TWI695843B - 對抗糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體（ｇｉｔｒ）之抗體及其用途 - Google Patents

對抗糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體（ｇｉｔｒ）之抗體及其用途 Download PDF

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Abstract

本文提供結合至糖皮質激素可誘導之TNF受體(GITR)之抗體或其抗原結合部分。亦提供該等蛋白質於治療應用，例如於癌症之治療中之用途。進一步提供產生該等抗體之細胞、編碼該等抗體之重鏈及/或輕鏈可變區之聚核苷酸及包含編碼該等抗體之重鏈及/或輕鏈可變區之該等聚核苷酸的載體。

Description

對抗糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體(GITR)之抗體及其用途
本發明係關於糖皮質激素可誘導之TNF受體(GITR)之抗體或其抗原結合部分及其用於治療應用，例如於癌症之治療中之用途。
糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)(一種共刺激分子，亦稱作TNFRSF18、AITR、CD357及GITR-D)係最初在經地塞米松(dexamethasone)處理之鼠類T細胞系中鑑別出之TNF受體家族之成員(Nocentini等人，PNAS 1997；94：6216-21)。TNF受體家族之其他相關成員包括CD40、CD27、4-1BB及OX40。儘管GITR表現在原初CD4+及CD8+細胞中較低，但其在調控性T細胞中組成型表現(Tone等人，PNAS 2003；100：15059-64)。然而，一旦在效應物T細胞上誘導其表現，則GITR接合促進其活化、增殖及細胞介素產生(Watts,Annual Reviews in Immunology 2005；23：23-68)。關於CD4+CD25+調控性T細胞(Treg)，Shimizu使用混合培養物阻抑分析報導GITR接合阻抑其功能(Shimizu等人，Nature Immunology 2002；3：135-42)。然而，由Stephans等人(JI 2004 15；173(8)：5008-20)之後續工作確定T效應物 (Teff)細胞上之GITR接合使得其對Treg表現較不敏感，從而解釋Treg-Teff細胞共培養物中觀察到之降低阻抑。在多種腫瘤模型中，DTA-1(大鼠抗小鼠GITR)抗體介導之GITR刺激促進抗腫瘤免疫性。
GITR-L(即GITR之配體)在抗原呈遞細胞(例如，B細胞、樹突細胞)中表現程度較低，但在由(例如)病毒感染活化後在該等細胞中瞬時上調(Suvas等人，J Virol.2005；79：11935-42)。
鑒於對用於靶向疾病(例如癌症)之改良策略、來自增強之免疫反應(具體而言T細胞反應)之益處之持續需要，調節GITR活性之新穎藥劑及方法係高度合意的。
本文提供特異性結合GITR且具有合意之功能性質之經分離抗體，例如單株抗體、具體而言人類單株抗體。該等性質包括結合至人類GITR、結合至猴GITR(例如，食蟹猴GITR)之高親和力及刺激抗原特異性T細胞反應之能力。本文所述抗體可用於刺激例如帶有腫瘤或帶有病毒(病毒感染)個體中之抗原特異性T細胞反應及檢測試樣中之GITR蛋白。
在一個態樣中，本文提供經分離抗體或其抗原結合部分，其結合至GITR且展現以下性質中之至少一者：(a)結合至可溶性人類GITR；(b)結合至膜結合之人類GITR；(c)結合至膜結合食蟹猴GITR；(d)誘導或增強T細胞活化，例如抗原特異性T細胞活化；(e)抑制GITR配體與3A9-hGITR細胞上之GITR的結合；(f)至多部分抑制GITR配體與活化T細胞上之GITR的結合；(g)結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)上之構象表位；(h)結合至O-連接及N-糖基化及未糖基化人類GITR二者； (i)在不與Fc受體結合下具有激動劑活性，但其中與Fc受體之結合進一步增強激動劑活性；及(j)在任一方向或兩個方向上與抗體28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10中之一或多者競爭結合至人類GITR。
在某些實施例中，本文所述抗GITR抗體或其抗原結合部分刺激抗腫瘤免疫反應，例如抗原特異性T細胞反應。在某些實施例中，抗GITR抗體或其抗原結合部分增加表現GITR之T細胞中之細胞介素產生(例如，IL-2及/或IFN-γ)及/或增加T細胞增殖。
在某些實施例中，抗GITR抗體或其抗原結合部分不結合至Fc受體。在某些實施例中，抗GITR抗體或其抗原結合部分結合至一或多個FcγR，例如活化或抑制性FcγR。
在某些實施例中，抗GITR抗體或其抗原結合部分以如藉由Biacore量測之10nM或更小之KD結合至可溶性人類GITR，以如藉由Scatchard量測之1nM或更小之KD結合至膜結合之人類GITR，以如藉由FACS量測之1nM或更小之EC50結合至膜結合之人類GITR，以如藉由FACS量測之10nM或更小之EC50結合至膜結合食蟹猴GITR，誘導或增強T細胞(例如Teff細胞)活化而無需多價交聯，以如藉由FACS量測之1μg/mL或更小之EC50抑制GITR配體與GITR結合，及/或在成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)之區域PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)內結合。
本文提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至GITR且包含呈選自以下之可變重鏈及可變輕鏈對之三個可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR：(a)SEQ ID NO：13及14；(b)SEQ ID NO：26及27； (c)SEQ ID NO：39及40；(d)SEQ ID NO：52及53；(e)SEQ ID NO：52及54；(f)SEQ ID NO：71及72；(g)SEQ ID NO：84及85；(h)SEQ ID NO：97及98；(i)SEQ ID NO：97及99；(j)SEQ ID NO：115及116；(k)SEQ ID NO：128及129；(l)SEQ ID NO：128及130；及(m)SEQ ID NO：335及336。
本文提供結合至GITR且包含以下之經分離單株抗體或其抗原結合部分：(a)分別包含SEQ ID NO：20、21及22之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：23、24及25之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(b)分別包含SEQ ID NO：33、34及35之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：36、37及38之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；或(c)分別包含SEQ ID NO：46、47及48之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：49、50及51之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(d)分別包含SEQ ID NO：62、63及64之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：65、66及67之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(e)分別包含SEQ ID NO：62、63及64之重鏈CDR1、CDR2及 CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：68、69及70之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(f)分別包含SEQ ID NO：78、79及80之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：81、82及83之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(g)分別包含SEQ ID NO：91、92及93之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：94、95及96之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(h)分別包含SEQ ID NO：106、107及108之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：109、110及111之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(i)分別包含SEQ ID NO：106、107及108之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：112、113及114之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(j)分別包含SEQ ID NO：122、123及124之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：125、126及127之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(k)分別包含SEQ ID NO：138、139及140之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：141、142及143之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(l)分別包含SEQ ID NO：138、139及140之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：144、145及146之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；或(m)分別包含SEQ ID NO：342、343及344之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：345、346及347之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
本文提供結合至GITR且包含重鏈及輕鏈可變區之經分離單株抗體或其抗原結合部分，其中該重鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：13、26、39、52、71、84、97、115、128及335。
本文提供結合至GITR且包含重鏈及輕鏈可變區之經分離單株抗體或其抗原結合部分，其中該輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336。
本文提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至GITR且包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少85%一致(例如90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致)之重鏈及輕鏈可變區序列：(a)分別SEQ ID NO：13及14；(b)分別SEQ ID NO：26及27；(c)分別SEQ ID NO：39及40；(d)分別SEQ ID NO：52及53；(e)分別SEQ ID NO：52及54；(f)分別SEQ ID NO：71及72；(g)分別SEQ ID NO：84及85；(h)分別SEQ ID NO：97及98；(i)分別SEQ ID NO：97及99；(j)分別SEQ ID NO：115及116；(k)分別SEQ ID NO：128及129；(l)分別SEQ ID NO：128及130；及 (m)分別SEQ ID NO：335及336。
本文提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至GITR且包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%99%或100%一致的重鏈及輕鏈序列：(a)分別SEQ ID NO：15及16；(b)分別SEQ ID NO：17及19；(c)分別SEQ ID NO：18及19；(d)分別SEQ ID NO：28及29；(e)分別SEQ ID NO：30及32；(f)分別SEQ ID NO：31及32；(g)分別SEQ ID NO：41及42；(h)分別SEQ ID NO：43及45；(i)分別SEQ ID NO：44及45；(j)分別SEQ ID NO：55及56；(k)分別SEQ ID NO：55及57；(l)分別SEQ ID NO：58及60；(m)分別SEQ ID NO：59及60；(n)分別SEQ ID NO：58及61；(o)分別SEQ ID NO：59及61；(p)分別SEQ ID NO：73及74；(q)分別SEQ ID NO：75及77；(r)分別SEQ ID NO：76及77；(s)分別SEQ ID NO：86及87；(t)分別SEQ ID NO：88及90；(u)分別SEQ ID NO：89及90；(v)分別SEQ ID NO：102及104； (w)分別SEQ ID NO：103及104；(x)分別SEQ ID NO：100及101；(y)分別SEQ ID NO：100及371；(z)分別SEQ ID NO：102及105；(za)分別SEQ ID NO：103及105；(zb)分別SEQ ID NO：117及118；(zc)分別SEQ ID NO：119及121；(zd)分別SEQ ID NO：120及121；(ze)分別SEQ ID NO：131及132；(zf)分別SEQ ID NO：134及136；(zg)分別SEQ ID NO：135及136；(zh)分別SEQ ID NO：131及133；(zi)分別SEQ ID NO：134及137；(zj)分別SEQ ID NO：135及137(zk)分別SEQ ID NO：337及338；(zL)分別SEQ ID NO：339及341；及(zm)分別SEQ ID NO：340及341。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合部分(a)與28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及/或6G10結合至GITR上之相同表位，及(b)將28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、及/或6G10與活化T細胞上之GITR的結合抑制至少50%、60%、70%、80%或90%，如藉由(例如)FACS所量測。
在某些實施例中，抗GITR抗體或其抗原結合部分在成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)之區域PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)內結合。在一些實施例中，本文 所述抗GITR抗體或其抗原結合部分結合至人類及食蟹猴GITR二者。
在某些實施例中，抗GITR抗體或其抗原結合部分係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體或其變體。在某些實施例中，抗GITR抗體或其抗原結合部分包含較差效應物(effectorless)IgG1 Fc，例如具有以下突變之較差效應物IgG1 Fc：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。在某些實施例中，抗GITR抗體或其抗原結合部分包含結合至活化FcγR或(例如)相對於野生型IgG1 Fc具有增強之與活化FcγR之結合的Fc。在某些實施例中，抗GITR抗體或其抗原結合部分之CDR區中之甲硫胺酸殘基取代不經歷氧化之胺基酸殘基。在某些實施例中，抗GITR抗體或其抗原結合部分係人類或人類化抗體。
本文提供結合至GITR之經分離單株抗體或其抗原結合部分，該GITR包括包含IgG2鉸鏈及不屬IgG2同型之CH1、CH2及CH3中之至少一者的經修飾重鏈恆定區，其中抗GITR抗體相對於相同但具有非IgG2鉸鏈之抗GITR抗體具有增強之激動劑活性。
在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包括包含選自由SEQ ID NO：223至226及283至290組成之群之胺基酸序列之重鏈恆定區或與SEQ ID NO：223至226及283至290之胺基酸序列至多5個胺基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈恆定區。
在某些實施例中，重鏈包含選自由SEQ ID NO：15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362組成之群之胺基酸序列、或與SEQ ID NO：15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362之胺基酸序列至多10個胺基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈。
在某些實施例中，輕鏈包含選自由SEQ ID NO：16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341及371組成之群之胺基酸序列、或與SEQ ID NO：16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341及371之胺基酸序列至多10個胺基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈。
本文提供包含連接至具有第二結合特異性之分子之抗GITR抗體的雙特異性分子。
本文提供編碼抗GITR抗體或其抗原結合部分之重鏈及/或輕鏈可變區之核酸、包含核酸分子之表現載體及經表現載體轉化之細胞。
本文提供包含連接至藥劑之本文所述抗GITR抗體的免疫偶聯物。
本文提供包含抗GITR抗體或其抗原結合部分及載劑之組合物。亦本文提供包含抗GITR抗體或其抗原結合部分及使用說明書之套組。
本文提供製備抗GITR抗體之方法，其包含使抗GITR抗體在細胞中表現並自細胞分離該抗體。
本文提供刺激抗原特異性T細胞反應之方法，其包含使T細胞與抗GITR抗體或其抗原結合部分接觸，使得刺激抗原特異性T細胞反應。
本文提供活化或共刺激T細胞(例如效應物T細胞)之方法，其包含使細胞(例如效應物T細胞)與抗GITR抗體或其抗原結合部分及CD3接觸，其中活化或共刺激效應物T細胞。
本文提供增加T細胞中之IL-2及/或IFN-γ產生及/或T細胞之增殖的方法，其包含使T細胞與有效量之抗GITR抗體或其抗原結合部分接 觸。
本文提供增加個體中T細胞中之IL-2及/或IFN-γ產生之方法，其包含投與有效量之抗GITR抗體或其抗原結合部分、包含抗GITR抗體之雙特異性分子或偶聯物或包含抗GITR抗體之組合物以增加自T細胞之IL-2及/或IFN-γ產生。
本文提供減少或耗盡有需要之個體之腫瘤中T調控性細胞之數目的方法，其包含投與有效量之抗GITR抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或偶聯物以減少腫瘤中T調控性細胞之數目，其中抗體或其抗原結合部分具有效應物或增強效應物功能。
本文提供刺激個體中免疫反應之方法，其包含向個體投與有效量之抗GITR抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或偶聯物，使得刺激個體中之免疫反應。在某些實施例中，個體具有腫瘤且刺激抵抗腫瘤之免疫反應。
本文提供抑制個體中腫瘤細胞生長之方法，其包含向個體投與抗GITR抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或偶聯物，使得抑制個體中腫瘤之生長。
本文提供藉由(例如)免疫療法治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之抗GITR抗體或其抗原結合部分、包含抗GITR抗體之雙特異性分子或偶聯物或包含抗GITR抗體之組合物以治療癌症。在某些實施例中，癌症係膀胱癌、乳癌、子宮/子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、食道癌、胃腸癌、胰臟癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎癌、頭頸癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝癌、甲狀腺癌、皮膚癌、中樞神經系統之贅瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相關癌症。在某些實施例中，癌症係轉移性癌症、難治性癌症或復發性癌症。
在某些實施例中，本文所述方法進一步包含投與一或多種額外 治療劑與抗GITR抗體(例如抗PD1抗體、LAG-3抗體、CTLA-4抗體及/或PD-L1抗體)。
本文提供檢測試樣中GITR之存在之方法，其包含在容許在抗體或其抗原結合部分與GITR之間形成複合物之條件下使試樣與抗GITR抗體或其抗原結合部分接觸及檢測複合物之形成。
本文提供本文所述抗GITR抗體之用途，其用於治療癌症、刺激個體中之免疫反應、刺激抗原特異性T細胞反應、活化或共刺激T細胞、增加T細胞中之IL-2及/或IFN-γ產生及/或T細胞之增殖、減少或耗盡腫瘤中T調控性細胞之數目及/或抑制腫瘤細胞生長。亦本文提供本文所述抗GITR抗體之用途，其用於製備用於刺激個體中之免疫反應、刺激抗原特異性T細胞反應、活化或共刺激T細胞、增加T細胞中之IL-2及/或IFN-γ產生及/或T細胞之增殖、減少或耗盡腫瘤中T調控性細胞之數目及/或抑制腫瘤細胞生長的藥劑。
自以下詳細說明及實例(其不應理解為具有限制性)將明瞭本發明之其他特徵及優點。
圖1顯示單株抗體28F3(分別SEQ ID NO：13及14)、18E10(分別SEQ ID NO：39及40)及19D3(分別SEQ ID NO：26及27)之重鏈及輕鏈可變區的胺基酸序列。28F3之VH及VL CDR加下劃線。
圖2A顯示28F3人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：147)及胺基酸序列(SEQ ID NO：13)。描繪CDR1(SEQ ID NO：20)、CDR2(SEQ ID NO：21)及CDR3(SEQ ID NO：22)區且指示V、D及J種系來源。
圖2B顯示28F3人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：148)及胺基酸序列(SEQ ID NO：14)。描繪CDR1(SEQ ID NO：23)、CDR2(SEQ ID NO：24)及CDR3(SEQ ID NO：25)區且指示V及J 種系來源。
圖3A顯示18E10人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：158)及胺基酸序列(SEQ ID NO：39)。描繪CDR1(SEQ ID NO：46)、CDR2(SEQ ID NO：47)及CDR3(SEQ ID NO：48)區且指示V、D及J種系來源。
圖3B顯示18E10人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：159)及胺基酸序列(SEQ ID NO：40)。描繪CDR1(SEQ ID NO：49)、CDR2(SEQ ID NO：50)及CDR3(SEQ ID NO：51)區且指示V及J種系來源。
圖4A顯示19D3人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：154)及胺基酸序列(SEQ ID NO：26)。描繪CDR1(SEQ ID NO：33)、CDR2(SEQ ID NO：34)及CDR3(SEQ ID NO：35)區且指示V、D及J種系來源。
圖4B顯示19D3人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：155)及胺基酸序列(SEQ ID NO：27)。描繪CDR1(SEQ ID NO：36)、CDR2(SEQ ID NO：37)及CDR3(SEQ ID NO：38)區且指示V及J種系來源。
圖5A顯示3C3人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：162)及胺基酸序列(SEQ ID NO：52)。描繪CDR1(SEQ ID NO：62)、CDR2(SEQ ID NO：63)及CDR3(SEQ ID NO：64)區且指示V、D及J種系來源。
圖5B顯示3C3人類單株抗體之κ輕鏈可變區(VK1)之核苷酸序列(SEQ ID NO：163)及胺基酸序列(SEQ ID NO：53)。描繪CDR1(SEQ ID NO：65)、CDR2(SEQ ID NO：66)及CDR3(SEQ ID NO：67)區且指示V及J種系來源。
圖5C顯示3C3人類單株抗體之κ輕鏈可變區(VK2)之核苷酸序列 (SEQ ID NO：164)及胺基酸序列(SEQ ID NO：54)。描繪CDR1(SEQ ID NO：68)、CDR2(SEQ ID NO：69)及CDR3(SEQ ID NO：70)區且指示V及J種系來源。
圖6A顯示2G6人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：168)及胺基酸序列(SEQ ID NO：71)。描繪CDR1(SEQ ID NO：78)、CDR2(SEQ ID NO：79)及CDR3(SEQ ID NO：80)區且指示V、D及J種系來源。
圖6B顯示2G6人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：169)及胺基酸序列(SEQ ID NO：72)。描繪CDR1(SEQ ID NO：81)、CDR2(SEQ ID NO：82)及CDR3(SEQ ID NO：83)區且指示V及J種系來源。
圖7A顯示8A6人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：172)及胺基酸序列(SEQ ID NO：84)。描繪CDR1(SEQ ID NO：91)、CDR2(SEQ ID NO：92)及CDR3(SEQ ID NO：93)區且指示V、D及J種系來源。
圖7B顯示8A6人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：173)及胺基酸序列(SEQ ID NO：85)。描繪CDR1(SEQ ID NO：94)、CDR2(SEQ ID NO：95)及CDR3(SEQ ID NO：96)區且指示V及J種系來源。
圖8A顯示9G7人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：176)及胺基酸序列(SEQ ID NO：97)。描繪CDR1(SEQ ID NO：106)、CDR2(SEQ ID NO：107)及CDR3(SEQ ID NO：108)區且指示V、D及J種系來源。
圖8B顯示9G7人類單株抗體之κ輕鏈可變區(VK1)之核苷酸序列(SEQ ID NO：177)及胺基酸序列(SEQ ID NO：98)。描繪CDR1(SEQ ID NO：109)、CDR2(SEQ ID NO：110)及CDR3(SEQ ID NO：111)區且指 示V及J種系來源。
圖8C顯示9G7人類單株抗體之κ輕鏈可變區(VK2)之核苷酸序列(SEQ ID NO：178)及胺基酸序列(SEQ ID NO：99)。描繪CDR1(SEQ ID NO：112)、CDR2(SEQ ID NO：113)及CDR3(SEQ ID NO：114)區且指示V及J種系來源。
圖9A顯示14E3人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：182)及胺基酸序列(SEQ ID NO：115)。描繪CDR1(SEQ ID NO：122)、CDR2(SEQ ID NO：123)及CDR3(SEQ ID NO：124)區且指示V、D及J種系來源。
圖9B顯示14E3人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：183)及胺基酸序列(SEQ ID NO：116)。描繪CDR1(SEQ ID NO：125)、CDR2(SEQ ID NO：126)及CDR3(SEQ ID NO：127)區且指示V及J種系來源。
圖10A顯示19H8人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：186)及胺基酸序列(SEQ ID NO：128)。描繪CDR1(SEQ ID NO：138)、CDR2(SEQ ID NO：139)及CDR3(SEQ ID NO：140)區且指示V、D及J種系來源。
圖10B顯示19H8人類單株抗體之κ輕鏈可變區(VK1)之核苷酸序列(SEQ ID NO：187)及胺基酸序列(SEQ ID NO：129)。描繪CDR1(SEQ ID NO：141)、CDR2(SEQ ID NO：142)及CDR3(SEQ ID NO：143)區且指示V及J種系來源。
圖10C顯示19H8人類單株抗體之κ輕鏈可變區(VK2)之核苷酸序列(SEQ ID NO：188)及胺基酸序列(SEQ ID NO：130)。描繪CDR1(SEQ ID NO：144)、CDR2(SEQ ID NO：145)及CDR3(SEQ ID NO：146)區且指示V及J種系來源。
圖11A顯示6G10人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：353)及胺基酸序列(SEQ ID NO：335)。描繪CDR1(SEQ ID NO：342)、CDR2(SEQ ID NO：343)及CDR3(SEQ ID NO：344)區且指示V、D及J種系來源。
圖11B顯示6G10人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：354)及胺基酸序列(SEQ ID NO：336)。描繪CDR1(SEQ ID NO：345)、CDR2(SEQ ID NO：346)及CDR3(SEQ ID NO：347)區且指示V及J種系來源。
圖12顯示28F3之重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：13)與人類種系VH 3-33、3-10及JH6胺基酸序列(分別SEQ ID NO：192、193及196)之比對。
圖13顯示28F3之輕鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：14)與人類種系Vk L18及JK2胺基酸序列(分別SEQ ID NO：204及205)之比對。
圖14顯示18E10之重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：39)與人類種系VH 3-33、6-19及JH6胺基酸序列(分別SEQ ID NO：192、199及197)之比對。
圖15顯示18E10之輕鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：40)與人類種系Vk L15及JK2胺基酸序列(分別SEQ ID NO：207及205)之比對。
圖16顯示19D3之重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：26)與人類種系VH 3-33、3-16及JH6胺基酸序列(分別SEQ ID NO：192、200及198)之比對。
圖17顯示19D3之輕鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：27)與人類種系Vk L15及JK2胺基酸序列(分別SEQ ID NO：207及205)之比對。
圖18顯示3C3之重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：52)與人類種系VH 4-34及JH3胺基酸序列(分別SEQ ID NO：201及202)之比對。
圖19A顯示3C3之輕鏈可變區(VK1)之胺基酸序列(SEQ ID NO：53)與人類種系Vk L15及JK2胺基酸序列(分別SEQ ID NO：207及205)之 比對。
圖19B顯示3C3之輕鏈可變區(VK2)之胺基酸序列(SEQ ID NO：54)與人類種系Vk L20及JK2胺基酸序列(分別SEQ ID NO：208及206)之比對。
圖20顯示2G6之重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：71)與人類種系VH 3-33及JH6胺基酸序列(分別SEQ ID NO：192及197)之比對。
圖21顯示2G6之輕鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：72)與人類種系Vk L15及JK2胺基酸序列(分別SEQ ID NO：207及205)之比對。
圖22顯示8A6之重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：84)與人類種系VH 3-33、3-10及JH6胺基酸序列(分別SEQ ID NO：192、193及197)之比對。
圖23顯示8A6之輕鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：85)與人類種系Vk L18及JK2胺基酸序列(分別SEQ ID NO：204及205)之比對。
圖24顯示9G7之重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：97)與人類種系VH 3-15、3-10及JH6胺基酸序列(分別SEQ ID NO：203、194及198)之比對。
圖25A顯示9G7之輕鏈可變區(VK1)之胺基酸序列(SEQ ID NO：98)與人類種系Vk A27及JK1胺基酸序列(分別SEQ ID NO：209及210)之比對。
圖25B顯示9G7之輕鏈可變區(VK2)之胺基酸序列(SEQ ID NO：99)與人類種系Vk A27及JK5胺基酸序列(分別SEQ ID NO：209及212)之比對。
圖26顯示14E3之重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：115)與人類種系VH 4-34及JH3胺基酸序列(分別SEQ ID NO：201及202)之比對。
圖27顯示14E3之輕鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：116)與人類種系Vk L15及JK1胺基酸序列(分別SEQ ID NO：207及211)之比對。
圖28顯示19H8之重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：128)與人類種系VH 3-33、3-10及JH6胺基酸序列(分別SEQ ID NO：192、195及196)之比對。
圖29A顯示19H8之輕鏈可變區(VK1)之胺基酸序列(SEQ ID NO：129)與人類種系Vk L18及JK1胺基酸序列(分別SEQ ID NO：204及211)之比對。
圖29B顯示19H8之輕鏈可變區(VK2)之胺基酸序列(SEQ ID NO：130)與人類種系Vk L6及JK4胺基酸序列(分別SEQ ID NO：213及214)之比對。
圖30顯示6G10之重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：335)與人類種系VH 3-33、3-10及JH6胺基酸序列(分別SEQ ID NO：192、195及196)之比對。
圖31顯示6G10之輕鏈可變區(VK1)之胺基酸序列(SEQ ID NO：336)與人類種系Vk L18及JK2胺基酸序列(分別SEQ ID NO：204及205)之比對。
圖32顯示各種抗GITR抗體對於活化人類T細胞之結合親和力(以nM表示)，其中無抗體、IgG1及hIgG2抗體作為對照，如藉由FACS所評價。
圖33顯示各種抗GITR抗體對於活化食蟹猴T細胞之結合親和力(以nM表示)，其中無抗體及hIgG1及hIgG2抗體作為對照，如藉由FACS所評價。
圖34A及34B顯示各種抗GITR抗體抑制GITR配體(GITR-L)與GITR 3A9細胞之結合之能力，其中hIgG1、hIgG2、無抗體及僅細胞作為對照。
圖34C顯示重組GITR-L與活化人類CD4及CD8 T細胞之結合。
圖34D顯示GITR-L部分阻斷28F3-hIgG1與活化人類CD4+ T細胞 之結合。0.5μg/mL之固定濃度之28F3-hIgG1與活化T細胞之結合以0.0024μg/mL之IC50由預結合GITR-L部分阻斷。
圖34E顯示28F3-hIgG1不阻斷0.6μg/ml GITR-L與活化人類T細胞之結合。在以0.6mg/mL、約90%飽和度向CD4+ T細胞中添加GITR-L時，在100mg/mL至0.00056mg/mL範圍內之預結合28F3-hIgG1不能阻斷GITR-L。
圖34F顯示28F3-hIgG1部分阻斷0.02μg/ml GITR-L與活化人類T細胞之結合。20ng/mL之固定濃度之GITR-L與活化T細胞之結合以0.075μg/mL之IC50由預結合之28F3-hIgG1部分阻斷。
圖35A顯示西方墨點，其展示抗GITR抗體28F3結合至天然但並不欲變性之人類GITR且該結合並不受N-連接糖基化之存在或不存在影響。「+」符號指示經PNGase F處理以去除N-連接糖基化之試樣。
圖35B係考馬斯藍(Coomassie blue)染色之凝膠，其顯示在轉移至硝基纖維素上用於西方墨點分析之前所有形式之人類GITR之存在。
圖36A-36B顯示28F3及3C3抗體與藉由用胞內蛋白酶Arg-C(1)、胞內蛋白酶Lys-C(2)、胰蛋白酶(3)、胞內蛋白酶Glu-C(4)或胞內蛋白酶Asp-N(5)消解生成之天然GITR片段的結合。
圖37顯示結合至利用胞內蛋白酶Glu-C及胰蛋白酶(「Glu-C及胰蛋白酶」)、胞內蛋白酶Arg-C(「Arg-C」)、胞內蛋白酶Lys-C及胰蛋白酶(「Lys-C及胰蛋白酶」)、胰蛋白酶、或胞內蛋白酶Asp-N及胞內蛋白酶Glu-C(「AspN及GluC」)消解天然人類GITR蛋白生成之人類GITR肽片段之抗GITR抗體28F3的熱圖視圖，從而鑑別與28F3抗體結合之表位之位置(加框區)。人類GITR之成熟細胞外結構域之胺基酸序列以深灰色顯示且與其以C-末端連接之小鼠Fc之序列以淺灰色顯示。
圖38A顯示塗佈28F3之珠粒與來自天然人類GITR之胰蛋白酶消解產生之肽培育後流出部分中之肽。
圖38B顯示兩種主要28F3結合肽(由星號指示)。
圖38C顯示藉由圖34B中之兩個峰之第一個之LC-MS鑑別為對應於具有所示序列且無O-連接糖基化之N-末端肽。
圖38D顯示藉由圖34B中之兩個峰之第二個之LC-MS鑑別為對應於具有所示序列且在T20上具有O-連接糖基化之N-末端肽。
圖38E顯示在用與28F3一起培育之較長肽之胞內蛋白酶Asp-N原位消解後剩餘之GITR肽。
圖39A顯示重組人類GITR/Fc以及重組人類GITR/Fc與28F3 IgG1之蛋白複合物之消化性肽的列表，從而對GITR之N-末端區達成86%之序列覆蓋率。
圖39B顯示在28F3 IgG1 mAb(「GITR.6」)不存在/存在下藉由HDX質譜(MS)之氘攝取量。
圖39C繪示由28F3結合之成熟人類GITR中之兩個區，如藉由HDX MS所測定。
圖40顯示在板結合之抗CD3抗體存在下各種激動劑抗GITR抗體對3A9-hGITR細胞之IL-2分泌的效應。
圖41A顯示激動劑抗GITR抗體18E10、13H2(與28F3相同)及28F3對由特異性抗原活化之3A9-hGITR細胞之IL-2分泌的效應。
圖41B顯示激動劑抗GITR抗體3C3(顯示為「GITR.3」)、28F3、19D3及18E10對由特異性抗原活化之3A9-hGITR細胞之IL-2分泌的效應。
圖42A顯示各種激動劑抗GITR HuMab抗體對由經CHO-OKT3細胞(即，表現OKT3 scfv之CHO細胞)刺激之T細胞之干擾素γ(IFN-γ)分泌的效應。
圖42B顯示激動劑抗GITR抗體28F3對由經表現OKT3之CHO細胞刺激之CD4+ T細胞之IL-2分泌的效應，其中T細胞係來自第一供體。
圖42C顯示抗GITR抗體28F3對由經表現OKT3之CHO細胞刺激之CD4+ T細胞之IFN-γ分泌的效應，其中T細胞係來自第一供體。
圖42D顯示抗GITR抗體28F3對由經表現OKT3之CHO細胞刺激之CD4+ T細胞之IL-2分泌的效應，其中T細胞係來自第二供體。
圖42E顯示抗GITR抗體28F3對由經表現OKT3之CHO細胞刺激之CD4+ T細胞之IFN-γ分泌的效應，其中T細胞係來自第二供體。
圖43顯示在HEL48-63肽存在下抗GITR抗體28F3(IgG2)、28F3-F(ab’)2片段及28F3-Fab對由經LK35.2細胞刺激之3A9-hGITR細胞之IL-2分泌的效應。
圖44顯示具有單株抗體28F3-FITC之人類扁桃體樣品的免疫組織化學。
圖45A-45D顯示MC38結腸腺癌模型中大鼠抗小鼠GITR抗體DTA-1之不同同型對抗腫瘤活性之效應，該抗腫瘤活性係藉由經該等同型處理之個別小鼠之腫瘤體積變化來量測：(圖45A)對照小鼠IgG1抗體(10mg/kg)；(圖45B)DTA-1大鼠IgG2b(10mg/kg)；(圖45C)DTA-1小鼠IgG1(10mg/kg)；(圖45D)DTA-1小鼠IgG2a(10mg/kg)。針對10隻小鼠之每一組顯示每組之無腫瘤(TF)小鼠之數目。
圖46A及46B顯示經不同同型之DTA-1抗體(10mg/kg)處理之小鼠組中之MC38腫瘤之平均(圖46A)及中值腫瘤體積(圖46B)變化。
圖47A-47F顯示經不同抗GITR(DTA-1)及抗CTLA-4(9D9)同型及所指示對照抗體處理之帶有MC38腫瘤之小鼠之脾(圖47A-47C)及腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)(圖47D-47F)的流式細胞分析。(圖47A)脾中之CD8+ T細胞之百分比；(圖47B)脾中之CD4+細胞之百分比；(圖47C)脾中亦係Foxp3+之CD4+細胞之百分比；(圖47D)TIL中CD8+ T細胞之百分比；(圖47E)TIL中CD4+細胞之百分比；(圖47F)TIL中亦係Foxp3+之CD4+細胞之百分比。
圖48A-48F顯示MC38模型中經重新改造以最小化聚集之大鼠抗小鼠GITR抗體DTA-1(稱作「mGITR.7」)之不同同型對抗腫瘤活性的效應，該抗腫瘤活性係藉由經該等同型處理之個別小鼠之腫瘤體積變化量測：(圖48A)對照小鼠IgG1抗體；(圖48B)mGITR.7 mIgG1；(圖48C)mGITR.7 mIgG1-D265A；(圖48D)mGITR.7 mIgG2a；(圖48E)mGITR.7 mIgG2b；(圖48F)mGITR.7大鼠IgG2b。針對9隻小鼠之每一組顯示每組之TF小鼠之數目。
圖49A及49B顯示經不同同型之經重新改造之DTA-1抗體處理之小鼠組中MC38腫瘤之平均(圖49A)及中值腫瘤體積(圖49B)變化。
圖50A及50B顯示不同DTA-1(經重新改造之「mGITR」DTA-1或最初經改造之「DTA-1」抗體)及抗CTLA-4(9D9)同型對帶有MC38腫瘤之小鼠之脾(圖50A)及TIL(圖50B)中Foxp3+/CD4+ Treg的效應之流式細胞分析。
圖51A-51E顯示Sa1N纖維肉瘤小鼠模型中不同小鼠DTA-1同型之抗腫瘤活性，如藉由經該等同型處理之個別小鼠之腫瘤體積變化所量測：(圖51A)對照小鼠IgG1抗體；(圖51B)DTA-1小鼠IgG2a；(圖51C)DTA-1大鼠IgG2b；(圖51D)DTA-1小鼠IgG1；(圖51E)DTA-1小鼠IgG1-D265A。針對至多10隻小鼠之每一組顯示每組之TF小鼠之數目。
圖52A及52B顯示經不同同型之DTA-1抗體處理之小鼠組中Sa1N腫瘤之平均(圖52A)及中值腫瘤體積(圖52B)。
圖53A及53B顯示不同DTA-1及抗CTLA-4(9D9)同型對帶有Sa1N腫瘤之小鼠之脾(圖53A)及TIL(圖53B)中Foxp3+/CD4+ Treg的效應。
圖54A-54D顯示使用分級MC38結腸腺癌模型之大鼠抗GITR抗體DTA-1對腫瘤體積之效應。在第7、10及14天用(圖54A)對照mIgG1、(圖54B)mIgG+DTA-1、(圖54C)mIgG+PD-1及(圖54D)PD-1+ DTA-1處理小鼠。針對10隻小鼠之每一組顯示每組之無腫瘤(TF)小鼠之數目。
圖55A及55B顯示抗GITR抗體28F3中VH CDR3之突變之各種組合對與3A9-hGITR細胞之結合的效應。
圖56A-56F顯示在板結合之抗CD3存在下抗GITR抗體28F3中VH CDR3之突變之各種組合對自3A9-hGITR細胞之IL-2分泌之量的效應。
圖57顯示所指示抗GITR抗體對於活化T細胞之結合親和力。所測試抗體包含以下重鏈恆定區中之一者：IgG1恆定區(「抗GITR.g1f」)、較差效應物IgG1恆定區(「抗GITR.g1.1f」)、IgG2恆定區(「抗GITR-G2」)、IgG2鉸鏈及IgG1 Fc結構域(「抗GITR.G2.G1f」)及IgG2鉸鏈及較差效應物IgG1 Fc結構域(「抗GITR.G2.G1.1f」)。
圖58A-58C顯示自經具有不同重鏈恆定區之可溶性抗人類GITR抗體刺激之供體CD4 T細胞之IFN-γ及IL-2的分泌。圖58A顯示自經表現OKT3之CHO細胞及不同濃度之具有IgG2-IgG1恆定區之抗人類GITR抗體刺激之供體CD4 T細胞的IFN-γ分泌。圖58B顯示自經表現OKT3之CHO細胞及不同濃度之IgG1重鏈恆定結構域或IgG2-IgG1雜合重鏈恆定結構域刺激之供體CD4 T細胞的IL-2分泌。圖58C顯示經表現OKT3之CHO細胞及不同濃度之圖55A及B中抗體之較差效應物型式(IgG1.1)刺激之供體CD4 T細胞的IL-2分泌。
圖59顯示在板結合之抗CD3存在下所指示抗GITR抗體對自3A9-hGITR細胞之IL-2分泌的比較。
圖60A-60D顯示28F3.IgG1及28F3.IgG1.1對Treg及Teff細胞之增殖之效應。
圖61A-61F顯示28F3.IgG1(「GITR.6IgG1」)及28F3.IgG1.1 (「GITR.6IgG1.1」)對來自兩種不同供體之活化CD4+細胞、CD8+細胞及富含Treg之細胞之NK細胞誘導之溶解的效應。
圖62A-62C顯示對照hIgG1抗體、28F3.IgG1(「抗GITR IgG1」)及28F3.IgG1.1(「抗GITR IgG1.1」)對MC38腫瘤生長之效應。
圖63A及63B分別顯示經對照hIgG1抗體、28F3.IgG1(「抗GITR IgG1」)及28F3.IgG1.1(「抗GITR IgG1.1」)處理之小鼠中MC38腫瘤之平均體積及中值體積。
圖64A及64B分別顯示經對照hIgG1抗體、28F3.IgG1(「抗GITR IgG1」)及28F3.IgG1.1(「抗GITR IgG1.1」)處理之具有MC38腫瘤之小鼠的體重變化平均%及體重變化中值%。
圖65顯示MC38腫瘤模型中28F3.IgG1(「GITR IgG1」)相對於同型對照對Treg細胞之耗盡之效應。
圖66顯示MC38腫瘤模型中28F3.IgG1(「GITR IgG1」)相對於同型對照對CD8+ T細胞之百分比的效應。
圖67顯示可溶性交聯28F3.IgG1(「GITR.6IgG1」)及28F3.IgG1.1(「GITR.6IgG1.1」)對在與CHO-OKT3及CHO-OKT3-CD32a細胞共培養時自T細胞之IFN-γ分泌的效應。
圖68顯示可溶性交聯28F3.IgG1(「GITR.6IgG1」)及28F3.IgG1.1(「GITR.6IgG1.1」)對在與CHO-OKT3及CHO-OKT3-CD32a細胞共培養時T細胞增殖的效應。
本文闡述特異性結合至GITR且藉此活化下游GITR信號傳導之經分離抗體(「激動劑抗GITR抗體」)，具體而言單株抗體，例如人類單株抗體。在某些實施例中，本文所述抗體係源自特定重鏈及輕鏈種系序列及/或包括包含特定胺基酸序列之特定結構特徵，例如CDR區。本文提供經分離抗體、製備該等抗體之方法、包含該等抗體之免疫偶 聯物及雙特異性分子及經調配以含有該等抗體之醫藥組合物。本文亦提供單獨或與其他免疫刺激劑(例如，抗體)及/或癌症療法組合使用該等抗體用於免疫反應增強之方法。因此，本文所述抗GITR抗體可用於多種治療應用中之治療，包括(例如)抑制腫瘤生長及治療病毒感染。
定義
為了更容易瞭解本說明，首先定義某些術語。其他定義在整個詳細說明中進行闡釋。
如本文所用術語「糖皮質激素可誘導之TNF受體」或「GITR」係指作為TNF-受體超家族之成員之受體，其結合至GITR配體(GITR-L)。GITR亦稱作腫瘤壞死因子受體超家族成員18(TNFRSF18)、AITR及CD357。術語「GITR」包括由細胞天然表現之GITR之任何變體或同種型。因此，本文所述抗體可與來自除人類外之物種之GITR(例如，食蟹猴GITR)交叉反應。或者，抗體可對人類GITR具有特異性且可不展現與其他物種之任何交叉反應性。GITR或其任何變體及同種型可自天然表現其或使用業內熟知之技術及/或彼等本文所述者以重組方式產生之細胞或組織分離。
已鑑別人類GITR之三種同種型，其全部共用相同細胞外結構域，其C-末端部分除外。變體1(登錄號NP_004186；SEQ ID NO：1)由241個胺基酸組成且代表最長之轉錄物。與變體2相比，其含有導致移碼之超編碼區段。與同種型2相比，所得蛋白質(同種型1)含有不同且較短之C-末端。變體2(登錄號NP_683699；SEQ ID NO：2)編碼最長蛋白質(同種型2)，由255個胺基酸組成，且係可溶的。與變體2相比，變體3(登錄號NP_683700；SEQ ID NO：3)含有=導致移碼之超編碼區段。與同種型2相比所得蛋白質(同種型3)含有不同且較短之C-末端，且由234個胺基酸組成。
以下係三種已知人類GITR同種型、cyno GITR及GITR-L之胺基酸序列。
人類GITR同種型1(登錄號NP_004186；SEQ ID NO：1；由具有登錄號NM_004195.2之核苷酸序列編碼)：
Figure 104118186-A0305-02-0028-2
人類GITR同種型2(登錄號NP_683699.1；SEQ ID NO：2；由具有登錄號NM_148901.1之核苷酸序列編碼)：
Figure 104118186-A0305-02-0028-3
人類GITR同種型3(登錄號NP_683700.1；SEQ ID NO：3；由具有登錄號NM_148902.1之核苷酸序列編碼)：
Figure 104118186-A0305-02-0028-4
同種型1-3之信號序列對應於胺基酸1-25。因此，成熟同種型1、2及3分別由胺基酸26至241、255或234組成。成熟GITR之細胞外結構域由胺基酸26-162組成且具有以下胺基酸序列：
Figure 104118186-A0305-02-0029-5
Figure 104118186-A0305-02-0029-8
(SEQ ID NO：4)
食蟹猴GITR蛋白序列(SEQ ID NO：5)：
Figure 104118186-A0305-02-0029-6
人類GITR-L蛋白序列(登錄號NP_005083.2；SEQ ID NO：6)：
Figure 104118186-A0305-02-0029-7
如本文所用術語「抗體」包括全抗體及其任一抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或單鏈。在一個實施例中，「抗體」係指包含由二硫鍵互連之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的糖蛋白或其抗原結合部分。每一重鏈包括重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。在某些天然抗體中，重鏈恆定區包括三個結構域：CH1、CH2及CH3。在某些天然抗體中，每一輕鏈包括輕鏈可變區(在本文中縮寫 為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個結構域(CL)。可將VH及VL區進一步細分成超變區(稱為互補決定區(CDR))及更保守之區(稱為框架區(FR))，二者間雜排列。每一VH及VL由三個CDR及四個FR構成，其自胺基-末端至羧基-末端按下列順序佈置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統之各種細胞(例如效應物細胞)及經典補體系統之第一組份(C1q))的結合。
抗體通常以高親和力(由10-5M至10-11M或更小之解離常數(KD)反映)特異性結合至其同源抗原。通常將大於約10-4M之任何KD視為指示非特異性結合。如本文所用，「特異性結合」至抗原之抗體係指以高親和力(此意味著KD為10-7M或更小、較佳10-8M或更小、甚至更佳5×10-9M或更小、且最佳介於10-8M與10-10M之間或更小)結合至抗原及實質上一致抗原、但不以高親和力結合至無關抗原的抗體。若抗原展現與給定抗原之高程度序列一致性，例如，若其展現與給定抗原之序列至少80%、至少90%、較佳至少95%、更佳至少97%或甚至更佳至少99%序列一致性，則該抗原與給定抗原「實質上一致」。舉例而言，特異性結合至人類GITR之抗體亦可與來自某些靈長類動物物種之GITR抗原(例如，食蟹猴GITR)交叉反應，但可不與來自其他物種之GITR抗原或除GITR外之抗原交叉反應。
免疫球蛋白可來自普遍已知同型中之任一者，包括但不限於IgA、分泌IgA、IgG及IgM。IgG同型在某些物種中分成亞類：在人類中為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，且在小鼠中為IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3。在某些實施例中，本文所述抗GITR抗體屬IgG1或IgG2亞型。免疫球蛋白(例如IgG1)係以若干異型存在，該等異型在至多多個胺基酸中彼此不同。「抗體」包括(例如)天然及非天然抗體；單株及 多株抗體；嵌合及人類化抗體；人類及非人類抗體；全合成抗體；及單鏈抗體。
如本文所用術語抗體之「抗原結合部分」係指保持特異性結合至抗原(例如，人類GITR)之能力的抗體之一或多個片段。該等「片段」係(例如)介於約8個與約1500個胺基酸之間長，適宜地介於約8個與約745個胺基酸之間長，適宜地約8個至約300個、例如約8個至約200個胺基酸或約10個至約50個或100個胺基酸長。已顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來實施。術語抗體(例如本文所述抗GITR抗體)之「抗原結合部分」內所涵蓋結合片段之實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，即包含兩個在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH結構域組成；及(vi)經分離互補決定區(CDR)或(vii)兩個或更多個可視情況由合成連接體接合之經分離CDR的組合。此外，儘管Fv片段之兩個結構域(VL及VH)係由單獨基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接體接合在一起，該合成連接體使其能夠成為其中VL及VH區配對形成單價分子之單一蛋白鏈(稱作單鏈Fv(scFv))；例如，參見Bird等人，(1988)Science 242：423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。該等抗體片段係使用彼等熟習此項技術者已知之習用技術獲得，且以與完整抗體相同之方式針對效用篩選片段。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由酶或化學裂解完整免疫球蛋白來產生。
「雙特異性」或「雙功能性抗體」係具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜合抗體。雙特異性抗體可藉由多種方法 (包括雜交瘤融合或連接Fab'片段)產生。參見(例如)Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148,1547-1553(1992)。
如本文所用術語「單株抗體」係指對抗體之特定表位或組合物展示單一結合特異性及親和力之抗體，其中所有抗體皆對特定表位展示單一結合特異性及親和力。因此，術語「人類單株抗體」係指展示單一結合特異性且具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變及可選恆定區的抗體或抗體組合物。在一個實施例中，人類單株抗體係由雜交瘤產生，該雜交瘤包括自轉基因非人動物(例如轉基因小鼠)獲得之B細胞，其基因組包含與永生化細胞融合之人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因。
如本文所用術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，例如(a)自對人類免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體之動物(例如小鼠)或自其製備之雜交瘤分離之抗體；(b)自經轉化以表現抗體之宿主細胞、例如自轉染瘤分離之抗體；(c)自重組、組合人類抗體文庫分離之抗體；及(d)藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離的抗體。該等重組人類抗體包含可變及恆定區，其利用由種系基因編碼之特定人類種系免疫球蛋白序列，但包括在(例如)抗體成熟期間發生之後續重排及突變。如業內所知(例如參見Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9)：1117-1125)，可變區含有抗原結合結構域，其係由重排以形成對外來抗原具有特異性之各種基因編碼。除重排外，可變區可藉由多個單一胺基酸變化(稱作體細胞突變或超突變)進一步經修飾以增加抗體對外來抗原之親和力。恆定區將進一步因應於抗原發生變化(即，同型切換)。因此，因應抗原編碼輕鏈及重鏈免疫球蛋白多肽之重排且體細胞突變之核酸分子可不與初始核酸分子具 有序列一致性，而是將實質上一致或類似(即，具有至少80%一致性)。
「人類」抗體(HuMAb)係指具有可變區之抗體，其中框架及CDR區二者皆係源自人類種系免疫球蛋白序列。此外，若抗體含有恆定區，則恆定區亦係源自人類種系免疫球蛋白序列。本文所述抗體可包括不由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機誘變或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文所用術語「人類抗體」並不意欲包括源自另一哺乳動物物種(例如小鼠)種系之CDR序列已移植至人類框架序列上之抗體。術語「人類」抗體及「完全人類」抗體同義使用。
「人類化」抗體係指非人類抗體之CDR結構域外之一些、大部分或所有胺基酸經源自人類免疫球蛋白之相應胺基酸置換的抗體。在抗體之人類化形式之一個實施例中，CDR結構域外之一些、大部分或所有胺基酸經人類免疫球蛋白之胺基酸置換，而一或多個CDR區內之一些、大部分或所有胺基酸未改變。可允許存在胺基酸之小的添加、缺失、插人、取代或修飾，只要其不消除抗體結合給定抗原之能力即可。「人類化」抗體保留類似於初始抗體之抗原特異性之抗原特異性。
「嵌合抗體」係指可變區係源自一個物種且恆定區係源自另一物種之抗體，例如可變區係源自小鼠抗體且恆定區係源自人類抗體之抗體。
如本文所用「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE抗體)。
「異型」係指特異性同型組內之天然變體，該等變體之多個胺基酸不同(例如，參見Jefferis等人(2009)mAbs 1：1)。本文所述抗體 可屬任何異型。如本文所用，稱作「IgG1f」或「IgG1.1f」同型之抗體分別係異型「f」之IgG1及較差效應物IgG1.1抗體，即根據如Kabat中之EU索引如(例如)SEQ ID NO：7中所示具有214R、356E及358M(參見表11之SEQ ID NO：7中之加下劃線之殘基)。
片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性結合至抗原之抗體」互換使用。
如本文所用之「經分離抗體」欲指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如，特異性結合至GITR之經分離抗體實質上不含特異性結合除GITR以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合至GITR之表位之經分離抗體可與來自不同物種之其他GITR蛋白具有交叉反應性。
如本文所用，「抑制GITR-L與GITR結合」之抗體欲指在業內公認之方法(例如本文所述基於FACS之結合分析)中(例如)在使用3A9-hGITR細胞之結合分析中以如下EC50抑制GITR-L與GITR結合的抗體：約1μg/mL或更小，例如約0.9μg/mL或更小、約0.85μg/mL或更小、約0.8μg/mL或更小、約0.75μg/mL或更小、約0.7μg/mL或更小、約0.65μg/mL或更小、約0.6μg/mL或更小、約0.55μg/mL或更小、約0.5μg/mL或更小、約0.45μg/mL或更小、約0.4μg/mL或更小、約0.35μg/mL或更小、約0.3μg/mL或更小、約0.25μg/mL或更小、約0.2μg/mL或更小、約0.15μg/mL或更小或約0.1μg/mL或更小。
「效應物功能」係指抗體Fc區與Fc受體或配體之相互作用或自其產生之生物化學事件。實例性「效應物功能」包括Clq結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、FcγR介導之效應物功能(例如ADCC及抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP))及細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)之下調。該等效應物功能通常需要Fc區與結合 結構域(例如，抗體可變結構域)組合。
「Fc受體」或「FcR」係結合至免疫球蛋白之Fc區之受體。結合至IgG抗體之FcR包含FcγR家族之受體，包括該等受體之等位基因變體及選擇性剪接形式。FcγR家族由三種活化受體(小鼠中為FcγRI、FcγRIII及FcγRIV；人類中為FcγRIA、FcγRIIA及FcγRIIIA)及一種抑制受體(FcγRIIB)組成。人類FcγR之各種性質概述於表1中。大多數先天效應細胞類型共表現一或多種活化FcγR及抑制FcγRIIB，而天然殺傷(NK)細胞選擇性表現一種活化Fc受體(小鼠中為FcγRIII且人類中為FcγRIIIA)而不表現小鼠及人類中之抑制FcγRIIB。人類IgG1結合至大部分人類Fc受體且關於其結合之活化Fc受體之類型認為其等效於鼠類IgG2a。
Figure 104118186-A0305-02-0035-10
「Fc區」(片段可結晶區)或「Fc結構域」或「Fc」係指介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合(包括結合至位於免疫系統之各種細胞(例如，效應細胞)上之Fc受體或經典補體系統之第一組份(C1q))之抗體之重鏈的C-末端區。因此，Fc區包含排除第一恆定區免疫球蛋 白結構域(例如，CH1或CL)之抗體之恆定區。在IgG、IgA及IgD抗體同型中，Fc區包含源自抗體之兩條重鏈之第二(CH2)及第三(CH3)恆定結構域之兩個一致蛋白質片段；IgM及IgE Fc區在每一多肽鏈中包含三個重鏈恆定結構域(CH結構域2-4)。對於IgG而言，Fc區包含免疫球蛋白結構域Cγ2及Cγ3及介於Cγ1與Cγ2之間之鉸鏈。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變，但通常將人類IgG重鏈Fc區定義為自位置C226或P230處之胺基酸殘基(或該兩個胺基酸之間之胺基酸)延伸至重鏈之羧基-末端，其中編號係根據如Kabat中之EU索引。人類IgG Fc區之CH2結構域自約胺基酸231至約胺基酸340延伸，而CH3結構域位於Fc區中之CH2結構域之C-末端側上，即，其自IgG之約胺基酸341延伸至約胺基酸447。如本文所用，Fc區可為天然序列Fc(包括任何異型變體)或變體Fc(例如，非天然Fc)。Fc亦可指與包含Fc之蛋白多肽(例如「包含Fc區之結合蛋白」(亦稱作「Fc融合蛋白」(例如，抗體或免疫黏附素)))分離或在其背景下之此區。
「天然序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列人類IgG1 Fc區；天然序列人類IgG2 Fc區；天然序列人類IgG3 Fc區；及天然序列人類IgG4 Fc區以及其天然變體。天然序列Fc包括Fc之各種異型(例如，參見Jefferis等人(2009)mAbs 1：1)。
「鉸鏈」、「鉸鏈結構域」或「鉸鏈區」或「抗體鉸鏈區」係指重鏈恆定區中將CH1結構域接合至CH2結構域之結構域且包括鉸鏈之上部、中間及下部部分(Roux等人J.Immunol.1998 161：4083)。鉸鏈在抗體之結合區與效應物區之間提供不同程度之撓性且亦提供用於兩個重鏈恆定區之間之分子間二硫鍵結之位點。如本文所用，對於所有IgG同型而言，鉸鏈始於Glu216且結束於Gly237(Roux等人，1998 J Immunol 161：4083)。野生型IgG1、IgG2、IgG3及IgG4鉸鏈之序列示 於表2及9中。
Figure 104118186-A0305-02-0037-11
術語「鉸鏈」包括野生型鉸鏈(例如彼等闡述於表11中者)以及其 變體(例如，非天然鉸鏈或經修飾鉸鏈)。舉例而言，術語「IgG2鉸鏈」包括如表11中所示之野生型IgG2鉸鏈及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1個突變(例如取代、缺失或添加)之變體。實例性IgG2鉸鏈變體包括1、2、3或全部4個半胱胺酸(C219、C220、C226及C229)變為另一胺基酸之IgG2鉸鏈。在具體實施例中，IgG2包含C219S取代。在某些實施例中，鉸鏈係包含來自至少兩個同型之序列之雜合鉸鏈。舉例而言，鉸鏈可包含來自一個同型之上部、中間或下部鉸鏈且鉸鏈之其餘部分來自一或多個其他同型。舉例而言，鉸鏈可為IgG2/IgG1鉸鏈，且可包含(例如)IgG2之上部及中間鉸鏈及IgG1之下部鉸鏈。鉸鏈可藉由效應物功能或喪失效應物功能。舉例而言，野生型IgG1之下部鉸鏈提供效應物功能。
術語「CH1結構域」係指重鏈恆定結構域中將可變結構域連接至鉸鏈之重鏈恆定區。如本文所用，CH1結構域始於A118且結束於V215。術語「CH1結構域」包括野生型CH1結構域(例如對於IgG1具有SEQ ID NO：278且對於IgG2具有SEQ ID NO：279；表11)以及其變體(例如，非天然CH1結構域或經修飾CH1結構域)。舉例而言，術語「CH1結構域」包括野生型CH1結構域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1個突變(例如取代、缺失或添加)之變體。實例性CH1結構域包括具有改良抗體之生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)之突變之CH1結構域。本文提供影響抗體之生物活性之CH1結構域之修飾形式。
術語「CH2結構域」係指重鏈恆定結構域中將鉸鏈連接至CH3結構域之重鏈恆定區。如本文所用，CH2結構域始於P238且結束於K340。術語「CH2結構域」包括野生型CH2結構域(例如對於IgG1具有SEQ ID NO：280且對於IgG2具有SEQ ID NO：297；表11)以及其變體(例如，非天然CH2結構域或經修飾CH2結構域)。舉例而言，術語 「CH2結構域」包括野生型CH2結構域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1個突變(例如取代、缺失或添加)之變體。實例性CH2結構域包括具有改良抗體之生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)之突變之CH2結構域。在某些實施例中，CH2結構域包含降低效應物功能之取代A330S/P331S。本文提供影響抗體之生物活性之CH2結構域之其他修飾形式。
術語「CH3結構域」係指重鏈恆定結構域中將C-末端連接至CH2結構域之重鏈恆定區。如本文所用，CH3結構域始於G341且結束於K447。術語「CH3結構域」包括野生型CH3結構域(例如對於IgG1具有SEQ ID NO：282且對於IgG2具有SEQ ID NO：298；表11)以及其變體(例如，非天然CH3結構域或經修飾CH3結構域)。舉例而言，術語「CH3結構域」包括野生型CH3結構域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1個突變(例如取代、缺失或添加)之變體。實例性CH3結構域包括具有改良抗體之生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)之突變之CH3結構域。本文提供影響抗體之生物活性之CH3結構域之修飾形式。
「天然序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列人類IgG1 Fc區；天然序列人類IgG2 Fc區；天然序列人類IgG3 Fc區；及天然序列人類IgG4 Fc區以及其天然變體。天然序列Fc包括Fc之各種異型(例如，參見Jefferis等人(2009)mAbs 1：1)。
