou rendus liquides, est leur capacité à dépasser la limite de détection de la technique d’évaluation mise en œuvre. Ceci est particulièrement difficile pour les échantillons faiblement concentrés en microorganismes d’intérêt. Une étape d’enrichissement ou de concentration apparaît souvent nécessaire pour ce type d’échantillon.
Ua phase de pré-enrichissement et/ou d'enrichissement nécessite d’utiliser des milieux de culture, sélectifs ou non, qui ont pour but de promouvoir la croissance des microorganismes cibles dans les échantillons biologiques ou environnementaux, tout en limitant la croissance des flores non cibles. Ainsi, la population cible, qui est souvent présente à des niveaux bas par rapport à la flore annexe présente dans les aliments, est amplifiée. Ces étapes d’enrichissement en amont de l’analyse permettent d’accroître le nombre de microorganismes d’intérêt dans l’échantillon mais condamnent à la fois la possibilité d’une analyse rapide mais également la possibilité de quantifier la population initiale de microorganismes d’intérêt.
U’autre possibilité consiste à passer par une étape de concentration des microorganismes à partir de l’échantillon liquide ou rendu liquide.
Une des techniques les plus utilisées pour la concentration de micro-organismes à partir d’échantillons est l’utilisation d’un ou plusieurs filtres membranes de porosité variable à travers lequel le milieu liquide est filtré. Ues microorganismes contenus dans l’échantillon sont arrêtés par la membrane et donc concentrés. Une telle technique est généralement mise en œuvre pour l’analyse microbiologique d’eau de process, d’eau potable, ou de boisson.
Bien que simple d’utilisation, cette méthode de filtration sur membrane reste limitée par des facteurs provoquant le colmatage du filtre membrane tels que la turbidité élevée, ou la présence de particules dans l’échantillon. D'autres facteurs liés à la nature du filtre et à son mode de stérilisation peuvent aussi influer sur le résultat de l’analyse microbiologique pouvant gravement altérer la viabilité, la précision et la sensibilité de la méthode et conduire à des résultats erronés et faiblement reproductibles. Nous pouvons citer à titre d’exemple non exhaustif, l'inhibition de la croissance microbienne, une propagation anormale des colonies, l’existence de zones non mouillantes, la fragilité du filtre, un défaut de planéité du filtre, un faible taux de récupération. En outre, la nécessité de concentrer de grandes quantités d’échantillon afin de compenser les variations spatiales et temporelles de l’occurrence des microorganismes, augmente la probabilité de colmatage du filtre membrane.
D’autres méthodes permettent également de concentrer les micro-organismes et de les séparer des éléments constitutifs de l’échantillon. Par exemple, les méthodes d’immunocapture ou d’immunoconcentration sont largement utilisées dans de nombreuses applications. Elles mettent très souvent en œuvre des supports fonctionnalisés avec des anticorps et permettent de capturer spécifiquement ou non les microorganismes contenus dans l’échantillon. Ces méthodes sont largement utilisées pour l’analyse microbiologique de fluides humains ou d’échantillons alimentaires.
De nouvelles méthodes permettent également la capture semi-spécifique de microorganismes à l'aide de surfaces cellulaires fonctionnalisées. Elles mettent en œuvre des dérivés de lectines ou d’hydrates de carbone, des peptides et des composés mimant les peptides et sont appliquées à la capture à large spectre et / ou de liaison spécifique des micro-organismes dans l’échantillon.
En outre, les peptides antimicrobiens liés à des composés non solubles ont été utilisés pour tuer, immobiliser et détecter des microorganismes.
Par ailleurs, la polylysine est connue pour son activité antimicrobienne.
L’un des buts de l’invention est de fournir des billes de verre fonctionnalisées pouvant capter des micro-organismes dans des conditions d’utilisation simples.
Un autre but de l’invention est de fournir un procédé simple de préparation de ces billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine.
Un autre but de l’invention est de fournir un dispositif comprenant les billes de verre fonctionnalisées pour une utilisation dans la captation de micro-organismes.
Un autre but de l’invention est de fournir un procédé efficace de captation de micro-organismes pour une utilisation en élimination de micro-organismes ou en diagnostic.
Un premier objet de la présente invention est une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface.
Au sens de la présente invention, on entend par « bille de verre » un élément de forme sphérique composé de verre.
Au sens de la présente invention, on entend par « lysine » l’acide aminé représenté par la formule ci- dessous.
Au sens de la présente invention, on entend par « polylysine » un polymère de la lysine.
Au sens de la présente invention, on entend par « adsorbé » le fait que les molécules de lysine ou de polylysine soit fixées à la surface des billes de verre par des liaisons faibles de type Van der Waals sans modifier la structure moléculaire du verre ou de la lysine ou polylysine.
Le procédé de fonctionnalisation des billes utilisé dans cette invention consiste à adsorber un polycation sur une surface négative telle que le verre. Le procédé d’adsorption présente l’avantage d’être facile à mettre en œuvre. Ce dernier ne nécessite pas de matériel ou d’appareil particulier contrairement à la mise en œuvre d’une liaison covalente entre la polylysine et les billes de verre.
Ainsi, l’invention constitue une solution non spécifique de captation/élimination de micro-organismes dans un produit sans pour autant l’altérer puis, dans un objectif de diagnostic, de proposer une solution d’élution permettant le relargage de la totalité des microorganismes retenus sur la colonne et garantissant la viabilité cellulaire. Seules ces deux conditions permettront d’apporter une quantification précise des microorganismes vivants contenus dans l’échantillon analysé.
Dans ce contexte, la présente invention s’appuie sur l’utilisation de la lysine ou de son polymère la polylysine. La polylysine est un polymère cationique qui améliore l'adhésion cellulaire et l'absorption des protéines ou encore des acides nucléiques en modifiant les charges de surface des matériaux sur lesquelles elle est appliquée, par exemple certains plastiques comme le polystyrène ou encore le verre.
Les traitements de surface en polylysine permettent de nombreuses applications parmi lesquelles l'adhésion et l'étalement de diverses lignées cellulaires, la différenciation cellulaire et l'excroissance de neurites, l'adhésion des lignées de cellules transfectées et la survie de neurones primaires dans la culture.
L’invention présente de nombreux avantages par rapport aux techniques de l’art antérieur. Elle permet tout d’abord d’éviter l’utilisation du traitement thermique pour éliminer les micro-organismes de solutions potentiellement contaminées et ainsi de préserver toutes les qualités originelles du produit sans engendrer de modifications sur ses constituants. L’invention permet également d’éviter d’utiliser la filtration membranaire et ses inconvénients liés entre autres au colmatage. Ainsi, l’invention permet d’éliminer les microorganismes contenus dans des échantillons liquides ou rendus liquides de volume important, échantillons pouvant être de natures différentes et posséder par exemple une turbidité élevée ou des particules ou des sédiments en son sein.
En ce qui concerne l'analyse microbiologique, la présente invention concerne notamment un procédé pour capturer et concentrer au moins un microorganisme susceptible d'être présent dans un échantillon en vue de le détecter, le quantifier ou d’en évaluer la viabilité. Ainsi, grâce à l’invention, un très faible nombre de microorganismes est détectable ce qui permet d’éviter de réaliser un enrichissement et ainsi de réduire considérablement le temps d’analyse mais également de pouvoir quantifier la population cible initiale. De même, l’invention résout les problèmes de mortalité pouvant être induites par l’utilisation de la polylysine dans le cadre d’un diagnostic et permet de maintenir le microorganisme dans son état physiologique initial (mort ou vivant). Le microorganisme pouvant être ici une bactérie, un Fungi (par exemple une levure ou une moisissure) ou un virus. Ce procédé est particulièrement applicable aux microorganismes contenus dans les milieux complexes. Ces milieux correspondant à des échantillons biologiques peuvent être d’origine humaine, alimentaire, cosmétique, vétérinaire ou pharmaceutique.
L’un des avantages majeurs de la présente invention réside dans le fait que le produit ne subit aucune modification au contact des billes de verre fonctionnalisées et que celle-ci permet également de s’affranchir des problèmes de colmatage.
Un autre avantage majeur de la présente invention est la possibilité d’utiliser le dispositif de captation de micro-organismes en flux continu, sans étapes d’enrichissement et ce même si la quantité de microorganismes est faible.
Il est ainsi possible d’intégrer ce dispositif à une unité industrielle de production sur laquelle une étape d’élimination de micro-organismes serait nécessaire, et ce sans interrompre la chaîne de production. Par conséquent, cette invention permet un gain de temps considérable par rapport aux méthodes impliquant une étape d’enrichissement.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre fonctionnalisée par de la poly lysine adsorbée à sa surface.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus ayant un diamètre d’environ 20 à environ 1000 pm, notamment d’environ 20 à 30 pm, d’environ 30 à 40 pm, d’environ 40 à 50 pm, d’environ 50 à 75 pm, d’environ 75 à 100 pm, d’environ 100 à 200 pm, d’environ 200 à 300 pm, d’environ 300 à 400 pm, d’environ 400 à 500 pm, d’environ 500 à 600 pm, d’environ 600 à 700 pm, d’environ 700 à 800 pm, d’environ 800 à 900 pm, d’environ 900 à 1000 pm.
Si la taille des billes de verre est inférieure à 20 pm, les billes passent à travers le fritté sensé les retenir. En revanche, pour des billes de taille supérieure à 1000 pm les taux de captation obtenus sont faibles. La diminution de la taille des billes combinée à un nombre de billes plus important permet d’avoir une surface de contact plus élevée.
