JP6449338B2 - グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）に対する抗体およびその使用 - Google Patents

グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）に対する抗体およびその使用 Download PDF

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Description

関連出願の参照
本出願は、それぞれ２０１４年６月６日および２０１４年１１月２１日出願の“グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体(ＧＩＴＲ)に対する抗体およびその使用”なる表題の米国仮出願６２／００８,９４５号および６２／０８２,９８０号に基づく優先権を主張し、これらの内容を引用により本明細書に包含させる。
背景
ＴＮＦＲＳＦ１８、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７およびＧＩＴＲ−Ｄとしても知られる共刺激分子であるグルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)は、デキサメサゾン処理マウスＴ細胞株で最初に特定されたＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである(Nocentini et al., PNAS 1997;94:6216-21)。ＴＮＦ受容体ファミリーの他の関係するメンバーはＣＤ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢおよびＯＸ４０を含む。ＧＩＴＲ発現はナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞では低いが、制御性Ｔ細胞で構成的に発現されている(Tone et al., PNAS 2003;100:15059-64)。しかしながら、その発現がエフェクターＴ細胞で誘発されると、ＧＩＴＲ結合がその活性化、増殖およびサイトカイン産生を刺激する(Watts, Annual Reviews in Immunology 2005;23:23-68)。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)に関して、Shimizuは、混合培養抑制アッセイを使用して、ＧＩＴＲ結合がＴｒｅｇの機能を抑制すると報告した(Shimizu et al., Nature Immunology 2002;3:135-42)。しかしながら、その後のStephans et al(JI 2004 15;173(8):5008-20)による研究では、Ｔエフェクター(Ｔｅｆｆ)細胞上のＧＩＴＲ結合が、Ｔｒｅｇ−Ｔｅｆｆ細胞共培養で観察された抑制の低下を主要因として、Ｔｅｆｆ細胞をＴｒｅｇ抑制に低感受性とすることが測定された。ＤＴＡ−１(ラット抗マウスＧＩＴＲ)抗体介在ＧＩＴＲ刺激は、多数の腫瘍モデルにおいて抗腫瘍免疫を促進する。
ＧＩＴＲに対するリガンドであるＧＩＴＲ−Ｌは、抗原提示細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞)で低レベルで発現されるが、例えば、ウイルス感染による活性化により、これらの細胞で一過性に上方制御される(Suvas et al., J Virol. 2005;79:11935-42)。
癌のような疾患を標的とする改善された戦略に対する要望が継続していることを考慮して、ＧＩＴＲ活性を制御する増強された免疫応答、特に、Ｔ細胞応答、新規薬剤および方法からの利益が渇望される。
要約
ＧＩＴＲに特異的に結合し、望ましい機能的性質を有する単離抗体、例えばモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体がここに提供される。これらの性質は、ヒトＧＩＴＲへの高親和性結合、サルＧＩＴＲ(例えば、カニクイザルＧＩＴＲ)への結合および抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を含む。ここに記載する抗体は、腫瘍担持またはウイルス担持(ウイルス感染)対象におけるような抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するためおよびサンプル中のＧＩＴＲタンパク質を検出するために使用できる。
ある面において、ここに提供されるのは、単離抗体またはその抗原結合部分であり、これは、ＧＩＴＲに結合し、次の性質の少なくとも一つを示す：
(ａ) 可溶性ヒトＧＩＴＲに結合する；
(ｂ) 膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(ｃ) 膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合する；
(ｄ) Ｔ細胞活性化、例えば、抗原特異的Ｔ細胞活性化誘発または増強；
(ｅ) ＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合を阻害する；
(ｆ) ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を最大でも部分的に阻害する；
(ｇ) 成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)上の立体エピトープに結合する；
(ｈ) Ｏ結合ならびにＮグリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両者に結合する；
(ｉ) Ｆｃ受容体への結合非存在下でアゴニスト活性を有するが、ここで、Ｆｃ受容体への結合がさらにアゴニスト活性を増強する；そして
(ｊ) １以上の抗体２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および６Ｇ１０と、ヒトＧＩＴＲへの結合についていずれかの方向または双方向で競合する。
ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、抗腫瘍免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるサイトカイン産生(例えば、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ)を増加するおよび／またはＴ細胞増殖を増加する。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、Ｆｃ受容体に結合しない。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、１以上のＦｃγＲ、例えば、活性化または阻害性のＦｃγＲに結合する。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定して１０nM以下のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合し、スキャッチャードにより測定して１nM以下のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合し、ＦＡＣＳにより測定して１nM以下のＥＣ５０で膜結合ヒトＧＩＴＲに結合し、ＦＡＣＳにより測定して１０nM以下のＥＣ５０で膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合し、Ｔ細胞、例えば、Ｔｅｆｆ細胞を誘発または増強し、多価架橋結合を必要とせず活性化し、ＦＡＣＳで測定して１μg／mL以下のＥＣ５０でＧＩＴＲリガンドのＧＩＴＲへの結合を阻害しおよび／または成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)の領域ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)内に結合する。
ここに提供されるのは、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、これは、ＧＩＴＲに特異的に結合し、次のものから選択される可変重鎖および可変軽鎖対である３可変重鎖ＣＤＲおよび３可変軽鎖ＣＤＲを含む：
(ａ) 配列番号１３および１４；
(ｂ) 配列番号２６および２７；
(ｃ) 配列番号３９および４０；
(ｄ) 配列番号５２および５３；
(ｅ) 配列番号５２および５４；
(ｆ) 配列番号７１および７２；
(ｇ) 配列番号８４および８５；
(ｈ) 配列番号９７および９８；
(ｉ) 配列番号９７および９９；
(ｊ) 配列番号１１５および１１６；
(ｋ) 配列番号１２８および１２９；
(ｌ) 配列番号１２８および１３０；および
(ｍ) 配列番号３３５および３３６。
ここに提供されるのは、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、これは、ＧＩＴＲに結合し、次のものを含む：
(ａ) それぞれ配列番号２０、２１および２２を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号２３、２４および２５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｂ) それぞれ配列番号３３、３４および３５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号３６、３７および３８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
(ｃ) それぞれ配列番号４６、４７および４８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号４９、５０および５１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｄ) それぞれ配列番号６２、６３および６４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６５、６６および６７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｅ) それぞれ配列番号６２、６３および６４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６８、６９および７０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｆ) それぞれ配列番号７８、７９および８０を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号８１、８２および８３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｇ) それぞれ配列番号９１、９２および９３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号９４、９５および９６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｈ) それぞれ配列番号１０６、１０７および１０８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１０９、１１０および１１１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｉ) それぞれ配列番号１０６、１０７および１０８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１１２、１１３および１１４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｊ) それぞれ配列番号１２２、１２３および１２４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１２５、１２６および１２７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｋ) それぞれ配列番号１３８、１３９および１４０を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１４１、１４２および１４３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｌ) それぞれ配列番号１３８、１３９および１４０を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１４４、１４５および１４６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
(ｍ) それぞれ配列番号３４２、３４３および３４４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号３４５、３４６および３４７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列。
ここに提供されるのは、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、これは、ＧＩＴＲに結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、該重鎖可変領域は、配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ここに提供されるのは、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、これは、ＧＩＴＲに結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、該軽鎖可変領域は、配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ここに提供されるのは、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、これは、ＧＩＴＲに結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む：
(ａ) それぞれ配列番号１３および１４；
(ｂ) それぞれ配列番号２６および２７；
(ｃ) それぞれ配列番号３９および４０；
(ｄ) それぞれ配列番号５２および５３；
(ｅ) それぞれ配列番号５２および５４；
(ｆ) それぞれ配列番号７１および７２；
(ｇ) それぞれ配列番号８４および８５；
(ｈ) それぞれ配列番号９７および９８；
(ｉ) それぞれ配列番号９７および９９；
(ｊ) それぞれ配列番号１１５および１１６；
(ｋ) それぞれ配列番号１２８および１２９；
(ｌ) それぞれ配列番号１２８および１３０；および
(ｍ) それぞれ配列番号３３５および３３６。
ここに提供されるのは、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、これは、ＧＩＴＲに結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖および軽鎖配列を含む：
(ａ) それぞれ配列番号１５および１６；
(ｂ) それぞれ配列番号１７および１９；
(ｃ) それぞれ配列番号１８および１９；
(ｄ) それぞれ配列番号２８および２９；
(ｅ) それぞれ配列番号３０および３２；
(ｆ) それぞれ配列番号３１および３２；
(ｇ) それぞれ配列番号４１および４２；
(ｈ) それぞれ配列番号４３および４５；
(ｉ) それぞれ配列番号４４および４５；
(ｊ) それぞれ配列番号５５および５６；
(ｋ) それぞれ配列番号５５および５７；
(ｌ) それぞれ配列番号５８および６０；
(ｍ) それぞれ配列番号５９および６０；
(ｎ) それぞれ配列番号５８および６１；
(ｏ) それぞれ配列番号５９および６１；
(ｐ) それぞれ配列番号７３および７４；
(ｑ) それぞれ配列番号７５および７７；
(ｒ) それぞれ配列番号７６および７７；
(ｓ) それぞれ配列番号８６および８７；
(ｔ) それぞれ配列番号８８および９０；
(ｕ) それぞれ配列番号８９および９０；
(ｖ) それぞれ配列番号１０２および１０４；
(ｗ) それぞれ配列番号１０３および１０４；
(ｘ) それぞれ配列番号１００および１０１；
(ｙ) それぞれ配列番号１００および３７１；
(ｚ) それぞれ配列番号１０２および１０５；
(ｚａ) それぞれ配列番号１０３および１０５；
(ｚｂ) それぞれ配列番号１１７および１１８；
(ｚｃ) それぞれ配列番号１１９および１２１；
(ｚｄ) それぞれ配列番号１２０および１２１；
(ｚｅ) それぞれ配列番号１３１および１３２；
(ｚｆ) それぞれ配列番号１３４および１３６；
(ｚｇ) それぞれ配列番号１３５および１３６；
(ｚｈ) それぞれ配列番号１３１および１３３；
(ｚｉ) それぞれ配列番号１３４および１３７；
(ｚｊ) それぞれ配列番号１３５および１３７
(ｚｋ) それぞれ配列番号３３７および３３８；
(ｚｌ) それぞれ配列番号３３９および３４１；および
(ｚｍ) それぞれ配列番号３４０および３４１。
ある態様において、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、(ａ)ＧＩＴＲ上の２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および／または６Ｇ１０と同じエピトープに結合し、かつ(ｂ)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、活性化Ｔ細胞上の２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および／または６Ｇ１０のＧＩＴＲへの結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％阻害する。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)の領域ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)内に結合する。ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、ヒトおよびカニクイザルＧＩＴＲの両者に結合する。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体またはそのバリアントである。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、エフェクターレス(effectorless)ＩｇＧ１ Ｆｃ、例えば、次のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓの変異を有するエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃを含む。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、活性化ＦｃγＲに結合するか、または、例えば、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃに比して結合が増強されたＦｃを含む。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分のＣＤＲ領域におけるメチオニン残基は、酸化を受けないアミノ酸残基に置換される。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、ヒトまたはヒト化抗体である。
ここに提供されるのは、ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２アイソタイプのものではないＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の少なくとも一つを含む修飾重鎖定常領域を含む、ＧＩＴＲに結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、該抗ＧＩＴＲ抗体は、非ＩｇＧ２ヒンジを有する以外同一である抗ＧＩＴＲ抗体よりも増強されたアゴニスト活性を有する。
ある態様において、修飾重鎖定常領域は、配列番号２２３〜２２６および２８３〜２９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域またはそれらと異なるのが多くて５アミノ酸であるもしくは配列番号２２３〜２２６および２８３〜２９０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域を含む。
ある態様において、重鎖は配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらと異なるのが多くて１０アミノ酸であるもしくは配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖である。