術語「表位」或「抗原決定子」係指免疫球蛋白或抗體特異性結合抗原(例如，GITR)上之位點。表位可自藉由蛋白質之三級摺疊(通常構象表位)並置之鄰接胺基酸(通常線性表位)或非鄰接胺基酸形成。在暴露於變性溶劑時，通常但不總是保留自鄰接胺基酸形成之表位，而在用變性溶劑處理時通常損失藉由三級摺疊形成之表位。在獨 特空間構象中，表位通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。確定由給定抗體結合表位之方法(即表位定位)已為業內熟知且包括(例如)免疫印跡及免疫沈澱分析，其中測試(例如來自GITR)之重疊或鄰接肽與給定抗體(例如抗GITR抗體)之反應性。確定表位之空間構象之方法包括業內之技術及彼等本文所述者，例如，x射線結晶學及2維核磁共振及HDX-MS(例如，參見Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris編輯，(1996))。
術語「表位定位」係指鑑別分子決定子用於抗體-抗原識別之方法。
術語「結合至相同表位」在提及兩種或更多種抗體時意指抗體結合至胺基酸殘基之相同區段，如藉由給定方法所測定。確定抗體與本文所述抗體是否結合至「GITR上之相同表位」之技術包括(例如)表位定位方法，例如抗原：抗體複合物之晶體之x射線分析，其提供表位之原子拆分及氫/氘交換質譜(HDX-MS)。其他方法監測抗體與抗原片段或抗原之突變變化形式的結合，其中由於抗原序列內胺基酸殘基之修飾所致之結合損失經常被視為可指示表位組份。另外，亦可使用表位定位之計算組合方法。該等方法取決於目標抗體自組合噬菌體展示肽文庫親和分離特異性短肽的能力。預計具有相同VH及VL或相同CDR1、2及3序列之抗體結合至相同表位。
「與另一抗體競爭結合至靶標」之抗體係指抑制(部分或完全)另一抗體與靶標結合之抗體。可使用已知競爭實驗確定兩個抗體是否彼此競爭結合至靶標，即一個抗體是否抑制另一抗體與靶標結合及其抑制程度。在某些實施例中，抗體與另一抗體競爭結合至靶標且將該結合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。端視抗體係「阻斷抗體」(即，首先與靶標一起培育之冷抗 體)而定，抑制或競爭之程度可不同。競爭分析可如以下中所述執行：例如，Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harb Protoc；2006；doi：10.1101/pdb.prot4277，或「Using Antibodies」之第11章，Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA 1999。競爭抗體結合至相同表位、重疊表位或毗鄰表位(例如，如由立體阻礙所證明)。
其他競爭性結合分析包括：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心式競爭分析(參見Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland等人，J.Immunol.137：3614(1986))；固相直接標記之分析、固相直接標記之夾心式分析(參見Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125標記之固相之間標記RIA(參見Morel等人，Mol.Immunol.25(1)：7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176：546(1990))；及直接標記之RIA。(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77(1990))。
如本文所用術語「特異性結合」(「specific binding」)、「選擇性結合」(「selective binding」)、「選擇性結合」(「selectively binds」)及「特異性結合」(「specifically binds」)係指結合至預定抗原上之表位之抗體。通常，抗體(i)在藉由(例如)在BIACORE 2000儀器中使用預定抗原(例如重組人類GITR)作為分析物及抗體作為配體之表面電漿共振(SPR)技術、或抗體與抗原陽性細胞之結合之Scatchard分析測定時，以約小於10-7M、例如約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之平衡解離常數(KD)結合，及(ii)較其與除預定抗原或密切相關抗原以外之非特異性抗原(例如，BSA、酪蛋白)之結合親和力大至少兩倍之親和力結合至預定抗原。因此，「特異性結合至人類 GITR」之抗體係指以10-7M或更小、例如約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之KD結合至可溶性或細胞結合之人類GITR的抗體。「與食蟹猴GITR交叉反應」之抗體係指以10-7M或更小、例如約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之KD結合至食蟹猴GITR的抗體。在某些實施例中，在標準結合分析中，不與非人類物種之GITR交叉反應之該等抗體展現針對該等蛋白質基本上不可檢測之結合。
如本文所用術語「K締合」或「Ka」欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而如本文所用術語「K解離」或「Kd」欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。本文所用術語「KD」欲指解離常數，其係自Kd對Ka之比率(亦即Kd/Ka)獲得且以莫耳濃度(M)表示。可使用業內充分確立之方法測定抗體之KD值。測定抗體之KD之較佳方法係藉由使用表面電漿共振、較佳使用生物感測器系統(例如Biacore®系統)或流式細胞術及Scatchard分析。
如本文所用術語對IgG抗體之「高親和力」係指抗體對於靶抗原具有10-8M或更小、更佳10-9M或更小且甚至更佳10-10M或更小之KD。然而，對於其他抗體同型，「高親和力」結合可變。舉例而言，對於IgM同型之「高親和力」結合係指抗體具有10-7M或更小、更佳10-8M或更小之KD。
術語「EC50」在使用抗體或其抗原結合片段之活體外或活體內分析之上下文中係指誘導係最大反應之50%之反應、即介於最大反應與基線之間之一半的抗體或其抗原結合部分之濃度。
術語「結合至固定GITR」係指本文所述抗體結合至(例如)細胞表面上表現或附接至固體載體之GITR的能力。
如本文所用術語「交叉反應」係指本文所述抗體結合至不同物種之GITR之能力。舉例而言，結合人類GITR之本文所述抗體亦可結合GITR之另一物種(例如，食蟹猴GITR)。如本文所用，交叉反應性 可藉由在結合分析(例如，SPR、ELISA)中檢測與純化抗原之特定反應性或結合至或以其他方式與生理上表現GITR之細胞在功能上相互作用上來量測。用於測定交叉反應性之方法包括(例如)藉由BiacoreTM表面電漿共振(SPR)分析使用BiacoreTM 2000 SPR儀器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)或流式細胞技術的如本文所述之標準結合分析。
如適於物體之如本文所用術語「天然」係指自然界中可發現之物體。舉例而言，可自自然界中之來源分離且尚未在實驗室中由人有意修飾之生物體(包括病毒)中存在之多肽或聚核苷酸序列係天然的。
「多肽」係指包含至少兩個連續連接之胺基酸殘基之鏈，其中鏈之長度無上限。蛋白質中之一或多個胺基酸殘基可含有例如但不限於糖基化、磷酸化或二硫鍵形成等修飾。「蛋白質」可包含一或多種多肽。
如本文所用術語「核酸分子」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，且可為cDNA。
亦提供本文中(例如)表11中(例如)SEQ ID NO：13-191中所述之序列之「保守序列修飾」，即，不消除由核苷酸序列編碼或含有胺基酸序列之抗體與抗原之結合之核苷酸及胺基酸序列修飾。該等保守序列修飾包括保守核苷酸及胺基酸取代、以及核苷酸及胺基酸添加及缺失。舉例而言，可藉由業內已知之標準技術(例如定點誘變及PCR介導之誘變)向表11中之序列(例如SEQ ID NO：13-191)中引入修飾。保守胺基酸取代包括胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換者。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、 白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分支側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，舉例而言，抗GITR抗體中之預測非必需胺基酸殘基較佳係經來自同一側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。不消除抗原結合之鑑別核苷酸及胺基酸保守取代之方法為業內所熟知(例如，參見Brummell等人，Bioohem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；及Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417(1997))。
或者，在另一實施例中，可藉由(例如)飽和誘變沿抗GITR抗體編碼序列之全部或一部分隨機引入突變，且可針對結合活性篩選所得經修飾之抗GITR抗體。
對於核酸而言，術語「實質同源性」指示，兩個核酸或其指定序列在最佳比對及比較(其中適當插入或缺失核苷酸)時有至少約80%之核苷酸、通常至少約90%至95%且更佳至少約98%至99.5%之核苷酸一致。或者，當區段將在選擇性雜交條件下與鏈之補體雜交時存在實質同源性。
對於多肽而言，術語「實質同源性」指示，兩個多肽或其指定序列在最佳比對及比較(其中適當插入或缺失胺基酸)時有至少約80%之胺基酸、通常至少約90%至95%且更佳至少約98%至99.5%之核苷酸一致。
兩個序列之間之一致性百分比隨該等序列共有之一致位置數而變化(即同源性%=一致位置數/總位置數乘以100)，考慮為達成兩個序列最佳比對而需要引入之缺口數及各缺口長度。兩個序列之間之序列比較及一致性百分比測定可使用數學算法來完成，如下文非限制性實例中所述。
兩個核苷酸序列之間之一致性百分比可使用GCG軟體包裝(可於 http：//www.gcg.com獲得)中之GAP程式使用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或80之空位權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來測定。兩個核苷酸或胺基酸序列之間之一致性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller之算法(CABIOS,4：11-17(1989))使用PAM120權重殘基表來測定，該算法已納入ALIGN程式(2.0版)中，空位長度罰分為12且空位罰分為4。另外，兩個胺基酸序列之間之一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣測試，該算法已納入GCG軟體包裝(可於http：//www.gcg.com獲得)中之GAP程式中，且空位權重為16、14、12、10、8、6或4且長度權重為1、2、3、4、5或6。
本文所述核酸及蛋白序列可進一步用作「查詢序列」以針對資料庫實施搜索以(例如)鑑別相關序列。該等搜索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)實施。BLAST核苷酸搜索可利用NBLAST程式實施(評分=100，字長=12)以獲得與本文所述核酸分子同源之核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可利用XBLAST程式實施(評分=50，字長=3)以獲得與本文所述蛋白質分子同源之胺基酸序列。出於比較目的，為獲得加空位比對，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述來利用加空位BLAST。在利用BLAST及加空位BLAST程式時，可使用各別程式(例如，XBLAST及NBLAST)之缺省參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。
該等核酸可存在於全細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純之形式存在。當藉由標準技術實施純化以清除其他細胞組份或其他污染物(例如其他細胞核酸(例如染色體之其他部分)或蛋白質)時，核酸係「經分離」或「使得實質上純的」，該等標準技術包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及業內熟知 之其他方法。參見F.Ausubel等人編輯，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
可根據標準技術使核酸(例如cDNA)突變以提供基因序列。對於編碼序列而言，若合意，該等突變可影響胺基酸序列。具體而言，涵蓋與本文所述天然V、D、J、恆定、切換及其他該等序列之實質上同源或源自其之DNA序列(其中「源自」指示序列與另一序列一致或子其修飾)。
如本文所用術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸之核酸分子。一類載體為「質粒」，其係指額外DNA區段可連接至其中之環形雙鏈DNA環。另一類載體為病毒載體，其中額外DNA區段可連接至病毒基因組中。某些載體能夠在已將其引入其中之宿主細胞中進行自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中時整合至該宿主細胞之基因組中，並藉此隨宿主基因組一同複製。此外，某些載體能夠引導與其可操作連接之基因的表現。該等載體在本文中稱作「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體經常呈質體形式。在本說明書中，「質粒」與「載體」可互換使用，此乃因質粒係載體之最常用形式。然而，亦包括可起等效功能之其他形式之表現載體，例如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文所用術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)欲指包含細胞中並不天然存在之核酸之細胞，且可為向其中引入重組表現載體之細胞。應瞭解，此等術語不僅欲指特定個體細胞而且亦指此細胞之子代。由於突變或環境影響可使後續各代發生某些改變，因此，此子代實際上可能與母細胞不同但卻仍包括於本文所用術語「宿 主細胞」之範疇內。
如本文所用術語「抗原」係指任何天然或合成免疫原性物質，例如蛋白質、肽或半抗原。抗原可為GITR或其片段。抗原亦可為腫瘤抗原，針對其期望保護或治療性免疫反應，例如由腫瘤細胞(例如，與抗GITR抗體組合之疫苗中)表現之抗原。抗原包括用於預防或治療癌症之腫瘤相關之抗原。腫瘤相關之抗原之實例包括(但不限於)包含以下之序列之全部或一部分之序列：βhCG、gp100或Pmel17、HER2/neu、WT1、間皮素、CEA、gp100、MART1、TRP-2、黑色素-A、NY-ESO-1、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、獨特型、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-A3、酪胺酸酶、端粒酶、SSX2及MUC-1抗原及生殖細胞衍生之腫瘤抗原。腫瘤相關之抗原亦包括血型抗原，例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。或者，構築體中可包括一種以上抗原。舉例而言，可將MAGE抗原與其他抗原(例如黑色素A、酪胺酸酶及gp100)以及佐劑(例如GM-CSF或IL-12)組合，並連接至抗APC抗體。
上述抗原之序列為業內熟知。舉例而言，MAGE-3 cDNA序列之實例提供於US 6,235,525(Ludwig Institute for Cancer Research)中；NY-ESO-1核酸及蛋白序列之實例提供於US 5,804,381及US 6,069,233(Ludwig Institute for Cancer Research)中；黑色素-A核酸及蛋白序列之實例提供於US 5,620,886及US 5,854,203(Ludwig Institute for Cancer Research)中；NY-BR-1核酸及蛋白序列之實例提供於US 6,774,226及US 6,911,529(Ludwig Institute for Cancer Research)中且NY-CO-58核酸及蛋白序列之實例提供於WO 02090986(Ludwig Institute for Cancer Research)中；HER-2/neu蛋白之胺基酸序列之實例可以GENBANK®登錄號AAA58637獲得；且人類癌胚抗原-樣1(CEA-1)之核苷酸序列(mRNA)可以GENBANK®登錄號NM020219獲得。
「免疫反應」係指脊椎動物內針對外來試劑之生物反應，該反應保護生物體抵抗該等試劑及由其引起之疾病。免疫反應係由免疫系統之細胞(例如，T淋巴球、B淋巴球、天然殺傷(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥胖細胞、樹突細胞或嗜中性球)及由該等細胞中之任一者或肝產生之可溶性大分子(包括抗體、細胞介素及補體)之作用介導，其導致選擇性靶向、結合至、損害、破壞及/或自脊椎動物滲透消除侵入病原體、經病原體感染之細胞或組織、癌性或其他異常細胞或在自體免疫或病理發炎之情形下正常人類細胞或組織。免疫反應包括(例如)T細胞(例如效應物T細胞)或Th細胞(例如CD4+或CD8+ T細胞)之活化或抑制或Treg細胞之抑制。
「免疫調節劑」或「免疫調控劑」係指可參與調節、調控或改良免疫反應之試劑，例如信號傳導路徑之組份。「調節」、「調控」或「改良」免疫反應係指免疫系統之細胞或該等細胞(例如，效應物T細胞)之活性之任何改變。該調節包括免疫系統之刺激或阻抑，其可表現為各種細胞類型之數目之增加或減少、該等細胞之活性之增加或減少或可在免疫系統內發生之任何其他變化。已鑑別抑制性及刺激性免疫調節劑，其中之一些在腫瘤微環境中可具有增強之功能。在較佳實施例中，免疫調節劑位於T細胞表面上。「免疫調節性靶標」或「免疫調控性靶標」係藉由物質、試劑、部分、化合物或分子靶向結合且其活性藉由物質、試劑、部分、化合物或分子之結合得以改變之免疫調節劑。免疫調節性靶標包括(例如)細胞表面上之受體(「免疫調節性受體」)及受體配體(「免疫調節性配體」)。
「免疫療法」係指藉由包含誘導、增強、阻抑或以其他方式改良免疫反應之方法治療受疾病折磨或處於感染或患有疾病之復發之風險的個體。
「免疫刺激療法」或「免疫刺激性療法」係指引起增加(誘導或 增強)個體中之免疫反應用於(例如)治療癌症的療法。
「增強內源免疫反應」意指增加個體中之現存免疫反應之有效性或功效有效性及功效之此增加可藉由(例如)克服阻抑內源宿主免疫反應之機制或藉由刺激增強內源宿主免疫反應之機制來達成。
「T效應物」(「Teff」)細胞係指具有細胞溶解活性之T細胞(例如，CD4+及CD8+ T細胞)以及T輔助(Th)細胞，其分泌細胞介素且活化並引導其他免疫細胞，但不包括調控性T細胞(Treg細胞)。本文所述抗GITR抗體活化Teff細胞，例如CD4+及CD8+ Teff細胞。
增加之刺激免疫反應或免疫系統之能力可自T細胞共刺激受體之增強之激動劑活性及/或抑制受體之增強之拮抗劑活性產生。增加之刺激免疫反應或免疫系統之能力可在量測免疫反應之分析、例如量測細胞介素或趨化介素釋放、細胞溶解活性(在靶細胞上直接測定或經由檢測CD107a或粒酶間接測定)及增殖變化之分析中由EC50或最大活性值之倍數增加反映。刺激免疫反應或免疫系統活性之能力可增強至少10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍或更多。
在某些實施例中，包含經修飾重鏈恆定區之抗體相對於不包含經修飾重鏈恆定區之相同抗體具有更有效力之激動劑活性。抗體之增強之激動劑活性可如(例如)實例中所示藉由(例如)量測自與抗體接觸之T細胞之IFN-γ或IL-2分泌量來測定。激動劑活性可增強至少10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍或更多，如藉由以下所定義：效應物T細胞中增加之細胞介素釋放或增加之增殖；若Treg上之接合降低Treg功能，降低之T調控性細胞活性；或增加之Treg耗盡。舉例而言，自經包含經修飾重鏈恆定區之抗體刺激之T細胞分泌之IFN-γ或IL-2的量可較經不包含經修飾重鏈恆定區之相同抗體刺激之T細胞高至少10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍或更多。
如本文所用術語「連接」係指兩個或更多個分子之締合。鏈接 可為共價或非共價鏈接。鏈接亦可為遺傳的(即，重組融合)。該等鏈接可使用多種業內公認之技術(例如化學偶聯及重組蛋白產生)來達成。
如本文所用，「投與」係指使用熟習此項技術者已知之各種方法及遞送系統向個體引入包含治療劑之組合物。本文所述抗體之較佳投與途徑包括靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、脊柱或其他非經腸投與途徑(例如藉由注射或輸注)。如本文所用片語「非經腸投與」意指除經腸及局部投與以外之投與方式，通常藉由注射，且包括(但不限於)靜脈內、腹膜內、肌內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、經囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注、以及活體外電穿孔。或者，本文所述抗體可經由非經腸途徑投與，例如局部、表皮或黏膜投與途徑，例如經鼻內、經口、經引道、經直腸、經舌下或經局部。投與亦可(例如)實施一次、複數次及/或在一或多個延長時段內實施。
如本文所用術語「T細胞介導之反應」係指由T細胞(包括效應物T細胞(例如，CD8+細胞)及輔助T細胞(例如，CD4+細胞))介導之反應。T細胞介導之反應包括(例如)T細胞細胞毒性及增殖。
如本文所用術語「細胞毒性T淋巴球(CTL)反應」係指由細胞毒性T細胞誘導之免疫反應。CTL反應主要係由CD8+T細胞介導。
如本文所用術語「抑制」或「阻斷」(例如，在提及細胞上GITR-L與GITR之結合之抑制/阻斷時)可互換使用且涵蓋部分及完全抑制/阻斷。在一些實施例中，抗GITR抗體將GITR-L與GITR之結合抑制至少約50%、例如約60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%，如(例如)本文中進一步所述所測定。在一些實施例中，抗GITR抗體將GITR-L與GITR之結合抑制不超過50%、例如約40%、30%、20%、10%、5%或1%，如(例如)本文中進一步所述所測定。
如本文所用術語「抑制腫瘤之生長」包括腫瘤生長之任何可量測減少，例如腫瘤生長抑制至少約10%、例如至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約99%或100%。
如本文所用「癌症」係指特徵在於體內異常細胞不受控生長之寬泛組之疾病。失調之細胞分裂可形成侵襲相鄰組織且可經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠部分的惡性腫瘤或細胞。
如本文所用術語「治療」(「treat」、「treating」及「treatment」)係指對個體實施之任何類型之介入或方法或向其投與活性劑，其中目的係逆轉、緩和、改善、抑制或緩解或預防症狀、併發症、病況或與疾病相關之生物化學標記的進展、發展、嚴重程度或復發。治療可針對患有疾病之個體或無疾病之個體(例如用於預防)。
「血液惡性病」包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴惡性病以及脾及淋巴結之癌症。實例性淋巴瘤包括B細胞淋巴瘤(B細胞血液癌)及T細胞淋巴瘤。B細胞淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphomas)及大部分非霍奇金氏淋巴瘤。B細胞淋巴瘤之非限制性實例包括瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜下相關之淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴球性淋巴瘤(與慢性淋巴球性白血病重疊)、外套細胞淋巴瘤(MCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、縱膈大B細胞淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia)、結節邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性積液淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病。T細胞淋巴瘤之非限制性實例包括結節外T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤及血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤。血液惡性病亦包括白血病，例如但不限於繼發性白血病、慢性淋巴球性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病及急性淋巴母細胞性白血 病。血液惡性病進一步包括骨髓瘤，例如但不限於多發性骨髓瘤及燜燃型多發性骨髓瘤。術語血液惡性病涵蓋其他血液及/或B細胞-或T細胞-相關之癌症。
術語「有效劑量」(「effective dose」或「effective dosage」)定義為足以達成或至少部分達成期望效應之量。藥物或治療劑之「治療有效量」或「治療有效劑量」係在單獨使用或與另一治療劑組合使用時促進疾病消退之藥物之任何量，該疾病消退係由疾病症狀之嚴重程度降低、無疾病症狀之時段之頻率及持續時間增加或防止因感病性之損害或失能來證明。藥物之治療有效量或劑量包括「預防有效量」或「預防有效劑量」，其係在向處於發生疾病或患有疾病之復發之風險之個體單獨投與或與另一治療劑組合投與時抑制疾病發展或復發的藥物之任何量。可使用多種熟練從業者已知之方法、例如在臨床試驗期間在人類個體中、在預測於人類中之效能之動物模型系統中或藉由在活體外分析中分析試劑之活性評估治療劑促進疾病消退或抑制疾病發展或復發之能力。
舉例而言，抗癌劑係促進個體中癌症消退之藥物。在較佳實施例中，藥物之治療有效量促進癌症消退至消除癌症之程度。「促進癌症消退」意指單獨或與抗贅瘤劑組合投與有效量之藥物可減少腫瘤生長或大小、使腫瘤壞死、減少至少一種疾病症狀之嚴重程度、增加無疾病症狀之時段之頻率及持續時間、防止因感病性之損害或失能或以其他方式改善患者之疾病症狀。另外，關於治療之術語「有效」及「有效性」包括藥理學有效性及生理安全性。藥理學有效性係指藥物促進患者中癌症消退之能力。生理安全性係指因藥物投與引起之細胞、器官及/或生物體水平(不利效應)之毒性或其他不利生理效應的程度。
舉例而言，對於腫瘤之治療，藥物之治療有效量或劑量較佳相 對於未治療個體將細胞生長或腫瘤生長抑制至少約20%、更佳至少約40%、甚至更佳至少約60%且仍更佳至少約80%。在最佳實施例中，藥物之治療有效量或劑量完全抑制細胞生長或腫瘤生長，即較佳將細胞生長或腫瘤生長抑制100%。可使用下文所述之分析評估化合物抑制腫瘤生長之能力。或者，可藉由檢驗化合物抑制細胞生長之能力評估組合物之此性質，該抑制可藉由熟練從業人員已知之分析在活體外量測。在本文所述之其他較佳實施例中，可觀察到腫瘤消退且其持續至少約20天、更佳至少約40天或甚至更佳至少約60天之時段。
術語「患者」包括接受預防性或治療性治療之人類及其他哺乳動物個體。
如本文所用術語「個體」包括任何人類或非人類動物。舉例而言，本文所述方法及組合物可用於治療患有癌症之個體。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，例如非人類靈長類動物、羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬蟲類等。
如本文所用術語「ug」及「uM」可與「μg」及「μM」互換使用。
在以下子部分中進一步詳細闡述本文所述各個態樣。
I.抗GITR抗體
本文闡述特徵在於特定功能特徵或性質之抗體，例如完全人類抗體。舉例而言，抗體特異性結合人類GITR。另外，抗體可與來自一或多種非人類靈長類動物之GITR(例如食蟹猴GITR)交叉反應。
除特異性結合至可溶性及/或膜結合之人類GITR以外，本文所述抗體展現以下功能性質中之一或多者：(a)結合至食蟹猴GITR；(b)刺激或增強免疫反應；(c)活化T細胞(如藉由(例如)增強之細胞介素分泌及/或增殖所證 明)；(d)抑制GITRL與3A9-hGITR細胞上之GITR的結合；(e)至多部分抑制GITR配體與活化T細胞上之GITR的結合；(f)結合至人類GITR之N-末端部分中之構象表位；(g)結合至糖基化及未糖基化人類GITR；及(h)在不與Fc受體結合下具有激動劑活性，但其中與Fc受體之結合進一步增強激動劑活性。
較佳地，抗GITR抗體以高親和力、例如以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M或10-9M至10-7M之KD結合至GITR。在某些實施例中，抗GITR抗體如(例如)藉由Biacore所測定以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M或10-8M至10-7M之KD結合至可溶性人類GITR。在某些實施例中，抗GITR抗體如(例如)藉由流式細胞術及Scatchard曲線所測定以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10-11M至10-9M或10-10M至10-9M之KD結合至(例如)活化人類T細胞上之結合之(例如，細胞膜結合之)人類GITR。在某些實施例中，抗GITR抗體如(例如)藉由FACS所測定以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-19M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10-11M至10-9M或10-10M至10-9M之EC50結合至(例如)活化人類T細胞上之結合之(例如，細胞膜結合之)人類GITR。在某些實施例中，抗GITR抗體以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M或10-8M 至10-7M之KD結合至可溶性人類GITR，且以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10-11M至10-9M或10-10M至10-9M之KD或EC50結合至細胞膜結合之人類GITR。
抗GITR抗體可如(例如)藉由FACS量測(例如，如實例中所述)以(例如)100nM或更小、10nM或更小、100nM至0.01nM、100nM至0.1nM、100nM至1nM、或10nM至1nM之EC50結合至食蟹猴GITR，例如結合至膜結合之食蟹猴GITR。
抗GITR抗體可藉由(例如)活化Teff細胞、限制T效應細胞由Treg細胞阻抑、耗盡及/或抑制腫瘤Treg細胞及/或活化(例如)腫瘤中之NK細胞刺激或增強免疫反應。舉例而言，抗GITR抗體可活化或共刺激Teff細胞，如藉由(例如)增強之細胞介素(例如，IL-2及IFN-γ)分泌及/或增強之增殖所證明。在某些實施例中，亦提供CD3刺激。在某些實施例中，GITR抗體將IL-2分泌增加50%、100%(即，2倍)、3倍、4倍、5倍或更大之因數，視情況最大值為至多10倍、30倍、100倍，如(例如)原代人類T細胞或表現人類GITR之T細胞上所量測(例如，如實例中進一步闡述)。在某些實施例中，GITR抗體將IFN-γ分泌增加50%、100%(即，2倍)、3倍、4倍、5倍或更大之因數，視情況最大值為至多10倍、30倍、100倍，如(例如)原代人類T細胞或表現人類GITR之T細胞上所量測(例如，如實例中進一步闡述)。
抗GITR抗體可(例如)以10μg/ml或更小、1μg/ml或更小、0.01μg/ml至10μg/ml、0.1μg/ml至10μg/ml或0.1μg/ml至1μg/ml之EC50抑制人類GITRL與細胞(例如表現人類GITR之3A9細胞)上之人類GITR的結合(參見實例5)。
在某些實施例中，抗GITR抗體至多僅部分抑制人類GITRL與細胞(例如活化T細胞)上之人類GITR的結合(參見實例5)。
抗GITR抗體可結合至表位，例如人類GITR之N-末端部分中之構象表位，例如位於成熟人類GITR之胺基酸1至39內之表位(參見實例9)，如(例如)藉由抗體與人類GITR之片段(例如人類GITR之天然(即，非變性)片段)之結合所測定。抗GITR抗體可結合至成熟人類GITR之胺基酸1至20或位於該等胺基酸內之表位(如(例如)藉由抗體與人類GITR之片段(例如人類GITR之天然(即，非變性)片段)之結合所測定)，之後酶裂解或HDX(分別參見實例11及12)。抗GITR抗體可結合至成熟人類GITR之胺基酸3至20(PTGGPGCGPGRLLLGTGT，SEQ ID NO：217)或該等胺基酸內之表位。抗GITR抗體可結合至成熟人類GITR之胺基酸3至20及胺基酸33至40(即胺基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218))或該等胺基酸內之表位。在某些實施例中，抗GITR抗體結合至糖基化及未糖基化人類GITR。在某些實施例中，抗GITR抗體結合至胺基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)，如(例如)使用實例中所述之方案藉由HDX所測定。
抗GITR抗體可與包含本文所述CDR或可變區之抗GITR抗體(例如28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10)競爭結合至GITR(或抑制其結合)。在某些實施例中，抗GITR抗體將28F3、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8、19D3、18E10及/或6G10與人類GITR之結合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在某些實施例中，28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10將抗GITR抗體與人類GITR之結合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在某些實施例中，抗GITR抗體將28F3、3C3-1、 3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10與人類GITR之結合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%，且28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10將抗GITR抗體與人類GITR之結合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(例如，在兩個方向上競爭)。
在某些實施例中，抗GITR抗體誘導或增強T細胞活化而無需多價交聯，如(例如)無需FcR結合所測定。在某些實施例中，抗GITR抗體係多價，例如二價。在某些實施例中，抗GITR抗體並非單價。本文中已顯示F’(ab)2片段較Fab片段更有效地活化T細胞(參見實例)。
在某些實施例中，抗GITR抗體對於其激動劑活性無需經由Fc受體交聯，然而，與Fc受體之交聯相對於未結合至Fc受體之相同抗體增強其激動劑活性。
在某些實施例中，抗GITR抗體具有以下特徵中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12者：(1)以如(例如)藉由Biacore量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類GITR；(2)以如(例如)藉由Scatchard量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之KD結合至膜結合之人類GITR；(3)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類GITR；(4)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴GITR，例如結合至膜結合之食蟹猴GITR；(5)(例如)在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3濃度存在下) 誘導或增強T細胞活化，如藉由(i)表現GITR之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖所證明；(6)誘導或增強T細胞活化而無需多價交聯；(7)在不與Fc受體結合下具有激動劑活性，但其中與Fc受體之結合進一步增強激動劑活性；(8)例如利用3A9-hGITR細胞之分析中以如藉由FACS量測之(例如)1μg/mL或更小之EC50抑制GITR配體與GITR之結合；(9)至多部分抑制GITR配體與活化T細胞上之GITR的結合；(10)結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)上之構象表位，例如胺基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)內之不連續表位；(11)結合至O-連接及N-連接糖基化及未糖基化人類GITR；及(12)在任一方向或兩個方向上與28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10競爭結合至人類GITR。
抗GITR抗體亦可在(例如)10分鐘、30分鐘或60分鐘內誘導GITR在活化T細胞(例如CD4+及CD8+ T細胞)中內化、以及p65 NF-kB及p38 MAP激酶之後續信號轉導(例如活化(即，磷酸化))。
因此，應理解，如根據業內已知之方法測定並在本文中闡述之展現該等功能性質中之一或多者(例如，生物化學、免疫化學、細胞、生理學或其他生物活性或諸如此類)之抗體與具體活性相對於在抗體不存在下(或在存在不相關特異性之對照抗體時)觀察到的活性統計學上顯著之差異有關。較佳地，抗GITR抗體誘導之所量測參數(例如，T細胞增殖、細胞介素產生)之增加實現所量測參數在統計學上顯著增加至少10%、更佳至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%(即2倍)、3倍、5倍或10倍，且在某些較佳 實施例中，本文所述抗體可將所量測參數增加大於92%、94%、95%、97%、98%、99%、100%(即2倍)、3倍、5倍或10倍。相反，抗GITR抗體誘導之所量測參數(例如，腫瘤體積、結合至GITR之GITR-L、腫瘤中調節性T細胞之量)的減少實現所量測參數在統計學上顯著減少至少10%、更佳至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，且在某些較佳實施例中，本文所述抗體可將所量測參數減少大於92%、94%、95%、97%、98%或99%。
業內已知用於評估抗體對不同物種之GITR之結合親和力的標準分析，包括(例如)ELISA、西方印跡及RIA。適宜分析詳細闡述於實例中。亦可藉由業內已知之標準分析(例如藉由Biacore分析)評價抗體之結合動力學(例如，結合親和力)。用於評估抗體對GITR之功能性質(例如，配體結合、T細胞增殖、細胞介素產生)之效應的分析更詳細闡述於下文及實例中。
在某些實施例中，抗GITR抗體並非天然抗體或係非天然抗體。舉例而言，抗GITR抗體具有不同於天然抗體之轉譯後修飾，其不同之處在於(例如)具有更多、更少或不同類型之轉譯後修飾。
II.實例性抗GITR抗體
本文所述特定抗體係具有如實例1中所述分離並在結構上表徵之抗體28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10之CDR及/或可變區序列的抗體(例如單株抗體)，以及與其可變區或CDR序列具有至少80%一致性(例如，至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致性)之抗體。28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10之VH胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：13、26、39、52、71、84、97、115、128及335中。28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2 及6G10之VL胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336中。
因此，本文提供包含重鏈及輕鏈可變區之經分離抗體或其抗原結合部分，其中重鏈可變區包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：13、26、39、52、71、84、97、115、128及335。
亦提供包含重鏈及輕鏈可變區之經分離抗體或其抗原結合部分，其中輕鏈可變區包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336。
本文提供包含以下之經分離抗體或其抗原結合部分：(a)分別包含SEQ ID NO：13及14之重鏈及輕鏈可變區序列；(b)分別包含SEQ ID NO：26及27之重鏈及輕鏈可變區序列；(c)分別包含SEQ ID NO：39及40之重鏈及輕鏈可變區序列；(d)分別包含SEQ ID NO：52及53之重鏈及輕鏈可變區序列；(e)分別包含SEQ ID NO：52及54之重鏈及輕鏈可變區序列；(f)分別包含SEQ ID NO：71及72之重鏈及輕鏈可變區序列；(g)分別包含SEQ ID NO：84及85之重鏈及輕鏈可變區序列；(h)分別包含SEQ ID NO：97及98之重鏈及輕鏈可變區序列；(i)分別包含SEQ ID NO：97及99之重鏈及輕鏈可變區序列；(j)分別包含SEQ ID NO：115及116之重鏈及輕鏈可變區序列；(k)分別包含SEQ ID NO：128及129之重鏈及輕鏈可變區序列；(l)分別包含SEQ ID NO：128及130之重鏈及輕鏈可變區序列；或(m)分別包含SEQ ID NO：335及336之重鏈及輕鏈可變區序列。
抗GITR抗體可包含28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10或其組合之重 鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10之VH CDR1之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：20、33、46、62、78、91、106、122、138及342中。28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10之VH CDR2之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：21、34、47、63、79、92、107、123、139及343中。28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10之VH CDR3之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：22、35、48、64、80、93、108、124、140及344中。28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10之VL CDR1之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345中。28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10之VL CDR2之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346中。28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10之VL CDR3之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347中。CDR區係使用Kabat系統描繪(Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)。
假定該等抗體中之每一者皆結合至GITR且抗原結合特異性主要係由CDR1區、2區及3區提供，可「混合並匹配」VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列(即可混合並匹配來自不同抗體之CDR，但 每一抗體必須含有VH CDR1、2及3及VL CDR1、2及3)以產生本文所述其他抗GITR結合分子。可使用上文及實例中所闡述之結合分析(例如ELISA)來測試該等「混合並匹配」抗體之GITR結合。較佳地，在混合並匹配VH CDR序列時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列經結構上類似之CDR序列置換。同樣，在混合並匹配VLCDR序列時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列經結構上類似之CDR序列置換。熟習此項技術者將容易地明瞭，可藉由用來自針對單株抗體28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10本文揭示之CDR序列之結構式類似之序列取代一或多個VH及/或VL CDR區序列來產生新穎VH及VL序列。
本文提供包含以下之經分離抗體或其抗原結合部分：(a)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區CDR1：SEQ ID NO：20、33、46、62、78、91、106、122、138及342；(b)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區CDR2：SEQ ID NO：21、34、47、63、79、92、107、123、139及343；(c)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區CDR3：SEQ ID NO：22、35、48、64、80、93、108、124、140及344；(d)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區CDR1：SEQ ID NO：23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345；(e)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區CDR2：SEQ ID NO：24、37、50、66、69、82、95、110、113、 126、142、145及346；及(f)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區CDR3：SEQ ID NO：25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347；其中抗體特異性結合至人類GITR。
在一個實施例中，抗體包含重鏈及輕鏈可變區，其中重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3區包含：(a)SEQ ID NO：20-22；(b)SEQ ID NO：33-35；(c)SEQ ID NO：46-48；(d)SEQ ID NO：62-64；(e)SEQ ID NO：78-80；(f)SEQ ID NO：91-93；(g)SEQ ID NO：106-108；(h)SEQ ID NO：122-124；(i)SEQ ID NO：138-140；或(j)SEQ ID NO：342-344；其中抗體特異性結合至人類GITR。
在另一實施例中，抗體包含重鏈及輕鏈可變區，其中輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3區包含：(a)SEQ ID NO：23-25；(b)SEQ ID NO：36-38；(c)SEQ ID NO：49-51；(d)SEQ ID NO：65-67；(e)SEQ ID NO：68-70；(f)SEQ ID NO：81-83； (f)SEQ ID NO：94-96；(g)SEQ ID NO：109-111；(h)SEQ ID NO：112-114；(i)SEQ ID NO：125-127；(j)SEQ ID NO：141-143；(k)SEQ ID NO：144-146；或(l)SEQ ID NO：345-347；其中抗體特異性結合至人類GITR。
在具體實施例中，抗體包含重鏈及輕鏈可變區s，其中：(a)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：20-22，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：23-25；(b)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：33-35，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：36-38；(c)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：46-48，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：49-51；(d)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：62-64，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：65-67；(e)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：62-64，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：68-70；(f)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：78-80，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：81- 83；(g)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：91-93，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：94-96；(h)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：106-108，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：109-111；(i)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：106-108，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：112-114；(j)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：122-124，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：125-127；(k)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：138-140，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：141-143；(l)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：138-140，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：144-146；或(m)重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：342-344，且輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3分別包含SEQ ID NO：345-347；其中抗體特異性結合至人類GITR。
本文所述之VH結構域或其一或多個CDR可連接至恆定結構域用於形成重鏈，例如全長重鏈。類似地，本文所述之VL結構域或其一或多個CDR可連接至恆定結構域用於形成輕鏈，例如全長輕鏈。全長 重鏈(C-末端離胺酸(K)除外或C-末端甘胺酸及離胺酸(GK)除外，其可不存在)及全長輕鏈組合以形成全長抗體。
本文所述VH結構域可稠合至人類IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，其係天然的或經修飾)之恆定結構域，例如，如本文進一步闡述。舉例而言，VH結構域可包含稠合至以下人類IgG1胺基酸序列之本文所述任一VH結構域的胺基酸序列：
Figure 104118186-A0305-02-0066-12
Figure 104118186-A0305-02-0066-13
(SEQ ID NO：7)
人類IgG1恆定結構域亦可為異型變體之恆定結構域。舉例而言，IgG1之異型變體包含R107K、E189D及M191L(在上文中加下劃線且編號係根據SEQ ID NO：7中之編號)。在全長重鏈區內，該等胺基酸取代編號為R214K、E356D及M358L。
本文所述VL結構域可稠合至人類κ或λ輕鏈之恆定結構域。舉例而言，VL結構域可包含稠合至以下人類IgG1 κ輕鏈胺基酸序列之本文所述任一VL結構域的胺基酸序列：
Figure 104118186-A0305-02-0066-14
Figure 104118186-A0305-02-0067-16
Figure 104118186-A0305-02-0067-17
(SEQ ID NO：12)
在某些實施例中，重鏈恆定區在C-末端處包含離胺酸或另一胺基酸，例如，其包含以下最後胺基酸：對於重鏈為LSPGK(SEQ ID NO：220)。在某些實施例中，重鏈恆定區在C-末端處缺乏一或多個胺基酸，例如C-末端序列LSPG(SEQ ID NO：276)或LSP。
實例性重鏈及輕鏈之胺基酸序列闡述於表11中且對於重鏈對應於SEQ ID NO：15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362且對於輕鏈對應於SEQ ID NO：16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341及371。
包含與表11中闡述之重鏈或輕鏈中之任一者(或其可變區)至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之胺基酸序列(例如SEQ ID NO：13-19、26-32、40-45、52-61、71-77、84-90、97-105、116-121、128-137、227-275、337-341、348-352、361、362及371)的重鏈及輕鏈可用於形成具有期望特徵之抗人類GITR抗體，例如彼等本文進一步闡述者。實例性變體係彼等包含(例如)恆定結構域之異型變化及/或可變區或恆定區之突變(例如本文揭示之突變)者。包含與表11中闡述之重鏈或輕鏈中之任一者(或其可變區)至多1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2或1個胺基酸不同(藉由取代、添加或缺失)之胺基酸序列的重鏈及輕鏈可用於形成具有期望特徵之抗人類GITR抗體，例如彼等本文進一步闡述者。
在各個實施例中，上述抗體展現以下功能性質中之一或多者、兩者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者、六者 或更多者、七者或更多者、八者或更多者、九者或更多者、十者或更多者、十一者或全部：(1)以如(例如)藉由Biacore量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類GITR；(2)以如(例如)藉由Scatchard量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之KD結合至膜結合之人類GITR；(3)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類GITR；(4)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴GITR，例如結合至膜結合之食蟹猴GITR；(5)(例如)在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3濃度存在下)誘導或增強T細胞活化，如藉由(i)表現GITR之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖所證明；(6)誘導或增強T細胞活化而無需多價交聯；(7)以如藉由FACS量測之(例如)1μg/mL或更小之EC50抑制GITR配體與3A9-hGITR細胞上之GITR的結合；(8)至多部分抑制GITR配體與活化T細胞上之GITR的結合；(9)結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)上之構象表位，例如胺基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)內之不連續表位；(10)結合至O-連接及N-連接糖基化及未糖基化人類GITR；(11)在不與Fc受體結合下具有激動劑活性，但其中與Fc受體之結合進一步增強激動劑活性；及(12)在任一方向或兩個方向上與28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或 6G10競爭結合至人類GITR。
該等抗體包括(例如)人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體。
在一個實施例中，本文所述抗GITR抗體結合至糖基化(例如，N-連接或O-連接糖基化)及未糖基化人類GITR。
在一個實施例中，本文所述抗GITR抗體結合至構象表位。
在一個實施例中，本文所述抗GITR抗體結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)之以下區域內之胺基酸殘基：QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(SEQ ID NO：215)，對應於成熟人類GITR同種型1、2或3(SEQ ID NO：4)之胺基酸殘基1-39。
在一個實施例中，本文所述抗GITR抗體結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)之以下區域內之胺基酸殘基：QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：216)，對應於成熟人類GITR同種型1、2或3(SEQ ID NO：4)之胺基酸殘基1-20。
在一個實施例中，本文所述抗GITR抗體結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)之以下區域內之胺基酸殘基：PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)。
經修飾重鏈恆定結構域
如本文進一步論述，本文所述抗GITR抗體之重鏈恆定區可屬任一同型，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4或其組合及/或其修飾形式。抗GITR抗體可具有效應物功能或可具有降低之效應物功能或較差效應物功能。在某些實施例中，抗GITR抗體包含為抗體提供增強之性質之經修飾重鏈恆定區。如實例中所示，具有包含IgG2鉸鏈之經修飾 重鏈恆定區的抗GITR抗體相對於具有相同可變區但具有非IgG2鉸鏈之抗體係更有效力之激動劑。舉例而言，包含IgG2鉸鏈、IgG1同型之CH2及CH3結構域且具有或較差效應物功能之抗體具有增強之激動劑活性，如藉由自與抗體一起培育之T細胞增強之IFN-γ及IL-2分泌所量測。不希望限於具體作用機制，假設具有IgG2鉸鏈之抗GITR抗體形成較大抗體/抗原複合物且更有效地經內化，藉此產生增加之激動劑活性。據信大複合物的形成係自IgG2鉸鏈相對於其他同型(例如，IgG1、IgG3及IgG4)之鉸鏈之勁度較高而產生。如實例中進一步闡述，增強之激動劑活性似乎與抗體之較高或較低親和力無關。因此，本文提供具有經修飾重鏈恆定區之抗GITR抗體，其中抗GITR抗體具有增強之激動劑活性，且其中，具有經修飾重鏈恆定區之抗體之親和力以與相同可變區但具有不同重鏈恆定區類似之親和力結合至GITR。
因此，本文亦提供增強抗GITR抗體之激動劑活性之方法，其包含提供具有非IgG2鉸鏈之抗GITR抗體及用IgG2鉸鏈置換非IgG2鉸鏈。可受益於該修飾之抗體包括任何抗GITR抗體，例如彼等業內已知者，例如抗體6C8或具有6C8之CDR之人類化抗體，如(例如)WO2006/105021中所述；WO2011/028683、JP2008278814、KR20080105674、US20040072566、US2001472565、US20140065152或WO2015/031667中所述之抗體。
在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包含IgG2同型之鉸鏈(「IgG2鉸鏈」)及CH1、CH2及CH3結構域。在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包含IgG2鉸鏈及CH1、CH2及CH3結構域，其中CH1、CH2及CH3結構域中之至少一者不屬IgG2同型。IgG2鉸鏈可為野生型IgG2鉸鏈，例如野生型人類IgG2鉸鏈(例如，ERKCCVECPPCPAPPVAG；SEQ ID NO：291)或其變體，前提係IgG2 鉸鏈保留賦予抗體相對於包含非IgG2鉸鏈之相同抗體增強之活性之能力。在某些實施例中，IgG2鉸鏈變體保留與野生型IgG2鉸鏈類似之剛性或勁度。鉸鏈之剛性可藉由(例如)電腦建模、電子顯微鏡、光譜(例如核磁共振(NMR))、X射線結晶照相術(B-因子)或沉降速度分析超離心(AUC)測定以量測或比較包含鉸鏈之抗體之回轉半徑。若包含鉸鏈之抗體具有與具有不同鉸鏈(例如IgG1鉸鏈)之相同抗體之值相差小於5%、10%、25%、50%、75%或100%之自前一句子中所述之測試中之一者獲得之值，則鉸鏈相對於另一鉸鏈可具有類似或較高剛性。熟習此項技術者藉由闡釋該等測試之結果應能夠自測試確定鉸鏈是否具有與另一鉸鏈至少類似之剛性。實例性人類IgG2鉸鏈變體係包含四個半胱胺酸殘基(即，C219、C220、C226及C229)中之一或多者之取代之的IgG2鉸鏈。半胱胺酸可由絲胺酸置換。實例性IgG2鉸鏈係包含C219S突變(例如，ERKSCVECPPCPAPPVAG；SEQ ID NO：292)之人類IgG2鉸鏈。可使用之其他IgG2鉸鏈變體包括包含C220、C226及/或C229取代(例如C220S、C226S或C229S突變(其可與C219S突變組合))之人類IgG2鉸鏈。IgG2鉸鏈亦可為鉸鏈之一部分係另一同型之鉸鏈(即，其係嵌合鉸鏈)的IgG2鉸鏈，前提係嵌合鉸鏈之剛性至少類似於野生型IgG2鉸鏈之剛性。舉例而言，IgG2鉸鏈可為下部鉸鏈(如表2中所定義)屬IgG1同型且係(例如)野生型IgG1下部鉸鏈的IgG2鉸鏈。可用於IgG2鉸鏈中之額外IgG2鉸鏈突變包括SE(S267E)、SELF(S267E/L328F)、SDIE(S239D/I332E)、SEFF及GASDALIE(G236A/S239D/A330L/I332E)突變。
若鉸鏈之連續胺基酸之一半以上來自同型，則「雜合」或「嵌合」鉸鏈稱作屬特異性同型。舉例而言，將具有IgG2之上鉸鏈及中鉸鏈及IgG1之下部鉸鏈的鉸鏈視為IgG2鉸鏈。
在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包含CH1結構域，其係IgG1 或IgG2同型之野生型CH1結構域(分別「IgG1 CH1結構域」或「IgG2 CH1結構域」)。亦可使用同型IgG3及IgG4之CH1結構域(分別「IgG3 CH1結構域」及「IgG2 CH1結構域」)。CH1結構域亦可為野生型CH1結構域之變體，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH1結構域之變體。CH1結構域之實例性變體包括A114C及T173C。
在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包含CH2結構域，其係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型之野生型CH2結構域(分別「IgG1 CH2結構域」、「IgG2 CH2結構域」、「IgG3 CH2結構域」或「IgG4 CH2結構域」)。CH2結構域亦可為野生型CH2結構域之變體，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH2結構域之變體。CH2結構域之實例性變體包括調節抗體之Fc區之生物活性(例如ADCC或CDC)或調節抗體之半衰期或其穩定性的變體。在一個實施例中，CH2結構域係具有A330S及P331S突變之人類IgG1 CH2結構域，其中CH2結構域相對於無突變之相同CH2突變具有降低之效應物功能。其他突變進一步闡述於本文中別處。
在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包含CH3結構域，其係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型之野生型CH3結構域(分別「IgG1 CH3結構域」、「IgG2 CH3結構域」、「IgG3 CH3結構域」或「IgG4 CH3結構域」)。CH3結構域亦可為野生型CH3結構域之變體，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3結構域之變體。CH3結構域之實例性變體包括調節抗體之Fc區之生物活性(例如ADCC或CDC)或調節抗體之半衰期或其穩定性的變體。
通常，CH1、鉸鏈、CH2或CH3結構域之變體可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個突變、及/或至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個突變、或1-10或1-5個突變，或包含與相應野生型結構域(分別CH1、鉸鏈、CH2或CH3結構域)之胺基酸序列至少約75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，前提係包含特定變體之重鏈恆定區保留必需生物活性。
表3闡述包含人類CH1、鉸鏈、CH2及/或CH3結構域之實例性人類重鏈恆定區，其中每一結構域皆係為重鏈恆定區提供期望生物活性之野生型結構域或其變體。表3中之未填充單元指示結構域存在或不存在，且若存在則可屬任一同型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。舉例而言，包含表3中之重鏈恆定區1之抗體係包含至少包含IgG2鉸鏈之重鏈恆定區的抗體，且其亦可包含CH1、CH2及/或CH3結構域，且若存在，則該CH1、CH2及/或CH3結構域屬IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。作為用於理解表3之另一實例，包含重鏈恆定區8之抗體係包括包含IgG1CH1結構域、及IgG2鉸鏈、IgG1 CH2結構域之重鏈恆定區的抗體，且其亦可包含或不包含CH3結構域，若存在其可屬IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
Figure 104118186-A0305-02-0073-19
Figure 104118186-A0305-02-0074-22
在某些實施例中，抗GITR抗體包含表3中所示之重鏈恆定區且相對於包含不包含該特定重鏈恆定區之重鏈恆定區的相同抗體具有增強之激動劑活性。在某些實施例中，包含表3中所示之重鏈恆定區之抗體相對於包含不包含IgG2鉸鏈或相同IgG2鉸鏈之重鏈恆定區的相同抗體具有增強之激動劑活性。在某些實施例中，包含表3中所示之重鏈恆定區之抗體相對於包括包含非IgG2鉸鏈且包含(例如)IgG1、IgG3或IgG4鉸鏈之重鏈恆定區的相同抗體具有增強之激動劑活性。在某些實施例中，包含表3中所示之重鏈恆定區之抗體相對於包含不包含相同CH1、鉸鏈、CH2或CH3結構域中之一或多者之重鏈恆定區的相同抗體具有增強之激動劑活性。舉例而言，在某些實施例中，包含表3中所示之重鏈恆定區之抗體相對於包含不包含IgG2鉸鏈及特定同型之CH1、CH2及/或CH3結構域之重鏈恆定區的相同抗體具有增強之激動劑活性。舉例而言，包含表3中所示之重鏈恆定區22之抗體相對於以 下抗體可具有增強之激動劑活性：(i)包含不包含IgG2鉸鏈且包含(例如)非IgG2鉸鏈(例如，IgG1、IgG3或IgG4鉸鏈)之重鏈恆定區的相同抗體；(ii)包含不包含IgG2鉸鏈及IgG1 CH1且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG1 CH1之重鏈恆定區的相同抗體；(iii)包含不包含IgG2鉸鏈及IgG2 CH2且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG2 CH2之重鏈恆定區的相同抗體；(iv)包含不包含IgG2鉸鏈及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG1 CH3之重鏈恆定區的相同抗體；(v)包含不包含IgG2鉸鏈、IgG1 CH1及IgG2 CH2且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG1 CH1及/或非IgG2 CH2之重鏈恆定區的相同抗體；(vi)包含不包含IgG2鉸鏈、IgG1CH1及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG1 CH1及/或非IgG1 CH3之重鏈恆定區的相同抗體；(vii)包含不包含IgG2鉸鏈、IgG2 CH2及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG2 CH及/或非IgG1 CH3之重鏈恆定區的相同抗體；(viii)或包含不包含IgG2鉸鏈、IgG1 CH1、IgG2 CH2及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG1 CH1及/或非IgG2 CH2及/或非IgG1 CH3之重鏈恆定區的相同抗體。