Par ailleurs, plus la taille des billes est élevée, plus le nombre de billes doit être important pour conserver un taux de captation constant.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus, dans laquelle le verre est de type sodocalcique ou borosilicaté.
Le type de verre utilisé pour la présente invention, notamment le verre sodocalcique, présente un avantage en termes de coût qui est peu élevé.
Au sens de la présente invention, on entend par « verre de type sodocalcique », un verre à base de silice (Si02), de calcium et de sodium.
Au sens de la présente invention, on entend par « verre de type borosilicaté », un verre à base de silice (Si02), et de trioxyde de bore (B203).
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus ayant une masse d’environ 10 ng à environ 2 mg notamment d’environ 10 à 50 ng, d’environ 50 à 100 ng, d’environ 100 à 200 ng, d’environ 200 à 500 ng, d’environ 500 ng à 1 pg, d’environ 1 à 5 pg, d’environ 5 à 10 pg, d’environ 10 à 20 pg, d’environ 20 à 50 pg, d’environ 50 à 100 pg, d’environ 100 à 200 pg, d’environ 200 à 500 pg, d’environ 500 pg à 1 mg, d’environ 1 à 1,5 mg, d’environ 1,5 à 2 mg.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus, dans laquelle la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d’environ 146 à environ 146000 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1460 Da, d’environ 1460 à environ 2920 Da, d’environ 2920 à environ 4380 Da, d’environ 4380 à environ 7300 Da, d’environ 7300 à environ 14600 Da, d’environ 14600 à environ 36500 Da, d’environ 36500 à environ 58400 Da, d’environ 58400 à environ 80 300 Da, d’environ 80 300 Da à environ 87 600 Da, d’environ 87 600 Da à environl 16800 Da, d’environ 116800 à environ 146000 Da.
La taille de la polylysine peut être comprise de 292 à environ 146000 Da. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus, dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 1000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550, de 550 à 600, de 600 à 800, de 800 à 1000 unités lysine.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine dans laquelle la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d’environ 146 à environ 80 300 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1460 Da, d’environ 1460 à environ 2920 Da, d’environ 2920 à environ 4380 Da, d’environ 4380 à environ 7300 Da, d’environ 7300 à environ 14600 Da, d’environ 14600 à environ 36500 Da, d’environ 36500 à environ 58400 Da, d’environ 58400 à environ 80 300 Da.
La taille de la polylysine peut être comprise de 292 à environ 80 300 Da.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 550 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550 unités lysine.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre telle que décrite ci-dessus, dans laquelle la lysine est de la L-lysine ou de la D-lysine ou un mélange de L-lysine et de D-lysine, ou la polylysine est de type a ou e-poly-L-lysine ou de type a ou e-poly-D-lysine ou un mélange de a ou e-poly-L-lysine et a ou e-poly-D-lysine, linéaire ou ramifiée, éventuellement sous forme d’un sel, notamment hydrobromure ou hydrochlorure.
Au sens de la présente invention, on entend par « L-lysine » et « D-lysine » les énantiomères représentés par les formules ci-dessous.
Au sens de la présente invention, on entend par « a ou e-poly-L-lysine » et « a ou e-poly-D-lysine » les polymères représentés par les formules ci-dessous.
Au sens de la présente invention, on entend par « linéaire » un polymère dans lequel l’enchainement des motifs monomères se fait de façon linéaire.
Au sens de la présente invention, on entend par « ramifié » un polymère dans lequel l’enchainement des motifs monomères présente des ramifications.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une bille de verre ayant un diamètre d’environ 20 à environ 1000 pm, et une masse d’environ 10 ng à environ 2 mg, dans laquelle le verre est de type sodocalcique ou borosilicaté, fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface, dans laquelle la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d’environ 146 à environ 146000 Da, est de la L-lysine ou de la D-lysine ou un mélange de L-lysine et de D-lysine, ou la a ou s-poly-L-lysine ou de la a ou s -poly-D -lysine ou un mélange de a ou e-poly-L-lysine et a ou s-poly-D-lysine, linéaire ou ramifiée, éventuellement sous forme d’un sel, notamment hydrobromure ou hydrochlorure.
Un second objet de l’invention est un procédé de préparation d’une bille de verre telle que décrite précédemment comprenant une étape de mise en contact de la lysine ou de la polylysine avec une bille de verre pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface.
L’adsorption consiste à mettre en contact la polylysine à une concentration comprise de 0.1% à 2% avec la surface de verre pendant une durée moyenne d’une dizaine de minutes. Il a été démontré qu’un temps plus court permettait également l’adsorption de la polylysine. Avec ou sans rinçage, le procédé permet de capter de façon efficace les microorganismes. Un rinçage à l’eau permet néanmoins d’éliminer la polylysine excédentaire, de diminuer la mortalité induite et d’améliorer une éventuelle élution.
Un séchage est ensuite réalisé à l’air libre ou accéléré à l’aide d’un système de chambre sous vide, ou par lyophilisation. Ue temps de séchage peut ainsi être réduit à une dizaine de minutes. Des expérimentations ont par ailleurs démontré que lorsque qu’il n’y a pas de séchage de la colonne mais une conservation en condition immergée (dans de l’eau, après que la PLL ait été éliminée et qu’un rinçage ait été réalisé), la captation est conservée.
A l’issue de ces différentes étapes, les billes sont fonctionnalisées et prêtes à l’emploi.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus comprenant une étape de mise en contact de la lysine ou de la polylysine avec une bille de verre pendant une durée de 1 minute à 24 heures, notamment de 1 à 5 minutes, de 5 à 10 minutes, de 10 à 15 minutes, de 15 à 20 minutes, de 20 à 25 minutes, de 25 à 30 minutes, de 30 minutes à 1 heure, de 1 à 2 heures, de 2 à 5 heures, de 5 à 10 heures, de 10 à 24 heures, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée.
Selon un mode de réalisation encore plus particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus comprenant une étape de mise en contact de la lysine ou de la polylysine avec une bille de verre pendant une durée de 10 minutes, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus comprenant une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, notamment de 1 à 5 minutes, de 5 à 10 minutes, de 10 à 15 minutes, de 15 à 20 minutes, de 20 à 25 minutes, de 25 à 30 minutes, de 30 minutes à 1 heure, de 1 à 2 heures, de 2 à 5 heures, de 5 à 12 heures, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée.
Selon un autre mode de réalisation encore plus particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus comprenant une étape de séchage pour une durée de 10 minutes, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée.
Le temps de séchage de 10 min correspond à la durée de l’étape de séchage lorsque ce dernier est accéléré à l’aide d’un système de chambre sous vide avec la dépression réglée sur son maximum (-900 mbar au manomètre avant ouverture de la vanne).
Lorsque le séchage est réalisé à l’air libre, le temps de séchage est plus long et peut atteindre 12 heures.
Au sens de la présente invention, on entend par « séchage » une méthode de séchage à l’air libre ou accéléré à l’aide d’un système de chambre sous vide, ou par lyophilisation. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus dans lequel l’étape de séchage est effectuée à l’air libre ou accéléré à l’aide d’un système de chambre sous vide, ou par lyophilisation, notamment à une température allant de la température ambiante à 60°C, notamment de la température ambiante à 30°C, de 30°C à 40°C, de 40°C à 50°C et de 50°C à 60°C.
Au sens de la présente invention, on entend par « température ambiante », une température allant d’environ 20°C à environ 25°C.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus comprenant une étape de rinçage avec une solution aqueuse, notamment de l’eau, préalable à l’étape de séchage, pour éliminer la polylysine non adsorbée lors de l’étape de mise en contact.
Au sens de la présente invention, on entend par « solution aqueuse » une phase liquide contenant de l’eau. Des exemples de solution aqueuses pouvant être utilisées sont l’eau, des solutions aqueuses de NaCl 150 mM, NaCl 200 mM et HCl 0.01N.
L’objectif pendant le rinçage peut être de diminuer le pH à l’aide d’une solution acide afin de maximiser les charges positives à la surface de la polylysine, il est possible dans ce cas d’utiliser des acides tels que l’acide citrique ou l’acide acétique.
Un troisième objet de l’invention est un dispositif comprenant un récipient contenant des billes de verre telles que décrites ci-dessus.
Ce dispositif peut être utilisé en statique ou en flux.
Le mode statique permet d’augmenter le temps de contact entre les billes de verre fonctionnalisées par la lysine ou la polylysine et le liquide contaminé et donc de maximiser la probabilité de rencontre entre les billes et les microorganismes. Cette probabilité de rencontre peut être encore améliorée en procédant à une agitation manuelle ou mécanique. L’inconvénient de cette technique concerne les grands volumes de solution à analyser ou à débactériser (100 mL, 250 mL) puisqu’ils nécessitent une quantité importante de billes, et par conséquent un coup plus élevé que pour la méthode en flux.
En effet, pour la méthode en flux, il est possible de faire passer de grands volumes dans un espace réduit pour forcer, en quelque sorte, les microorganismes à rencontrer la polylysine adsorbé des billes (la quantité de billes utilisées pouvant-être de lg). Ainsi, si on souhaite obtenir un coût réduit par analyse, on peut utiliser la méthode statique pour de petits volumes mais pas pour de grands volumes. Au sens de la présente invention, on entend par « récipient » un objet destiné à recevoir les billes de verre.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci- dessus dans lequel le récipient est sous forme d’un tube, d’un flacon, d’un bêcher ou d’un pot.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci- dessus, dans lequel le contenant est sous forme de colonne comprenant de façon optionnelle un fritté.
