CA3150552A1 - Dispositif contenant des billes de verre fonctionnalisees avec du polyethyleneimine, et leur utilisation pour capter les micro-organismes - Google Patents
Dispositif contenant des billes de verre fonctionnalisees avec du polyethyleneimine, et leur utilisation pour capter les micro-organismesInfo
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- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
- B01J20/28016—Particle form
- B01J20/28019—Spherical, ellipsoidal or cylindrical
Abstract
L'invention concerne un dispositif contenant des billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre et son utilisation dans la captation de micro-organismes pour la mise en uvre d'un procédé d'élimination de micro-organismes ou de diagnostic. Les micro-organismes pouvant notamment être choisis parmi les bactéries, et les Fungi, notamment les levures et les champignons.
Description
Description DISPOSITIF CONTENANT DES BILLES DE VERRE FONCTIONNALISEES AVEC DU
POLYETHYLENEIMINE, ET LEUR
UTILISATION POUR CAPTER LES MICRO-ORGANISMES
La présente invention concerne un dispositif contenant des billes de verre fonctionnalisées, et son utilisation dans la captation de micro-organismes pour la mise en oeuvre d'un procédé d'élimination de micro-organismes ou de diagnostic.
La captation de micro-organismes présente un intérêt fondamental dans de nombreux types d'industrie, tels que les industries pharmaceutique, cosmétique, vétérinaire ou alimentaire. Elle peut notamment être utilisée pour des applications qui se découpent en deux grands domaines :
- L'élimination de micro-organismes de solutions potentiellement contaminées, - L'analyse sous la forme d'un diagnostic, notamment dans le cadre d'un diagnostic clinique, permettant d'évaluer la qualité microbiologique d'une solution.
Pour éliminer des micro-organismes présents au sein de solutions potentiellement contaminées, les techniques utilisées font généralement appel au traitement thermique (Magali, WAGNER, Anne Gaëlle MELLOUET, et François ZUBER. 2016. "Traitement thermique en continu de produits pompables." "Agroalimentaire." Techniques de l'Ingénieur, 10 Septembre 2016) et/ou à la filtration membranaire (Christel, CAUSSERAND, Claire ALBASI, et Hélène ROUX DE BALMANN.
2017.
"Filtration membranaire (0I, NF, UF, MF) - Applications en traitement des eaux." "Technologies de l'eau." Techniques de l'Ingénieur, 10 Août 2017). L'inconvénient majeur du traitement thermique provient du fait que la température est susceptible d'engendrer des modifications irréversibles du produit en agissant directement sur ses constituants. Également, au niveau microbiologique, le traitement thermique correspond à une réduction de la charge en microorganismes et il est par exemple susceptible de réactiver des spores bactériennes. Concernant la filtration membranaire, le colmatage de la membrane est le principal problème pouvant être rencontré. Ce dernier peut être dû à la concentration en micro-organismes dans le produit autant qu'à la nature du produit et en particulier aux particules solides présentes en son sein.
L'analyse microbiologique, nécessite l'utilisation de techniques précises pour lesquelles le temps d'obtention du résultat le plus court possible est recherché. En effet, plus les résultats d'analyse sont obtenus rapidement, plus il est possible d'engager des actions correctives en cas de résultats non satisfaisants ou non acceptables. En particulier, dans le domaine médical, il est nécessaire de prévoir et diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimisé.
POLYETHYLENEIMINE, ET LEUR
UTILISATION POUR CAPTER LES MICRO-ORGANISMES
La présente invention concerne un dispositif contenant des billes de verre fonctionnalisées, et son utilisation dans la captation de micro-organismes pour la mise en oeuvre d'un procédé d'élimination de micro-organismes ou de diagnostic.
La captation de micro-organismes présente un intérêt fondamental dans de nombreux types d'industrie, tels que les industries pharmaceutique, cosmétique, vétérinaire ou alimentaire. Elle peut notamment être utilisée pour des applications qui se découpent en deux grands domaines :
- L'élimination de micro-organismes de solutions potentiellement contaminées, - L'analyse sous la forme d'un diagnostic, notamment dans le cadre d'un diagnostic clinique, permettant d'évaluer la qualité microbiologique d'une solution.
Pour éliminer des micro-organismes présents au sein de solutions potentiellement contaminées, les techniques utilisées font généralement appel au traitement thermique (Magali, WAGNER, Anne Gaëlle MELLOUET, et François ZUBER. 2016. "Traitement thermique en continu de produits pompables." "Agroalimentaire." Techniques de l'Ingénieur, 10 Septembre 2016) et/ou à la filtration membranaire (Christel, CAUSSERAND, Claire ALBASI, et Hélène ROUX DE BALMANN.
2017.
"Filtration membranaire (0I, NF, UF, MF) - Applications en traitement des eaux." "Technologies de l'eau." Techniques de l'Ingénieur, 10 Août 2017). L'inconvénient majeur du traitement thermique provient du fait que la température est susceptible d'engendrer des modifications irréversibles du produit en agissant directement sur ses constituants. Également, au niveau microbiologique, le traitement thermique correspond à une réduction de la charge en microorganismes et il est par exemple susceptible de réactiver des spores bactériennes. Concernant la filtration membranaire, le colmatage de la membrane est le principal problème pouvant être rencontré. Ce dernier peut être dû à la concentration en micro-organismes dans le produit autant qu'à la nature du produit et en particulier aux particules solides présentes en son sein.
L'analyse microbiologique, nécessite l'utilisation de techniques précises pour lesquelles le temps d'obtention du résultat le plus court possible est recherché. En effet, plus les résultats d'analyse sont obtenus rapidement, plus il est possible d'engager des actions correctives en cas de résultats non satisfaisants ou non acceptables. En particulier, dans le domaine médical, il est nécessaire de prévoir et diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimisé.
2 Cependant, pour mettre en évidence la présence de microorganismes, il est nécessaire de réaliser des prélèvements suffisamment importants afin de s'assurer de récupérer une quantité minimale de microorganismes. Il faut ensuite augmenter leur concentration, les isoler et les identifier.
Une étape clé pour la plupart de ces méthodes de détection/quantification de microorganismes dans les échantillons liquides ou rendus liquides, est leur capacité à dépasser la limite de détection de la technique d'évaluation mise en oeuvre. Ceci est particulièrement difficile pour les échantillons faiblement concentrés en microorganismes d'intérêt. Une étape d'enrichissement ou de concentration apparait souvent nécessaire pour ce type d'échantillon, ladite étape d'enrichissement pouvant éventuellement être mise en oeuvre directement dans le conditionnement dans lequel se trouve l'échantillon. Il s'agit dans ce cas, d'une étape d'enrichissement directement dans le produit.
L'étape d'enrichissement nécessite d'utiliser des milieux de culture, sélectifs ou non, qui ont pour but de promouvoir la croissance des microorganismes cibles dans les échantillons biologiques ou environnementaux, tout en limitant la croissance des flores non cibles. Ainsi, la population cible, qui est souvent présente à des niveaux bas par rapport à la flore annexe présente dans les aliments, est amplifiée. Ces étapes d'enrichissement en amont de l'analyse permettent d'accroitre le nombre de microorganismes d'intérêt dans l'échantillon mais condamnent à la fois la possibilité d'une analyse rapide mais également la possibilité de quantifier la population initiale de microorganismes d'intérêt.
L'autre possibilité consiste à passer par une étape de concentration des microorganismes à partir de l'échantillon liquide ou rendu liquide.
Une des techniques les plus utilisées pour la concentration de micro-organismes à partir d'échantillons est l'utilisation d'un ou plusieurs filtres membranes de porosité variable à
travers lequel le milieu liquide est filtré. Les microorganismes contenus dans l'échantillon sont arrêtés par la membrane et donc concentrés. Une telle technique est généralement mise en oeuvre pour l'analyse microbiologique d'eau de process, d'eau potable, de boisson, ou de produit pharmaceutique.
Bien que simple d'utilisation, cette méthode de filtration sur membrane reste limitée par des facteurs provoquant le colmatage du filtre membrane tels que la turbidité élevée, ou la présence de particules dans l'échantillon. D'autres facteurs liés à la nature du filtre et à son mode de stérilisation peuvent aussi influer sur le résultat de l'analyse microbiologique pouvant gravement altérer la viabilité, la précision et la sensibilité de la méthode et conduire à des résultats erronés et faiblement reproductibles. Nous pouvons citer à titre d'exemple non exhaustif, l'inhibition de la croissance microbienne, une propagation anormale des colonies, l'existence de zones non mouillantes, la fragilité
du filtre, un défaut de planéité du filtre, un faible taux de récupération. En outre, la nécessité de concentrer de grandes quantités d'échantillon afin de compenser les variations spatiales et temporelles de l'occurrence des microorganismes, augmente la probabilité de colmatage du filtre membrane.
Une étape clé pour la plupart de ces méthodes de détection/quantification de microorganismes dans les échantillons liquides ou rendus liquides, est leur capacité à dépasser la limite de détection de la technique d'évaluation mise en oeuvre. Ceci est particulièrement difficile pour les échantillons faiblement concentrés en microorganismes d'intérêt. Une étape d'enrichissement ou de concentration apparait souvent nécessaire pour ce type d'échantillon, ladite étape d'enrichissement pouvant éventuellement être mise en oeuvre directement dans le conditionnement dans lequel se trouve l'échantillon. Il s'agit dans ce cas, d'une étape d'enrichissement directement dans le produit.
L'étape d'enrichissement nécessite d'utiliser des milieux de culture, sélectifs ou non, qui ont pour but de promouvoir la croissance des microorganismes cibles dans les échantillons biologiques ou environnementaux, tout en limitant la croissance des flores non cibles. Ainsi, la population cible, qui est souvent présente à des niveaux bas par rapport à la flore annexe présente dans les aliments, est amplifiée. Ces étapes d'enrichissement en amont de l'analyse permettent d'accroitre le nombre de microorganismes d'intérêt dans l'échantillon mais condamnent à la fois la possibilité d'une analyse rapide mais également la possibilité de quantifier la population initiale de microorganismes d'intérêt.
L'autre possibilité consiste à passer par une étape de concentration des microorganismes à partir de l'échantillon liquide ou rendu liquide.
Une des techniques les plus utilisées pour la concentration de micro-organismes à partir d'échantillons est l'utilisation d'un ou plusieurs filtres membranes de porosité variable à
travers lequel le milieu liquide est filtré. Les microorganismes contenus dans l'échantillon sont arrêtés par la membrane et donc concentrés. Une telle technique est généralement mise en oeuvre pour l'analyse microbiologique d'eau de process, d'eau potable, de boisson, ou de produit pharmaceutique.
Bien que simple d'utilisation, cette méthode de filtration sur membrane reste limitée par des facteurs provoquant le colmatage du filtre membrane tels que la turbidité élevée, ou la présence de particules dans l'échantillon. D'autres facteurs liés à la nature du filtre et à son mode de stérilisation peuvent aussi influer sur le résultat de l'analyse microbiologique pouvant gravement altérer la viabilité, la précision et la sensibilité de la méthode et conduire à des résultats erronés et faiblement reproductibles. Nous pouvons citer à titre d'exemple non exhaustif, l'inhibition de la croissance microbienne, une propagation anormale des colonies, l'existence de zones non mouillantes, la fragilité
du filtre, un défaut de planéité du filtre, un faible taux de récupération. En outre, la nécessité de concentrer de grandes quantités d'échantillon afin de compenser les variations spatiales et temporelles de l'occurrence des microorganismes, augmente la probabilité de colmatage du filtre membrane.
3 D'autres méthodes permettent également de concentrer les micro-organismes et de les séparer des éléments constitutifs de l'échantillon.
Par exemple, les méthodes d'immunocapture ou d'immunoconcentration sont largement utilisées dans de nombreuses applications. Elles mettent très souvent en oeuvre des supports fonctionnalisés avec des anticorps et permettent de capturer spécifiquement ou non les microorganismes contenus dans l'échantillon. Ces méthodes sont largement utilisées pour l'analyse microbiologique de fluides humains ou d'échantillons alimentaires, et peuvent être mises en oeuvre sur les échantillons bruts, enrichis, ou dans des milieux de cultures spécifiques (pré-enrichissement et enrichissement).
De nouvelles méthodes permettent également la capture semi-spécifique de microorganismes à l'aide de surfaces cellulaires fonctionnalisées. Elles mettent en oeuvre des dérivés de lectines ou d'hydrates de carbone, des peptides et des composés mimant les peptides et sont appliquées à la capture à large spectre et / ou de liaison spécifique des micro-organismes dans l'échantillon.
.. En outre, les peptides antimicrobiens liés à des composés non solubles ont été utilisés pour tuer, immobiliser et détecter des microorganismes.
L'un des buts de l'invention est de fournir un dispositif comprenant les billes de verre fonctionnalisées pour une utilisation dans la captation de micro-organismes.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de préparation des billes de verre fonctionnalisées.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé efficace de captation de micro-organismes pour une utilisation en élimination de micro-organismes ou en diagnostic.
Un premier objet de la présente invention est un dispositif comprenant un récipient creux contenant des billes de verre, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre.
En particulier, la présente invention concerne un dispositif comprenant un récipient creux contenant des billes de verre non poreuses, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre.
La présente invention concerne un dispositif comprenant un récipient creux contenant des billes de verre, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre, les billes de verre étant notamment constituées de verre de type sodocalcique ou borosilicate, dans lequel la masse moléculaire du polyéthylèneimine adsorbé est comprise de 0,6 à 2000 kDa.
Par exemple, les méthodes d'immunocapture ou d'immunoconcentration sont largement utilisées dans de nombreuses applications. Elles mettent très souvent en oeuvre des supports fonctionnalisés avec des anticorps et permettent de capturer spécifiquement ou non les microorganismes contenus dans l'échantillon. Ces méthodes sont largement utilisées pour l'analyse microbiologique de fluides humains ou d'échantillons alimentaires, et peuvent être mises en oeuvre sur les échantillons bruts, enrichis, ou dans des milieux de cultures spécifiques (pré-enrichissement et enrichissement).
De nouvelles méthodes permettent également la capture semi-spécifique de microorganismes à l'aide de surfaces cellulaires fonctionnalisées. Elles mettent en oeuvre des dérivés de lectines ou d'hydrates de carbone, des peptides et des composés mimant les peptides et sont appliquées à la capture à large spectre et / ou de liaison spécifique des micro-organismes dans l'échantillon.
.. En outre, les peptides antimicrobiens liés à des composés non solubles ont été utilisés pour tuer, immobiliser et détecter des microorganismes.
L'un des buts de l'invention est de fournir un dispositif comprenant les billes de verre fonctionnalisées pour une utilisation dans la captation de micro-organismes.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de préparation des billes de verre fonctionnalisées.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé efficace de captation de micro-organismes pour une utilisation en élimination de micro-organismes ou en diagnostic.
Un premier objet de la présente invention est un dispositif comprenant un récipient creux contenant des billes de verre, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre.
En particulier, la présente invention concerne un dispositif comprenant un récipient creux contenant des billes de verre non poreuses, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre.
La présente invention concerne un dispositif comprenant un récipient creux contenant des billes de verre, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre, les billes de verre étant notamment constituées de verre de type sodocalcique ou borosilicate, dans lequel la masse moléculaire du polyéthylèneimine adsorbé est comprise de 0,6 à 2000 kDa.
4 Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif comprenant un récipient creux contenant des billes de verre, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine directement adsorbé à la surface des billes de verre, en particulier sans agent de couplage entre ledit polyéthylèneimine et la surface des billes de verre, de préférence par des interactions électrostatiques, lesdites billes de verre étant notamment constituées de verre de type sodocalcique ou borosilicate, dans lequel la masse moléculaire du polyéthylèneimine adsorbé est comprise de 0,6 à
2000 kDa.
Au sens de la présente invention, on entend par récipient un objet destiné
à recevoir les billes de verre.
Au sens de la présente invention, on entend par récipient creux un récipient tel que défini ci-dessus, comprenant un espace concave, ou une cavité, pouvant accueillir les billes de verre.
Au sens de la présente invention on entend par billes de verre des éléments de forme sphérique ou ovoïde composés de verre.
Au sens de la présente invention, on entend par billes de verre non poreuses des billes de verre lisses et dépourvues de pores. A titre d'exemple, les billes type Poravor0, ou les billes de gel de silice sont considérées comme poreuses.
Les billes de verres utilisables dans la présente invention ont notamment une densité comprise de 2 à 3 kg/1, en particulier comprise de 2.3 à 2.7 kg/1, notamment d'environ 2,48 kg/l.