ある態様において、軽鎖は、配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、５７、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７、３３８、３４１および３７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらと異なるのが多くて１０アミノ酸であるもしくは配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、５７、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７、３３８、３４１および３７１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である軽鎖である。
ここに提供されるのは、第二結合特異性を有する分子に連結された抗ＧＩＴＲ抗体を含む二重特異性分子である。
ここに提供されるのは、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸、核酸分子を含む発現ベクターおよび発現ベクターで形質転換された細胞である。
ここに提供されるのは、ある薬剤に連結させたここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を含むイムノコンジュゲートである。
ここに提供されるのは、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分および担体を含む組成物である。抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分および使用指示を含むキットもここに提供される。
ここに提供されるのは、抗ＧＩＴＲ抗体を細胞内で発現させ、該抗体を該細胞から単離することを含む、抗ＧＩＴＲ抗体を製造する方法である。
ここに提供されるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、Ｔ細胞と抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法である。
ここに提供されるのは、細胞、例えば、エフェクターＴ細胞と抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分およびＣＤ３を接触させることを含む、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞を活性化または共刺激する方法であって、ここで、エフェクターＴ細胞は活性化または共刺激される。
ここに提供されるのは、Ｔ細胞と抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分の有効量を接触させることを含む、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生および／またはＴ細胞の増殖を増加させる方法である。
ここに提供されるのは、Ｔ細胞からのＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させるために、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、抗ＧＩＴＲ抗体を含む二重特異性分子もしくはコンジュゲートまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含む組成物の有効量を投与することを含む、対象のＴ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる方法である。
ここに提供されるのは、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子もしくはコンジュゲートの有効量を投与することを含む処置を必要とする対象の腫瘍におけるＴ制御性細胞の数を減らすまたは枯渇させる方法であって、ここで、該抗体またはその抗原結合部分は、腫瘍におけるＴ制御性細胞の数を減らすためのエフェクターまたは増強されたエフェクター機能を有する。
ここに提供されるのは、対象における免疫応答が刺激されるように、対象に抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子もしくはコンジュゲートの有効量を投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法である。ある態様において、対象は腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。
ここに提供されるのは、対象において腫瘍の増殖が阻害されるように、対象に抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはコンジュゲートを投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻止する方法である。
ここに提供されるのは、癌を処置するために、処置を必要とする対象に抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、抗ＧＩＴＲ抗体を含む二重特異性分子またはコンジュゲートまたは抗ＧＩＴＲ抗体を含む組成物の治療有効量を投与することを含む、例えば、免疫療法により、癌を処置する方法である。ある態様において、癌は膀胱癌、乳癌、子宮／頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、胚細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌である。ある態様において、癌は転移性癌、難治性癌または再発性癌である。
ある態様において、ここに記載する方法は、さらに、抗ＧＩＴＲ抗体と１以上のさらなる治療剤、例えば、抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ−３抗体、ＣＴＬＡ−４抗体および／またはＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む。
ここに提供されるのは、サンプルと抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を、抗体またはその抗原結合部分とＧＩＴＲの複合体の形成を可能にする条件下で接触させ、複合体の形成を検出することを含む、サンプル中のＧＩＴＲの存在を検出する方法である。
ここに提供されるのは、癌の処置、対象における免疫応答の刺激、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激、Ｔ細胞の活性化または共刺激、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生および／またはＴ細胞の増殖の増加、腫瘍におけるＴ制御性細胞数の減少または枯渇および／または腫瘍細胞の増殖阻止のための、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の使用である。またここに提供されるのは、対象における免疫応答の刺激、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激、Ｔ細胞の活性化または共刺激、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生および／またはＴ細胞の増殖の増加、腫瘍におけるＴ制御性細胞数の減少または枯渇および／または腫瘍細胞の増殖阻止のための医薬の製造のための、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の使用である。
本発明の他の特性および利益は、次の詳細な記載および実施例から明らかとなり、これらは限定的と解釈してはならない。
モノクローナル抗体２８Ｆ３(それぞれ配列番号１３および１４)、１８Ｅ１０(それぞれ配列番号３９および４０)および１９Ｄ３(それぞれ配列番号２６および２７)の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。２８Ｆ３のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲは下線を引く。
２８Ｆ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４７)およびアミノ酸配列(配列番号１３)を示す。ＣＤＲ１(配列番号２０)、ＣＤＲ２(配列番号２１)およびＣＤＲ３(配列番号２２)領域を記載し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
２８Ｆ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４８)およびアミノ酸配列(配列番号１４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号２３)、ＣＤＲ２(配列番号２４)およびＣＤＲ３(配列番号２５)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
１８Ｅ１０ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５８)およびアミノ酸配列(配列番号３９)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４６)、ＣＤＲ２(配列番号４７)およびＣＤＲ３(配列番号４８)領域を記載し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
１８Ｅ１０ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５９)およびアミノ酸配列(配列番号４０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４９)、ＣＤＲ２(配列番号５０)およびＣＤＲ３(配列番号５１)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
１９Ｄ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５４)およびアミノ酸配列(配列番号２６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３３)、ＣＤＲ２(配列番号３４)およびＣＤＲ３(配列番号３５)領域を記載し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
１９Ｄ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１５５)およびアミノ酸配列(配列番号２７)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３６)、ＣＤＲ２(配列番号３７)およびＣＤＲ３(配列番号３８)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
３Ｃ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１６２)およびアミノ酸配列(配列番号５２)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６２)、ＣＤＲ２(配列番号６３)およびＣＤＲ３(配列番号６４)領域を記載し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
３Ｃ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ１)のヌクレオチド配列(配列番号１６３)およびアミノ酸配列(配列番号５３)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６５)、ＣＤＲ２(配列番号６６)およびＣＤＲ３(配列番号６７)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
３Ｃ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ２)のヌクレオチド配列(配列番号１６４)およびアミノ酸配列(配列番号５４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６８)、ＣＤＲ２(配列番号６９)およびＣＤＲ３(配列番号７０)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
２Ｇ６ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１６８)およびアミノ酸配列(配列番号７１)を示す。ＣＤＲ１(配列番号７８)、ＣＤＲ２(配列番号７９)およびＣＤＲ３(配列番号８０)領域を記載し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
２Ｇ６ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１６９)およびアミノ酸配列(配列番号７２)を示す。ＣＤＲ１(配列番号８１)、ＣＤＲ２(配列番号８２)およびＣＤＲ３(配列番号８３)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
８Ａ６ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１７２)およびアミノ酸配列(配列番号８４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号９１)、ＣＤＲ２(配列番号９２)およびＣＤＲ３(配列番号９３)領域を記載し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
８Ａ６ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１７３)およびアミノ酸配列(配列番号８５)を示す。ＣＤＲ１(配列番号９４)、ＣＤＲ２(配列番号９５)およびＣＤＲ３(配列番号９６)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
９Ｇ７ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１７６)およびアミノ酸配列(配列番号９７)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１０６)、ＣＤＲ２(配列番号１０７)およびＣＤＲ３(配列番号１０８)領域を記載し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
９Ｇ７ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ１)のヌクレオチド配列(配列番号１７７)およびアミノ酸配列(配列番号９８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１０９)、ＣＤＲ２(配列番号１１０)およびＣＤＲ３(配列番号１１１)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
９Ｇ７ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ２)のヌクレオチド配列(配列番号１７８)およびアミノ酸配列(配列番号９９)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１１２)、ＣＤＲ２(配列番号１１３)およびＣＤＲ３(配列番号１１４)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
１４Ｅ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１８２)およびアミノ酸配列(配列番号１１５)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１２２)、ＣＤＲ２(配列番号１２３)およびＣＤＲ３(配列番号１２４)領域を記載し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
１４Ｅ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１８３)およびアミノ酸配列(配列番号１１６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１２５)、ＣＤＲ２(配列番号１２６)およびＣＤＲ３(配列番号１２７)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
１９Ｈ８ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１８６)およびアミノ酸配列(配列番号１２８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１３８)、ＣＤＲ２(配列番号１３９)およびＣＤＲ３(配列番号１４０)領域を記載し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
１９Ｈ８ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ１)のヌクレオチド配列(配列番号１８７)およびアミノ酸配列(配列番号１２９)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１４１)、ＣＤＲ２(配列番号１４２)およびＣＤＲ３(配列番号１４３)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
１９Ｈ８ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域(ＶＫ２)のヌクレオチド配列(配列番号１８８)およびアミノ酸配列(配列番号１３０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１４４)、ＣＤＲ２(配列番号１４５)およびＣＤＲ３(配列番号１４６)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
６Ｇ１０ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号３５３)およびアミノ酸配列(配列番号３３５)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３４２)、ＣＤＲ２(配列番号３４３)およびＣＤＲ３(配列番号３４４)領域を記載し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
６Ｇ１０ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号３５４)およびアミノ酸配列(配列番号３３６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３４５)、ＣＤＲ２(配列番号３４６)およびＣＤＲ３(配列番号３４７)領域を記載し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
２８Ｆ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号１３)とヒト生殖系列ＶＨ ３−３３、３−１０およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、１９３および１９６)のアラインメントを示す。
２８Ｆ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号１４)とヒト生殖系列Ｖｋ Ｌ１８およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０４および２０５)のアラインメントを示す。
１８Ｅ１０の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号３９)とヒト生殖系列ＶＨ ３−３３、６−１９およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、１９９および１９７)のアラインメントを示す。
１８Ｅ１０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号４０)とヒト生殖系列Ｖｋ Ｌ１５およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０７および２０５)のアラインメントを示す。