Au sens de la présente invention, lorsque la colonne comprend un fritté, la colonne et le fritté peuvent être deux éléments d’un même ensemble, ou deux éléments séparés pouvant être assemblés.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci- dessus, dans lequel la colonne a un volume d’environ 0,5 mL à environ 1 L, notamment d’environ 0,1 mL à 1 mL, d’environ 1 mL à 2 ml, d’environ 2 mL à 5 mL, d’environ 5 mL à 10 mL, d’environ 10 mL à 50 mL, d’environ 50 mL à 100 mL, d’environ 100 mL à 200 mL, d’environ 200 mL à 500 mL, d’environ 500 mL à 1 L, et le fritté a une porosité inférieure à la taille des billes de verre utilisées.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci- dessus, dans lequel la masse totale des billes de verre est d’environ 10 mg à environ 1 kg, notamment d’environ 10 à 50 mg, d’environ 50 à 100 mg, d’environ 100 à 200 mg, d’environ 200 à 500 mg, d’environ 500 mg à 1 g, d’environ 1 à 2 g, d’environ 2 à 5 g, d’environ 5 à 10 g, d’environ 10 à 50 g, d’environ 50 à 100 g, d’environ 100 à 200 g, d’environ 200 à 500 g, d’environ 500 g à 1 kg.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci- dessus, comprenant un récipient contenant des billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface, ledit récipient étant notamment sous forme de colonne comprenant de façon optionnelle un fritté, ladite colonne ayant notamment un volume d’environ 0,5 mL à environ 1 L, et ledit fritté ayant notamment une porosité inférieure à la taille des billes de verre utilisées.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci- dessus, dans lequel la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d’environ 146 à environ 146 000 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1460 Da, d’environ 1460 à environ 2 920 Da, d’environ 2920 à environ 4 380 Da, d’environ 4380 à environ 7 300 Da, d’environ 7 300 à environ 14 600 Da, d’environ 14 600 à environ 36 500 Da, d’environ 36 500 à environ 58 400 Da, d’environ 58 400 à environ 80 300 Da, d’environ 80 300 Da à environ 87 600 Da, d’environ 87 600 Da à environ 116 800 Da, d’environ 116 800 à environ 146 000 Da, et/ou dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 1000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550, de 550 à 600, de 600 à 800, de 800 à 1000 unités lysine.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci- dessus, dans lequel la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d’environ 146 à environ 80 300 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1460 Da, d’environ 1460 à environ 2 920 Da, d’environ 2 920 à environ 4380 Da, d’environ 4 380 à environ 7 300 Da, d’environ 7 300 à environ 14 600 Da, d’environ 14 600 à environ 36 500 Da, d’environ 36 500 à environ 58 400 Da, d’environ 58 400 à environ 80 300 Da, et/ou dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 1 000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550 unités lysine.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci- dessus, comprenant des billes de verre ayant un diamètre d’environ 20 à environ 1000 pm, et/ou ayant une masse d’environ 10 ng à environ 2 mg, et/ou dans laquelle le verre est de type sodocalcique ou borosilicaté.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci- dessus, dans lequel la lysine est de la L-lysine ou de la D-lysine ou un mélange de L-lysine et de D- lysine, ou la polylysine est de la a ou e-poly-L-lysine ou de la a ou e-poly-D-lysine ou un mélange de a ou s-poly-L-lysine et a ou e-poly-D-lysine, linéaire ou ramifiée, éventuellement sous forme d’un sel, notamment hydrobromure ou hydrochlorure.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci- dessus, comprenant un récipient contenant des billes de verre telles que décrites ci-dessus, ledit récipient étant notamment sous forme de colonne comprenant de façon optionnelle un fritté, ladite colonne ayant notamment un volume d’environ 0,5 mL à environ 1 L, et ledit fritté ayant notamment une porosité inférieure à la taille des billes de verre utilisées.
L’une des premières applications du procédé est l’élimination de micro-organismes : grâce à la captation, l’échantillon est dépiété des microorganismes initialement présents.
Une seconde application envisagée est le diagnostic : la captation est alors utilisée comme un moyen pour concentrer les microorganismes en vue d’un diagnostic. Ce dernier peut être qualitatif, de type présence/absence, ou quantitatif. Il peut être spécifique ou non du type de microorganisme, et différencier ou non les cellules vivantes des cellules mortes. L’analyse des microorganismes captés peut se faire directement après captation sur billes. Ces tests peuvent être par exemple basés sur la détection de la cellule entière ou de la détection/quantification d’un de ses constituants (ADN, ARN, ATP, enzymes et leurs activités ou plus largement les protéines...). Pour ce faire, il est possible d’éluer les microorganismes ou bien de les lyser. Ensuite, une multitude de techniques sont utilisables, parmi lesquelles la cytométrie en flux ou en phase solide, la colorimétrie, la spectroscopie, la microscopie, l’ATPmétrie (ATP : Adénosine triphosphate), la PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase), la RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse), l’amplification isothermale ou encore la détection immunologique.
Un quatrième objet de l’invention est une utilisation de billes de verre telles que décrites ci-dessus ou d’un dispositif tel que décrit ci-dessus, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic.
Au sens de la présente invention nous entendons par « microorganisme » tout organisme microscopique procaryote ou eucaryote tel que les bactéries, les levures, les champignons et les virus. Ces microorganismes peuvent être vivants ou morts. Ils sont composés d’ADN, d’une membrane plasmique et de différents organites cellulaires. Les hématies, présentant une membrane plasmique, sont exclues de cette définition.
Au sens de la présente invention, on entend par « diagnostic » la détection des micro-organismes captés.
Des exemples de techniques de diagnostic pouvant être utilisées sont notamment la cytométrie en flux ou en phase solide, la colorimétrie, la spectroscopie, la microscopie, l’ATPmétrie (ATP : Adénosine triphosphate), la PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase), la RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse), l’amplification isothermale, ou la détection immunologique.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une utilisation telle que décrite ci-dessus, pour la captation de micro-organismes en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes. Au sens de la présente invention, on entend par « élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes » l’action de diminuer la quantité de micro-organismes présents dans un échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une utilisation de billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à leur surface, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro organismes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une utilisation telle que décrite ci-dessus d’un dispositif comprenant des billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine et tel que défini ci-dessus, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une utilisation que décrite ci- dessus, dans laquelle la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d’environ 146 à environ 146 000 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1460 Da, d’environ 1460 à environ 2920 Da, d’environ 2920 à environ 4380 Da, d’environ 4380 à environ 7300 Da, d’environ 7300 à environ 14 600 Da, d’environ 14 600 à environ 36 500 Da, d’environ 36 500 à environ 58 400 Da, d’environ 58 400 à environ 80 300 Da, d’environ 80 300 Da à environ 87 600 Da, d’environ 87 600 Da à environ 116 800 Da, d’environ 116 800 à environ 146 000 Da, et/ou dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 1000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550, de 550 à 600, de 600 à 800, de 800 à 1000 unités lysine,
pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une utilisation que décrite ci- dessus, dans laquelle la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d’environ 146 à environ 80 300 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1460 Da, d’environ 1460 à environ 2920 Da, d’environ 2920 à environ 4380 Da, d’environ 4380 à environ 7300 Da, d’environ 7300 à environ 14600 Da, d’environ 14600 à environ 36500 Da, d’environ 36500 à environ 58400 Da, d’environ 58400 à environ 80 300 Da, et/ou dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 1000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550 unités lysine,
pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une utilisation que décrite ci- dessus de billes de verre telles que décrites ci-dessus, lesdites billes de verre ayant un diamètre d’environ 20 à environ 1000 pm, et/ou ayant une masse d’environ 10 ng à environ 2 mg, et/ou dans laquelle le verre est de type sodocalcique ou borosilicaté, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une utilisation que décrite ci- dessus de billes de verre telles que décrites ci-dessus, dans laquelle la lysine est de la L-lysine ou de la D-lysine ou un mélange de L-lysine et de D-lysine, ou la polylysine est de la a ou e-poly-L-lysine ou de la a ou e-poly-D-lysine ou un mélange de a ou e-poly-L-lysine et a ou e-poly-D-lysine, linéaire ou ramifiée, éventuellement sous forme d’un sel, notamment hydrobromure ou hydrochlorure, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une utilisation que décrite ci- dessus dans laquelle lesdites billes de verre sont définies ci-dessus, pour la captation de micro organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro organismes.