可連接至抗GITR可變區之實例性經修飾重鏈恆定區(例如本文中所述之彼等)提供於表4中，其闡述結構域中之每一者之身份。
Figure 104118186-A0305-02-0076-23
Figure 104118186-A0305-02-0077-24
Figure 104118186-A0305-02-0078-25
在某些實施例中，抗GITR抗體包含經修飾重鏈恆定區，其包括包含SEQ ID NO：291、292、293或294之IgG2鉸鏈或其變體，例如包含如下胺基酸序列之IgG2鉸鏈：(i)與SEQ ID NO：291、292、293或294有1、2、3、4或5個胺基酸取代、添加或缺失不同；(ii)與SEQ ID NO：291、292、293或294有至多5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加或缺失不同；(iii)與SEQ ID NO：291、292、293或294有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5個胺基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含與SEQ ID NO：291、292、293或294至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，其中在(i)-(iv)中之任一者中，胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代；且其中經修飾重鏈恆定區相對於另一重鏈恆定區(例如包含非IgG2鉸鏈之重鏈恆定區)或相對於包含非IgG2鉸鏈之相同經修飾重鏈恆定區為抗GITR抗體提供增強之激動劑活性。
在某些實施例中，抗GITR抗體包含經修飾重鏈恆定區，其包括包含SEQ ID NO：278之IgG1 CH1結構域或包含SEQ ID NO：279或者SEQ ID NO：278或279之變體之IgG2 CH1結構域，該變體(i)與SEQ ID NO：278或279有1、2、3、4或5個胺基酸取代、添加或缺失不同；(ii)與SEQ ID NO：278或279有至多5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加或缺失不同；(iii)與SEQ ID NO：278或279有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5個胺基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含與SEQ ID NO：278或279至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致 之胺基酸序列，其中在(i)-(iv)中之任一者中，胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代；且其中包含經修飾重鏈恆定區之抗GITR抗體相對於具有另一重鏈恆定區(例如包含非IgG2鉸鏈之重鏈恆定區)之抗GITR抗體或相對於包含非IgG2鉸鏈之相同經修飾重鏈恆定區具有增強之激動劑活性。
在某些實施例中，抗GITR抗體包含經修飾重鏈恆定區，其包括包含SEQ ID NO：280或281或者SEQ ID NO：280或281之變體之IgG1 CH2結構域，該變體(i)與SEQ ID NO：280或281有1、2、3、4或5個胺基酸取代、添加或缺失不同；(ii)與SEQ ID NO：280或281有至多5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加或缺失不同；(iii)與SEQ ID NO：280或281有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5個胺基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含與SEQ ID NO：280或281至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，其中在(i)-(iv)中之任一者中，胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代；且其中經修飾重鏈恆定區相對於另一重鏈恆定區(例如包含非IgG2鉸鏈之重鏈恆定區)或相對於包含非IgG2鉸鏈之相同經修飾重鏈恆定區為抗GITR抗體提供增強之激動劑活性。
在某些實施例中，抗GITR抗體包含經修飾重鏈恆定區，其包括包含SEQ ID NO：282或SEQ ID NO：282之變體之IgG1 CH3結構域，該變體(i)與SEQ ID NO：282有1、2、3、4或5個胺基酸取代、添加或缺失不同；(ii)與SEQ ID NO：282有至多5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加或缺失不同；(iii)與SEQ ID NO：282有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5個胺基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含與SEQ ID NO：282至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，其中在(i)-(iv)中之任一者中，胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代；且其中經修飾重鏈恆定區相對於另一 重鏈恆定區(例如包含非IgG2鉸鏈之重鏈恆定區)或相對於包含非IgG2鉸鏈之經修飾重鏈恆定區提供增強之激動劑活性。
經修飾重鏈恆定區亦可包含上述CH1、鉸鏈、CH2及CH3結構域之組合。
在某些實施例中，抗GITR抗體包含經修飾重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO：223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290或SEQ ID NO：223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290之變體，該變體(i)與SEQ ID NO：223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸取代、添加或缺失不同；(ii)與SEQ ID NO：223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290有至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加或缺失不同；(iii)與SEQ ID NO：223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290有1-5、1-3、1-2、2-5、3-5、1-10或5-10個胺基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含與SEQ ID NO：223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，其中在(i)-(iv)中之任一者中，胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代；且其中經修飾重鏈恆定區相對於另一重鏈恆定區(例如包含非IgG2鉸鏈之重鏈恆定區)或相對於包含非IgG2鉸鏈之相同經修飾重鏈恆定區提供增強之激動劑活性。
經修飾重鏈恆定區可具有(i)相對於野生型重鏈恆定區類似、降低或增加之效應物功能(例如，結合至FcγR)及或(ii)相對於野生型重鏈恆定區類似、降低或增加之半衰期(或結合至FcRn受體)。
III.具有特定種系序列之抗體
在某些實施例中，抗GITR抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因之重鏈可變區及/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因之輕鏈可變區。
如本文所展示，製備對GITR具有特異性之人類抗體，其包含係人類種系VH 3-33基因、VH 3-10基因、VH 3-15基因、VH 3-16、VH JH6b基因、VH 6-19基因、VH 4-34基因及/或VH JH3b基因之產物或源自其之重鏈可變區。因此，本文提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含係選自由以下組成之群之人類VH種系基因之產物或源自其之重鏈可變區：VH 3-33、VH 3-10、VH 3-15、VH 3-16、VH JH6b、VH 6-19、VH 4-34及/或VH JH3b。
製備對GITR具有特異性之人類抗體，其包含係人類種系VK L6基因、VK L18基因、VK L15基因、VK L20基因、VK A27基因、VK JK5基因、VK JK4基因、VK JK2基因及VK JK1基因之產物或源自其之輕鏈可變區。因此，本文提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含係選自由以下組成之群之人類VK種系基因之產物或源自其之輕鏈可變區：VK L6、VK L18、VK L15、VK L20、VK A27、VK JK5、VK JK4、VK JK2及VK JK1。
本文所述較佳抗體係彼等包含係上文所列舉人類種系VH基因中之一者之產物或源自其之重鏈可變區且亦包含係上文所列舉人類種系VK基因中之一者之產物或源自其之輕鏈可變區者，如圖2-11中所示。
如本文所用，若抗體之可變區係自使用人類種系免疫球蛋白基因之系統獲得，則人類抗體包含係特定種系序列之「產物」或「源自」其之重鏈或輕鏈可變區。該等系統包括利用所關注抗原對攜帶人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠實施免疫或利用所關注抗原篩選展示於噬菌體上之人類免疫球蛋白基因文庫。為人類種系免疫球蛋白序列 之「產物」或「源自」其之人類抗體可藉由以下方式來鑑別：比較人類抗體之胺基酸序列與人類種系免疫球蛋白之胺基酸序列，並選擇序列最接近人類抗體序列(即最大一致性%)之人類種系免疫球蛋白序列。為特定人類種系免疫球蛋白序列之「產物」或「源自」其之人類抗體與種系序列相比可含有胺基酸差異，此乃因存在(例如)天然體細胞突變或有意引入定點突變。然而，所選人類抗體之胺基酸序列通常與由人類種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有當與其他物種之種系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類種系序列)相比時將人類抗體鑑別為人類之胺基酸殘基。在某些情形下，人類抗體之胺基酸序列可與由種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少95%、或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。通常，源自特定人類種系序列之人類抗體將展示與由人類種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過10個的胺基酸差異。在某些情形下，人類抗體可展示與由種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過5個或甚至不超過4個、3個、2個或1個的胺基酸差異。
IV.同源抗體
本文涵蓋具有重鏈及輕鏈可變區之抗體，該等重鏈及輕鏈可變區包含與本文所述較佳抗體之胺基酸序列同源之胺基酸序列，且其中抗體保留本文所述抗GITR抗體之期望功能性質。
舉例而言，經分離抗GITR抗體或其抗原結合部分可包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中：(a)重鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：13、26、39、52、71、84、97、115、128及335，或相對於選自由以下組成之群之胺基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50個胺基酸變化(即，胺 基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO：13、26、39、52、71、84、97、115、128及335；(b)輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336，或相對於選自由以下組成之群之胺基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50個胺基酸變化(即，胺基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO：14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336；(c)抗體特異性結合至GITR，且(d)抗體展現以下功能性質中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11者或全部：(1)以如(例如)藉由Biacore量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類GITR；(2)以如(例如)藉由Scatchard量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之KD結合至膜結合之人類GITR；(3)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類GITR；(4)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴GITR，例如結合至膜結合之食蟹猴GITR；(5)(例如)在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3濃度存在下)誘導或增強T細胞活化，如藉由(i)表現GITR之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖所證明；(6)誘導或增強T細胞活化而無需多價交聯；(7)以如藉由FACS量測之(例如)1μg/mL或更小之EC50抑制GITR 配體與3A9-hGITR細胞上之GITR的結合；(8)至多部分抑制GITR配體與活化T細胞上之GITR的結合；(9)結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)上之構象表位，例如胺基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)內之不連續表位；(10)結合至O-連接及N-連接糖基化及未糖基化人類GITR；(11)在不與Fc受體結合下具有激動劑活性，但其中與Fc受體之結合進一步增強激動劑活性；(12)在任一方向或兩個方向上與28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10競爭結合至人類GITR。
在各個實施例中，抗體可展現如上文(1)至(12)所列舉之功能性質中之一或多者、兩者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者、六者或更多者、七者或更多者、八者或更多者、九者、十者、十一者或全部。該抗體可係(例如)人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
經分離抗GITR抗體或其抗原結合部分可包含重鏈及輕鏈，其中：(a)重鏈包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列之至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362，或相對於選自由以下組成之群之胺基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50個胺基酸變化(即，胺基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO：15、17、18、28、30、31、 41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362，前提係在某些實施例中，若序列係較差效應物重鏈之序列，則使得重鏈較差效應物之突變未經修飾(即，未對A234、E235、A237、S330及S331進行修飾)；(b)輕鏈包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341及371，或相對於選自由以下組成之群之胺基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50個胺基酸變化(即，胺基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO：16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341及371；(c)抗體特異性結合至GITR，且(d)抗體展現以下功能性質中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11者或全部：(1)以如(例如)藉由Biacore量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類GITR；(2)以如(例如)藉由Scatchard量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之KD結合至膜結合之人類GITR；(3)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類GITR；(4)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴GITR，例如結合至膜結合之食蟹猴GITR； (5)(例如)在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3濃度存在下)誘導或增強T細胞活化，如藉由(i)表現GITR之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖所證明；(6)誘導或增強T細胞活化而無需多價交聯；(7)以如藉由FACS量測之(例如)1μg/mL或更小之EC50抑制GITR配體與3A9-hGITR細胞上之GITR的結合；(8)至多部分抑制GITR配體與活化T細胞上之GITR的結合；(9)結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)上之構象表位，例如胺基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)內之不連續表位；(10)結合至O-連接及N-連接糖基化及未糖基化人類GITR；(11)在不與Fc受體結合下具有激動劑活性，但其中與Fc受體之結合進一步增強激動劑活性；及(12)在任一方向或兩個方向上與28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10競爭結合至人類GITR。
亦提供包含如下VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及/或VLCDR3之抗GITR抗體：其與28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10之相應CDR有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個胺基酸變化(即，胺基酸取代、添加或缺失)的不同。在某些實施例中，抗GITR抗體在1、2、3、4、5或6個CDR中之每一者中相對於28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10中之相應序列包含1-5個胺基酸變化。在某些實施例中，抗GITR抗體在所有CDR中相對於28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、 18E10及/或6G10中之CDR包含總1-5個胺基酸變化。
在某些實施例中，抗GITR抗體包含由28F3之彼等組成之VH及VL CDR，其中一或多個CDR中之一或多個胺基酸係本文揭示之其他抗GITR抗體中之一者之彼等胺基酸。
舉例而言，在某些實施例中，抗GITR抗體包含相對於SYGMH(SEQ ID NO：20)包含一或多個胺基酸修飾之VHCDR1，且可包含(例如)以下簡併序列中之一者：SYGXH(SEQ ID NO：372)，其中X係任一胺基酸，例如M或F；X1YGX2H，其中X1係任一胺基酸，例如S、N或D；且X2係任一胺基酸，例如M或F；及X1YGX2X3，其中X1係任一胺基酸，例如S、N或D；X2係任一胺基酸，例如M或F，且X3係任一胺基酸，例如H或Q。
在某些實施例中，抗GITR抗體包含相對於VIWYEGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：21)包含一或多個胺基酸修飾之VHCDR2，且可包含以下簡併序列中之一者：VIWYX1GSNKX2YADSVKG(SEQ ID NO：373)，其中X1係任一胺基酸，例如E或A；且X2係任一胺基酸，例如Y或F；及VIWYX1GSNKX2YX3DSVKG(SEQ ID NO：374)，其中X1係任一胺基酸，例如E、A、G或D；X2係任一胺基酸，例如Y或F；且X3係任一胺基酸，例如A或V。
在某些實施例中，抗GITR抗體包含相對於GGSMVRGDYYYGMDV(SEQ ID NO：22)包含一或多個胺基酸修飾之VHCDR3，且可包含(例如)以下簡併序列中之一者：GGSX1VRGDYYYGMDV(SEQ ID NO：375)，其中X1係任一胺基酸，例如M或V、L、I或A。
GGSX1VRGX2YYYGMDV(SEQ ID NO：376)，其中X1係任一胺 基酸，例如M或V、L、I或A；且X2係任一胺基酸，例如D或E。X1與X2之特定組合闡述於實例中。
GG(6-7aa)MDVWYYX1MDVW(SEQ ID NO：377)，其中X1係任一胺基酸，例如G、S或V。在某些實施例中，6-7個胺基酸對應於本文揭示之抗GITR抗體之VHCDR3序列中該位置處的胺基酸。
在某些實施例中，抗GITR抗體包含相對於RASQGISSALA(SEQ ID NO：23)包含一或多個胺基酸修飾之VLCDR1，且可包含(例如)以下簡併序列中之一者：RASQGISSXLA(SEQ ID NO：378)，其中X係任一胺基酸，例如A或W(或A、W或Y)；及RASQG(2-3 aa)SX1LA(SEQ ID NO：379)，其中X1係任一胺基酸，例如W、Y或A且2-3個胺基酸係任何胺基酸，例如GI、SVS或SVT。
在某些實施例中，抗GITR抗體包含相對於DASSLES(SEQ ID NO：24)包含一或多個胺基酸修飾之VLCDR2，且可包含(例如)以下簡併序列中之一者：DASSLXS(SEQ ID NO：380)，其中X係任一胺基酸，例如E或Q；及X1ASSX2X3X4，其中X1係任一胺基酸，例如A、D或G；X4係任一胺基酸，例如L或R；X3係任一胺基酸，例如Q、E或A；且X4係任一胺基酸，例如S或T。
在某些實施例中，抗GITR抗體包含相對於QQFNSYPYT(SEQ ID NO：25)包含一或多個胺基酸修飾之VLCDR3，且可包含(例如)以下簡併序列中之一者：QQXNSYPYT(SEQ ID NO：381)，其中X係任一胺基酸，例如F或Y；且 QQX1X2SX3PX4T(SEQ ID NO：382)，其中X1係任一胺基酸，例如F或Y；X2係任一胺基酸，例如N或G；X3係任一胺基酸，例如Y或S；且X4係任一胺基酸，例如Y、W、I、P或Q。
具有與28F3、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8、19D3、18E10及/或6G10之彼等序列同源之序列(例如分別SEQ ID NO：13、26、39、52、71、84、97、115、128及335、及SEQ ID NO：14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336之VH及VL區、或分別SEQ ID NO：15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135及337、及SEQ ID NO：16、19、29、32、42、45、56、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137及338之重鏈及輕鏈或CDR)的抗體可藉由以下方式獲得：誘變(例如，定點或PCR介導之誘變)編碼SEQ ID NO：147、154、158、162、168、172、176、182、186、353及/或SEQ ID NO：148、155、159、163、164、169、173、177、178、183、187、188、354或SEQ ID NO：149、151、152、156、160、165、170、174、179、184、189、355及/或SEQ ID NO：150、153、157、161、166、171、175、180、185、190、191、356之核酸分子，之後使用本文所述功能分析針對保留功能(即，上文(1)至(12)中闡述之功能)測試經編碼改變抗體。
V.具有保守修飾之抗體
抗GITR抗體可包括包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中該等CDR序列中之一或多者包含基於本文所述較佳抗體(例如，28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10)的指定胺基酸序列或其保守修飾形式，且其中抗體保留本文所述抗GITR抗體之期 望功能性質。因此，經分離抗GITR抗體或其抗原結合部分可包括包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中：(a)重鏈可變區CDR3序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：22、35、48、64、80、93、108、124、140及344之胺基酸序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代；(b)輕鏈可變區CDR3序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347之胺基酸序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代；(c)抗體特異性結合至GITR，且(d)抗體展現以下功能性質中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11者或全部：(1)以如(例如)藉由Biacore量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類GITR；(2)以如(例如)藉由Scatchard量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之KD結合至膜結合之人類GITR；(3)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類GITR；(4)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴GITR，例如結合至膜結合之食蟹猴GITR；(5)(例如)在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3濃度存在下)誘導或增強T細胞活化，如藉由(i)表現GITR之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖所證明； (6)誘導或增強T細胞活化而無需多價交聯；(7)以如藉由FACS量測之(例如)1μg/mL或更小之EC50抑制GITR配體與3A9-hGITR細胞上之GITR的結合；(8)至多部分抑制GITR配體與活化T細胞上之GITR的結合；(9)結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)上之構象表位，例如胺基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)內之不連續表位；(10)結合至O-連接及N-連接糖基化及未糖基化人類GITR；(11)在不與Fc受體結合下具有激動劑活性，但其中與Fc受體之結合進一步增強激動劑活性；及(12)在任一方向或兩個方向上與28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10競爭結合至人類GITR。
在較佳實施例中，重鏈可變區CDR2序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：21、34、47、63、79、92、107、123、139及343之胺基酸序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代；且輕鏈可變區CDR2序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346之胺基酸序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代。在另一較佳實施例中，重鏈可變區CDR1序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：20、33、46、62、78、91、106、122、138及342之胺基酸序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代；且輕鏈可變區CDR1序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345之胺基酸 序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代。
在各個實施例中，抗體可展現如上文(1)至(12)所列舉之功能性質中之一或多者、兩者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者、六者或更多者、七者或更多者、八者或更多者、九者或全部。該等抗體可係(例如)人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
亦可在除CDR外或以及CDR的抗體部分中進行保守胺基酸取代。舉例而言，可在框架區或Fc區中進行保守胺基酸修飾。相對於本文提供之抗GITR抗體序列，可變區或重鏈或輕鏈可包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50個保守胺基酸取代、在某些實施例中，抗GITR抗體包含保守及非保守胺基酸修飾之組合。
VI.在GITR上與本文所述抗體結合相同表位或與本文所述抗體競爭結合至GITR之抗體
亦提供與本文所述特定抗GITR抗體(例如，抗體28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10)競爭結合至GITR之抗體。該等競爭抗體可在標準GITR結合分析中基於其競爭性抑制結合至單株抗體28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10中之一或多者之GITR的能力來鑑別。舉例而言，可使用標準ELISA分析或競爭性ELISA分析，其中將重組人類GITR蛋白固定於板上，添加不同濃度之未標記之第一抗體，洗滌板，添加經標記之第二抗體，且量測標記之量。若增加濃度之未經標記(第一)抗體(亦稱作「封阻抗體」)抑制經標記(第二)抗體之結合，則據稱第一抗體抑制第二抗體與板上之靶標之結合，或據稱競爭第二抗體之結合。另外或或者，可使用BIAcore分析以評價抗體競爭之能力。測試抗體抑制本文所述抗GITR抗體與 GITR之結合之能力展示測試抗體可與抗體競爭結合至GITR。
因此，本文提供如下抗GITR抗體：將本文所述抗GITR抗體與細胞(例如活化T細胞)上之GITR的結合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%及/或與細胞(例如活化T細胞)上之GITR之結合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，如(例如)藉由ELISA或FACS量測、例如藉由使用以下段落中所述之分析。
可如下執行用以確定(例如)第一抗體是否阻斷第二抗體之結合(即，「與其競爭」)之實例性競爭實驗：如下製備活化人類T細胞：使用Ficoll梯度自人類全血分離末梢血單核細胞(PBMC)並用10μg/mL植物血球凝集素(PHA-L)(USBiol編號P3370-30)及200IU/mL重組IL-2(Peprotech編號200-02)活化3天。將活化T細胞重新懸浮於FACS緩衝液(具有5%胎牛血清之PBS)中並以105個細胞/試樣孔在96孔板中接種。將板設定於冰上，之後以介於0μg/mL至50μg/mL範圍內之濃度(自50μg/mL之最高濃度開始三倍滴定)添加未偶聯之第一抗體。可使用無關IgG作為第一抗體之同型對照且其以相同濃度(自50μg/mL之最高濃度開始三倍滴定)添加。可包括與50μg/mL未經標記之第二抗體一起預培育之試樣作為競爭阻斷(100%抑制)之陽性對照且可使用一級培育中無抗體之試樣作為陰性對照(無競爭；0%抑制)。培育30分鐘後，以2μg/mL/孔之濃度添加經標記(例如生物素化)第二抗體而不洗滌。將試樣在冰上再培育30分鐘。藉由用FACS緩衝液洗滌細胞去除未結合之抗體。利用檢測標記用於檢測生物素之試劑(例如PE偶聯之鏈黴抗生物素蛋白(Invitrogen，目錄編號S21388))檢測細胞結合之經標記之第 二抗體。在FACS Calibur流式細胞儀(BD,San Jose)上獲取試樣並利用Flowjo軟體(Tree Star公司，Ashland,OR)進行分析。結果可表示為抑制%(即，自100%減去每一濃度下標記之量除以在無封阻抗體情況下獲得之標記之量)。通常，隨後逆向執行相同實驗，即第一抗體係第二抗體且第二抗體係第一抗體。在某些實施例中，抗體至少部分(例如，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)或完全(100%)阻斷另一抗體與靶標(例如人類GITR或其部分)之結合，且與在一種或另一抗體係第一抗體時是否發生抑制無關。在抗體以兩種方式(即在首先添加第一抗體之競爭實驗中及在首先添加第二抗體之競爭實驗中)彼此競爭時，第一及第二抗體「交叉阻斷」彼此與靶標之結合。在某些實施例中，抗GITR抗體與本文所述抗GITR抗體(例如，抗體28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10)結合至相同表位，如(例如)藉由指定表位定位技術所測定。如本文中進一步論述，28F3抗體在QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(SEQ ID NO：215)內人類GITR中之區內結合。因此，在某些實施例中，抗GITR抗體結合至區域QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(SEQ ID NO：215)內對應於成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)之胺基酸殘基1-39之胺基酸殘基。在一個實施例中，抗GITR抗體結合至成熟人類GITR之區域QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：216)內之胺基酸殘基。在一個實施例中，本文所述抗GITR抗體結合至成熟人類GITR之區域PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)內之胺基酸殘基。在某些實施例中，抗GITR抗體結合至胺基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)，如(例如)使用實例中所述之方案藉由 HDX所測定。
用於測定與本文所述抗體結合至「GITR上之相同表位」之抗體的技術包括(例如)表位定位方法，例如抗原：抗體複合物之晶體之x射線分析，其提供表位之原子解析度。其他方法監測抗體與抗原片段或抗原之突變變化形式的結合，其中由於抗原序列內胺基酸殘基之修飾所致之結合損失經常被視為可指示表位組份。另外，亦可使用表位定位之計算組合方法。該等方法亦依賴於所關注抗體與自組合噬菌體展示肽文庫之單離特異性短肽(呈天然三維形式或呈變性形式)的親和能力。隨後該等肽可視為界定對應於用於篩選肽文庫之抗體之表位的前導序列。對於表位定位而言，亦已開發一種顯示可定位構象不連續表位之計算算法。
可藉由使用業內已知方法鑑別與本文所述抗GITR抗體競爭結合或與其結合至相同表位的抗體。舉例而言，可利用如本文所述人類GITR對小鼠實施免疫，產生雜交瘤，且針對與本文所述抗體競爭結合至GITR之能力篩選所得單株抗體。亦可利用含有抗體結合之表位之GITR之較小片段對小鼠實施免疫。可藉由(例如)針對與跨越GITR之一系列重疊肽之結合進行篩選來定位表位或包含表位之區域。或者，可使用Jespers等人，Biotechnology 12：899,1994之方法以引導與本文所述抗GITR抗體具有相同表位且因此具有類似性質之抗體的選擇。使用噬菌體展示，首先使抗GITR抗體之重鏈與(較佳人類)輕鏈譜配對以選擇GITR結合抗體，且隨後使新輕鏈與(較佳人類)重鏈譜配對以選擇具有與本文所述抗GITR抗體相同之表位或表位區的(較佳人類)GITR結合抗體。或者，可藉由誘變編碼抗體之重鏈及輕鏈之cDNA獲得本文所述抗體之變體。
亦可如由Cunningham及Wells(1989)Science 244：1081-1085所述之丙胺酸掃描誘變或GITR中胺基酸殘基之定點誘變之一些其他形式 以測定抗GITR抗體之功能表位。然而，誘變研究亦可揭示對GITR之總體三維結構至關重要但並不直接參與抗體-抗原接觸的胺基酸殘基，且因此可能需要其他方法以確認使用此方法測定之功能表位。
亦可藉由評價抗體與包含GITR之片段(例如非變性或變性片段)之肽之結合測定由特異性抗體結合之表位或表位區域(「表位區域」係包含表位或與表位重疊之區域)。可合成一系列涵蓋GITR(例如，人類GITR)之序列之重疊肽且在(例如)直接ELISA、競爭性ELISA(其中評價肽防止抗體與結合至微量滴定板之孔之GITR之結合之能力)中或在晶片上針對結合進行篩選。該等肽篩選方法可不能夠檢測一些不連續功能表位，即涉及沿GITR多肽鏈之一級序列並不鄰接之胺基酸殘基的功能表位。
亦可藉由基於MS之蛋白質足跡法(例如氫/氘交換質譜(HDX-MS)及蛋白質之快速光化學氧化(FPOP))鑑別表位。HDX-MS可如實例及以下中進一步闡述來執行：例如Wei等人(2014)Drug Discovery Today 19：95，其方法以引用方式明確併入本文中。FPOP可如(例如)Hambley and Gross(2005)J.American Soc.Mass Spectrometry 16：2057中所述來執行，其方法以引用方式明確併入本文中。
亦可藉由結構方法(例如X射線晶體結構測定(例如，WO2005/044853))、分子建模及核磁共振(NMR)譜(包括在游離時及在與所關注抗體之複合物中結合時GITR中不穩定醯胺氫之H-D交換速率之NMR測定)測定由抗GITR抗體結合之表位(Zinn-Justin等人(1992)Biochemistry 31,11335-11347；Zinn-Justin等人(1993)Biochemistry 32,6884-6891)。
關於X射線結晶照相術，結晶可使用業內已知方法中之任一者來完成(例如Giege等人(1994)Acta Crystallogr.D50：339-350；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189：1-23)，該等方法包括微配液 (microbatch)(例如Chayen(1997)Structure 5：1269-1274)、懸滴氣相擴散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251：6300-6303)、接種及透析。期望使用具有至少約1mg/mL且較佳約10mg/mL至約20mg/mL之濃度之蛋白製劑。可在含有聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量介於約1000Da至約20,000Da之範圍內，較佳約5000Da至約7000Da，更佳約6000Da)之沈澱溶液中最大達成結晶，其中濃度介於約10%至約30%(w/v)之範圍內。亦可期望包括蛋白穩定劑，例如甘油，其中濃度介於約0.5%至約20%範圍內。適宜鹽(例如氯化鈉、氯化鋰或檸檬酸鈉)亦可在沈澱溶液中係合意的，濃度較佳介於約1mM至約1000mM範圍內。沈澱較佳緩衝至約3.0至約5.0、較佳約4.0之pH。可用於沈澱溶液中之具體緩衝液可變且為業內所熟知(Scopes,Protein Purification：Principles and Practice，第三版，(1994)Springer-Verlag,New York)。有用緩衝液之實例包括(但不限於)HEPES、Tris、MES及乙酸鹽。晶體可在寬範圍之溫度(包括2℃、4℃、8℃及26℃)下生長。
可使用熟知X射線繞射技術研究抗體：抗原晶體且可使用電腦軟體(例如X-PLOR(Yale University,1992，由Molecular Simulations公司分發；例如參見Blundell & Johnson(1985)Meth.Enzymol.114 & 115,H.W.Wyckoff等人編輯，Academic Press；美國專利申請公開案第2004/0014194號)及BUSTER(Bricogne(1993)Acta Cryst.D49：37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A：361-423,Carter及Sweet編輯；Roversi等人(2000)Acta Cryst.D56：1313-1323)對其進行精製，該等參考文獻之揭示內容之全文以引用方式併入本中。
抗GITR抗體可與具有本文所述胺基酸序列之抗GITR抗體中之任一者結合至相同表位，如藉由表位定位技術(例如本文所述技術)所測定。
VII.經改造及修飾之抗體 VH及VL區
亦提供經改質及修飾之抗體，其可使用具有本文揭示之VH及/或VL序列中之一或多者之抗體作為起始材料來製備以改造經修飾抗體，該經修飾抗體可具有自起始抗體改變之性質。抗體可藉由修飾一或兩個可變區(即VH及/或VL)內、例如一或多個CDR區內及/或一或多個框架區內之一或多個殘基來改造。另外或或者，抗體可藉由修飾恆定區內之殘基來改造，例如改變抗體之效應物功能。
可實施之一種可變區改造類型係CDR移植。抗體與靶抗原主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中之胺基酸殘基相互作用。出於此原因，在個別抗體之間CDR內之胺基酸序列較CDR外之序列更不同。由於CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，故可藉由構築包括來自移植至具有不同性質之不同抗體之框架序列之特異性天然抗體之CDR序列的表現載體表現模擬特異性天然抗體之性質的重組抗體(例如參見Riechmann,L.等人(1998)Nature 332：323-327；Jones,P.等人(1986)Nature 321：522-525；Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A. 86：10029-10033；頒予Winter之美國專利第5,225,539號、及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
因此，本文所述之另一實施例涉及經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包括包含分別包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3序列的重鏈可變區：SEQ ID NO：20、33、46、62、78、91、106、122、138及342、SEQ ID NO：21、34、47、63、79、92、107、123、139及343及SEQ ID NO：22、35、48、64、80、93、108、124、140及344、以及包含分別包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3序列的輕鏈可變區：SEQ ID NO： 23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345、SEQ ID NO：24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346及SEQ ID NO：25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347。因此，該等抗體含有單株抗體28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10之VH及VL CDR序列，但可含有與該等抗體不同之框架序列。
該等框架序列可自包括種系抗體基因序列之公開DNA資料庫或公開參考文獻來獲得。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之種系DNA序列可參見「VBase」人類種系序列資料庫(可在網際網路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上獲得)以及Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號；Tomlinson,I.M.等人(1992)「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」J.Mol.Biol. 227：776-798；及Cox,J.P.L.等人(1994)「A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」Eur.J.Immunol. 24：827-836；每一者之內容係全文以引用方式明確併入本文中。
用於本文所述抗體中之較佳框架序列係彼等在結構域類似於本文所述抗體所使用之框架序列者。可將VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列移植至具有與發現於衍生出框架序列之種系免疫球蛋白基因中之序列一致之序列的框架區上，或可將CDR序列移植至與種系序列相比含有一或多個突變之框架區上。舉例而言，已發現，在某些情況下，有益地突變框架區內之殘基以維持或增強抗體之抗原結合能力(例如，參見頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第 5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
本文所述經改造抗體包括彼等已對VH及/或VL內之框架殘基進行修飾以(例如)改良抗體之性質者。通常，進行該等框架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方式係將一或多個框架殘基「回復突變」成相應種系序列。更特定而言，已經受體細胞突變之抗體可含有與衍生出該抗體之種系序列不同之框架殘基。該等殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生出該抗體之種系序列來鑑別。為使框架區序列返回至其種系構形，可藉由(例如)定點誘變或PCR介導之誘變將體細胞突變「回復突變」成種系序列。亦意欲涵蓋該等「回復突變」抗體。另一類型之框架修飾涉及突變框架區或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基，以去除T細胞表位，藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱作「去免疫化」且進一步詳細闡述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
另一類型之可變區修飾係突變VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基，藉此改良所關注抗體之一或多種結合性質(例如親和力)。可實施定點誘變或PCR介導之誘變以引入突變，且可在如本文所闡述且於實例中提供之活體外或活體內分析中評估對抗體結合之效應或所關注之其他功能性質。較佳引入保守修飾(如上文所論述)。突變可為胺基酸取代、添加或缺失，但較佳係取代。此外，通常改變CDR區內不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基。
因此，亦提供經分離抗GITR單株抗體或其抗原結合部分，其包括包含以下之重鏈可變區：(a)VH CDR1區，其包含選自由SEQ ID NO：20、33、46、62、78、91、106、122、138及342組成之群之胺基酸序列或與SEQ ID NO：20、33、46、62、78、91、106、122、138及342相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；(b)VH CDR2區，其包含選自由SEQ ID NO：21、 34、47、63、79、92、107、123、139及343組成之群之胺基酸序列或與SEQ ID NO：21、34、47、63、79、92、107、123、139及343相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；(c)VH CDR3區，其包含選自由SEQ ID NO：22、35、48、64、80、93、108、124、140及344組成之群之胺基酸序列或與SEQ ID NO：22、35、48、64、80、93、108、124、140及344相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；(d)VL CDR1區，其包含選自由SEQ ID NO：23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345組成之群之胺基酸序列或與SEQ ID NO：23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；(e)VL CDR2區，其包含選自由SEQ ID NO：24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346組成之群之胺基酸序列或與SEQ ID NO：24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；及(f)VL CDR3區，其包含選自由SEQ ID NO：25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347組成之群之胺基酸序列或與SEQ ID NO：25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。
抗體之CDR中之甲硫胺酸殘基會被氧化，引起抗體之潛在化學降解及因此降低功效。因此，亦提供一種抗GITR抗體，其重鏈及/或輕鏈CDR中一或多個甲硫胺酸殘基被不會進行氧化降解之胺基酸殘基置換。在一個實施例中，抗體28F3、18E10、19D3及6G10之CDR中之甲硫胺酸殘基被不會進行氧化降解之胺基酸殘基置換。
類似地，可自抗GITR抗體、具體而言於CDR中去除去醯胺位點。
Fc及經修飾之Fc
本文所述抗GITR可變區可連接(例如，共價連接或稠合)至Fc，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，其可屬任何異型或同種異型，例如對於IgG1：G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z)；對於IgG2：G2m、G2m23(n)；對於IgG3：G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)；且對於K：Km、Km1、Km2、Km3(例如，參見Jefferies等人(2009)mAbs 1：1)。
在某些實施例中，本文所述抗GITR可變區連接至結合至一或多種活化Fc受體(FcγI、FcγIIa或FcγIIIa)之Fc，且藉此刺激ADCC且可引起T細胞耗盡。在某些實施例中，本文所述抗GITR可變區連接至Fc，從而引起耗盡。如實例(實例16及17)中進一步闡述，在若干小鼠腫瘤模型中，小鼠IgG2a及大鼠IgG2b同型(在與小鼠活化FcR之結合中等效於小鼠IgG2a)誘導腫瘤生長之最大抑制。抗GITR mG2a、mG2b及rG2b同型對末梢中Treg群體之效應極小，或相對於誘導腫瘤環境中之顯著Treg耗盡(其與腫瘤生長抑制相關)誘導末梢中Treg群體小的增加。相反，mIgG2a同型引起腫瘤位點處CD8+細胞之百分比增加，而mIgG1及大鼠IgG2b不引起CD8+細胞之百分比增加或僅引起邊際增加。因此，在某些實施例中，本文所述抗GITR可變區連接至人類IgG1或IgG3 Fc，即抗體屬IgG1或IgG3同型。在某些實施例中，抗GITR抗體係耗盡抗體，具體而言，其耗盡處於腫瘤微環境中之Treg細胞(且藉此增強抗腫瘤活性)，但不顯著耗盡處於腫瘤微環境中之Teff細胞並介導抗腫瘤效應，及/或不顯著耗盡在腫瘤外(例如在末梢中)之 Treg及Teff細胞。在某些實施例中，抗GITR抗體屬刺激腫瘤位點處Treg細胞耗盡或消除及Teff細胞之伴隨活化的同型(天然或非天然(例如，包括突變)同型)。在某些實施例中，抗GITR抗體在腫瘤位點處產生升高之Teff對Treg比率，其指示有效力之抗腫瘤活性，且較佳不顯著耗盡在腫瘤外(例如在末梢中)之Treg及Teff細胞。在某些實施例中，抗GITR抗體阻斷Treg之免疫阻抑性活性。在某些實施例中，抗GITR抗體具有無FcR結合或具有降低之FcR結合(例如降低之與活化FcR之結合)的Fc受體。在某些實施例中，抗GITR抗體具有結合至FcRIIb或具有增強之與FcRIIb之結合的Fc，此可提供增強之激動作用。
在某些實施例中，藉由包含選擇、設計或修飾抗體之Fc區以便增強該Fc區與活化Fc受體之結合的方法增強、最佳化或最大化抗GITR抗體增強內源免疫反應之功效。在一個實施例中，抗GITR抗體係TRX-518。
在某些實施例中，本文所述抗GITR可變區連接至較差效應物或大部分較差效應物Fc，例如IgG2或IgG4。
本文所述抗GITR可變區可連接至非天然Fc區(例如較差效應物Fc或具有增強之與一或多種活化Fc受體(FcγI、FcγIIa或FcγIIIa)之結合的Fc)，例如以增強腫瘤環境中Treg耗盡。
通常，本文所述可變區可連接至包含一或多個修飾通常以改變抗體之一或多種功能性質(例如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞細胞毒性)的Fc。此外，本文所述抗體可經化學修飾(例如可將一或多個化學部分附接至該抗體)或經修飾以改變其糖基化，以改變抗體之一或多種功能性質。該等實施例中之每一者進一步詳細闡述於下文中。Fc區中殘基之編號係Kabat之EU索引之編號。
Fc區涵蓋源自免疫球蛋白(較佳人類免疫球蛋白)之恆定區(包括恆定區之片段、類似物、變體、突變體或衍生物)之結構域。適宜免 疫球蛋白包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其他類別，例如IgA、IgD、IgE及IgM。免疫球蛋白之恆定區定義為與免疫球蛋白C-末端區同源之天然或合成產生之多肽，且可單獨或組合包括CH1結構域、鉸鏈、CH2結構域、CH3結構域或CH4結構域。
免疫球蛋白之恆定區負責許多重要抗體功能，包括Fc受體(FcR)結合及補體結合。存在五種主要類別之重鏈恆定區，其分類為IgA、IgG、IgD、IgE、IgM，其各自具有由同型指定之特徵性效應物功能。舉例而言，將IgG分成四個子類，稱作IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
Ig分子與多個類別之細胞受體相互作用。舉例而言，IgG分子與三類對抗體之IgG類別具有特異性之Fcγ受體(FcγR)(即FcγRI、FcγRII及FcγRIII)相互作用。已報導對於IgG與FcγR受體之結合重要的序列位於CH2及CH3結構域中。抗體之血清半衰期受抗體結合至Fc受體(FcR)之能力影響。
在某些實施例中，Fc區係變體Fc區，例如相對於母體Fc序列(例如，隨後經修飾以生成變體之未經修飾之Fc多肽)經修飾(例如，藉由胺基酸取代、缺失及/或插入)的Fc序列，以提供合意之結構特徵及/或生物活性。
舉例而言，可在Fc區中進行修飾以生成如下Fc變體：(a)具有增加或降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，(b)增加或降低補體介導之細胞毒性(CDC)，(c)具有增加或降低之對C1q之親和力及/或(d)相對於母體Fc具有增加或降低之對Fc受體之親和力。該等Fc區變體通常將包含Fc區中之至少一個胺基酸修飾。據信合併胺基酸修飾尤其合意。舉例而言，變體Fc區可包括其中、(例如)本文中鑑別之具體Fc區位置之兩個、三個、四個、五個等取代。
變體Fc區亦可包含序列改變，其中去除參與二硫鍵形成之胺基 酸或其經其他胺基酸置換。該去除可避免與用於產生本文所述抗體之宿主細胞中存在的其他含有半胱胺酸之蛋白質反應。即使在去除半胱胺酸殘基時，單鏈Fc結構域仍可形成非共價保持在一起之二聚體Fc結構域。在其他實施例中，Fc區可經修飾以使得其與所選宿主細胞更相容。舉例而言，可去除典型天然Fc區之N-末端附近之PA序列，其可由大腸桿菌(E.coli)中之消化酶(例如脯胺酸亞胺基肽酶)識別。在其他實施例中，可去除Fc結構域內之一或多個糖基化位點。通常經糖基化之殘基(例如，天冬醯胺)可賦予細胞溶解反應。該等殘基可缺失或經未糖基化殘基(例如，丙胺酸)取代。在其他實施例中，可自Fc區去除參與與補體相互作用之位點(例如C1q結合位點)。舉例而言，可缺失或取代人類IgG1之EKK序列。在某些實施例中，可去除影響與Fc受體之結合之位點，較佳除補救受體結合位點之位點。在其他實施例中，Fc區可經修飾以去除ADCC位點。ADCC位點為業內已知；關於IgG1中之ADCC位點，參見(例如)Molec.Immunol.29(5)：633-9(1992)。變體Fc結構域之具體實例揭示於(例如)WO 97/34631及WO 96/32478中。
在一個實施例中，Fc之鉸鏈區經修飾以改變(例如增加或減少)鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數。此方法進一步闡述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。改變Fc之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數以(例如)有利於輕鏈及重鏈之裝配或增加或降低抗體之穩定性。在一個實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短抗體之生物半衰期。更特定而言，將一或多個胺基酸突變引入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區域中，以使得該抗體具有相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合受損的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合。此方法進一步詳細闡述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在再一些實施例中，藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基 酸殘基來改變Fc區以改變抗體之效應物功能。舉例而言，一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，使得抗體具有改變之對效應物配體之親和力，但保留親代抗體之抗原結合能力。對其親和力改變之效應物配體可係(例如)Fc受體或補體之C1組份。此方法進一步詳細闡述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實例中，一或多個選自胺基酸殘基329、331及322之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，以使抗體具有經改變之C1q結合及/或降低或消除補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細闡述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實例中，改變胺基酸位置231及239內之一或多個胺基酸殘基以藉此改變抗體結合補體之能力。此方法進一步闡述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在再一實例中，可藉由在以下位置處修飾一或多個胺基酸修飾Fc區以增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或增加對Fcγ受體之親和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。實例性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D及332E。實例性變體包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T及267E/268F/324T。用於增強FcyR及補體相互作用之其他修飾包括(但 不限於)取代298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I及396L。該等及其他修飾參閱Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology 20：685-691。
增加與Fcγ受體之結合之Fc修飾包括Fc區之以下胺基酸位置中之任一或多者處之胺基酸修飾：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc區中之殘基之編號係如Kabat(WO00/42072)中之EU索引之編號。
可對Fc進行之其他Fc修飾係彼等用於降低或除去與FcγR及/或補體蛋白之結合，藉此降低或除去Fc介導之效應物功能(例如ADCC、ADCP及CDC)。實例性修飾包括(但不限於)位置234、235、236、237、267、269、325及328處之取代、插入及缺失，其中編號係根據EU索引。實例性取代包括(但不限於)234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L及328R，其中編號係根據EU索引。Fc變體可包含236R/328R。用於降低FcyR及補體相互作用之其他修飾包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331 S、220S、226S、229S、238S、233P及234V、以及藉由突變或酶方式或藉由在不糖基化蛋白之生物體(例如細菌)中產生去除位置297處之糖基化。該等及其他修飾參閱Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology 20：685-691。
視情況，Fc區可包含熟習此項技術者已知之額外及/或替代位置處之非天然胺基酸殘基(例如，參見美國專利第5,624.821號、第 6,277,375號、第6,737,056號、第6,194,551號、第7,317,091號、第8,101,720號；PCT專利公開案WO 00/42072、WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO 05/070963、WO 05/040217、WO 05/092925及WO 06/020114)。
亦可使用增強對抑制性受體FcyRllb之親和力之Fc變體。該等變體可提供具有與FcyRllb+細胞(包括例如B細胞及單核球)相關之免疫調節活性之Fc融合蛋白。在一個實施例中，Fc變體相對於一或多種活化受體提供選擇性增強之對FcyRllb之親和力。用於改變與FcyRllb之結合之修飾包括根據EU索引選自由以下組成之群之位置處之一或多個修飾：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328及332。用於增強FcyRllb親和力之實例性取代包括(但不限於)234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y及332E。實例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W及328Y。用於增強與FcyRllb之結合之其他Fc變體包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E及267E/328F。
Fc區對其配體之親和力及結合性質可藉由業內已知之多種活體外分析方法(基於生物化學或免疫學之分析)來測定，該等方法包括(但不限於)平衡方法(例如，酶聯免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA))或動力學(例如，BIACORE分析)及其他方法，例如間接結合分析、競爭抑制分析、螢光共振能量轉移(FRET)、凝膠電泳及層析(例如，凝膠過濾)。該等及其他方法可在所檢查組份之一或多者上利用標記及/或採用多種檢測方法，其包括(但不限於)發色、螢光、發光或 同位素標記。結合親和力及動力學之詳細說明可參見Paul,W.E.編輯，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其關注抗體-免疫原相互作用。
在某些實施例中，抗體經修飾以延長其生物半衰期。多種方式係可行的。舉例而言，此可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和力來進行。舉例而言，可使以下殘基中之一或多者突變：252、254、256、433、435、436，如美國專利第6,277,375號中所述。具體實例性取代包括以下中之一或多者：T252L、T254S及/或T256F。或者，為延長生物半衰期，抗體可在CH1或CL區內經改變以含有取自IgG之Fc區之CH2結構域之兩個環的補救受體結合表位，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述。增加與FcRn之結合及/或改良藥物動力學性質之其他實例性變體包括位置259、308、428及434處之取代，包括(例如)259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y及434M。增加與FcRn之Fc結合之其他變體包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，2004,J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216,Hinton等人2006 Journal of Immunology 176：346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、31 1A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal of Biological Chemistry,2001,276(9)：6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、31 1 S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等人Journal of Immunology,2002,169：5171-5180,Dall'Acqua等人，2006,Journal of Biological Chemistry 281：23514-23524)。用於調節FcRn結合之其他修飾闡述於Yeung等人，2010,J Immunol,182：7663-7671中。在某些實施例中，可使用具有特定生物特徵之雜合IgG同型。舉 例而言，可藉由用兩種同型不同之位置處之IgG3的胺基酸取代CH2及/或CH3區中之IgG1位置構築IgG1/IgG3雜合變體。因此，可構築雜合變體IgG抗體，其包含一或多個取代，例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R及436F。在本文所述其他實施例中，可藉由用兩種同型不同之位置處之IgG1的胺基酸取代CH2及/或CH3區中之IgG2位置構築IgG1/IgG2雜合變體。因此，可構築雜合變體IgG抗體，其包含一或多個取代，例如以下胺基酸取代中之一或多者：233E、234L、235L、-236G(係指在位置236處插入甘胺酸)及327A。