Au sens de la présente invention on entend par polyéthylèneimine un polymère sous forme linéaire ou ramifié composé de motifs éthylène diamine. Il s'agit d'un polymère hydrosoluble dont plusieurs produits de poids moléculaire différents sont commercialement disponibles. Le polyéthylèneimine peut être synthétisé à partir de l'Aziridine par une polymérisation par ouverture de cycle, conduisant à
un polyéthylèneimine ramifié.
77.
PE ar=
PE !Uléaire Structure du polyéthylèneimine ramifié et linéaire Au sens de la présente invention on entend par adsorbé à la surface des billes de verre le fait que le polyéthylèneimine soit lié de façon non-covalente à la surface des billes de verre sans pour autant modifier la structure du verre. Le procédé d'adsorption fait intervenir des interactions électrostatiques
2000 kDa.
Au sens de la présente invention, on entend par récipient un objet destiné
à recevoir les billes de verre.
Au sens de la présente invention, on entend par récipient creux un récipient tel que défini ci-dessus, comprenant un espace concave, ou une cavité, pouvant accueillir les billes de verre.
Au sens de la présente invention on entend par billes de verre des éléments de forme sphérique ou ovoïde composés de verre.
Au sens de la présente invention, on entend par billes de verre non poreuses des billes de verre lisses et dépourvues de pores. A titre d'exemple, les billes type Poravor0, ou les billes de gel de silice sont considérées comme poreuses.
Les billes de verres utilisables dans la présente invention ont notamment une densité comprise de 2 à 3 kg/1, en particulier comprise de 2.3 à 2.7 kg/1, notamment d'environ 2,48 kg/l.
Au sens de la présente invention on entend par polyéthylèneimine un polymère sous forme linéaire ou ramifié composé de motifs éthylène diamine. Il s'agit d'un polymère hydrosoluble dont plusieurs produits de poids moléculaire différents sont commercialement disponibles. Le polyéthylèneimine peut être synthétisé à partir de l'Aziridine par une polymérisation par ouverture de cycle, conduisant à
un polyéthylèneimine ramifié.
77.
PE ar=
PE !Uléaire Structure du polyéthylèneimine ramifié et linéaire Au sens de la présente invention on entend par adsorbé à la surface des billes de verre le fait que le polyéthylèneimine soit lié de façon non-covalente à la surface des billes de verre sans pour autant modifier la structure du verre. Le procédé d'adsorption fait intervenir des interactions électrostatiques
5 type van de Waals entre le polymère cationique présentant des charges positives et la surface de verre anionique présentant des charges négatives.
L'adsorption de polymère cationique sur une surface de verre non poreuse par des interactions électrostatiques est connue. Ce phénomène est notamment mis en oeuvre pour adsorber des microorganismes sur des plaques de verre pour une observation par microscopie optique, où un polymère cationique, tel que la polylysine, est ajouté dans le milieu comme liant entre les microorganismes et la plaque de verre.
Les inventeurs ont constaté de façon inattendue dans le cas de billes de verre fonctionnalisées par adsorption du polyéthylèneimine, une stabilité surprenante de l'interaction entre le polyéthylèneimine et la bille de verre. Les billes de verre ainsi fonctionnalisées permettent la captation de microorganismes dans leur état, mort ou vivant, dans un milieu de façon quantitative et permettent sous élution le relargage de la totalité des microorganismes retenus à la surface des billes de verres fonctionnalisées par le polyéthylèneimine en conservant l'état, mort ou vivant, des microorganismes.
L'adsorption présente de nombreux avantages par rapport à un greffage par liaison covalente également connu. L'adsorption ne nécessite pas de modification chimique préalable de la surface de verre afin d'y introduire des groupements fonctionnels, tels que les siloxanes, pouvant réagir avec le polymère. De plus, l'adsorption met en jeu de faibles interactions rendant le processus réversible. Les billes de verre, ainsi que le polymère peuvent alors potentiellement être recyclés par désorption.
Contrairement à un greffage covalent, l'adsorption peut s'effectuer dans un matériel ou appareil non spécifique.
Ainsi, l'invention constitue un moyen de captation/élimination de micro-organismes dans un produit.
Puis, dans un objectif de diagnostic, de proposer un moyen d'élution permettant le relargage de la totalité des microorganismes retenus sur la colonne et garantissant la viabilité cellulaire. Ceci permet d'apporter une quantification précise des microorganismes vivants contenus dans l'échantillon analysé.
Les surfaces traitées par du polyéthylèneimine trouvent de nombreuses applications parmi lesquelles l'adhésion et l'étalement de diverses lignées cellulaires, la différenciation cellulaire et l'excroissance de neurites, l'adhésion des lignées de cellules transfectées et la survie de neurones primaires dans la culture.
L'adsorption de polymère cationique sur une surface de verre non poreuse par des interactions électrostatiques est connue. Ce phénomène est notamment mis en oeuvre pour adsorber des microorganismes sur des plaques de verre pour une observation par microscopie optique, où un polymère cationique, tel que la polylysine, est ajouté dans le milieu comme liant entre les microorganismes et la plaque de verre.
Les inventeurs ont constaté de façon inattendue dans le cas de billes de verre fonctionnalisées par adsorption du polyéthylèneimine, une stabilité surprenante de l'interaction entre le polyéthylèneimine et la bille de verre. Les billes de verre ainsi fonctionnalisées permettent la captation de microorganismes dans leur état, mort ou vivant, dans un milieu de façon quantitative et permettent sous élution le relargage de la totalité des microorganismes retenus à la surface des billes de verres fonctionnalisées par le polyéthylèneimine en conservant l'état, mort ou vivant, des microorganismes.
L'adsorption présente de nombreux avantages par rapport à un greffage par liaison covalente également connu. L'adsorption ne nécessite pas de modification chimique préalable de la surface de verre afin d'y introduire des groupements fonctionnels, tels que les siloxanes, pouvant réagir avec le polymère. De plus, l'adsorption met en jeu de faibles interactions rendant le processus réversible. Les billes de verre, ainsi que le polymère peuvent alors potentiellement être recyclés par désorption.
Contrairement à un greffage covalent, l'adsorption peut s'effectuer dans un matériel ou appareil non spécifique.
Ainsi, l'invention constitue un moyen de captation/élimination de micro-organismes dans un produit.
Puis, dans un objectif de diagnostic, de proposer un moyen d'élution permettant le relargage de la totalité des microorganismes retenus sur la colonne et garantissant la viabilité cellulaire. Ceci permet d'apporter une quantification précise des microorganismes vivants contenus dans l'échantillon analysé.
Les surfaces traitées par du polyéthylèneimine trouvent de nombreuses applications parmi lesquelles l'adhésion et l'étalement de diverses lignées cellulaires, la différenciation cellulaire et l'excroissance de neurites, l'adhésion des lignées de cellules transfectées et la survie de neurones primaires dans la culture.
6 Le dispositif de la présente Invention peut être utilisé en statique ou en flux. Le mode statique permet d'augmenter le temps de contact entre les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylènemine et le liquide contaminé et donc de maximiser la probabilité de rencontre entre les billes et les microorganismes. Cette probabilité de rencontre peut être encore améliorée en procédant à une agitation manuelle ou mécanique.
L'inconvénient de cette technique concerne les grands volumes de solution à
analyser ou à
débactériser (100 mL, 250 mL) puisqu'ils nécessitent une quantité importante de billes, et par conséquent un coût plus élevé.
La méthode en flux, permet de passer de grands volumes de liquide dans un espace réduit pour forcer, en quelque sorte, les microorganismes à rencontrer le polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes (la quantité de billes utilisées pouvant-être de 1g). Ainsi, si l'on souhaite obtenir un coût réduit par analyse, on peut utiliser la méthode statique pour de petits volumes et la méthode en flux pour de grand volume.
L'invention présente de nombreux avantages par rapport aux techniques de l'art antérieur. Elle permet tout d'abord d'éviter l'utilisation du traitement thermique pour éliminer les micro-organismes de solutions potentiellement contaminées et ainsi de préserver toutes les qualités originelles du produit sans engendrer de modifications sur ses constituants. L'invention permet également d'éviter d'utiliser .. la filtration membranaire et ses inconvénients liés entre autres au colmatage. Ainsi, l'invention permet d'éliminer les microorganismes contenus dans des échantillons liquides ou rendus liquides de volume important, échantillons pouvant être de natures différentes et posséder par exemple une turbidité
élevée ou des particules ou des sédiments en son sein.
En ce qui concerne l'analyse microbiologique, la présente invention concerne notamment un procédé
pour capturer et concentrer au moins un microorganisme susceptible d'être présent dans un échantillon en vue de le détecter, le quantifier ou d'en évaluer la viabilité. Cette invention permet ainsi de s'affranchir d'une étape d'enrichissement, et par conséquent de réduire considérablement le temps d'analyse mais également de quantifier la population cible initiale.
.. Le microorganisme peut être une bactérie, un Fungi (par exemple une levure ou une moisissure) ou un virus. Ce procédé est particulièrement applicable aux microorganismes contenus dans les milieux complexes. Ces milieux correspondant à des échantillons biologiques peuvent être d'origine humaine, alimentaire, cosmétique, vétérinaire ou pharmaceutique.
L'un des avantages de la présente invention réside dans le fait que le produit ne subit aucune modification au contact des billes de verre fonctionnalisées et que celle-ci permet également de s'affranchir des problèmes de colmatage.
L'inconvénient de cette technique concerne les grands volumes de solution à
analyser ou à
débactériser (100 mL, 250 mL) puisqu'ils nécessitent une quantité importante de billes, et par conséquent un coût plus élevé.
La méthode en flux, permet de passer de grands volumes de liquide dans un espace réduit pour forcer, en quelque sorte, les microorganismes à rencontrer le polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes (la quantité de billes utilisées pouvant-être de 1g). Ainsi, si l'on souhaite obtenir un coût réduit par analyse, on peut utiliser la méthode statique pour de petits volumes et la méthode en flux pour de grand volume.
L'invention présente de nombreux avantages par rapport aux techniques de l'art antérieur. Elle permet tout d'abord d'éviter l'utilisation du traitement thermique pour éliminer les micro-organismes de solutions potentiellement contaminées et ainsi de préserver toutes les qualités originelles du produit sans engendrer de modifications sur ses constituants. L'invention permet également d'éviter d'utiliser .. la filtration membranaire et ses inconvénients liés entre autres au colmatage. Ainsi, l'invention permet d'éliminer les microorganismes contenus dans des échantillons liquides ou rendus liquides de volume important, échantillons pouvant être de natures différentes et posséder par exemple une turbidité
élevée ou des particules ou des sédiments en son sein.
En ce qui concerne l'analyse microbiologique, la présente invention concerne notamment un procédé
pour capturer et concentrer au moins un microorganisme susceptible d'être présent dans un échantillon en vue de le détecter, le quantifier ou d'en évaluer la viabilité. Cette invention permet ainsi de s'affranchir d'une étape d'enrichissement, et par conséquent de réduire considérablement le temps d'analyse mais également de quantifier la population cible initiale.
.. Le microorganisme peut être une bactérie, un Fungi (par exemple une levure ou une moisissure) ou un virus. Ce procédé est particulièrement applicable aux microorganismes contenus dans les milieux complexes. Ces milieux correspondant à des échantillons biologiques peuvent être d'origine humaine, alimentaire, cosmétique, vétérinaire ou pharmaceutique.
L'un des avantages de la présente invention réside dans le fait que le produit ne subit aucune modification au contact des billes de verre fonctionnalisées et que celle-ci permet également de s'affranchir des problèmes de colmatage.
7 PCT/EP2020/080199 Un autre avantage de la présente invention est la possibilité d'utiliser le dispositif de captation de micro-organismes en flux continu, sans étapes d'enrichissement et ce même si la quantité de microorganismes est faible.
Il est ainsi possible d'intégrer ce dispositif à une unité industrielle de production sur laquelle une étape d'élimination de micro-organismes serait nécessaire, et ce sans interrompre la chaine de production.
Par conséquent, cette invention permet un gain de temps considérable par rapport aux méthodes impliquant une étape d'enrichissement.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant un récipient creux contenant des billes de verre non poreuses, exclusivement fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre.
Selon ce mode de réalisation particulier, les billes de verre sont exclusivement fonctionnalisées par du polyéthylèneimine. L'expression exclusivement désigne le fait que le polyéthylèneimine est le seul polymère présent sur les billes de verre. Un système multicouche avec la présence d'un autre polymère ne fait pas partie de ce mode de réalisation.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre sont constituées de verre de type sodocalcique ou .. borosilicate.
Le type de verre utilisé pour la présente invention, notamment le verre sodocalcique, présente un avantage en termes de coût qui est peu élevé.
Au sens de la présente invention, on entend par verre de type sodocalcique , un verre à base de silice (5i02), de calcium et de sodium.
Au sens de la présente invention, on entend par verre de type borosilicaté
, un verre à base de silice (5i02), et de trioxyde de bore (B203).
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant un récipient creux contenant des billes de verre non poreuses, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre, les billes de verre étant notamment constituées de verre de type sodocalcique ou borosilicate.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre sont constituées de verre de type sodocalcique ou borosilicate non modifié au préalable.
Il est ainsi possible d'intégrer ce dispositif à une unité industrielle de production sur laquelle une étape d'élimination de micro-organismes serait nécessaire, et ce sans interrompre la chaine de production.
Par conséquent, cette invention permet un gain de temps considérable par rapport aux méthodes impliquant une étape d'enrichissement.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant un récipient creux contenant des billes de verre non poreuses, exclusivement fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre.
Selon ce mode de réalisation particulier, les billes de verre sont exclusivement fonctionnalisées par du polyéthylèneimine. L'expression exclusivement désigne le fait que le polyéthylèneimine est le seul polymère présent sur les billes de verre. Un système multicouche avec la présence d'un autre polymère ne fait pas partie de ce mode de réalisation.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre sont constituées de verre de type sodocalcique ou .. borosilicate.
Le type de verre utilisé pour la présente invention, notamment le verre sodocalcique, présente un avantage en termes de coût qui est peu élevé.
Au sens de la présente invention, on entend par verre de type sodocalcique , un verre à base de silice (5i02), de calcium et de sodium.
Au sens de la présente invention, on entend par verre de type borosilicaté
, un verre à base de silice (5i02), et de trioxyde de bore (B203).
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant un récipient creux contenant des billes de verre non poreuses, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre, les billes de verre étant notamment constituées de verre de type sodocalcique ou borosilicate.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre sont constituées de verre de type sodocalcique ou borosilicate non modifié au préalable.
8 Dans ce mode de réalisation, les billes de verre n'ont pas subi un traitement chimique, hors nettoyage, modifiant la structure du verre, dont par exemple un traitement par de l'aluminate de sodium, avant adsorption du polyéthylèneimine.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont un diamètre d'environ 20 à environ 1000 iam, notamment d'environ 20 à 30 lm, d'environ 30 à 40 lm, d'environ 40 à 50 lm, d'environ 50 à 75 lm, d'environ 75 à 100 iam, d'environ 100 à 200 iam, d'environ 200 à 300 iam, d'environ 300 à 400 lm, d'environ 400 à 500 lm, d'environ 500 à 600 lm, d'environ 600 à 700 lm, d'environ 700 à 800 .in, d'environ 800 à 900 lm, d'environ 900 à 1000 lm.
Si la taille des billes de verre est inférieure à 20 pm, les billes passent à
travers le fritté sensé les retenir. En revanche, pour des billes de taille supérieure à 1000 pm, les taux de captation obtenus sont faibles.