Un autre objet de l’invention est un procédé de captation de micro-organismes comprenant une étape de mise en contact d’un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec des billes de verre telles que décrites ci-dessus ou d’un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans des conditions permettant de créer une interaction entre les dits micro-organismes et les billes de verre, et d’obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de réchantillon et captés sur les billes de verre est comprise de 0,001% à 100% en vue de rélimination de micro-organismes dudit échantillon. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, comportant une étape supplémentaire d’élution des micro-organismes précédemment captés dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des susdites billes de verre et la récupération des dits micro-organismes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, comprenant une étape de mise en contact d’un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec des billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine, dans des conditions permettant de créer une interaction entre lesdits micro-organismes et les billes de verre, et d’obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre, notamment dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de l’échantillon et captés sur les billes de verre est comprise de 0.001% à 100% en vue de l’élimination de micro-organismes dudit échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, comprenant une étape de mise en contact d’un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec un dispositif comprenant des billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine et tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant de créer une interaction entre lesdits micro-organismes et les billes de verre, et d’obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre, notamment dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de l’échantillon et captés sur les billes de verre est comprise de 0.001% à 100% en vue de l’élimination de micro-organismes dudit échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel les billes de verre sont fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine ayant un poids moléculaire d’environ 146 à environ 14 6000 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1 460 Da, d’environ 1 460 à environ 2 920 Da, d’environ 2 920 à environ 4 380 Da, d’environ 4 380 à environ 7 300 Da, d’environ 7 300 à environ 14600 Da, d’environ 14 600 à environ 36 500 Da, d’environ 36 500 à environ 58 400 Da, d’environ 58 400 à environ 80 300 Da, d’environ 80 300 Da à environ 87 600 Da, d’environ 87 600 Da à environ 116 800 Da, d’environ 116 800 à environ 146 000 Da, et/ou dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 1000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550, de 550 à 600, de 600 à 800, de 800 à 1000 unités lysine, Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, lesdites billes de verre ayant un diamètre d’environ 20 à environ 1000 pm, et/ou ayant une masse d’environ 10 ng à environ 2 mg, et/ou dans laquelle le verre est de type sodocalcique ou borosilicaté, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel la lysine est de la L-lysine ou de la D-lysine ou un mélange de L-lysine et de D- lysine, ou la polylysine est de la a ou e-poly-L-lysine ou de la a ou e-poly-D-lysine ou un mélange de a ou s-poly-L-lysine et a ou e-poly-D-lysine, linéaire ou ramifiée, éventuellement sous forme d’un sel, notamment hydrobromure ou hydrochlorure, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d’environ 146 à environ 80 300 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1460 Da, d’environ 1 460 à environ 2 920 Da, d’environ 2 920 à environ 4 380 Da, d’environ 4 380 à environ 7 300 Da, d’environ 7 300 à environ 14 600 Da, d’environ 14 600 à environ 36 500 Da, d’environ 36 500 à environ 58 400 Da, d’environ 58 400 à environ 80 300 Da, et/ou dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 1000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550 unités lysine,
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, comprenant des billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine définies ci- dessus, comprenant une étape de mise en contact d’un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans des conditions permettant de créer une interaction entre lesdits micro-organismes et les billes de verre, et d’obtenir les dits micro organismes captés sur les billes de verre, notamment dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de l’échantillon et captés sur les billes de verre est comprise de 0.001% à 100% en vue de l’élimination de micro-organismes dudit échantillon.
Dans le cas de l’élution avec une solution enzymatique, la solution en question doit rester en contact avec les billes de verres sur lesquelles ont été captées les micro-organismes pour une durée minimum de 5 à 40 minutes, notamment de 5 à 10, de 10 à 15, de 15 à 20, de 20 à 30, et de 30 à 40 minutes. Dans le cas d’une élution avec une solution enzymatique, cette étape est réalisée à une température pouvant aller de 20 à 55°C, préférentiellement dans les conditions optimales de température de l’enzyme utilisée.
Dans le cas d’une élution avec une solution chimique, cette étape est réalisée à température ambiante.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel lors de l’étape d’élution la proportion des micro-organismes séparés des billes de verre sur lesquelles les susdits micro-organismes avaient été précédemment captés, puis récupérés est comprise de 0.001% à 100%.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel la récupération des micro-organismes est effectuée en vue d’un diagnostic.
Ce diagnostic peut être qualitatif, de type présence/absence, ou quantitatif. Il peut être spécifique ou non du type de microorganisme, et différencier ou non les cellules vivantes des cellules mortes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit précédemment, comprenant :
- une étape de mise en contact de la lysine ou de la polylysine avec une bille de verre pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface,
- une étape de mise en contact d’un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro organismes, avec des billes de verre telles que décrites précédemment ou d’un dispositif tel que décrit précédemment, dans des conditions permettant de créer une interaction entre les dits micro-organismes et les billes de verre, et d’obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre,
- une étape supplémentaire d’élution des micro-organismes précédemment captés dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des susdites billes de verre et la récupération des dits micro-organismes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel l’étape d’élution est réalisée en utilisant une solution d’élution de type enzymatique ou chimique. Au sens de la présente invention, les solutions d’élution de type enzymatique pouvant être utilisées sont par exemples la trypsine, l’accumax (enzymes ACCUMAX dans du PBS Dulbecco (0.2 g/L KC1, 0.2 g/L KH2P04, 8 g/L NaCl, et 1.15 g/L Na2HP04)). l’accutase (enzymes Accutase dans du PBS Dulbecco (0.2 g/L KC1, 0.2 g/L KH2P04, 8 g/L NaCl, and 1.15 g/L Na2HP04) contenant 0.5 mM EDTA · 4Na et 3 mg/L de Phénol Red).
Au sens de la présente invention, les solutions d’élution de type chimique pouvant être utilisées sont par exemples : NaCl IM, EDTA 0.1 à 10%, bicarbonate de soude 1%, citrate de sodium 10%, acide acétique 0.1 à 10%, méthanol 0.1 à 10%, pluronic F-127 0.01 à 0.1% (poloxamère 407, copolymère non-ioniques à trois blocs : Poly(éthylène glycol)-block-poly(propylène glycol)-block-poly(éthylène glycol)).
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel la mise en contact de réchantillon avec les billes de verre ou le dispositif a lieu de façon statique ou en flux.
Au sens de la présente invention, on entend par « de façon statique », le fait que la mise en contact entre réchantillon et les billes de verre ait lieu dans un récipient sans qu’il y ait un mouvement continu de réchantillon et que l’échantillon ne soit renouvelé au cours de la mise en contact. La mise en contact de façon statique nécessite qu’à la fin du temps de contact l’échantillon soit séparé des billes de verre. Cette étape peut par exemple se réaliser par aspiration du liquide à travers un fritté ou par prélèvement du liquide.
Lorsque le procédé de captation est réalisé en statique, l’étape de mise en contact de l’échantillon contenant les micro-organismes avec des billes de verre est réalisée sur une durée de 5 à 15 minutes avant que l’aspiration ne soit déclenchée et réalisée à l’aide de la chambre à vide.
Au sens de la présente invention, on entend par « en flux », le fait que la mise en contact entre l’échantillon et les billes de verre ait lieu dans un récipient permettant de faire s’écouler de façon continue l’échantillon entre les billes de verre,
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel les micro-organismes sont choisis parmi les bactéries, et les Fungi, notamment les levures et les champignons. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel les Fungi appartiennent notamment aux genres Absidia, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Brettanomyces, Byssochlamys, Candida, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Cryptococcus, Debaryomyces, Emericella, Epicoccum, Eupenicillium, Eurotium, Fusarium, Galactomyces, Geotrichum, Gliocladium, Hanseniaspora, Humicola, Hyphopichia, Kluyveromyces, Lichtheimia, Lodderomyces, Meyerozyma, Monascus, Mucor, Mycocladus, Neosartorya, Nigrospora, Paecilomyces, Pénicillium, Pestalotia, Phoma, Phytophthora, Pichia, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Sclerotinia, Scopulariopsis, Serpula, Stemphylium Talaromyces, Thielaviopsis, Torulaspora, Trichoderma, Trichosporon, Trichothetium, Ulocladium, Verticillium, Wallemia, Wickerhamomyces, Xylaria, Zygosaccharomyces.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel les bactéries sont des bactéries Gram + ou Gram
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel les bactéries appartiennent notamment aux genres Acetobacter, Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes, Alicyclobacillus, Aquaspirillum, Asaia, Bacillus, Bifidobacterium sp., Bordetella, Brachybacterium, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Burkholderia, Buttiauxella, Campylobacter, Carnobacterium, Cellulomona, Citrobacter, Clavibacter Clostridium, Corynebacterium, Cronobacte, Cupriavidu, Curtobacterium, Elizabethkingia, Enteractinococcus, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Flacklamia, Flavobacterium, Geobacillus, Glutamicibacte, Halobacillus, Klebsiella, Kocuria, Lactobacillus, Lactococcus, Leclercia, Lelliottia, Leuconostoc, Lysinibacillus, Macrococcus, Methylobacteriu, Microbacterium spp. (CDC A-5), Micrococcus, Moraxell, Mycobacterium, Nesterenkonia, Oceanobacillus sp, Ochrobactrum, Paenibacillus, Pandorae, Pantoea, Paracoccus, Pasteurell, Pediococcus, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Roseomona, Rothia, Salmonella, Sanguibacter, Serratia, Shewanella, Sphingomonas, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Thermoanaerobacterium, Variovorax, Virgibacillus.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci- dessus, dans lequel l’échantillon liquide ou visqueux est choisi parmi :
- un échantillon biologique, tel que burine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses, - un échantillon pharmaceutique, tel que les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques,
- un échantillon cosmétique, tel que les démaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings,
- un échantillon alimentaire, tel que les boissons, notamment l’eau (plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, les sodas, les boissons alcoolisées, les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits laitiers, les ovoproduits.
Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon biologique », un échantillon provenant d’un liquide corporel ou d’un tissu d’un corps humain ou animal.