此外，已定位人類IgG1上對FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點且已闡述具有改良結合之變體(參加Shields,R.L.等人(2001)J.Biol.Chem. 276：6591-6604)。顯示位置256、290、298、333、334及339處之特異性突變以改良與FcγRIII之結合。另外，顯示以下組合突變體以改良FcγRIII結合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/E333A/K334A，已顯示其展現增強之FcγRIIIa結合及ADCC活性(Shields等人，2001)。已鑑別具有強烈增強之與FcγRIIIa之結合的其他IgG1變體，包括具有S239D/I332E及S239D/I332E/A330L突變之變體，其在食蟹猴中顯示對FcγRIIIa之親和力最大增加、FcγRIIb結合減少及強的細胞毒性活性(Lazar等人，2006)。向抗體(例如阿倫單抗(alemtuzumab)(CD52特異性)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HER2/neu特異性)、利妥昔單抗(rituximab)(CD20特異性)及西妥昔單抗(cetuximab)(EGFR特異性))中引入三重突變轉譯成大大增強之活體外ADCC活性，且S239D/I332E變體顯示在猴中增強之缺失B細胞之能力(Lazar等人，2006)。另外，已鑑別含有L235V、F243L、R292P、Y300L及P396L突變之IgG1突變體，其在B細胞惡性病及乳癌之模型中在表現人類FcγRIIIa之轉基因小鼠中展現 增強之與FcγRIIIa之結合及同時增強之ADCC活性(Stavenhagen等人，2007；Nordstrom等人，2011)。可使用之其他Fc突變體包括：S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L及M428L/N434S。
在某些實施例中，選擇具有降低之與FcγR之結合之Fc。具有降低之FcγR結合之實例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下三個胺基酸取代：L234A、L235E及G237A。
在某些實施例中，選擇具有降低之補體結合之Fc。具有降低之補體結合之實例性Fc(例如IgG1 Fc)具有以下兩個胺基酸取代：A330S及P331S。
在某些實施例中，選擇基本上較差效應物功能之Fc，即，其具有降低之與FcγR之結合及降低之補體結合。較差效應物之實例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下五個突變：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。包含該等突變之實例性重鏈闡述於表11中。
在使用IgG4恆定結構域時，其通常較佳包括取代S228P，該取代模擬IgG1中之鉸鏈序列且藉此穩定IgG4分子。
在另一實施例中，抗體之糖基化經修飾。舉例而言，可製備無糖基化抗體(即抗體缺少糖基化)。可改變糖基化以(例如)增加抗體對抗原之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來完成。舉例而言，可製備一或多個胺基酸取代以消除一或多個可變區框架糖基化位點，以藉此消除該位點處之糖基化。該無糖基化可增加抗體對抗原之親和力。此方法進一步詳細闡述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
可藉由將N297殘基突變成另一殘基(例如N297A)及/或藉由突變毗鄰胺基酸(例如298)以藉此降低上N297之糖基化來防止N297上恆定區之糖基化。
另外或或者，可製備具有經改變糖基化類型的抗體，例如具有降低量的岩藻糖基殘基的低岩藻糖基化抗體或具有增加的二等分GlcNac結構的抗體。已展示，該等經改變糖基化模式增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)在具有經改變之糖基化機構之宿主細胞中表現抗體來完成。具有經改變糖基化機構之細胞已於業內有所闡述且可用作其中表現本文所述重組抗體之宿主細胞，以藉此產生具有經改變糖基化之抗體。舉例而言，Hanai等人之EP 1,176,195闡述具有編碼岩藻糖基轉移酶之功能被破壞之FUT8基因的細胞系，使得在該細胞系中表現之抗體展現低岩藻糖基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835闡述將岩藻糖附接至Asn(297)連接之碳水化合物之能力降低的變體CHO細胞系Lec13細胞，亦導致在該宿主細胞中表現之抗體的低岩藻糖基化(亦參見Shields,R.L.等人，(2002)J.Biol.Chem. 277：26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342闡述經改造以表現修飾糖蛋白之糖基轉移酶(例如，β(1,4)-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII))的細胞系，使得在經改造細胞系中表現之抗體展現增加之二等分GlcNac結構，從而增強抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人，(1999)Nat.Biotech. 17：176-180)。
本文所述抗體之另一修飾係聚乙二醇化。抗體可經聚乙二醇化以(例如)延長抗體之生物(例如血清)半衰期。為聚乙二醇化抗體，通常在一或多個PEG基團附接至抗體或抗體片段之條件下使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(例如PEG之反應性酯或醛衍生物)反應。較佳地，聚乙二醇化係藉由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來實施。如本文所用術語「聚乙二醇」意欲涵蓋PEG之已用於衍生其他蛋白質之任一形式，例如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施例中，欲聚乙二醇化之抗體係無糖基化抗體。聚乙二醇化蛋白質之方法 為業內已知且可適用於本文所述抗體。參見(例如)Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
VIII.抗體物理性質
本文所述抗體可在輕鏈或重鏈可變區中含有一或多個糖基化位點。該等糖基化位點由於改變之抗原結合可增加抗體之免疫原性或改變抗體之pK(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala及Morrison(2004)J.Immunol 172：5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316：452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列之基序處發生。在一些情況下，較佳具有不含可變區糖基化之抗GITR抗體。此可藉由選擇可變區中不含糖基化基序之抗體或藉由使糖基化區內之殘基突變來完成。
在某些實施例中，本文所述抗體不含天冬醯胺異構現象位點。天冬醯胺之去醯胺可在N-G或D-G序列上發生且引起產生向多肽鏈中引入扭結且降低其穩定性(異天冬胺酸效應)的異天冬胺酸殘基。
每一抗體將具有獨特等電點(pI)，其通常在介於6與9.5之間之pH範圍內。IgG1抗體之pI通常通常在7-9.5之pH範圍內且IgG4抗體之pI通常在6-8之pH範圍內。pI在正常範圍外之推測抗體可在活體內條件下具有一定展開及不穩定。因此，較佳具有含有在正常範圍內之pI值之抗GITR抗體。此可藉由選擇pI在正常範圍內之抗體或使帶電表面殘基突變來達成。
每一抗體將具有特徵性熔融溫度，其中較高熔融溫度指示活體內較大總體穩定性(Krishnamurthy R及Manning M C(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。通常，較佳地，TM1(初始展開之溫度)大於60℃、較佳大於65℃、甚至更佳大於70℃。抗體之熔點可使用差示 掃描量熱法(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68：47-52)或圓二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)來量測。
在較佳實施例中，選擇不快速降解之抗體。抗體之降解可使用毛細管電泳(CE)及MALDI-MS(Alexander A J及Hughes D E(1995)Anal Chem 67：3626-32)來量測。
在另一較佳實施例中，選擇具有最小聚集效應之抗體，聚集效應可導致觸發不期望免疫反應及/或改變或不利之藥物動力學性質。通常，抗體可接受25%或更小、較佳20%或更小、甚至更佳15%或更小、甚至更佳10%或更小且甚至更佳5%或更小之聚集度。聚集度可藉由若干技術(包括尺寸排除管柱(SEC)、高效液相層析(HPLC)及光散射)來量測。
IX.改造抗體之方法
如上文所論述，可藉由修飾VH及/或VL序列或附接至其之恆定區使用具有本文揭示之VH及VL序列之抗GITR抗體以產生新抗GITR抗體。因此，在本文所述另一態樣中，使用本文所述抗GITR抗體(例如28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10)之結構特徵以產生結構上有關之抗GITR抗體，其保留本文所述抗體之至少一種功能性質，例如與人類GITR及食蟹猴GITR之結合。舉例而言，可將28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10或其突變之一或多個CDR區與已知框架區及/或其他CDR以重組方式組合以產生額外經重組改造之本文所述抗GITR抗體，如上文所論述。其他類型之修飾包括先前部分中所闡述之彼等。用於改造方法之起始材料係本文所提供VH及/或VL序列中之一或多者或其一或多個CDR區。為產生經改造抗體，實際上無需製備(即表現為蛋白質)具有本文所提供VH及/或VL序列中之一或多者或其一或多個CDR區 之抗體。而是，使用序列中所含有之資訊作為起始材料以產生源自初始序列之「第二代」序列，且然後製備「第二代」序列並表現為蛋白質。
因此，本文提供用於製備抗GITR抗體之方法，其包含：(a)提供：(i)重鏈可變區抗體序列，其包含選自由SEQ ID NO：20、33、46、62、78、91、106、122、138及342組成之群之CDR1序列、選自由SEQ ID NO：21、34、47、63、79、92、107、123、139及343組成之群之CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：22、35、48、64、80、93、108、124、140及344組成之群之CDR3序列；及(ii)輕鏈可變區抗體序列，其包含選自由SEQ ID NO：23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345組成之群之CDR1序列、選自由SEQ ID NO：24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346組成之群之CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347組成之群之CDR3序列；(b)改變重鏈可變區抗體序列及/或輕鏈可變區抗體序列內之至少一個胺基酸殘基以產生至少一個經改變之抗體序列；及(c)使經改變之抗體序列表現為蛋白質。
可使用標準分子生物學技術來製備並表現經改變抗體序列。
較佳地，由經改變之抗體序列編碼之抗體係保留本文所述抗GITR抗體之功能性質中之一者、一些或全部者，該等功能性質包括：(1)以如(例如)藉由Biacore量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類GITR；(2)以如(例如)藉由Scatchard量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之KD結合至膜結合之人類GITR； (3)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類GITR；(4)以如(例如)藉由FACS量測之(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴GITR，例如結合至膜結合之食蟹猴GITR；(5)(例如)在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3濃度存在下)誘導或增強T細胞活化，如藉由(i)表現GITR之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖所證明；(6)誘導或增強T細胞活化而無需多價交聯；(7)以如藉由FACS量測之(例如)1μg/mL或更小之EC50抑制GITR配體與3A9-hGITR細胞上之GITR的結合；(8)至多部分抑制GITR配體與活化T細胞上之GITR的結合；(9)結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)上之構象表位，例如胺基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)內之不連續表位；(10)結合至O-連接及N-連接糖基化及未糖基化人類GITR；(11)在不與Fc受體結合下具有激動劑活性，但其中與Fc受體之結合進一步增強激動劑活性；及(12)在任一方向或兩個方向上與28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10競爭結合至人類GITR。
經改變抗體可展現如上文(1)至(12)所述之功能性質中之一或多者、兩者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者、六者或更多者、七者或更多者、八者或更多者、九者或更多者、十者或更多者、十一者或全部。經改變抗體之功能特性可使用業內可獲得及/或本文所闡述之標準分析(例如實例中所闡釋之彼等(例如ELISA、 FACS))來評價。
在改造本文所述抗體之方法之某些實施例中，可沿抗GITR抗體編碼序列之全部或部分隨機或選擇性引入突變且可針對如本文所述結合活性及/或其他功能性質篩選所得經修飾抗GITR抗體。突變方法已於業內有所闡述。舉例而言，Short之PCT公開案WO 02/092780闡述使用飽和誘變、合成性接合裝配或其組合產生及篩選抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679闡述使用計算篩選方法以最佳化抗體之生理化學性質的方法。
X.核酸分子
本文所述另一態樣涉及編碼本文所述抗體之核酸分子。該等核酸可存在於全細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純之形式存在。當藉由標準技術實施純化以清除其他細胞組份或其他污染物(例如其他細胞核酸(例如其他染色體DNA，例如連接至自然界中經分離DNA之染色體DNA)或蛋白質)時，核酸係「經分離」或「使得實質上純的」，該等標準技術包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶、管柱層析、限制酶、瓊脂糖凝膠電泳及業內熟知之其他方法。參見F.Ausubel等人編輯，(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本文所述核酸可為(例如)DNA或RNA且可含有或不含有內含子序列。在某些實施例中，核酸係cDNA分子。
本文所述核酸可使用標準分子生物學技術來獲得。對於由雜交瘤(例如自攜帶人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠製備之雜交瘤，如下文進一步闡述)表現之抗體，編碼藉由雜交瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈的cDNA可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術來獲得。對於自免疫球蛋白基因文庫獲得(例如使用噬菌體展示技術)之抗體，可自文庫回收編碼抗體之核酸。
本文所述之較佳核酸分子係彼等編碼28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10單株抗體之VH及VL序列者。編碼28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10之VH序列之實例性DNA序列分別闡述於SEQ ID NO：147、154、158、162、168、172、176、182、186及353中。編碼28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10之VL序列之實例性DNA序列分別闡述於SEQ ID NO：148、155、163、164、169、173、177、178、183、187、188及354中。編碼28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10之重鏈序列之實例性DNA序列分別闡述於SEQ ID NO：149、156、160、165、170、174、179、184、189及355中。編碼28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10之輕鏈序列之實例性DNA序列分別闡述於SEQ ID NO：150、157、161、166、167、171、175、181、180、185、190、191及356中。
編碼28F3.IgG1及28F3.IgG1.1(相同可變區)抗體之成熟VH及VL結構域之實例性核酸分別闡述為SEQ ID NO：147及148。編碼28F3.IgG1及28F3.IgG1.1抗體之成熟重鏈之實例性核酸分別闡述為SEQ ID NO：151及152，且編碼28F3.IgG1及28F3.IgG1.1抗體之成熟輕鏈之實例性核酸闡述為SEQ ID NO：153。
具有信號肽之28F3.IgG1及28F3.IgG1.1(相同可變區)抗體之實例性VH及VL結構域分別闡述為SEQ ID NO：357及358，且編碼該等結構域之核苷酸序列分別闡述為SEQ ID NO：359及360。
具有信號肽之28F3.IgG1及28F3.IgG1.1抗體之實例性重鏈分別闡述為SEQ ID NO：361及362，且編碼該等重鏈之實例性核苷酸序列分 別闡述為SEQ ID NO：363及364。具有信號肽之28F3.IgG1及28F3.IgG1.1抗體之實例性輕鏈闡述為SEQ ID NO：365，且編碼其之實例性核苷酸序列闡述為SEQ ID NO：366。
用於製備28F3.IgG1之方法可包含使重鏈及輕鏈在包含編碼具有信號肽之重鏈及輕鏈核苷酸序列(例如分別SEQ ID NO：363及365)的細胞系中表現。用於製備28F3.IgG1.1之方法可包含使重鏈及輕鏈在包含編碼具有信號肽之重鏈及輕鏈之核苷酸序列(例如分別SEQ ID NO：364及366)的細胞系中表現。本文中涵蓋包含該等核苷酸序列之宿主細胞。
一旦獲得編碼VH及VL區段之DNA片段，即可藉由標準重組DNA技術進一步操縱該等DNA片段，以(例如)將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質之另一DNA片段(例如抗體恆定區或撓性連接體)。如本上下文中使用之術語「可操作地連接」欲指兩個DNA片段接合，使得由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持在框架內。
可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及/或CH3)之另一DNA分子，將編碼VH區之經分離DNA轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如，參見Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，例如IgG1區。對於Fab片段重鏈基因，編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另 一DNA分子，將編碼VL區之經分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如，參見Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。
為產生scFv基因，將編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接至編碼撓性連接體(例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3)之另一片段，使得VH及VL序列可表現為鄰接單鏈蛋白，其中VL及VH區藉由撓性連接體接合(例如，參見Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-554)。
本文亦提供編碼與28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10單株抗體之彼等序列同源之VH及VL序列的核酸分子。實例性核酸分子編碼與編碼28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10單株抗體之VH及VL序列之核酸分子至少70%一致(例如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致)的VH及VL序列。本文亦提供具有保守取代(即，在核酸分子轉譯時不改變所得胺基酸序列之取代)之核酸分子，例如用於密碼子最佳化。
XI.抗體產生
本文所述單株抗體可使用多種已知技術(例如由Kohler及Milstein,Nature 256：495(1975)闡述之標準體細胞雜交技術)來產生。儘管體細胞雜交程序較佳，但原則上亦可採用產生單株抗體之其他技術，例如B淋巴球之病毒或致癌轉變、使用人類抗體基因文庫之噬菌體展示技 術。
製備雜交瘤之較佳動物系統係鼠類系統。小鼠中之雜交瘤產生係已充分建立之程序。業內已知分離融合用免疫脾細胞之免疫方案及技術。亦已知融合配偶體(例如，鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序。
本文所述嵌合或人類化抗體可基於如上文所述製備之鼠類單株抗體之序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可自所關注鼠類雜交瘤獲得並使用標準分子生物學技術加以改造以含有非鼠類(例如，人類)免疫球蛋白序列。舉例而言，為產生嵌合抗體，可使用業內已知方法(例如，參見頒予Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)將鼠類可變區連接至人類恆定區。為產生人類化抗體，可使用業內已知方法(例如，參見頒予Winter之美國專利第5,225,539號及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)將鼠類CDR區插入人類框架中。
在一個實施例中，本文所述抗體係人類單株抗體。可使用攜帶人類免疫系統而非小鼠系統之部分的轉基因或轉染色體小鼠來產生針對GITR之該等人類單株抗體。該等轉基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠之小鼠，且在本文中統稱為「人類Ig小鼠」。
HuMAb mouse®(Medarex公司)含有編碼非重排人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列以及使內源性μ及κ鏈基因座不活化之靶突變的人類免疫球蛋白基因微小基因座(例如，參見Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠展現降低之小鼠IgM或κ表現，且因應免疫，所引入人類重鏈及輕鏈轉基因經歷類別切換及體細胞突變以生成高親和力人類IgGκ單株(Lonberg,N.等人(1994)，上文文獻；參閱Lonberg,N.(1994)Handbook of Experinental Pharmacology 113：49-101；Lonberg,N.及Huszar,D.(1995)Intern. Rev.Immunol. 13：65-93及Harding,F.及Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci. 764：536-546)。HuMab小鼠之製備及使用及由該等小鼠攜帶之基因體修飾進一步闡述於以下中：Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J. 12：821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol. 152：2912-2920；Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6：579-591；及Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有參考文獻之內容係全文以引用方式明確併入本文中。進一步參見所有皆頒予Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號；頒予Surani等人之美國專利第5,545,807號；所有皆頒予Lonberg及Kay之PCT公開案第WO 92/03918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97/13852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號；及頒予Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
在某些實施例中，本文所述抗體係使用在轉基因及轉染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠(例如攜帶人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠)產生。該等小鼠(在本文中稱作「KM小鼠」)詳細闡述於頒予Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
此外，業內可獲得表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉基因動物系統且可使用其來產生本文所述抗GITR抗體。舉例而言，可使用稱作Xenomouse(Abgenix公司)之替代性轉基因系統；該等小鼠闡述於(例如)頒予Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號、第6,075,181 號、第6,114,598號、第6,150,584號及第6,162,963號中。
此外，業內可獲得表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物系統且可使用其來產生本文所述抗GITR抗體。舉例而言，可使用攜帶人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體之小鼠，稱作「TC小鼠」；該等小鼠闡述於Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，攜帶人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛已在業內加以闡述(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)且可使用其來產生本文所述抗GITR抗體。
業內闡述之用於產生人類抗體(例如人類抗GITR抗體)之額外小鼠系統包括(i)VelocImmune®小鼠(Regeneron Pharmaceuticals公司)，其中內源性小鼠重鏈及輕鏈可變區已經由同源重組經人類重鏈及輕鏈可變區置換，可操作地連接至內源小鼠恆定區，使得在小鼠中產生嵌合抗體(人類V/小鼠C)，且隨後使用標準重組DNA技術轉化成完全人類抗體；及(ii)MeMo®小鼠(Merus Biopharmaceuticals公司)，其中小鼠含有非重排人類重鏈可變區而非單一重排人類常見輕鏈可變區。該等小鼠及其產生抗體之用途闡述於(例如)WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861及US 2012/0073004中。
本文所述人類單株抗體亦可使用用於篩選人類免疫球蛋白基因文庫之噬菌體展示方法來製備。用於分離人類抗體之該等噬菌體展示方法已於業內確立。參見(例如)：頒予Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698號；頒予Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；頒予McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；及頒予Griffiths等人之美國專利第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第 6,582,915號及第6,593,081號。
本文所述人類單株抗體亦可使用SCID小鼠來製備，其中人類免疫細胞已經重構以使得可在實施免疫後生成人類抗體反應。此等小鼠闡述於(例如)頒予Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
免疫
為生成GITR之完全人類抗體，可利用GITR抗原及/或表現GITR或其片段之細胞之純化或富集製劑對含有人類免疫球蛋白基因之轉基因或轉染色體小鼠(例如，HCo12、HCo7或KM小鼠)實施免疫，如針對其他抗原由(例如)Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851及WO 98/24884所述。或者，可利用編碼人類GITR或其片段之DNA對小鼠實施免疫。較佳地，小鼠在首次輸注時為6-16週齡。舉例而言，可使用重組GITR抗原之純化或富集製劑(5-50μg)對HuMAb小鼠實施腹膜內免疫。倘若使用GITR抗原之純化或富集製劑之免疫不產生抗體，亦可利用表現GITR之細胞(例如細胞系)對小鼠實施免疫以促進免疫反應。實例性細胞系包括過表現GITR之穩定CHO及Raji細胞系。
利用各種抗原之累積經驗已顯示，在最初用Ribi之佐劑中之抗原經腹膜內(IP)或皮下(SC)實施免疫、之後用Ribi之佐劑中之抗原每隔一週IP/SC免疫(直至總共10次)時，HuMAb轉基因小鼠反應最佳。可在免疫方案過程中利用血漿試樣監測免疫反應，該等血漿試樣係藉由眶後取血獲得。藉由ELISA及FACS(如下文所述)篩選血漿，且可使用具有抗GITR人類免疫球蛋白之足夠效價之小鼠進行融合。可在處死及去除脾及淋巴結之前3天將小鼠用抗原靜脈內加強免疫。預計對於每一免疫可需要實施2-3次融合。通常對於每一抗原對介於6隻與24隻之間之小鼠實施免疫。通常，使用HCo7、HCo12及KM菌株。另 外，可將HCo7及HCo12轉基因一起配種成具有兩種不同人類重鏈轉基因(HCo7/HCo12)之單一小鼠。
產生GITR之單株抗體之雜交瘤的生成
為生成產生本文所述人類單株抗體之雜交瘤，可自免疫小鼠分離脾細胞及/或淋巴結細胞並融合至適當永生細胞系，例如小鼠骨髓瘤細胞系。所得雜交瘤可經篩選用於產生抗原特異性抗體。舉例而言，使用50% PEG將來自經免疫小鼠之脾淋巴球之單細胞懸浮液融合至Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1581)。將細胞以約2×105平鋪於平底微量滴定板中，之後在含有10%胎牛純系血清、18%「653」條件化培養基、5%奧瑞金(origen，IGEN)、4mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50單位/ml青黴素(penicillin)、50mg/ml鏈黴素(streptomycin)、50mg/ml慶大黴素(gentamycin)及1×HAT(Sigma)之選擇性培養基中培育兩週。約兩週後，可在HAT更換為HT之培養基中培養細胞。然後可藉由ELISA針對人類單株IgM及IgG抗體篩選個別孔。一旦出現雜交瘤過度生長，通常即可在10-14天後觀察培養基。可將分泌抗體之雜交瘤再平鋪，再次篩選，且若對人類IgG仍呈陽性，則可藉由限制性稀釋將單株抗體亞選殖至少兩次。然後可在活體外培養穩定的亞純系以在組織培養基中產生少量抗體用於表徵。
為純化人類單株抗體，可使所選雜交瘤在兩升旋轉燒瓶中生長用於單株抗體純化。可將上清液過濾並濃縮，然後使用蛋白質A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N.J.)進行親和層析。可藉由凝膠電泳及高效液相層析檢查所溶析之IgG以確保純度。可將緩衝溶液更換為PBS，且可使用1.43消光係數藉由OD280來測定濃度。可將單株抗體等分並儲存於-80℃下。
產生GITR之單株抗體之轉染瘤之生成
抗體可在宿主細胞轉染瘤中使用(例如)如業內所熟知之重組DNA技術及基因轉染方法之組合產生(Morrison,S.(1985)Science 229：1202)。
舉例而言，為表現抗體或其抗體片段，可藉由標準分子生物學技術(例如使用表現所關注抗體之雜交瘤之PCR擴增或cDNA選殖)獲得編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA，且可將DNA插入表現載體中，使得該等基因可操作地連接至轉錄及轉譯控制序列。在此背景下，術語「可操作地連接」欲指使抗體基因接合至載體中，使得該載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控抗體基因之轉錄及轉譯之預期功能。表現載體及表現控制序列經選擇與所用表現宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入單獨載體中，或將兩種基因插入同一表現載體中。藉由標準方法(例如將抗體基因片段上之互補限制位點與載體接合，或若不存在限制位點，則利用鈍端接合)將抗體基因插入表現載體中。可使用本文所述抗體之輕鏈及重鏈可變區藉由將其插入已編碼期望同型之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中來產生任何抗體同型之全長抗體基因，使得VH區段可操作地連接至載體內之CH區段，且使VL區段可操作地連接至載體內之CL區段。
另外或或者，重組表現載體可編碼有利於自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。可將抗體鏈基因選殖至載體中，使得信號肽在框架內連接至抗體鏈基因之胺基末端。信號肽可係免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白之信號肽)。
在實例性實施例中，可使用來自人類抗體重鏈及輕鏈之以下信號肽：MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO：315)；MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO：321)；MEFGLNWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO：327)；MEFGLSWIFLAAILKGVQC(SEQ ID NO：329)； MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO：333)；MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO：323)；MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：325)；MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：317)；MRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO：319)；及METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：331)。
可利用各別信號序列表現抗GITR抗體之重鏈及輕鏈，該信號序列連接至選殖該等抗體之雜交瘤中之每一鏈。下文係如選殖抗GITR抗體之雜交瘤中存在之各種抗GITR抗體的信號序列，該等信號序列可用於表現同一抗體或另一抗體： 28F3 VH信號序列： MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO：315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO：316)
28F3 VL信號序列： MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGAT(SEQ ID NO：318)
18E10 VH信號序列： MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO：315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO：316)
18H10 VL信號序列： MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO：317)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGAT(SEQ ID NO：318)
19D3 VH信號序列： MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO：315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO：316)
19D3 VL信號序列： MRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO：319)
ATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO：320)
3C3 VH信號序列： MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO：321)
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(SEQ ID NO：322)
3C3 VL1信號序列： MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO：323)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO：324)
3C3 VL2信號序列： MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：325)
ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ ID NO：326)
8A6 VH信號序列： MEFGLNWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO：327)
ATGGAGTTTGGGCTGAACTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO：328)
8A6 VL信號序列： MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO：318)
9G7 VH信號序列： MEFGLSWIFLAAILKGVQC(SEQ ID NO：329)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGATTTTCCTTGCTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO：330)
9G7 VL1及VL2信號序列： METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：331)
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ ID NO：332)
14E3 VH信號序列： MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO：333)
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(SEQ ID NO：334)
14E3 VL信號序列： MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO：323)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO：324)
19H8VH信號序列： MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO：315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO：316)
19H8 VL1信號序列： MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO：318)
19H8 VL2信號序列： MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：325)
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ ID NO：326)
6G10 VH信號序列： MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO：315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO：316)
6G10 VL信號序列： MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO：318)
信號序列MRAWIFFLLCLAGRALA(SEQ ID NO：367)可用於表現重鏈及輕鏈。
重鏈及輕鏈或其部分(例如彼等提供於表11中)可連接至本文提供之信號序列。舉例而言，包含(例如)SEQ ID NO：13、15、17或18之28F3重鏈或其可變區可連接或稠合至包含MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO：315)或MRAWIFFLLCLAGRALA(SEQ ID NO：367)或由其組成之信號肽。(例如)包含SEQ ID NO：14、16或19之28F3輕鏈或其可變區可連接或稠合至包含MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：317)或MRAWIFFLLCLAGRALA(SEQ ID NO：367)或由其組成之信號肽。
除抗體鏈基因外，重組表現載體可攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中之表現之調控序列。術語「調控序列」意欲包括控制抗體鏈基因轉錄或轉譯之啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如，聚腺苷酸化信號)。該等調控序列闡述於(例如)Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。彼等熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計(包括調控序列之選擇)可端視諸如欲轉化之宿主細胞之選擇、期望蛋白質之表現程度等因素而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳調控序列包括在哺乳動物細胞中引導較高蛋白質表現程度之病毒元件，例如源自以下各項之啟動子及/或增強子：巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒。或者，可使用非病毒調控序列，例如泛素啟動子或β-球蛋白啟動子。此外，調控元件係由來自不同來源(例如SRα啟動子系統)之序列構成，該SRα啟動子系統含有來自SV40早期啟動子之序列及人類T細胞1型白血病病毒之長末端重複(Takebe,Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol. 8：466-472)。
除抗體鏈基因及調控序列外，重組表現載體亦可攜帶額外序列，例如調控載體在宿主細胞中複製之序列(例如複製起點)及可選標記物基因。可選標記物基因有利於選擇其中已引入載體之宿主細胞(例如，參見所有皆由Axel等人之美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。舉例而言，通常可選標記物基因賦予已引入載體之宿主細胞對藥物(例如G418、潮黴素(hygromycin)或胺甲喋呤)之抗性。較佳可選標記物基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(針對dhfr-宿主細胞用於胺甲喋呤選擇/擴增)及neo基因(針對G418選擇)。
對於輕鏈及重鏈之表現，藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於將外源性DNA引入原核或真核宿主細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及諸如此類。儘管理論上可在原核或真核宿主細胞中表現本文所述抗體，但在真核細胞(且最佳哺乳動物 宿主細胞)中表現抗體最佳，此乃因此等真核細胞且具體而言哺乳動物細胞較原核細胞更有可能裝配並分泌經適當摺疊且具有免疫活性之抗體。已報導抗體基因之原核表現對高產率從之活性抗體之產生無效(Boss,M.A.及Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
用於表現本文所述重組抗體之較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(包括dhfr-CHO細胞，闡述於Urlaub及Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中，與DHFR可選標記物一起使用，例如如R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。具體而言，對於與NSO骨髓瘤細胞之使用，另一較佳表現系統係WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中揭示之GS基因表現系統。在將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，抗體係藉由將宿主細胞培養足以容許抗體在宿主細胞中表現或更佳使抗體分泌至生長宿主細胞之培養基中的時間段來產生。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。
XII.分析
可藉由(例如)標準ELISA針對與GITR之結合測試本文所述抗體。簡言之，將微量滴定板用PBS中之1-2μg/ml之純化GITR塗佈，且隨後用PBS中之5%牛血清白蛋白封阻。將抗體之稀釋物(例如，來自GITR免疫之小鼠之血漿之稀釋物)添加至每一孔中並於37℃下培育1-2小時。將板用PBS/Tween洗滌且隨後於37℃下與偶聯至辣根過氧化酶(HRP)之二級試劑(例如，對於人類抗體，山羊-抗人類IgG Fc特異性多株試劑)一起培育1小時。在洗滌後，將板用ABTS受質(Moss公司，產品：ABTS-1000)顯影並藉由分光光度計於OD 415-495下進行分析。隨後藉由流式細胞術針對與表現人類GITR之細胞系、而非不表現GITR之對照細胞系之結合進一步篩選來自經免疫小鼠之血清。簡 言之，藉由將表現GITR之CHO細胞與抗GITR抗體以1：20稀釋一起培育來評價抗GITR抗體之結合。洗滌細胞並利用PE標記之抗人類IgG Ab檢測結合。使用FACScan流式細胞術(Becton Dickinson,San Jose,CA)實施流式細胞分析。較佳地，產生最高效價之小鼠將用於融合。
如上文所述ELISA分析可用於篩選抗體且因此雜交瘤，該等雜交瘤產生顯示與GITR免疫原之陽性反應性之抗體。隨後可亞選殖並進一步表徵產生較佳以高親和力結合至GITR之抗體的雜交瘤。隨後可選擇來自每一雜交瘤之一個純系(其保留母體細胞之反應性(藉由ELISA))用於製備細胞庫並用於抗體純化。
為純化抗GITR抗體，可使所選雜交瘤在兩升旋轉燒瓶中生長用於單株抗體純化。可將上清液過濾並濃縮，之後使用蛋白質A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,NJ)進行親和層析。可藉由凝膠電泳及高效液相層析檢查所溶析之IgG以確保純度。可將緩衝溶液更換為PBS，且可使用1.43消光係數藉由OD280來測定濃度。可將單株抗體等分並儲存於-80℃下。
為確定所選抗GITR單株抗體是否結合至獨特表位，可使用市售試劑(Pierce,Rockford,IL)生物素化每一抗體。可利用鏈黴抗生物素蛋白標記之探針檢測生物素化MAb結合。可使用如上文所述GITR塗佈之ELISA板實施使用未經標記之單株抗體及生物素化單株抗體之競爭研究。
為測定純化抗體之同型，可使用對特定同型之抗體具有特異性之試劑實施同型ELISA。舉例而言，為測定人類單株抗體之同型，可於4℃下將微量滴定板之孔用1μg/ml抗人類免疫球蛋白塗佈過夜。在用1% BSA封阻後，於環境溫度下使板與1μg/ml或更少測試單株抗體或純化同型對照反應1至2小時。隨後可使孔與人類IgG1或人類IgM特異性鹼性磷酸酶偶聯之探針反應。如上文所述使板顯影並加以分析。
為測試單株抗體與表現GITR之活細胞之結合，可使用流式細胞術，如實例中所述。簡言之，將表現膜結合之GITR之細胞系(在標準生長條件下生長)與含有0.1% BSA之PBS中之不同濃度之單株抗體於4℃下混合1小時。在洗滌後，在與一級抗體染色相同之條件下使細胞與螢光黃標記之抗IgG抗體反應。可藉由FACScan儀器使用光側向散射性質分析試樣以導通單一細胞且測定經標記抗體之結合。可使用使用螢光顯微鏡之替代分析(除流式細胞術分析外或代替流式細胞術分析)。可如上文所述精確染色細胞並藉由螢光顯微鏡檢查。此方法容許可視化個別細胞，但端視抗原之密度而定可具有減低之靈敏性。
可藉由西方墨點法針對與GITR抗原之反應性進一步測試抗GITR抗體。簡言之，可自表現GITR之細胞製備細胞萃取物且使其經受十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。在電泳後，將分離抗原轉移至硝基纖維素膜，用20%小鼠血清封阻，並用欲測試之單株抗體探測。可使用抗IgG鹼性磷酸酶檢測IgG結合並用BCIP/NBT受質片(Sigma Chem.公司St.Louis,MO)使其顯影。
用於分析各種抗GITR抗體之結合親和力、交叉反應性及結合動力學之方法包括業內已知之標準分析，例如使用BiacoreTM 2000 SPR儀器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)之BiacoreTM表面電漿共振(SPR)分析。
在一個實施例中，抗體特異性結合至人類GITR之細胞外區。抗體可特異性結合至GITR之細胞外結構域內之特定結構域(例如，功能結構域)。在具體實施例中，抗體特異性結合至GITR-L結合之GITR上之位點。在某些實施例中，抗體特異性結合至人類GITR之細胞外區及食蟹猴GITR之細胞外區。較佳地，抗體以高親和力結合至人類GITR。
XIII.免疫偶聯物、抗體衍生物及診斷
本文所述抗體可用於診斷目的，包括試樣測試及活體內成像，且出於此目的，抗體(或其結合片段)可偶聯至適當可檢測之試劑，以形成免疫偶聯物。出於診斷目的，適當試劑係可檢測之標記，其包括用於全身成像之放射性同位素、及用於試樣測試之放射性同位素、酶、螢光標記及其他適宜抗體標記。
可檢測標記可為活體外診斷領域中當前所用之各種類型中之任一者，包括包括金屬溶膠(例如膠狀金)之顆粒標記、提供有(例如)N2S2、N3S或N4類型之肽螯合劑之同位素(例如I125或Tc99)、發色團(包括螢光標記物、發光標記物、磷光標記物及諸如此類)、以及將給定受質轉化成可檢測標記物之酶標記及在藉由(例如)聚合酶鏈式反應擴增後顯示之聚核苷酸標記。適宜酶標記包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及諸如此類。舉例而言，標記可為酶鹼性磷酸酶，其係在1,2二氧雜環丁烷受質(例如金剛烷基甲氧基磷醯基氧基苯基二氧雜環丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧雜環丁烷-3,2'-(5'-氯)三環{3.3.1.13,7}癸}-4-基)苯基磷酸二鈉(CSPD)、以及CDP及CDP-star®或彼等熟習此項技術者熟知之其他發光受質(例如適宜鑭系元素(例如鋱(III)及銪(III))之螯合物)轉化後藉由量測化學發光之存在或形成來檢測。藉由所選標記測定檢測方式。標記或其反應產物之外觀在標記係顆粒且以適當程度累積之情形下可使用裸眼看到，或使用儀器(例如分光光度計、發光儀、螢光計及諸如此類)看到，所有皆係根據標準實踐。
較佳地，偶聯方法產生鏈接，其實質上(或幾乎)係非免疫原性，例如肽-(即醯胺-)、硫化-(立體阻礙)、二硫化物-、腙-及醚鏈接。該等鏈接幾乎係非免疫原性且在血清內顯示合理穩定性(例如，參見Senter,P.D.,Curr.Opin.Chem.Biol.13(2009)235-244；WO 2009/059278；WO 95/17886)。
端視部分及抗體之生物化學性質而定，可利用不同偶聯策略。 倘若部分係50至500個天然或重組胺基酸，則在闡述蛋白偶聯物之合成之化學法之教科書中存在標準程序，其可由熟習此項技術者容易地遵守(例如，參見Hackenberger,C.P.R.及Schwarzer,D.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.47(2008)10030-10074)。在一個實施例中，使用抗體或部分內之馬來醯亞胺基部分與半胱胺酸殘基的反應。倘若(例如)使用抗體之Fab或Fab'-片段，則此係尤其適宜之偶合化學。或者，在一個實施例中，偶合至抗體或部分之C-末端。蛋白質(例如Fab-片段)之C-末端修飾可如(例如)所述實施(Sunbul,M.及Yin,J.,Org.Biomol.Chem.7(2009)3361-3371)。
一般而言，位點特異性反應及共價偶合係基於將天然胺基酸轉變成具有與存在之其他官能基之反應性正交之反應性的胺基酸。舉例而言，稀有序列上下文內之具體半胱胺酸可在醛中經酶轉化(參見Frese,M.A.及Dierks,T.,ChemBioChem.10(2009)425-427)。亦可藉由利用某些酶與給定序列上下文中之天然胺基酸特異性酶反應性來獲得期望胺基酸修飾(例如，參見Taki,M.等人，Prot.Eng.Des.Sel.17(2004)119-126；Gautier,A.等人，Chem.Biol.15(2008)128-136；及Protease-catalyzed formation of C--N bonds is used by Bordusa,F.,Highlights in Bioorganic Chemistry(2004)389-403)。
亦可藉由末端胺基酸與適當修飾試劑之選擇性反應達成位點特異性反應及共價偶合。
N-末端半胱胺酸與苄腈之反應性(參見Ren,H.等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48(2009)9658-9662)可用於達成位點特異性共價偶合。
天然化學接合亦可依賴於C-末端半胱胺酸殘基(Taylor,E.Vogel；Imperiali,B,Nucleic Acids and Molecular Biology(2009),22(Protein Engineering),65-96)。
EP 1 074 563闡述偶聯方法，其係基於一段帶負電荷胺基酸內之半胱胺酸與位於一段帶正電胺基酸中之半胱胺酸的較快反應。
部分亦可為合成肽或肽模擬物。倘若多肽係經化學合成，則在該合成期間可納入具有正交化學反應性之胺基酸(例如，參見de Graaf,A.J.等人，Bioconjug.Chem.20(2009)1281-1295)。由於許多正交官能基處於危險中且可引入合成肽中，故該肽與連接體之偶聯係標準化學法。
為獲得單標記之多肽，可藉由層析分離具有1：1化學計量之偶聯物與其他偶聯副產物。可藉由使用染料標記之結合對成員及帶電連接體促進此程序。藉由使用此類經標記且帶高負電荷之結合對成員，容易分離單偶聯之多肽與未經標記之多肽及攜帶一個以上連接體之多肽，此乃因可使用電荷及分子量之差異進行分離。螢光染料可用於純化複合物與未結合之組份，如經標記之單價黏合劑。
在一個實施例中，附接至抗GITR抗體之部分係選自由以下組成之群：結合部分、標記部分及生物活性部分。
本文所述抗體亦可偶聯至治療劑以形成免疫偶聯物，例如抗體-藥物偶聯物(ADC)。適宜治療劑包括抗代謝物、烷基化劑、DNA小溝黏合劑、DNA嵌入劑、DNA交聯劑、組織蛋白去乙醯酶抑制劑、出核轉運抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓撲異構酶I或II抑制劑、熱休克蛋白抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、抗生素及抗有絲分裂劑。在ADC中，抗體及治療劑較佳經由可裂解連接體(例如肽基、二硫化物或腙連接體)偶聯。更佳地，連接體係肽基連接體，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO：219)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可如下文中所述：美國專利第7,087,600號、第6,989,452號及第7,129,261號；PCT公開案WO 02/096910、WO 07/038658、WO 07/051081、WO 07/059404、WO 08/083312及WO 08/103693；美國專利公開案20060024317、20060004081及20060247295；其揭示內容以引用方式併入本文中。
抗GITR抗體(例如彼等本文所述者)亦可用於檢測GITR，例如人類GITR，例如組織或組織試樣中之人類GITR。該等抗體可用於(例如)ELISA分析或流式細胞術中。在某些實施例中，使抗GITR抗體與細胞(例如組織中之細胞)接觸適於發生特異性結合之時間，且隨後添加試劑(例如檢測抗GITR抗體之抗體)。實例性分析提供於實例中。抗GITR抗體可為完全人類抗體，或其可為嵌合抗體，例如具有人類可變區及鼠類恆定區或其部分之抗體。用於檢測試樣(細胞或組織試樣)中之GITR(例如人類GITR)之實例性方法包含(i)使試樣與抗GITR抗體接觸足以容許抗GITR抗體與試樣中之GITR特異性結合的時間，及(2)使試樣與特異性結合至抗GITR抗體(例如結合至抗GITR抗體之Fc區)之檢測試劑(例如抗體)接觸，藉此檢測由抗GITR抗體結合之GITR。在與抗體及/或檢測試劑一起培育後，可包括洗滌步驟。用於該等方法中之抗GITR抗體不必連接至標記或檢測試劑，此乃因可使用單獨檢測試劑。
抗GITR抗體作為(例如)單一療法或組合療法之其他用途提供於本文中之別處，例如涉及組合治療之部分中。
XIV.雙特異性分子
本文所述抗體可用於形成雙特異性分子。抗GITR抗體或其抗原結合部分可衍生或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如受體之另一抗體或配體)，以生成結合至至少兩個不同結合位點或靶分子之雙特異性分子。舉例而言，抗GITR抗體可連接至特異性結合至可用作組合治療之潛在靶標之任何蛋白質(例如本文所述蛋白質)之抗體或scFv(例如，抗體與PD-1、PD-L1或LAG-3)。本文所述抗體事 實上可衍生或連接至一個以上之其他功能分子，以生成結合至兩個以上不同結合位點及/或靶分子之多特異性分子；該等多特異性分子亦欲涵蓋於如本文所用之術語「雙特異性分子」中。為產生本文所述雙特異性分子，本文所述抗體可在功能上連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他結合分子，例如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物，使得產生雙特異性分子。
因此，本文提供包含至少一種對GITR之第一結合特異性及對第二靶表位之第二結合特異性的雙特異性分子。在雙特異性分子係多特異性之本文所述實施例中，分子可進一步包括第三結合特異性。
在一個實施例中，本文所述雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(scFv))作為結合特異性。抗體亦可係輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，例如Fv或單鏈構築物，如Ladner等人，美國專利第4,946,778號中所述，其內容以引用方式明確併入。
儘管人類單株抗體較佳，但本文所述雙特異性分子中可採用之其他抗體係鼠類嵌合及人類化單株抗體。
本文所述雙特異性分子可使用業內已知之方法藉由偶聯成份結合特異性來製備。舉例而言，可單獨生成雙特異性分子之每一結合特異性且隨後彼此偶聯。當結合特異性係蛋白質或肽時，可使用多種偶合劑或交聯劑進行共價偶聯。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二馬來醯亞胺(oPDM)、丙酸N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)酯(SPDP)及4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SMCC)(例如，參見Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括彼等闡述於以下中者：Paulus (1985)Behring Ins.Mitt.編號78，118-132；Brennan等人(1985)Science 229：81-83)，及Glennie等人(1987)J.Immunol.139：2367-2375)。較佳偶聯劑係SATA及磺基-SMCC，其皆可自Pierce Chemical公司(Rockford,IL)購得。
當結合特異性係抗體時，其可經由兩條重鏈之C-末端鉸鏈區之巰基鍵結來偶聯。在尤佳實施例中，鉸鏈區經修飾在偶聯之前含有奇數個(較佳一個)巰基殘基。
或者，兩種結合特異性可在同一載體中編碼且在同一宿主細胞中表現並裝配。此方法在雙特異性分子係mAb×mAb、mAb×Fab、mAb×(scFv)2、Fab×F(ab')2或配體×Fab融合蛋白時尤其有用。雙特異性抗體可包含在每一重鏈之C-末端處包含scFv之抗體。本文所述雙特異性分子可係包含一種單鏈抗體及結合決定子之單鏈分子或包含兩種結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩種單鏈分子。用於製備雙特異性分子之方法闡述於(例如)美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號；及美國專利第5,482,858號中。
雙特異性分子與其特異性靶之結合可使用業內公認之方法(例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析)來確認。該等分析中之每一者通常藉由採用對所關注複合物經由特異性之經標記試劑(例如抗體)來檢測尤其受關注之蛋白質-抗體複合物之存在。
XV.組合物
進一步提供含有與醫藥上可接受之載劑調配在一起之本文所述抗GITR抗體或抗體與其他靶標之組合或其抗原結合部分中之一者或 組合的組合物(例如醫藥組合物)。該等組合物可包括本文所述抗體或免疫偶聯物或雙特異性分子中之一者或組合(例如兩種或更多種不同者)。舉例而言，本文所述醫藥組合物可包含結合至靶抗原上之不同表位或具有互補活性之抗體(或免疫偶聯物或雙特異性物)之組合。
在某些實施例中，組合物包含至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、1-300mg/ml或100-300mg/ml之濃度之抗GITR抗體。
本文所述醫藥組合物亦可以組合療法、即與其他藥劑組合投與。舉例而言，組合療法可包括與至少一種其他抗癌劑及/或T細胞刺激(例如，活化)劑組合之本文所述抗GITR抗體。可用於組合療法中之治療劑之實例更詳細闡述於下文關於本文所述抗體之用途之部分中。
在一些實施例中，本文揭示之治療組合物可包括用於治療癌症之其他化合物、藥物及/或藥劑。該等化合物、藥物及/或藥劑可包括(例如)刺激針對給定癌症之免疫反應之化學療法藥物、小分子藥物或抗體。在一些情況下，治療組合物可包括(例如)以下中之一或多者：抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PDL-1抗體、抗OX40(亦稱作CD134、TNFRSF4、ACT35及/或TXGP1L)抗體、抗CD137抗體或抗LAG-3抗體。
如本文所使用，「醫藥上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及生理上相容之類似試劑。較佳地，載劑適於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊柱或表皮投與(例如，藉由注射或輸注)。端視投與途徑而定，可於材料中對活性化合物(即抗體、免疫偶聯物或雙特異性分子)進行包衣以保護化合物免受酸及可使化合物不活化之其他天然條件的作用。
本文所述醫藥化合物可包括一或多種醫藥上可接受之鹽。「醫 藥上可接受之鹽」係指保留母體化合物之期望生物活性且不賦予任何不期望毒理學效應之鹽(例如，參見Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci. 66：1-19)。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括彼等源自無毒無機酸(例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及諸如此類)以及源自無毒有機酸(例如脂肪族單及二羧酸、經苯基取代之鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族磺酸及諸如此類)者。鹼加成鹽包括彼等源自鹼土金屬(例如鈉、鉀、鎂、鈣及諸如此類)以及源自無毒有機胺(例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及諸如此類)者。
本文所述醫藥組合物亦可包括醫藥上可接受之抗氧化劑。醫藥上可接受之抗氧化劑的實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、氫氯酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及諸如此類；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及諸如此類；及(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(FDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及諸如此類。
可用於本文所述醫藥組合物中之適宜水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物、植物油(例如橄欖油)及可注射有機酯(例如油酸乙酯)。可(例如)藉由使用諸如卵磷脂等包衣材料、藉由維持所需粒徑(在分散劑之情形下)及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。
該等組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。藉由上述滅菌程序並藉由納入各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸如此類)二者可確保阻止微生物之存在。該等組合物中亦可期望包括等滲劑，例如糖、 氯化鈉及諸如此類。另外，可藉由引入吸收延遲劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現可注射醫藥形式之長效吸收。
醫藥上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。業內已知用於醫藥活性物質之該等介質及藥劑之使用。除任何與活性化合物不相容之習用介質或藥劑外，亦涵蓋其於醫藥組合物中之使用。醫藥組合物可包含防腐劑或可不含防腐劑。該等組合物中亦可納入附加活性化合物。
通常，治療組合物必須無菌且在製造及儲存條件下穩定。可將組合物調配成溶液、微乳液、脂質體或其他適於高藥物濃度之有序結構。載劑可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物。可(例如)藉由使用包衣(例如卵磷脂)、藉由維持所需粒徑(在分散液情形下)且藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。在許多情形下，較佳可將等滲劑(例如糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)或氯化鈉)納入組合物中。可藉由向組合物中納入延遲吸收劑(例如，單硬脂酸鹽及明膠)實現可注射組合物之長效吸收。
無菌可注射溶液可藉由以下方式來製備：將所需量之活性化合物納入具有上文所列舉成份中之一者或組合(視需要)之適宜溶劑中，之後進行無菌微濾。通常，可藉由將活性化合物納入含有基本分散介質及來自彼等上文所列舉者之所需其他成份的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍-乾燥(凍乾)，其可自其預先經無菌過濾之溶液產生活性成份加上任一所期望額外成份之粉末。