La diminution de la taille des billes, combinée à un nombre de billes plus important permet d'avoir une surface de contact plus élevée par rapport à des billes plus grandes en nombre moins important.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont une masse d'environ 10 ng à environ 2 mg notamment d'environ 10 à 50 ng, d'environ 50 à 100 ng, d'environ 100 à 200 ng, d'environ 200 à 500 ng, d'environ 500 ng à 1 lag, d'environ 1 à 5 lag, d'environ 5 à 10 lag, d'environ 10 à 20 lag, d'environ 20 à 50 lag, d'environ 50 à 100 lag, d'environ 100 à 200 lag, d'environ 200 à
500 lag, d'environ 500 lag à 1 mg, d'environ 1 à 1,5 mg, d'environ 1,5 à 2 mg.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel :
= les billes de verre ont un diamètre d'environ 20 à environ 1000 lm, notamment d'environ 20 à
lm, d'environ 30 à 40 lm, d'environ 40 à 50 lm, d'environ 50 à 75 lm, d'environ 75 à
100 lm, d'environ 100 à 200 lm, d'environ 200 à 300 lm, d'environ 300 à 400 lm, d'environ 400 à 500 lm, d'environ 500 à 600 lm, d'environ 600 à 700 iam, d'environ 700 à
800 lm, d'environ 800 à 900 lm, d'environ 900 à 1000 lm, et/ou = les billes de verre ont une masse unitaire d'environ 10 ng à environ 2 mg, notamment d'environ 10 à 50 ng, d'environ 50 à 100 ng, d'environ 100 à 200 ng, d'environ 200 à 500 ng, d'environ 500 ng à 1 lag, d'environ 1 à 5 lag, d'environ 5 à 10 lag, d'environ 10 à 20 lag, d'environ 20 à 50 lag, d'environ 50 à 100 lag, d'environ 100 à 200 lag, d'environ 200 à 500 lag, d'environ 500 lag à 1 mg, d'environ 1 à 1,5 mg, d'environ 1,5 à 2 mg.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont un diamètre d'environ 20 à environ 1000 iam, notamment d'environ 20 à 30 lm, d'environ 30 à 40 lm, d'environ 40 à 50 lm, d'environ 50 à 75 lm, d'environ 75 à 100 iam, d'environ 100 à 200 iam, d'environ 200 à 300 iam, d'environ 300 à 400 lm, d'environ 400 à 500 lm, d'environ 500 à 600 lm, d'environ 600 à 700 lm, d'environ 700 à 800 .in, d'environ 800 à 900 lm, d'environ 900 à 1000 lm.
Si la taille des billes de verre est inférieure à 20 pm, les billes passent à
travers le fritté sensé les retenir. En revanche, pour des billes de taille supérieure à 1000 pm, les taux de captation obtenus sont faibles.
La diminution de la taille des billes, combinée à un nombre de billes plus important permet d'avoir une surface de contact plus élevée par rapport à des billes plus grandes en nombre moins important.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont une masse d'environ 10 ng à environ 2 mg notamment d'environ 10 à 50 ng, d'environ 50 à 100 ng, d'environ 100 à 200 ng, d'environ 200 à 500 ng, d'environ 500 ng à 1 lag, d'environ 1 à 5 lag, d'environ 5 à 10 lag, d'environ 10 à 20 lag, d'environ 20 à 50 lag, d'environ 50 à 100 lag, d'environ 100 à 200 lag, d'environ 200 à
500 lag, d'environ 500 lag à 1 mg, d'environ 1 à 1,5 mg, d'environ 1,5 à 2 mg.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel :
= les billes de verre ont un diamètre d'environ 20 à environ 1000 lm, notamment d'environ 20 à
lm, d'environ 30 à 40 lm, d'environ 40 à 50 lm, d'environ 50 à 75 lm, d'environ 75 à
100 lm, d'environ 100 à 200 lm, d'environ 200 à 300 lm, d'environ 300 à 400 lm, d'environ 400 à 500 lm, d'environ 500 à 600 lm, d'environ 600 à 700 iam, d'environ 700 à
800 lm, d'environ 800 à 900 lm, d'environ 900 à 1000 lm, et/ou = les billes de verre ont une masse unitaire d'environ 10 ng à environ 2 mg, notamment d'environ 10 à 50 ng, d'environ 50 à 100 ng, d'environ 100 à 200 ng, d'environ 200 à 500 ng, d'environ 500 ng à 1 lag, d'environ 1 à 5 lag, d'environ 5 à 10 lag, d'environ 10 à 20 lag, d'environ 20 à 50 lag, d'environ 50 à 100 lag, d'environ 100 à 200 lag, d'environ 200 à 500 lag, d'environ 500 lag à 1 mg, d'environ 1 à 1,5 mg, d'environ 1,5 à 2 mg.
9 Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif dans lequel la masse moléculaire du polyéthylèneimine adsorbé est comprise de 0,6 à 2000 kDa, notamment d'environ 0,6 à 1,3 kDa, d'environ 1,3 à 10 kDa, d'environ 10 à 25 kDa, d'environ 25 à 100 kDa, d'environ 100 à 250 kDa, d'environ 250 à 500 kDa, 500 à 1000 kDa, d'environ 1000 à 1500 kDa, d'environ 1000 à 2000 kDa.
Par masse moléculaire on entend la masse moléculaire en masse (Mw).
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif dans lequel le polyéthylèneimine adsorbé est linéaire ou ramifié, notamment ramifié.
Au sens de la présente invention, on entend par ramifié un polymère dans lequel l'enchainement des motifs monomères présente des ramifications.
Au sens de la présente invention, on entend par linéaire un polymère dans lequel l'enchainement des motifs monomères se fait de façon linéaire.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel la masse totale des billes de verre est d'environ 10 mg à environ 1 kg, notamment d'environ 10 à 50 mg, d'environ 50 à 100 mg, d'environ 100 à 200 mg, d'environ 200 à
500 mg, d'environ 500 mg à 1 g, d'environ 1 à 2 g, d'environ 2 à 5 g, d'environ 5 à 10 g, d'environ 10 à 50 g, d'environ 50 à 100 g, d'environ 100 à 200 g, d'environ 200 à 500 g, d'environ 500 g à 1 kg.
L'une des premières applications du procédé est l'élimination de micro-organismes : grâce à la captation, l'échantillon est déplété des microorganismes initialement présents.
Une seconde application envisagée est le diagnostic : la captation est alors utilisée comme un moyen pour concentrer les microorganismes en vue d'un diagnostic. Ce dernier peut être qualitatif, de type présence/absence, ou quantitatif. Il peut être spécifique ou non du type de microorganisme, et différencier ou non les cellules vivantes des cellules mortes. L'analyse des microorganismes captés peut se faire directement après captation sur billes. Ces tests peuvent être par exemple basés sur la détection de la cellule entière ou de la détection/quantification d'un de ses constituants (ADN, ARN, ATP, enzymes et leurs activités ou plus largement les protéines...). Pour ce faire, il est possible d'éluer les microorganismes captés sur les billes, éventuellement suivi d'une étape de lyse, ou alors, d'effectuer la lyse sur les microorganismes toujours captés sur les billes, puis d'éluer les constituants libérés des cellules. Ensuite, une multitude de techniques sont utilisables, parmi lesquelles la cytométrie en flux ou en phase solide, la colorimétrie, la spectroscopie, la microscopie, l'ATPmétrie (ATP : Adénosine triphosphate), la PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase), la RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse), l'amplification isothermale ou encore la détection immunologique.
5 Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel le récipient creux est sous forme d'un tube, d'un flacon d'un bécher ou d'un pot.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que
Par masse moléculaire on entend la masse moléculaire en masse (Mw).
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif dans lequel le polyéthylèneimine adsorbé est linéaire ou ramifié, notamment ramifié.
Au sens de la présente invention, on entend par ramifié un polymère dans lequel l'enchainement des motifs monomères présente des ramifications.
Au sens de la présente invention, on entend par linéaire un polymère dans lequel l'enchainement des motifs monomères se fait de façon linéaire.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel la masse totale des billes de verre est d'environ 10 mg à environ 1 kg, notamment d'environ 10 à 50 mg, d'environ 50 à 100 mg, d'environ 100 à 200 mg, d'environ 200 à
500 mg, d'environ 500 mg à 1 g, d'environ 1 à 2 g, d'environ 2 à 5 g, d'environ 5 à 10 g, d'environ 10 à 50 g, d'environ 50 à 100 g, d'environ 100 à 200 g, d'environ 200 à 500 g, d'environ 500 g à 1 kg.
L'une des premières applications du procédé est l'élimination de micro-organismes : grâce à la captation, l'échantillon est déplété des microorganismes initialement présents.
Une seconde application envisagée est le diagnostic : la captation est alors utilisée comme un moyen pour concentrer les microorganismes en vue d'un diagnostic. Ce dernier peut être qualitatif, de type présence/absence, ou quantitatif. Il peut être spécifique ou non du type de microorganisme, et différencier ou non les cellules vivantes des cellules mortes. L'analyse des microorganismes captés peut se faire directement après captation sur billes. Ces tests peuvent être par exemple basés sur la détection de la cellule entière ou de la détection/quantification d'un de ses constituants (ADN, ARN, ATP, enzymes et leurs activités ou plus largement les protéines...). Pour ce faire, il est possible d'éluer les microorganismes captés sur les billes, éventuellement suivi d'une étape de lyse, ou alors, d'effectuer la lyse sur les microorganismes toujours captés sur les billes, puis d'éluer les constituants libérés des cellules. Ensuite, une multitude de techniques sont utilisables, parmi lesquelles la cytométrie en flux ou en phase solide, la colorimétrie, la spectroscopie, la microscopie, l'ATPmétrie (ATP : Adénosine triphosphate), la PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase), la RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse), l'amplification isothermale ou encore la détection immunologique.
5 Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel le récipient creux est sous forme d'un tube, d'un flacon d'un bécher ou d'un pot.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que
10 décrit ci-dessus, dans lequel le récipient creux est sous forme de colonne comprenant de façon optionnelle un fritté.
Au sens de la présente invention, lorsque la colonne comprend un fritté, la colonne et le fritté peuvent être deux éléments d'un même ensemble, ou deux éléments séparés pouvant être assemblés.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel la colonne a un volume d'environ 0,5 mL à
environ 2 L, notamment d'environ 0,1 à 1 mL, d'environ 1 à 2 ml, d'environ 2 à 5 mL, d'environ 5 à 10 mL, d'environ 10 à 50 mL, d'environ 50 à 100 mL, d'environ 100 à 200 mL, d'environ 200 à 500 mL, d'environ 500 mL à 1 L, d'environ 1 L à 2 L, et le fritté a une porosité inférieure à la taille des billes de verre utilisées.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel le récipient creux est sous forme d'un tube, d'un flacon d'un bécher ou d'un pot, ledit récipient creux étant notamment sous forme de colonne comprenant de façon optionnelle un fritté, ladite colonne ayant notamment un d'environ 0,5 mL à
environ 2 L et le fritté
ayant notamment une porosité inférieure à la taille des billes de verre utilisées.
La taille de la colonne est choisie en fonction de la masse totale des billes, ainsi que les quantités des solutions utilisées (solutions de polyéthylèneimine, solutions de captation et solutions d'élution). Une quantité plus importante de billes nécessite une colonne de taille plus élevée, que l'Homme du Métier peut choisir.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont un diamètre d'environ 20 à environ 1000 lm, et une masse d'environ 10 ng à environ 2 mg, dans lequel le verre est de type sodocalcique ou borosilicate, fonctionnalisé par du polyéthylèneimine adsorbée à sa surface, dans lequel le polyéthylèneimine à une masse moléculaire comprise de 0,6 et 2000 kDa, dans lequel le polyéthylèneimine est ramifié ou
Au sens de la présente invention, lorsque la colonne comprend un fritté, la colonne et le fritté peuvent être deux éléments d'un même ensemble, ou deux éléments séparés pouvant être assemblés.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel la colonne a un volume d'environ 0,5 mL à
environ 2 L, notamment d'environ 0,1 à 1 mL, d'environ 1 à 2 ml, d'environ 2 à 5 mL, d'environ 5 à 10 mL, d'environ 10 à 50 mL, d'environ 50 à 100 mL, d'environ 100 à 200 mL, d'environ 200 à 500 mL, d'environ 500 mL à 1 L, d'environ 1 L à 2 L, et le fritté a une porosité inférieure à la taille des billes de verre utilisées.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel le récipient creux est sous forme d'un tube, d'un flacon d'un bécher ou d'un pot, ledit récipient creux étant notamment sous forme de colonne comprenant de façon optionnelle un fritté, ladite colonne ayant notamment un d'environ 0,5 mL à
environ 2 L et le fritté
ayant notamment une porosité inférieure à la taille des billes de verre utilisées.
La taille de la colonne est choisie en fonction de la masse totale des billes, ainsi que les quantités des solutions utilisées (solutions de polyéthylèneimine, solutions de captation et solutions d'élution). Une quantité plus importante de billes nécessite une colonne de taille plus élevée, que l'Homme du Métier peut choisir.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont un diamètre d'environ 20 à environ 1000 lm, et une masse d'environ 10 ng à environ 2 mg, dans lequel le verre est de type sodocalcique ou borosilicate, fonctionnalisé par du polyéthylèneimine adsorbée à sa surface, dans lequel le polyéthylèneimine à une masse moléculaire comprise de 0,6 et 2000 kDa, dans lequel le polyéthylèneimine est ramifié ou
11 linéaire, dans lequel le contenant est sous forme d'un tube, d'un flacon, d'un bécher, d'un pot ou d'une colonne comprenant de façon optionnelle un fritté, dans lequel la colonne a un volume comprise de 0,5 ml à 2 L, et le fritté a une porosité inférieure à la taille des billes de verre utilisées et dans lequel le poids total des billes est compris de 10 mg à 1 kg.
Un second objet de l'invention est un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de mise en contact du polyéthylèneimine avec une bille de verre pour obtenir une bille de verre non poreuse fonctionnalisée par du polyéthylèneimine adsorbé à sa surface.
L'adsorption consiste à mettre en contact une solution aqueuse de polyéthylèneimine à une concentration comprise de 0,1% à 5% (pourcentages massiques) avec la surface de la bille de verre pendant une durée moyenne de 5 à 10 minutes, notamment d'une dizaine de minutes. Un rinçage par de l'eau permet néanmoins d'éliminer le polyéthylèneimine excédentaire, de diminuer la mortalité
induite et d'améliorer une éventuelle élution des microorganismes.
Un séchage est ensuite réalisé à l'air libre ou accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide, ou par lyophilisation. Le temps de séchage peut ainsi être réduit à une dizaine de minutes.
A l'issue de ces différentes étapes, les billes sont fonctionnalisées et prêtes à l'emploi.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une bille de verre pour une durée de 1 minute à 24 heures, notamment de 1 à 5 minutes, de 5 à 10 minutes, de 10 à 15 minutes, de 15 à
20 minutes, de 20 à 25 minutes, de 25 à 30 minutes, de 30 minutes à 1 heure, de 1 à 2 heures, de 2 à 5 heures, de 5 à 10 heures, de 10 à 24 heures, de préférence de 10 minutes à 24 heures, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine adsorbé.
Lorsque le temps de contact est inférieur à 1 minute, la fonctionnalisation des billes de verre n'est pas toujours adéquate. Le temps de contact augmente en fonction de la masse totale des billes à
fonctionnaliser. A titre d'exemple, pour la fonctionnalisation de 300 mg de billes, un temps de fonctionnalisation de 5 minutes peut suffire, tandis-que pour la fonctionnalisation de 1 g de billes, un temps de contact de 10 minutes et préconisé.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel la solution de polyéthylèneimine est à une concentration de 0,1 et 5%, notamment de 0,1 à 0,5%, de 0,5 à
Un second objet de l'invention est un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de mise en contact du polyéthylèneimine avec une bille de verre pour obtenir une bille de verre non poreuse fonctionnalisée par du polyéthylèneimine adsorbé à sa surface.
L'adsorption consiste à mettre en contact une solution aqueuse de polyéthylèneimine à une concentration comprise de 0,1% à 5% (pourcentages massiques) avec la surface de la bille de verre pendant une durée moyenne de 5 à 10 minutes, notamment d'une dizaine de minutes. Un rinçage par de l'eau permet néanmoins d'éliminer le polyéthylèneimine excédentaire, de diminuer la mortalité
induite et d'améliorer une éventuelle élution des microorganismes.
Un séchage est ensuite réalisé à l'air libre ou accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide, ou par lyophilisation. Le temps de séchage peut ainsi être réduit à une dizaine de minutes.
A l'issue de ces différentes étapes, les billes sont fonctionnalisées et prêtes à l'emploi.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une bille de verre pour une durée de 1 minute à 24 heures, notamment de 1 à 5 minutes, de 5 à 10 minutes, de 10 à 15 minutes, de 15 à
20 minutes, de 20 à 25 minutes, de 25 à 30 minutes, de 30 minutes à 1 heure, de 1 à 2 heures, de 2 à 5 heures, de 5 à 10 heures, de 10 à 24 heures, de préférence de 10 minutes à 24 heures, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine adsorbé.