１９Ｄ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号２６)とヒト生殖系列ＶＨ ３−３３、３−１６およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、２００および１９８)のアラインメントを示す。
１９Ｄ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号２７)とヒト生殖系列Ｖｋ Ｌ１５およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０７および２０５)のアラインメントを示す。
３Ｃ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号５２)とヒト生殖系列ＶＨ ４−３４およびＪＨ３アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０１および２０２)のアラインメントを示す。
３Ｃ３の軽鎖可変領域(ＶＫ１)のアミノ酸配列(配列番号５３)とヒト生殖系列Ｖｋ Ｌ１５およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０７および２０５)のアラインメントを示す。
３Ｃ３の軽鎖可変領域(ＶＫ２)のアミノ酸配列(配列番号５４)とヒト生殖系列Ｖｋ Ｌ２０およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０８および２０６)のアラインメントを示す。
２Ｇ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号７１)とヒト生殖系列ＶＨ ３−３３およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２および１９７)のアラインメントを示す。
２Ｇ６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号７２)とヒト生殖系列Ｖｋ Ｌ１５およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０７および２０５)のアラインメントを示す。
８Ａ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号８４)とヒト生殖系列ＶＨ ３−３３、３−１０およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、１９３および１９７)のアラインメントを示す。
８Ａ６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号８５)とヒト生殖系列Ｖｋ Ｌ１８およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０４および２０５)のアラインメントを示す。
９Ｇ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号９７)とヒト生殖系列ＶＨ ３−１５、３−１０およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０３、１９４および１９８)のアラインメントを示す。
９Ｇ７の軽鎖可変領域(ＶＫ１)のアミノ酸配列(配列番号９８)とヒト生殖系列Ｖｋ Ａ２７およびＪＫ１アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０９および２１０)のアラインメントを示す。
９Ｇ７の軽鎖可変領域(ＶＫ２)のアミノ酸配列(配列番号９９)とヒト生殖系列Ｖｋ Ａ２７およびＪＫ５アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０９および２１２)のアラインメントを示す。
１４Ｅ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号１１５)とヒト生殖系列ＶＨ ４−３４およびＪＨ３アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０１および２０２)のアラインメントを示す。
１４Ｅ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号１１６)とヒト生殖系列Ｖｋ Ｌ１５およびＪＫ１アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０７および２１１)のアラインメントを示す。
１９Ｈ８の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号１２８)とヒト生殖系列ＶＨ ３−３３、３−１０およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、１９５および１９６)のアラインメントを示す。
１９Ｈ８の軽鎖可変領域(ＶＫ１)のアミノ酸配列(配列番号１２９)とヒト生殖系列Ｖｋ Ｌ１８およびＪＫ１アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０４および２１１)のアラインメントを示す。
１９Ｈ８の軽鎖可変領域(ＶＫ２)のアミノ酸配列(配列番号１３０)とヒト生殖系列Ｖｋ Ｌ６およびＪＫ４アミノ酸配列(それぞれ配列番号２１３および２１４)のアラインメントを示す。
６Ｇ１０の重鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号３３５)とヒト生殖系列ＶＨ ３−３３、３−１０およびＪＨ６アミノ酸配列(それぞれ配列番号１９２、１９５および１９６)のアラインメントを示す。
６Ｇ１０の軽鎖可変領域(ＶＫ１)のアミノ酸配列(配列番号３３６)とヒト生殖系列Ｖｋ Ｌ１８およびＪＫ２アミノ酸配列(それぞれ配列番号２０４および２０５)のアラインメントを示す。
種々の抗ＧＩＴＲ抗体の、抗体非存在下、ＩｇＧ１およびｈＩｇＧ２抗体対照存在下の、ＦＡＣＳにより評価した活性化ヒトＴ細胞に対する結合親和性(nM)を示す。
種々の抗ＧＩＴＲ抗体の、抗体非存在下および対照としてのｈＩｇＧ１およびｈＩｇＧ２抗体存在下の、ＦＡＣＳにより評価した活性化カニクイザルＴ細胞に対する結合親和性(nM)を示す。
種々の抗ＧＩＴＲ抗体が、ＧＩＴＲ ３Ａ９細胞に対するＧＩＴＲリガンド(ＧＩＴＲ−Ｌ)の結合を阻害する能力を、対照としてのｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２存在下、抗体非存在下および細胞単独と共に示す。
組み換えＧＩＴＲ−Ｌの活性化ヒトＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞への結合を示す。
ＧＩＴＲ−Ｌが、２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１の活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を一部遮断することを示す。０.５μg／mLの一定濃度の２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１の活性化Ｔ細胞への結合は、予め結合させたＧＩＴＲ−Ｌにより、０.００２４μg／mLのＩＣ５０で一部遮断された。
２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１が０.６μg／mlのＧＩＴＲ−Ｌの活性化ヒトＴ細胞への結合を遮断しないことを示す。ＧＩＴＲ−ＬをＣＤ４＋Ｔ細胞に、約９０％の飽和度である０.６mg／mLで添加したとき、予め結合させた２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１は、１００mg／mL〜０.０００５６mg／mLの範囲で、ＧＩＴＲ−Ｌを遮断できなかった。
２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１は、０.０２μg／mlのＧＩＴＲ−Ｌの活性化ヒトＴ細胞への結合を一部遮断することを示す。２０ng／mLの固定濃度でのＧＩＴＲ−Ｌの活性化Ｔ細胞への結合は、予め結合させた２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１により、０.０７５μg／mLのＩＣ５０で一部遮断された。
抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３が、変性ではなく、未変性のヒトＧＩＴＲに結合し、結合がＮ結合グリコシル化の存在または不在により影響されないことを示す、ウェスタンブロットを示す。“＋”符号は、Ｎ結合グリコシル化を除去するためにＰＮＧａｓｅ Ｆで処理されたサンプルを示す。
ウェスタンブロット分析用にニトロセルロースに移す前の、ヒトＧＩＴＲの全ての形態の存在を示す、クーマシーブルー染色ゲルである。
２８Ｆ３および３Ｃ３抗体のエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ(１)、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ(２)、トリプシン(３)、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ(４)またはエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ(５)での消化により産生した未変性ＧＩＴＲフラグメントへの結合を示す。
未変性ヒトＧＩＴＲタンパク質のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃおよびトリプシン(“Ｇｌｕ−Ｃおよびトリプシン”)、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ(“Ａｒｇ−Ｃ”)、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃおよびトリプシン(“Ｌｙｓ−Ｃおよびトリプシン”)、トリプシンまたはエンドプロテイナーゼＡｓｐ−ＮおよびエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ(“ＡｓｐＮおよびＧｌｕＣ”)での消化により産生したヒトＧＩＴＲペプチドフラグメントに結合する抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３のヒートマップ図であり、２８Ｆ３抗体が結合するエピトープの位置を同定する(四角で囲んだ領域)。ヒトＧＩＴＲの成熟細胞外ドメインのアミノ酸配列は濃い灰色で示し、それにＣ末端に結合したマウスＦｃの配列を薄い灰色で示す。
２８Ｆ３被覆ビーズへの、未変性ヒトＧＩＴＲのトリプシン消化により得られたペプチドのインキュベーション後の、フロースルーフラクションにおけるペプチドを示す。
二つの主２８Ｆ３結合ペプチド(星印により示す)を示す。
図３４Ｂにおける２ピークの最初のものの、ＬＣ−ＭＳによる、示した配列を有し、Ｏ結合グリコシル化を欠くＮ末端ペプチドに対応するものとしての同定を示す。
図３４Ｂにおける２ピークの２番目のものの、ＬＣ−ＭＳによる、示した配列を有し、Ｔ２０にＯ結合グリコシル化を有するＮ末端ペプチドに対応するものとしての同定を示す。
２８Ｆ３と共にインキュベートした、長いペプチドのエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎでのインサイチュ消化後に残存するＧＩＴＲペプチドを示す。
ＧＩＴＲのＮ末端領域について８６％の配列包括度を達成する、組み換えヒトＧＩＴＲ／Ｆｃおよび組み換えヒトＧＩＴＲ／Ｆｃと２８Ｆ３ ＩｇＧ１のタンパク質複合体のための消化性ペプチドのリストを示す。
ＨＤＸマススペクトロメトリー(ＭＳ)による２８Ｆ３ ＩｇＧ１ ｍＡｂ(“ＧＩＴＲ.６”)非存在下／存在下の重水素取り込みレベルを示す。
ＨＤＸ ＭＳにより測定して、成熟ヒトＧＩＴＲにおける２８Ｆ３により結合される２領域を示す。
プレートに結合した抗ＣＤ３抗体の存在下の、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞によるＩＬ−２分泌に対する種々のアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体の効果を示す。
特異的抗原により活性化された３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞によるＩＬ−２分泌に対するアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体１８Ｅ１０、１３Ｈ２(２８Ｆ３と同じ)および２８Ｆ３の効果を示す。
特異的抗原により活性化された３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞によるＩＬ−２分泌に対する、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体３Ｃ３(“ＧＩＴＲ.３”として示す)、２８Ｆ３、１９Ｄ３および１８Ｅ１０の効果を示す。
ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞(すなわち、ＯＫＴ３ ｓｃｆｖを発現するＣＨＯ細胞)で刺激されたＴ細胞によるインターフェロンガンマ(ＩＦＮ−γ)分泌に対する、種々のアゴニスト抗ＧＩＴＲ ＨｕＭａｂｓ抗体の効果を示す。
ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞により刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌に対するアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の効果を示し、ここで、Ｔ細胞は第一ドナー由来である。
ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞により刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌に対する抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の効果を示し、ここで、Ｔ細胞は第一ドナー由来である。
ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞により刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌に対する抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の効果を示し、ここで、Ｔ細胞は第二ドナー由来である。
ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞により刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌に対する抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の効果を示し、ここで、Ｔ細胞は第二ドナー由来である。
ＨＥＬ４８−６３ペプチドの存在下ＬＫ３５.２細胞により刺激された３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞によるＩＬ−２分泌に対する抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３(ＩｇＧ２)、２８Ｆ３−Ｆ(ａｂ’)２フラグメントおよび２８Ｆ３−Ｆａｂの効果を示す。
ヒト扁桃検体のモノクローナル抗体２８Ｆ３−ＦＩＴＣでの免疫組織化学を示す。
ＭＣ３８結腸腺癌モデルにおける、ラット抗マウスＧＩＴＲ抗体、ＤＴＡ−１の種々のアイソタイプの、これらのアイソタイプで処置した個々のマウスにおける腫瘍体積の変化により測定した抗腫瘍活性に対する効果を示す：(図４５Ａ)対照マウスＩｇＧ１抗体(１０mg／kg)；(図４５Ｂ)ＤＴＡ−１ラットＩｇＧ２ｂ(１０mg／kg)；(図４５Ｃ)ＤＴＡ−１マウスＩｇＧ１(１０mg／kg)；(図４５Ｄ)ＤＴＡ−１マウスＩｇＧ２ａ(１０mg／kg)。群あたりの無腫瘍(ＴＦ)マウス数を、１０マウスの各群について示す。
種々のアイソタイプのＤＴＡ−１抗体(１０mg／kg)で処置されたマウスの群におけるＭＣ３８腫瘍の平均(図４６Ａ)および中央腫瘍体積(図４６Ｂ)の変化を示す。
示す種々の抗ＧＩＴＲ(ＤＴＡ−１)および抗ＣＴＬＡ−４(９Ｄ９)アイソタイプならびに対照抗体で処置したＭＣ３８腫瘍担持マウスからの脾臓(図４７Ａ−４７Ｃ)および腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)(図４７Ｄ−４７Ｆ)のフローサイトメトリー分析を示す。(図４７Ａ)脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ；(図４７Ｂ)脾臓におけるＣＤ４＋細胞のパーセンテージ；(図４７Ｃ)脾臓におけるＦｏｘｐ３＋でもあるＣＤ４＋細胞のパーセンテージ；(図４７Ｄ)ＴＩＬにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ；(図４７Ｅ)ＴＩＬにおけるＣＤ４＋細胞のパーセンテージ；(図４７Ｆ)ＴＩＬにおけるＦｏｘｐ３＋でもあるＣＤ４＋細胞のパーセンテージ。
ＭＣ３８モデルにおける、凝集を最小化するために再操作したラット抗マウスＧＩＴＲ抗体、ＤＴＡ−１の種々のアイソタイプ(“ｍＧＩＴＲ.７”と称す)の、これらのアイソタイプで処置した個々のマウスにおける腫瘍体積の変化により測定した抗腫瘍活性に対する効果を示す：(図４８Ａ)対照マウスＩｇＧ１抗体；(図４８Ｂ)ｍＧＩＴＲ.７ ｍＩｇＧ１；(図４８Ｃ)ｍＧＩＴＲ.７ ｍＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ；(図４８Ｄ)ｍＧＩＴＲ.７ ｍＩｇＧ２ａ；(図４８Ｅ)ｍＧＩＴＲ.７ ｍＩｇＧ２ｂ；(図４８Ｆ)ｍＧＩＴＲ.７ラットＩｇＧ２ｂ。群あたりのＴＦマウス数を、９マウスの各群について示す。
種々のアイソタイプの再操作したＤＴＡ−１抗体で処置したマウスの分におけるＭＣ３８腫瘍の平均(図４９Ａ)および中央腫瘍体積(図４９Ｂ)の変化を示す。
ＭＣ３８腫瘍担持マウスからの脾臓(図５０Ａ)およびＴＩＬ(図５０Ｂ)におけるＦｏｘｐ３＋／ＣＤ４＋Ｔｒｅｇに対する、種々のＤＴＡ−１(再操作“ｍＧＩＴＲ”ＤＴＡ−１または最初に操作された“ＤＴＡ−１”抗体)および抗ＣＴＬＡ−４(９Ｄ９)アイソタイプの効果のフローサイトメトリー分析を示す。
Ｓａ１Ｎ線維肉腫マウスモデルにおける、種々のマウスＤＴＡ−１アイソタイプの、これらのアイソタイプで処置した個々のマウスにおける腫瘍体積の変化により測定した抗腫瘍活性を示す：(図５１Ａ)対照マウスＩｇＧ１抗体；(図５１Ｂ)ＤＴＡ−１マウスＩｇＧ２ａ；(図５１Ｃ)ＤＴＡ−１ラットＩｇＧ２ｂ；(図５１Ｄ)ＤＴＡ−１マウスＩｇＧ１；(図５１Ｅ)ＤＴＡ−１マウスＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ。群あたりのＴＦマウス数を、最大１０マウスの各群について示す。
種々のアイソタイプのＤＴＡ−１抗体で処置したマウスの群における、Ｓａ１Ｎ腫瘍の平均(図５２Ａ)および中央腫瘍体積(図５２Ｂ)の変化を示す。
Ｓａ１Ｎ腫瘍担持マウスからの脾臓(図５３Ａ)およびＴＩＬ(図５３Ｂ)におけるＦｏｘｐ３＋／ＣＤ４＋Ｔｒｅｇに対する種々のＤＴＡ−１および抗ＣＴＬＡ−４(９Ｄ９)アイソタイプの効果を示す。
ステージ分類ＭＣ３８結腸腺癌モデルを使用する、腫瘍体積に対する、ラット抗ＧＩＴＲ抗体、ＤＴＡ−１の効果を示す。マウスを７日目、１０日目および１４日目に(図５４Ａ)対照ｍＩｇＧ１、(図５４Ｂ)ｍＩｇＧ＋ＤＴＡ−１、(図５４Ｃ)ｍＩｇＧ＋ＰＤ−１および(図５４Ｄ)ＰＤ−１＋ＤＴＡ−１で処置した。群あたりの無腫瘍(ＴＦ)マウス数を、１０マウスの各群について示す。
抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３におけるＶＨ ＣＤＲ３における変異の種々の組み合わせの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞への結合に対する効果を示す。
プレートに結合した抗ＣＤ３存在下の、抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３におけるＶＨ ＣＤＲ３における変異の種々の組み合わせの、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞から分泌されるＩＬ−２レベルを示す。
記載する抗ＧＩＴＲ抗体の活性化Ｔ細胞に対する結合親和性を示す。試験した抗体は、次の重鎖定常領域の一つからなった：ＩｇＧ１定常領域(“抗ＧＩＴＲ.ｇ１ｆ”)、エフェクターレスＩｇＧ１定常領域(“抗ＧＩＴＲ.ｇ１.１ｆ”)、ＩｇＧ２定常領域(“抗ＧＩＴＲ−Ｇ２”)、ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ１ Ｆｃドメイン(“抗ＧＩＴＲ.Ｇ２.Ｇ１ｆ”)およびＩｇＧ２ヒンジおよびエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃドメイン(“抗ＧＩＴＲ.Ｇ２.Ｇ１.１ｆ”)。