可與載劑材料組合產生單一劑型之活性成份之量將端視所治療個體及特定投與方式而變化。可與載劑材料組合產生單一劑型之活性成份之量通常可為產生治療效應之組合物之量。通常，在100%中， 此量將在與醫藥上可接受之載劑組合之約0.01%至約99%之活性成份、較佳約0.1%至約70%、最佳約1%至約30%活性成份範圍內。
可對劑量方案進行調節以提供最佳期望反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單次濃注劑，可隨時間投與若干個分次劑量或可根據治療狀況緊急程度所指示按比例減少或增加劑量。尤其有利地將非經腸組合物調配成劑量單位形式以便於劑量之投與及均勻性。如本文所使用之劑量單元形式係指適於作為單位劑量供欲治療個體使用之物理離散單元；各單元含有預定量之活性化合物，此預定量經計算與所需醫藥載劑一起產生期望治療效應。本文所述劑量單位形式之規格取決於且直接依賴於下列因素：(a)活性化合物之獨特特性及欲達成之特定治療效應，及(b)複合此活性化合物以治療個體敏感性之技術中的固有限制條件。
對於抗體之投與，劑量將在約0.0001mg/kg至100mg/kg且更通常0.01mg/kg至5mg/kg或10mg/kg宿主體重之範圍內。舉例而言，劑量可為0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或在1mg/kg至10mg/kg範圍內。實例性治療方案需要每週投與一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每3個月一次或每3至6個月一次。本文所述抗GITR抗體之較佳劑量方案包括經由靜脈內投與1mg/kg體重或3mg/kg體重，其中抗體係使用以下投藥排程表中之一者給予：(i)每四週共六個劑量，隨後每三個月；(ii)每三週；(iii)3mg/kg體重一次，之後每三週1mg/kg體重。
抗GITR抗體可以固定劑量(固定劑量方案)投與。
在一些方法中，同時投與兩種或更多種經由不同結合特異性之單株抗體，在該情形下，所投與每一抗體之劑量在所指示範圍內。抗體通常係在多個時機下投與。單一劑量之間之間隔可係(例如)每週、每月、每三個月或每年。間隔亦可如藉由量測患者之針對靶抗原之抗 體血液含量所指示而不規則。在一些方法中，對劑量進行調節以達成約1-1000μg/ml且在一些方法中約25-300μg/ml之血漿抗體濃度。
抗GITR抗體可以另一抗體之劑量方案與另一抗體一起投與。舉例而言，抗GITR抗體可每兩週在60分鐘內以靜脈內輸注形式與抗PD-1抗體(例如尼沃魯單抗(nivolumab)(OPDIVO))一起投與直至疾病進展或不可接受之毒性發生為止。抗GITR抗體可每3週在30分鐘內以靜脈內輸注形式與派姆單抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA)一起投與直至疾病進展或不可接受之毒性發生為止。
抗體可以持續釋放調配物形式投與，在該情形下需要較不頻繁投與。劑量及頻率端視抗體在患者中之半衰期而變化。通常，人類抗體顯示最長半衰期，其次為人類化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。投與劑量及頻率可端視治療為預防性抑或或治療性而變化。在預防性應用中，以相對較不頻繁之間隔經較長時間段投與相對較低之劑量。一些患者在其餘生中持續接受治療。在治療性應用中，有時需要相對較短間隔之相對較高之劑量直至減輕或終止疾病進展且較佳直至患者顯示疾病症狀之部分或完全改善。此後，可向患者投與預防性方案。
本文所述醫藥組合物中活性成份之實際劑量可有所變化，以便獲得對於特定患者、組合物及投與方式有效達到期望治療反應而對患者不具毒性之活性成份量。所選劑量量將端視多種藥物代謝動力學因素而定，該等因素包括所用本文所述特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所用特定化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、一般健康情況及先前病史及已為醫學技術中所熟知之類似因素。
本文所述抗GITR抗體之「治療有效量」較佳可降低疾病症狀之嚴重程度，增加無疾病症狀時段之頻率及持續時間或預防因感病性所 致之損害或失能。在癌症之上下文中，治療有效劑量較佳可增加存活、及/或預防與癌症相關之身體症狀之進一步劣化。癌症之症狀為業內所熟知且包括(例如)不常見的痣特徵(unusual mole feature)、痣外觀(包括不對稱、邊界、顏色及/或直徑)變化、新近著色皮膚區域、異常痣、指甲下變深區域、乳房腫塊、乳頭變化、乳腺囊腫、乳房疼痛、死亡、體重減輕、虛弱、過度疲勞、進食困難、喪失食慾、慢性咳嗽、惡化氣絕、咳血、尿液帶血、糞便帶血、噁心、嘔吐、肝轉移、肺轉移、骨轉移、腹痛下墮、氣脹病、腹腔中流體、陰道出血、便秘、腹脹、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、發熱、疼痛)、疼痛、吐血、嚴重出汗、發熱、高血壓、貧血、腹瀉、黃疸、頭暈、發冷、肌肉痙攣、結腸轉移、肺轉移、膀胱轉移、肝轉移、骨轉移、腎轉移及胰臟轉移、吞嚥困難及諸如此類。
治療有效劑量可防止或延遲癌症發作，例如在存在疾病之早期或初步體徵時可為合意的。用於診斷癌症之實驗室測試包括化學(包括GITR含量之量測)、血液學、血清學及放射學。因此，監測上述中之任一者之任何臨床或生物化學分析可用於確定特定治療是否係用於治療癌症之治療有效劑量。熟習此項技術者應能夠基於諸如個體之大小、個體症狀之嚴重程度及特定組合物或所選投與途徑等因素來測定該等量。
本文所述組合物可使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者經由一或多個投與途徑投與。如熟習此項技術者應瞭解，投與途徑及/或方式應視所期望結果而變化。本文所述抗體之較佳投與途徑包括靜脈內、肌內、皮內、腹膜腔內、皮下、脊柱或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。本文所用片語「非經腸投與」意指除經腸及局部投與以外之投與方式，通常藉由注射，且包括(但不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼窩內、心內、皮內、腹膜腔內、 經氣管、皮下、表皮下、關節內、經囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
或者，本文所述抗體可經由非經腸途徑投與，例如局部、表皮或黏膜投與途徑，例如經鼻內、經口、經引道、經直腸、經舌下或經局部。
活性化合物可利用保護化合物免於快速釋放之載劑製備，例如控制釋放調配物，包括植入體、經皮貼劑及微囊封遞送系統。可使用生物可降解之生物相容聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此等調配物之許多方法已獲得專利權或通常已為彼等熟習此項技術者所知。參見(例如)Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker公司，New York,1978。
治療組合物可利用業內已知之醫學器件投與。舉例而言，在較佳實施例中，本文所述治療組合物可利用無針皮下注射(例如器件揭示於美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中之器件)來投與。與本文所述抗GITR抗體一起使用之熟知植入體及模組的實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示用於以控制速率分配用藥之可植入微輸注幫浦；美國專利第4,486,194號，其揭示用於經由皮膚投與藥物之治療器件；美國專利第4,447,233號，其揭示用於以精確輸注速率遞送用藥之用藥輸注幫浦；美國專利第4,447,224號，其揭示用於連續藥物遞送之可變流量可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，其揭示經由多室隔間之滲透藥物遞送系統；及美國專利第4,475,196號，其揭示滲透藥物遞送系統。此等專利皆以引用方式併入本文中。許多其他植入體、遞送系統及模組為熟習此項技術者已知。
在某些實施例中，本文所述抗GITR抗體可經調配以確保活體內 適當分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排除許多高度親水性化合物。為確保本文所述治療化合物跨越BBB(若期望，例如，針對腦癌)，則其可(例如)在脂質體中經調配。對於製造脂質體之方法，參見(例如)美國專利4,522,811；5,374,548；及5,399,331。脂質體可包含一或多個選擇性運輸至特定細胞或器官中、由此增強靶向藥物遞送的部分(例如，參見V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。實例性靶向部分包括葉酸或生物素(例如，參見頒予Low等人之美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗體(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
XVI.使用及方法
本文所述抗體、抗體組合物及方法具有多種活體外及活體內應用，其涉及(例如)藉由活化GITR信號傳導增強免疫反應或檢測GITR。在較佳實施例中，本文所述抗體係人類抗體。舉例而言，本文所述抗GITR抗體可在活體外或離體投與培養物中之細胞或(例如)在活體內投與人類個體以增強多種疾病中之免疫性。因此，本文提供改良個體中之免疫反應的方法，其包含向個體投與本文所述抗體或其抗原結合部分，使得個體中之免疫反應經改良。較佳地，增強、刺激或上調反應。
較佳個體包括免疫反應之增強可為合意的之人類患者。該等方法尤其適於治療患有可藉由加強免疫反應(例如，T細胞介導之免疫反應，例如抗原特異性T細胞反應)治療之病症之人類患者。在具體實施 例中，該等方法尤其適於治療活體內癌症。為達成免疫性之抗原特異性增強，本文所述抗GITR抗體可與所關注抗原一起投與或抗原可已經存於欲治療之個體(例如，帶有腫瘤或帶有病毒之個體)中。在針對GITR之抗體與另一藥劑一起投與時，兩者可單獨或同時投與。
亦涵蓋用於檢測試樣中人類GITR抗原之存在或量測人類GITR抗原之量的方法，其包含在容許在抗體或其部分與人類GITR之間形成複合物之條件下使試樣及對照試樣與單株抗體(例如，特異性結合至人類GITR之人類單株抗體或其抗原結合部分)接觸。隨後檢測複合物之形成，其中試樣與對照試樣相比之間之複合物形成差異指示試樣中人類GITR抗原之存在。此外，本文所述抗GITR抗體可用於經由免疫親和力純化來純化人類GITR。
假定本文所述抗GITR抗體刺激或共刺激T細胞反應(例如抗原特異性T細胞反應)之能力，本文提供使用本文所述抗體以刺激、增強或上調抗原特異性T細胞反應(例如抗腫瘤T細胞反應)之活體外及活體內方法。在某些實施例中，亦提供CD3刺激(例如，藉由與表現膜CD3之細胞共培育)，該刺激可與用抗GITR抗體刺激同時、之後或之後提供。舉例而言，本文提供刺激抗原特異性T細胞反應之方法，其包含使該T細胞與本文所述抗GITR抗體及視情況與抗CD3抗體接觸，使得刺激抗原特異性T細胞反應。可使用抗原特異性T細胞反應之任何適宜指示因子以量測抗原特異性T細胞反應。該等適宜指示因子之非限制性實例包括在抗體存在下增加之T細胞增殖及/或在抗體存在下增加細胞介素產生。在較佳實施例中，刺激由抗原特異性T細胞之介白素-2及/或干擾素-γ產生。
可利用抗GITR抗體增強或共刺激之T細胞包括CD4+ T細胞及CD8+ T細胞。T細胞可為Teff細胞，例如CD4+ Teff細胞、CD8+ Teff細胞、T輔助(Th)細胞及T細胞毒性(Tc)細胞。
進一步涵蓋刺激個體中免疫反應(例如，抗原特異性T細胞反應)之方法，其包含向個體投與本文所述抗GITR抗體，使得刺激個體中之免疫反應(例如，抗原特異性T細胞反應)。在較佳實施例中，個體係帶有腫瘤之個體且刺激針對腫瘤之免疫反應。腫瘤可為實體腫瘤或液體腫瘤(例如血液惡性病)。在某些實施例中，腫瘤係免疫原性腫瘤。在某些實施例中，腫瘤係非免疫原性。在某些實施例中，腫瘤係PD-L1陽性。在某些實施例中，腫瘤係PD-L1陰性。個體亦可為帶有病毒之個體且刺激針對病毒之免疫反應。
進一步提供抑制個體中腫瘤細胞生長之方法，其包含向個體投與本文所述抗GITR抗體，使得抑制個體中之腫瘤生長。亦提供治療個體中病毒感染之方法，其包含向個體投與本文所述抗GITR抗體，使得治療個體中之病毒感染。
本文亦涵蓋自患有腫瘤(例如癌性腫瘤)之個體之腫瘤微環境耗盡Treg細胞的方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所述抗GITR抗體，該抗GITR抗體包含刺激腫瘤微環境中Treg細胞之耗盡的Fc。Fc可為(例如)具有效應物功能或增強之效應物功能(例如結合至一或多種活化Fc受體或具有增強之與一或多種活化Fc受體之結合)的Fc。在較佳實施例中，Treg耗盡發生而不顯著耗盡或抑制腫瘤微環境中之Teff，且不顯著耗盡或抑制腫瘤微環境外、例如末梢中之Teff細胞及Treg細胞。在某些實施例中，個體在Treg細胞上較在Teff細胞上、例如在腫瘤微環境中具有較高含量之GITR。
在某些實施例中，用具有增強激動作用(例如結合至抑制性FcRIIb或具有增強之與抑制性FcRIIb之結合)之Fc的抗GITR抗體治療個體。利用具有不結合至一或多種活化FcR或具有降低之與一或多種活化FcR之結合之Fc的抗GITR抗體執行某些治療。抗GITR抗體可耗盡腫瘤中之Treg及/或腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)中之Treg。
在某些實施例中，給予個體抗GITR抗體作為附加療法。利用抗GITR抗體治療患有癌症之個體可引起延長存活，例如相對於當前護理標準長期耐久反應；至少3個月、6個月、9個月、1年、2年、3年、4年、5年、10年或更多年之長期存活，或至少3個月、6個月、9個月、1年、2年、3年、4年、5年或10年或更多年之無復發存活。在某些實施例中，用抗GITR抗體治療患有癌症之個體可防止癌症復發或延遲癌症復發(例如)3個月、6個月、9個月、1年、2年、3年、4年、5年或10年或更多年。抗GITR治療可用作一線、二線或三線治療。
在較佳實施例中，本文所述抗GITR抗體並無顯著毒性。舉例而言，GITR抗體對人類器官(例如肝、腎、腦、肺及心臟中之一或多者)並無顯著毒性，如(例如臨床試驗)中所測定。在某些實施例中，GITR抗體並不顯著觸發不合意之免疫反應，例如自體免疫性或發炎。
在某些實施例中，用抗GITR激動劑(例如，抗GITR抗體)治療個體不會引起免疫系統過刺激至個體之免疫系統隨後攻擊個體自身之程度(例如，自體免疫反應)或引起(例如)過敏反應。因此，抗GITR抗體較佳不引起過敏反應。
在某些實施例中，用本文所述抗GITR抗體(例如包含28F3之CDR或可變區之抗體)治療個體不會引起顯著發炎反應，例如免疫介導之肺炎、免疫介導之結腸炎、免疫介導之肝炎、免疫介導之腎炎或腎功能障礙、免疫介導之垂體炎、免疫介導之甲狀腺功能減退及甲狀腺功能亢進或其他免疫介導之不良反應。在某些實施例中，包含28F3之CDR或可變區之抗GITR抗體較其他抗GITR抗體引起較少發炎反應，例如免疫介導之肺炎、免疫介導之結腸炎、免疫介導之肝炎、免疫介導之腎炎或腎功能障礙、免疫介導之垂體炎、免疫介導之甲狀腺功能減退及甲狀腺功能亢進、過敏反應或其他免疫介導之不良反應。其他免疫介導之不良反應包括：心臟病症，例如心室心律不整；眼病症， 例如虹膜睫狀體炎；輸注相關之反應；增加之澱粉酶、增加之脂肪酶；神經系統病症，例如頭暈、末梢及感覺神經病變；皮膚及皮下組織病症，例如疹、搔癢、表皮脫落性皮膚炎、多形性紅斑、白斑病或牛皮癬；呼吸、胸腔及縱膈病症，例如咳嗽；疲勞；噁心；食慾下降；便秘；關節痛；及腹瀉。
在某些實施例中，GITR抗體與另一癌症療法(例如刺激免疫系統之化合物(例如，免疫-腫瘤藥劑)，例如本文所述化合物或調節本文所述靶標之化合物)組合提供協同抗腫瘤效應。
下文進一步詳細論述本文所述該等及其他方法。
癌症
由抗GITR抗體活化GITR可增強對患者中癌細胞之免疫反應。本文提供治療患有癌症之個體之方法，其包含向個體投與本文所述抗GITR抗體，使得治療個體，例如使得抑制或減少癌性腫瘤之生長及/或腫瘤退化及/或達成延長存活。抗GITR抗體可單獨使用以抑制癌症腫瘤之生長。或者，抗GITR抗體可與另一藥劑(例如另一免疫原性藥劑、標準癌症治療或另一抗體)組合使用，如下文所述。
因此，本文提供(例如)藉由抑制個體中腫瘤細胞生長來治療癌症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所述抗GITR抗體(例如28F3.IgG1或28F3.IgG1.1)或其抗原結合部分。該抗體可為人類抗GITR抗體(例如本文所述人類抗人類GITR抗體中之任一者)。另外或或者，該抗體可為嵌合或人類化抗GITR抗體，例如包含28F3或本文所述其他抗GITR抗體之序列之嵌合或人類化抗GITR抗體。
可使用本發明抗體抑制生長之癌症包括通常對免疫療法有反應之癌症及彼等通常對免疫療法無反應者。癌症可為具有實體腫瘤或血液惡性病(液體腫瘤)之癌症。用於治療之癌症之非限制性實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌 (NSCLC)、非鱗狀NSCLC、神經膠質瘤、胃腸癌、腎癌(例如透明細胞癌)、卵巢癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌(例如，腎細胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素難治性前列腺腺癌)、甲狀腺癌、神經胚細胞瘤、胰臟癌、神經膠母細胞瘤(多形性神經膠母細胞瘤)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝瘤、乳癌、結腸癌及頭頸癌(或癌瘤)、胃癌、生殖細胞腫瘤、兒科肉瘤、鼻竇天然殺傷、黑色素瘤(例如，轉移性惡性黑色素瘤，例如皮膚或眼內惡性黑色素瘤)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛區癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童期實體腫瘤、輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統之贅瘤(CNS)、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊軸腫瘤、腦癌、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘導之癌症(包括彼等由石棉誘導者)、病毒相關癌症或病毒起源之癌症(例如，人類乳頭瘤病毒(HPV相關或起源之腫瘤))、及源自兩種主要血球譜系(即骨髓細胞系(其產生顆粒球、紅血球、血栓細胞、巨噬細胞及肥胖細胞)或淋巴細胞系(其產生B、T、NK及漿細胞))中之任一者之血液學惡性病，例如所有類型之白血病、淋巴瘤及骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴球性及/或骨髓性白血病，例如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)及慢性骨髓性白血病(CML)、未分化之AML(M0)、骨髓母細胞性白血病(M1)、骨髓母細胞性白血病(M2；細胞成熟)、前髓球性白血病(M3或M3變體[M3V])、骨髓單核球性白血病(具有嗜酸性球增多症之M4或M4變體[M4E])、單核球性白血病(M5)、紅白血病(M6)、巨核母球性白血病(M7)、分離之顆粒球性肉瘤及綠色瘤；淋巴瘤，例如霍奇金氏氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B細胞血液 學惡性病(例如B細胞淋巴瘤)、T細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、單核球樣B細胞淋巴瘤、黏膜相關之淋巴組織(MALT)淋巴瘤、退行性(例如，Ki 1+)大細胞淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤/白血病、外套細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤、腸T細胞淋巴瘤、原發性縱膈B細胞淋巴瘤、前體T-淋巴母細胞性淋巴瘤、T-淋巴母細胞性；及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、末梢T細胞淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤、移植後淋巴增殖病症、真實組織細胞性淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性積液淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴譜系之造血性腫瘤、急性淋巴母細胞性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、瀰漫性組織細胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前體B-淋巴母細胞性淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTLC)(亦稱作蕈樣真菌病或塞紮裡症候群(Sezary syndrome))及具有瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)之淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、燜燃型骨髓瘤(亦稱作無痛骨髓瘤)、孤立性漿細胞瘤及多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、多毛細胞淋巴瘤；類骨髓譜系之造血性腫瘤、間質起源之腫瘤(包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤)；精細胞瘤、畸形癌、中樞及周圍神經腫瘤，包括星細胞瘤、神經鞘瘤；間質起源之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑色素瘤、著色性乾皮病、角質棘皮瘤、精細胞瘤、甲狀腺濾泡性癌及畸形癌、淋巴譜系之造血性腫瘤，例如T細胞及B細胞腫瘤，包括(但不限於)T細胞病症，例如T前淋巴球性白血病(T-PLL)，包括小細胞及腦回狀細胞類型；較佳T細胞類型之大的顆粒性淋巴球白血病(LGL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；末梢/胸腺後T細胞淋巴瘤(多型及免疫母細胞亞型)；血管中心(鼻)T細胞淋巴瘤；頭或頸癌、腎癌、直腸 癌、甲狀腺癌；急性類骨髓性淋巴瘤以及該等癌症之任何組合。本文所述方法亦可用於治療轉移性癌症、不可切除及/或難治性癌症(例如，利用(例如)阻斷CTLA-4或PD-1抗體之先前免疫療法難治之癌症)及復發性癌症。
在某些實施例中，向對先前治療(例如利用免疫-腫瘤藥物之先前治療)之反應不足之患有癌症之患者或患有難治或抗性、固有難治或抗性(例如，利用PD-1路徑拮抗劑難治)或其中抗性或難治性狀態係獲得性之癌症之患者投與抗GITR Ab。舉例而言，可藉由單獨投與抗GITR抗體或與另一療法(例如，抗PD-1療法)之組合治療對第一療法無反應或反應不足或在治療(例如抗PD-1治療)後觀察到疾病進展之個體。
在某些實施例中，向先前未接受(即，經治療)免疫-腫瘤藥劑(例如PD-1路徑拮抗劑)之患者投與抗GITR抗體。
可利用護理治療之標準投與抗GITR抗體。抗GITR抗體可作為維持療法(例如意欲防止腫瘤發生或復發之療法)投與。
抗GITR抗體可與另一治療(例如輻射、手術或化學療法)一起投與。舉例而言，在存在可存在微轉移之風險時及/或為了降低復發之風險，可投與抗GITR抗體附加療法。
抗GITR抗體可作為單一療法、或作為唯一免疫刺激療法投與。針對GITR之抗體(例如本文所述抗GITR抗體)亦可免疫原試劑(例如癌細胞、純化腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽及碳水化合物分子)、細胞及經編碼免疫刺激細胞介素之基因轉染之細胞)組合(He等人(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可使用之腫瘤疫苗之非限制性實例包括黑色素瘤抗原之肽(例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪胺酸酶之肽)、或經轉染以表現細胞介素GM-CSF之腫瘤細胞(下文進一步論述)。
在人類中，已顯示一些腫瘤具有免疫原性，例如黑色素瘤。藉由經由GITR活化降低T細胞活化之臨限值，可活化宿主中之腫瘤反應，從而容許治療非免疫原性腫瘤或彼等具有限制免疫原性者。
抗GITR抗體(例如本文所述抗GITR抗體)可與疫苗接種方案組合。已設計出針對腫瘤之疫苗接種之許多實驗策略(參見Rosenberg,S.,2000,Development of Cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring：60-62；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational Book Spring：300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring：414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring：730-738；亦參見Restifo,N.及Sznol,M.,Cancer Vaccines,Ch.61，第3023-3043頁，DeVita等人(編輯),1997,Cancer：Principles and Practice of Oncology，第五版)。在該等策略中之一者中，使用自體或同種腫瘤細胞製備疫苗。已顯示該等細胞疫苗在腫瘤細胞經轉導以表現GM-CSF時最有效。已顯示GM-CSF係用於腫瘤疫苗接種之抗原呈遞之有效力之活化劑(Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90：3539-43)。
各種腫瘤中基因表現及大規模基因表現模式之研究已產生所謂腫瘤特異性抗原之定義(Rosenberg,S A(1999)Immunity 10：281-7)。在許多情形下，該等腫瘤特異性抗原係在腫瘤及腫瘤產生之細胞中表現之分化抗原，例如黑色素細胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要的是，可顯示許多該等抗原為宿主中發現之腫瘤特異性T細胞之靶標。GITR活化可與在腫瘤中表現之重組蛋白及/或肽之集合結合使用以生成對該等蛋白之免疫反應。該等蛋白通常由免疫系統視為自身抗原且因此對其具有耐受性。腫瘤抗原可包括蛋白端粒酶，其係染色體之端粒之合成所需的且在85%以上人類癌症及僅有限數目之體細胞組織中表現(Kim等人(1994)Science 266：2011-2013)。腫瘤抗原亦可為由於改變蛋白序列或在兩個無關序列(即，費城染色體(Philadelphia chromosome)中之bcr-abl)之間產生融合蛋白之體細胞突變而在癌細胞中表現之「新-抗原」或來自B細胞腫瘤之獨特型(idiotype)。
其他腫瘤疫苗可包括來自參與人類癌症之病毒(例如人類乳頭瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV))之病毒的蛋白質。可與GITR活化結合使用之另一形式之腫瘤特異性抗原係自腫瘤組織自身分離之純化熱休克蛋白(HSP)。該等熱休克蛋白含有來自腫瘤細胞之蛋白之片段且該等HSP高度有效地遞送至抗原呈遞細胞用於引發腫瘤免疫性(Suot及Srivastava(1995)Science 269：1585-1588；Tamura等人(1997)Science 278：117-120)。
樹突細胞(DC)係可用於引發抗原特異性反應之有效力之抗原呈遞細胞。DC可離體產生且裝載有各種蛋白質及肽抗原以及腫瘤細胞萃取物(Nestle等人(1998)Nature Medicine 4：328-332)。DC亦可藉由遺傳方式轉導以亦表現該等腫瘤抗原。出於免疫目的，DC亦已直接融合至腫瘤細胞(Kugler等人(2000)Nature Medicine 6：332-336)。作為疫苗接種之方法，DC免疫可有效地與GITR活化組合以活化更有效力之抗腫瘤反應。
GITR活化亦可與標準癌症治療(例如，手術、輻射及化學療法)組合。GITR活化可有效地與化學治療方案組合。在該等情況下，可減少所投與化學治療試劑之劑量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。該組合之實例係抗GITR抗體與氨烯咪胺(decarbazine)之組合用於治療黑色素瘤。該組合之另一實例係抗GITR抗體與介白素-2(IL-2)之組合用於治療黑色素瘤。支持GITR活化及化學療法之組合使用之科學原理係細胞死亡，其係大部分化學治療化合物之細胞毒性作用的結果，應在抗原呈遞路徑中產生增加之腫瘤抗原含量。可經由細胞死亡與GITR活化產生協同作用之其他組合療法係輻射、手術及激素剝奪。該等方案中之每一者皆在宿主中產生腫瘤抗 原之來源。血管生成抑制劑亦可與GITR活化組合。血管生成之抑制導致腫瘤細胞死亡，此可將腫瘤抗原餵入宿主抗原呈遞路徑中。
本文所述抗GITR抗體亦可與將表現Fcα或Fcγ受體之效應物細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性抗體組合使用(例如，參見美國專利第5,922,845號及第5,837,243號)。雙特異性抗體可用於靶向兩種單獨抗原。舉例而言，抗Fc受體/抗腫瘤抗原(例如，Her-2/neu)雙特異性抗體已用於將巨噬細胞靶向腫瘤之位點。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性反應。可藉由GITR之活化加強該等反應之T細胞臂。或者，可藉由使用結合至腫瘤抗原及樹突細胞特異性細胞表面標記物之雙特異性抗體將抗原直接遞送至DC。
腫瘤藉由多種機制逃避宿主免疫監督。許多該等機制可藉由由腫瘤表現且具有免疫阻抑性之蛋白質之不活化來克服。該等機制尤其包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163：1037-1050)、IL-10(Howard及O'Garra(1992)Immunology Today 13：198-200)及Fas配體(Hahne等人(1996)Science 274：1363-1365)。針對該等實體中之每一者之抗體可與抗GITR抗體組合使用以消除免疫阻抑劑之效應並幫助由宿主之腫瘤免疫反應。
活化宿主免疫反應之其他抗體可與抗GITR抗體組合使用。該等抗體包括樹突細胞表面上之分子，其活化DC功能及抗原呈遞。抗CD40抗體能夠有效地取代T細胞輔助活性(Ridge等人(1998)Nature 393：474-478)且可與抗GITR抗體結合使用。活化針對T細胞共刺激分子(例如CTLA-4(例如，美國專利第5,811,097號)、OX-40(Weinberg等人(2000)Immunol 164：2160-2169)、4-1BB(Melero等人(1997)Nature Medicine 3：682-685(1997)及ICOS(Hutloff等人(1999)Nature 397：262-266))之抗體亦可提供增加之T細胞活化程度。PD1或PD-L1之抑制劑亦可與抗GITR抗體結合使用。
目前使用骨髓移植以治療多種造血性起源之腫瘤。儘管移植物抗宿主病係由此治療所致，但可自移植物抗腫瘤反應獲得治療益處。GITR活化可用於增加移入腫瘤特異性T細胞中之供體之有效性。
亦存在若干實驗治療方案，其涉及抗原特異性T細胞之離體活化及擴增及該等細胞授受性轉移至接受者中以針對腫瘤刺激抗原特異性T細胞(Greenberg及Riddell(1999)Science 285：546-51)。該等方法亦可用於活化T細胞對感染物(例如CMV)之反應。在抗GITR抗體存在下之離體活化可增加授受性轉移之T細胞之頻率及活性。
傳染病
本文所述方法亦可用於治療已暴露於特定毒素或病原體之患者。因此，本文所述另一態樣提供治療個體之傳染病之方法，其包含向個體投與抗GITR抗體或其抗原結合部分，使得治療個體之傳染病。另外或或者，抗體可為嵌合或人類化抗體。
類似於如上文所論述抗體介導之GITR活化對於腫瘤之應用，其可單獨使用或作為佐劑與疫苗組合使用，以刺激對病原體、毒素及自身抗原之免疫反應。此治療方法可尤其有用之病原體之實例包括目前無有效疫苗之病原體或習用疫苗並非完全有效之病原體。該等病原體包括(但不限於)HIV、肝炎(A、B及C型)、流行性感冒、疱疹、賈第蟲(Giardia)、瘧疾、利什曼蟲(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。GITR活化可針對由在感染過程中呈遞改變抗原之試劑(例如HIV)之確立感染有用。在抗人類GITR抗體投與時，該等新穎表位被識別為外來物，由此引起強的T細胞反應。
引起可由本文所述方法治療之感染之病原體病毒的一些實例包括HIV、肝炎(A、B或C型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus))、腺病 毒、流行性感冒病毒、蟲媒病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯薩奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、小病毒、痘瘡病毒、HTLV病毒、登革熱病毒(dengue virus)、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒腦炎病毒。
引起可由本文所述方法治療之感染之病原體細菌的一些實例包括披衣菌屬(chlamydia)、立克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克留氏菌屬(klebsiella)、變形桿菌屬(proteus)、沙雷菌屬(serratia)、假單胞菌屬(pseudomonas)、軍團病桿菌屬(legionella)、白喉(diphtheria)、沙門桿菌屬(salmonella)、桿菌、霍亂(cholera)、破傷風(tetanus)、肉毒中毒、炭疽(anthrax)、瘟疫、鈎端螺旋體病(leptospirosis)及萊姆病細菌(Lymes disease bacteria)。
引起可由本文所述方法治療之感染之病原體真菌的一些實例包括念珠菌屬(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克魯斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、曲黴菌屬(Aspergillus)(煙曲黴菌(fumigatus)、黑曲黴菌(niger)等)、毛黴菌屬(Genus Mucorales)(毛黴(mucor)、犁頭黴(absidia)、根黴菌(rhizopus))、申克孢子絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織漿菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可由本文所述方法治療之感染之病原體寄生蟲的一些實例包括溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格裡原蟲(Naegleriafowleri)、棘狀變形蟲 屬(Acanthamoeba sp.)、藍氏賈第蟲(Giardia lambia)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium sp.)、肺泡囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、焦蟲(Babesia microti)、布魯氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克魯氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、黑熱病利什曼原蟲(Leishmania donovani)、弓蟲(Toxoplasma gondii)、巴西鼠鉤蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，GITR活化可與其他形式之免疫療法(例如細胞介素治療(例如，干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或雙特異性抗體療法(其提供增強之腫瘤抗原呈遞(例如，參見Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak(1994)Structure 2：1121-1123)))組合物。
自體免疫反應
抗GITR抗體可引起並擴增自體免疫反應。實際上，使用腫瘤細胞及肽疫苗之抗腫瘤反應之誘導揭示，許多抗腫瘤反應涉及抗自身反應性(van Elsas等人(2001)J.Exp.Med.194：481-489；Overwijk等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：2982-2987；Hurwitz,(2000)，上文文獻；Rosenberg及White(1996)J.Immunother Emphasis Tumor Immunol 19(1)：81-4)。因此，可使用抗GITR抗體結合各種自身蛋白考慮以設計疫苗接種方案以有效地生成針對該等自身蛋白之免疫反應用於疾病治療。舉例而言，阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)涉及Aβ肽在腦中類澱粉沈積物中之不適當累積；針對類澱粉之抗體反應能夠清除該等類澱粉沈積物(Schenk等人，(1999)Nature 400：173-177)。
其他自身蛋白亦可用作用於治療過敏及哮喘之靶標(例如IgE)及用於類風濕性關節炎之TNFc。最後，可藉由使用抗GITR抗體誘導對於各種激素之抗體反應。中和對生殖激素之抗體反應可用於避孕。亦可將中和對激素及特定腫瘤之生長所需之其他可溶性因子之抗體反應 視為可能之疫苗接種靶標。
如上文針對抗GITR抗體之使用所述之類似方法可用於誘導治療性自體免疫反應以治療具有其他自身抗原(例如類澱粉沈積物，包括阿茲海默氏病中之Aβ)、細胞介素(例如TNFα)及IgE之不適當累積的患者。
疫苗
本文所述抗GITR抗體可藉由共投與抗GITR抗體與所關注抗原(例如，疫苗)用於刺激抗原特異性免疫反應。因此，本文提供增強對個體中之抗原之免疫反應的方法，其包含向個體投與：(i)抗原；及(ii)抗GITR抗體或其抗原結合部分，使得增強對個體中之抗原之免疫反應。抗體可為人類抗人類GITR抗體(例如本文所述人類抗GITR抗體中之任一者)。另外或或者，抗體可為嵌合或人類化抗體。抗原可為(例如)腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體之抗原。該等抗原之非限制性實例包括彼等論述於上文部分中者，例如上文論述之腫瘤抗原(或腫瘤疫苗)、或來自上述病毒、細菌或其他病原體之抗原。
在某些實施例中，使用包含抗GITR抗體結合之表位之肽或融合蛋白作為疫苗代替抗GITR抗體或除抗GITR抗體外亦使用該肽或融合蛋白。
在活體內及活體外投與本文所述抗體組合物(例如，人類單株抗體、多特異性及雙特異性分子及免疫偶聯物)的適宜途徑為業內所熟知且可由彼等熟習此項技術者選擇。舉例而言，抗體組合物可藉由注射(例如，靜脈內或皮下)投與。所用分子之適宜劑量將端視個體之年齡及體重及抗體組合物之濃度及/或調配物而定。
如前文所述，本文所述抗GITR抗體可與一或多種其他治療劑(例如細胞毒性劑、放射性毒性劑或免疫阻抑劑)共投與。抗體可連接至試劑(呈免疫-複合物形式)或可與試劑分開投與。在後一情形(單獨投 與)中，抗體可在試劑之前、之後或同時投與或可與其他已知療法(例如抗癌療法，例如輻射)共投與。該等治療劑尤其包括抗贅瘤劑，例如多柔比星(doxorubicin)(阿德力黴素(adriamycin))、順鉑、硫酸博來黴素(bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、達卡巴嗪(dacarbazine)及環磷醯胺羥基脲，其自身僅在對患者具有毒性或亞毒性之量下有效。順鉑係以100mg/ml劑量每四週一次靜脈內投與且阿德力黴素係以60-75mg/ml劑量每21天一次靜脈內投與。本文所述抗GITR抗體或其抗原結合片段與化學治療劑之共投與提供兩種抗癌劑，其經由對人類腫瘤細胞產生細胞毒性效應之不同機制起作用。該共投與可解決由於發生對藥物之抗性或可使得腫瘤細胞與抗體不反應之腫瘤細胞之抗原性變化所引起的問題。
包含本文所述抗體組合物(例如，人類抗體、雙特異性或多特異性分子或免疫偶聯物)及使用說明書之套組亦在本文所述範疇內。該套組可進一步含有至少一種額外試劑或一或多種額外本文所述人類抗體(例如，具有互補活性且結合至不同於第一人類抗體之GITR抗原中之表位的人類抗體)。套組通常包括指示套組之內容物之預期用途之標記。術語標記包括套組上供應或與套組一起供應或以其他方式伴隨套組之任何書面或記錄材料。
組合療法
除上文提供之組合療法外，抗GITR抗體(例如彼等本文所述者)亦可用於組合療法(例如)用於治療癌症，如下文所述。
本文提供組合療法之方法，其中抗GITR抗體與一或多種額外試劑(例如小分子藥物、有效刺激免疫反應以藉此進一步增強、刺激或上調個體之免疫反應的抗體或其抗原結合部分)共投與。如實例中所示，向小鼠投與激動劑抗GITR抗體及拮抗劑抗PD-1抗體在抑制腫瘤生長中具有協同效應。
通常，例如本文所述抗GITR抗體可與以下物質組合：(i)刺激性(例如，共刺激)分子(例如，受體或配體)之激動劑及/或(ii)免疫細胞(例如T細胞)上之抑制性信號或分子(例如，受體或配體)之拮抗劑，二者皆可擴增免疫反應(例如抗原特異性T細胞反應)。在某些態樣中，免疫-腫瘤藥劑係(i)刺激性(包括共刺激)分子(例如，受體或配體)之激動劑或(ii)涉及先天免疫性之細胞(例如NK細胞)上之抑制性(包括共抑制性)分子(例如，受體或配體)的拮抗劑，且其中免疫-腫瘤藥劑增強先天免疫性。該等免疫-腫瘤藥劑通常稱作免疫檢查點調節劑，例如免疫檢查點抑制劑或免疫檢查點刺激劑。
在某些實施例中，抗GITR抗體與靶向作為免疫球蛋白超家族(IgSF)之成員之刺激性或抑制性分子的試劑一起投與。舉例而言，例如本文所述抗GITR抗體可與靶向IgSF家族之成員以增加免疫反應之試劑一起投與個體。舉例而言，抗GITR抗體可與靶向(或特異性結合至)膜結合之配體之B7家族之成員(其包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)及B7-H6)或特異性結合至B7家族成員之共刺激性或共抑制性受體的試劑一起投與。
抗GITR抗體亦可與靶向分子(配體或受體)之TNF及TNFR家族之成員之試劑一起投與，該等試劑係例如CD40及CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDA1、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α 1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY及NGFR(例如，參見 Tansey(2009)Drug Discovery Today 00：1)。
可由本文所述抗GITR抗體(例如28F3.IgG1及28F3.IgG1.1)與以下試劑中之一或多者之組合刺激T細胞反應：(1)抑制T細胞活化之蛋白質之拮抗劑(抑制劑或阻斷劑)(例如，免疫檢查點抑制劑)，例如如上文所述CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2及LAG-3及以下蛋白質中之任一者：TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1及TIM-4；及/或(2)刺激T細胞活化之蛋白質之激動劑，例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、CD27、CD40、DR3及CD28H。
調節上述蛋白質中之任一者且可與激動劑抗GITR抗體(例如彼等本文所述者)組合用於治療癌症之實例性藥劑包括：YervoyTM(伊匹單抗(ipilimumab))或曲美目單抗(Tremelimumab)(針對CTLA-4)、加利昔單抗(galiximab)(針對B7.1)、BMS-936558(針對PD-1)、MK-3475(針對PD-1)、AMP224(針對B7DC)、BMS-936559(針對B7-H1)、MPDL3280A(針對B7-H1)、MEDI-570(針對ICOS)、AMG557(針對B7H2)、MGA271(針對B7H3)、IMP321(針對LAG-3)、BMS-663513(針對CD137)、PF-05082566(針對CD137)、CDX-1127(針對CD27)、抗OX40(Providence Health Services)、huMAbOX40L(針對OX40L)、阿塞西普(Atacicept)(針對TACI)、CP-870893(針對CD40)、魯卡木單抗(Lucatumumab)(針對CD40)、達西珠單抗(Dacetuzumab)(針對CD40)、莫羅單抗-CD3(Muromonab-CD3)(針對CD3)、伊匹單抗(針對CTLA-4)。
抗GITR抗體亦可與匹利珠單抗(pidilizumab)(CT-011)一起投與， 但其對PD-1結合之特異性已受到質疑。
可與激動劑抗GITR抗體組合用於治療癌症之其他分子包括NK細胞上之抑制性受體之拮抗劑或NK細胞上之活化受體之激動劑。舉例而言，抗GITR激動劑抗體可與KIR之拮抗劑(例如，利利單抗)組合。
T細胞活化亦由可溶性細胞介素調控，且抗GITR抗體可與抑制T細胞活化之細胞介素之拮抗劑或刺激T細胞活化之細胞介素之激動劑一起投與(例如)患有癌症之個體。
在某些實施例中，抗GITR抗體可與以下物質組合使用：(i)抑制T細胞活化之IgSF家族或B7家族或TNF家族之蛋白質之拮抗劑(或抑制劑或阻斷劑)或抑制T細胞活化之細胞介素之拮抗劑(例如，IL-6、IL-10、TGF-ß、VEGF；「免疫阻抑性細胞介素」)及/或(ii)刺激T細胞活化之IgSF家族、B7家族或TNF家族之刺激性受體或細胞介素的激動劑，其用於刺激免疫反應、例如用於治療增殖疾病(例如癌症)。
用於組合療法之再一些藥劑包括抑制或耗盡巨噬細胞或單核球之藥劑，包括(但不限於)CSF-1R拮抗劑，例如CSF-1R拮抗劑抗體，包括RG7155(WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、WO13/87699、WO13/119716、WO13/132044)或FPA-008(WO11/140249；WO13169264；WO14/036357)。
抗GITR抗體亦可與抑制TGF-β信號傳導之藥劑一起投與。
可與抗GITR抗體組合之額外藥劑包括增強腫瘤抗原呈遞之藥劑，例如樹突細胞疫苗、GM-CSF分泌細胞疫苗、CpG寡核苷酸及咪喹莫特(imiquimod)，或增強腫瘤細胞之免疫原性之療法(例如，蒽環)。
可與抗GITR抗體組合之再一些療法包括耗盡或阻斷Treg細胞之療法，例如特異性結合至CD25之藥劑。
可與抗GITR抗體組合之另一療法係抑制抑制代謝酶(例如吲哚胺 加雙氧酶(IDO)、加雙氧酶、精胺酸酶或一氧化氮合成酶)之療法。
可與抗GITR抗體一起使用之另一類藥劑包括抑制腺苷形成或抑制腺苷A2A受體之藥劑。
可與抗GITR抗體組合用於治療癌症之其他療法包括逆轉/防止T細胞無反應或耗竭之療法及在腫瘤位點處觸發先天免疫活化及/或發炎的療法。
抗GITR抗體可與一種以上免疫-腫瘤藥劑組合，且可(例如)與靶向免疫路徑之多個要素之組合方法組合，例如以下中之一或多者：增強腫瘤抗原呈遞之療法(例如，樹突細胞疫苗、GM-CSF分泌細胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特)；藉由(例如)抑制CTLA-4及/或PD1/PD-L1/PD-L2路徑及/或耗盡或阻斷Treg或其他免疫阻抑細胞抑制陰性免疫調控之療法；利用(例如)刺激CD-137、OX-40及/或GITR路徑及/或刺激T細胞效應物功能之激動劑刺激陽性免疫調控的療法；全身性增加抗腫瘤T細胞之頻率的療法；使用(例如)CD25之拮抗劑(例如，達利珠單抗(daclizumab))或藉由離體抗CD25珠粒耗盡來耗盡或抑制Treg(例如腫瘤中之Treg)的療法；影響腫瘤中之阻抑劑骨髓細胞之功能的療法；增強腫瘤細胞之免疫原性之療法(例如，蒽環)；包括經遺傳修飾之細胞(例如由嵌合抗原受體修飾之細胞)的授受性T細胞或NK細胞轉移(CAR-T療法)；抑制代謝酶(例如吲哚胺加雙氧酶(IDO)、加雙氧酶、精胺酸酶或一氧化氮合成酶)之療法；逆轉/防止T細胞無反應或耗竭之療法；在腫瘤位點處觸發先天免疫活化及/或發炎之療法；投與免疫刺激性細胞介素；或阻斷免疫抑制性細胞介素。
本文所述激動劑抗GITR抗體可與以下試劑中之一或多者一起使用：接合陽性共刺激性受體之激動試劑、減弱經由抑制性受體信號傳導之阻斷劑、拮抗劑及一或多種全身性增加抗腫瘤T細胞之頻率之藥劑、克服腫瘤微環境內之不同免疫阻抑性路徑(例如，阻斷抑制性受 體接合(例如，PD-L1/PD-1相互作用)、耗盡或抑制Treg(例如，使用抗CD25單株抗體(例如，達利珠單抗)或藉由離體抗CD25珠粒耗盡)、抑制代謝酶(例如IDO)或逆轉/防止T細胞無反應或耗竭)的藥劑及在腫瘤位點處觸發先天免疫活化及/或發炎之藥劑。
在某些實施例中，若個體係BRAF V600突變陽性，則將抗GITR抗體與BRAF抑制劑一起投與個體。
在某些實施例中，與另一免疫刺激性抗體一起投與之抗GITR抗體係本文所述抗體。在某些實施例中，與另一免疫刺激性抗體一起投與之抗GITR抗體係具有6C8之CDR序列之抗體，例如具有6C8之CDR之人類化抗體，如(例如)WO2006/105021中所述；包含WO2011/028683中所述之抗GITR抗體之CDR的抗體；包含JP2008278814中所述之抗GITR抗體之CDR的抗體、包含WO2015/031667中所述之抗GITR抗體之CDR的抗體或本文中闡述或提及之其他抗GITR抗體。
本文提供刺激個體中之免疫反應之方法，其包含向個體投與激動劑抗GITR分子，例如抗體及一或多種額外免疫刺激性抗體，例如抗PD-1拮抗劑(例如拮抗劑抗體)、抗PD-L1拮抗劑(例如拮抗劑抗體)、拮抗劑抗CTLA-4拮抗劑(例如拮抗劑抗體)及/或抗LAG3拮抗劑(例如拮抗劑抗體)，使得在個體中刺激免疫反應，以(例如)抑制腫瘤生長或刺激抗病毒反應。在一個實施例中，向個體投與激動劑抗GITR抗體及拮抗劑抗PD-1抗體。在一個實施例中，向個體投與激動劑抗GITR抗體及拮抗劑抗PD-L1抗體。在一個實施例中，向個體投與激動劑抗GITR抗體及拮抗劑抗CTLA-4抗體。在一個實施例中，抗GITR抗體係人類抗體，例如本文所述抗體。或者，抗GITR抗體可為(例如)嵌合或人類化抗體(例如，自小鼠抗GITR mAb製備)，例如彼等於本文中進一步闡述者。在一個實施例中，至少一種額外免疫刺激性 抗體(例如，拮抗劑抗PD-1、拮抗劑抗PD-L1、拮抗劑抗CTLA-4及/或拮抗劑抗LAG3抗體)係人類抗體。或者，至少一種額外免疫刺激性抗體可為(例如)嵌合或人類化抗體(例如，自小鼠抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4及/或抗LAG3抗體製備)。
本文提供治療過度增殖疾病(例如，癌症)之方法，其包含向個體投與激動劑抗GITR抗體及拮抗劑PD-1抗體。在某些實施例中，抗GITR抗體係以亞治療劑量投與，抗PD-1抗體係以亞治療劑量投與，或二者皆係以亞治療劑量投與。本文亦提供改變與用免疫刺激劑治療過度增殖疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與抗GITR抗體及亞治療劑量之抗PD-1抗體。在某些實施例中，個體係人類。在某些實施例中，抗PD-1抗體係人類序列單株抗體且抗GITR抗體係人類序列單株抗體，例如包含本文所述28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10(例如，28F3.IgG1或28F3.IgG1.1)或本文所述另一激動劑抗GITR抗體之CDR或可變區的抗體。
適用於本文所述方法中之PD-1拮抗劑包括(但不限於)配體、抗體(例如，單株抗體及雙特異性抗體)及多價試劑。在一個實施例中，PD-1拮抗劑係融合蛋白，例如Fc融合蛋白，例如AMP-244。在一個實施例中，PD-1拮抗劑係抗PD-1或抗PD-L1抗體。
實例性抗PD-1抗體係尼沃魯單抗(nivolumab)(BMS-936558)或包含WO 2006/121168中所述之抗體17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4及4A11中之一者之CDR或可變區的抗體。在某些實施例中，抗PD1抗體係WO2012/145493中所述之MK-3475(蘭布魯珠單抗(Lambrolizumab))；及WO 2012/145493中所述AMP-514。其他已知PD-1抗體及其他PD-1抑制劑包括彼等闡述於WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2011/066389、WO 2011/161699、 WO 2012/145493、美國專利第7,635,757號及第8,217,149號及美國專利公開案第2009/0317368號中者。亦可使用WO2013/173223中所述之抗PD-1抗體中之任一者。與該等抗體中之一者競爭結合及/或結合至與該等抗體中之一者相同之PD-1上之表位的抗PD-1抗體亦可用於組合治療。靶向PD-1受體之另一方法係由稠合至IgG1之Fc部分之PD-L2(B7-DC)的細胞外結構域構成的重組蛋白，稱作AMP-224。
在某些實施例中，抗PD-1抗體以5×10-8M或更小之KD結合至人類PD-1，以1×10-8M或更小之KD結合至人類PD-1，以5×10-9M或更小之KD結合至人類PD-1，或以介於1×10-8M與1×10-10M之間或更小之KD結合至人類PD-1。
本文提供治療過度增殖疾病(例如，癌症)之方法，其包含向個體投與激動劑抗GITR抗體及拮抗劑PD-L1抗體。在某些實施例中，抗GITR抗體係以亞治療劑量投與，抗PD-L1抗體係以亞治療劑量投與，或二者皆係以亞治療劑量投與。本文提供改變與用免疫刺激劑治療過度增殖疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與抗GITR抗體及亞治療劑量之抗PD-L1抗體。在某些實施例中，個體係人類。在某些實施例中，抗PD-L1抗體係人類序列單株抗體且抗GITR抗體係人類序列單株抗體，例如包含本文所述28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10(例如，28F3.IgG1或28F3.IgG1.1)或本文所述另一激動劑抗GITR抗體之CDR或可變區的抗體。
在一個實施例中，抗PD-L1抗體係BMS-936559(在WO 2007/005874及美國專利第7,943,743號中稱作12A4)、或包含闡述於PCT公開案WO 07/005874及美國專利第7,943,743號中之3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7及13G4之CDR或可變區的抗體。在某一實施例中，抗PD-L1抗體係MEDI4736(亦稱 作抗B7-H1)、MPDL3280A(亦稱作RG7446)、MSB0010718C(WO2013/79174)或rHigM12B7。亦可使用WO2013/173223、WO2011/066389、WO2012/145493、美國專利第7,635,757號及第8,217,149號及美國公開案第2009/145493號中揭示之抗PD-L1抗體中之任一者。與該等抗體中之任一者競爭及/或結合至相同表位之抗PD-L1抗體亦可用於組合治療。
在某些實施例中，抗PD-L1抗體以5×10-8M或更小之KD結合至人類PD-L1，以1×10-8M或更小之KD結合至人類PD-L1，以5×10-9M或更小之KD結合至人類PD-L1，或以介於1×10-8M與1×10-10M之間或更小之KD結合至人類PD-L1。
本文提供治療過度增殖疾病(例如，癌症)之方法，其包含向個體投與本文所述抗GITR抗體及CTLA-4拮抗劑抗體。在某些實施例中，抗GITR抗體係以亞治療劑量投與，抗CTLA-4抗體係以亞治療劑量投與，或二者皆係以亞治療劑量投與。本文提供改變與用免疫刺激劑治療過度增殖疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與抗GITR抗體及亞治療劑量之抗CTLA-4抗體。在某些實施例中，個體係人類。在某些實施例中，抗CTLA-4抗體係選自以下之群之抗體：YervoyTM(伊匹單抗或抗體10D1，闡述於PCT公開案WO 01/14424中)、曲美目單抗(先前稱作替西莫單抗(ticilimumab)，CP-675,206)、闡述於以下公開案中之任一者中之單株或抗CTLA-4抗體：WO 98/42752；WO 00/37504；美國專利第6,207,156號；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17)：10067-10071；Camacho等人(2004)J.Clin.Oncology 22(145)：摘要號2505(抗體CP-675206)；及Mokyr等人(1998)Cancer Res.58：5301-5304。亦可使用WO2013/173223中揭示之抗CTLA-4抗體中之任一者。
在某些實施例中，抗CTLA-4抗體以5×10-8M或更小之KD結合至 人類CTLA-4，以1×10-8M或更小之KD結合至人類CTLA-4，以5×10-9M或更小之KD結合至人類CTLA-4，或以介於1×10-8M與1×10-10M之間或更小之KD結合至人類CTLA-4。
本文提供治療過度增殖疾病(例如，癌症)之方法，其包含向個體投與抗GITR抗體及抗LAG-3抗體。在其他實施例中，抗GITR抗體係以亞治療劑量投與，抗LAG-3抗體係以亞治療劑量投與，或二者皆係以亞治療劑量投與。本文提供改變與用免疫刺激劑治療過度增殖疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與抗GITR抗體及亞治療劑量之抗LAG-3抗體。在某些實施例中，個體係人類。在某些實施例中，抗PD-L1抗體係人類序列單株抗體且抗GITR抗體係人類序列單株抗體，例如包含本文所述28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、或6G10(例如，28F3.IgG1或28F3.IgG1.1)或本文所述另一激動劑抗GITR抗體之CDR或可變區的抗體。抗LAG3抗體之實例包括包含闡述於美國專利公開案第US2011/0150892號、第WO10/19570號及第WO2014/008218號中之抗體25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5之CDR或可變區的抗體。在一個實施例中，抗LAG-3抗體係BMS-986016。可使用之其他業內公認之抗LAG-3抗體包括闡述於US 2011/007023、WO08/132601及WO09/44273中之IMP731及IMP-321。與該等抗體中之任一者競爭及/或結合至相同表位之抗LAG-3抗體亦可用於組合治療。
在某些實施例中，抗LAG-3抗體以5×10-8M或更小之KD結合至人類LAG-3，以1×10-8M或更小之KD結合至人類LAG-3，以5×10-9M或更小之KD結合至人類LAG-3，或以介於1×10-8M與1×10-10M之間或更小之KD結合至人類LAG-3。
向一或多種第二靶抗原(例如LAG-3及/或CTLA-4及/或PD-1及/或 PD-L1)投與本文所述抗GITR抗體及拮抗劑(例如拮抗劑抗體)可增強對患者中癌細胞之免疫反應。可使用本發明抗體抑制生長之癌症包括通常對免疫療法有反應之癌症及彼等通常對免疫療法無反應者。利用本發明之組合療法治療之癌症之代表性實例包括本文所列舉之彼等癌症。
在某些實施例中，本文論述之治療抗體之組合可以單一組合物形式在醫藥上可接受之載劑中同時投與，或以單獨組合物形式與每一抗體在醫藥上可接受之載劑中同時投與。在另一實施例中，治療抗體之組合可依序投與。舉例而言，抗CTLA-4抗體及抗GITR抗體可依序投與，例如首先投與抗CTLA-4抗體且第二投與抗GITR抗體，或首先投與抗GITR抗體且第二投與抗CTLA-4抗體。另外或或者，抗PD-1抗體及抗GITR抗體可依序投與，例如首先投與抗PD-1抗體且第二投與抗GITR抗體，或首先投與抗GITR抗體且第二投與抗PD-1抗體。另外或或者，抗PD-L1抗體及抗GITR抗體可依序投與，例如首先投與抗PD-L1抗體且第二投與抗GITR抗體，或首先投與抗GITR抗體且第二投與抗PD-L1抗體。另外或或者，抗LAG-3抗體及抗GITR抗體可依序投與，例如首先投與抗LAG-3抗體且第二投與抗GITR抗體，或首先投與抗GITR抗體且第二投與抗LAG-3抗體。
此外，若依序投與組合療法之一個以上劑量，則依序投與之次序可在投與之每一時間點逆轉或保持相同次序，依序投與可與同時投與組合，或其任一組合。舉例而言，首先投與抗CTLA-4抗體與抗GITR抗體之組合可為同時的，第二投與可為依序的(其中首先抗CTLA-4抗體且第二抗GITR抗體)，且第三投與可為依序的(其中首先抗GITR抗體且第二抗CTLA-4抗體)等。另外或或者，首先投與抗PD-1抗體與抗GITR抗體之組合可為同時的，第二投與可為依序的(其中首先抗PD-1抗體且第二抗GITR抗體)，且第三投與可為依序的(其中首 先抗GITR抗體且第二抗PD-1抗體)等。另外或或者，首先投與抗PD-L1抗體與抗GITR抗體之組合可為同時的，第二投與可為依序的(其中首先抗PD-L1抗體且第二抗GITR抗體)，且第三投與可為依序的(其中首先抗GITR抗體且第二抗PD-L1抗體)等。另外或或者，首先投與抗LAG-3抗體與抗GITR抗體之組合可為同時的，第二投與可為依序的(其中首先抗LAG-3抗體且第二抗GITR抗體)，且第三投與可為依序的(其中首先抗GITR抗體且第二抗LAG-3抗體)等。另一代表性投藥方案可涉及依序首先投與，其中首先抗GITR且第二抗CTLA-4抗體(及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或抗LAG-3抗體)，且隨後投與可為同時的。
在一個實施例中，藉由投與向患有可受益於免疫系統之刺激之疾病(例如癌症或傳染病)之個體投與抗GITR抗體及免疫-腫瘤藥劑治療該個體，其中免疫-腫瘤藥劑係CD137(4-1BB)激動劑，例如激動性CD137抗體。適宜CD137抗體包括(例如)烏瑞魯單抗(urelumab)或PF-05082566(WO12/32433)。
在一個實施例中，藉由投與向患有可受益於免疫系統之刺激之疾病(例如癌症或傳染病)之個體投與抗GITR抗體及免疫-腫瘤藥劑治療該個體，其中免疫-腫瘤藥劑係OX40激動劑，例如激動性OX40抗體。適宜OX40抗體包括(例如)MEDI-6383、MEDI-6469或MOXR0916(RG7888；WO06/029879)。
在一個實施例中，藉由向患有可受益於免疫系統之刺激之疾病(例如癌症或傳染病)之個體投與抗GITR抗體及免疫-腫瘤藥劑治療該個體，其中免疫-腫瘤藥劑係CD40激動劑，例如激動性CD40抗體。在某些實施例中，免疫-腫瘤藥劑係CD40拮抗劑，例如拮抗性CD40抗體。適宜CD40抗體包括(例如)魯卡木單抗(HCD122)、達西珠單抗(SGN-40)、CP-870,893或Chi Lob 7/4。
在一個實施例中，藉由向患有可受益於免疫系統之刺激之疾病(例如癌症或傳染病)之個體投與抗GITR抗體及免疫-腫瘤藥劑治療該個體，其中免疫-腫瘤藥劑係CD27激動劑，例如激動性CD27抗體。適宜CD27抗體包括(例如)瓦利路單抗(varlilumab)(CDX-1127)。
在一個實施例中，藉由向患有可受益於免疫系統之刺激之疾病(例如癌症或傳染病)之個體投與抗GITR抗體及免疫-腫瘤藥劑治療該個體，其中免疫-腫瘤藥劑係MGA271(針對B7H3)(WO11/109400)。
在一個實施例中，藉由向患有可受益於免疫系統之刺激之疾病(例如癌症或傳染病)之個體投與抗GITR抗體及免疫-腫瘤藥劑治療該個體，其中免疫-腫瘤藥劑係KIR拮抗劑，例如利利單抗(lirilumab)。
在一個實施例中，藉由向患有可受益於免疫系統之刺激之疾病(例如癌症或傳染病)之個體投與抗GITR抗體及免疫-腫瘤藥劑治療該個體，其中免疫-腫瘤藥劑係IDO拮抗劑。適宜IDO拮抗劑包括(例如)INCB-024360(WO2006/122150、WO07/75598、WO08/36653、WO08/36642)、吲哚西莫(indoximod)、NLG-919(WO09/73620、WO09/1156652、WO11/56652、WO12/142237)或F001287。
在一個實施例中，藉由向患有可受益於免疫系統之刺激之疾病(例如癌症或傳染病)之個體投與抗GITR抗體及免疫-腫瘤藥劑治療該個體，其中免疫-腫瘤藥劑係類鐸(Toll-like)受體激動劑，例如TLR2/4激動劑(例如，卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin))；TLR7激動劑(例如，海特諾(Hiltonol)或咪喹莫特)；TLR7/8激動劑(例如，雷西莫特(Resiquimod))；或TLR9激動劑(例如，CpG7909)。
在一個實施例中，藉由向患有可受益於免疫系統之刺激之疾病(例如癌症或傳染病)之個體投與抗GITR抗體及免疫-腫瘤藥劑治療該個體，其中免疫-腫瘤藥劑係TGF-β抑制劑，例如GC1008、LY2157299、TEW7197或IMC-TR1。
在一個態樣中，抗GITR抗體係在投與第二藥劑(例如免疫-腫瘤藥劑)之前依序投與。在一個態樣中，抗GITR抗體係與第二藥劑例如免疫-腫瘤藥劑)同時投與。在再一態樣中，抗GITR抗體係在投與第二藥劑後依序投與。兩種藥劑之投與可以間隔(例如)30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、3小時、6小時、12小時、24小時、36小時、48小時、3天、5天、7天或一或多個週之時間開始，或第二藥劑之投與可在投與第一藥劑後(例如)30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、3小時、6小時、12小時、24小時、36小時、48小時、3天、5天、7天或一或多個週開始。
在某些態樣中，抗GITR抗體及第二藥劑(例如免疫-腫瘤藥劑)係同時投與，例如在(例如)30分鐘或60分鐘之時段內向患者同時輸注。抗GITR抗體可與第二藥劑(例如免疫-腫瘤藥劑)共調配。
視情況，作為單獨免疫治療劑之抗GITR或抗GITR抗體與一或多種額外免疫治療抗體(例如，抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3阻斷)之組合可進一步與免疫原試劑(例如癌細胞、純化腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽及碳水化合物分子)、細胞及經編碼免疫刺激細胞介素之基因轉染之細胞)組合(He等人(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可使用之腫瘤疫苗之非限制性實例包括黑色素瘤抗原之肽(例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪胺酸酶之肽)、或經轉染以表現細胞介素GM-CSF之腫瘤細胞(下文進一步論述)。組合之GITR活化及一或多種額外抗體(例如，CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷)亦可進一步與標準癌症治療組合。舉例而言，組合之GITR活化及一或多種額外抗體(例如，CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷)可與化學治療方案有效地組合。在該等情況下，可減少與本發明之組合一起投與之化學治療試劑之劑量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。該組合之實例 係具有或無額外抗體(例如抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或抗LAG-3抗體)之抗GITR激動劑抗體之組合，其進一步與氨烯咪胺組合用於治療黑色素瘤。另一實例係具有或無抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或LAG-3抗體之抗GITR抗體之組合，其進一步與介白素-2(IL-2)組合用於治療黑色素瘤。支持GITR活化及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷與化學療法之組合使用之科學原理係細胞死亡，其係大部分化學治療化合物之細胞毒性作用的結果，應在抗原呈遞路徑中產生增加之腫瘤抗原含量。可經由細胞死亡與具有或無CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷之組合GITR活化產生協同作用之其他組合療法包括輻射、手術或激素剝奪。該等方案中之每一者皆在宿主中產生腫瘤抗原之來源。血管生成抑制劑亦可與組合之GITR活化及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷組合。血管生成之抑制導致腫瘤細胞死亡，其可為餵入宿主抗原呈遞路徑中之腫瘤抗原之來源。
作為單獨免疫治療劑之抗GITR激動劑抗體或GITR激動性及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3封阻抗體之組合亦可與將表現Fcα或Fcγ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性抗體組合使用(例如，參見美國專利第5,922,845號及第5,837,243號)。雙特異性抗體可用於靶向兩種單獨抗原。可藉由使用組合之GITR活化及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷加強該等反應之T細胞臂。