Lorsque le temps de contact est inférieur à 1 minute, la fonctionnalisation des billes de verre n'est pas toujours adéquate. Le temps de contact augmente en fonction de la masse totale des billes à
fonctionnaliser. A titre d'exemple, pour la fonctionnalisation de 300 mg de billes, un temps de fonctionnalisation de 5 minutes peut suffire, tandis-que pour la fonctionnalisation de 1 g de billes, un temps de contact de 10 minutes et préconisé.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel la solution de polyéthylèneimine est à une concentration de 0,1 et 5%, notamment de 0,1 à 0,5%, de 0,5 à
12 1%, de 1 à 2%, de 2 à 3%, de 3 à 4%, de 4 à 5% pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel le volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est compris de 4 1.1.1 à
environ 0,5 L, notamment d'environ 4 à 25 1.1.1, d'environ 25 à 50 1.1.1, d'environ 50 à 100 1.1.1, d'environ 100 à 250 1.1.1, d'environ 250 à 500 1.1.1, d'environ 5000 à 1 ml, d'environ 1 à 2,5 ml, d'environ 2,5 à
5 ml, d'environ 5 à 25 ml, d'environ 25 à 50 ml, d'environ 50 à 100 ml, d'environ 100 à 250 ml, d'environ 250 ml à 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de mise en contact du polyéthylèneimine avec une bille de verre, notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de polyéthylèneimine est notamment à une concentration entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est notamment compris de 4 à 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
La concentration et le volume de la solution de polyéthylèneimine à utiliser sont dépendants de la surface totale des billes à fonctionnaliser. Il est possible de calculer ladite surface à partir de de la masse totale, la taille et la densité des billes utilisées.
= La surface par bille peut être calculée avec la formule 47rr2 (r étant le rayon de la bille) = Le volume par bille peut être calculé avec la formule (4/3)7rr3 (r étant le rayon de la bille) = Le volume total des billes peut être calculé en divisant la masse totale des billes par la densité
= Le nombre de billes peut être calculé en divisant le volume total des billes par le volume par bille = Enfin, la surface totale des billes est obtenue par la multiplication de la surface par bille et le nombre de billes Une surface totale plus élevée nécessite l'utilisation d'une quantité plus importante de polyéthylèneimine. Cette quantité plus importante peut être apportée par l'utilisation d'un volume de solution plus important, l'utilisation d'une solution plus concentrée, ou une combinaison des deux.
A titre d'exemple, il est possible d'utiliser 0.5 ml d'une solution à 0.16 %
de polyéthylèneimine afin de fonctionnaliser 1 g de billes de 105-150 !_tm (exemple 12). Dans ce cas, la surface totale des billes est d'environ 188 cm2(lesdites billes ayant une densité des billes de 2.50 g/cm3).
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel le volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est compris de 4 1.1.1 à
environ 0,5 L, notamment d'environ 4 à 25 1.1.1, d'environ 25 à 50 1.1.1, d'environ 50 à 100 1.1.1, d'environ 100 à 250 1.1.1, d'environ 250 à 500 1.1.1, d'environ 5000 à 1 ml, d'environ 1 à 2,5 ml, d'environ 2,5 à
5 ml, d'environ 5 à 25 ml, d'environ 25 à 50 ml, d'environ 50 à 100 ml, d'environ 100 à 250 ml, d'environ 250 ml à 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de mise en contact du polyéthylèneimine avec une bille de verre, notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de polyéthylèneimine est notamment à une concentration entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est notamment compris de 4 à 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
La concentration et le volume de la solution de polyéthylèneimine à utiliser sont dépendants de la surface totale des billes à fonctionnaliser. Il est possible de calculer ladite surface à partir de de la masse totale, la taille et la densité des billes utilisées.
= La surface par bille peut être calculée avec la formule 47rr2 (r étant le rayon de la bille) = Le volume par bille peut être calculé avec la formule (4/3)7rr3 (r étant le rayon de la bille) = Le volume total des billes peut être calculé en divisant la masse totale des billes par la densité
= Le nombre de billes peut être calculé en divisant le volume total des billes par le volume par bille = Enfin, la surface totale des billes est obtenue par la multiplication de la surface par bille et le nombre de billes Une surface totale plus élevée nécessite l'utilisation d'une quantité plus importante de polyéthylèneimine. Cette quantité plus importante peut être apportée par l'utilisation d'un volume de solution plus important, l'utilisation d'une solution plus concentrée, ou une combinaison des deux.
A titre d'exemple, il est possible d'utiliser 0.5 ml d'une solution à 0.16 %
de polyéthylèneimine afin de fonctionnaliser 1 g de billes de 105-150 !_tm (exemple 12). Dans ce cas, la surface totale des billes est d'environ 188 cm2(lesdites billes ayant une densité des billes de 2.50 g/cm3).
13 En revanche, 1 g de billes de 30-50 !,tm ont une surface calculée plus importante (600 cm2). Dans ces conditions, en utilisant également une concentration en polyéthylèneiminde de 0.16%, environ 3,2 fois plus de solution (600/188) est nécessaire afin d'effectuer la fonctionnalisation dans les mêmes conditions que précédemment.
Il est également possible d'utiliser 0.5 ml d'une solution 3,2 fois plus concentrée, ou de modifier la concentration et le volume en appliquant une règle de trois.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, notamment de 1 à 5 minutes, de 5 à 10 minutes, de 10 à 15 minutes, de 15 à 20 minutes, de 20 à 25 minutes, de 25 à
30 minutes, de 30 minutes à 1 heure, de 1 à 2 heures, de 2 à 5 heures, de 5 à 12 heures, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
Selon un autre mode de réalisation encore plus particulier, la présente invention concerne un procédé
de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage pour une durée d'environ 10 minutes, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine adsorbé.
.. Le temps de séchage d'environ 10 min correspond à la durée de l'étape de séchage lorsque ce dernier est accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide avec la dépression réglée sur son maximum (-900 mbar au manomètre avant ouverture de la vanne).
Lorsque le séchage est réalisé à l'air libre, le temps de séchage est plus long et peut atteindre environ 12 heures.
Au sens de la présente invention, on entend par séchage une méthode de séchage à l'air libre ou accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide, ou par lyophilisation.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou accélérée par flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90 C, notamment de la température ambiante à 80 C, de température ambiante à 60 C, de température ambiante à 30 C, de 30 C à 40 C, de 40 C à 50 C et de 50 C à 60 C, ou de 60 C à 90 C, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
.. Au sens de la présente invention, on entend par température ambiante , une température allant d'environ 20 C à environ 25 C.
Il est également possible d'utiliser 0.5 ml d'une solution 3,2 fois plus concentrée, ou de modifier la concentration et le volume en appliquant une règle de trois.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, notamment de 1 à 5 minutes, de 5 à 10 minutes, de 10 à 15 minutes, de 15 à 20 minutes, de 20 à 25 minutes, de 25 à
30 minutes, de 30 minutes à 1 heure, de 1 à 2 heures, de 2 à 5 heures, de 5 à 12 heures, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
Selon un autre mode de réalisation encore plus particulier, la présente invention concerne un procédé
de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage pour une durée d'environ 10 minutes, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine adsorbé.
.. Le temps de séchage d'environ 10 min correspond à la durée de l'étape de séchage lorsque ce dernier est accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide avec la dépression réglée sur son maximum (-900 mbar au manomètre avant ouverture de la vanne).
Lorsque le séchage est réalisé à l'air libre, le temps de séchage est plus long et peut atteindre environ 12 heures.
Au sens de la présente invention, on entend par séchage une méthode de séchage à l'air libre ou accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide, ou par lyophilisation.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou accélérée par flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90 C, notamment de la température ambiante à 80 C, de température ambiante à 60 C, de température ambiante à 30 C, de 30 C à 40 C, de 40 C à 50 C et de 50 C à 60 C, ou de 60 C à 90 C, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
.. Au sens de la présente invention, on entend par température ambiante , une température allant d'environ 20 C à environ 25 C.
14 Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de rinçage avec une solution aqueuse, notamment de l'eau, préalable à l'étape de séchage, pour éliminer le polyéthylèneimine non adsorbée lors de l'étape de mise en contact.
Au sens de la présente invention, on entend par solution aqueuse une phase liquide contenant de l'eau. Des exemples de solution aqueuses pouvant être utilisées sont l'eau, des solutions aqueuses de NaCl 1M ou de Tris 50 mM.
L'objectif pendant le rinçage peut être de diminuer le pH à l'aide d'une solution acide afin de maximiser les charges positives à la surface du polyéthylèneimine; il est possible dans ce cas d'utiliser des acides tels que l'acide citrique ou l'acide acétique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
- une étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une bille de verre notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de polyéthylèneimine est notamment à une concentration entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est notamment compris de 4 .il à 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine;
une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou accélérée par flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90 C
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage d'une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
- une étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une bille de verre notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de polyéthylèneimine est notamment à une concentration entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est notamment compris de 4 .il à 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine;
- une étape de rinçage avec une solution aqueuse, notamment de l'eau, pour éliminer le polyéthylèneimine non adsorbée lors de l'étape de mise en contact ;
- une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou accélérée par flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90 C.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage d'une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
- une étape de rinçage et de séchage des billes de verres avec de l'eau ;
- une étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une bille de verre notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de
Au sens de la présente invention, on entend par solution aqueuse une phase liquide contenant de l'eau. Des exemples de solution aqueuses pouvant être utilisées sont l'eau, des solutions aqueuses de NaCl 1M ou de Tris 50 mM.
L'objectif pendant le rinçage peut être de diminuer le pH à l'aide d'une solution acide afin de maximiser les charges positives à la surface du polyéthylèneimine; il est possible dans ce cas d'utiliser des acides tels que l'acide citrique ou l'acide acétique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
- une étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une bille de verre notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de polyéthylèneimine est notamment à une concentration entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est notamment compris de 4 .il à 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine;
une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou accélérée par flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90 C
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage d'une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
- une étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une bille de verre notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de polyéthylèneimine est notamment à une concentration entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est notamment compris de 4 .il à 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine;
- une étape de rinçage avec une solution aqueuse, notamment de l'eau, pour éliminer le polyéthylèneimine non adsorbée lors de l'étape de mise en contact ;
- une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou accélérée par flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90 C.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage d'une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
- une étape de rinçage et de séchage des billes de verres avec de l'eau ;
- une étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une bille de verre notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de
15 polyéthylèneimine est notamment à une concentration entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est notamment compris de 4 .il à 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine;
- une étape de rinçage avec une solution aqueuse, notamment de l'eau, pour éliminer le polyéthylèneimine non adsorbée lors de l'étape de mise en contact ;
- une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou accélérée par flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90 C.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage d'une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel ladite solution de polyéthylèneimine est exempte de borate.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel un agent de réticulation du polyéthylèneimine n'est pas introduit.
- une étape de rinçage avec une solution aqueuse, notamment de l'eau, pour éliminer le polyéthylèneimine non adsorbée lors de l'étape de mise en contact ;
- une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou accélérée par flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90 C.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage d'une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel ladite solution de polyéthylèneimine est exempte de borate.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-dessus, dans lequel un agent de réticulation du polyéthylèneimine n'est pas introduit.
16 Un troisième objet de l'invention est l'utilisation d'un dispositif tel que décrit ci-dessus, pour la captation de micro-organismes en vue d'un diagnostic.
Au sens de la présente invention, on entend par micro-organismes des organismes microscopiques vivants ou morts. Des exemples de micro-organismes pouvant être captés sont les bactéries, les levures, les champignons, les virus, les archées, les micro-algues, et certains parasites microscopiques.
Au sens de la présente invention, on entend par diagnostic la détection des micro-organismes captés.
Des exemples de techniques de diagnostic pouvant être utilisées sont notamment la cytométrie en flux ou en phase solide, la colorimétrie, la spectroscopie, la microscopie, l'ATPmétrie (ATP : Adénosine triphosphate), la PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase), la RT-PCR
(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse), l'amplification isothermale, ou la détection immunologique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une utilisation telle que décrite ci-dessus, pour la captation de micro-organismes en vue de l'élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d'échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Au sens de la présente invention, on entend par élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes l'action de diminuer la quantité de micro-organismes présents dans un échantillon.
Un autre objet de l'invention est un procédé de captation de micro-organismes comprenant une étape de mise en contact d'un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans des conditions permettant de créer une interaction entre les dits micro-organismes et les billes de verre, et d'obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'étape de mise en contact d'un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes est réalisée en un seul passage dans le dispositif selon l'invention et n'est pas effectuée de façon itérative.
Un seul passage dans le dispositif selon l'invention permet de capter quantitativement l'ensemble des -- microorganismes présents dans ledit échantillon liquide ou visqueux. Par exemple, il n'est pas nécessaire de faire de multiples passages de l'échantillon liquide ou visqueux dans une colonne
Au sens de la présente invention, on entend par micro-organismes des organismes microscopiques vivants ou morts. Des exemples de micro-organismes pouvant être captés sont les bactéries, les levures, les champignons, les virus, les archées, les micro-algues, et certains parasites microscopiques.
Au sens de la présente invention, on entend par diagnostic la détection des micro-organismes captés.
Des exemples de techniques de diagnostic pouvant être utilisées sont notamment la cytométrie en flux ou en phase solide, la colorimétrie, la spectroscopie, la microscopie, l'ATPmétrie (ATP : Adénosine triphosphate), la PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase), la RT-PCR
(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse), l'amplification isothermale, ou la détection immunologique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une utilisation telle que décrite ci-dessus, pour la captation de micro-organismes en vue de l'élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d'échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Au sens de la présente invention, on entend par élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes l'action de diminuer la quantité de micro-organismes présents dans un échantillon.
Un autre objet de l'invention est un procédé de captation de micro-organismes comprenant une étape de mise en contact d'un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec un dispositif tel que décrit ci-dessus, dans des conditions permettant de créer une interaction entre les dits micro-organismes et les billes de verre, et d'obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'étape de mise en contact d'un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes est réalisée en un seul passage dans le dispositif selon l'invention et n'est pas effectuée de façon itérative.
Un seul passage dans le dispositif selon l'invention permet de capter quantitativement l'ensemble des -- microorganismes présents dans ledit échantillon liquide ou visqueux. Par exemple, il n'est pas nécessaire de faire de multiples passages de l'échantillon liquide ou visqueux dans une colonne
17 contenant les billes de verre fonctionnalisées pour capter ou concentrer les microorganismes dans la colonne.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de l'échantillon et captés sur les billes de verre est comprise de 0,001% à 100% en vue de la débactérisation dudit échantillon.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, comportant une étape supplémentaire d'élution des micro-organismes précédemment captés dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des susdites billes de verre et la récupération des dits micro-organismes.
L'élution avec une solution chimique est réalisée à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel lors de l'étape d'élution la proportion des micro-organismes séparés des billes de verre sur lesquelles les susdits micro-organismes avaient été précédemment captés, puis récupérés est comprise de 0,001% à 100%.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel la récupération des micro-organismes est effectuée en vue d'un diagnostic.
Ce diagnostic peut être qualitatif, de type présence/absence, ou quantitatif.
Il peut être spécifique ou non du type de microorganisme, et différencier ou non les cellules vivantes des cellules mortes.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit précédemment, comprenant :
- une étape de mise en contact, de préférence non itérative, d'un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec des billes de verre contenues dans le dispositif décrit ci-dessus, dans des conditions permettant de créer une interaction entre les dits micro-organismes et les billes de verre, et d'obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre, - une étape supplémentaire d'élution des micro-organismes précédemment captés dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des susdites billes de verre et la récupération des dits micro-organismes.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'étape d'élution est réalisée en utilisant une solution de type chimique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de l'échantillon et captés sur les billes de verre est comprise de 0,001% à 100% en vue de la débactérisation dudit échantillon.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, comportant une étape supplémentaire d'élution des micro-organismes précédemment captés dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des susdites billes de verre et la récupération des dits micro-organismes.
L'élution avec une solution chimique est réalisée à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel lors de l'étape d'élution la proportion des micro-organismes séparés des billes de verre sur lesquelles les susdits micro-organismes avaient été précédemment captés, puis récupérés est comprise de 0,001% à 100%.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel la récupération des micro-organismes est effectuée en vue d'un diagnostic.
Ce diagnostic peut être qualitatif, de type présence/absence, ou quantitatif.