種々の重鎖定常領域を有する可溶性抗ヒトＧＩＴＲ抗体で刺激したドナーＣＤ４ Ｔ細胞からのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌を示す。図５８Ａは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および種々の濃度のＩｇＧ２−ＩｇＧ１定常領域を有する抗ヒトＧＩＴＲ抗体で刺激されたドナーＣＤ４ Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を示す。図５８Ｂは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および種々の濃度のＩｇＧ１重鎖定常ドメインまたはＩｇＧ２−ＩｇＧ１ハイブリッド重鎖定常ドメインで刺激されたドナーＣＤ４ Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を示す。図５８Ｃは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および種々の濃度の図５５ＡおよびＢにおける抗体のエフェクターレスバージョン(ＩｇＧ１.１)で刺激したドナーＣＤ４ Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を示す。
プレートに結合した抗ＣＤ３存在下の３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌に対する、記載する抗ＧＩＴＲ抗体の比較を示す。
ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞増殖に対する２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１の効果を示す。
２つの異なるドナーからの活性化ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞およびＴｒｅｇ富化細胞のＮＫ細胞誘発溶解に対する２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１.１”)の効果を示す。
ＭＣ３８腫瘍の増殖に対する対照ｈＩｇＧ１抗体、２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“抗ＧＩＴＲ ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(“抗ＧＩＴＲ ＩｇＧ１.１”)の効果を示す。
対照ｈＩｇＧ１抗体、２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“抗ＧＩＴＲ ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(“抗ＧＩＴＲ ＩｇＧ１.１”)で処置したマウスにおけるＭＣ３８腫瘍のそれぞれ平均体積および中央体積を示す。
対照ｈＩｇＧ１抗体、２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“抗ＧＩＴＲ ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(“抗ＧＩＴＲ ＩｇＧ１.１”)で処置したＭＣ３８腫瘍を有するマウスの、それぞれ平均％体重変化および中央％体重変化を示す。
ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＴｒｅｇ細胞の枯渇に対する、アイソタイプ対照と比較した、２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“ＧＩＴＲ ＩｇＧ１”)の効果を示す。
ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージに対する、アイソタイプ対照と比較した、２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“ＧＩＴＲ ＩｇＧ１”)の効果を示す。
ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞およびＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ細胞と共培養したときの、Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌に対する可溶性および架橋２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１.１”)の効果を示す。
ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞およびＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ細胞と共培養したときの、Ｔ細胞増殖に対する可溶性および架橋２８Ｆ３.ＩｇＧ１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１”)および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(“ＧＩＴＲ.６ＩｇＧ１.１”)の効果を示す。
詳細な記載
ここに記載するのは、ＧＩＴＲに特異的に結合し、それにより下流ＧＩＴＲシグナル伝達を活性化する単離抗体、特にモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体(“アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体”)である。ある態様において、ここに記載する抗体は特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列由来であり、そして／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域のような特定の構造的特徴を含む。ここに提供されるのは、単離抗体、このような抗体を製造する方法、このような抗体を含むイムノコンジュゲートおよび二重特異性分子および該抗体を含むように製剤された医薬組成物である。またここに提供されるのは、単独でまたは他の免疫刺激剤(例えば、抗体)および／または癌治療と組み合わせて、免疫応答増強のために該抗体を使用する方法である。よって、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、例えば、腫瘍増殖阻止およびウイルス感染処置を含む、広範な治療適用における処置に使用し得る。
定義
本記載がより容易に理解され得るために、いくつかの用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な記載において示す。
ここで使用する用語“グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体”または“ＧＩＴＲ”は、ＧＩＴＲリガンド(ＧＩＴＲ−Ｌ)に結合する、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである受容体をいう。ＧＩＴＲはまた腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１８(ＴＮＦＲＳＦ１８)、ＡＩＴＲおよびＣＤ３５７とも称される。用語“ＧＩＴＲ”はまた、細胞により天然に発現されるＧＩＴＲのあらゆるバリアントまたはアイソフォームを含む。よって、ここに記載する抗体は、ヒト以外の種からのＧＩＴＲ(例えば、カニクイザルＧＩＴＲ)と交差反応し得る。あるいは、抗体はヒトＧＩＴＲに特異的であってよく、他の種と交差反応性を示さなくてよい。ＧＩＴＲまたはそのあらゆるバリアントおよびアイソフォームは、それらを天然に発現する細胞または組織から単離してよくまたは当分野で周知のおよび／またはここに記載する技術を使用して組み換えにより産生してよい。
ヒトＧＩＴＲの３アイソフォームが同定されており、その全ては、Ｃ末端部分以外、同じ細胞外ドメインを共有する。バリアント１(Accession No. NP_004186；配列番号１)は２４１アミノ酸からなり、最長転写物を表す。これは、バリアント２と比較してフレームシフトをもたらす余分のコーディングセグメントを含む。得られたタンパク質(アイソフォーム１)は、アイソフォーム２と比較して、異なり、短いＣ末端を含む。バリアント２(Accession No. NP_683699；配列番号２)は、２５５アミノ酸からなる最長タンパク質(アイソフォーム２)をコードし、可溶性である。バリアント３(Accession No. NP_683700；配列番号３)は、バリアント２と比較してフレームシフトをもたらす余分のコーディングセグメントを含む。得られたタンパク質(アイソフォーム３)は、アイソフォーム２と比較して、異なり、短いＣ末端を含み、２３４アミノ酸からなる。
次に示すのは、３種の既知ヒトＧＩＴＲアイソフォーム、ｃｙｎｏ ＧＩＴＲおよびＧＩＴＲ−Ｌのアミノ酸配列である。
ヒトＧＩＴＲアイソフォーム１(Accession No. NP_004186；配列番号１；Accession No. NM_004195.2を有するヌクレオチド配列によりコード)：
ヒトＧＩＴＲアイソフォーム２(Accession No. NP_683699.１；配列番号２；Accession No. NM_148901.1を有するヌクレオチド配列によりコード)：
ヒトＧＩＴＲアイソフォーム３(Accession No. NP_683700.１；配列番号３；Accession No. NM_148902.1を有するヌクレオチド配列によりコード)：
アイソフォーム１〜３のシグナル配列は、アミノ酸１〜２５に対応する。それゆえに、成熟アイソフォーム１、２および３は、それぞれアミノ酸２６〜２４１、２５５または２３４からなる。成熟ＧＩＴＲの細胞外ドメインはアミノ酸２６〜１６２からなり、次のアミノ酸配列を有する。
カニクイザルＧＩＴＲタンパク質配列(配列番号５)：
ヒトＧＩＴＲ−Ｌタンパク質配列(Accession No. NP_005083.2；配列番号６)：
ここで使用する用語“抗体”は、抗体全体およびそのあらゆる抗原結合フラグメント(すなわち、“抗原結合部分”)または一本鎖を含む。“抗体”は、ある態様において、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重(Ｈ)鎖および２つの軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分をいう。各重鎖は重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域を含む。ある天然に存在する抗体において、重鎖定常領域は３ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。ある天然に存在する抗体において、各軽鎖は軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１ドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる、より保存された領域が分散した、相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分できる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端で次の順番で配置された、３ＣＤＲおよび４ＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃｌｑ)を含む因子への結合に介在し得る。
抗体は、一般に、その同族抗原に、１０−５〜１０−１１Ｍ以下の解離定数(ＫＤ)により反映される高親和性で特異的に結合する。約１０−４Ｍを超えるあらゆるＫＤは、非特異的結合を示すと一般に解釈される。ここで使用する抗原に“特異的に結合する”抗体は、ある抗原および実質的に同一の抗原に、１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは５×１０−９Ｍ以下、最も好ましくは１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ以下のＫＤを有することを意味する高親和性で結合するが、無関係の抗原には高親和性で結合しない抗体をいう。抗原は、ある抗原と高い程度の配列同一性を示すならば、例えば、ある抗原の配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％配列同一性を示すならば、当該抗原と“実質的に同一”である。例として、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する抗体はまた、ある霊長類種(例えば、カニクイザルＧＩＴＲ)からのＧＩＴＲ抗原と交差反応性し得るが、他の種からのＧＩＴＲ抗原またはＧＩＴＲ以外の抗原と交差反応し得ない。
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない一般的に知られるアイソタイプのいずれか由来であり得る。ＩｇＧアイソタイプは、特定の種におけるサブクラスに分割される：ヒトにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびにマウスにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１は、互いに多くても数アミノ酸異なる、数アロタイプ存在する。“抗体”は、例として、天然に存在するおよび天然に存在しない抗体の両方；モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトおよび非ヒト抗体；完全合成抗体；および一本鎖抗体を含む。
ここで使用する抗体の“抗原結合部分”なる用語は、抗原(例えば、ヒトＧＩＴＲ)に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメンをいう。このような“フラグメント”は、例えば約８〜約１５００アミノ酸長、適当には約８〜約７４５アミノ酸長、適当には約８〜約３００、例えば約８〜約２００アミノ酸または約１０〜約５０または１００アミノ酸長である。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントにより実施され得ることが示されている。抗体、例えば、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の“抗原結合部分”なる用語に含まれる結合フラグメントの例は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ’)２フラグメント；(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；(iv)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；および(vi)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)または(vii)所望により合成リンカーにより連結されていてよい２以上の単離ＣＤＲの組み合わせを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは別の遺伝子によりコードされるが、組み換え方法を使用して、一価分子を形成するためにＶＬおよびＶＨ領域が対になっている単一タンパク質鎖としてそれらが形成されることを可能とする、合成リンカーにより、連結できる(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として既知；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。このような一本鎖抗体もまた抗体の“抗原結合部分”なる用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られる慣用の技術を使用して得て、フラグメントは、インタクト抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ法またはインタクト免疫グロブリンの酵素もしくは化学開裂により製造できる。
“二重特異性”または“二機能性抗体”は、２種の異なる重鎖／軽鎖対および２種の異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含む多様な方法により産生される。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)参照。
ここで使用する用語“モノクローナル抗体”は、特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す抗体または全抗体が特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す抗体の組成物をいう。よって、用語“ヒトモノクローナル抗体”は、単一結合特異性を示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および任意的な定常領域を有する抗体または抗体組成物をいう。ある態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得たＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生する。
ここで使用する用語“組み換えヒト抗体”は、(ａ)ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたは染色体導入である動物(例えば、マウス)から単離された抗体またはそこから製造したハイブリドーマ、(ｂ)抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、(ｃ)組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および(ｄ)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む何らかの他の手段により製造、発現、創製または単離された抗体のような、組み換え手段により製造、発現、創製または単離された全ヒト抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する可変および定常領域を含み、生殖系列遺伝子によりコードされるが、例えば、抗体成熟中に生じる、その後の再配列および変異を含む。当分野で知られるように(例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125参照)、可変領域は、外来抗原に特異的な抗体を形成するために再配列される種々の遺伝子によりコードされる抗原結合ドメインを含む。再配列に加えて、可変領域は、さらに、外来抗原に対する抗体の親和性を高めるために、複数の一アミノ酸変更(体細胞性変異または超変異という)により修飾され得る。定常領域は、抗原へのさらなる応答において変化する(すなわち、アイソタイプスイッチ)。それゆえに、抗原に対する応答において軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再配列され、体細胞変異された核酸分子は、元の核酸分子と配列同一性を有しなくてよいが、むしろ実質的に同一または類似(すなわち、少なくとも８０％同一性)である。
“ヒト”抗体(ＨｕＭＡｂ)は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両者がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体をいう。さらに、抗体が定常領域を含むならば、該定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である。ここに記載する抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る(例えば、インビトロでランダム変異誘発または部位特異的変異誘発またはインビボで体細胞性変異により導入された変異)。しかしながら、ここで使用する用語“ヒト抗体”は、マウスのような他の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。用語“ヒト”抗体および“完全ヒト”抗体は、同義的に使用する。