Des exemples d’échantillons biologiques pouvant être utilisées sont l’urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses.
Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon pharmaceutique », un échantillon provenant d’un produit pharmaceutique contenant des substances chimiques, naturelles ou synthétiques à usage humain ou vétérinaire.
Des exemples d’échantillons pharmaceutiques pouvant être utilisées sont les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques.
Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon cosmétique », un échantillon provenant d’un produit cosmétique contenant une substance ou un mélange destiné à être mise en contact avec les diverses parties superficielles du corps humain, en vue, exclusivement ou principalement, de les nettoyer, de les parfumer, d'en modifier l'aspect, de les protéger, de les maintenir en bon état ou de corriger les odeurs corporelles.
Des exemples d’échantillons cosmétiques pouvant être utilisées sont les démaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings.
Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon alimentaire », un échantillon provenant d’un produit alimentaire pouvant servir de nourriture ou de boisson à un être humain ou animal.
Des exemples d’échantillons alimentaires pouvant être utilisées sont les boissons, notamment l’eau (plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, les sodas, les boissons alcoolisées, les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits laitiers, les ovoproduits. Un autre objet de l’invention est un kit comprenant des billes de verre, de la lysine ou de la polylysine et optionnellement un dispositif sous forme de colonne et des solutions d’élution de type enzymatique ou chimique, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Description des figures
Figure IA : Principe général de fonctionnement de captation/élimination des microorganismes en mode flux
La Figure IA représente le principe général de fonctionnement de la captation/élimination des microorganismes en mode flux.
1 représente l’ajout de la solution potentiellement contaminée ; 2 représente la colonne ; 3 représente les billes de verre fonctionnalisées à l’aide de lysine ou polylysine ; 4 représente le fritté ; 5 représente la solution dépourvue de ses microorganismes à la sortie de la colonne ; 6 représente un grossissement des microorganismes immobilisés au contact des billes fonctionnalisées.
Figure IB : Principe général de fonctionnement de l’élution en mode flux
1 représente l’ajout de la solution d’élution ; 2 représente la solution d’élution à la sortie de la colonne contenant les microorganismes précédemment immobilisés.
Figure 2A : Principe général de fonctionnement de captation/élimination des microorganismes en mode statique
La Figure 2A représente le principe général de fonctionnement de la captation/élimination des microorganismes en mode statique.
1 représente l’ajout de la solution potentiellement contaminée ; 2 représente le contenant ; 3 représente la solution potentiellement contaminée mise en contact avec les billes de verre ; 4 représente les billes de verre fonctionnalisées à l’aide de lysine ou polylysine ; 5 représente un grossissement des microorganismes immobilisés au contact des billes fonctionnalisées ; 6 représente la récupération ou l’élimination de la solution dépourvue de ses microorganismes.
Figure 2B : Principe général de fonctionnement de l’élution en mode statique 1 représente l’ajout de la solution d’élution ; 2 représente le prélèvement de la solution d’élution pourvue des microorganismes éluées.
Exemples
Exemple 1 : Protocole général d’adsorption de la polv-1-lvsine sur les billes de verre
lg de billes de verre de diamètre 105-150 mih (réf. 15927, Polysciences Europe GmbH, Germany) a été pesé directement dans des colonnes de fdtration de 2.4 mL en polypropylène munies d’un fritté en PEHD de porosité 45-90 pm (réf. 208-3049-03S, Evergreen Scientific, USA). L’ensemble a été placé sur une plaque adaptée pour pouvoir placer 24 colonnes simultanément (NucleoVac Adapter Plate, réf.740694, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany) qui s’intégre à une chambre à vide NucleoVac96 (réf. 740681, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany). Le tout a été relié à une pompe à vide KNF type N816.1.2KN.45.18 (KNF Neuberger SAS, France). Pour réaliser l’adsorption de la poly-L-lysine sur les billes de verre, 500 pL d’une solution de poly-L-lysine à 0.166% (Poly-L- lysine hydrobromide, réf. PLKB10, Alamanda Polymers, Inc., USA), préparée dans de l’eau de biologie moléculaire (W4502, Sigma- Aldrich, Merck KGaA, Darmstadt, Germany), ont été introduits par colonne contenant les billes de verre. La solution a été laissée en contact durant 10 min après homogénéisation à l’aide d’une pointe à fdtre. Après mise en contact, la solution de poly-L-lysine a été aspirée sous vide avant qu’un rinçage à l’aide de 6 mL (6 x 1 mL) d’eau désionisée ne soit réalisé pour chaque colonne. Pour chaque aspiration, la pompe à vide a été réglée sur 700 mbar de dépression. Après rinçage, les colonnes sont fonctionnalisées et prêtes à l’emploi.
Exemple 2 : Préparation des souches
Les souches de microorganismes ont été décongelées à l’aide d’une cryobille dans un milieu liquide ou solide approprié avant d’être placées à une température permettant leur croissance pendant le temps nécessaire à leur croissance. Les souches ont subi deux repiquages minimums à 2% dans un milieu liquide approprié ou par transfert sur milieu solide avant d’être utilisées pour les essais.
Exemple 3 : Préparation des suspensions de travail
Les suspensions fdles ont été réalisées dans de l’eau supplémentée ou non de NaCl à 0.85% par dilutions successives (habituellement au dixième). A partir des suspensions fdles réalisées, des matrices liquides (jus de fruits, sodas, eaux plates, gazeuses, aromatisées ou pas) ont été inoculées afin de contenir des microorganismes pour les essais. Pour ce faire, la dernière dilution a été réalisée dans la matrice à tester. Exemple 4 : Protocole général de captation en statique
Un faible volume (de 500 pL à 1 mL) de solution contenant une quantité donnée de microorganismes (de 20 à ~107 unités) a été introduit dans une colonne contenant lg de billes de verre fonctionnalisées par de la poly-l-lysine. Un temps de contact de 5 à 15 min a été appliqué avant que l’aspiration ne soit déclenchée et réalisée à l’aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe étant fixée sur 50 mbar.
Exemple 5 : Protocole général de captation en flux
Un volume donné (de 500 pL à 100 mL) de solution contenant une quantité donnée de microorganismes (de 20 à ~107 unités) a été fdtré à travers une colonne contenant lg de billes de verre fonctionnalisées par de la poly-1 -lysine. L’aspiration a été déclenchée avant l’introduction de la solution et a été réalisée à l’aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe a été fixée sur 50 mbar.
Exemple 6 : Protocole général d’élution
Après passage de l’échantillon d’intérêt au travers de la colonne, une solution d’élution a été introduite afin de procéder au décrochage des microorganismes. La quantité de solution d’élution a été variable mais a été au minimum de 500 pL afin de recouvrir toutes les billes présentes dans la colonne. La solution a été (1) de nature enzymatique, (2) chimique et/ou (3) des deux appliquées en mélange ou successivement.
Exemple 6-1 : Protocole général d’élution enzymatique
Les solutions enzymatiques (trypsine, accumax) ont été achetées prêtes à l’emploi, la concentration pouvant varier (ex : Trypsine 0.05% à 2.5%). L’aspiration a été déclenchée après un temps de contact plus ou moins important (minimum 5 min, la durée la plus importante ayant été testée est de 40 min) afin de laisser du temps aux enzymes d’agir. La température d’incubation appliquée a été de la température ambiante à 42°C selon la solution enzymatique qui a été utilisée. Il a par exemple été possible de faire agir la trypsine à température ambiante ou à 42°C (37°C étant la température optimale). La filtration a ensuite été réalisée à l’aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe a été fixée sur 700 mbar.
Exemple 6-2 : Protocole général d’élution chimique Toutes les solutions chimiques (NaCl IM, EDTA 0.1 à 10%, bicarbonate de soude 1%, sodium citrate 10%, acide acétique 0.1 à 10%, méthanol 0.1 à 10%, pluronic F-127 0.01 à 0.1%) ont été préparées à l’aide d’eau désionisée puis filtrée sur filtre 0.2 pm. Les pourcentages cités précédemment correspondent à un rapport poids/volume d’eau (g/100 mL). L’aspiration a été déclenchée avant introduction de la solution ou après un temps de contact plus ou moins important (5 minutes minimum testées). La filtration a été réalisée à l’aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe étant fixée sur 700 mbar.
Exemple 6-3 : Protocole général d’élution enzymatique et/ou chimique en mélange ou successivement
Les deux types de solutions enzymatique et chimique ont également pu être appliquées en mélange (ex : Trypsine-EDTA) ou successivement (ex : Accumax suivi de NaCl). Il a été nécessaire de respecter un temps de contact obligatoire pour les solutions enzymatiques afin, une nouvelle fois, de permettre aux enzymes d’agir.
Exemple 7 : Protocole générale d’évaluation du taux de captation et/ou d’élution
L’évaluation du taux de captation ou d’élution a pu être réalisée de façons différentes en fonction de la quantité de microorganismes présents et du volume de solution à analyser.
Il a par exemple été possible d’évaluer le nombre de microorganismes présents dans une solution donnée à l’aide (1) de la cytométrie en flux, (2) de la filtration sur membrane déposée sur milieu gélosé, (3) par observation au microscope ou encore (4) de l’étalement sur boite de Pétri.