Il peut être spécifique ou non du type de microorganisme, et différencier ou non les cellules vivantes des cellules mortes.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit précédemment, comprenant :
- une étape de mise en contact, de préférence non itérative, d'un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec des billes de verre contenues dans le dispositif décrit ci-dessus, dans des conditions permettant de créer une interaction entre les dits micro-organismes et les billes de verre, et d'obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre, - une étape supplémentaire d'élution des micro-organismes précédemment captés dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des susdites billes de verre et la récupération des dits micro-organismes.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'étape d'élution est réalisée en utilisant une solution de type chimique.
18 Au sens de la présente invention, les solutions d'élution de type chimique pouvant être utilisées sont par exemples : NaCl 1M, Tris 50mM pH 7,5, Tris 50mM pH 9,5, sodium hexametaphosphate 0,01% à
0,1% EDTA 0,1 à 10%, bicarbonate de soude 1%, citrate de sodium 10%, acide acétique 0,1 à 10%, méthanol 0,1 à 10%, pluronic F-127 0,01 à 0,1% (poloxamère 407, copolymère non-ioniques à trois .. blocs : Poly(éthylène glycol)-block-poly(propylène glycol)-block-poly(éthylène glycol)).
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel la mise en contact de l'échantillon avec les billes de verre ou le dispositif a lieu de façon statique ou en flux.
Au sens de la présente invention, on entend par de façon statique , le fait que la mise en contact entre l'échantillon et les billes de verre a lieu dans un récipient sans qu'il y ait un mouvement continu de l'échantillon et que l'échantillon ne soit renouvelé au cours de la mise en contact. La mise en contact de façon statique nécessite qu'à la fin du temps de contact l'échantillon soit séparé des billes de verre. Cette étape peut par exemple se réaliser par aspiration du liquide à
travers un fritté ou par prélèvement du liquide.
Lorsque le procédé de captation est réalisé en statique, l'étape de mise en contact de l'échantillon contenant les micro-organismes avec des billes de verre est réalisée sur une durée de 5 à 15 minutes avant que l'aspiration ne soit déclenchée et réalisée à l'aide de la chambre à
vide.
Au sens de la présente invention, on entend par en flux , le fait que la mise en contact entre l'échantillon et les billes de verre ait lieu dans un récipient permettant de faire s'écouler de façon continue l'échantillon entre les billes de verre.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les micro-organismes sont choisis parmi les bactéries, et les Fungi, notamment les levures et les champignons.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les Fungi appartiennent aux genres Absidia, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Brettanomyces, Byssochlamys, Candida, Chaetomium, Cladosporium, Colle totrichum, Cryptococcus, Debaryomyces, Emericella, Epicoccum, Eupenicillium, Eurotium, Fusarium, Galactomyces, Geotrichum, Gliocladium, Hanseniaspora, Humicola, Hyphopichia, Kluyveromyces, Lichtheimia, Lodderomyces, Meyerozyma, Monascus, Mucor, Mycocladus, Neosartorya, Nigrospora, Paecilomyces, Penicillium, Pestalotia, Phoma, Phytophthora, Pichia, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Sclerotinia, Scopulariopsis, Serpula, Stemphylium Talaromyces, Thielaviopsis,
0,1% EDTA 0,1 à 10%, bicarbonate de soude 1%, citrate de sodium 10%, acide acétique 0,1 à 10%, méthanol 0,1 à 10%, pluronic F-127 0,01 à 0,1% (poloxamère 407, copolymère non-ioniques à trois .. blocs : Poly(éthylène glycol)-block-poly(propylène glycol)-block-poly(éthylène glycol)).
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel la mise en contact de l'échantillon avec les billes de verre ou le dispositif a lieu de façon statique ou en flux.
Au sens de la présente invention, on entend par de façon statique , le fait que la mise en contact entre l'échantillon et les billes de verre a lieu dans un récipient sans qu'il y ait un mouvement continu de l'échantillon et que l'échantillon ne soit renouvelé au cours de la mise en contact. La mise en contact de façon statique nécessite qu'à la fin du temps de contact l'échantillon soit séparé des billes de verre. Cette étape peut par exemple se réaliser par aspiration du liquide à
travers un fritté ou par prélèvement du liquide.
Lorsque le procédé de captation est réalisé en statique, l'étape de mise en contact de l'échantillon contenant les micro-organismes avec des billes de verre est réalisée sur une durée de 5 à 15 minutes avant que l'aspiration ne soit déclenchée et réalisée à l'aide de la chambre à
vide.
Au sens de la présente invention, on entend par en flux , le fait que la mise en contact entre l'échantillon et les billes de verre ait lieu dans un récipient permettant de faire s'écouler de façon continue l'échantillon entre les billes de verre.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les micro-organismes sont choisis parmi les bactéries, et les Fungi, notamment les levures et les champignons.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les Fungi appartiennent aux genres Absidia, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Brettanomyces, Byssochlamys, Candida, Chaetomium, Cladosporium, Colle totrichum, Cryptococcus, Debaryomyces, Emericella, Epicoccum, Eupenicillium, Eurotium, Fusarium, Galactomyces, Geotrichum, Gliocladium, Hanseniaspora, Humicola, Hyphopichia, Kluyveromyces, Lichtheimia, Lodderomyces, Meyerozyma, Monascus, Mucor, Mycocladus, Neosartorya, Nigrospora, Paecilomyces, Penicillium, Pestalotia, Phoma, Phytophthora, Pichia, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Sclerotinia, Scopulariopsis, Serpula, Stemphylium Talaromyces, Thielaviopsis,
19 Torulaspora, Tri choderma, Tri chosporon, Trichothetium, Ulocladium, Verticillium, Wallemia, Wickerhamomyces, Xylaria, Zygosaccharomyces.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries sont des bactéries Gram + ou Gram ¨.
Les bactéries Gram + sont mises en évidence par la technique de coloration de Gram. Après coloration, lesdites bactéries apparaissent en couleur mauve lors d'une analyse microscopique. En revanche, les bactéries Gram ¨ ne sont pas colorées en mauve à l'issue du test de coloration de Gram.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries appartiennent aux genres Acetobacter, Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes, Alicyclobacillus, Aquaspirillum, Asaia, Bacillus, Bifidobacterium sp., Borde tella, Brachybacterium, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Burkholderia, Buttiauxella, Campylobacter, Carnobacterium, Cellulomona, Citrobacter, Clavibacter Clos tridium, Corynebacterium, Cronobacte, Cupriavidu, Curtobacterium, Elizabethkingia, Enteractinococcus, Enterobacter, Enterococcus, Escheri chia, Flacklamia, Flavobacterium, Geobacillus, Glutamicibacte, Halobacillus, Klebsiella, Kocuria, Lactobacillus, Lactococcus, Leclercia, Lelliottia, Leuconos toc, Lysinibacillus, Macrococcus, Methylobacteriu, Microbacterium spp. (CDC A-5), Micrococcus, Moraxell, Mycobacterium, Nesterenkonia, Oceanobacillus sp, Ochrobactrum, Paenibacillus, Pandorae, Pan toea, Paracoccus, Pas teurell, Pediococcus, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Roseomona, Rothia, Salmonella, Sanguibacter, Serratia, Shewanella, Sphingomonas, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Thermoanaerobacterium, Variovorax, Virgibacillus Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'échantillon liquide ou visqueux est choisi parmi :
- un échantillon biologique, humain ou vétérinaire, tel que l'urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses, - un échantillon pharmaceutique, tel que les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques, - un échantillon cosmétique, tel que les démaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings, - un échantillon alimentaire, tel que les boissons, notamment l'eau (plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, tel que le jus d'orange, les sodas, les boissons alcoolisées, les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits laitiers, les ovoproduits, - Un échantillon d'eaux de process, tel qu'un échantillon issu des boucles de nettoyage, de l'eau 5 de production, - Un échantillon de type environnemental, tel que des échantillons marins, ou pluviaux.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique , un échantillon provenant d'un liquide corporel ou d'un tissu d'un corps humain ou animal.
10 Des exemples d'échantillons biologiques pouvant être utilisées sont l'urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon pharmaceutique , un échantillon provenant d'un produit pharmaceutique contenant des substances chimiques, naturelles ou 15 synthétiques à usage humain ou vétérinaire.
Des exemples d'échantillons pharmaceutiques pouvant être utilisés sont les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques, les solutions nasales, les compléments de vaccination rendus liquide, les poudres rendues liquide.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon cosmétique , un échantillon provenant d'un produit cosmétique contenant une substance ou un mélange destiné à être mise en contact avec les diverses parties superficielles du corps humain, en vue, exclusivement ou principalement, de les nettoyer, de les parfumer, d'en modifier l'aspect, de les protéger, de les maintenir en bon état ou de corriger les odeurs corporelles.
Des exemples d'échantillons cosmétiques pouvant être utilisés sont les démaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings, lotions démaquillantes, crèmes, émulsions, savons, agents de nettoyage.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon alimentaire , un échantillon provenant d'un produit alimentaire pouvant servir de nourriture ou de boisson à un être humain ou animal.
Des exemples d'échantillons alimentaires pouvant être utilisés sont les boissons, notamment l'eau (plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, les sodas, les boissons alcoolisées, les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits laitiers, les ovoproduits, la charcuterie, les poissons, les oeufs, les soupes, les concentrés de fruits.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon d'eaux de process , un échantillon provenant d'une usine de production, notamment un échantillon d'eau entrant dans un procédé de production. Des exemples d'échantillons d'eaux de process pouvant être utilisés sont des échantillons issu des boucles de nettoyage, de l'eau de production, une tour de lavage, une tour aéroréfrigérante.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon de type environnemental , un échantillon provenant de l'environnement. Des exemples d'échantillons de type environnementaux sont pouvant être utilisés sont des échantillons de sols, d'eau, notamment d'eau de mer, rivière, fleuve.
Un autre objet de l'invention est un kit comprenant des billes de verre, du polyéthylèneimine et un dispositif sous forme de colonne et des solutions d'élution de type chimique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un kit comprenant des billes de verre, du polyéthylèneimine et un dispositif sous forme de colonne et des solutions d'élution de type chimique, pour la captation de micro-organismes en vue d'un diagnostic, ou en vue de l'élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d'échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un kit comprenant des billes de verre, du polyéthylèneimine et un dispositif sous forme de colonne pour son utilisation pour mettre en oeuvre le dispositif selon l'invention et des solutions d'élution de type chimique, pour la captation de micro-organismes en vue d'un diagnostic, ou en vue de l'élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d'échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Description des figures [Fig 1A] Figure lA : Principe général de fonctionnement de captation/élimination des microorganismes en mode flux La Figure lA représente le principe général de fonctionnement de la captation/élimination des microorganismes en mode flux.
1 représente l'ajout de la solution potentiellement contaminée ; 2 représente la colonne ; 3 représente les billes de verre fonctionnalisées à l'aide de polyéthylèneimine ; 4 représente le fritté ; 5 représente la solution dépourvue de ses microorganismes à la sortie de la colonne ; 6 représente un grossissement des microorganismes immobilisés au contact des billes fonctionnalisées.
[Fig 1B] Figure 1B : Principe général de fonctionnement de l'élution en mode flux 1 représente l'ajout de la solution d'élution; 2 représente la solution d'élution à la sortie de la colonne contenant les microorganismes précédemment immobilisés.
[Fig 2A] Figure 2A: Principe général de fonctionnement de captation/élimination des microorganismes en mode statique La Figure 2A représente le principe général de fonctionnement de la captation/élimination des microorganismes en mode statique.
1 représente l'ajout de la solution potentiellement contaminée ; 2 représente le contenant ; 3 représente la solution potentiellement contaminée mise en contact avec les billes de verre ; 4 représente les billes de verre fonctionnalisées à l'aide de polyéthylèneimine ; 5 représente un grossissement des microorganismes immobilisés au contact des billes fonctionnalisées ; 6 représente la récupération ou l'élimination de la solution dépourvue de ses microorganismes.
[Fig 2B] Figure 2B : Principe général de fonctionnement de l'élution en mode statique 1 représente l'ajout de la solution d'élution; 2 représente le prélèvement de la solution d'élution pourvue des microorganismes élués.
EXEMPLES
Exemple 1 Protocole générale d'adsorption du polyéthylèneimine sur les billes de verre lg de billes de verre de diamètre 105-150 !,tm (réf. 15927, Polysciences Europe GmbH, Germany) sont pesées directement dans des colonnes de filtration 2,4 mL en polypropylène munies d'un fritté en PEHD de porosité 45-90 lm (réf. 208-3049-03S, Evergreen Scientific, USA).
L'ensemble est placé
sur une plaque adaptée pour pouvoir placer 24 colonnes simultanément (NucleoVac Adapter Plate, réf.740694, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany) qui s'intègre à une chambre à vide NucleoVac96 (réf. 740681, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany). Le tout est relié à une pompe à vide KNF type N816.1.2KN.45.18 (KNF Neuberger SAS, France). Une solution de polyéthylèneimine ramifié (1,3 kDa, réf. 482595 Sigma-Aldrich) à 0,166% dans de l'eau désionisée biologique (Réf. W4502, Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) est additionnée à
chaque colonne. Le mélange est homogénéisé pendant 10 minutes à l'aide d'une pointe à filtre de 10 1, suivi d'un rinçage par de l'eau de biologie moléculaire (1 m1). Pour chaque aspiration, la pompe à
vide est réglée sur 700 mbar de dépression. Après rinçage, les colonnes sont fonctionnalisées et prêtes à l'emploi.
Exemple 2 : Préparation des souches Les souches de microorganismes ont été décongelées à l'aide d'une cryobille dans un milieu liquide ou solide approprié avant d'être placées à une température permettant leur croissance pendant le temps nécessaire à leur croissance. Les souches ont subi deux repiquages minimums à
2% dans un milieu liquide approprié ou par transfert sur milieu solide avant d'être utilisées pour les essais.
Exemple 3 : Préparation des suspensions de travail Les suspensions filles ont été réalisées dans de l'eau supplémentée ou non de NaCl à 0,85% par dilutions successives (habituellement au dixième). A partir des suspensions filles réalisées, des matrices liquides (jus de fruits, sodas, eaux plates, gazeuses, aromatisées ou pas) ont été inoculées afin de contenir des microorganismes pour les essais. Pour ce faire, la dernière dilution a été réalisée dans la matrice à tester.
Exemple 4 : Protocole général de captation en statique Un faible volume (de 500 jiL à 1 mL) de solution contenant une quantité donnée de microorganismes (de 20 à ¨107 unités) a été introduit dans une colonne contenant lg de billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine. Un temps de contact de 5 à 15 min a été appliqué
avant que l'aspiration ne soit déclenchée et réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe étant fixée sur 50 mbar.
Exemple 5 : Protocole général de captation en flux Un volume donné (de 500 jiL à 100 mL) de solution contenant une quantité
donnée de microorganismes (de 20 à ¨107 unités) a été filtré à travers une colonne contenant lg de billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine. L'aspiration a été déclenchée avant l'introduction de la solution et a été réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe a été fixée sur 50 mbar.
Exemple 6 : Protocole général d'élution chimique Après passage de l'échantillon d'intérêt au travers de la colonne, une solution d'élution a été introduite afin de procéder au décrochage des microorganismes. La quantité de solution d'élution a été variable mais a été au minimum de 500 jiL afin de recouvrir toutes les billes présentes dans la colonne. La solution a été de nature chimique.
Toutes les solutions chimiques (NaCl 1M, Tris 50mM pH 7,5, Tris 50mM pH 9,5, sodium hexametaphosphate 0,01% à 0,1 EDTA 0,1 à 10%, bicarbonate de soude 1%, sodium citrate 10%, acide acétique 0,1 à 10%, méthanol 0,1 à 10%, pluronic F-127 0,01 à 0,1%) ont été préparées à l'aide d'eau désionisée puis filtrée sur filtre 0,2 um. Les pourcentages cités précédemment correspondent à
un rapport poids/volume d'eau (g/100 mL). L'aspiration a été déclenchée avant introduction de la solution ou après un temps de contact plus ou moins important (5 minutes minimum testées). La filtration a été réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe étant fixée sur 700 mbar.
Exemple 7 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution L'évaluation du taux de captation ou d'élution a pu être réalisée de façons différentes en fonction de la quantité de microorganismes présents et du volume de solution à analyser.
Il a par exemple été possible d'évaluer le nombre de microorganismes présents dans une solution donnée à l'aide (1) de la cytométrie en flux, (2) de la filtration sur membrane déposée sur milieu gélosé, (3) par observation au microscope ou encore (4) de l'étalement sur boite de Petri.