“ヒト化”抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸のいくつか、大部分または全てがヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置き換えられた抗体をいう。抗体のヒト化形態のある態様において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸のいくつか、大部分または全ては、ヒト免疫グロブリンからのアミノ酸で置き換えられており、一方１以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸のいくつか、大部分または全ては変化していない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、特定の抗原に結合する抗体の能力を無効にしない限り、許容される。“ヒト化”抗体は、元の抗体に類似する抗原特異性を保持する。
“キメラ抗体”は、可変領域がマウス抗体由来であり、定常領域がヒト抗体由来である抗体のような、可変領域が一つの種由来であり、定常領域が他の種由来である抗体をいう。
ここで使用する“アイソタイプ”は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)をいう。
“アロタイプ”は、特異的アイソタイプ群内の天然に存在するバリアントをいい、このバリアントは数アミノ酸異なる(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。ここに記載する抗体は、あらゆるアロタイプであり得る。ここで使用する“ＩｇＧ１ｆ”または“ＩｇＧ１.１ｆ”アイソタイプと称される抗体は、それぞれ、アロタイプ“ｆ”のＩｇＧ１抗体およびエフェクターレスＩｇＧ１.１抗体、すなわち、例えば、配列番号７に示す、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指標に従い、２１４Ｒ、３５６Ｅおよび３５８Ｍを有するものである(表１１の配列番号７における下線を引いた残基参照)。
用語“抗原を認識する抗体”および“抗原に特異的な抗体”は、ここでは用語“抗原に特異的に結合する抗体”と相互交換可能に使用する。
ここで使用する“単離抗体”は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的に含まれない抗体をいう(例えば、ＧＩＴＲ以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にないＧＩＴＲに特異的に結合する単離抗体)。ＧＩＴＲのエピトープに特異的に結合する単離抗体は、しかしながら、異なる種由来の他のＧＩＴＲタンパク質と交差反応性を有し得る。
ここで使用する“ＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲへの結合を阻害する”抗体は、例えば、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を使用する結合アッセイにおいて、当分野で認知されている方法、例えば、ここに記載するＦＡＣＳベースの結合アッセイにおいて、約１μg／mL以下、例えば約０.９μg／mL以下、約０.８５μg／mL以下、約０.８μg／mL以下、約０.７５μg／mL以下、約０.７μg／mL以下、約０.６５μg／mL以下、約０.６μg／mL以下、約０.５５μg／mL以下、約０.５μg／mL以下、約０.４５μg／mL以下、約０.４μg／mL以下、約０.３５μg／mL以下、約０.３μg／mL以下、約０.２５μg／mL以下、約０.２μg／mL以下、約０.１５μg／mL以下または約０.１μg／mL以下のＥＣ５０で、ＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲへの結合を阻害する抗体をいう。
“エフェクター機能”は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体もしくはリガンドの相互作用またはそれに起因する生化学的事象をいう。“エフェクター機能”の例は、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞介在貪食(ＡＤＣＰ)のようなＦｃγＲ介在エフェクター機能ならびに細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)の下方制御を含む。このようなエフェクター機能は、一般にＦｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と結合していていることを必要とする。
“Ｆｃ受容体”または“ＦｃＲ”は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する受容体である。ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲは、これらの受容体の対立遺伝子変異型およびオルタナティブスプライシング型を含む、ＦｃγＲファミリーの受容体を含む。ＦｃγＲファミリーは、３活性化受容体(マウスにおけるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIIおよびＦｃγＲIV；ヒトにおけるＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲIIＡおよびＦｃγＲIIIＡ)および１阻害性受容体(ＦｃγＲIIＢ)からなる。ヒトＦｃγＲの種々の性質を表１に要約する。先天的エフェクター細胞型の大部分は１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲIIＢを共発現し、一方ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は、１活性化Ｆｃ受容体(マウスにおけるＦｃγＲIIIおよびヒトにおけるＦｃγＲIIIＡ)を選択的に発現するが、マウスおよびヒトにおける阻害性ＦｃγＲIIＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は大部分のヒトＦｃ受容体に結合し、それが結合する活性化Ｆｃ受容体のタイプに関して、マウスＩｇＧ２ａに相当すると考えられる。
“Ｆｃ領域”(結晶化フラグメント領域)または“Ｆｃドメイン”または“Ｆｃ”は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)上に位置するＦｃ受容体または古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)への結合を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を仲介する抗体の重鎖のＣ末端領域をいう。それゆえに、Ｆｃ領域は、抗体の第一定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、ＣＨ１またはＣＬ)以外の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２個の重鎖の第二(ＣＨ２)および第三(ＣＨ３)定常ドメイン由来の２個の同一タンパク質フラグメントを含み、ＩｇＭおよびＩｇＥ Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３重鎖定常ドメイン(ＣＨドメイン２〜４)を含む。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３およびＣγ１とＣγ２の間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変わるであろうが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常重鎖のＣ２２６またはＰ２３０(またはこれらの２アミノ酸間のアミノ酸)の位置からカルボキシ末端まで延びるアミノ酸残基を定義し、ここで、ナンバリングはＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指標に従う。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、約アミノ酸２３１〜約アミノ酸３４０に及び、一方ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、ＩｇＧの約アミノ酸３４１〜約アミノ酸４４７に及ぶ。ここで使用するＦｃ領域は、あらゆるアロタイプバリアントまたはバリアントＦｃ(例えば、天然に存在しないＦｃ)を含む、未変性配列Ｆｃであり得る。Ｆｃはまた単離におけるこの領域または、また“Ｆｃ融合タンパク質”(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)とも称する“Ｆｃ領域を含む結合タンパク質”のようなＦｃ含有タンパク質ポリペプチドの文脈におけるこの領域もいうことがある。
“未変性配列Ｆｃ領域”または“未変性配列Ｆｃ”は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。未変性配列ヒトＦｃ領域は、未変性配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域；未変性配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；未変性配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；および未変性配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ならびに天然に存在するそのバリアントを含む。未変性配列Ｆｃは、Ｆｃの種々のアロタイプを含む(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
“ヒンジ”、“ヒンジドメイン”または“ヒンジ領域”または“抗体ヒンジ領域”は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接続する重鎖定常領域のドメインをいい、ヒンジの上部、中間部および下部を含む(Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083)。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域の間に種々のレベルの柔軟性を提供し、２重鎖定常領域間の分子間ジスルフィド結合部位も提供する。ここで使用するヒンジは、全ＩｇＧアイソタイプについてＧｌｕ２１６から始まり、Ｇｌｙ２３７で終わる(Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083)。野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジの配列は、表２および９に示す。
＊ ＣＨ１ドメインのＣ末端アミノ酸配列。
用語“ヒンジ”は、野生型ヒンジ(例えば表１１に示すもの)ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないヒンジまたは修飾ヒンジ)を含む。例えば、用語“ＩｇＧ２ヒンジ”は、表１１に示すような野生型ＩｇＧ２ヒンジおよび１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＩｇＧ２ヒンジバリアントの例は、１、２、３または全４システイン(Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)が他のアミノ酸に変えられているＩｇＧ２ヒンジを含む。具体的態様において、ＩｇＧ２はＣ２１９Ｓ置換を含む。ある態様において、ヒンジは、少なくとも２アイソタイプからの配列を含むハイブリッドヒンジである。例えば、ヒンジは、あるアイソタイプからの上部、中間部または下部ヒンジおよび１以上の他のアイソタイプからのヒンジの残り部分を含んでよい。例えば、ヒンジはＩｇＧ２／ＩｇＧ１ヒンジであってよく、例えば、ＩｇＧ２の上部および中間部ヒンジおよびＩｇＧ１の下部ヒンジを含んでよい。ヒンジはエフェクター機能を有してよくまたはエフェクター機能が除かれていてよい。例えば、野生型ＩｇＧ１の下部ヒンジはエフェクター機能を提供する。
用語“ＣＨ１ドメイン”は、可変ドメインを重鎖定常ドメインにおけるヒンジと連結する重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ１ドメインは、Ａ１１８から始まり、Ｖ２１５で終わる。用語“ＣＨ１ドメイン”は、野生型ＣＨ１ドメイン(例えばＩｇＧ１について配列番号２７８およびＩｇＧ２について配列番号２７９を有する；表１１)ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ１ドメインまたは修飾ＣＨ１ドメイン)を含む。例えば、用語“ＣＨ１ドメイン”は、野生型ＣＨ１ドメインおよび１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＣＨ１ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期のような抗体の生物学的活性を修飾する変異を伴うＣＨ１ドメインを含む。抗体の生物学的活性に影響するＣＨ１ドメインへの修飾をここに提供する。
用語“ＣＨ２ドメイン”は、ヒンジを重鎖定常ドメインにおけるＣＨ３ドメインと連結する重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ２ドメインはＰ２３８から始まり、Ｋ３４０で終わる。用語“ＣＨ２ドメイン”は、野生型ＣＨ２ドメイン(例えばＩｇＧ１については配列番号２８０およびＩｇＧ２については配列番号２９７を有する；表１１)ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ２ドメインまたは修飾ＣＨ２ドメイン)を含む。例えば、用語“ＣＨ２ドメイン”は、野生型ＣＨ２ドメインおよび１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＣＨ２ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期のような抗体の生物学的活性を修飾する変異を伴うＣＨ２ドメインを含む。ある態様において、ＣＨ２ドメインは、エフェクター機能を低下させる置換Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを含む。抗体の生物学的活性に影響するＣＨ２ドメインへの他の修飾をここに提供する。
用語“ＣＨ３ドメイン”は、重鎖定常ドメインにおけるＣＨ２ドメインに対してＣ末端の重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ３ドメインはＧ３４１から始まり、Ｋ４４７で終わる。用語“ＣＨ３ドメイン”は、野生型ＣＨ３ドメイン(例えばＩｇＧ１について配列番号２８２およびＩｇＧ２について配列番号２９８を有する；表１１)ならびにそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ３ドメインまたは修飾ＣＨ３ドメイン)を含む。例えば、用語“ＣＨ３ドメイン”は、野生型ＣＨ３ドメインおよび１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＣＨ３ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期のような抗体の生物学的活性を修飾する変異を伴うＣＨ３ドメインを含む。抗体の生物学的活性に影響するＣＨ３ドメインへの修飾をここに提供する。
“未変性配列Ｆｃ領域”または“未変性配列Ｆｃ”は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する。未変性配列ヒトＦｃ領域は、未変性配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域；未変性配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；未変性配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；および未変性配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域ならびに天然に存在するそのバリアントを含む。未変性配列Ｆｃは、Ｆｃの種々のアロタイプを含む(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
用語“エピトープ”または“抗原決定基”は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する、抗原(例えば、ＧＩＴＲ)上の部位をいう。エピトープは、連続的アミノ酸(通常線状エピトープ)またはタンパク質の三次フォールディングにより隣り合った非連続的アミノ酸(通常立体エピトープ)の両者から形成され得る。連続的アミノ酸から形成されたエピトープは、常にではないが、一般に、変性溶媒への暴露により維持されるが、一方、三次フォールディングにより形成されたエピトープは、一般に変性溶媒での処理により喪失する。エピトープは、一般に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸を独特な空間的構造で含む。どのエピトープがある抗体により結合されるかを決定する(すなわち、エピトープマッピング)方法は当分野で周知であり、例えば、イムノブロッティングおよび免疫沈降アッセイを含み、ここで、(例えば、ＧＩＴＲ)からの重複または連続的ペプチドを、ある抗体(例えば、抗ＧＩＴＲ抗体)との反応性について試験する。エピトープの空間的構造を決定する方法は、当分野におけるおよびここに記載する方法、例えば、ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴およびＨＤＸ−ＭＳを含む(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照)。
用語“エピトープマッピング”は、抗体−抗原認識について分子決定基を同定する過程をいう。
２以上の抗体について“同じエピトープに結合する”なる用語は、ある方法において、複数の抗体がアミノ酸残基の同じセグメントに結合することを意味する。抗体が、ここに記載する抗体と“ＧＩＴＲ上の同じエピトープ”に結合するか否かを決定する技術は、例えば、エピトープマッピング法、例えば、エピトープの原子分解(atomic resolution)を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析および水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)を含む。他の方法は、抗原配列中のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失がしばしばエピトープ成分の指標と見なされる、抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異した異形への結合をモニターする。さらに、エピトープマッピングのためのコンピューターによるコンビナトリアル法も使用できる。これらの方法は、目的の抗体がコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーが特異的短ペプチドを親和性単離する能力に依存する。同じＶＨおよびＶＬまたは同じＣＤＲ１、２および３配列を有する抗体は、同じエピトープに結合すると予測される。
“標的への結合について他の抗体と競合する”抗体は、他の抗体の標的への結合を(部分的にまたは完全に)阻害する抗体をいう。２抗体が、標的への結合について互いに競合するか、すなわち、一方の抗体が他方の抗体の標的への結合を阻害するかおよびどの程度阻害するかは、既知競合実験を使用して決定し得る。ある態様において、抗体は、他の抗体の標的への結合と、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％競合し、阻害する。阻害または競合のレベルは、どちらの抗体が“遮断抗体”(すなわち、最初に標的とインキュベートされる冷抗体)であるかによる。競合アッセイを、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc ; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277またはChapter 11 of “Using Antibodies” by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載のように実施できる。競合する抗体は、同じエピトープ、重複するエピトープまたは隣接エピトープに結合する(例えば、立体障害により証明されるように)。