Exemple 7-1 : Evaluation du taux de captation et/ou d’élution par cytométrie en flux
La cytométrie en flux a nécessité une concentration en microorganisme relativement importante pour obtenir un résultat fiable (~105 UFC/mL). Les résultats en termes de taux de captation et d’élution ont été obtenus comme décrits ci-après. Les perméats obtenus après captation ont été analysés au cytomètre pour évaluer le nombre de microorganismes non captés. Il a ainsi été possible de déduire le nombre de microorganismes captés sur la colonne étant donné que la quantité de microorganismes préalablement introduits dans la colonne est connue (dénombrement réalisé au cytomètre). Pour l’élution, le nombre de microorganismes élués a directement été mesuré à l’aide du cytomètre. A noter qu’il a été possible de marquer les microorganismes ce qui a permis à la fois de mieux discriminer les microorganismes du bruit de fond et en même temps de décrire leur état physiologique (vivants ou morts) à un instant donné. Exemple 7-2 : Evaluation du taux de captation et/ou d’élution par filtration sur membrane déposée sur milieu gélosé
La filtration sur membrane a permis, elle, de concentrer les microorganismes. Il a ensuite été possible de déposer cette membrane sur un milieu favorable à leur croissance à une température donnée et pendant un temps défini. Les filtrations indépendantes des perméats et des éluats ont permis ainsi de calculer les taux de captation et d’élution de la même manière que pour la cytométrie en flux. Pour cela, il a été nécessaire de compter les colonies sur la membrane après le temps d’incubation.
Exemple 7-3 : Evaluation du taux de captation et/ou d’élution par filtration sur membrane pour observation au microscope
La filtration sur membrane a permis de concentrer les microorganismes et de les observer après marquage directement au microscope. De la même manière que précédemment, il a ensuite été nécessaire de compter les microorganismes présents sur la membrane à l’aide d’un microscope. Pour rappel, les marqueurs permettent de décrire l’état physiologique des microorganismes (vivants ou morts) à un instant donné ce que ne permet pas la croissance sur membrane en boite de Pétri (Exemple 7-2) ou l’étalement sur milieu gélosé (Exemple 7-4) pour lesquels seuls les microorganismes viables et cultivables sont observables, et ce, au minimum 24 heures après le dépôt.
Exemple 7-4 : Evaluation du taux de captation et/ou d’élution par filtration sur membrane pour de l’étalement sur boite de Pétri
Une autre méthode consiste en l’étalement de tout ou une partie des perméats et des éluats sur un milieu gélosé (en boite de Pétri) favorable à la croissance des microorganismes. Cette méthode a nécessité un temps d’incubation variable à une température donnée. De la même manière que précédemment, il a ensuite été nécessaire de compter les microorganismes présents sur la boite afin d’en déduire les taux de captation et d’élution, le nombre de microorganismes introduits étant connu grâce à la même méthode d’étalement.
Exemple 8 :
Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
20 g de billes de verre 105-150 pm ont été ajoutés dans un contenant de 25 mL. 9 mL de poly-L-lysine (10 lysines par chaîne de poly-L-lysine) à 0.166 % (w/v) ont été ajoutés dans le contenant. Une mise en contact de 10 min a été respectée avec agitation toutes les deux minutes. Le tout a ensuite été transféré dans des colonnes munies d’un fritté de porosité 45-90 pm à hauteur de 2 g par colonne. Un rinçage a été réalisé à l’aide d’un système de chambre à vide et d’une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. 4 mL d’eau de biologie moléculaire ont été utilisées pour rincer les billes contenues dans chaque colonne afin d’éliminer l’excédent de polylysine. Un séchage des billes de verre d’une durée de 10 min a ensuite été réalisé en réglant la pompe sur 700 mbar de dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l’emploi.
Protocole de captation/élimination de micro-organismes
1 g de billes fonctionnalisées par de la polylysine a été réparti par colonne munie d’un fritté de porosité 45-90 pm. Dans un premier temps, un dénombrement des suspensions mères des microorganismes testés a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Pétri pour les concentrations testées inférieures à 105 UFC/mL (UFC : Unité Formant Colonie). Pour les concentrations testées supérieures à 105 UFC/mF, le dénombrement a été réalisé au cytomètre. 500 pL de suspension, à la concentration souhaitée, ont été ajoutés par colonne sachant que le procédé de captation a été réalisé en flux à l’aide du système de chambre à vide. Fa dépression a été réglée sur 50 mbar. Fes 500 pF de suspension ayant traversés la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé, par dilutions successives au dixième dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl, par étalements sur milieux gélosés en boite de Pétri. Fes mêmes microorganismes ont été testés à forte et faible concentrations.
Efficacité de la captation/élimination de micro-organismes
Fe tableau 1 suivant présente le nombre d’Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant.
Pourcentage de
Espèce UFC introduites
captation
S. aureus (3) 5.27E+06 99.78%
B. cereus (4) 4.14E+05 99.49%
S. enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis (5) 8.77E+06 85.25% S. marcescens (8) L55E+07 95.41%
E. coli (9) L27E+07 87.91%
B. cereus (15) 3.50E+05 99.88%
B. pumilus (19) 2.00E+06 100.00%
B. subtilis (20) 9.45E+05 100.00%
E. cloacae (25) L85E+07 76.21%
E. faecium (26) 6.41E+06 99.90%
P. mirabilis (28) 3.83E+07 97.66%
P. aeruginosa (29) L65E+07 97.78%
S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (33) L 13E+07 82.12%
C. parapsilosis (47) 3.23E+05 99.90%
C. parapsilosis (106) 3.41E+05 98.10% S. aureus (3) 527 100.00%
B. cereus (4) 41 100.00%
S. enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis (5) 877 86.51% S. marcescens (8) 1555 91.16%
E. coli (9) 1273 86.20%
B. cereus (15) 35 100.00%
B. pumilus (19) 200 100.00%
B. subtilis (20) 95 100.00%
E. cloacae (25) 1845 74.14%
E. faecium (26) 641 100.00%
P. mirabilis (28) 3832 79.37%
P. aeruginosa (29) 1655 97.69%
S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (33) 1127 80.02%
C. parapsilosis (47) 32 100.00%
C. parapsilosis (106) 34 100.00%
Tableau 1 Résultats de la captation de microorganismes
Exemple 9 E. coli :
Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
420 mg de billes de verre 30-50 pm ont été ajoutés par boite de Pétri 90 mm vide. 10 mL de poly-L- lysine (400 lysines par chaîne de poly-L-lysine) à 0.01 % (w/v) ont été ajoutés par boite de Pétri. Après homogénéisation, les boites de Pétri ont ensuite été laissées ouvertes pendant 17h sous la ventilation d’un PSM (Poste de Sécurité Microbiologique) afin de faire évaporer l’eau. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l’emploi. Tous les contenus des boites de Pétri ont été réunis dans une seule afin d’homogénéiser la production.
Protocole de captation/élimination de micro-organismes
300 g de billes fonctionnalisées à la polylysine ont été réparti par colonne munie d’un fritté de porosité de 20 pm. Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d’E. coli CIP 54.8 testée a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Pétri. La dilution au dixième devant être testée a également été réalisée en matrices (Guinness, Lait, Nestea, Oasis, jus d’orange ou jus de pomme) et dénombrée sur boite pour évaluer l’effet matrice. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne sachant que le procédé de captation a été réalisé en flux à l’aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 pL de suspension ayant traversés la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Pétri. Efficacité de la captation/élimination de micro-organismes en condition matrices
Le tableau 2 suivant présente le nombre d’Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant.
Matrice UFC introduites Pourcentage de captation
Eau physiologique 0.85% NaCl 2.39E+03 100.00%
Guinness 2.55E+03 100.00%
Lait 2.31E+03 100.00%
Nestea 2.38E+03 100.00%
Oasis 2.36E+03 100.00%
Jus d'orange 2.05E+03 100.00%
Jus de pomme 2.41E+03 100.00%
Tableau 2 Résultats de la captation d Έ. coli CIP 54.8
Exemple 10 E. Coli :
Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
312 mg de billes de verre 105-150 pm ont été ajoutés dans une boite de Pétri 90 mm vide. 2 mL de poly-D-lysine (250 lysines par chaîne de poly-D -lysine) à 0.01 % (w/v) ont été ajoutés. Après homogénéisation, la boite de Pétri a été laissée ouverte pendant 17h sous la ventilation d’un PSM (Poste de Sécurité Microbiologique) afin de faire évaporer l’eau. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l’emploi.
Protocole de captation/élimination de micro-organismes
20 et 25 mg de billes fonctionnalisées à la polylysine ont été répartis dans deux colonnes séparées munies d’un fritté de porosité de 20 pm. Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d’E. coli CIP 54.8 testée a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Pétri. 350 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne sachant que le procédé de captation est maximisé par agitation manuelle de 15 min à température ambiante. Après 15 min d’agitation, la colonne munie d’un tube collecteur a subi une centrifugation de 15 s à 1500 x g. Un dénombrement du perméat a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Pétri. Efficacité de la captation/élimination de micro-organismes en condition matrices
Le tableau 3 suivant présente le nombre d’Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation
1 (20 g) 4.33E+03 85.15%
2 (25 g) 4.33E+03 85.00%
Tableau 3 Résultats de la captation d Έ. coli CIP 54.8
Exemple 11 E. Coli :
Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 pm ont été répartis dans des colonnes de 0.8 mL. 142.8 pL de poly-L-lysine (10 lysines par chaîne de poly-L-lysine) à 0.5% (w/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et la polylysine. La solution a ensuite été éliminée à l’aide d’un système de chambre à vide et d’une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l’aide de 1 mL d’eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l’emploi.