Exemple 7-1: Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par cytométrie en flux La cytométrie en flux a nécessité une concentration en microorganisme relativement importante pour obtenir un résultat fiable (-105 UFC/mL). Les résultats en termes de taux de captation et d'élution ont été obtenus comme décrits ci-après. Les perméats obtenus après captation ont été analysés au cytomètre pour évaluer le nombre de microorganismes non captés. Il a ainsi été
possible de déduire le nombre de microorganismes captés sur la colonne étant donné que la quantité de microorganismes préalablement introduits dans la colonne est connue (dénombrement réalisé au cytomètre). Pour l'élution, le nombre de microorganismes élués a directement été mesuré à
l'aide du cytomètre. A noter qu'il a été possible de marquer les microorganismes ce qui a permis à la fois de mieux discriminer les microorganismes du bruit de fond et en même temps de décrire leur état physiologique (vivants ou morts) à un instant donné.
Exemple 7-2 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration sur membrane déposée sur milieu gélosé
La filtration sur membrane a permis, elle, de concentrer les microorganismes.
Il a ensuite été possible de déposer cette membrane sur un milieu favorable à leur croissance à une température donnée et pendant un temps défini. Les filtrations indépendantes des perméats et des éluats ont permis ainsi de calculer les taux de captation et d'élution de la même manière que pour la cytométrie en flux. Pour cela, il a été nécessaire de compter les colonies sur la membrane après le temps d'incubation.
Exemple 7-3 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration sur membrane pour observation au microscope La filtration sur membrane a permis de concentrer les microorganismes et de les observer après marquage directement au microscope. De la même manière que précédemment, il a ensuite été
nécessaire de compter les microorganismes présents sur la membrane à l'aide d'un microscope. Pour rappel, les marqueurs permettent de décrire l'état physiologique des microorganismes (vivants ou 5 morts) à un instant donné ce que ne permet pas la croissance sur membrane en boite de Petri (Exemple 7-2) ou l'étalement sur milieu gélosé (Exemple 7-4) pour lesquels seuls les microorganismes viables et cultivables sont observables, et ce, au minimum 24 heures après le dépôt.
Exemple 7-4 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration sur membrane pour de 10 l'étalement sur boite de Petri Une autre méthode consiste en l'étalement de tout ou une partie des perméats et des éluats sur un milieu gélosé (en boite de Petri) favorable à la croissance des microorganismes. Cette méthode a nécessité un temps d'incubation variable à une température donnée. De la même manière que précédemment, il a ensuite été nécessaire de compter les microorganismes présents sur la boite afin 15 d'en déduire les taux de captation et d'élution, le nombre de microorganismes introduits étant connu grâce à la même méthode d'étalement.
Exemple 8 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries sont des bactéries Gram + ou Gram ¨.
Les bactéries Gram + sont mises en évidence par la technique de coloration de Gram. Après coloration, lesdites bactéries apparaissent en couleur mauve lors d'une analyse microscopique. En revanche, les bactéries Gram ¨ ne sont pas colorées en mauve à l'issue du test de coloration de Gram.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel les bactéries appartiennent aux genres Acetobacter, Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes, Alicyclobacillus, Aquaspirillum, Asaia, Bacillus, Bifidobacterium sp., Borde tella, Brachybacterium, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Burkholderia, Buttiauxella, Campylobacter, Carnobacterium, Cellulomona, Citrobacter, Clavibacter Clos tridium, Corynebacterium, Cronobacte, Cupriavidu, Curtobacterium, Elizabethkingia, Enteractinococcus, Enterobacter, Enterococcus, Escheri chia, Flacklamia, Flavobacterium, Geobacillus, Glutamicibacte, Halobacillus, Klebsiella, Kocuria, Lactobacillus, Lactococcus, Leclercia, Lelliottia, Leuconos toc, Lysinibacillus, Macrococcus, Methylobacteriu, Microbacterium spp. (CDC A-5), Micrococcus, Moraxell, Mycobacterium, Nesterenkonia, Oceanobacillus sp, Ochrobactrum, Paenibacillus, Pandorae, Pan toea, Paracoccus, Pas teurell, Pediococcus, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Roseomona, Rothia, Salmonella, Sanguibacter, Serratia, Shewanella, Sphingomonas, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Thermoanaerobacterium, Variovorax, Virgibacillus Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'échantillon liquide ou visqueux est choisi parmi :
- un échantillon biologique, humain ou vétérinaire, tel que l'urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses, - un échantillon pharmaceutique, tel que les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques, - un échantillon cosmétique, tel que les démaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings, - un échantillon alimentaire, tel que les boissons, notamment l'eau (plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, tel que le jus d'orange, les sodas, les boissons alcoolisées, les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits laitiers, les ovoproduits, - Un échantillon d'eaux de process, tel qu'un échantillon issu des boucles de nettoyage, de l'eau 5 de production, - Un échantillon de type environnemental, tel que des échantillons marins, ou pluviaux.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique , un échantillon provenant d'un liquide corporel ou d'un tissu d'un corps humain ou animal.
10 Des exemples d'échantillons biologiques pouvant être utilisées sont l'urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon pharmaceutique , un échantillon provenant d'un produit pharmaceutique contenant des substances chimiques, naturelles ou 15 synthétiques à usage humain ou vétérinaire.
Des exemples d'échantillons pharmaceutiques pouvant être utilisés sont les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques, les solutions nasales, les compléments de vaccination rendus liquide, les poudres rendues liquide.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon cosmétique , un échantillon provenant d'un produit cosmétique contenant une substance ou un mélange destiné à être mise en contact avec les diverses parties superficielles du corps humain, en vue, exclusivement ou principalement, de les nettoyer, de les parfumer, d'en modifier l'aspect, de les protéger, de les maintenir en bon état ou de corriger les odeurs corporelles.
Des exemples d'échantillons cosmétiques pouvant être utilisés sont les démaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings, lotions démaquillantes, crèmes, émulsions, savons, agents de nettoyage.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon alimentaire , un échantillon provenant d'un produit alimentaire pouvant servir de nourriture ou de boisson à un être humain ou animal.
Des exemples d'échantillons alimentaires pouvant être utilisés sont les boissons, notamment l'eau (plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, les sodas, les boissons alcoolisées, les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits laitiers, les ovoproduits, la charcuterie, les poissons, les oeufs, les soupes, les concentrés de fruits.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon d'eaux de process , un échantillon provenant d'une usine de production, notamment un échantillon d'eau entrant dans un procédé de production. Des exemples d'échantillons d'eaux de process pouvant être utilisés sont des échantillons issu des boucles de nettoyage, de l'eau de production, une tour de lavage, une tour aéroréfrigérante.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon de type environnemental , un échantillon provenant de l'environnement. Des exemples d'échantillons de type environnementaux sont pouvant être utilisés sont des échantillons de sols, d'eau, notamment d'eau de mer, rivière, fleuve.
Un autre objet de l'invention est un kit comprenant des billes de verre, du polyéthylèneimine et un dispositif sous forme de colonne et des solutions d'élution de type chimique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un kit comprenant des billes de verre, du polyéthylèneimine et un dispositif sous forme de colonne et des solutions d'élution de type chimique, pour la captation de micro-organismes en vue d'un diagnostic, ou en vue de l'élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d'échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un kit comprenant des billes de verre, du polyéthylèneimine et un dispositif sous forme de colonne pour son utilisation pour mettre en oeuvre le dispositif selon l'invention et des solutions d'élution de type chimique, pour la captation de micro-organismes en vue d'un diagnostic, ou en vue de l'élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d'échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Description des figures [Fig 1A] Figure lA : Principe général de fonctionnement de captation/élimination des microorganismes en mode flux La Figure lA représente le principe général de fonctionnement de la captation/élimination des microorganismes en mode flux.
1 représente l'ajout de la solution potentiellement contaminée ; 2 représente la colonne ; 3 représente les billes de verre fonctionnalisées à l'aide de polyéthylèneimine ; 4 représente le fritté ; 5 représente la solution dépourvue de ses microorganismes à la sortie de la colonne ; 6 représente un grossissement des microorganismes immobilisés au contact des billes fonctionnalisées.
[Fig 1B] Figure 1B : Principe général de fonctionnement de l'élution en mode flux 1 représente l'ajout de la solution d'élution; 2 représente la solution d'élution à la sortie de la colonne contenant les microorganismes précédemment immobilisés.
[Fig 2A] Figure 2A: Principe général de fonctionnement de captation/élimination des microorganismes en mode statique La Figure 2A représente le principe général de fonctionnement de la captation/élimination des microorganismes en mode statique.
1 représente l'ajout de la solution potentiellement contaminée ; 2 représente le contenant ; 3 représente la solution potentiellement contaminée mise en contact avec les billes de verre ; 4 représente les billes de verre fonctionnalisées à l'aide de polyéthylèneimine ; 5 représente un grossissement des microorganismes immobilisés au contact des billes fonctionnalisées ; 6 représente la récupération ou l'élimination de la solution dépourvue de ses microorganismes.
[Fig 2B] Figure 2B : Principe général de fonctionnement de l'élution en mode statique 1 représente l'ajout de la solution d'élution; 2 représente le prélèvement de la solution d'élution pourvue des microorganismes élués.
EXEMPLES
Exemple 1 Protocole générale d'adsorption du polyéthylèneimine sur les billes de verre lg de billes de verre de diamètre 105-150 !,tm (réf. 15927, Polysciences Europe GmbH, Germany) sont pesées directement dans des colonnes de filtration 2,4 mL en polypropylène munies d'un fritté en PEHD de porosité 45-90 lm (réf. 208-3049-03S, Evergreen Scientific, USA).
L'ensemble est placé
sur une plaque adaptée pour pouvoir placer 24 colonnes simultanément (NucleoVac Adapter Plate, réf.740694, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany) qui s'intègre à une chambre à vide NucleoVac96 (réf. 740681, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany). Le tout est relié à une pompe à vide KNF type N816.1.2KN.45.18 (KNF Neuberger SAS, France). Une solution de polyéthylèneimine ramifié (1,3 kDa, réf. 482595 Sigma-Aldrich) à 0,166% dans de l'eau désionisée biologique (Réf. W4502, Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) est additionnée à
chaque colonne. Le mélange est homogénéisé pendant 10 minutes à l'aide d'une pointe à filtre de 10 1, suivi d'un rinçage par de l'eau de biologie moléculaire (1 m1). Pour chaque aspiration, la pompe à
vide est réglée sur 700 mbar de dépression. Après rinçage, les colonnes sont fonctionnalisées et prêtes à l'emploi.
Exemple 2 : Préparation des souches Les souches de microorganismes ont été décongelées à l'aide d'une cryobille dans un milieu liquide ou solide approprié avant d'être placées à une température permettant leur croissance pendant le temps nécessaire à leur croissance. Les souches ont subi deux repiquages minimums à
2% dans un milieu liquide approprié ou par transfert sur milieu solide avant d'être utilisées pour les essais.
Exemple 3 : Préparation des suspensions de travail Les suspensions filles ont été réalisées dans de l'eau supplémentée ou non de NaCl à 0,85% par dilutions successives (habituellement au dixième). A partir des suspensions filles réalisées, des matrices liquides (jus de fruits, sodas, eaux plates, gazeuses, aromatisées ou pas) ont été inoculées afin de contenir des microorganismes pour les essais. Pour ce faire, la dernière dilution a été réalisée dans la matrice à tester.
Exemple 4 : Protocole général de captation en statique Un faible volume (de 500 jiL à 1 mL) de solution contenant une quantité donnée de microorganismes (de 20 à ¨107 unités) a été introduit dans une colonne contenant lg de billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine. Un temps de contact de 5 à 15 min a été appliqué
avant que l'aspiration ne soit déclenchée et réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe étant fixée sur 50 mbar.
Exemple 5 : Protocole général de captation en flux Un volume donné (de 500 jiL à 100 mL) de solution contenant une quantité
donnée de microorganismes (de 20 à ¨107 unités) a été filtré à travers une colonne contenant lg de billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine. L'aspiration a été déclenchée avant l'introduction de la solution et a été réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe a été fixée sur 50 mbar.
Exemple 6 : Protocole général d'élution chimique Après passage de l'échantillon d'intérêt au travers de la colonne, une solution d'élution a été introduite afin de procéder au décrochage des microorganismes. La quantité de solution d'élution a été variable mais a été au minimum de 500 jiL afin de recouvrir toutes les billes présentes dans la colonne. La solution a été de nature chimique.
Toutes les solutions chimiques (NaCl 1M, Tris 50mM pH 7,5, Tris 50mM pH 9,5, sodium hexametaphosphate 0,01% à 0,1 EDTA 0,1 à 10%, bicarbonate de soude 1%, sodium citrate 10%, acide acétique 0,1 à 10%, méthanol 0,1 à 10%, pluronic F-127 0,01 à 0,1%) ont été préparées à l'aide d'eau désionisée puis filtrée sur filtre 0,2 um. Les pourcentages cités précédemment correspondent à
un rapport poids/volume d'eau (g/100 mL). L'aspiration a été déclenchée avant introduction de la solution ou après un temps de contact plus ou moins important (5 minutes minimum testées). La filtration a été réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la pompe étant fixée sur 700 mbar.
Exemple 7 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution L'évaluation du taux de captation ou d'élution a pu être réalisée de façons différentes en fonction de la quantité de microorganismes présents et du volume de solution à analyser.
Il a par exemple été possible d'évaluer le nombre de microorganismes présents dans une solution donnée à l'aide (1) de la cytométrie en flux, (2) de la filtration sur membrane déposée sur milieu gélosé, (3) par observation au microscope ou encore (4) de l'étalement sur boite de Petri.
Exemple 7-1: Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par cytométrie en flux La cytométrie en flux a nécessité une concentration en microorganisme relativement importante pour obtenir un résultat fiable (-105 UFC/mL). Les résultats en termes de taux de captation et d'élution ont été obtenus comme décrits ci-après. Les perméats obtenus après captation ont été analysés au cytomètre pour évaluer le nombre de microorganismes non captés. Il a ainsi été
possible de déduire le nombre de microorganismes captés sur la colonne étant donné que la quantité de microorganismes préalablement introduits dans la colonne est connue (dénombrement réalisé au cytomètre). Pour l'élution, le nombre de microorganismes élués a directement été mesuré à
l'aide du cytomètre. A noter qu'il a été possible de marquer les microorganismes ce qui a permis à la fois de mieux discriminer les microorganismes du bruit de fond et en même temps de décrire leur état physiologique (vivants ou morts) à un instant donné.
Exemple 7-2 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration sur membrane déposée sur milieu gélosé
La filtration sur membrane a permis, elle, de concentrer les microorganismes.
Il a ensuite été possible de déposer cette membrane sur un milieu favorable à leur croissance à une température donnée et pendant un temps défini. Les filtrations indépendantes des perméats et des éluats ont permis ainsi de calculer les taux de captation et d'élution de la même manière que pour la cytométrie en flux. Pour cela, il a été nécessaire de compter les colonies sur la membrane après le temps d'incubation.
Exemple 7-3 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration sur membrane pour observation au microscope La filtration sur membrane a permis de concentrer les microorganismes et de les observer après marquage directement au microscope. De la même manière que précédemment, il a ensuite été
nécessaire de compter les microorganismes présents sur la membrane à l'aide d'un microscope. Pour rappel, les marqueurs permettent de décrire l'état physiologique des microorganismes (vivants ou 5 morts) à un instant donné ce que ne permet pas la croissance sur membrane en boite de Petri (Exemple 7-2) ou l'étalement sur milieu gélosé (Exemple 7-4) pour lesquels seuls les microorganismes viables et cultivables sont observables, et ce, au minimum 24 heures après le dépôt.
Exemple 7-4 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration sur membrane pour de 10 l'étalement sur boite de Petri Une autre méthode consiste en l'étalement de tout ou une partie des perméats et des éluats sur un milieu gélosé (en boite de Petri) favorable à la croissance des microorganismes. Cette méthode a nécessité un temps d'incubation variable à une température donnée. De la même manière que précédemment, il a ensuite été nécessaire de compter les microorganismes présents sur la boite afin 15 d'en déduire les taux de captation et d'élution, le nombre de microorganismes introduits étant connu grâce à la même méthode d'étalement.