他の競合的結合アッセイは、固相直接的または間接的放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、固相直接的または間接的酵素免疫アッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)参照)；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)参照)；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al., Virology 176:546 (1990))；および直接標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))を含む。
ここで使用する用語“特異的結合”、“選択的結合”、“選択的に結合する”および“特異的に結合する”は、予定した抗原上のエピトープへの抗体結合をいう。一般に、抗体(ｉ)は、例えば、検体として予定した抗原、例えば、組み換えヒトＧＩＴＲおよびリガンドとして抗体を使用するＢＩＡＣＯＲＥ ２０００装置での表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)テクノロジーまたは抗体の抗原陽性細胞への結合のスキャッチャード分析により決定したとき、約１０−７Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれより低い平衡解離定数(ＫＤ)で結合し、かつ(ii)予定した抗原または密接に関係した抗原以外の非特異的抗原(例えば、ＢＳＡ、カゼイン)への結合の親和性より少なくとも２倍高い親和性で予定した抗原に結合する。よって、“ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する”抗体は、可溶性または細胞結合ヒトＧＩＴＲに、１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれより低いＫＤで結合する抗体をいう。“カニクイザルＧＩＴＲと交差反応する”抗体は、カニクイザルＧＩＴＲに１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれより低いＫＤで結合する抗体をいう。ある態様において、非ヒト種からのＧＩＴＲと交差反応しないこのような抗体は、標準結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して本質的に検出不可能な結合を示す。
ここで使用する用語“ｋａｓｓｏｃ”または“ｋａ”は、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度をいうことを意図し、一方ここで使用する用語“ｋｄｉｓ”または“ｋｄ”は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度をいうことを意図する。ここで使用する用語“ＫＤ”は、ｋｄ対ｋａ比(すなわち、ｋｄ／ｋａ)から得た解離定数であり、モル濃度(Ｍ)として表す。抗体のＫＤ値は、当分野で十分に確立されている方法を使用して決定できる。抗体のＫＤを決定する好ましい方法は、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ(登録商標)システムのようなバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード分析を使用することによる。
ここで使用する用語ＩｇＧ抗体に対する“高親和性”は、標的抗原に対して１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下およびさらに好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。しかしながら、“高親和性”結合は、他の抗体アイソタイプについて異なり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプについての“高親和性”結合は、１０−７Ｍ以下、より好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体をいう。
抗体またはその抗原結合フラグメントを使用するインビトロまたはインビボアッセイの文脈における用語“ＥＣ５０”は、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの中間である応答を誘発する抗体またはその抗原結合部分の濃度をいう。
用語“固定化ＧＩＴＲに結合する”は、ここに記載する抗体が、例えば、細胞表面上に発現されているまたは固体支持体に結合されているＧＩＴＲに結合する能力をいう。
ここで使用する用語“交差反応”は、ここに記載する抗体が、異なる種からのＧＩＴＲに結合する能力をいう。例えば、ヒトＧＩＴＲに結合するここに記載する抗体は、他の種のＧＩＴＲ(例えば、カニクイザルＧＩＴＲ)にも結合し得る。ここで使用する交差反応性は、結合アッセイ(例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ)における精製抗原との特異的反応性またはＧＩＴＲを生理学的に発現する細胞への結合または他の機能的相互作用の検出により測定し得る。交差反応性を決定する方法は、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ ２０００ ＳＰＲ装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用するＢｉａｃｏｒｅＴＭ表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析またはフローサイトメトリー方法による、ここに記載するような標準結合アッセイを含む。
ここで使用する、物体に対して適用される用語“天然に存在する”は、ある物体が天然に見ることができるとの事実をいう。例えば、天然の源から単離でき、研究室でヒトにより意図的に修飾されていない、生物(ウイルスを含む)に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
“ポリペプチド”は、少なくとも２個の連続的に結合したアミノ酸残基を含む鎖をいい、該鎖の長さの上限はない。タンパク質における１以上のアミノ酸残基は、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成のような、しかし、これらに限定されない修飾を含み得る。“タンパク質”は１以上のポリペプチドを含み得る。
ここで使用する用語“核酸分子”は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよく、ｃＤＮＡであり得る。
また提供されるのは、配列番号１３〜１９１におけるような、ここに、例えば、表１１に示す配列の“保存的配列修飾”、すなわち、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾であって、該ヌクレオチド配列によりコードされるまたは該アミノ酸配列を含む抗体の抗原への結合を無効にしない修飾である。このような保存的配列修飾は、保存的ヌクレオチドおよびアミノ酸置換ならびに、ヌクレオチドおよびアミノ酸付加および欠失を含む。例えば、修飾を、表１１における配列、例えば、配列番号１３〜１９１に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準方法により導入できる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものを含む。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それゆえに、抗ＧＩＴＲ抗体における予測される非必須アミノ酸残基を、好ましくは同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置き換える。抗原結合を除かないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は当分野で周知である(例えば、Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); and Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)参照)。
あるいは、他の態様において、飽和変異誘発によるように、抗ＧＩＴＲ抗体コード化配列の全体または一部に沿って変異を無作為に導入でき、得られた修飾抗ＧＩＴＲ抗体を、結合活性についてスクリーニングできる。
核酸について、用語“実質的相同性”は、２つの核酸またはその指定配列を、最適にアラインし、比較したとき、少なくともヌクレオチドの約８０％、通常ヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９.５％で、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴い、同一であることを示す。あるいは、セグメントが、鎖の相補体に選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするとき、実質的相同性が存在する。
ポリペプチドについて、用語“実質的相同性”は、２つのポリペプチドまたはその指定配列を、最適にアラインし、比較したとき、少なくともアミノ酸の約８０％、通常少なくともアミノ酸の約９０％〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９.５％で、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴い、同一であることを示す。
２配列間の同一性パーセントは、２配列の最適アラインメントのために導入することが必要であったギャップ数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列により共有される同一位置の関数である(すなわち、％相同性＝同一位置数／位置の総数×１００)である。２配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、下記の非限定的例のように、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。
２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)におけるギャッププログラムを使用して、NWSgapdna.CMPマトリクスおよびギャップ荷重４０、５０、６０、７０または８０および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定できる。２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に取り込まれているE. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用しても決定できる。さらに、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)におけるギャッププログラムに取り込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定できる。
ここに記載する核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するために、公的データベースに対するサーチを実施するための“クエリ配列”としてさらに使用できる。このようなサーチは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)を使用して実施できる。ここに記載する核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施できる。ここに記載するタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、ワード長＝３で実施できる。比較目的のためのギャップ付きアラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のようなGapped BLASTを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびGapped BLASTプログラムを使用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメータを使用できる。www.ncbi.nlm.nih.gov参照。
核酸は細胞全体、細胞ライセートまたは部分精製したもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準方法により、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞性核酸(例えば、染色体の他の部分)またはタンパク質から分離されて精製されたとき、“単離され”または“実質的に純粋にされ”る。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。
核酸、例えば、ｃＤＮＡは、遺伝子配列を提供するための標準方法に従い、変異させ得る。コーディング配列について、これらの変異は、望みどおり、アミノ酸配列に影響し得る。特に、未変性Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよびここに記載する他のこのような配列に実質的に相同であるかまたはこれらに由来するＤＮＡ配列が、考慮される(ここで、“由来する”は、配列が他の配列と同一または修飾形態であることを示す)。
ここで使用する用語“ベクター”は、結合している他の核酸を輸送できる核酸分子をいうことを意図する。ベクターの１タイプは“プラスミド”であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントを中にライゲートさせ得る環状二本鎖ＤＮＡループである。他のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントはウイルスゲノムにライゲートされ得る。あるベクターは、導入された宿主細胞内での自律的複製が可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに統合され、それにより宿主ゲノムと共に複製され得る。さらに、あるベクターは、操作可能に結合された遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは、ここでは“組み換え発現ベクター”(または単に、“発現ベクター”)と呼ぶ。一般に、組み換えＤＮＡ法で有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形である。本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は、プラスミドが最も一般的に使用される形態のベクターであるため、相互交換可能に使用し得る。しかしながら、同等の機能を提供するウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形態の発現ベクターも含まれる。
ここで使用する用語“組み換え宿主細胞”(または単に“宿主細胞”)は、細胞に天然に存在しない核酸を含む細胞をいうことを意図し、組み換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫もいうことを意図することは理解すべきである。変異または環境の影響により続く世代にある修飾が生じ得るため、このような子孫は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、なお、ここで使用する用語“宿主細胞”の範囲内である。
ここで使用する用語“抗原”は、タンパク質、ペプチドまたはハプテンのようなあらゆる天然または合成免疫原性物質をいう。抗原はＧＩＴＲまたはそのフラグメントであり得る。抗原は、保護的または治療的免疫応答が望まれる腫瘍抗原、例えば、腫瘍細胞により発現される抗原でもあり得る(例えば、抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせたワクチンにおける)。抗原は、癌の予防または処置用腫瘍関連抗原を含む。腫瘍関連抗原の例は、βｈＣＧ、ｇｐ１００またはＰｍｅｌ１７の配列の全てまたは一部を含む配列、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＷＴ１、メソセリン、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、ＴＲＰ−２、ｍｅｌａｎ−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＣＯ−５８、ＭＮ(ｇｐ２５０)、イディオタイプ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−Ａ３、チロシナーゼ、テロメラーゼ、ＳＳＸ２およびＭＵＣ−１抗原および胚細胞由来腫瘍抗原を含むが、これらに限定されない。腫瘍関連抗原はまた血液型抗原、例えば、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、ＬｅＸ、ＬｅＹ、Ｈ−２、Ｂ−１、Ｂ−２抗原も含む。あるいは、１を超える抗原を構築物に包含させ得る。例えば、ＭＡＧＥ抗原を、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２のようなアジュバントと共にメラニンＡ、チロシナーゼおよびｇｐ１００のような他の抗原と組み合わせ、抗ＡＰＣ抗体に結合できる。
上記抗原の配列は当分野で周知である。例えば、ＭＡＧＥ−３ ｃＤＮＡ配列の例は、ＵＳ６,２３５,５２５号に提供され(Ludwig Institute for Cancer Research)、ＮＹ−ＥＳＯ−１核酸およびタンパク質配列の例は、ＵＳ５,８０４,３８１およびＵＳ６,０６９,２３３号に提供され(Ludwig Institute for Cancer Research)、Ｍｅｌａｎ−Ａ核酸およびタンパク質配列の例は、ＵＳ５,６２０,８８６号およびＵＳ５,８５４,２０３号に提供され(Ludwig Institute for Cancer Research)、ＮＹ−ＢＲ−１核酸およびタンパク質配列の例は、ＵＳ６,７７４,２２６号およびＵＳ６,９１１,５２９号に提供され(Ludwig Institute for Cancer Research)、ＮＹ−ＣＯ−５８核酸およびタンパク質配列の例はＷＯ０２０９０９８６号に提供され(Ludwig Institute for Cancer Research)、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列の例は、GENBANK(登録商標)Accession No. AAA58637で入手可能であり、ヒト癌胎児性抗原様−１(ＣＥＡ−１)のヌクレオチド配列(ｍＲＮＡ)はGENBANK(登録商標)Accession No. NM020219で入手可能である。
“免疫応答”は、外来因子に対する脊椎動物内の生物学的応答であり、この応答は、これらの因子およびこれらの因子が原因の疾患から生物を守る。免疫応答は、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌性もしくは他の異常細胞、または、自己免疫もしくは病的炎症の場合、正常ヒト細胞もしくは組織の、選択的ターゲティング、それへの結合、その損傷、その破壊および／またはその脊椎動物の体からの排出を起こす、免疫系の細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球)およびこれらの細胞のいずれかもしくは肝臓により産生される可溶性巨大分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用により介在される。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のようなエフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞の活性化もしくは阻害またはＴｒｅｇ細胞の阻害を含む。
“免疫調節物質”または“イムノレギュレーター”は、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る薬剤、例えば、シグナル伝達経路の成分をいう。免疫応答の“調節”、“制御”または“修飾”は、免疫系の細胞またはこのような細胞(例えば、エフェクターＴ細胞)の活性の何らかの改変をいう。このような調節は、種々の細胞型の数の増減、これらの細胞の活性の増減または免疫系で生じ得る何らかの他の変化により顕在化し得る、免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性両者の免疫調節物質が同定されており、そのいくつかは、腫瘍微小環境において増強された機能を有し得る。好ましい態様において、免疫調節物質はＴ細胞の表面に位置する。“免疫調節性標的”または“免疫制御性標的”は、物質、薬剤、部分、化合物または分子による結合の標的とされ、その結合により活性が改変される、免疫調節物質である。免疫調節性標的は、例えば、細胞表面上の受容体(“免疫調節性受容体”)および受容体リガンド(“免疫調節性リガンド”)を含む。