在另一實例中，作為單獨免疫治療劑之抗GITR激動劑抗體或抗GITR抗體與額外免疫刺激劑(例如抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或LAG-3試劑，例如抗體)之組合可結合抗贅瘤抗體(例如Rituxan®(利妥昔單抗)、Herceptin®(曲妥珠單抗)、Bexxar®(托西莫單抗(tositumomab))、Zevalin®(替伊莫單抗(ibritumomab))、Campath®(阿倫單抗)、Lymphocide®(依帕珠單抗(eprtuzumab))、 Avastin®(貝伐珠單抗(bevacizumab))及Tarceva®(厄洛替尼(erlotinib))及諸如此類)使用。舉例而言且不希望受限於理論，用抗癌抗體或偶聯至毒素之抗癌抗體之治療可導致癌細胞死亡(例如，腫瘤細胞)，其可增強由免疫刺激劑(例如GITR、CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3試劑，例如抗體)介導之免疫反應。在實例性實施例中，過度增殖疾病(例如，癌症腫瘤)之治療可包括抗癌劑(例如抗體)與抗GITR及視情況額外免疫刺激劑(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3試劑，例如抗體)之組合，其同時或依序或其任一組合，其可增強由宿主之抗腫瘤免疫反應。
腫瘤藉由多種機制逃避宿主免疫監督。許多該等機制可藉由由腫瘤表現且具有免疫阻抑性之蛋白質之不活化來克服。該等機制尤其包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163：1037-1050)、IL-10(Howard及O'Garra(1992)Immunology Today 13：198-200)及Fas配體(Hahne等人(1996)Science 274：1363-1365)。針對該等實體中之每一者之抗體可進一步與具有或無額外免疫刺激劑(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3試劑，例如抗體)之抗GITR抗體組合，以消除免疫阻抑劑之效應並幫助由宿主之抗腫瘤免疫反應。
可用於活化宿主免疫反應之其他試劑(例如抗體)可進一步與具有或無額外免疫刺激劑(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗體)之抗GITR抗體組合使用。該等抗體包括樹突細胞表面上之分子，其活化DC功能及抗原呈遞。抗CD40抗體(Ridge等人，上文文獻)可結合抗GITR抗體及視情況額外免疫刺激劑(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3試劑，例如抗體)使用。針對T細胞共刺激性分子之其他活化抗體(Weinberg等人，上文文獻；Melero等人，上文文獻；Hutloff等人，上文文獻)亦可提供增加之T細胞活化程度。
如上文所論述，目前正使用骨髓移植以治療多種造血性起源之腫瘤。單獨或與CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷組合之抗GITR免疫療法可用於增加移入腫瘤特異性T細胞中之供體之有效性。
若干實驗治療方案涉及抗原特異性T細胞之離體活化及擴增，及該等細胞授受性轉移(adoptive transfer)至接受者中，以刺激對抗腫瘤之抗原特異性T細胞(Greenberg及Riddell，上文文獻)。該等方法亦可用於活化T細胞對感染物(例如CMV)之反應。可預期在採用或不採用額外免疫刺激療法(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗體)下，於抗GITR存在下之離體活化可增加授受性轉移之T細胞之頻率及活性。
本文提供改變與使用免疫刺激劑治療過度增殖疾病(例如癌症)相關之不良事件的方法，包含向個體投與具有或沒有抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3試劑(例如抗體)之抗GITR抗體。舉例而言，本文所述方法提供藉由向患者投與非吸收性類固醇來降低免疫刺激性治療性抗體所誘導之結腸炎或腹瀉之發病率的方法。如本文所用，「非吸收性類固醇」係展現高度首渡代謝效應之糖皮質激素，使得在肝中代謝後，類固醇之生物利用度低，即小於約20%。在本文所述之一個實施例中，非吸收性類固醇係布地奈德(budesonide)。布地奈德係一種局部作用之糖皮質類固醇，在經口投與後，其主要被肝高度代謝。ENTOCORT EC®(Astra-Zeneca)係布地奈德之pH-及時間依賴性口服調配物，其經研發以最佳化藥物遞送至回腸及整個結腸。ENTOCORT EC®在美國經批准用於治療涉及回腸及/或升結腸之輕度至中度克羅恩氏病(Crohn's disease)。用於治療克羅恩氏病之ENTOCORT EC®之常見經口劑量係6mg/天至9mg/天。ENTOCORT EC®在腸中釋放，之後吸收並保留於腸黏膜中。一旦其穿過腸黏膜靶 組織，ENTOCORT EC®即被肝中細胞色素P450系統高度代謝成幾乎沒有糖皮質激素活性之代謝物。因此，生物利用度低(約10%)。與具有較低度首渡代謝效應之其他糖皮質激素相比，布地奈德之低生物利用度產生改良之治療比率。相較於全身作用性皮質類固醇，布地奈德產生較少不利效應，包括較少下丘腦-垂體阻抑性。然而，長期投與ENTOCORT EC®可引起全身性糖皮質激素效應，例如腎上腺功能亢進及腎上腺阻抑。參見PDR，第58版，2004；608-610。
在再一些實施例中，具有或無CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷(即，免疫刺激性治療抗體抗GITR及視情況抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗體)之GITR活化以及非吸收性類固醇可進一步與柳酸鹽組合。柳酸鹽包括5-ASA試劑，例如；磺胺塞拉金(sulfasalazine)(AZULFIDINE®,Pharmacia & UpJohn)；奧沙拉秦(olsalazine)(DIPENTUM®,Pharmacia & UpJohn)；巴柳氮(balsalazide)(COLAZAL®,Salix Pharmaceuticals公司)；及美沙拉秦(mesalamine)(ASACOL®,Procter & Gamble Pharmaceuticals；PENTASA®,Shire US；CANASA®,Axcan Scandipharm公司；ROWASA®,Solvay)。
根據本文所述方法，出於降低由免疫刺激性抗體誘導之結腸炎之發病率的目的，與具有或無抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或LAG-3抗體之抗GITR及非吸收性類固醇組合投與之柳酸鹽可包括柳酸鹽及非吸收性類固醇之任何重疊或依序投與。因此，例如，用於降低由本文所述免疫刺激性抗體誘導之結腸炎之發病率的方法涵蓋同時或依序投與柳酸鹽及非吸收性類固醇(例如，在非吸收性類固醇6小時後投與柳酸鹽)或其任一組合。此外，柳酸鹽及非吸收性類固醇可藉由相同途徑投與(例如，二者皆係經口投與)或藉由不同途徑投與(例如，柳酸鹽係經口投與且非吸收性類固醇係經直腸投與)，其可不同 於用於投與抗GITR及抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗體之途徑。
本文所述抗GITR抗體及組合抗體療法亦可結合其他熟知療法使用，該等熟知療法針對其針對所治療適應症(例如癌症)之特定有用性進行選擇。本文所述抗GITR抗體之組合可與已知醫藥上可接受之藥劑依序使用。
舉例而言，本文所述抗GITR抗體及組合抗體療法可與額外治療(例如輻照、化學療法(例如，使用喜樹鹼(camptothecin)(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、順鉑、多柔比星、伊立替康(irinotecan)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑、太平洋紫杉醇、卡鉑-太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多柔比星、5-fu或喜樹鹼+apo21/TRAIL(6X combo))、一或多種蛋白酶體抑制劑(例如，硼替佐米(bortezomib)或MG132)、一或多種Bcl-2抑制劑(例如，BH3I-2’(bcl-xl抑制劑)、吲哚胺加雙氧酶-1抑制劑(例如，INCB24360、吲哚西莫、NLG-919或F001287)、AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奧巴克拉(obatoclax))或MCL-1(類骨髓性白血病細胞分化蛋白-1)拮抗劑)、iAP(細胞凋亡蛋白之抑制劑)拮抗劑(例如，smac7、smac4、小分子smac模擬物、合成smac肽(參見Fulda等人，Nat Med 2002；8：808-15)、ISIS23722(LY2181308)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(組織蛋白去乙醯酶)抑制劑、抗CD20抗體(例如，利妥昔單抗)、血管生成抑制劑(例如，貝伐珠單抗)、靶向VEGF及VEGFR之抗血管生成劑(例如，癌思停(Avastin))、合成三萜系化合物(參見Hyer等人，Cancer Research 2005；65：4799-808)、c-FLIP(細胞FLICE-抑制性蛋白)調節劑(例如，PPARγ(過氧化體增殖子-活化受體γ)之天然及合成配體、5809354或5569100)、激酶抑制劑(例如，索拉菲尼(Sorafenib))、曲妥珠單抗、西妥昔單抗、替 西羅莫司(Temsirolimus)、mTOR抑制劑(例如雷帕黴素(rapamycin)及替西羅莫司、硼替佐米、JAK2抑制劑、HSP90抑制劑、PI3K-AKT抑制劑、來那度胺(Lenalildomide)、GSK3β抑制劑、IAP抑制劑及/或遺傳毒性藥物組合使用(例如同時或分開))。
本文所述抗GITR抗體及組合抗體療法可進一步與一或多種抗增殖細胞毒性劑組合使用。可用作抗增殖細胞毒性劑之化合物之類別包括(但不限於)以下：烷基化劑(包括但不限於氮芥(nitrogen mustards)、次乙亞胺衍生物、磺酸烷基酯、亞硝基脲及三氮烯)：尿嘧啶氮芥、甲川氯(Chlormethine)、環磷醯胺(CYTOXANTM)愛斯達(fosfamide)、美法侖(Melphalan)、氮芥苯丁酸(Chlorambucil)、哌泊溴烷(Pipobroman)、(Triethylenemelamine)、三乙烯硫代磷醯胺、白消安(Busulfan)、卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、鏈脲菌素(Streptozocin)、達卡巴嗪及替莫唑胺(Temozolomide)。
抗代謝物(包括但不限於葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷去胺酶抑制劑)：胺甲喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷(Floxuridine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、磷酸氟達拉濱(Fludarabine phosphate)、噴司他汀(Pentostatine)及吉西他濱。
除業內已知之其他微管蛋白穩定劑外，適於與激動劑抗GITR抗體組合之抗增殖劑包括但不限於紫杉烷、太平洋紫杉醇(太平洋紫杉醇係以TAXOLTM購得)、多西他賽(docetaxel)、盤皮海綿內酯(discodermolide)(DDM)、地特斯他汀(dictyostatin)(DCT)、培洛賽德A(Peloruside A)、埃博黴素、埃博黴素A、埃博黴素B、埃博黴素C、埃博黴素D、埃博黴素E、埃博黴素F、呋喃埃博黴素D(furanoepothilone D)、去氧埃博黴素Bl、[17]-脫氫去氧埃博黴素B、 [18]脫氫去氧埃博黴素B、C12,13-環丙基-埃博黴素A、C6-C8橋接埃博黴素A、反式-9,10-脫氫埃博黴素D、順式-9,10-脫氫埃博黴素D、16-去甲基埃博黴素B、埃博黴素B10、盤皮海綿內酯、帕土匹龍(patupilone)(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(盤皮海綿內酯)、TZT-1027(索博列多汀(soblidotin))、ILX-651(鹽酸泰絲多汀(tasidotin hydrochloride))、軟海綿素B(Halichondrin B)、甲磺酸埃雷布林(Eribulin mesylate)(E-7389)、哈米特林(Hemiasterlin)(HTI-286)、E-7974、念珠藻素(Cyrptophycin)、LY-355703、類美登素(Maytansinoid)免疫偶聯物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(伊匹尼塞(ispinesib))、SB-743921、MK-0731、STA-5312、軟珊瑚醇(eleutherobin)、17β-乙醯氧基-2-乙氧基-6-側氧基-B-均-雌-1,3,5(10)-三烯-3-醇、環鏈黴菌素(cyclostreptin)、異勞力馬來(isolaulimalide)、勞力馬來(laulimalide)、4-表-7-去羥基-14,16-二去甲基-(+)-盤皮海綿內酯及隱塞龍1(cryptothilone 1)。
在期望結合本文所述抗GITR抗體或在用本文所述抗GITR抗體治療之前使得異常增殖細胞休眠的情形下，亦可向患者投與激素及類固醇(包括合成類似物)、例如17a-乙炔基雌二醇、已烯雌酚(Diethylstilbestrol)、睪固酮、普賴松(Prednisone)、氟甲睪酮(Fluoxymesterone)、丙酸甲雄烷酮(Dromostanolone propionate)、睪內酯(Testolactone)、乙酸甲地孕酮(Megestrolacetate)、甲基普賴蘇濃(Methylprednisolone)、甲基-睪固酮、普賴蘇濃(Prednisolone)、曲安西龍(Triamcinolone)、氯烯雌醚(Chlorotrianisene)、羥基助孕酮(Hydroxyprogesterone)、胺魯米特(Aminoglutethimide)、雌氮芥(Estramustine)、乙酸甲羥孕酮(Medroxyprogesteroneacetate)、柳培林(Leuprolide)、氟他胺(Flutamide)、托瑞米芬(Toremifene)、 ZOLADEXTM。在採用本文所述方法或組合物時，若期望，亦可投與在臨床設定中用於調節腫瘤生長或轉移之其他藥劑，例如抗模擬物。
安全有效投與化學治療劑之方法已為熟習此項技術者所知。另外，其投與闡述於標準文獻中。舉例而言，許多化學治療劑之投與闡述於Physicians' Desk Reference(PDR)，例如1996版(Medical Economics公司，Montvale,N.J.07645-1742,USA)中；其揭示內容以引用方式併入本文中。
化學治療劑及/或輻射療法可根據業內熟知之治療方案投與。熟習此項技術者應明瞭，化學治療劑及/或輻射療法之投與可端視所治療疾病及化學治療劑及/或輻射療法對該疾病之已知效應而變。同樣，根據熟練臨床醫師之知識，治療方案(例如，投與之劑量量及時間)可鑒於所投與治療劑對患者之觀察效應並鑒於疾病對所投與治療劑之觀察反應而變。
實例性實施例
1.一種經分離抗體或其抗原結合部分，其結合至人類糖皮質激素可誘導之TNF受體(GITR)且展現以下性質：(a)結合至可溶性人類GITR；(b)結合至膜結合之人類GITR；(c)結合至膜結合之食蟹猴GITR；(d)誘導或增強T細胞活化；(e)抑制GITR配體與3A9-hGITR細胞上之GITR的結合；(f)至多部分抑制GITR配體與活化T細胞上之GITR的結合；(g)結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)上之構象表位；(h)結合至O-連接及N-糖基化及未糖基化人類GITR二者；(i)在不與Fc受體結合下具有激動劑活性，但其中與Fc受體之結合進一步增強該激動劑活性；及 (i)在任一方向或兩個方向上與抗體28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10中之一或多者競爭結合至人類GITR。
2.如實施例1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體刺激抗腫瘤免疫反應。
3.如實施例1或2之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體刺激抗原特異性T細胞反應。
4.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體增加表現GITR之T細胞中之IL-2及/或IFN-γ產生。
5.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體增加T細胞增殖。
6.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體不結合至Fc受體。
7.如實施例1至5中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合至一或多種活化FcγR。
8.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體以如藉由Biacore量測之10nM或更小之KD結合至可溶性人類GITR。
9.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體以如藉由Scatchard量測之1nM或更小之KD結合至膜結合之人類GITR。
10.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體以如藉由FACS量測之1nM或更小之EC50結合至膜結合之人類GITR。
11.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體以如藉由FACS量測之10nM或更小之EC50結合至膜結合之食 蟹猴GITR。
12.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體誘導或增強T細胞活化而無需多價交聯。
13.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體以如藉由FACS量測之1μg/mL或更小之EC50抑制GITR配體與GITR之結合。
14.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)之PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)。
15.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至糖皮質激素可誘導之TNF受體(GITR)且包含呈選自由以下組成之群之可變重鏈及可變輕鏈對之三個可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR：(a)SEQ ID NO：13及14；(b)SEQ ID NO：26及27；(c)SEQ ID NO：39及40；(d)SEQ ID NO：52及53；(e)SEQ ID NO：52及54；(f)SEQ ID NO：71及72；(g)SEQ ID NO：84及85；(h)SEQ ID NO：97及98；(i)SEQ ID NO：97及99；(j)SEQ ID NO：115及116；(k)SEQ ID NO：128及129；(l)SEQ ID NO：128及130；及(m)SEQ ID NO：335及336。
16.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至糖皮質激素可誘導之TNF受體(GITR)，且包含：(a)分別包含SEQ ID NO：20、21及22之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：23、24及25之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(b)分別包含SEQ ID NO：33、34及35之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：36、37及38之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(c)分別包含SEQ ID NO：46、47及48之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：49、50及51之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(d)分別包含SEQ ID NO：62、63及64之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：65、66及67之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(e)分別包含SEQ ID NO：62、63及64之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：68、69及70之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(f)分別包含SEQ ID NO：78、79及80之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：81、82及83之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(g)分別包含SEQ ID NO：91、92及93之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：94、95及96之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(h)分別包含SEQ ID NO：106、107及108之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：109、110及111之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列； (i)分別包含SEQ ID NO：106、107及108之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：112、113及114之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(j)分別包含SEQ ID NO：122、123及124之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：125、126及127之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(k)分別包含SEQ ID NO：138、139及140之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：141、142及143之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(l)分別包含SEQ ID NO：138、139及140之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：144、145及146之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；或(m)分別包含SEQ ID NO：342、343及344之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：345、346及347之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
17.如實施例16之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含分別包含SEQ ID NO：20、21及22之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：23、24及25之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
18.如實施例16之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含分別包含SEQ ID NO：33、34及35之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：36、37及38之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
19.如實施例16之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含分別包含SEQ ID NO：46、47及48之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：49、50及51之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序 列。
20.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至糖皮質激素可誘導之TNF受體(GITR)且包含重鏈及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：13、26、39、52、71、84、97、115、128及335。
21.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至糖皮質激素可誘導之TNF受體(GITR)且包含重鏈及輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336。
22.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至糖皮質激素可誘導之TNF受體(GITR)且包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少85%一致之重鏈及輕鏈可變區序列：(a)分別SEQ ID NO：13及14；(b)分別SEQ ID NO：26及27；(c)分別SEQ ID NO：39及40；(d)分別SEQ ID NO：52及53；(e)分別SEQ ID NO：52及54；(f)分別SEQ ID NO：71及72；(g)分別SEQ ID NO：84及85；(h)分別SEQ ID NO：97及98；(i)分別SEQ ID NO：97及99；(j)分別SEQ ID NO：115及116；(k)分別SEQ ID NO：128及129；(l)分別SEQ ID NO：128及130；及 (m)分別SEQ ID NO：335及336。
23.如實施例22之抗體或其抗原結合部分，其中該等重鏈及輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之重鏈及輕鏈可變區至少90%一致之胺基酸序列：(a)至(m)。
24.如實施例23之抗體或其抗原結合部分，其中該重鏈及輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之重鏈及輕鏈可變區至少95%一致之胺基酸序列：(a)至(m)。
25.如實施例24之抗體或其抗原結合部分，其中該重鏈及輕鏈可變區包含選自由以下組成之群之重鏈及輕鏈可變區：(a)至(m)。
26.如實施例25之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包括包含闡述於SEQ ID NO：13中之胺基酸序列之重鏈可變區及包含闡述於SEQ ID NO：14中之胺基酸序列之輕鏈可變區。
27.如實施例25之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包括包含闡述於SEQ ID NO：26中之胺基酸序列之重鏈可變區及包含闡述於SEQ ID NO：27中之胺基酸序列之輕鏈可變區。
28.如實施例25之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包括包含闡述於SEQ ID NO：39中之胺基酸序列之重鏈可變區及/或包含闡述於SEQ ID NO：40中之胺基酸序列之輕鏈可變區。
29.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至糖皮質激素可誘導之TNF受體(GITR)且包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈及輕鏈序列：(a)分別SEQ ID NO：15及16；(b)分別SEQ ID NO：17及19；(c)分別SEQ ID NO：18及19；(d)分別SEQ ID NO：28及29； (e)分別SEQ ID NO：30及32；(f)分別SEQ ID NO：31及32；(g)分別SEQ ID NO：41及42；(h)分別SEQ ID NO：43及45；(i)分別SEQ ID NO：44及45；(j)分別SEQ ID NO：55及56；(k)分別SEQ ID NO：55及57；(l)分別SEQ ID NO：58及60；(m)分別SEQ ID NO：59及60；(n)分別SEQ ID NO：58及61；(o)分別SEQ ID NO：59及61；(p)分別SEQ ID NO：73及74；(q)分別SEQ ID NO：75及77；(r)分別SEQ ID NO：76及77；(s)分別SEQ ID NO：86及87；(t)分別SEQ ID NO：88及90；(u)分別SEQ ID NO：89及90；(v)分別SEQ ID NO：102及104；(w)分別SEQ ID NO：103及104；(x)分別SEQ ID NO：100及101；(y)分別SEQ ID NO：100及371；(z)分別SEQ ID NO：102及105；(za)分別SEQ ID NO：103及105；(zb)分別SEQ ID NO：117及118；(zc)分別SEQ ID NO：119及121；(zd)分別SEQ ID NO：120及121； (ze)分別SEQ ID NO：131及132；(zf)分別SEQ ID NO：134及136；(zg)分別SEQ ID NO：135及136；(zh)分別SEQ ID NO：131及133；(zi)分別SEQ ID NO：134及137；(zj)分別SEQ ID NO：135及137；(zk)分別SEQ ID NO：337及338；(zl)分別SEQ ID NO：339及341；及(zm)分別SEQ ID NO：340及341。
30.如實施例29之抗體或其抗原結合部分，其中該等重鏈及輕鏈包含選自由以下組成之群之重鏈及輕鏈：(a)至(zm)。
31.如實施例30之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包括包含闡述於SEQ ID NO：17中之胺基酸序列之重鏈及包含闡述於SEQ ID NO：19中之胺基酸序列之輕鏈。
32.如實施例30之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包括包含闡述於SEQ ID NO：18中之胺基酸序列之重鏈及包含闡述於SEQ ID NO：19中之胺基酸序列之輕鏈。
33.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其(a)與如實施例25之抗體結合至GITR上之相同表位，及(b)使如實施例25之抗體與活化T細胞上之GITR的結合受到抑制至少90%，如藉由FACS所量測。
34.如實施例15至33中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)之PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)。
35.如實施例15至34中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合至人類及食蟹猴GITR二者。
36.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
37.如實施例36之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係IgG1抗體。
38.如實施例36之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含較差效應物IgG1 Fc。
39.如實施例38之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包括包含以下突變之較差效應物IgG1 Fc：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
40.如實施例36之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含具有增強之與活化FcγR之結合的Fc。
41.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該等CDR區中之甲硫胺酸殘基被不會進行氧化之胺基酸殘基取代。
42.如實施例15至41中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分係人類或人類化抗體。
43.一種雙特異性分子，其包含連接至具有第二結合特異性之分子之如前述實施例中任一實施例之抗體。
44.一種核酸，其編碼如實施例1至42中任一實施例之抗體或其抗原結合部分之重鏈及/或輕鏈可變區。
45.一種表現載體，其包含如實施例44之核酸分子。
46.一種經如實施例45之表現載體轉化的細胞。
47.一種免疫偶聯物，其包含連接至試劑之如實施例1至42中任一實施例之抗體。
48.一種組合物，其包含如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物以及載劑。
49.一種套組，其包含如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、或雙特異性分子或免疫偶聯物以及使用說明書。
50.一種製備抗GITR抗體或其抗原結合部分之方法，其包含使該抗體或其抗原結合部分在如實施例46之細胞中表現及自該細胞分離該抗體或其抗原結合部分。
51.一種刺激抗原特異性T細胞反應之方法，其包含使該T細胞與如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物接觸，使得刺激抗原特異性T細胞反應。
52.一種活化或共刺激效應物T細胞之方法，其包含使效應物T細胞與如實施例1至43及47中任一實施例之抗GITR抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物與CD3接觸，其中活化或共刺激該效應物T細胞。
53.一種增加T細胞中IL-2及/或IFN-γ產生之方法，其包含使該T細胞與有效量之如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物接觸。
54.一種增加T細胞增殖之方法，其包含使該細胞與有效量之如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物接觸。
55.一種增加個體之T細胞中IL-2及/或IFN-γ產生之方法，其包含投與有效量之如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物，以增加自該等T細胞之IL-2及/或IFN-γ產生。
56.一種減少或耗盡有需要之個體之腫瘤中T調控性細胞之數目的方法，其包含投與有效量之如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物，其中該抗體或其抗原結合部分具有效應物或增強之效應物功能，以減少該腫瘤中T調 控性細胞之數目。
57.一種刺激個體之免疫反應之方法，其包含向該個體投與如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物，使得刺激該個體之免疫反應。
58.如實施例57之方法，其中該個體患有腫瘤且刺激針對該腫瘤之免疫反應。
59.一種抑制個體中腫瘤細胞生長之方法，其包含向該個體投與如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物，使得抑制該個體中該腫瘤之生長。
60.一種治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物，以治療該癌症。
61.如實施例60之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、子宮/子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、食道癌、胃腸癌、胰臟癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎癌、頭頸癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝癌、甲狀腺癌、皮膚癌、中樞神經系統之贅瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相關癌症。
62.如實施例60或61之方法，其中該癌症係轉移性癌症、難治性癌症或復發性癌症。
63.如實施例56至62中任一實施例之方法，其進一步包含投與一或多種額外治療劑。
64.如實施例63之方法，其中該額外療法係抗PD1抗體、LAG-3抗體、CTLA-4抗體或PD-L1抗體。
65.一種檢測試樣中糖皮質激素可誘導之TNF受體(GITR)之存在之方法，其包含使該試樣與如實施例1至42中任一實施例之抗體或其抗原結合部分在容許在該抗體或其抗原結合部分與GITR之間形成 複合物之條件下接觸，及檢測複合物之形成。
66.一種經分離抗GITR抗體，其包括包含IgG2鉸鏈及不屬IgG2同型之CH1、CH2及CH3中之至少一者的經修飾重鏈恆定區，其中該抗GITR抗體相對於具有非IgG2鉸鏈之相同抗GITR抗體具有增強之激動劑活性。
67.如實施例66之經分離抗GITR抗體，其中該經修飾重鏈恆定區包括包含選自由SEQ ID NO：223至226及283至290組成之群之胺基酸序列的重鏈恆定區或與SEQ ID NO：223至226及283至290之胺基酸序列至多5個胺基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈恆定區。
68.如實施例67之經分離抗GITR抗體，其中該重鏈包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362，或與SEQ ID NO：15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362之胺基酸序列至多10個胺基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈。
藉由以下實例進一步闡釋本發明，但其不應視為進一步限制本發明。貫穿本申請案引用之所有圖及所有參考文獻、基因庫序列、專利及已公開專利申請案之內容皆係以引用方式明確併入本文中。具體而言，PCT公開案WO 09/045957、WO 09/073533、WO 09/073546、WO 09/054863及PCT/US2013/072918及美國專利公開案第2011/0150892號之揭示內容以引用方式明確併入本文中。
實例 實例1：不同抗GITR抗體之生成
在HuMAb®轉基因小鼠(「HuMAb」係Medarex公司之商標，Princeton,New Jersey)及KM小鼠(KM Mouse®品系含有如PCT公開案WO 02/43478中所述之SC20轉染色體)之Hco7、Hco27、Hco20、Hco12、Hco17及Hc2品系中生成人類抗GITR單株抗體。如美國專利第5,770,429號及第5,545,806號中所述生成HC2/KCo27 HuMAb小鼠及KM小鼠，該等案件之揭示內容以引用方式併入本文中。
用不同免疫策略(不同抗原、不同劑量、持續時間、投與途徑(足墊(fp)、腹膜內(ip)及皮下(sc)及佐劑(CFA/IFA、Ribi及抗體)等)對總共94隻小鼠(其包括轉基因小鼠之7種基因型(KM、Hco7、Hco27、Hco20、Hco12、Hco17及Hc2))進行免疫。實施自54隻小鼠之36次融合並篩選。自該36種融合物鑑別157種抗體，且進一步表徵可分離特定關注之抗體，包括命名為28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10之抗體。
cDNA測序鑑別抗體28F3、19D3、18D10、2G6、8A6、14E3及6G10中之每一者之一條重鏈及一條輕鏈及抗體3C3、9G7及19H8中之每一者之一條重鏈及兩條輕鏈(輕鏈1或「L1」及輕鏈2或「L2」)。藉由蛋白質分析，鑑別抗體3C3及9G7之單一輕鏈，且N-末端測序及分子量測定指示其係3C3之輕鏈L1及9G7之輕鏈L2。關於抗體19H8，93%之由雜交瘤表現之抗體含有輕鏈L1且3%含有輕鏈L2。抗體3C3-1及3C3-2分別對應於具有輕鏈L1及L2之抗體3C3。抗體9G7-1及9G7-2分別對應於具有輕鏈L1及L2之抗體9G73。抗體19H8-1及19H8-2分別對應於具有輕鏈L1及L2之抗體19H8。3種抗體之輕鏈中之每一者之胺基酸及核苷酸序列提供於表11中。
抗體28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10之可變 區胺基酸序列及同型闡述於圖2至31中。每一抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸及核苷酸序列提供於表11中。28F3之重鏈及輕鏈由胺基酸序列SEQ ID NO：15及16組成。19D3之重鏈及輕鏈由胺基酸序列SEQ ID NO：28及29組成。18E10之重鏈及輕鏈由胺基酸序列SEQ ID NO：41及42組成。3C3之重鏈及輕鏈由胺基酸序列SEQ ID NO：55及56組成。2G6之重鏈及輕鏈由胺基酸序列SEQ ID NO：73及74組成。8A6之重鏈及輕鏈由胺基酸序列SEQ ID NO：86及87組成。9G7之重鏈及輕鏈由胺基酸序列SEQ ID NO：100及101組成。14E3之重鏈及輕鏈由胺基酸序列SEQ ID NO：117及118組成。19H8-1之重鏈及輕鏈由胺基酸序列SEQ ID NO：131及132組成。19H8-2之重鏈及輕鏈由胺基酸序列SEQ ID NO：131及133組成。6G10之重鏈及輕鏈由胺基酸序列337及338組成。編碼該等蛋白質之核苷酸序列提供於表11中。
實例2：抗GITR抗體與活化人類及食蟹猴T細胞之結合
測試實例1中生成之人類單株抗GITR抗體與活化人類及食蟹猴T細胞(其在其表面上表現GITR)之結合。
將自人類或食蟹猴分離之末梢血單核細胞(PBMC)利用板塗佈之抗CD3抗體(純系：用於人類T細胞活化之UCHT1；純系：用於食蟹猴T細胞活化之SP34；二者皆來自BD Biosciences)及可溶性抗CD28抗體(純系：用於人類及食蟹猴二者之CD28.2，BD Biosciences)活化4天(人類)/或5天(食蟹猴)。在基於螢光活化之細胞分選(FACS)之分析中使用藻紅素(PE)偶聯之抗人類IgG抗體(Jackson ImmunoResearch)測試細胞之GITR mAb結合。利用BD FACS Canto流式細胞儀分析試樣。
抗GITR抗體3C3、19D3、18E10及28F3結合至活化人類及食蟹猴T細胞。如圖32中所示，抗體3C3、19D3、18E10及28F3強烈結合至活化人類T細胞，如分別0.04916nM、0.3633nM、0.1461nM及0.1916nM之EC50值所反映。類似地，抗體18E10及28F3結合至活化食蟹猴T 細胞，其中對於18E10及28F3 EC50值分別為0.9134nM及1.044nM(圖33)。3C3不顯著結合至食蟹猴T細胞。
實例3：抗GITR抗體與可溶性GITR之結合
藉由Biacore測定抗GITR抗體與可溶性GITR之結合。將抗GITR抗體捕獲於人類κ塗佈之晶片(約5KRU；Southernbiotech目錄號2060-01)上，且使重組人類GITR(rHGITR/Fc：R&D systems，目錄號689-GR)以500nM、250nM、125nM、62nM及31nM之濃度流經晶片。mAb/體積之捕獲濃度係2-40μg/mL(於10μL/min下5μL)。於15μL/min下抗原締合時間係5分鐘，抗原解離時間係6分鐘，且利用50mM HCl/50mM NaOH(於100μL/min下各自12μL)實施再生。利用28F3及若干其他抗GITR抗體獲得之結果示於表5中。
Figure 104118186-A0305-02-0199-26
結果指示，抗GITR抗體以介於1.2×10-8M至3.5×10-8M範圍內之KD結合至可溶性GITR。提供3C3之2種亞純系之數據，其中KD介於1.33×10-8M至1.44×10-8M之範圍內。
在單獨Biacore實驗中，測定具有具有三個不同恆定區之28F3之可變區之抗體的結合特徵。第一28F3抗體具有野生型IgG1恆定區 (「g1f」，亦稱作「g1」或「IgG1」或「IgG1f」；具有SEQ ID NO：17之重鏈及具有SEQ ID NO：19之輕鏈)。後綴「f」係指異型。第二抗體具有在Fc區中具有三個突變之較差效應物IgG1恆定區(「g1.1f」，亦稱作「g1.1」、「IgG1.1」及「IgG1.1f」，具有L234A、L235E、G237A；具有SEQ ID NO：18之重鏈及具有SEQ ID NO：19之輕鏈)；且第三28F3抗體具有具有N297A突變之IgG1恆定區。
如上文所述執行Biacore實驗，只是晶片經抗CH1(Invitrogen參考號054500)塗佈。表6中所示之結果指示，所有三種抗體具有類似結合特徵，其中KD介於3.93×10-8M至4.39×10-8M範圍內。
Figure 104118186-A0305-02-0200-27
實例4：抗GITR抗體與活化人類T細胞及3A9-huGITR細胞之結合親和力
藉由Scatchard分析測定抗GITR抗體與異常表現人類GITR之活化人類T細胞及小鼠T細胞雜交瘤3A9細胞系(3A9-hGITR)上之GITR的結合。此分析係利用28F3.IgG1.1(對於重鏈為SEQ ID NO：18且對於輕鏈為SEQ ID NO：19)以4.59mg/mL執行。
如下執行關於活化人類T細胞之Scatchard分析。將自人類供體獲得之T細胞用培養基(RPMI，具有10% FBS、2mM L-麩醯胺酸、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇)洗滌一次並以106個細胞/mL再懸浮於補充有1μg/mL抗CD28(CD28.2，BD編號555725)及100U/mL IL-2(Peprotech編號200-02)之相同培養基中。將5×106個細胞各自平鋪於6孔板之三個孔 中，該板經20ug抗CD3(5mL，4μg/mL，於4℃下過夜；UCHT-1，BD編號555329)塗佈。將細胞於37℃下培育3天，且該等細胞之一半用於Scatchard分析(「第3天」分析)。將另一半之用盡之培養基更換為5mL新鮮培養基並將細胞再培育一天，且隨後與該等細胞一起用於Scatchard分析(「第4天」分析)。
對於Scatchard分析而言，將28F3.IgG1.1用125I-Na(Perkin Elmer編號NEZ033H001MC(1mCi)，使用IODO-GEN®固相碘化試劑(1,3,4,6-四氯-3a-6a-二苯基甘脲；Pierce編號28601)放射性碘化。使用脫鹽管柱(Pierce編號43243)去除過量碘化物。收集經標記抗體之部分並利用Wizard 1470 γ計數器(Perkin-Elmer)分析其放射性。利用來自Invitrogen之QubitTM螢光計計算每一部分中之125I-28F3.IgG1.1濃度。藉由峰蛋白及放射性部分(Pinestar Technology編號151-005)之薄層層析確立放射性純度。
放射性碘化28F3.IgG1.1與活化人類T細胞之結合係藉由將活化人類T細胞與一定滴度(titration)之125I-28F3.IgG1.1一起培育來展示。藉由在滴度之100倍莫耳濃度過量之未經標記之抗體存在下之結合測定非特異性結合且將其自總CPM減去以計算特異性結合。使用125I-28F3.IgG1.1濃度對CPM之線性標準曲線以外推最大nM結合之125I-28F3.IgG1.1並藉此計算每細胞之受體數目。每經刺激人類CD4+T細胞之人類GITR分子之數目在第3天係約8,400，且在第4天係約13,200。Scatchard分析之結果指示，28F3.IgG1.1以0.7nM之KD特異性結合至第3天刺激之人類CD4+ T細胞，且以0.87nM之KD結合至第4天刺激之人類CD4+ T細胞。
放射性碘化28F3.IgG1.1與3A9-huGITR細胞之結合係藉由將3A9-huGITR細胞與一定滴度之125I-28F3.IgG1.1一起培育來展示。藉由在滴度之100倍莫耳濃度過量之未經標記之抗體存在下之結合測定非特 異性結合且將其自總CPM減去以計算特異性結合。使用125I-28F3.IgG1.1濃度對CPM之線性標準曲線以外推最大nM結合之125I-28F3.IgG1.1並藉此計算每細胞之受體數目。每3A9-huGITR細胞之人類GITR分子之數目係約180,000。Scatchard分析之結果指示，28F3.IgG1.1以0.5nM之KD特異性結合至3A9-huGITR細胞。
在另一實驗中，測定28F3.IgG1及28F3.IgG1.1與來自人類及食蟹猴供體之活化CD4+及CD8+ T細胞的結合。自人類及食蟹猴供體分離人類及食蟹猴CD4+及CD8+ T細胞，並用抗CD3及抗CD28抗體處理用於活化。結果指示，28F3.IgG1及28.IgG1.1分別以0.55nM及0.67nM之EC50類似地結合至活化人類CD4+細胞，且分別以0.56nM及0.65nM之EC50類似地結合至活化人類CD8+細胞。28F3.IgG1及28.IgG1.1分別以1nM及0.86nM之EC50結合至活化食蟹猴CD4+細胞，且分別以1.26nM及0.74nM之EC50類似地結合至活化食蟹猴CD8+細胞。
實例5：人類單株抗GITR抗體抑制GITR-L與GITR之結合
為確定HuMab抗GITR抗體是否抑制GITR配體與GITR之結合，將異常表現人類GITR之小鼠T細胞雜交瘤3A9細胞系(GITR-3A9細胞)與GITR mAb以介於10-4μg/mL至100μg/mL範圍內之濃度預培育，之後以10ng/mL之濃度培育GITR配體(R&D Systems編號6987-GL)。在基於FACS之分析中使用PE偶聯之抗血球凝集素(HA)標籤抗體測定細胞上GITR配體之結合，且利用BD FACS Canto流式細胞儀分析試樣。如圖34A及34B中所示，在該等條件下，抗體19D3、28F3及GITR.3(3C3)皆阻斷GITR-L與GITR-3A9細胞之結合，其中EC50值分別為0.7546、0.2783及0.06934。利用抗體19H8獲得類似結果。
在不同條件下執行另一組實驗以進一步評估抗GITR抗體阻斷GITR-L與GITR結合之程度。在該等實驗中，將濃度為1.06×10-9mg/ml至100mg/ml之可溶性重組hGITR-L三聚物添加至活化人類T細 胞中並以0.016ug/ml之EC50值以劑量依賴性方式結合至CD4+及CD8+ T細胞(圖34C)。如下執行實驗：將濃度為1.06e-9μg/mL至100μg/mL之重組hGITR-L三聚物(R&D Systems目錄號6987-GL)添加至PHA-活化T細胞。30分鐘初步培育後，使用PE偶聯之抗HA標籤(Miltenyi目錄號120-002-687)檢測細胞結合之GITR-L。在FACS Canto流式細胞儀(BD,San Jose)上獲取試樣並利用FlowJo軟體(Tree Star公司，Ashland,OR)進行分析。
濃度為1.06×10-9ug/ml至100ug/ml之rhGITR-L在活化T細胞上之預結合以0.0024ug/ml之IC50阻斷0.5ug/ml 28F3-hIgG1(約90%之飽和度)之後續結合。由於於100ug/ml下MFI未達到基線(IgG對照)，故抑制係部分的(圖34D)。如下執行實驗：首先將PHA活化之T細胞用以100μg/mL開始之24點3倍滴定之重組GITR-L三聚物(R&D Systems 6987-GL)處理30分鐘。隨後向細胞混合物中以0.5μg/mL之固定濃度添加28F3-hIgG1，使其再經受30分鐘培育。使用針對人類IgG Fc之PE偶聯之二級抗體檢測細胞結合之28F3-hIgG1(Jackson ImmunoResearch目錄號109-116-098)。使用無關hIgG1 Ab作為28F3-hIgG1之同型對照，同時包括未預培育GITR-L之試樣以顯示在不存在阻斷下28F3-hIgG1之結合。在FACS Canto流式細胞儀(BD,San Jose)上獲取試樣並利用FlowJo軟體(Tree Star公司，Ashland,OR)進行分析。
在將活化T細胞與預濃度介於1.06×10-9ug/ml至100ug/ml範圍內之28F3-hIgG1一起培育時，0.6ug/ml(約90%飽和度)之GITR-L之結合未受影響(圖34E)。然而，在添加接近其EC50之20ng/ml之較低濃度之GITR-L時，其結合以0.076mg/ml之IC50由預結合之28F3-hIgG1部分阻斷(圖34F)。如下執行實驗：將PHA-活化T細胞與濃度介於0.00056μg/mL至100μg/mL範圍內之28F3-hIgG1一起預培育，之後添 加0.6ug/ml或20ng/mL GITR-L。利用PE偶聯抗HA標籤檢測細胞結合之GITR-L。包括無關hIgG1作為28F3-hIgG1之同型對照且使用無一級抗體之試樣以顯示在無阻斷情況下GITR-L之結合。在FACS Canto流式細胞儀(BD,San Jose)上獲取試樣並利用FlowJo軟體(Tree Star公司，Ashland,OR)進行分析。
該等數據顯示28F3-hIgG1係部分配體阻斷劑，其可容許GITR由GITR-L之一定活體內接合。
實例6：所有抗GITR抗體皆分揀至一個組中
利用以下抗人類GITR抗體執行抗體分揀實驗：28F3、18E10、19D3、14E3、8A6、9G7、3C3及6G10。
將抗GITR抗體固定至感測器晶片CM5晶片(Series S,GE Healthcare目錄號BR-1005-30)表面、flowcell2、flowcell3及flowcell4(5000RU)上，且使用flowcell1作為陰性對照。將抗體以開始濃度稀釋至120μg/mL(2×)。藉由針對8個不同濃度(120μg/ml-0.0μg/ml，2×)用緩衝液稀釋1：3濃度之抗體製備一系列稀釋物，以獲得滴定曲線。將每一抗體濃度系列分成兩半。在第一半濃度系列中，添加40nM(2×)GITR抗原(rHGITR/Fc目錄號689-GR)以在每一孔中製備最終濃度系列(60μg/ml-0.0μg/ml)及20nM之最終抗原濃度。在第二半濃度系列中，代替抗原，添加緩衝液以具有稀釋至相同濃度之抗體，且將此一半處理為空白。將複合物培育2小時。將40μL複合物以30μL/min流速注射至抗體塗佈之表面上。使用Biacore T200儀器且運行緩衝液係HBE-EP，GE Healthcare目錄號BR-1001-88，經過濾脫氣，0.01M HEPES pH7.4，0.15 NaCl，3Mm EDTA，0.005%表面活性劑P20。將表面用25mM NaOH(指令碼：BR-1003-58,GE Healthcare)以100μL/min再生5秒。使用Microsoft Excel分析數據，其中針對相應反應單元繪示抗體之濃度系列的圖以獲得滴定曲線。
結果指示，所有測試抗體皆分揀至一個組中，從而指示其皆結合至人類GITR之細胞外區域之類似區域。
實例7：抗GITR抗體結合至構象表位
此實例顯示，抗GITR抗體28F3及3C3結合至非變性人類GITR，但不結合至變性人類GITR，且結合並不受N-或O-連接糖基化影響。
如下測定抗GITR抗體與具有或無N-連接糖基化之天然或變性GITR之結合。於37℃下在PBS中將天然(即，非變性)及變性人類GITR之試樣與酶N-聚糖酶PNGase F一起或不一起培育過夜以去除N-糖基化。GITR之變性係藉由如下方式完成：於37℃在50mM二硫蘇糖醇及4M胍鹽酸鹽中還原45分鐘，且隨後之後於室溫下在100mM碘乙醯胺中烷基化20分鐘。使具有或無N-連接糖基化之天然人類GITR之試樣經受SDS凝膠電泳，且使具有或無N-連接糖基化之變性GITR之試樣經受變性SDS凝膠電泳。將蛋白質轉移至硝基纖維素膜上用於西方墨點分析。將膜與28F3抗體一起培育。藉由與和對抗人類IgG重鏈及輕鏈具有特異性之辣根過氧化酶(HRP標記)偶聯之二級抗體一起培育檢測結合(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)，且之後捕獲於膜上之發光檢測。圖35中所示之結果指示，抗GITR Ab 28F3僅結合至天然GITR，且不結合至變性形式，且糖基化之存在或不存在不影響結合。利用抗GITR抗體3C3獲得類似結果。
因此，抗GITR抗體28F3及3C3結合至呈構象且與N-連接及O-連接糖基化無關之表位。
實例8：28F3及3C3與天然人類GITR肽之結合型式
藉由SDS-PAGE及西方墨點分析藉由測試該等抗體與自天然人類GITR生成之肽的結合研究28F3及3C3與人類GITR之結合型式。如下執行實驗。首先，藉由在不存在變性試劑下於37℃下在PBS中與胞內蛋白酶Arg-C、胞內蛋白酶Lys-C、胰蛋白酶、胞內蛋白酶Glu-C或胞 內蛋白酶Asp-N以2% w/w比率一起培育5小時使天然人類GITR經受蛋白分解。隨後使來自每一消解之2μg整個反應混合物經受非變性SDS-PAGE電泳，並轉移至硝基纖維素上用於西方墨點分析。隨後將西方墨點與28F3或3C3抗體一起培育，並藉由與和對抗人類IgG重鏈及輕鏈具有特異性之辣根過氧化酶(HRP標記)偶聯之二級抗體一起培育檢測結合(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)，且之後捕獲於膜上之發光檢測。圖36中所示之結果指示，28F3及3C3之結合型式不同，從而表明該等抗體並不精確結合至人類GITR之相同區域。
實例9：抗GITR抗體28F3結合至人類GITR之細胞外結構域之N-末端
藉由在溶液中測試抗體與人類GITR之各種非變性片段之結合測定28F3結合之人類GITR上之區域的位置。如下執行實驗：藉由在不存在變性試劑下於37℃下在PBS中使人類GITR與胞內蛋白酶Arg-C、胞內蛋白酶Lys-C、胰蛋白酶、胞內蛋白酶Glu-C或胞內蛋白酶Asp-N以2% w/w比率一起培育5小時生成人類GITR肽片段。隨後於室溫下將肽混合物與抗GITR Ab珠粒在PBS中一起培育2小時。藉由與不同酶在PBS中一起培育一小時使一些試樣經受原位二次裂解。藉由用PBS洗滌抗GITR Ab珠粒兩次去除未結合肽。將結合至抗GITR Ab 28F3上之肽用2%甲酸稀釋，且隨後藉由LC-MS使其經受序列鑑別。圖37中顯示為熱圖之結果指示，28F3結合至以下N-末端胺基酸鏈段內之構象表位：QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(SEQ ID NO：215)，其對應於成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)之胺基酸殘基1至39，或結合至較短片段QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTR(SEQ ID NO：370)內之構象表位。
實例10：人類GITR上之O-連接糖基化不干擾28F3之結合
人類GITR之細胞外結構域上無已知或有記載之O-連接糖基化。然而，SEQ ID NO：215之殘基T18及T20含有O-糖基化共有序列。該等殘基在表位序列中加下劃線：QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(SEQ ID NO：215)。因此，確定O-連接糖基化是否影響28F3與人類GITR之結合。
如下執行28F3與由SEQ ID NO：215組成之糖基化或未糖基化肽的結合：藉由使連接至小鼠Fc之完整天然人類GITR細胞外結構域蛋白分解生成人類GITR之部分糖基化及未糖基化N-末端肽。亦藉由有機合成生成由SEQ ID NO：215之胺基酸殘基1至39組成之未糖基化GITR肽。28F3與肽之結合之程序闡述於前述部分中(使用28F3塗佈之珠粒)。如圖38B中所示，發現兩種肽結合至28F3塗佈之珠粒，且該等肽藉由LC-MS鑑別為無O-連接糖基化之N-末端肽(圖38A)且另一者係在SEQ ID NO：215之T18及/或T20上具有O-連接糖基化之相同N-末端肽(圖38D)。
因此，28F3結合至人類GITR之N-末端區，此與其在胺基酸T18及/或T20上是否具有O-連接之糖無關。
實例11：抗GITR抗體28F3與20聚體之結合
作為前述實例中所述實驗之一部分，發現具有不具有任何O-連接糖基化之SEQ ID NO：215之合成肽首先結合至28F3塗佈之珠粒上，且隨後藉由利用胞內蛋白酶Asp-N原位消解來進一步裂解。由胺基酸序列QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：216)組成且含有胺基酸殘基T18及T20而無O-連接糖基化之剩餘肽結合至28F3(圖38E)。因此，28F3結合至由SEQ ID NO：216組成之20聚體。
實例12：藉由HDX-MS之表位定位
氫/氘交換質譜(HDX-MS)方法藉由監測主鏈醯胺氫原子之氘交換 之速率及程度探測溶液中之蛋白質構象及構象動力學。HDX之程度取決於主鏈醯胺氫原子及蛋白質氫鍵之溶劑可及性。可藉由MS精確地量測HDX時蛋白質之質量增加。在此技術與酶消解配對時，可拆分肽水平下之結構特徵，從而使得能夠區分表面暴露之肽與彼等內部摺疊者。通常，實施氘標記及隨後驟冷實驗，之後在線胃蛋白酶消解、肽分離及MS分析。
在藉由HDX-MS表位定位GITR中之28F3.IgG1 mAb(具有分別由SEQ ID No：17及19組成之重鏈及輕鏈)之前，實施非氘化實驗以生成重組人類GITR/Fc(R&D systems，10μM，其含有胺基酸取代T20A)及重組人類GITR/Fc及28F3.IgG1 mAb之蛋白複合物(1：2莫耳比，10μM及20μM)之常見消化性肽的列表，從而對於GITR N-末端區達到86%之序列覆蓋率(圖39A)。在此實驗中，在標記步驟期間使用10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)，之後添加驟冷緩衝液(200mM磷酸鹽緩衝液，具有4M GdnCl及0.5M TCEP，pH 2.5，1：1,v/v)。對於表位定位實驗，於室溫下將5μL每一試樣(GITR/Fc或具有28F3.IgG1 mAb之GITR/Fc(1：2莫耳比))稀釋至55μL D2O緩衝液(10mM磷酸鹽緩衝液，D2O，pD 7.0)中以開始標記反應。將反應實施不同時間段：20sec、1min、10min、60min及240min。直至每一標記反應時段結束，藉由添加驟冷緩衝液(1：1 v/v)驟冷反應並將50μL驟冷試樣注射至Waters HDX-MS系統中用於分析。監測所觀察之常見消化性肽在28F3.IgG1 mAb不存在/存在下之氘攝取量。
圖39B及39C中所示之自對GITR中之28F3.IgG1 mAb之HDX-MS量測獲得的實驗數據指示，28F3.IgG1 mAb具有包含在GITR N-末端區中包括兩個肽區(或在其內)之不連續表位。
肽區1：PTGGPGCGPGRLLLGTGA(SEQ ID NO：217)
肽區2：CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)
基於相對氘攝取量之變化，可將兩個肽區歸類為1>2，其中區1具有最顯著之氘攝取變化，且其中區2在統計上顯著。
實例13：抗GITR抗體誘導自T細胞之IL-2及IFN-γ分泌
藉由量測由與抗體一起培育之T細胞分泌之IL-2及IFN-γ之量測試抗GITR抗體增強活體外T細胞活性的能力。
在增加量之19D3、18E10及28F3抗體存在下在抗CD3單株抗體塗佈之板上培養異常表現人類GITR之小鼠T細胞雜交瘤3A9細胞系(3A9-hGITR)。在經1μg/ml抗CD3抗體(純系145-2C11；BD Biosciences)塗佈之板上培養5×104個3A9-hGITR細胞，並用指示濃度之抗體處理24小時。如圖40中所示，抗體3C3(GITR.3)、28F3、19D3及18E10皆以劑量依賴性方式增強自T細胞之IL-2分泌。如所預計，對照hIgG1及hIgG2抗體不增加自3A9-hGITR細胞之IL-2分泌。
假定在刺激性CD3信號存在下抗GITR抗體增強自3A9-hGITR細胞之IL-2分泌，測試抗體增強自由特異性抗原活化之3A9-hGITR細胞之IL-2分泌的能力。在0.4μM HEL48-63肽及指示抗體存在下將5×104個3A9-hGITR細胞與2.5×104個LK35.2抗原呈遞細胞共培養24小時。如圖41A及41B中所示，抗體18E10、13H2(與28F3相同之抗體)、28F3、3C3及19D3以劑量依賴性方式增強自3A9-hGITR細胞之IL-2分泌。
在其他實驗中，在經表現抗CD3scFv(OKT3)之CHO細胞刺激之人類供體T細胞上測試28F3對由T細胞之IL-2及IFN-γ分泌之效應。CHO細胞表現低水平之OKT3以促進次最佳刺激以能夠觀察由抗GITR抗體之激動作用。在一組實驗中，用表現OKT3之CHO細胞及抗GITR抗體刺激供體之CD3+ T細胞，且量測IFN-γ分泌，且在第二組實驗中，用表現OKT3之CHO細胞及抗GITR抗體刺激2種供體(不同於CD3+ T細胞之供體)之CD4+ T細胞，且量測IL-2及IFN-γ分泌。如下執行實 驗。從自Ficoll梯度(Amersham Bioscience 17-1440-03)利用Pan T細胞分離套組(Miltenyi編號130-091-156)根據製造商之方案分離之人類PBMC獲得全T細胞。對於利用CD4+ T細胞之實驗，CD4+T細胞係自人類PBMC(供體1及2)利用RosetteSep人類CD4+ T細胞富集混合劑(StemCell Technology編號15062)根據製造商之方案獲得。將表現抗CD3scFv(OKT3)之CHO細胞(CHO-OKT3)用RPMI培養基洗滌兩次並使其經受50K Rad之劑量之輻照。收穫細胞並將其以2.5×105/mL再懸浮於培養基(RPMI-1640，補充有10%胎牛血清、2mM L-麩醯胺酸、55nM β-巰基乙醇、1mM丙酮酸鈉及100U/mL青黴素/鏈黴素)中。在96孔TC級平底板(Costar)中每孔接種2.5×104個CHO-OKT3細胞及1×105個T細胞。將細胞與以20μg/mL開始之8點3倍滴定之GITR抗體一起培育。添加20μg/mL之無關hIgG1作為同型對照。包括僅具有細胞之試樣以顯示無任何處理之基線活性。在第2天收穫每一試樣之上清液用於IL-2量測(僅用於利用CD4+ T細胞之分析)(BD opt EIA Human IL-2 ELISA套組；BD Bioscience編號555190)且在第3天收穫每一試樣之上清液用於IFN-γ量測(BD optEIA human IFN-g ELISA套組；BD Bioscience編號555142)。
圖42B-E中所示之結果指示，由兩種供體之CD4+ T細胞之IL-2及IFN-γ分泌28F3劑量依賴性增加。
亦展示由經其他抗GITR抗體刺激之供體T細胞之IFN-γ分泌。如上文所述執行分析。如圖42A中所示，抗體28F3、3C3、19D3及18E10皆以劑量依賴性方式增強自CD3+ T細胞之IFN-γ分泌，其中抗體28F3及3C3顯示測試抗體之最大效應。
在另一實驗中，在混合淋巴球反應(MLR)中觀察在抗GITR抗體(具體而言28F3)存在下之T細胞增殖。
共同地，該等數據指示，抗體18E10、19D3及28F3用作增強自T 細胞之細胞介素分泌之激動性抗GITR抗體。
實例14：抗GITR抗體獨立於活體外FcR相互作用活化T細胞反應
已報導激動性抗TNFR抗體需要FcγRIIB共接合用於其活體內活性(Li等人，Cell Cycle 2012；11：3343-3344)。為確定此需要是否亦延伸至抗GITR抗體，如實例13中所述將3A9-hGITR細胞與LK35.2細胞及HEL48-63肽共培養，用全長抗GITR抗體28F3(hIgG2)、28F3之F(ab')2片段或28F3之Fab片段處理，並針對mIL-2產生進行評價。圖43中所述之結果顯示，全長28F3及28F3之F(ab')2片段增強mIL-2產生，但28F3之Fab片段具有較弱效應，從而表明二價而非單價接合促進抗GITR抗體28F3之效應。該等結果共同表明，儘管活體外激動性抗GITR抗體之T細胞增強效應無需FcγRIIB共接合，但接合FcγRIIB受體可增強激動劑活性。抗GITR抗體可經改造以增加與FcγRIIB受體之結合以增加其激動作用。
實例15：抗GITR抗體28F3標記人類扁桃體中之淋巴球
為確定何種組織表現GITR，使用抗GITR抗體28F3進行各種組織中之GITR之免疫組織化學檢測。發現非淋巴組織中之非特異性染色(包括心臟、肝、肺、腎、皮膚、周圍神經、甲狀腺、睾丸、前列腺)。僅在淋巴(包括扁桃體、脾及胸腺)及富含淋巴(結腸、胃、子宮之黏膜固有層)之組織中之淋巴球及/或單核細胞之離散亞組中觀察到陽性染色。扁桃體中之染色示於圖44中。在濾泡間/濾泡旁區及生髮中心中之離散淋巴球中觀察到陽性染色。單核細胞(在上皮下方)及上皮浸潤性淋巴球之離散簇亦染色陽性。
實例16：MC38腫瘤模型中之變體抗GITR同型之抗腫瘤活性
DTA-1係激動性大鼠抗小鼠GITR抗體(Shimizu等人，2002；eBioscience,San Diego,CA)。已顯示在B16黑色素瘤處理期間此IgG2b抗體可調節Treg及Teff。另外，DTA-1之全效應需要由Teff及Treg 二者之GITR表現。Cohen等人(2010)表明，儘管由DTA-1之GITR接合並不總體消除Treg阻抑活性，但其損害Treg腫瘤浸潤並導致腫瘤內Treg內之Foxp3表現損失，此意味著阻抑之局部消除。淨結果係加強之腫瘤內Teff：Treg比率及腫瘤內較大Teff活化及功能。DTA-1阻斷GITR與GITR配體(GITRL)之間之相互作用且可溶性抗體有效促進活體外細胞反應。其亦在各種腫瘤模型中有效抑制腫瘤生長(例如，參見Turk等人，2004；Cohen等人，2010)。