Exemple 8 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
20 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 um ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 um. 142,8 uL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 25 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide 25 de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour un séchage pendant 5 minutes. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou CIP 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri, ainsi qu'en cytométrie. 500 uL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé
en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 uL de suspension ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri, ainsi que par cytométrie.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 1 présente le nombre d'Unités Formant Colonie (UFC) introduites et le taux de captation correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
Colonne T_TC introduites Pourcentage de captation Moyenne 9.82x1 2 9.32x1 71.99'µ
3 9.rx116.:
Tableau 1 Résultats de la captation de microorganismes Le Tableau 2 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne 1:FC introduites Pourcentage de captation Moenne 1 1.4;5x1r: 91.27' 2 1.4Cx1C.-3 1.4.:5.x1C 71.53' Tableau 2 Résultats de la captation de microorganismes Exemple 9:
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 um ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 um. 142,8 uL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutées dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou CIP 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri, ainsi qu'en cytométrie. 500 uL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé
en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 p.1_, de suspension ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri, ainsi que par cytométrie.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 3 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
Colonne T_TC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 55.71' à
2. 91.5j"0 93.2700 :952,x106 4 9....54x 1 C 93.54's 5: 9.j4x1Cre 93.5%
Tableau 3 Résultats de la captation de microorganismes Le Tableau 4 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne T_TC introduites :Pourcentage de captation :Nloyenne 1.25x1C-:2 :14 5x. 1::.92.5% 94.370 53.54' à
1.25x.1C 94.04" à
5 1.:5x103 S3.:31% 94.:D2 0 1.25x105 Tableau 4 Résultats de la captation de microorganismes Exemple 10:
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 !,tm ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 p.m. 142,8 !,t.L d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou C1P 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri. 500 !,t.L de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 !,t.L de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement est réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri.
- Protocole d'élution des micro-organismes 2 élutions successives au NaCl 1M de 500 !,t.L chacune ont été réalisées par colonne. Les deux élutions ont été réalisées en respectant un temps de contact de 5 min à température ambiante. L'aspiration a été
réalisée à 50 mbar de dépression. Les deux éluats ont été collectés dans des tubes différents à l'aide du système de chambre à vide. Les 500 !,t.L d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 5 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
Colonne "[TC introduites Pourcentage de captation loyenne 1 9.5.CS1CT
2 9.5Cx1C:i 89.04" 28.1:5.
3 9.1..Cx1C14 Tableau 5 Résultats de la captation de microorganismes - Efficacité de l'élution Le Tableau 6 présente le taux d'élution correspondant à chaque colonne.
Colonne Pourcentage cumulé
cl'éltition Moyenne 33.2790 3 93.7Sc!fo.
Tableau 6 Résultats de l'élution de microorganismes Le rendement global est donc de 77,98%.
Exemple 11:
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 !,tm ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 lm. 142,8 .1_, d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou C1P 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri. 500 !,t.L de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et l'aspiration a été réalisée après un temps de contact de 5 min de la solution avec les billes contenues dans la colonne. L'aspiration a été réalisée à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 !,t.L de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri.
5 - Protocole d'élution des micro-organismes Une élution au NaCl 1M de 500 !,t.L a été réalisée par colonne. L'élution a été réalisée en respectant un temps de contact de 5 min à température ambiante. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression.
Les 500 !,t.L d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements 10 sur milieux gélosés en boite de Petri.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 7 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
Colonne 1LT-C introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 27x:1::-2. 96.95%
3 1.2.7x101 Tableau 7 Résultats de la captation de microorganismes - Efficacité de l'élution Le Tableau 8 présente le taux d'élution correspondant à chaque colonne.
Colonne Pourcentage cumulé cl'élution Moyenne 1 73.94 O
2 o S1.53 ô
:3 84A4%:
Tableau 8 Résultats de l'élution de microorganismes Le rendement global est donc de 78,83%.
Exemple 12 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 956 mg de billes de verre de diamètre 105-150 p.m ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL
munies d'un fritté de 20 lm. 455,1 i.t.L d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,16% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre de la suspension mère d'Escherichia cou CIP
54.8 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. 500 i.t.L de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 500 pi de solution d'élution (Tris 50 mM pH 9,5, NaCl 1M) ont été réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 500 d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre est réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5 - Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 9 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne 1TC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1.72x1:
.2 1.72x1C' 3 1.72x1rr S3.35%
Tableau 9 Résultats de la captation de microorganismes - Efficacité de l'élution Le Tableau 10 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
C o loin] e Pourcentage cumulé crelution Moyenne 91.S=2)0 2 91t.5S 0 3 S-1.110c Tableau 10 Résultats de l'élution de microorganismes Le rendement global est donc de 75,24%.
Exemple 13 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 p.m ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 m. 142,8 pi d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ATCC 13388 et Salmonella enterica subsp.
enterica serovar Enteritidis ATCC 13076 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé
la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 11 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie.
Espèce Colonne ETC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 5.19x1 Cr' 98,19%
Staphylacaccus aureus 2 5.19xIO 99.18%
98.48%
3 519x106 98.06%
4 1.46x10 94.15%
Pseudomona,5 aeniginasa 1.46x10- 90.029 89.08%
6 1.46x107 83.08%
7 1.07x101 ct 94.56?.'3 .S-idoireUct subsp.
emerica serovar Enteritidis 8 1.07x107 94.74%
94.16%
9 1.07x107 93.09%
Tableau 11 Résultats de la captation de microorganismes Exemple 14 :
5 - Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 p.m ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 m. 142,8 pi d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères d'Escherichia cou CIP
54.8 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi de suspension à la concentration souhaitée ont été
ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 12 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 1.33x10'. 99.40 -0 2.: 1.33x101. 100.00' 99. Ci9 ..0 :133É.103'.
4 1.33x1:7:1 99.97c', 5. L3xiO5 99.490.0 99.550o ..133x105 99.21Po 7 1.33x10- 98.84'0 1_33x1e .98.15 -0 9.S.i=OQ:0 133k107 97 Tableau 12 Résultats de la captation de microorganismes Exemple 15 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 um ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 um. 500 uL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié 1,3 kDa) à 0,166%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères des microorganismes utilisés a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. 500 uL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 uL de suspension ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium hexametaphosphate 0,1% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
10 - Efficacité du couple captation/élution des micro-organismes Le Tableau 13 présente le rendement global de la captation/élution de microorganismes.
Souches Rendement global subsp etufert serovar Choleraesuis CEP 55A33 Protes mirabilis CIP A235 94.5.59.µ
Bacilids cereits ATCC 10876 71.32%
Bacflhis tJ .. gie ATCC 10792 86.03%
EteïobacterckcwaeNCTC 13406 75_88%
^ taro coccei s faecim ATCC 27270 81.32%
Poteu.alli'abîf ATCC 12453 82.19%
Salmohelia ettm.f.ca subsp entoila! serovarEnteritidis ATCC 13076 Tableau 13 Résultats de la captation/élution de microorganismes 15 Exemple 16:
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 p.m ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 m. 500 pi d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté
20 entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été
éliminée à l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
25 - Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères des microorganismes utilisés a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi de suspension à la concentration souhaitée ont été
ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Efficacité du couple captation/élution des micro-organismes Souches Rendement global POtÉ infrah*5 CIP A235 91.7t5o Pseudamona 5 aeruginosa ATCC 133 S 3 78.86%
Salmonella re'ica subsp.ente'lect serovarEntelitidis ATCC 13076 72.79%
Myerazyma çqi;.1h nondii ATCC 6260 93.08%
Hansen(' %-oo.cf g t&eoJi ATCC 32857 78.63%
Striphylococcus epidernie5 ATCC 49134 91.42%
Staphyloccecu 5 aui.et 95.18%
Sainionella niterica 5 i sp. enterica o.o var holeresiis CIP 55.133 85.89%
Proteus mirabilis CIP A235 90.76%
Serratia marcescens CIP 58.14 85.15%
Escherichia CIP 54.8 92.15%
8aci!'s pumis ATCC 14884 99.32%
'ID taro acier cloaca NCTC 13406 93.95%
Tableau 14 Résultats de la captation/élution de microorganismes Exemple 17 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 p.m ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 m. 500 !JI d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères d'Escherichia cou CIP
54.8 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi d'une boisson à base de thé (Nestea goût pêche) contenant une concentration souhaitée en microorganismes ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 500 !JI de suspension ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Efficacité de la capatation Le Tableau 15 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Moyenne 53.41.7"' 2 1 Tx1CS5.77% 96.4.7.;
'3: 1.57X1C?
Tableau 15 Résultats de la captation de microorganismes - Efficacité de l'élution Le Tableau 16 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
Colonne Pourcentage d'élution Moyenne '2:: FS.14?-.;
92.42P0 Tableau 16 Résultats de l'élution de microorganismes Le rendement global est donc de 88,2%
Exemple 18 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 m ont été réparties dans des colonnes de 2,4 mL munies d'un fritté de 45-90 m. 500 L d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre de la suspension mère de Serratia marcescens CIP 58.14 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl via la cytométrie. 8 mL de suspension à la concentration souhaitée ont été
ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 8 mL de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl.
- Efficacité de la captation Le Tableau 17 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie Colonne 1L-FC introduites Pourcentage de captation 7%loyenne 1 1.05x1C- L'.53.1c 8:.'% 83.57 ù
3 1 .03x107 S3.71 iy Tableau 17 Résultats de la captation de microorganismes - Efficacité de l'élution Le Tableau 18 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
Colonne Pourcentage cumulé d'élution Moyenne Tableau 18 Résultats de l'élution de microorganismes Le rendement global est donc de 83,57%.
Exemple 19 : Application sur les levures - Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 !,tm ont été réparties dans des colonnes de 2,4 mL munies d'un fritté de 45-90 iam. 500 iaL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
5 - Protocole de captation/élimination des micro-organismes Les suspensions mères de Candida albicans (ATCC 14053), Candida parapsilosis (ATCC 22019) et Saccharomyces cerevisiae (ATCC 18824) sont diluées au 10ème dans de l'eau physiologique 0.85%
NaCl puis dénombrées par cytométrie en flux. 500 p.L de suspension à la concentration souhaitée ont 10 été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 p.L) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont été
15 réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl.
- Efficacité de la captation Le Tableau 19 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant pour chaque souche, évalué par cytométrie.
to ri ne EFC introduites Pourcentage de captation 3.23E-1-25 7 E-C,5 (ii=3-: 3.52 E¨C= oc Tableau 19 Résultats de la captation - Efficacité de l'élution Le Tableau 20 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
Colonne Pourcentage d'élution 2.S o ;,..a=3) 6.7..;
Tableau 20 Résultats de l'élution Exemple 20 : Application sur les champignons - Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 !,tm ont été réparties dans des colonnes de 2,4 mL munies d'un fritté de 45-90 iam. 500 iaL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Les suspensions mères de Fusarium oxysporum (UBOCC-A-112042) et Mucor racemosus (ATCC
42647) sont diluées au 10ème dans de l'eau physiologique 0.85% NaCl puis dénombrées par cytométrie en flux. 500 !,t.L de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl.
- Efficacité de la captation Le Tableau 21 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant pour chaque souche, évalué par cytométrie.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation (II=3) 5.1 E¨ii:=5 76. oc=
11=3L
Tableau 21 Résultats de la captation - Efficacité de l'élution Le Tableau 22 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
Colonne Pourcentage (relation (y,=3 µ: õ _________________________ - = -1,11=33. S
Tableau 22 Résultats de l'élution
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide 25 de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour un séchage pendant 5 minutes. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou CIP 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri, ainsi qu'en cytométrie. 500 uL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé
en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 uL de suspension ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri, ainsi que par cytométrie.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 1 présente le nombre d'Unités Formant Colonie (UFC) introduites et le taux de captation correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
Colonne T_TC introduites Pourcentage de captation Moyenne 9.82x1 2 9.32x1 71.99'µ
3 9.rx116.:
Tableau 1 Résultats de la captation de microorganismes Le Tableau 2 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne 1:FC introduites Pourcentage de captation Moenne 1 1.4;5x1r: 91.27' 2 1.4Cx1C.-3 1.4.:5.x1C 71.53' Tableau 2 Résultats de la captation de microorganismes Exemple 9:
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 um ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 um. 142,8 uL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutées dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou CIP 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri, ainsi qu'en cytométrie. 500 uL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé
en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 p.1_, de suspension ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri, ainsi que par cytométrie.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 3 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
Colonne T_TC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 55.71' à
2. 91.5j"0 93.2700 :952,x106 4 9....54x 1 C 93.54's 5: 9.j4x1Cre 93.5%
Tableau 3 Résultats de la captation de microorganismes Le Tableau 4 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne T_TC introduites :Pourcentage de captation :Nloyenne 1.25x1C-:2 :14 5x. 1::.92.5% 94.370 53.54' à
1.25x.1C 94.04" à
5 1.:5x103 S3.:31% 94.:D2 0 1.25x105 Tableau 4 Résultats de la captation de microorganismes Exemple 10:
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 !,tm ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 p.m. 142,8 !,t.L d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou C1P 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri. 500 !,t.L de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 !,t.L de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement est réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri.
- Protocole d'élution des micro-organismes 2 élutions successives au NaCl 1M de 500 !,t.L chacune ont été réalisées par colonne. Les deux élutions ont été réalisées en respectant un temps de contact de 5 min à température ambiante. L'aspiration a été
réalisée à 50 mbar de dépression. Les deux éluats ont été collectés dans des tubes différents à l'aide du système de chambre à vide. Les 500 !,t.L d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 5 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
Colonne "[TC introduites Pourcentage de captation loyenne 1 9.5.CS1CT
2 9.5Cx1C:i 89.04" 28.1:5.
3 9.1..Cx1C14 Tableau 5 Résultats de la captation de microorganismes - Efficacité de l'élution Le Tableau 6 présente le taux d'élution correspondant à chaque colonne.
Colonne Pourcentage cumulé
cl'éltition Moyenne 33.2790 3 93.7Sc!fo.
Tableau 6 Résultats de l'élution de microorganismes Le rendement global est donc de 77,98%.
Exemple 11:
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 !,tm ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 lm. 142,8 .1_, d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou C1P 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri. 500 !,t.L de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et l'aspiration a été réalisée après un temps de contact de 5 min de la solution avec les billes contenues dans la colonne. L'aspiration a été réalisée à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 !,t.L de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri.
5 - Protocole d'élution des micro-organismes Une élution au NaCl 1M de 500 !,t.L a été réalisée par colonne. L'élution a été réalisée en respectant un temps de contact de 5 min à température ambiante. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression.
Les 500 !,t.L d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements 10 sur milieux gélosés en boite de Petri.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 7 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
Colonne 1LT-C introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 27x:1::-2. 96.95%
3 1.2.7x101 Tableau 7 Résultats de la captation de microorganismes - Efficacité de l'élution Le Tableau 8 présente le taux d'élution correspondant à chaque colonne.
Colonne Pourcentage cumulé cl'élution Moyenne 1 73.94 O
2 o S1.53 ô
:3 84A4%:
Tableau 8 Résultats de l'élution de microorganismes Le rendement global est donc de 78,83%.
Exemple 12 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 956 mg de billes de verre de diamètre 105-150 p.m ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL
munies d'un fritté de 20 lm. 455,1 i.t.L d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,16% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre de la suspension mère d'Escherichia cou CIP
54.8 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. 500 i.t.L de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 500 pi de solution d'élution (Tris 50 mM pH 9,5, NaCl 1M) ont été réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 500 d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre est réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5 - Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 9 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne 1TC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1.72x1:
.2 1.72x1C' 3 1.72x1rr S3.35%
Tableau 9 Résultats de la captation de microorganismes - Efficacité de l'élution Le Tableau 10 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
C o loin] e Pourcentage cumulé crelution Moyenne 91.S=2)0 2 91t.5S 0 3 S-1.110c Tableau 10 Résultats de l'élution de microorganismes Le rendement global est donc de 75,24%.
Exemple 13 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 p.m ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 m. 142,8 pi d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ATCC 13388 et Salmonella enterica subsp.
enterica serovar Enteritidis ATCC 13076 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé
la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 11 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie.