Protocole de captation/élimination de micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d’E. coli CIP 54.8 testée a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Pétri. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Pétri.
Protocole d’élution
7 élutions successives au NaCl IM de 500 pL chacune ont été réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en flux sans temps de contact prolongé de la solution et à 50 mbar de dépression. Les éluats ont été collectés dans un tube à l’aide du système de chambre à vide.
Efficacité du couple captation/élution Le tableau 4 suivant présente le nombre d’Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant.
Colonne _ UFC introduites _ Pourcentage de captation
1 1.21E+07 99.06%
2 1.21E+07 99.23%
3 _ 1.21E+07 _ 99 21% _
Tableau 4 Résultats de la captation d Έ. coli CIP 54.8
Le tableau 5 suivant présente la colonne et le taux d’élution correspondant.
Colonne_ Pourcentage d'élution
1 89.99%
2 90.30%
_ 3 _ 92.36% _
Tableau 5 Résultats de l’élution d Έ. coli CIP 54.8
Exemple 12 Bacillus subtilis :
Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 pm ont été répartis dans des colonnes de 0.8 mL. 142.8 pL de poly-L-lysine (10 lysines par chaîne de poly-L-lysine) à 0.5% (w/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et la polylysine. La solution a ensuite été éliminée à l’aide d’un système de chambre à vide et d’une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l’aide de 1 mL d’eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l’emploi.
Protocole de captation/élimination de micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère de Bacillus subtilis ATCC 11774 testée a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl et cytométrie. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie.
Protocole d’élution 2 éludons successives à la trypsine 0.05% - EDTA IX (en PBS sans Calcium, sans Magnésium, avec Rouge de Phénol) de 500 pL chacune ont été réalisées par colonne. La première élution a été réalisée en respectant un temps de contact de 15 min à 37°C. La suivante a été réalisée en flux sans temps de contact prolongé de la solution et à 50 mbar de dépression. Les éluats ont été collectés dans un tube à l’aide du système de chambre à vide.
Efficacité du couple captation/élution
Le tableau 6 suivant présente le nombre d’Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation
B. subtilis (n=8) 9.11E+06 87.70%
Tableau 6 Résultats de la captation de Bacillus subtilis
Le tableau 7 suivant présente la colonne, le microorganisme et le taux d’élution correspondant.
Colonne Pourcentage d'élution
B. subtilis (n=l) 89.50%
Tableau 7 Résultats de la captation de Bacillus subtilis
Exemple 13 Staphylococcus aureus :
Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 pm ont été répartis dans des colonnes de 0.8 mL. 142.8 pL de poly-L-lysine (10 lysines par chaîne de poly-L-lysine) à 0.5% (w/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et la polylysine. La solution a ensuite été éliminée à l’aide d’un système de chambre à vide et d’une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l’aide de 1 mL d’eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l’emploi.
Protocole de captation/élimination de micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère de Staphylococcus aureus testée a été réalisé, par dilutions successives au dixième dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl, en cytométrie. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie.
Protocole d’élution
3 élutions successives à la trypsine 0.05% - EDTA IX (en PBS sans Calcium, sans Magnésium, avec Rouge de Phénol) de 500 pL chacune ont été réalisées par colonne. Les trois élutions ont été réalisées en respectant un temps de contact de 15 min à 37°C. L’aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les éluats ont été collectés dans un tube à l’aide du système de chambre à vide.
Efficacité du couple captation/élution
Le tableau 8 suivant présente le nombre d’Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation
S. aureus (n=3) 1.11E+07 99.72%
Tableau 8 Résultats de la captation de Staphylococcus aureus
Le tableau 9 suivant présente la colonne, le microorganisme et le taux d’élution correspondant.
Colonne Pourcentage d'élution
S. aureus (n=l) 96.06%
Tableau 9 Résultats de l’élution de Staphylococcus aureus
Exemple 14 Staphylococcus marcescens :
Protocole de fonctionnabsation des billes de verre
1 g de billes de verre de diamètre 105-150 pm ont été répartis dans des colonnes de 0.8 mL munies d’un fritté de 20-50 pm de porosité. 500 pL de poly-L-lysine (10 lysines par chaîne de poly-L-lysine) à 0.166% (w/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté entre les billes et la polylysine. La solution a ensuite été éliminée à l’aide d’un système de chambre à vide et d’une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l’aide de 2 mL (4 x 500 pL) d’eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l’emploi.
Protocole de captation/élimination de micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère de Staphylococcus marcescens testée a été réalisé, par dilutions successives au dixième dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl, en cytométrie. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie.
Protocole d’élution
5 élutions successives utilisant des solutions différentes ont été réalisées. Les 5 solutions et les conditions suivantes ont été utilisées :
Elution 1 : Sodium citrate 1% - EDTA 0.1% (3,5 mL) puis eau physiologique 0.85% NaCl (0.5 mL) Elution 2 : Trypsine 2.5% (0.5 mL, 30 min à température ambiante)
Elution 3 : NaCl IM (4 mL)
Elution 4 : Pluronic 0.01 % (4 mL)
Elution 5 : Acide acétique 1 % (4 mL)
L’aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les éluats ont été collectés dans des tubes différents à l’aide du système de chambre à vide.
Efficacité du couple captation/élution
Le tableau 10 suivant présente le nombre d’Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation
S. marcescens ( n=2) 1.44E+07 91.97%
Tableau 10 Résultats de la captation de Staphylococcus marcescens
Le tableau 11 suivant présente la colonne, le microorganisme et le taux d’élution correspondant.
Colonne Pourcentage d'élution S. marcescens (n=l) 73.66%
Tableau 11 Résultats de l’élution de Staphylococcus marcescens
Exemple 15 Fusarium oxysporum :
Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 mih sont répartis dans des colonnes de 0.8 mL. 142.8 pL de poly-L-lysine (10 lysines par chaîne de poly-L-lysine) à 0.5% (w/v) sont ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min est respecté entre les billes et la polylysine. La solution est ensuite éliminée à l’aide d’un système de chambre à vide et d’une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne est réalisé à l’aide de 1 mL d’eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe est ensuite réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine sont prêtes à l’emploi.
Protocole de captation/élimination de micro-organismes
La suspension mère de Fusarium oxysporum (UBOCC-A-112042) est diluée au 10eme dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl puis dénombrée par cytométrie en flux. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie.
Protocole d’élution
2 élutions successives à la trypsine 0.05% - EDTA IX (en PBS sans Calcium, sans Magnésium, avec Rouge de Phénol) de 500 pL chacune sont réalisées par colonne. La première élution a été réalisée en respectant un temps de contact de 15 min à 37°C. La suivante a été réalisée en flux sans temps de contact prolongé de la solution et à 50 mbar de dépression. Les éluats sont collectés dans un tube à l’aide du système de chambre à vide. Un dénombrement des éluats en cytométrie en flux est réalisé pour déterminer le taux d’élution.
Efficacité du couple captation/élution
Le tableau 12 suivant présente le nombre d’Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation
Fusarium oxysporum { n=3) 5.1E+06 72.50% Tableau 12 Résultats de la captation de Fusarium oxysporum
Le tableau 13 suivant présente la colonne, le microorganisme et le taux d’élution correspondant.
Colonne Pourcentage d'élution
Fusarium oxysporum (n=3) 45.8%
Tableau 13 Résultats de l’élution de Fusarium oxysporum
Exemple 16 champignon Mucor racemosus
Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 pm ont été répartis dans des colonnes de 0.8 mL. 142.8 pL de poly-L-lysine (10 lysines par chaîne de poly-L-lysine) à 0.5% (w/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et la polylysine. La solution a ensuite été éliminée à l’aide d’un système de chambre à vide et d’une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l’aide de 1 mL d’eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées à la poly-L-lysine ont été prêtes à l’emploi.
Protocole de captation/élimination de micro-organismes
La suspension mère de Mucor racemosus (ATCC 42647) est diluée au 10eme dans de l’eau physiologique 0.85% NaCl puis dénombrée par cytométrie en flux. 500 pL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie.
Protocole d’élution
2 élutions successives à la trypsine 0.05% - EDTA IX (en PBS sans Calcium, sans Magnésium, avec Rouge de Phénol) de 500 pL chacune ont été réalisées par colonne. La première élution a été réalisée en respectant un temps de contact de 15 min à 37°C. La suivante a été réalisée en flux sans temps de contact prolongé de la solution et à 50 mbar de dépression. Les éluats ont été collectés dans un tube à l’aide du système de chambre à vide. Un dénombrement des éluats en cytométrie en flux est réalisé pour déterminer le taux d’élution. Efficacité du couple captation/élution
Le tableau 14 suivant présente le nombre d’Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation
Mucor racemosus (n=3) 3.5 E+06 65.70%
Tableau 14 Résultats de la captation de Mucor racemosus
Le tableau 15 suivant présente la colonne, le microorganisme et le taux d’élution correspondant.
Colonne Pourcentage d'élution
Mucor racemosus (n=3) 55.2%
Tableau 15 Résultats de l’élution de Mucor racemosus

Claims

Revendications
1. Bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface, dans laquelle la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d’environ 146 à environ 80 300 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1460 Da, d’environ 1460 à environ 2920 Da, d’environ 2920 à environ 4380 Da, d’environ 4380 à environ 7300 Da, d’environ 7300 à environ 14600 Da, d’environ 14600 à environ 36500 Da, d’environ 36500 à environ 58400 Da, d’environ 58400 à environ 80 300 Da,
dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 1000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550 unités lysine.