a)實驗MC38編號1
在分級MC38結腸腺癌腫瘤模型中評價不同抗GITR(DTA-1)同型之抗腫瘤活性。向C57BL/6小鼠各自皮下注射2×106個MC38腫瘤細胞。7天後，將小鼠隨機分成5個治療組且在第7、10及14天如下以200μg/劑量以200μl之體積IP投與測試抗體：組1：小鼠IgG1對照(IgG)；組2：抗GITR大鼠IgG2b Ab(DTA-rG2b)；組3：抗GITR小鼠IgG1 Ab(DTA-mG1)；及組4：抗GITR小鼠IgG 2a Ab(DTA-mG2a)。在第15天收穫腫瘤及脾。
圖45C顯示，IgG1抗GITR處理之腫瘤以與經小鼠IgG1對照處理之腫瘤(圖45A)相當之速率生長，直至監測小鼠結束，10隻小鼠無一無腫瘤(TF)。然而，DTA-rG2b(圖45B)及DTA-mG2a(圖45D)顯著降低腫瘤生長之速率，其中10隻小鼠中分別3隻及2隻係TF。
經不同抗GITR同型處理之小鼠組之平均腫瘤體積及中值腫瘤體積的變化繪製於圖46A及46B中。該等曲線確認圖45中所示之個別小鼠數據，抗GITR抗體之IgG2b同型展現對MC38腫瘤生長之最有效力之抑制效應，其中IgG2a同型僅稍微較不有效力。IgG1同型顯示較小腫瘤生長抑制，其中平均及中值腫瘤體積類似於經小鼠IgG對照處理之小鼠中之彼等。
亦確定抗GITR同型對TIL及脾中MC38 T細胞亞組之效應。比較 經不同抗GITR同型處理之小鼠之MC38 TIL及脾中之T細胞亞組的群體。在脾中，DTA-m2a及DTA-r2b引起CD8+細胞之含量稍微減少，而9D9-m2a(抗CTLA-4抗體)及DTA-m1不改變CD8+ T細胞含量(圖47A)。所測試同型變體對脾中CD4+或CD4+Foxp3+細胞之百分比皆不具有顯著效應(圖47B及47C)。
在TIL中，9D9-m2a引起與小鼠IgG1對照相比CD8+細胞之百分比增加至少2倍(圖47D)。DTA-m2a具有較不明顯效應，從而將CD8+細胞之百分比增加約50%，而與小鼠IgG1同型對照相比，DTA-m1及DTA-r2b不引起或僅引起CD8+細胞百分比邊際增加(圖47D)。與小鼠IgG1同型對照相比，9D9-m2a引起CD4+細胞百分比小的增加，而DTA-m1不引起CD4+變化(圖47E)。相比之下，與小鼠IgG1同型相比，DTA-m2a及DTA-r2b二者將CD4+百分比降低40%至50%(圖47E)。
TIL中之CD4+Foxp3+ Treg含量觀察到最顯著效應。儘管DTA-m1對T細胞之此群體無效應，但與IgG1同型及DTA-m1相比，9D9-m2a及DTA-m2a誘導CD4+Foxp3+ Treg含量減少至約1/6(圖47F)。該等數據展示，抗GITR之IgG2a變體降低尤其腫瘤環境中之Treg含量。因此，IgG2a抗GITR同型在腫瘤位點處誘導CD8+ Teff增加及Treg減少，其轉化為升高之Teff對Treg比率，此指示穩健抗腫瘤活性。與IgG1對照相比，DTA-r2b亦誘導CD4+Foxp3+ Treg含量顯著降低，但並不與由9D9-m2a及DTA-m2a誘導之降低一樣明顯，此與大鼠IgG2b Fc區與鼠類活化FcγR之較低結合一致。該等數據展示，激動劑抗GITR抗體需要活化FcγR之接合用於耗盡活性。
對MC38 TIL及脾中T細胞之不同亞組之GITR表現程度之流式細胞量測顯示，GITR在腫瘤位點處在Treg上最高表現，表現程度高於末梢中之Treg或腫瘤位點處之CD8+ Teff上的表現程度，其又展現較末梢中CD8+或CD4+ Teff高之表現。在腫瘤位點處之CD4+ Teff上觀察到 GITR表現之最低相對程度。該等數據表明如下機制：其中若Fc融合蛋白之靶標在腫瘤位點處之Treg上相對於靶標在腫瘤位點處之Teff上之表現高度表現，且Fc融合蛋白結合至介導靶細胞之耗盡之活化FcR，則T細胞耗盡活性有助於刺激T細胞反應且藉此增強Fc融合蛋白之抗腫瘤效能。
b)實驗MC38編號2
由於DTA-1變體(商業獲得之初始形式之DTA-r2b除外)遇到之聚集，新一組同型變體經重新改造以獲得不聚集之DTA-1抗體。所觀察聚集追溯至已有意地納入經改造同型變體之輕鏈中之外來胺基酸，且此問題藉由去除此外來胺基酸得以緩和。在此實驗編號2中使用經重新改造之抗體。使用分級MC38模型評價經重新改造之抗GITR(DTA-1；GITR.7系列)同型之抗腫瘤活性。向C57BL/6小鼠各自皮下植入2×106個MC38細胞。7天後，將小鼠隨機分成7個治療組以便具有約148mm3/2之相當之平均腫瘤體積，且在第7、10及14天如下以200μg/劑量(只是mIgG對照係以200μg之劑量投與)IP投與測試抗體：組1：小鼠IgG1對照(mIgG或「同型」)；組2：抗GITR小鼠IgG1Ab(mGITR.7.mg1)；組3：抗GITR小鼠IgG1D265A同型(mGITR.7.mg1-D265A)；組4：抗GITR小鼠IgG2a Ab(mGITR.7.mg2a)；組5：抗GITR小鼠IgG2b Ab(mGITR.7.mg2b)；及組6：抗GITR大鼠IgG2b Ab(mGITR.7.r2b或DTA-1-rG2b)。在第15天收穫腫瘤及脾。
圖48B及48C顯示，IgG1及IgG1-D265A抗GITR處理之腫瘤以與經小鼠IgG1對照處理之腫瘤(圖48A)相當之速率生長。在每一情形下，直至植入後35天監測小鼠結束，9隻小鼠中無一係TF。然而，類似於實驗MC38編號1中之結果，mGITR.7.mg2a(圖48D)誘導最大腫瘤生長抑制，其中9隻小鼠中之2隻係TF。小鼠及大鼠抗GITR-2b抗體亦將腫瘤生長速率顯著降低至類似程度(圖48E及48F)，但在植入後35天，大 鼠2b抗體產生1隻TF小鼠，而小鼠2b抗體不產生任何TF小鼠。
平均腫瘤體積及中值腫瘤體積變化顯示於圖49A及49B中。趨勢類似於彼等於MC38實驗1中所觀察到者，只是IgG2a抗GITR同型係最有效力之MC38腫瘤生長抑制劑，而IgG2b同型展現顯著但較低之抑制腫瘤生長之功效。與小鼠IgG對照相比，IgG1及IgG1-D265A同型顯示腫瘤生長之較低程度抑制。
不同抗GITR同型對經處理小鼠之TIL及脾中Treg之群體的效應顯示於圖50中。如實驗編號1中所觀察，所測試同型變體對脾中CD4+Foxp3+ Treg之百分比均無巨大效應：最強效應係藉由用大鼠抗GITR IgG2b同型處理誘導之小於40%增加，而小鼠抗GITR IgG2b同型稍微降低CD4+Foxp3+ Treg之百分比。所測試之其他抗GITR同型及抗CTLA-4 IgG2a(9D9-mG2a)抗體稍微增加Treg之百分比(圖50A)。
相比之下，在TIL中，除IgG1同型(其與同型對照相比不引起變化)外，所測試之所有抗體皆誘導Treg之百分比顯著降低。與IgG1同型相比，抗CTLA-4抗體9D9-mG2a引起CD4+Foxp3+ Treg之含量減少至約1/4；抗GITR小鼠2a及2b同型及大鼠2b同型皆將Treg之含量降低至約1/2，且IgG1-D265A突變體引起稍微較低減少(圖50B)。該等數據確認實驗編號1中觀察到之效應展示，抗GITR mG2a、mG2b及rG2b同型在腫瘤環境中誘導顯著Treg耗盡，其與腫瘤生長抑制相關。
實驗MC38編號2中獲得之數據與彼等於實驗編號1中所獲得者大大一致，此表明抗體之聚集不會過度地干擾抗體之活性。所聚集抗體可能在小鼠中快速經清除，且因此，抗體聚集在本發明活體內分析中可不成顯著問題。
實例17：分級Sa1N腫瘤模型中變體抗GITR同型之抗腫瘤活性
亦在A/J小鼠中之Sa1N肉瘤模型中評價抗GITR之抗腫瘤活性。向小鼠皮下注射2×106個Sa1N細胞/植入體。7天後，測定腫瘤體積並 將小鼠隨機分成治療組以便具有相當之平均腫瘤體積(約75mm3/2)。在第7、10及12天以200μg/劑量IP投與如實例10之實驗MC38編號1中所述經改造以具有不同同型之抗GITR(DTA-1)抗體。
對腫瘤生長之效應示於圖51中。用IgG2a抗GITR抗體之處理完全抑制腫瘤生長且直至植入後約第20天所有10隻小鼠皆係TF(圖51B)，且大鼠IgG2b同型具有類似效應，其中直至約第20天10隻小鼠中之9隻係TF(圖51C)。與IgG1同型對照處理之腫瘤之未抑制生長(圖51A)相比，IgG1(圖51D)及IgG1D265A(圖51E)同型將腫瘤抑制至一定程度，但此遠小於利用mIgG2a及rIgG2b同型所觀察到之抑制。圖52A及52B中所示之平均腫瘤體積及中值腫瘤體積變化確認與由mIgG1及mIgG1-D265A同型展現之腫瘤生長之遠較低抑制相比，mIgG2a及rIgG2b抗體對腫瘤生長之實質上完全抑制效應。
共同地，圖51及52中之數據確認，利用MC38腫瘤模型(實例10)獲得之數據顯示，與展現遠較低抗腫瘤活性之mIgG1(及mIgG1-D265A)同型相比，抗GITR mIgG2a及rIgG2b同型展現有效力之抗腫瘤活性。mIgG1及D265A變體抗體之Sa1N模型中之抗腫瘤活性與無Treg耗盡之GITR之激動作用的效應一致。
不同抗GITR同型對經處理小鼠之Sa1N TIL及脾中Treg之群體的效應顯示於圖53中。所測試之所有抗GITR同型變體皆誘導脾中CD4+Foxp3+ Treg之含量之約20-40%之相對較小增加。最高增加係藉由用小鼠抗GITR IgG2a同型之處理誘導，其引起與用抗CTLA-4 IgG2b(9D9-G2b)及IgG1-D265A(9D9-G1-D265A)抗體之處理相同之增加(圖53A)。在此GITR研究中使用後一抗CTLA-4同型作為陽性對照，此乃因先前已利用IgG2b同型觀察Treg耗盡。
與末梢中Treg之效應相比，抗GITR m2a及r2b同型以及抗CTLA-4 2b同型皆將腫瘤位點處Treg之含量降低至至多1/3.5(圖53B)。抗GITR IgG1同型及IgG1-D265A突變體二者皆誘導Treg百分比之約35%之較小減少，而抗CTLA-4 IgG1-D265A突變體不引起TIL中Treg百分比變化(圖53B)。因此，如MC38腫瘤模型中所觀察，抗GITR mG2a及rG2b同型在腫瘤環境中誘導顯著Treg耗盡，遠大於IgG1及IgG1-D265A抗體所誘導，此與腫瘤生長抑制相關。
實例18：抗GITR抗體及抗PD1拮抗劑抗體之組合之協同活性
為確認協同抗腫瘤效應是否可藉由組合DTA-1抗體與拮抗PD-1之抗體(一種提供抗腫瘤機制之抑制信號的分子)來獲得，使用分級MC38結腸腺癌模型評價抗體之組合對腫瘤體積之效應。在第7、10及14天將小鼠用(A)對照mIgG1、(B)mIgG+DTA-1、(C)mIgG+PD-1(純系4H2,BMS)及(D)PD-1+DTA-1處理。
對腫瘤生長之效應顯示於圖54中。用DTA-1抗體或抗PD-1抗體之處理個別地抑制腫瘤生長至特定程度，其中10隻小鼠中之2隻係TF。相比之下，直至第30天，DTA-1抗體及抗PD-1抗體之組合實質上增加TF小鼠之數目，其中10隻小鼠中之7隻係TF。如所預計，在投與對照mIgG之小鼠中無TF小鼠。
該等結果表明，激動性抗GITR抗體及拮抗性抗PD-1抗體之組合協同地用於抑制腫瘤生長。
實例19：CDR胺基酸突變對結合親和力之效應
此實例顯示，28F3之VH CDR3中之某些胺基酸殘基可突變成另一胺基酸而不顯著影響其結合親和力。
藉由使VH CDR3中之以下胺基酸中之一或多種突變生成28F3之48種突變體：M102、D106及M111(根據SEQ ID NO：13編號)，並測試以下活性：與3A9-hGITR細胞之結合及在板結合之抗CD3存在下3A9-hGITR細胞之IL-2分泌。如上文所述執行實驗。
結果示於圖55A及55B(與3A9-hGITR細胞之結合)、圖56A-F(IL- 2分泌)及表7中。
Figure 104118186-A0305-02-0218-28
Figure 104118186-A0305-02-0219-29
Figure 104118186-A0305-02-0220-30
結果指示，若干突變體具有與28F3之彼等相當之結合及活性，而其他突變降低結合及IL-2分泌中之一者或二者。以下突變體具有相當之結合及活性數據：M98V；M98V/D106E；M98L/D106E；M98I/D160E；及M98A/D106E。
實例20：恆定區修飾對GITR抗體激動劑活性之效應
此實例展示，包含IgG2鉸鏈之GITR抗體相對於具有IgG1鉸鏈之相同抗體具有增加之誘導自T細胞之IL-2及IFN-γ分泌的能力。
已在上述CHO-OKT3及3A9分析中觀察到，具有IgG2恆定區之雜交瘤衍生之抗體較重鏈恆定區切換成IgG1或較差效應物IgG1(IgG1.1)之重鏈恆定區的相同抗體更有效力地刺激細胞介素分泌。因此，在該等分析中在抗GITR抗體上進一步測試IgG2恆定區或鉸鏈之效應。
抗人類GITR抗體之重鏈可變區連接至以下重鏈恆定區：
Figure 104118186-A0305-02-0221-31
首先，比較該等GITR抗體之結合親和力與具有IgG1鉸鏈之GITR抗體之結合親和力。如實例2中所示測定結合親和力。如圖57中所示，具有IgG2鉸鏈之所有三種GITR抗體具有與具有IgG1鉸鏈之兩種GITR抗體類似之對活化T細胞之親和力。
其次，測試具有IgG1恆定區或IgG2鉸鏈/IgG1 Fc結構域之GITR 抗體誘導自經表現OKT3之CHO細胞刺激之T細胞之IL-2及IFN-γ分泌的能力，如實例13中所示。如圖58A及58B中所示，具有IgG2鉸鏈/IgG1 Fc結構域之抗體(「抗GITR.G2.g1f」)較具有IgG1恆定區之抗體(「抗GITR.g1f」)誘導自T細胞之IFN-γ及IL-2分泌至較高程度。利用該等恆定結構域之較差效應物型式獲得類似結果(圖58C)。
為進一步確認具有包含IgG2鉸鏈之抗GITR抗體之T細胞的增加活化，測試不同實驗格式中之IL-2分泌。在此實驗中，測試GITR抗體誘導自3A9-hGITR細胞(異常表現人類GITR之小鼠T細胞雜交瘤3A9細胞系)之IL-2分泌的能力，如實例13中所述。如圖59中所示，所有具有IgG2鉸鏈之抗體(抗GITR.g2、抗GITR.g2.g1f及抗GITR.g2.g1.1f)較含有對應體之其IgG1恆定區(「抗GITR.g1f及抗GITR.g1.1f」)皆誘導自3A9-hGITR細胞之IL-2分泌至較高程度。
該等結果共同表明，具有IgG2鉸鏈及g1或g1.1恆定區之抗GITR抗體較具有IgG1鉸鏈之相同抗體更有效力。一種用以解釋含有IgG2鉸鏈之GITR抗體之改良效應的潛在機制係相對於包含IgG1鉸鏈之相同抗體，細胞表面處該等抗體之增加之內化及/或增加之複合物形成。
實例21：抗GITR抗體誘導之增殖係Teff細胞固有的
使GITR在小鼠及人類調節性T(Treg)細胞上表現。文獻中之數據已顯示，在Treg細胞存在下激動性抗GITR抗體驅動小鼠CD4+Foxp3- T效應物(Teff)細胞之增殖。另外，已表明，此效應主要係經由抗GITR抗體與Teff細胞之結合而非對Treg細胞阻抑劑功能之直接效應來驅動。其他出版物顯示，抗GITR抗體驅動Treg細胞增殖且可誘導特徵在於Foxp3損失之Treg細胞譜系不穩定性。
為檢查抗GITR抗體對Treg細胞功能之效應，執行小鼠Treg細胞阻抑分析，其中在APC及遞增數目之Treg細胞存在下用抗CD3及抗小鼠GITR mAb DTA-1之各種同型刺激Teff細胞。結果顯示，與同型對 照相比，DTA-1抗體處理增加增殖。此外，IgG1、2a、2b及惰性IgG1 D265A同型皆有效增加Teff細胞增殖，藉此展示此系統中之抗GITR抗體功能無需FcR結合。
自前述實驗並不清楚增加之Teff增殖是否係由於作用於Treg及/或Teff細胞之抗GITR抗體。為解決此問題，使用人類GITR「敲入」(huGITR KI)小鼠。在該等小鼠中，用人類TNFRSF18基因置換編碼小鼠GITR之基因Tnfrsf18，且人類GITR類似於野生型小鼠中之muGITR表現；人類GITR在Teff及Treg細胞上表現，其中後者程度較高。發現抗人類GITR mAb 28F3能夠驅動huGITR KI小鼠之Teff細胞之增殖。由於28F3結合至人類GITR而非小鼠GITR，故可設定Treg阻抑分析系統，其中在Teff及Treg細胞上可差別地靶向GITR。此系統亦容許檢查28F3與人類IgG1或惰性IgG1.1 Fc區之間之功能差異。
基於CD4及CD25表現自huGITR KI及WT小鼠分選Treg及Teff細胞。將WT及huGITR Treg及Teff細胞混合成容許單腔靶向(unicompartmental targeting)Treg或Teff細胞與28F3(huGITR KI Teff細胞與野生型Treg細胞等)之組合。作為對照，包括28F3可結合至Treg及Teff細胞或不結合至任一者之情況。在APC及28F3 IgG1、28F3 IgG1.1或同型對照存在下用抗CD3刺激含有Teff及Treg細胞之培養物。
結果提供於圖60中。如所預計，在28F3可結合Treg及Teff兩種細胞時，觀察到Teff細胞增殖增加，且在28F3僅可結合Teff細胞之條件下維持此效應。相比之下，在28F3僅能夠結合Treg細胞時，相對於同型對照無Teff增殖增加。關於同型，在28F3顯示效應之條件中IgG1與IgG1.1 Fc之間無差異。此與上述數據一致，從而顯示抗GITR激動作用無需Fc交聯。總之，在此系統中，抗GITR抗體主要經由其調節Teff細胞功能之能力起作用而非經由抑制Treg細胞阻抑劑能力起作用。然 而，此並不排除GITR信號傳導對活體內Treg細胞之作用，此乃因抗GITR抗體可驅動Treg細胞增殖或為ADCC或ADCP提供Treg特異性靶標。
實例22：抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)
使用NK92/CD16細胞或原代NK細胞作為效應物評價28F3.IgG1f及28F3.IgG1.1f之活體外ADCC活性且使用已知表現GITR之多種細胞作為靶標。
在分析之前三天，藉由陰性選擇分離靶CD4+及CD8+ T細胞亞組且藉由CD25陽性選擇自CD4+ T細胞進一步分離Treg。將T細胞亞組中之每一者用CD2/CD3/CD28珠粒(Miltenyi Biotec)刺激三天以誘導GITR之上調。在分析之前一天，藉由陰性選擇(StemCell Technologies公司)自新鮮PBMC分離原代NK細胞並在補充有500IU/mL重組IL-2(R&D Systems)及1uM氫化可體松(hydrocortisone)(StemCell)之MyeloCult H5100培養基(StemCell)中培育過夜。在分析當天，將效應細胞(原代NK細胞或NK92/CD16)與鈣黃綠素AM標記之活化T細胞以指定效應物對靶標比率在1ug/mL 28F3.IgG1f及28F3.IgG1.1f存在下培育。
使用原代NK細胞或NK92/CD16細胞作為效應物，28F3.IgG1誘導活化CD4+ T效應物及Treg細胞溶解，而觀察到活化CD8+ T細胞較少溶解(圖61)。如所預計，使用NK92或原代NK細胞作為效應物，28F3.IgG1.1並不介導任何靶細胞之ADCC。因此，28F3.IgG1誘導活化CD4+ T效應物及Treg細胞溶解，且較低程度地誘導活化CD8+ T細胞溶解，且由28F3.IgG1誘導之溶解程度似乎與靶細胞上之GITR表現程度成正比。
實例23：人類GITR敲入小鼠中28F3.IgG1抗體之活性
此實例顯示，28F3.IgG1及28F3IgG1.1在具有人類免疫系統及人 類GITR蛋白之C57BL/6小鼠中之MC38腫瘤中具有抗腫瘤活性，且28F3.IgG1之抗腫瘤活性較強。
類GITR敲入小鼠之生成：對C57BL/6小鼠進行遺傳改造以表現人類GITR細胞外結構域(ECD)代替小鼠GITR ECD，從而保持小鼠跨膜及細胞質序列完整。藉由對具有抗人類GITR抗體之抗CD3/CD28活化之脾細胞進行染色確認人類/小鼠嵌合GITR之表現。
在具有10%熱不活化胎牛血清(FBS)、2mM L-麩醯胺酸、4.5g/L(45%)葡萄糖(10mL/L)及1mM丙酮酸鈉(10mL/L)之DMEM培養基中培養MC38細胞。細胞每2天以1：10分化。使用兩個隊列之小鼠，且對於兩個隊列而言，使用1-cm3注射器及25規半英吋針向每一小鼠之右側腹皮下植入0.2mL PBS中之75萬個MC38細胞。對於隊列1而言，在植入後第7天，根據腫瘤體積(L×W×H/2)將40隻小鼠隨機分成3組，每組12至13隻小鼠。所有組皆具有約174mm3/2之平均腫瘤體積。在第7、10及14天，以10mg/kg投與媒劑對照或mAb。對於隊列2而言，在植入後第7天，根據腫瘤體積(L×W×H/2)將10隻小鼠隨機分成2組，每組5隻小鼠。所有組皆具有約69mm3/2之平均腫瘤體積。在第7、10及14天，以10mg/kg投與媒劑對照或28F3.IgG1 mAb。
以表9中概述之濃度及日期向小鼠腹膜內(IP)投藥。
Figure 104118186-A0305-02-0225-32
直至研究終止每週量測兩次腫瘤及體重。利用Fowler電子數位測徑器(62379-531型；Fred V.Fowler公司，Newton,MA)以3維量測腫瘤，且使用來自Studylog Systems公司(South San Francisco,CA)之 StudyDirector軟體電子記錄數據。
在此腫瘤研究中，在植入後第52天終止隊列1。使用Microsoft Excel計算腫瘤體積及體重之平均值、標準偏差(SD)及中值。在100%及至少60%之研究動物分別保留於每一治療組中時，計算平均值及中值。在第15天收穫隊列2中之小鼠之腫瘤。
結果指示，在腫瘤植入後第22天，即在研究中之所有小鼠皆係活的時之最後一天，與同型對照抗體相比，10mg/kg劑量之28F3.IgG1顯示對MC38異種移植物之67%平均腫瘤生長抑制(TGI)。腫瘤TGI由表10中之治療組概述。藉由治療組之腫瘤生長曲線示於圖62A至62C中。藉由治療組之平均及中值腫瘤生長曲線提供於圖63A-63B中。在任何治療組中毒性皆不明顯，此乃因平均及中值體重變化小於20%。隨時間之小鼠體重及百分比變化示於圖64A-64B中。
Figure 104118186-A0305-02-0226-34
結果顯示，在植入後第22天，28F3.IgG1具有67% TGI，而28F3.IgG1.1f具有22% TGI，此指示在MC38腫瘤模型中兩種抗體皆減少腫瘤生長。另外，結果表明，在MC38腫瘤模型中，由28F3.IgG1之Fc結合增強抗腫瘤功效。
為研究28F3.IgG1對T細胞群體所具有之效應，在植入後第15天自每一治療組中之5隻小鼠收穫組織。利用gentleMACS Octo DissociatorTM(Miltenyi,San Diego,CA)處理脾及腫瘤。使用流式細胞術(FACS)針對T細胞標記物對單一細胞懸浮液進行染色。藉由流式細胞術利用Fortessa(BD Biosciences,San Jose,CA)檢測抗體螢光且利用電腦程式Flowjo(Flowjo,LLC,Ashland,OR)分析結果。
圖65及66中所示之結果顯示相對於同型對照降低之Treg細胞百分比，此與經28F3.IgG1處理之小鼠中之耗盡一致(圖65)。相反，28F3.IgG1組中之CD8+ T細胞百分比增加(圖66)。
因此，與同型對照相比，經28F3.IgG1處理之小鼠中之免疫監測表明，TGI可藉由Treg耗盡介導且CD8+ T細胞增加。
實例24：交聯28F3.IgG1增加其功效
此實例顯示，交聯28F3.IgG1增加其增強T細胞之IFN-γ分泌及促進T細胞增殖的功效。
在各種濃度之抗GITR抗體或對照試劑存在下將T細胞與CHO-OKT3細胞或CHO-OKT3-CD32a高共培養，且量測干擾素-γ(IFN-γ)分泌及細胞增殖。CHO-OKT3-CD32高細胞系具有極高含量之Fc受體CD32a及較其親代CHO-OKT3純系稍微較高之OKT3表現。
如下執行分析。反應者T細胞係自從Ficoll梯度(Amersham Bioscience 17-1440-03)利用CD4 T細胞分離套組(Life technologies，目錄號113.31D)及CD25微珠粒(Miltenyi，目錄號130-092-983)根據製造商之方案分離的人類PBMC獲得。將表現抗CD3scFv(OKT3)之CHO細胞(CHO-OKT3)或表現抗CD3scFv及CD32a之CHO細胞用RPMI培養基洗滌兩次，經受50K Rad之劑量之輻照。收穫細胞並將其以2.5×105/mL再懸浮於培養基(RPMI-1640，補充有10%胎牛血清、2mM L-麩醯胺酸、55nM β-巰基乙醇、1mM丙酮酸鈉及100U/mL青黴素/鏈黴素)中。在96孔TC級平底板(Costar)中每孔接種2.5×104個CHO細胞及1×105個T細胞。將細胞與以20μg/mL開始之8點4倍滴定之GITR抗 體一起培育。添加20μg/mL之無關hIgG1作為同型對照。包括僅具有細胞之試樣以顯示無任何處理之基線活性。在第3天收穫每一試樣之上清液用於IFN-γ量測(BD optEIA human IFN-g ELISA套組；BD Bioscience編號555142)。針對最後8小時培育藉由3H-胸苷納入評價細胞增殖。圖67及68中所示之結果指示，在28F3.IgG1存在下，相對於彼等與CHO-OKT3細胞共培養之細胞，自與CHO-OKT3-CD32a高共培養之T細胞分泌更多IFN-γ(圖67)。如所預計，利用較差效應物28F3.IgG1.1f抗體(其不結合至CD32a)未觀察到顯著差異。另外，在28F3.IgG1存在下，相對於彼等與CHO-OKT3細胞共培養之細胞，在與CHO-OKT3-CD32a高共培養之T細胞中觀察到更多T細胞增殖；利用較差效應物28F3.IgG1.1f抗體並未觀察到此效應(圖68)。因此，交聯28F3.IgG1增加其增強T細胞之IFN-γ分泌及促進T細胞增殖的功效。利用表現較低程度之CD32a之CHO-OKT3細胞亦觀察到對T細胞增殖之此增強效應。與在可溶時相比，在交聯時，GITR.6 g1.1f顯示較高含量之IFN-γ。此可能係相對於CHO-OKT3細胞在CHO-OKT3-CD32a高細胞上表現之OKT3含量稍微較高的反映。利用交聯GITR.6 g1f觀察之增加大於利用惰性同型所觀察者，此表明對交聯之正性益處。G1f型式即使於低劑量下亦促進高含量之IFN-γ，其中可溶性抗體展示相對於背景極小之激動作用，再次表明交聯之正性作用。
因此，28F3.IgG1及較差效應物28F3.IgG1抗體皆刺激IFN-γ產生並刺激T細胞增殖，然而，交聯28F3.IgG1進一步增加其增強T細胞之IFN-γ分泌及促進T細胞增殖的功效。
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表11提供成熟可變區及重鏈及輕鏈之序列及(若指示)具有信號肽之序列。
等效內容：
彼等熟習此項技術者僅使用常規實驗即可認識或能夠確定本文所揭示具體實施例之許多等效內容。此等等效內容皆意欲涵蓋在下文申請專利範圍內。
<110> 美商必治妥美雅史谷比公司
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<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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Figure 104118186-A0305-02-0354-160
<210> 2
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
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<212> PRT
<213> 智人
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<211> 235
<212> PRT
<213> 馬來猴
<400> 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Figure 104118186-A0305-02-0360-170
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
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<211> 124
<212> PRT
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<220>
<223> 合成
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Figure 104118186-A0305-02-0369-184
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
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<210> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
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<210> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<210> 17
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Figure 104118186-A0305-02-0374-191
Figure 104118186-A0305-02-0375-192
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<210> 18
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
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<210> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<210> 20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<210> 21
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<210> 22
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<220>
<223> 合成
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<210> 23
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<210> 24
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<213> 人工序列
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<210> 25
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<223> 合成
<400> 25
Figure 104118186-A0305-02-0381-204
<210> 26
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
Figure 104118186-A0305-02-0381-205
Figure 104118186-A0305-02-0382-206
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
Figure 104118186-A0305-02-0382-207
<210> 28
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
Figure 104118186-A0305-02-0383-208
Figure 104118186-A0305-02-0384-209
Figure 104118186-A0305-02-0385-210
<210> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
Figure 104118186-A0305-02-0385-211
Figure 104118186-A0305-02-0386-212
<210> 30
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
Figure 104118186-A0305-02-0386-213
Figure 104118186-A0305-02-0387-214
Figure 104118186-A0305-02-0388-215
<210> 31
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
Figure 104118186-A0305-02-0388-216
Figure 104118186-A0305-02-0389-217
Figure 104118186-A0305-02-0390-218
<210> 32
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
Figure 104118186-A0305-02-0391-219
Figure 104118186-A0305-02-0392-221
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
Figure 104118186-A0305-02-0392-885
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
Figure 104118186-A0305-02-0392-220
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
Figure 104118186-A0305-02-0393-222
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
Figure 104118186-A0305-02-0393-223
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
Figure 104118186-A0305-02-0393-224
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
Figure 104118186-A0305-02-0393-226
<210> 39
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
Figure 104118186-A0305-02-0394-227
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Figure 104118186-A0305-02-0394-228
Figure 104118186-A0305-02-0395-229
<210> 41
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
Figure 104118186-A0305-02-0395-230
Figure 104118186-A0305-02-0396-231
Figure 104118186-A0305-02-0397-232
<210> 42
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
Figure 104118186-A0305-02-0397-233
Figure 104118186-A0305-02-0398-235
<210> 43
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
Figure 104118186-A0305-02-0398-234
Figure 104118186-A0305-02-0399-236
Figure 104118186-A0305-02-0400-237
Figure 104118186-A0305-02-0401-238
<210> 44
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
Figure 104118186-A0305-02-0401-239
Figure 104118186-A0305-02-0402-240
Figure 104118186-A0305-02-0403-241
<210> 45
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
Figure 104118186-A0305-02-0403-242
Figure 104118186-A0305-02-0404-244
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
Figure 104118186-A0305-02-0404-243
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
Figure 104118186-A0305-02-0405-245
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
Figure 104118186-A0305-02-0405-246
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
Figure 104118186-A0305-02-0405-247
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
Figure 104118186-A0305-02-0405-248
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
Figure 104118186-A0305-02-0406-249
<210> 52
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
Figure 104118186-A0305-02-0406-250
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
Figure 104118186-A0305-02-0407-251
<210> 54
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
Figure 104118186-A0305-02-0407-252
Figure 104118186-A0305-02-0408-253
<210> 55
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
Figure 104118186-A0305-02-0408-254
Figure 104118186-A0305-02-0409-255
Figure 104118186-A0305-02-0410-256
<210> 56
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
Figure 104118186-A0305-02-0410-257
Figure 104118186-A0305-02-0411-258
<210> 57
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
Figure 104118186-A0305-02-0411-262
Figure 104118186-A0305-02-0412-260
<210> 58
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
Figure 104118186-A0305-02-0413-263
Figure 104118186-A0305-02-0414-264
Figure 104118186-A0305-02-0415-265
<210> 59
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
Figure 104118186-A0305-02-0415-266
Figure 104118186-A0305-02-0416-267
Figure 104118186-A0305-02-0417-268
<210> 60
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
Figure 104118186-A0305-02-0417-269
Figure 104118186-A0305-02-0418-270
<210> 61
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
Figure 104118186-A0305-02-0418-271
Figure 104118186-A0305-02-0419-272
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
Figure 104118186-A0305-02-0419-273
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
Figure 104118186-A0305-02-0420-277
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
Figure 104118186-A0305-02-0420-276
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
Figure 104118186-A0305-02-0420-275
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
Figure 104118186-A0305-02-0420-274
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
Figure 104118186-A0305-02-0421-278
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
Figure 104118186-A0305-02-0421-279
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
Figure 104118186-A0305-02-0421-280
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
Figure 104118186-A0305-02-0421-281
Figure 104118186-A0305-02-0422-282
<210> 71
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
Figure 104118186-A0305-02-0422-283
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
Figure 104118186-A0305-02-0423-284
<210> 73
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
Figure 104118186-A0305-02-0423-285
Figure 104118186-A0305-02-0424-286
Figure 104118186-A0305-02-0425-287
<210> 74
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
Figure 104118186-A0305-02-0425-288
Figure 104118186-A0305-02-0426-289
<210> 75
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
Figure 104118186-A0305-02-0427-290
Figure 104118186-A0305-02-0428-291
Figure 104118186-A0305-02-0429-292
<210> 76
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
Figure 104118186-A0305-02-0429-294
Figure 104118186-A0305-02-0430-295
Figure 104118186-A0305-02-0431-296
<210> 77
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
Figure 104118186-A0305-02-0431-297
Figure 104118186-A0305-02-0432-299
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
Figure 104118186-A0305-02-0432-298
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
Figure 104118186-A0305-02-0433-300
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
Figure 104118186-A0305-02-0433-301
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
Figure 104118186-A0305-02-0433-302
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
Figure 104118186-A0305-02-0434-305
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
Figure 104118186-A0305-02-0434-304
<210> 84
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
Figure 104118186-A0305-02-0434-303
Figure 104118186-A0305-02-0435-306
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
Figure 104118186-A0305-02-0435-307
<210> 86
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
Figure 104118186-A0305-02-0436-308
Figure 104118186-A0305-02-0437-309
Figure 104118186-A0305-02-0438-310
<210> 87
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
Figure 104118186-A0305-02-0438-311
Figure 104118186-A0305-02-0439-313
<210> 88
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
Figure 104118186-A0305-02-0439-312
Figure 104118186-A0305-02-0440-314
Figure 104118186-A0305-02-0441-315
<210> 89
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
Figure 104118186-A0305-02-0441-317
Figure 104118186-A0305-02-0442-318
Figure 104118186-A0305-02-0443-319
<210> 90
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
Figure 104118186-A0305-02-0444-320
Figure 104118186-A0305-02-0445-321
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 91
Figure 104118186-A0305-02-0445-324
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 92
Figure 104118186-A0305-02-0445-322
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 93
Figure 104118186-A0305-02-0445-323
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 94
Figure 104118186-A0305-02-0446-325
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 95
Figure 104118186-A0305-02-0446-326
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 96
Figure 104118186-A0305-02-0446-327
<210> 97
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
Figure 104118186-A0305-02-0446-328
Figure 104118186-A0305-02-0447-330
<210> 98
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
Figure 104118186-A0305-02-0447-329
Figure 104118186-A0305-02-0448-331
<210> 99
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 99
Figure 104118186-A0305-02-0448-332
<210> 100
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
Figure 104118186-A0305-02-0449-333
Figure 104118186-A0305-02-0450-334
Figure 104118186-A0305-02-0451-335
<210> 101
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
Figure 104118186-A0305-02-0451-336
Figure 104118186-A0305-02-0452-337
<210> 102
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
Figure 104118186-A0305-02-0452-338
Figure 104118186-A0305-02-0453-339
Figure 104118186-A0305-02-0454-340
<210> 103
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
Figure 104118186-A0305-02-0454-341
Figure 104118186-A0305-02-0455-342
Figure 104118186-A0305-02-0456-343
<210> 104
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
Figure 104118186-A0305-02-0457-344
Figure 104118186-A0305-02-0458-345
<210> 105
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 105
Figure 104118186-A0305-02-0458-346
Figure 104118186-A0305-02-0459-349
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
Figure 104118186-A0305-02-0459-348
<210> 107
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 107
Figure 104118186-A0305-02-0459-347
<210> 108
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 108
Figure 104118186-A0305-02-0460-350
<210> 109
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 109
Figure 104118186-A0305-02-0460-351
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 110
Figure 104118186-A0305-02-0460-352
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 111
Figure 104118186-A0305-02-0460-353
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 112
Figure 104118186-A0305-02-0461-357
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 113
Figure 104118186-A0305-02-0461-356
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 114
Figure 104118186-A0305-02-0461-355
<210> 115
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 115
Figure 104118186-A0305-02-0461-354
Figure 104118186-A0305-02-0462-358
<210> 116
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 116
Figure 104118186-A0305-02-0462-359
Figure 104118186-A0305-02-0463-360
<210> 117
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 117
Figure 104118186-A0305-02-0463-362
Figure 104118186-A0305-02-0464-363
Figure 104118186-A0305-02-0465-364
<210> 118
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 118
Figure 104118186-A0305-02-0465-365
Figure 104118186-A0305-02-0466-367
<210> 119
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 119
Figure 104118186-A0305-02-0466-366
Figure 104118186-A0305-02-0467-368
Figure 104118186-A0305-02-0468-369
<210> 120
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 120
Figure 104118186-A0305-02-0468-371
Figure 104118186-A0305-02-0469-372
Figure 104118186-A0305-02-0470-373
<210> 121
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 121
Figure 104118186-A0305-02-0471-374
Figure 104118186-A0305-02-0472-378
<210> 122
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
Figure 104118186-A0305-02-0472-377
<210> 123
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 123
Figure 104118186-A0305-02-0472-376
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 124
Figure 104118186-A0305-02-0472-375
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 125
Figure 104118186-A0305-02-0473-379
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 126
Figure 104118186-A0305-02-0473-382
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 127
Figure 104118186-A0305-02-0473-383
<210> 128
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 128
Figure 104118186-A0305-02-0473-384
Figure 104118186-A0305-02-0474-385
<210> 129
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 129
Figure 104118186-A0305-02-0474-386
Figure 104118186-A0305-02-0475-387
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 130
Figure 104118186-A0305-02-0475-388
<210> 131
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 131
Figure 104118186-A0305-02-0476-389
Figure 104118186-A0305-02-0477-390
Figure 104118186-A0305-02-0478-391
<210> 132
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 132
Figure 104118186-A0305-02-0478-392
Figure 104118186-A0305-02-0479-393
<210> 133
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 133
Figure 104118186-A0305-02-0479-394
Figure 104118186-A0305-02-0480-395
<210> 134
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 134
Figure 104118186-A0305-02-0480-396
Figure 104118186-A0305-02-0481-397
Figure 104118186-A0305-02-0482-398
<210> 135
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 135
Figure 104118186-A0305-02-0483-399
Figure 104118186-A0305-02-0484-400
Figure 104118186-A0305-02-0485-401
<210> 136
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 136
Figure 104118186-A0305-02-0485-402
Figure 104118186-A0305-02-0486-403
<210> 137
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 137
Figure 104118186-A0305-02-0486-404
Figure 104118186-A0305-02-0487-405
<210> 138
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 138
Figure 104118186-A0305-02-0487-407
<210> 139
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 139
Figure 104118186-A0305-02-0487-406
Figure 104118186-A0305-02-0488-411
<210> 140
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 140
Figure 104118186-A0305-02-0488-410
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 141
Figure 104118186-A0305-02-0488-409
<210> 142
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 142
Figure 104118186-A0305-02-0488-408
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 143
Figure 104118186-A0305-02-0489-412
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 144
Figure 104118186-A0305-02-0489-413
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 145
Figure 104118186-A0305-02-0489-414
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 146
Figure 104118186-A0305-02-0489-415
<210> 147
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 147
Figure 104118186-A0305-02-0490-418
<210> 148
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 148
Figure 104118186-A0305-02-0490-417
<210> 149
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 149
Figure 104118186-A0305-02-0490-416
Figure 104118186-A0305-02-0491-419
<210> 150
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 150
Figure 104118186-A0305-02-0491-420
Figure 104118186-A0305-02-0492-421
<210> 151
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 151
Figure 104118186-A0305-02-0492-422
Figure 104118186-A0305-02-0493-423
<210> 152
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 152
Figure 104118186-A0305-02-0493-425
Figure 104118186-A0305-02-0494-426
<210> 153
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 153
Figure 104118186-A0305-02-0494-428
<210> 154
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 154
Figure 104118186-A0305-02-0495-430
<210> 155
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 155
Figure 104118186-A0305-02-0495-431
<210> 156
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 156
Figure 104118186-A0305-02-0495-432
Figure 104118186-A0305-02-0496-433
<210> 157
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 157
Figure 104118186-A0305-02-0496-434
Figure 104118186-A0305-02-0497-435
<210> 158
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 158
Figure 104118186-A0305-02-0497-436
<210> 159
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 159
Figure 104118186-A0305-02-0498-437
<210> 160
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 160
Figure 104118186-A0305-02-0498-446
Figure 104118186-A0305-02-0499-441
<210> 161
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 161
Figure 104118186-A0305-02-0499-443
<210> 162
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 162
Figure 104118186-A0305-02-0500-447
<210> 163
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 163
Figure 104118186-A0305-02-0500-448
<210> 164
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 164
Figure 104118186-A0305-02-0500-450
<210> 165
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 165
Figure 104118186-A0305-02-0501-451
Figure 104118186-A0305-02-0502-452
<210> 166
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 166
Figure 104118186-A0305-02-0502-453
<210> 167
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 167
Figure 104118186-A0305-02-0502-454
Figure 104118186-A0305-02-0503-459
<210> 168
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 168
Figure 104118186-A0305-02-0503-457
<210> 169
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 169
Figure 104118186-A0305-02-0503-458
Figure 104118186-A0305-02-0504-460
<210> 170
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 170
Figure 104118186-A0305-02-0504-462
Figure 104118186-A0305-02-0505-463
<210> 171
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 171
Figure 104118186-A0305-02-0505-464
<210> 172