Espèce Colonne ETC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 5.19x1 Cr' 98,19%
Staphylacaccus aureus 2 5.19xIO 99.18%
98.48%
3 519x106 98.06%
4 1.46x10 94.15%
Pseudomona,5 aeniginasa 1.46x10- 90.029 89.08%
6 1.46x107 83.08%
7 1.07x101 ct 94.56?.'3 .S-idoireUct subsp.
emerica serovar Enteritidis 8 1.07x107 94.74%
94.16%
9 1.07x107 93.09%
Tableau 11 Résultats de la captation de microorganismes Exemple 14 :
5 - Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 p.m ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 m. 142,8 pi d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a ensuite été réglée sur 700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères d'Escherichia cou CIP
54.8 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi de suspension à la concentration souhaitée ont été
ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes Le Tableau 12 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Moyenne 1 1.33x10'. 99.40 -0 2.: 1.33x101. 100.00' 99. Ci9 ..0 :133É.103'.
4 1.33x1:7:1 99.97c', 5. L3xiO5 99.490.0 99.550o ..133x105 99.21Po 7 1.33x10- 98.84'0 1_33x1e .98.15 -0 9.S.i=OQ:0 133k107 97 Tableau 12 Résultats de la captation de microorganismes Exemple 15 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 um ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 um. 500 uL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié 1,3 kDa) à 0,166%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères des microorganismes utilisés a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. 500 uL de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 uL de suspension ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium hexametaphosphate 0,1% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
10 - Efficacité du couple captation/élution des micro-organismes Le Tableau 13 présente le rendement global de la captation/élution de microorganismes.
Souches Rendement global subsp etufert serovar Choleraesuis CEP 55A33 Protes mirabilis CIP A235 94.5.59.µ
Bacilids cereits ATCC 10876 71.32%
Bacflhis tJ .. gie ATCC 10792 86.03%
EteïobacterckcwaeNCTC 13406 75_88%
^ taro coccei s faecim ATCC 27270 81.32%
Poteu.alli'abîf ATCC 12453 82.19%
Salmohelia ettm.f.ca subsp entoila! serovarEnteritidis ATCC 13076 Tableau 13 Résultats de la captation/élution de microorganismes 15 Exemple 16:
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 p.m ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 m. 500 pi d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté
20 entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été
éliminée à l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
25 - Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères des microorganismes utilisés a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi de suspension à la concentration souhaitée ont été
ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Efficacité du couple captation/élution des micro-organismes Souches Rendement global POtÉ infrah*5 CIP A235 91.7t5o Pseudamona 5 aeruginosa ATCC 133 S 3 78.86%
Salmonella re'ica subsp.ente'lect serovarEntelitidis ATCC 13076 72.79%
Myerazyma çqi;.1h nondii ATCC 6260 93.08%
Hansen(' %-oo.cf g t&eoJi ATCC 32857 78.63%
Striphylococcus epidernie5 ATCC 49134 91.42%
Staphyloccecu 5 aui.et 95.18%
Sainionella niterica 5 i sp. enterica o.o var holeresiis CIP 55.133 85.89%
Proteus mirabilis CIP A235 90.76%
Serratia marcescens CIP 58.14 85.15%
Escherichia CIP 54.8 92.15%
8aci!'s pumis ATCC 14884 99.32%
'ID taro acier cloaca NCTC 13406 93.95%
Tableau 14 Résultats de la captation/élution de microorganismes Exemple 17 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 p.m ont été réparties dans des colonnes de 0,8 mL munies d'un fritté de 20 m. 500 !JI d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères d'Escherichia cou CIP
54.8 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi d'une boisson à base de thé (Nestea goût pêche) contenant une concentration souhaitée en microorganismes ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 500 !JI de suspension ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Efficacité de la capatation Le Tableau 15 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Moyenne 53.41.7"' 2 1 Tx1CS5.77% 96.4.7.;
'3: 1.57X1C?
Tableau 15 Résultats de la captation de microorganismes - Efficacité de l'élution Le Tableau 16 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
Colonne Pourcentage d'élution Moyenne '2:: FS.14?-.;
92.42P0 Tableau 16 Résultats de l'élution de microorganismes Le rendement global est donc de 88,2%
Exemple 18 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 m ont été réparties dans des colonnes de 2,4 mL munies d'un fritté de 45-90 m. 500 L d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre de la suspension mère de Serratia marcescens CIP 58.14 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl via la cytométrie. 8 mL de suspension à la concentration souhaitée ont été
ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 8 mL de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl.
- Efficacité de la captation Le Tableau 17 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant, évalué par cytométrie Colonne 1L-FC introduites Pourcentage de captation 7%loyenne 1 1.05x1C- L'.53.1c 8:.'% 83.57 ù
3 1 .03x107 S3.71 iy Tableau 17 Résultats de la captation de microorganismes - Efficacité de l'élution Le Tableau 18 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
Colonne Pourcentage cumulé d'élution Moyenne Tableau 18 Résultats de l'élution de microorganismes Le rendement global est donc de 83,57%.
Exemple 19 : Application sur les levures - Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 !,tm ont été réparties dans des colonnes de 2,4 mL munies d'un fritté de 45-90 iam. 500 iaL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
5 - Protocole de captation/élimination des micro-organismes Les suspensions mères de Candida albicans (ATCC 14053), Candida parapsilosis (ATCC 22019) et Saccharomyces cerevisiae (ATCC 18824) sont diluées au 10ème dans de l'eau physiologique 0.85%
NaCl puis dénombrées par cytométrie en flux. 500 p.L de suspension à la concentration souhaitée ont 10 été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 p.L) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont été
15 réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl.
- Efficacité de la captation Le Tableau 19 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant pour chaque souche, évalué par cytométrie.
to ri ne EFC introduites Pourcentage de captation 3.23E-1-25 7 E-C,5 (ii=3-: 3.52 E¨C= oc Tableau 19 Résultats de la captation - Efficacité de l'élution Le Tableau 20 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
Colonne Pourcentage d'élution 2.S o ;,..a=3) 6.7..;
Tableau 20 Résultats de l'élution Exemple 20 : Application sur les champignons - Protocole de fonctionnalisation des billes de verre 1 g de billes de verre de diamètre 105-150 !,tm ont été réparties dans des colonnes de 2,4 mL munies d'un fritté de 45-90 iam. 500 iaL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette étape, les billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes Les suspensions mères de Fusarium oxysporum (UBOCC-A-112042) et Mucor racemosus (ATCC
42647) sont diluées au 10ème dans de l'eau physiologique 0.85% NaCl puis dénombrées par cytométrie en flux. 500 !,t.L de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie.
- Protocole d'élution des micro-organismes Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant systématiquement un temps de contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de chaque élution. Les 3,5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl.
- Efficacité de la captation Le Tableau 21 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le taux de captation correspondant pour chaque souche, évalué par cytométrie.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation (II=3) 5.1 E¨ii:=5 76. oc=
11=3L
Tableau 21 Résultats de la captation - Efficacité de l'élution Le Tableau 22 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
Colonne Pourcentage (relation (y,=3 µ: õ _________________________ - = -1,11=33. S
Tableau 22 Résultats de l'élution
Claims (13)
1. Dispositif comprenant un récipient creux contenant des billes de verre, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de verre, les billes de verre étant notamment constituées de verre de type sodocalcique ou borosilicate, dans lequel la masse moléculaire du polyéthylèneimine adsorbé est comprise de 0,6 à 2000 kDa.
2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel :
= les billes de verre ont un diamètre d'environ 20 à environ 1000 lm, notamment d'environ 20 à
30 lm, d'environ 30 à 40 lm, d'environ 40 à 50 lm, d'environ 50 à 75 lm, d'environ 75 à
100 lm, d'environ 100 à 200 lm, d'environ 200 à 300 lm, d'environ 300 à 400 lm, d'environ 400 à 500 lm, d'environ 500 à 600 lm, d'environ 600 à 700 iam, d'environ 700 à
800 lm, d'environ 800 à 900 lm, d'environ 900 à 1000 lm, et/ou = les billes de verre ont une masse unitaire d'environ 10 ng à environ 2 mg, notamment d'environ 10 à 50 ng, d'environ 50 à 100 ng, d'environ 100 à 200 ng, d'environ 200 à 500 ng, d'environ 500 ng à 1 lag, d'environ 1 à 5 lag, d'environ 5 à 10 lag, d'environ 10 à 20 lag, d'environ 20 à 50 lag, d'environ 50 à 100 lag, d'environ 100 à 200 lag, d'environ 200 à 500 lag, d'environ 500 lag à 1 mg, d'environ 1 à 1,5 mg, d'environ 1,5 à 2 mg.
= les billes de verre ont un diamètre d'environ 20 à environ 1000 lm, notamment d'environ 20 à
30 lm, d'environ 30 à 40 lm, d'environ 40 à 50 lm, d'environ 50 à 75 lm, d'environ 75 à
100 lm, d'environ 100 à 200 lm, d'environ 200 à 300 lm, d'environ 300 à 400 lm, d'environ 400 à 500 lm, d'environ 500 à 600 lm, d'environ 600 à 700 iam, d'environ 700 à
800 lm, d'environ 800 à 900 lm, d'environ 900 à 1000 lm, et/ou = les billes de verre ont une masse unitaire d'environ 10 ng à environ 2 mg, notamment d'environ 10 à 50 ng, d'environ 50 à 100 ng, d'environ 100 à 200 ng, d'environ 200 à 500 ng, d'environ 500 ng à 1 lag, d'environ 1 à 5 lag, d'environ 5 à 10 lag, d'environ 10 à 20 lag, d'environ 20 à 50 lag, d'environ 50 à 100 lag, d'environ 100 à 200 lag, d'environ 200 à 500 lag, d'environ 500 lag à 1 mg, d'environ 1 à 1,5 mg, d'environ 1,5 à 2 mg.
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la masse moléculaire du polyéthylèneimine adsorbé est d'environ 0,6 à 1,3 kDa, d'environ 1,3 à 10 kDa, d'environ 10 à 25 kDa, d'environ 25 à 100 kDa, d'environ 100 à 250 kDa, d'environ 100 à 500 kDa, d'environ 500 à
1000 kDa, d'environ 1000 à 1500 kDa, d'environ 500 à 2000 kDa, dans lequel le polyéthylèneimine adsorbé
est notamment ramifié.
1000 kDa, d'environ 1000 à 1500 kDa, d'environ 500 à 2000 kDa, dans lequel le polyéthylèneimine adsorbé
est notamment ramifié.
4. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le poids total des billes est d'environ mg à environ 1 kg, notamment d'environ 10 à 50 mg, d'environ 50 à 100 mg, d'environ 100 à
200 mg, d'environ 200 à 500 mg, d'environ 500 mg à 1 g, d'environ 1 à 2 g, d'environ 2 à 5 g, d'environ 5 à 10 g, d'environ 10 à 50 g, d'environ 50 à 100 g, d'environ 100 à
200 g, d'environ 200 à 500 g, d'environ 500 g à 1 kg.
200 mg, d'environ 200 à 500 mg, d'environ 500 mg à 1 g, d'environ 1 à 2 g, d'environ 2 à 5 g, d'environ 5 à 10 g, d'environ 10 à 50 g, d'environ 50 à 100 g, d'environ 100 à
200 g, d'environ 200 à 500 g, d'environ 500 g à 1 kg.
5. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le récipient creux est sous forme d'un tube, d'un flacon d'un bécher ou d'un pot, ledit récipient creux étant notamment sous forme de colonne comprenant de façon optionnelle un fritté, ladite colonne ayant notamment un volume d'environ 0,5 mL à environ 2 L et le fritté ayant notamment une porosité
inférieure à la taille des billes de verre utilisées.
inférieure à la taille des billes de verre utilisées.
6. Procédé de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif de l'une des revendications 1 à 5, comprenant une étape de mise en contact du polyéthylèneimine avec une bille de verre, notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de polyéthylèneimine est notamment à une concentration entre 0,1 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est notamment compris de 4 I à 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
7. Procédé selon la revendication 6, comprenant une étape de séchage pour une durée de 1 minute à
12 heures, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou accélérée par flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90 C, en particulier une durée d'environ 10 minutes à température ambiante.
12 heures, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou accélérée par flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90 C, en particulier une durée d'environ 10 minutes à température ambiante.
8. Utilisation d'un dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, pour la captation de micro-organismes en vue d'un diagnostic, ou en vue de l'élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes d'échantillons liquides ou visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
9. Procédé de captation de micro-organismes comprenant une étape de mise en contact, de préférence non itérative, d'un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits micro-organismes, avec un dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, dans des conditions permettant de créer une interaction entre les dits micro-organismes et les billes de verre, et d'obtenir les dits micro-organismes captés sur les billes de verre, notamment dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de l'échantillon et captés sur les billes de verre est comprise de 0,001% à
100% en vue de la débactérisation dudit échantillon.
100% en vue de la débactérisation dudit échantillon.
10. Procédé selon la revendication 9, comportant une étape supplémentaire d'élution des micro-organismes précédemment captés dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des susdites billes de verre et la récupération des dits micro-organismes, notamment en vue d'un diagnostic.
11. Procédé selon l'une des revendications 9 à 10, dans lequel les micro-organismes sont choisis parmi les bactéries, et les Fungi, notamment les levures et les champignons, les fungi appartenant notamment aux genres Absidia, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Brettanomyces, Byssochlamys, Candida, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Cryptococcus, Debaryomyces, Emericella, Epicoccum, Eupenicillium, Eurotium, Fusarium, Galactomyces, Geotrichum, Gliocladium, Hanseniaspora, Humicola, Hyphopichia, Kluyveromyces, Lichtheimia, Lodderomyces, Meyerozyma, Monascus, Mucor, Mycocladus, Neosartorya, Nigrospora, Paecilomyces, Penicillium, Pestalotia, Phoma, Phytophthora, Pichia, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Sclerotinia, Scopulariopsis, Serpula, Stemphylium Talaromyces, Thielaviopsis, Torulaspora, Trichoderma, Trichosporon, Trichothetium, Ulocladium, Verticillium, Wallemia, Wickerhamomyces, Xylaria, Zygosaccharomyces, les bactéries étant en particulier des bactéries Gram + ou Gram ¨, notamment appartenant aux genres Acetobacter, Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes, Alicyclobacillus, Aquaspirillum, Asaia, Bacillus, Bifidobacterium sp., Bordetella, Brachybacterium, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Burkholderia, Buttiauxella, Campylobacter, Carnobacterium, Cellulomona, Citrobacter, Clavibacter Clostridium, Corynebacterium, Cronobacte, Cupriavidu, Curtobacterium, Elizabethkingia, Enteractinococcus, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Flacklamia, Flavobacterium, Geobacillus, Glutamicibacte, Halobacillus, Klebsiella, Kocuria, Lactobacillus, Lactococcus, Leclercia, Lelliottia, Leuconostoc, Lysinibacillus, Macrococcus, Methylobacteriu, Microbacterium spp. (CDC A-5), Micrococcus, Moraxell, Mycobacterium, Nesterenkonia, Oceanobacillus sp, Ochrobactrum, Paenibacillus, Pandorae, Pantoea, Paracoccus, Pasteurell, Pediococcus, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Roseomona, Rothia, Salmonella, Sanguibacter, Serratia, Shewanella, Sphingomonas, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Thermoanaerobacterium, Variovorax, Virgibacillus.
12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel l'échantillon liquide ou visqueux est choisi parmi :
- un échantillon biologique, humain ou vétérinaire, tel que l'urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses, - un échantillon pharmaceutique, tel que les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques, - un échantillon cosmétique, tel que les démaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings, - un échantillon alimentaire, tel que les boissons, notamment l'eau (plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, tel que le jus d'orange, les sodas, les boissons alcoolisées, les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits laitiers, les ovoproduits, - Un échantillon d'eaux de process, tel qu'un échantillon issu des boucles de nettoyage.
- Un échantillon de type environnemental, tel que des échantillons marins, ou pluviaux.
- un échantillon biologique, humain ou vétérinaire, tel que l'urine, le sang, le liquide synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses, - un échantillon pharmaceutique, tel que les solutions injectables, les sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques, - un échantillon cosmétique, tel que les démaquillants, produits pour le nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings, - un échantillon alimentaire, tel que les boissons, notamment l'eau (plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, tel que le jus d'orange, les sodas, les boissons alcoolisées, les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits laitiers, les ovoproduits, - Un échantillon d'eaux de process, tel qu'un échantillon issu des boucles de nettoyage.
- Un échantillon de type environnemental, tel que des échantillons marins, ou pluviaux.
13. Kit comprenant des billes de verre, du polyéthylèneimine et un dispositif sous forme de colonne et des solutions d'élution de type chimique.
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