2. Bille de verre selon la revendication 1,
• ayant un diamètre d’environ 20 à environ 1000 pm, et/ou
• ayant une masse d’environ 10 ng à environ 2 mg, et/ou
• dans laquelle le verre est de type sodocalcique ou borosilicaté.
3. Bille de verre selon l’une des revendications 1 à 2 dans laquelle la lysine est de la L-lysine ou de la D-lysine ou un mélange de L-lysine et de D-lysine, ou la polylysine est de la a ou s- poly-L-lysine ou de la a ou e-poly-D-lysine ou un mélange de a ou e-poly-L-lysine et a ou s- poly-D-lysine, linéaire ou ramifiée, éventuellement sous forme d’un sel, notamment hydrobromure ou hydrochlorure.
4. Procédé de préparation d’une bille de verre selon l’une des revendications 1 à 3 comprenant une étape de mise en contact de la lysine ou de la polylysine, notamment pendant une durée de 1 minute à 24 heures, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée.
5. Dispositif comprenant un récipient contenant des billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface, ledit récipient étant notamment sous forme de colonne comprenant de façon optionnelle un fritté, ladite colonne ayant notamment un volume d’environ 0,5 mL à environ 1 L, et ledit fritté ayant notamment une porosité inférieure à la taille des billes de verre utilisées.
6. Dispositif selon la revendication 5 dans lequel la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d’environ 146 à environ 146000 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1460 Da, d’environ 1460 à environ 2920 Da, d’environ 2920 à environ 4380 Da, d’environ 4380 à environ 7300 Da, d’environ 7300 à environ 14600 Da, d’environ 14600 à environ 36500 Da, d’environ 36500 à environ 58400 Da, d’environ 58400 à environ 80 300 Da, d’environ 80 300 Da à environ 87 600 Da, d’environ 87 600 Da à environ 116800 Da, d’environ 116800 à environ 146000 Da, et/ou
dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 1000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550, de 550 à 600, de 600 à 800, de 800 à 1000 unités lysine.
7. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel lesdites billes de verre sont définies selon Tune des revendications 1 à 3.
8. Utilisation de billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à leur surface, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de rélimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
9. Utilisation selon la revendication 8 d’un dispositif comprenant des billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine et tel que défini selon l’une des revendication 5 à 7, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
10. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle la lysine ou la polylysine a un poids moléculaire d’environ 146 à environ 146000 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1460 Da, d’environ 1460 à environ 2920 Da, d’environ 2920 à environ 4380 Da, d’environ 4380 à environ 7300 Da, d’environ 7300 à environ 14600 Da, d’environ 14600 à environ 36500 Da, d’environ 36500 à environ 58400 Da, d’environ 58400 à environ 80 300 Da, d’environ 80 300 Da à environ 87 600 Da, d’environ 87 600 Da à environ 116800 Da, d’environ 116800 à environ 146000 Da, et/ou
dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 1000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550, de 550 à 600, de 600 à 800, de 800 à 1000 unités lysine, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
11. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle lesdites billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine sont définies selon l’une des revendications 1 à 3, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
12. Procédé de captation de micro-organismes comprenant une étape de mise en contact d’un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec des billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine, dans des conditions permettant de créer une interaction entre lesdits micro-organismes et les billes de verre, et d’obtenir les dits micro organismes captés sur les billes de verre, notamment
dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de l’échantillon et captés sur les billes de verre est comprise de 0.001% à 100% en vue de l’élimination de micro-organismes dudit échantillon.
13. Procédé de captation de micro-organismes selon la revendication 12 comprenant une étape de mise en contact d’un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec un dispositif comprenant des billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine et tel que défini selon l’une des revendication 5 à 7, dans des conditions permettant de créer une interaction entre lesdits micro-organismes et les billes de verre, et d’obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre, notamment
dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de l’échantillon et captés sur les billes de verre est comprise de 0.001% à 100% en vue de l’élimination de micro-organismes dudit échantillon.
14. Procédé de captation de micro-organismes selon la revendication 12 ou 13, dans lequel les billes de verre sont fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine ayant un poids moléculaire d’environ 146 à environ 146000 Da, notamment d’environ 146 à environ 292 Da, d’environ 292 à environ 1460 Da, d’environ 1460 à environ 2920 Da, d’environ 2920 à environ 4380 Da, d’environ 4380 à environ 7300 Da, d’environ 7300 à environ 14600 Da, d’environ 14600 à environ 36500 Da, d’environ 36500 à environ 58400 Da, d’environ 58400 à environ 80 300 Da, d’environ 80 300 Da à environ 87 600 Da, d’environ 87 600 Da à environ 116800 Da, d’environ 116800 à environ 146000 Da, et/ou dans laquelle la polylysine est constituée d’un enchaînement de 2 à 1000 unités lysine, notamment de 2 à 10, de 10 à 20, de 20 à 30, de 30 à 50, de 50 à 100, de 100 à 250, de 250 à 400, de 400 à 550, de 550 à 600, de 600 à 800, de 800 à 1000 unités lysine,
15. Procédé de captation de micro-organismes selon la revendication 12 ou 13, comprenant des billes de verre fonctionnalisées par de la lysine ou de la polylysine définies selon l’une des revendications 1 à 3.
16. Procédé selon l’une des revendications 12 à 15, comportant une étape supplémentaire d’élution des micro-organismes précédemment captés dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des susdites billes de verre et la récupération des dits micro-organismes, notamment en vue d’un diagnostic.
17. Procédé selon l’une des revendications 4 ou 12 à 16, comprenant :
- une étape de mise en contact de la lysine ou de la polylysine avec une bille de verre pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par de la lysine ou de la polylysine adsorbée à sa surface,
- une étape de mise en contact d’un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro organismes, avec des billes de verre selon l’une des revendications 1 à 4 ou d’un dispositif selon la revendication 6, dans des conditions permettant de créer une interaction entre les dits micro-organismes et les billes de verre, et d’obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre,
- une étape supplémentaire d’élution des micro-organismes précédemment captés dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des susdites billes de verre et la récupération des dits micro-organismes.
18. Procédé selon l’une des revendications 12 à 17 dans lequel les micro-organismes sont choisis parmi les bactéries, et les Fungi, notamment les levures et les champignons, les Fungi appartenant notamment aux genres Absidia, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Brettanomyces, Byssochlamys, Candida, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Cryptococcus, Debaryomyces, Emericella, Epicoccum, Eupenicillium, Eurotium, Fusarium, Galactomyces, Geotrichum, Gliocladium, Hanseniaspora, Humicola, Hyphopichia, Kluyveromyces, Lichtheimia, Lodderomyces, Meyerozyma, Monascus, Mucor, Mycocladus, Neosartorya, Nigrospora, Paecilomyces, Pénicillium, Pestalotia, Phoma, Phytophthora, Pichia, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Sclerotinia, Scopulariopsis, Serpula, Stemphylium Talaromyces, Thielaviopsis, Torulaspora, Trichoderma, Trichosporon, Trichothetium, Ulocladium, Verticillium, Wallemia, Wickerhamomyces, Xylaria, Zygosaccharomyces, les bactéries étant en particulier des bactéries Gram + ou Gram -, notamment appartenant aux genres Acetobacter, Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes, Alicyclobacillus, Aquaspirillum, Asaia, Bacillus, Bifidobacterium sp., Bordetella, Brachybacterium, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Burkholderia, Buttiauxella, Campylobacter, Carnobacterium, Cellulomona, Citrobacter, Clavibacter Clostridium, Corynebacterium, Cronobacte, Cupriavidu, Curtobacterium, Elizabethkingia, Enteractinococcus, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Flacklamia, Flavobacterium, Geobacillus, Glutamicibacte, Halobacillus, Klebsiella, Kocuria, Lactobacillus, Lactococcus, Leclercia, Lelliottia, Leuconostoc, Lysinibacillus, Macrococcus, Methylobacteriu, Microbacterium spp. (CDC A-5), Micrococcus, Moraxell, Mycobacterium, Nesterenkonia, Oceanobacillus sp, Ochrobactrum, Paenibacillus, Pandorae, Pantoea, Paracoccus, Pasteurell, Pediococcus, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Roseomona, Rothia, Salmonella, Sanguibacter, Serratia, Shewanella, Sphingomonas, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Thermoanaerobacterium, Variovorax, Virgibacillus.
19. Procédé selon l’une des revendications 12 à 18, dans lequel l’échantillon liquide ou visqueux est choisi parmi :
- un échantillon biologique, tel que l’urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses,
- un échantillon pharmaceutique, tel que les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques,
- un échantillon cosmétique, tel que les démaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings,
- un échantillon alimentaire, tel que les boissons, notamment l’eau (plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, les sodas, les boissons alcoolisées, les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits laitiers, les ovoproduits.
20 Kit comprenant des billes de verre, de la lysine ou de la polylysine et optionnellement un dispositif sous forme de colonne et des solutions d’élution de type enzymatique ou chimique, pour la captation de micro-organismes en vue d’un diagnostic, ou en vue de l’élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d’échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
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