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 172
Figure 104118186-A0305-02-0505-465
Figure 104118186-A0305-02-0506-466
<210> 173
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 173
Figure 104118186-A0305-02-0506-468
<210> 174
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 174
Figure 104118186-A0305-02-0506-470
Figure 104118186-A0305-02-0507-471
<210> 175
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 175
Figure 104118186-A0305-02-0507-474
Figure 104118186-A0305-02-0508-475
<210> 176
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 176
Figure 104118186-A0305-02-0508-478
<210> 177
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 177
Figure 104118186-A0305-02-0508-477
<210> 178
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 178
Figure 104118186-A0305-02-0509-479
<210> 179
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 179
Figure 104118186-A0305-02-0509-480
Figure 104118186-A0305-02-0510-482
<210> 180
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 180
Figure 104118186-A0305-02-0510-483
<210> 181
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 181
Figure 104118186-A0305-02-0511-484
<210> 182
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 182
Figure 104118186-A0305-02-0511-486
<210> 183
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 183
Figure 104118186-A0305-02-0512-488
<210> 184
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 184
Figure 104118186-A0305-02-0512-490
Figure 104118186-A0305-02-0513-491
<210> 185
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 185
Figure 104118186-A0305-02-0513-492
<210> 186
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 186
Figure 104118186-A0305-02-0514-493
<210> 187
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 187
Figure 104118186-A0305-02-0514-495
<210> 188
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 188
Figure 104118186-A0305-02-0514-497
Figure 104118186-A0305-02-0515-498
<210> 189
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 189
Figure 104118186-A0305-02-0515-499
Figure 104118186-A0305-02-0516-500
<210> 190
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 190
Figure 104118186-A0305-02-0516-501
<210> 191
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 191
Figure 104118186-A0305-02-0516-502
Figure 104118186-A0305-02-0517-504
<210> 192
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 192
Figure 104118186-A0305-02-0517-503
<210> 193
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 193
Figure 104118186-A0305-02-0518-505
<210> 194
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 194
Figure 104118186-A0305-02-0518-506
<210> 195
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 195
Figure 104118186-A0305-02-0518-508
<210> 196
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 196
Figure 104118186-A0305-02-0518-507
Figure 104118186-A0305-02-0519-512
<210> 197
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 197
Figure 104118186-A0305-02-0519-511
<210> 198
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 198
Figure 104118186-A0305-02-0519-510
<210> 199
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 199
Figure 104118186-A0305-02-0519-509
<210> 200
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 200
Figure 104118186-A0305-02-0520-513
<210> 201
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 201
Figure 104118186-A0305-02-0520-514
<210> 202
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 202
Figure 104118186-A0305-02-0521-516
<210> 203
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 203
Figure 104118186-A0305-02-0521-515
<210> 204
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 204
Figure 104118186-A0305-02-0522-517
<210> 205
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 205
Figure 104118186-A0305-02-0522-518
<210> 206
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 206
Figure 104118186-A0305-02-0522-519
<210> 207
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 207
Figure 104118186-A0305-02-0523-520
<210> 208
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 208
Figure 104118186-A0305-02-0523-521
Figure 104118186-A0305-02-0524-522
<210> 209
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 209
Figure 104118186-A0305-02-0524-523
<210> 210
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 210
Figure 104118186-A0305-02-0525-524
<210> 211
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 211
Figure 104118186-A0305-02-0525-525
<210> 212
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 212
Figure 104118186-A0305-02-0525-526
<210> 213
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 213
Figure 104118186-A0305-02-0525-527
Figure 104118186-A0305-02-0526-528
<210> 214
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 214
Figure 104118186-A0305-02-0526-529
<210> 215
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 215
Figure 104118186-A0305-02-0526-530
<210> 216
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 216
Figure 104118186-A0305-02-0527-533
<210> 217
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 217
Figure 104118186-A0305-02-0527-532
<210> 218
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 218
Figure 104118186-A0305-02-0527-531
<210> 219
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 219
Figure 104118186-A0305-02-0528-534
<210> 220
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 220
Figure 104118186-A0305-02-0528-536
<210> 221
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 221
Figure 104118186-A0305-02-0528-535
Figure 104118186-A0305-02-0529-537
Figure 104118186-A0305-02-0530-538
<210> 222
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 222
Figure 104118186-A0305-02-0530-539
Figure 104118186-A0305-02-0531-541
<210> 223
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 223
Figure 104118186-A0305-02-0531-540
Figure 104118186-A0305-02-0532-542
Figure 104118186-A0305-02-0533-543
<210> 224
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 224
Figure 104118186-A0305-02-0533-544
Figure 104118186-A0305-02-0534-545
Figure 104118186-A0305-02-0535-546
<210> 225
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 225
Figure 104118186-A0305-02-0535-547
Figure 104118186-A0305-02-0536-549
<210> 226
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 226
Figure 104118186-A0305-02-0537-550
Figure 104118186-A0305-02-0538-552
<210> 227
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 227
Figure 104118186-A0305-02-0538-551
Figure 104118186-A0305-02-0539-553
Figure 104118186-A0305-02-0540-554
<210> 228
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 228
Figure 104118186-A0305-02-0541-555
Figure 104118186-A0305-02-0542-556
Figure 104118186-A0305-02-0543-557
<210> 229
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 229
Figure 104118186-A0305-02-0543-558
Figure 104118186-A0305-02-0544-559
Figure 104118186-A0305-02-0545-560
<210> 230
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 230
Figure 104118186-A0305-02-0545-561
Figure 104118186-A0305-02-0546-562
Figure 104118186-A0305-02-0547-563
<210> 231
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 231
Figure 104118186-A0305-02-0547-564
Figure 104118186-A0305-02-0548-565
Figure 104118186-A0305-02-0549-566
<210> 232
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 232
Figure 104118186-A0305-02-0550-567
Figure 104118186-A0305-02-0551-568
Figure 104118186-A0305-02-0552-569
<210> 233
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 233
Figure 104118186-A0305-02-0552-570
Figure 104118186-A0305-02-0553-571
Figure 104118186-A0305-02-0554-572
<210> 234
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 234
Figure 104118186-A0305-02-0554-573
Figure 104118186-A0305-02-0555-574
Figure 104118186-A0305-02-0556-575
<210> 235
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 235
Figure 104118186-A0305-02-0556-576
Figure 104118186-A0305-02-0557-577
Figure 104118186-A0305-02-0558-578
Figure 104118186-A0305-02-0559-579
<210> 236
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 236
Figure 104118186-A0305-02-0559-581
Figure 104118186-A0305-02-0560-582
Figure 104118186-A0305-02-0561-583
<210> 237
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 237
Figure 104118186-A0305-02-0561-584
Figure 104118186-A0305-02-0562-585
Figure 104118186-A0305-02-0563-586
<210> 238
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 238
Figure 104118186-A0305-02-0563-587
Figure 104118186-A0305-02-0564-588
Figure 104118186-A0305-02-0565-592
<210> 239
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 239
Figure 104118186-A0305-02-0565-591
Figure 104118186-A0305-02-0566-593
Figure 104118186-A0305-02-0567-594
<210> 240
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 240
Figure 104118186-A0305-02-0568-595
Figure 104118186-A0305-02-0569-596
Figure 104118186-A0305-02-0570-597
<210> 241
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 241
Figure 104118186-A0305-02-0570-598
Figure 104118186-A0305-02-0571-599
Figure 104118186-A0305-02-0572-600
<210> 242
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 242
Figure 104118186-A0305-02-0572-601
Figure 104118186-A0305-02-0573-602
Figure 104118186-A0305-02-0574-603
<210> 243
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 243
Figure 104118186-A0305-02-0574-604
Figure 104118186-A0305-02-0575-605
Figure 104118186-A0305-02-0576-606
<210> 244
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 244
Figure 104118186-A0305-02-0577-607
Figure 104118186-A0305-02-0578-608
Figure 104118186-A0305-02-0579-609
<210> 245
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 245
Figure 104118186-A0305-02-0579-610
Figure 104118186-A0305-02-0580-611
Figure 104118186-A0305-02-0581-612
<210> 246
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 246
Figure 104118186-A0305-02-0581-613
Figure 104118186-A0305-02-0582-614
Figure 104118186-A0305-02-0583-615
<210> 247
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 247
Figure 104118186-A0305-02-0583-616
Figure 104118186-A0305-02-0584-617
Figure 104118186-A0305-02-0585-618
<210> 248
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 248
Figure 104118186-A0305-02-0586-619
Figure 104118186-A0305-02-0587-620
Figure 104118186-A0305-02-0588-621
<210> 249
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 249
Figure 104118186-A0305-02-0588-622
Figure 104118186-A0305-02-0589-623
Figure 104118186-A0305-02-0590-624
<210> 250
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 250
Figure 104118186-A0305-02-0590-625
Figure 104118186-A0305-02-0591-626
Figure 104118186-A0305-02-0592-627
<210> 251
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 251
Figure 104118186-A0305-02-0592-629
Figure 104118186-A0305-02-0593-630
Figure 104118186-A0305-02-0594-631
<210> 252
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 252
Figure 104118186-A0305-02-0595-632
Figure 104118186-A0305-02-0596-633
Figure 104118186-A0305-02-0597-634
<210> 253
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 253
Figure 104118186-A0305-02-0597-635
Figure 104118186-A0305-02-0598-636
Figure 104118186-A0305-02-0599-637
<210> 254
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 254
Figure 104118186-A0305-02-0599-638
Figure 104118186-A0305-02-0600-639
Figure 104118186-A0305-02-0601-640
<210> 255
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 255
Figure 104118186-A0305-02-0602-642
Figure 104118186-A0305-02-0603-643
Figure 104118186-A0305-02-0604-644
<210> 256
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 256
Figure 104118186-A0305-02-0604-645
Figure 104118186-A0305-02-0605-646
Figure 104118186-A0305-02-0606-647
<210> 257
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 257
Figure 104118186-A0305-02-0606-649
Figure 104118186-A0305-02-0607-650
Figure 104118186-A0305-02-0608-651
<210> 258
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 258
Figure 104118186-A0305-02-0608-652
Figure 104118186-A0305-02-0609-653
Figure 104118186-A0305-02-0610-654
<210> 259
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 259
Figure 104118186-A0305-02-0611-656
Figure 104118186-A0305-02-0612-657
Figure 104118186-A0305-02-0613-658
<210> 260
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 260
Figure 104118186-A0305-02-0613-659
Figure 104118186-A0305-02-0614-660
Figure 104118186-A0305-02-0615-661
<210> 261
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 261
Figure 104118186-A0305-02-0615-662
Figure 104118186-A0305-02-0616-663
Figure 104118186-A0305-02-0617-664
<210> 262
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 262
Figure 104118186-A0305-02-0618-665
Figure 104118186-A0305-02-0619-666
Figure 104118186-A0305-02-0620-667
<210> 263
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 263
Figure 104118186-A0305-02-0620-668
Figure 104118186-A0305-02-0621-669
Figure 104118186-A0305-02-0622-670
<210> 264
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 264
Figure 104118186-A0305-02-0622-671
Figure 104118186-A0305-02-0623-672
Figure 104118186-A0305-02-0624-673
<210> 265
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 265
Figure 104118186-A0305-02-0624-674
Figure 104118186-A0305-02-0625-675
Figure 104118186-A0305-02-0626-676
<210> 266
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 266
Figure 104118186-A0305-02-0627-677
Figure 104118186-A0305-02-0628-678
Figure 104118186-A0305-02-0629-679
<210> 267
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 267
Figure 104118186-A0305-02-0629-680
Figure 104118186-A0305-02-0630-681
Figure 104118186-A0305-02-0631-682
<210> 268
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 268
Figure 104118186-A0305-02-0631-683
Figure 104118186-A0305-02-0632-684
Figure 104118186-A0305-02-0633-685
<210> 269
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 269
Figure 104118186-A0305-02-0633-687
Figure 104118186-A0305-02-0634-688
Figure 104118186-A0305-02-0635-689
<210> 270
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 270
Figure 104118186-A0305-02-0636-690
Figure 104118186-A0305-02-0637-691
Figure 104118186-A0305-02-0638-692
<210> 271
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 271
Figure 104118186-A0305-02-0638-693
Figure 104118186-A0305-02-0639-694
Figure 104118186-A0305-02-0640-695
<210> 272
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 272
Figure 104118186-A0305-02-0640-696
Figure 104118186-A0305-02-0641-697
Figure 104118186-A0305-02-0642-698
<210> 273
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 273
Figure 104118186-A0305-02-0642-699
Figure 104118186-A0305-02-0643-700
Figure 104118186-A0305-02-0644-701
<210> 274
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 274
Figure 104118186-A0305-02-0645-702
Figure 104118186-A0305-02-0646-703
Figure 104118186-A0305-02-0647-704
<210> 275
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 275
Figure 104118186-A0305-02-0647-705
Figure 104118186-A0305-02-0648-706
Figure 104118186-A0305-02-0649-707
<210> 276
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 276
Figure 104118186-A0305-02-0649-708
<210> 277
<400> 277 000
<210> 278
<211> 98
<212> PRTT
<213> 智人
<400> 278
Figure 104118186-A0305-02-0650-709
<210> 279
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 279
Figure 104118186-A0305-02-0650-710
Figure 104118186-A0305-02-0651-711
<210> 280
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人
<400> 280
Figure 104118186-A0305-02-0651-713
<210> 281
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人
<400> 281
Figure 104118186-A0305-02-0651-712
Figure 104118186-A0305-02-0652-714
<210> 282
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 282
Figure 104118186-A0305-02-0652-715
Figure 104118186-A0305-02-0653-716
<210> 283
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 283
Figure 104118186-A0305-02-0653-717
Figure 104118186-A0305-02-0654-719
<210> 284
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 284
Figure 104118186-A0305-02-0654-718
Figure 104118186-A0305-02-0655-720
Figure 104118186-A0305-02-0656-721
<210> 285
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 285
Figure 104118186-A0305-02-0656-722
Figure 104118186-A0305-02-0657-723
Figure 104118186-A0305-02-0658-724
<210> 286
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 286
Figure 104118186-A0305-02-0658-725
Figure 104118186-A0305-02-0659-726
<210> 287
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 287
Figure 104118186-A0305-02-0660-727
Figure 104118186-A0305-02-0661-728
<210> 288
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 288
Figure 104118186-A0305-02-0661-729
Figure 104118186-A0305-02-0662-730
Figure 104118186-A0305-02-0663-731
<210> 289
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 289
Figure 104118186-A0305-02-0663-732
Figure 104118186-A0305-02-0664-733
<210> 290
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 290
Figure 104118186-A0305-02-0665-734
Figure 104118186-A0305-02-0666-735
<210> 291
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 291
Figure 104118186-A0305-02-0666-736
<210> 292
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 292
Figure 104118186-A0305-02-0667-737
<210> 293
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 293
Figure 104118186-A0305-02-0667-738
<210> 294
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 294
Figure 104118186-A0305-02-0667-739
<210> 295
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 295
Figure 104118186-A0305-02-0668-740
<210> 296
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 296
Figure 104118186-A0305-02-0668-741
<210> 297
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人
<400> 297
Figure 104118186-A0305-02-0668-742
Figure 104118186-A0305-02-0669-743
<210> 298
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 298
Figure 104118186-A0305-02-0669-744
<210> 299
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 299
Figure 104118186-A0305-02-0670-745
<210> 300
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 300
Figure 104118186-A0305-02-0670-746
<210> 301
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 301
Figure 104118186-A0305-02-0670-747
<210> 302
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 302
Figure 104118186-A0305-02-0670-748
<210> 303
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 303
Figure 104118186-A0305-02-0671-749
<210> 304
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 304
Figure 104118186-A0305-02-0671-750
<210> 305
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 305
Figure 104118186-A0305-02-0671-751
<210> 306
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 306
Figure 104118186-A0305-02-0671-752
<210> 307
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 307
Figure 104118186-A0305-02-0672-755
<210> 308
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 308
Figure 104118186-A0305-02-0672-754
<210> 309
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 309
Figure 104118186-A0305-02-0672-753
Figure 104118186-A0305-02-0673-756
<210> 310
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 310
Figure 104118186-A0305-02-0673-757
<210> 311
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 311
Figure 104118186-A0305-02-0673-758
<210> 312
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 312
Figure 104118186-A0305-02-0673-759
<210> 313
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 313
Figure 104118186-A0305-02-0674-762
<210> 314
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 314
Figure 104118186-A0305-02-0674-761
<210> 315
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 315
Figure 104118186-A0305-02-0674-760
<210> 316
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 316
Figure 104118186-A0305-02-0674-764
<210> 317
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 317
Figure 104118186-A0305-02-0675-765
<210> 318
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 318
Figure 104118186-A0305-02-0675-767
<210> 319
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 319
Figure 104118186-A0305-02-0675-769
<210> 320
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 320
Figure 104118186-A0305-02-0676-770
<210> 321
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 321
Figure 104118186-A0305-02-0676-771
<210> 322
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 322
Figure 104118186-A0305-02-0676-773
<210> 323
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 323
Figure 104118186-A0305-02-0676-774
<210> 324
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 324
Figure 104118186-A0305-02-0677-775
<210> 325
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 325
Figure 104118186-A0305-02-0677-776
<210> 326
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 326
Figure 104118186-A0305-02-0677-777
<210> 327
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 327
Figure 104118186-A0305-02-0678-778
<210> 328
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 328
Figure 104118186-A0305-02-0678-780
<210> 329
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 329
Figure 104118186-A0305-02-0678-781
<210> 330
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 330
Figure 104118186-A0305-02-0678-784
<210> 331
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 331
Figure 104118186-A0305-02-0679-785
<210> 332
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 332
Figure 104118186-A0305-02-0679-786
<210> 333
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 333
Figure 104118186-A0305-02-0679-787
<210> 334
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 334
Figure 104118186-A0305-02-0679-789
<210> 335
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 335
Figure 104118186-A0305-02-0680-790
<210> 336
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 336
Figure 104118186-A0305-02-0680-791
Figure 104118186-A0305-02-0681-792
<210> 337
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 337
Figure 104118186-A0305-02-0681-793
Figure 104118186-A0305-02-0682-794
Figure 104118186-A0305-02-0683-795
<210> 338
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 338
Figure 104118186-A0305-02-0683-797
Figure 104118186-A0305-02-0684-798
<210> 339
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 339
Figure 104118186-A0305-02-0685-799
Figure 104118186-A0305-02-0686-800
Figure 104118186-A0305-02-0687-801
<210> 340
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 340
Figure 104118186-A0305-02-0687-802
Figure 104118186-A0305-02-0688-803
Figure 104118186-A0305-02-0689-804
<210> 341
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 341
Figure 104118186-A0305-02-0689-805
Figure 104118186-A0305-02-0690-807
<210> 342
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 342
Figure 104118186-A0305-02-0690-806
<210> 343
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 343
Figure 104118186-A0305-02-0691-808
<210> 344
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 344
Figure 104118186-A0305-02-0691-809
<210> 345
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 345
Figure 104118186-A0305-02-0691-810
<210> 346
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 346
Figure 104118186-A0305-02-0692-812
<210> 347
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 347
Figure 104118186-A0305-02-0692-811
<210> 348
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 348
Figure 104118186-A0305-02-0692-813
Figure 104118186-A0305-02-0693-814
Figure 104118186-A0305-02-0694-815
<210> 349
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 349
Figure 104118186-A0305-02-0694-816
Figure 104118186-A0305-02-0695-817
Figure 104118186-A0305-02-0696-818
<210> 350
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 350
Figure 104118186-A0305-02-0697-820
Figure 104118186-A0305-02-0698-821
Figure 104118186-A0305-02-0699-822
<210> 351
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 351
Figure 104118186-A0305-02-0699-823
Figure 104118186-A0305-02-0700-824
Figure 104118186-A0305-02-0701-825
<210> 352
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 352
Figure 104118186-A0305-02-0701-826
Figure 104118186-A0305-02-0702-827
Figure 104118186-A0305-02-0703-828
<210> 353
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 353
Figure 104118186-A0305-02-0703-829
Figure 104118186-A0305-02-0704-834
<210> 354
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 354
Figure 104118186-A0305-02-0704-833
<210> 355
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 355
Figure 104118186-A0305-02-0704-832
Figure 104118186-A0305-02-0705-835
<210> 356
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 356
Figure 104118186-A0305-02-0705-838
Figure 104118186-A0305-02-0706-839
<210> 357
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 357
Figure 104118186-A0305-02-0706-840
Figure 104118186-A0305-02-0707-841
<210> 358
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 358
Figure 104118186-A0305-02-0707-842
<210> 359
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 359
Figure 104118186-A0305-02-0707-844
Figure 104118186-A0305-02-0708-846
<210> 360
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 360
Figure 104118186-A0305-02-0708-848
<210> 361
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 361
Figure 104118186-A0305-02-0708-845
Figure 104118186-A0305-02-0709-849
Figure 104118186-A0305-02-0710-850
Figure 104118186-A0305-02-0711-851
<210> 362
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 362
Figure 104118186-A0305-02-0711-852
Figure 104118186-A0305-02-0712-853
Figure 104118186-A0305-02-0713-854
<210> 363
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 363
Figure 104118186-A0305-02-0713-857
Figure 104118186-A0305-02-0714-858
<210> 364
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 364
Figure 104118186-A0305-02-0714-859
Figure 104118186-A0305-02-0715-861
<210> 365
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 365
Figure 104118186-A0305-02-0715-860
Figure 104118186-A0305-02-0716-862
<210> 366
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 366
Figure 104118186-A0305-02-0717-863
<210> 367
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 367
Figure 104118186-A0305-02-0717-864
<210> 368
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 368
Figure 104118186-A0305-02-0717-866
<210> 369
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 369
Figure 104118186-A0305-02-0718-868
<210> 370
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 370
Figure 104118186-A0305-02-0718-869
<210> 371
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 371
Figure 104118186-A0305-02-0718-870
Figure 104118186-A0305-02-0719-872
<210> 372
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 372
Figure 104118186-A0305-02-0719-871
Figure 104118186-A0305-02-0720-873
<210> 373
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 373
Figure 104118186-A0305-02-0720-874
<210> 374
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 374
Figure 104118186-A0305-02-0721-877
<210> 375
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 375
Figure 104118186-A0305-02-0721-876
<210> 376
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 376
Figure 104118186-A0305-02-0721-875
<210> 377
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(9)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸，且一者可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 377
Figure 104118186-A0305-02-0722-878
<210> 378
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 378
Figure 104118186-A0305-02-0722-879
<210> 379
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸，且一者可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 379
Figure 104118186-A0305-02-0723-881
<210> 380
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 380
Figure 104118186-A0305-02-0723-880
<210> 381
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 381
Figure 104118186-A0305-02-0724-882
<210> 382
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 382
Figure 104118186-A0305-02-0724-884

Claims (35)

  1. 一種經分離單株抗體，其結合至人類糖皮質激素可誘導之TNF受體(GITR)，該抗體包含重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，其中該重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列分別包含SEQ ID NO：20、21及22，以及該輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列分別包含SEQ ID NO：23、24及25。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體刺激T細胞反應。
  4. 如請求項1或2之抗體，其中如藉由Scatchard分析所量測，該抗體以1nM或更小之KD結合至膜結合之人類GITR。
  5. 如請求項1或2之抗體，其中如藉由氫/氘交換質譜(HDX-MS)所測定，該抗體結合至成熟人類GITR(SEQ ID NO：4)之PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO：217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO：218)。
  6. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈序列及輕鏈序列，其中該重鏈序列及輕鏈序列分別包含如SEQ ID NO：15及16所示之胺基酸序列。
  7. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈序列及輕鏈序列，其中該重鏈序列及輕鏈序列分別包含如SEQ ID NO：17及19所示之胺基酸序列。
  8. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈序列及輕鏈序列，其中該重鏈序列及輕鏈序列分別包含如SEQ ID NO：18及19所示之胺基酸序列。
  9. 如請求項1或2之抗體，其包含：(a)兩條重鏈及兩條輕鏈，其中該重鏈各者包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且該輕鏈各者包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(b)兩條重鏈及兩條輕鏈，其中該重鏈各者包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，且該輕鏈各者包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；或(c)兩條重鏈及兩條輕鏈，其中該重鏈各者包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，且該輕鏈各者包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。
  10. 如請求項9之抗體，其包含於該兩條重鏈之間的分子間二硫鍵結。
  11. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為IgG1、IgG2或IgG4抗體。
  12. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為人類或人類化抗體。
  13. 一種核酸，其編碼如請求項1至12中任一項之抗體之重鏈及輕鏈或其可變區。
  14. 一種組合物，其包含如請求項1至12中任一項之抗體以及載劑。
  15. 如請求項14之組合物，其進一步包含一或多種額外治療劑。
  16. 如請求項15之組合物，其中該一或多種額外治療劑為抗PD1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體或其組合。
  17. 一種如請求項1至12中任一項之抗體或如請求項12至14中任一項之組合物於製造藥物之用途，其中該藥物係用於治療癌症。
  18. 如請求項17之用途，其中該癌症為膀胱癌、乳癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、食道癌、胃腸癌、胰臟癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎癌、頭頸癌、肺癌(例如NSCLC)、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝癌、肝細胞癌、甲狀腺癌、皮膚癌、中樞神經系統之贅瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤或病毒相關癌症。
  19. 如請求項17或18之用途，其中該藥物進一步包含一或多種額外治療劑，或該該藥物係用於與一或多種額外治療劑一起投藥。
  20. 如請求項19之用途，其中該額外治療劑為抗PD1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗PD-L1抗體或其組合。
  21. 一種雙特異性分子，其包含連接至具有第二結合特異性之分子之如請求項1至12中任一項之抗體。
  22. 一種表現載體，其包含如請求項13之核酸分子。
  23. 一種經下列表現載體轉化的細胞：(i)如請求項22之表現載體，或(ii)包含編碼如請求項1至12中任一項之抗體之重鏈的核酸之表現載體以及包含編碼如請求項1至12中任一項之抗體的輕鏈之另一表現載體。
  24. 一種免疫結合物，其包含連接至試劑之如請求項1至12中任一項之抗體。
  25. 一種套組，其包含如請求項1至12中任一項之抗體、如請求項21之雙特異性分子、或如請求項24之免疫結合物以及使用說明書。
  26. 一種製備抗GITR抗體或其抗原結合部分之方法，其包括在如請求項23之細胞中表現該抗體或其抗原結合部分，及自該細胞分離該抗體或其抗原結合部分。
  27. 一種體外(in vitro)刺激抗原特異性T細胞反應之方法，其包含使該T細胞與如請求項1至12中任一項之抗體、如請求項21之雙特異性分子、或如請求項24之免疫結合物接觸，以刺激抗原特異性T細胞反應。
  28. 一種體外活化或共刺激效應物T細胞之方法，其包含使效應物T 細胞與下列接觸：(i)如請求項1至12中任一項之抗體、如請求項21之雙特異性分子、或如請求項24之免疫結合物，以及(ii)CD3接觸，其中活化或共刺激該效應物T細胞。
  29. 一種體外增加T細胞中IL-2及/或IFN-γ產生之方法，其包含使該T細胞與有效量之如請求項1至12中任一項之抗體、如請求項21之雙特異性分子、或如請求項24之免疫結合物接觸。
  30. 一種體外增加T細胞增殖之方法，其包含使該細胞與有效量之如請求項1至12中任一項之抗體、如請求項21之雙特異性分子、或如請求項24之免疫結合物接觸。
  31. 一種如請求項1至12中任一項之抗體、如請求項21之雙特異性分子、或如請求項24之免疫結合物於製造藥物之用途，其中該藥物係用於增加個體中T細胞之IL-2及/或IFN-γ生產。
  32. 一種如請求項1至12中任一項之抗體、如請求項21之雙特異性分子、或如請求項24之免疫結合物於製造藥物之用途，其中該藥物係用於為有需要之個體減少或耗盡腫瘤中T調控性細胞數目，其中該抗體具有效應物功能或增強之效應物功能。
  33. 一種如請求項1至12中任一項之抗體、如請求項21之雙特異性分子、或如請求項24之免疫結合物於製造藥物之用途，其中該藥物係用於刺激個體之免疫反應。
  34. 如請求項33之用途，其中該個體患有腫瘤且該藥物刺激對抗該 腫瘤之免疫反應。
  35. 一種如請求項1至12中任一項之抗體、如請求項21之雙特異性分子、或如請求項24之免疫結合物於製造藥物之用途，其中該藥物係用於抑制個體中腫瘤細胞生長。
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