“免疫療法”は、免疫応答の誘発、増強、抑制または他の修飾を含む方法による、疾患に罹患したまたは罹患するもしくは再発を有するリスクのある対象の処置をいう。
“免疫刺激療法”または“免疫刺激性治療”は、例えば、癌の処置のための、対象の免疫応答の増加(誘発または増強)をもたらす治療をいう。
“内因性免疫応答の増強”は、対象に存在する免疫応答の有効性または効力の増加を意味する。有効性および効力のこの増加は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機構に打ち勝つことによりまたは内因性宿主免疫応答を増強する機構を刺激することにより達成され得る。
“Ｔエフェクター”(“Ｔｅｆｆ”)細胞は、細胞溶解活性を有するＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞)ならびにサイトカインを分泌し、他の免疫細胞を活性化および配向させるＴヘルパー(Ｔｈ)細胞をいうが、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ細胞)を含まない。ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体はＴｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞を活性化する。
免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、Ｔ細胞共刺激受容体の増強されたアゴニスト活性および／または阻害性受容体の増強されたアンタゴニスト活性に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン遊離、細胞溶解活性(標的細胞で直接的にまたはＣＤ１０７ａまたはグランザイムの検出を介して間接的に測定)および増殖の変化を測定するアッセイにおけるＥＣ５０または活性の最大レベルの増加倍率により反映され得る。免疫応答または免疫系活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
ある態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まない同じ抗体と比較して、より強力なアゴニスト活性を有する。抗体の増強されたアゴニスト活性は、例えば、実施例に示すように、例えば、抗体と接触させたＴ細胞からのＩＦＮ−γまたはＩＬ−２分泌レベルを測定することにより決定できる。アゴニスト活性は、エフェクターＴ細胞におけるサイトカイン遊離増加または増殖増加；Ｔｒｅｇへの結合がＴｒｅｇ機能を低減させるならば、Ｔ制御性細胞活性低減；またはＴｒｅｇの枯渇増加により測定して、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。例えば、修飾重鎖定常領域を含む抗体で刺激されたＴ細胞から分泌されるＩＦＮ−γまたはＩＬ−２の量は、修飾重鎖定常領域を含まない同じ抗体で刺激されたＴ細胞より少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上高い。
ここで使用する用語“結合”は、２またはそれ以上の分子の結合をいう。結合は、共有でも非共有でもよい。結合はまた遺伝学的(すなわち、組み換えにより融合された)でもよい。このような結合は、化学的コンジュゲーションおよび組み換えタンパク質産生のような広範な当分野で認識される方法を使用して達成できる。
ここで使用する“投与”は、当業者に知られる種々の方法および送達系のいずれかを使用して、対象に治療剤を含む組成物を物理的導入することをいう。ここに記載する抗体のための好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。用語“ここで使用する非経腸投与”は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与方法をいい、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴ならびにインビボエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内に、経口で、膣に、直腸に、舌下にまたは局所的にのような、非経腸ではない経路で投与できる。投与は、例えば、１回、複数回および／または１回以上の長期にわたり実施できる。
ここで使用する用語“Ｔ細胞介在応答”は、エフェクターＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋細胞)およびヘルパーＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋細胞)を含む、Ｔ細胞が介在する応答をいう。Ｔ細胞介在応答は、例えば、Ｔ細胞の細胞毒性および増殖を含む。
ここで使用する用語“細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答”は、細胞毒性Ｔ細胞により誘発される免疫応答をいう。ＣＴＬ応答は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞により介在される。
ここで使用する用語“阻害”または“遮断”(例えば、ＧＩＴＲ−Ｌの細胞上のＧＩＴＲへの結合の阻害／遮断に関して)は相互交換可能に使用され、部分的および完全な阻害／遮断の両者を含む。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲへの結合を、例えば、ここにさらに記載するように測定して、少なくとも約５０％、例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％阻害する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲへの結合を、例えば、ここにさらに記載するように測定して、５０％以下、例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％阻害する。
ここで使用する腫瘍の“増殖阻害”なる用語は、腫瘍の増殖の何らかの測定可能な減少、例えば、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％または１００％の腫瘍の増殖の阻害をいう。
ここで使用する“癌”は、体の異常細胞の未制御の増殖により特徴付けられる広い一群の疾患をいう。未制御の細胞分裂は、隣接組織に浸潤し、リンパ系または血流を通して体の離れた場所に転移し得る、悪性腫瘍または細胞の形成を生じ得る。
ここで使用する用語“処置する”および“処置”は、疾患と関係する症状、合併症、状態または生化学的兆候の進行、進展、重症化または再発を逆転、軽減、回復、阻止または減速もしくは予防する目的で、対象に実施するあらゆるタイプの介入もしくは過程または活性剤の投与をいう。処置は、疾患を有する対象に対してでも疾患を有しない対象に対して(例えば、予防のため)でもよい。
“造血器腫瘍”は、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍ならびに脾臓およびリンパ節の癌を含む。リンパ腫の例は、Ｂ細胞リンパ腫(Ｂ細胞血液癌)およびＴ細胞リンパ腫の両者を含む。Ｂ細胞リンパ腫はホジキンリンパ腫および大部分の非ホジキンリンパ腫の両者を含む。Ｂ細胞リンパ腫の非限定的例は、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ性リンパ腫(慢性リンパ性白血病と重複)、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、バーキットリンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症を含む。Ｔ細胞リンパ腫の非限定的例は、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫および血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫を含む。血液系腫瘍は、二次性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病のような、しかし、これらに限定されない白血病も含む。血液系腫瘍は、さらに、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫のような、しかし、これらに限定されない骨髄腫を含む。他の血液学的および／またはＢ細胞またはＴ細胞関連癌が、用語造血器腫瘍に包含される。
用語“有効用量”または“有効投与量”は、望ましい効果を達成するまたは少なくとも一部達成するのに十分な量と定義される。薬物または治療剤の“治療有効量”または“治療有効投与量”は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて使用したとき、疾患症状の重症度の軽減、疾患無症状期間の頻度および期間の増加または疾患苦痛による機能障害または身体障害の予防により証明される、疾患退縮を促進する薬物のあらゆる量である。薬物の治療有効量または投与量は、“予防有効量”または“予防有効投与量”を含み、これは、疾患を発症するまたは疾患の再発を有するリスクのある対象に単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与したとき、疾患の発症または再発を阻止する薬物のあらゆる量である。治療剤が疾患退縮を促進するまたは疾患の発症もしくは再発を阻止する能力は、臨床試験中のヒト対象、ヒトにおける効果の予測的である動物モデルシステムにおいてまたはインビトロアッセイにおける薬剤の活性のアッセイによるような、当業者に知られる多様な方法を使用して評価できる。
例として、抗癌剤は、対象における癌退縮を促進する薬物である。好ましい態様において、治療有効量の薬物は、癌を排除する点まで癌退縮を促進する。“癌退縮の促進”は、有効量の薬物の単独または抗新生物剤と組み合わせた投与が、患者における腫瘍増殖またはサイズの低減、腫瘍の壊死、少なくとも一つの疾患症状の重症度低減、疾患無症状期間の頻度および期間の増加、疾患苦痛による機能障害または身体障害の予防または疾患症状の他の改善をもたらすことを意味する。さらに、処置に関する用語“有効”および“有効性”は、薬理学的有効性および生理学的安全性の両者を含む。薬理学的有効性は、薬物が患者における癌退縮を促進する能力をいう。生理学的安全性は、薬物投与に起因する、細胞、臓器および／または生物レベル(有害作用)での毒性または他の有害生理作用のレベルをいう。
腫瘍の処置に関する例、治療有効量または投与量の薬物は、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を、未処置対象と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、なお好ましくは少なくとも約８０％阻害する。最も好ましい態様において、治療有効量または投与量の薬物は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害し、すなわち、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、下記アッセイを使用して評価できる。あるいは、組成物のこの性質を、化合物が細胞増殖を阻害する能力を試験することにより評価でき、このような阻害は当業者に知られるアッセイでインビトロで測定できる。ここに記載する他の好ましい態様において、腫瘍退縮は、少なくとも約２０日、より好ましくは少なくとも約４０日またはさらに好ましくは少なくとも約６０日観察され、継続し得る。
用語“患者”は、予防的または治療的処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
ここで使用する用語“対象”は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、ここに記載する方法および組成物を、癌を有する対象の処置に使用できる。用語“非ヒト動物”は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などのような哺乳動物および非哺乳動物を含む。
ここで使用する用語“ｕｇ”および“ｕＭ”は、“μg”および“μＭ”と相互交換可能に使用する。
ここに記載する種々の面を、次にさらに詳細に記載する。
Ｉ. 抗ＧＩＴＲ抗体
ここに記載するのは、特定の機能的特性または性質により特徴付けられる抗体、例えば、完全ヒト抗体である。例えば、抗体は、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する。さらに、抗体は、カニクイザルＧＩＴＲのような１以上の非ヒト霊長類由来のＧＩＴＲと交差反応し得る。
可溶性および／または膜結合ヒトＧＩＴＲへの特異的結合に加えて、ここに記載する抗体は、次の機能的性質の一つ以上を示す：
(ａ) カニクイザルＧＩＴＲに結合する；
(ｂ) 免疫応答を刺激または増強する；
(ｃ) Ｔ細胞を活性化する(例えば、増強されたサイトカイン分泌および／または増殖により証明されるような)；
(ｄ) ＧＩＴＲＬの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合を阻害する；
(ｅ) ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を最大でも部分的に阻害する；
(ｆ) ヒトＧＩＴＲのＮ末端部分における立体エピトープに結合する；
(ｇ) グリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲ両者に結合する；および
(ｈ) Ｆｃ受容体への結合非存在下でアゴニスト活性を有するが、ここで、Ｆｃ受容体への結合がさらにアゴニスト活性を増強する。
好ましくは、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲに高親和性で、例えば、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−９Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで結合する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、可溶性ヒトＧＩＴＲに、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定して、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１nM)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで結合する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、活性化ヒトＴ細胞上におけるような、結合(例えば、細胞膜結合)ヒトＧＩＴＲに、例えば、フローサイトメトリーおよびスキャッチャードプロットにより決定して、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１nM)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＫＤで結合する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、活性化ヒトＴ細胞におけるような結合(例えば、細胞膜結合)ヒトＧＩＴＲに、例えば、ＦＡＣＳにより測定して、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１nM)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＥＣ５０で結合する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、可溶性ヒトＧＩＴＲに、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１nM)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで結合し、細胞膜結合ヒトＧＩＴＲに、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１nM)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＫＤもしくはＥＣ５０で結合する。
抗ＧＩＴＲ抗体は、カニクイザルＧＩＴＲ、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに、例えば、ＦＡＣＳにより測定して(例えば、実施例に記載するように)、例えば、１００nM以下、１０nM以下、１００nM〜０.０１nM、１００nM〜０.１nM、１００nM〜１nMまたは１０nM〜１nMのＥＣ５０で結合する。
抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、Ｔｅｆｆ細胞の活性化、Ｔｒｅｇ細胞によるＴエフェクター細胞抑制の制限、腫瘍Ｔｒｅｇ細胞および／または活性化ＮＫ細胞の枯渇および／または阻害により、例えば、腫瘍において、免疫応答を刺激または増強し得る。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、増強されたサイトカイン(例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ)分泌および／または増強された増殖により証明されるように、Ｔｅｆｆ細胞を活性化または共刺激し得る。ある態様において、ＣＤ３刺激も提供される。ある態様において、ＧＩＴＲ抗体は、例えば、初代ヒトＴ細胞またはヒトＧＩＴＲを発現するＴ細胞で測定して、ＩＬ−２分泌を５０％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、４倍、５倍またはそれ以上、所望により最大１０倍、３０倍、１００倍まで相加させる(例えば、さらに実施例に記載するように)。ある態様において、ＧＩＴＲ抗体は、例えば、初代ヒトＴ細胞またはヒトＧＩＴＲを発現するＴ細胞で測定して、ＩＦＮ−γ分泌を、５０％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、４倍、５倍またはそれ以上、所望により最大１０倍、３０倍、１００倍まで増加させる(例えば、さらに実施例に記載するように)。
抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒトＧＩＴＲＬの細胞、例えば、ヒトＧＩＴＲを発現する３Ａ９細胞上のヒトＧＩＴＲへの結合を、例えば、１０μg／ml以下、１μg／ml以下、０.０１μg／ml〜１０μg／ml、０.１μg／ml〜１０μg／mlまたは０.１μg／ml〜１μg／mlのＥＣ５０で阻害する(実施例５)。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒトＧＩＴＲＬの細胞、例えば、活性化Ｔ細胞上のヒトＧＩＴＲへの結合を、最大で部分的に阻害する(実施例５参照)。
抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、抗体のヒトＧＩＴＲのフラグメント、例えば、未変性(すなわち、変性していない)ヒトＧＩＴＲのフラグメントへの結合により決定して、エピトープ、例えば、ヒトＧＩＴＲのＮ末端部分における立体エピトープ、例えば、成熟ヒトＧＩＴＲのアミノ酸１〜３９内に位置するエピトープ(実施例９参照)に結合し得る。抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、抗体のヒトＧＩＴＲのフラグメント、例えば、未変性(すなわち、変性していない)ヒトＧＩＴＲのフラグメントへの結合と、続く酵素開裂またはＨＤＸにより決定されるように、成熟ヒトＧＩＴＲのアミノ酸１〜２０またはその中に位置するエピトープと結合し得る(それぞれ実施例１１および１２参照)。抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲのアミノ酸３〜２０(ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ、配列番号２１７)とまたはその中のエピトープと結合し得る。抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲのアミノ酸３〜２０およびアミノ酸３３〜４０、すなわち、アミノ酸配列ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)とまたはその中のエピトープと結合し得る。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、グリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両者と結合する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、実施例に示すプロトコールを使用して、ＨＤＸにより決定して、アミノ酸配列ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)と結合する。
抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲとここに記載するＣＤＲまたは可変領域を含む抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０の結合に競合(または結合を阻害)し得る。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０のヒトＧＩＴＲへの結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。ある態様において、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０は、抗ＧＩＴＲ抗体のヒトＧＩＴＲへの結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０のヒトＧＩＴＲへの結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害し、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０は、抗ＧＩＴＲ抗体のヒトＧＩＴＲへの結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する(例えば、双方向で競合)。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、ＦｃＲ結合の必要性の欠如により決定されるように、多価架橋結合を必要とせず、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は多価、例えば、二価である。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は一価ではない。Ｔ細胞活性化に、Ｆ’(ａｂ)２フラグメントがＦａｂフラグメントより有効であることがここで示される(実施例参照)。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、そのアゴニスト活性のためにＦｃ受容体を経る架橋結合を必要としないが、Ｆｃ受容体への架橋結合は、Ｆｃ受容体に結合していない同じ抗体と比較して、アゴニスト活性を増強する。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、次の特性の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２を有する：
(１)例えば、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定して、可溶性ヒトＧＩＴＲへ、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで結合する；
(２)例えば、スキャッチャードにより測定して、膜結合ヒトＧＩＴＲへ、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで結合する；
(３)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、膜結合ヒトＧＩＴＲへ、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で結合する；
(４)例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０で、カニクイザルＧＩＴＲへ結合、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲへ結合する；
(５)(ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)増強されたＴ細胞増殖により証明されるように、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化誘発または増強する；
(６)多価架橋結合を必要とせず、Ｔ細胞活性化誘発または増強する；
(７)Ｆｃ受容体への結合非存在下でアゴニスト活性を有するが、ここで、Ｆｃ受容体への結合がさらにアゴニスト活性を増強する；
(８)例えば、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を用いるアッセイにおいて、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０で、ＧＩＴＲリガンドのＧＩＴＲへの結合を阻害する；
(９)ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を最大でも部分的阻害する；
(１０)成熟ヒトＧＩＴＲ上の立体エピトープ(配列番号４)、例えば、アミノ酸配列ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)内の不連続エピトープへの結合する；
(１１)Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両者への結合する；および
(１２)ヒトＧＩＴＲへの結合について、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０といずれかの方向でまたは双方向で競合する。
抗ＧＩＴＲ抗体はまた、活性化Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＧＩＴＲの、例えば、１０分、３０分または６０分以内の、内部移行および続くシグナル伝達、例えば、ｐ６５ ＮＦ−ｋＢおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化(すなわち、リン酸化)も誘発し得る。
よって、当分野で知られるおよびここに記載する方法により決定した１以上のこれらの機能的性質(例えば、生化学的、免疫化学的、細胞性、生理学的または他の生物学的活性など)を示す抗体は、抗体の非存在下(例えばまたは無関係の特異性の対照抗体が存在するとき)に見られるものに対する、特定の活性における統計学的に有意な差に関係すると理解される。好ましくは、測定パラメータ(例えば、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生)における抗ＧＩＴＲ抗体誘発増加は、測定パラメータの少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、５倍または１０倍の統計学的に有意な増加を生じ、ある好ましい態様において、ここに記載する抗体は、測定パラメータを９２％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、５倍または１０倍を超えて増加させ得る。逆に、測定パラメータ(例えば、腫瘍体積、ＧＩＴＲへのＧＩＴＲ−Ｌ結合、腫瘍における制御性Ｔ細胞の含量)における抗ＧＩＴＲ抗体誘発低下は、測定パラメータの少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の統計学的に有意な低下を生じ、ある好ましい態様において、ここに記載する抗体は、測定パラメータ９２％、９４％、９５％、９７％、９８％または９９％を超えて低下させ得る。
抗体の様々な種のＧＩＴＲに対する結合能を評価する標準アッセイは当分野で知られ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡを含む。適当なアッセイは、実施例に詳細に記載する。抗体の結合動態(例えば、結合親和性)も、Ｂｉａｃｏｒｅ分析のような当分野で知られる標準アッセイにより評価できる。ＧＩＴＲの機能的性質(例えば、リガンド結合、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生)に対する抗体の効果を評価するアッセイを下におよび実施例にさらに詳細に記載する。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は未変性抗体ではないかまたは天然に存在する抗体ではない。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体は、多い、少ないまたは異なるタイプの翻訳後修飾を有することによるような、天然に存在する抗体のものと異なる翻訳後修飾を有する。
II. 抗ＧＩＴＲ抗体の例
特定のここに記載する抗体は、実施例１に記載のように単離され、構造特徴づけされた、抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０のＣＤＲおよび／または可変領域配列を有する抗体、例えば、モノクローナル抗体ならびにその可変領域またはＣＤＲ配列と少なくとも８０％同一性(例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一性)を有する抗体である。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０のＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６に示す。
よって、ここに提供されるのは、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
また提供されるのは、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、軽鎖可変領域は、配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ここに提供されるのは、
(ａ) それぞれ配列番号１３および１４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｂ) それぞれ配列番号２６および２７を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｃ) それぞれ配列番号３９および４０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｄ) それぞれ配列番号５２および５３を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｅ) それぞれ配列番号５２および５４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｆ) それぞれ配列番号７１および７２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｇ) それぞれ配列番号８４および８５を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｈ) それぞれ配列番号９７および９８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｉ) それぞれ配列番号９７および９９を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｊ) それぞれ配列番号１１５および１１６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｋ) それぞれ配列番号１２８および１２９を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｌ) それぞれ配列番号１２８および１３０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；または
(ｍ) それぞれ配列番号３３５および３３６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列
を含む単離抗体またはその抗原結合部分である。
抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはそれらの組み合わせを含み得る。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７に示す。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用して線引きされる(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。
これらの抗体の各々がＧＩＴＲに結合し、抗原−結合特異性が主にＣＤＲ１、２および３領域により提供されることを考えると、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列は、他のここに記載する抗ＧＩＴＲ結合分子を作るために、“混合および整合”させ得る(すなわち、異なる抗体からのＣＤＲを混合および整合できるが、各抗はＶＨ ＣＤＲ１、２および３およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３を含まなければならない。このような“混合および整合”させた抗体のＧＩＴＲ結合を、上におよび実施例に記載する結合アッセイを使用して試験できる(例えば、ＥＬＩＳＡ)。好ましくは、ＶＨ ＣＤＲ配列を混合および整合するとき、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換える。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合および整合するとき、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、好ましくは構造的に類似するＣＤＲ配列で置き換える。新規ＶＨおよびＶＬ配列を、１以上のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、モノクローナル抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０についてここに開示するＣＤＲ配列からの構造的に類似する配列で置換することにより製造できることは、当業者には明らかである。
ここに提供されるのは、
(ａ) 配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ) 配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ) 配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ) 配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ) 配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ) 配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む単離抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、該抗体は、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する。
ある態様において、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は
(ａ) 配列番号２０〜２２；
(ｂ) 配列番号３３〜３５；
(ｃ) 配列番号４６〜４８；
(ｄ) 配列番号６２〜６４；
(ｅ) 配列番号７８〜８０；
(ｆ) 配列番号９１〜９３；
(ｇ) 配列番号１０６〜１０８；
(ｈ) 配列番号１２２〜１２４；
(ｉ) 配列番号１３８〜１４０；または
(ｊ) 配列番号３４２〜３４４
を含み、ここで、該抗体は、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する。
他の態様において、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は
(ａ) 配列番号２３〜２５；
(ｂ) 配列番号３６〜３８；
(ｃ) 配列番号４９〜５１；
(ｄ) 配列番号６５〜６７；
(ｅ) 配列番号６８〜７０；
(ｆ) 配列番号８１〜８３；
(ｆ) 配列番号９４〜９６；
(ｇ) 配列番号１０９〜１１１；
(ｈ) 配列番号１１２〜１１４；
(ｉ) 配列番号１２５〜１２７；
(ｊ) 配列番号１４１〜１４３；
(ｋ) 配列番号１４４〜１４６；または
(ｌ) 配列番号３４５〜３４７
を含み、ここで、該抗体は、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する。
特定の態様において、抗体は重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、
(ａ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２０〜２２を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２３〜２５を含むか；
(ｂ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３３〜３５を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３６〜３８を含むか；
(ｃ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４６〜４８を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４９〜５１を含むか；
(ｄ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６２〜６４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６５〜６７を含むか；
(ｅ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６２〜６４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６８〜７０を含むか；
(ｆ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号７８〜８０を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８１〜８３を含むか；
(ｇ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９１〜９３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９４〜９６を含むか；
(ｈ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１０６〜１０８を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１０９〜１１１を含むか；
(ｉ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１０６〜１０８を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１１２〜１１４を含むか；
(ｊ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１２２〜１２４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１２５〜１２７を含むか；
(ｋ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１３８〜１４０を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１４１〜１４３を含むか；
(ｌ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１３８〜１４０を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１４４〜１４６を含むか；または
(ｍ) 重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３４２〜３４４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３４５〜３４７を含み、
ここで、該抗体は、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する。
ここに記載するＶＨドメインまたはその１以上のＣＤＲは、重鎖、例えば、完全長重鎖を形成するために定常ドメインと結合させ得る。同様に、ここに記載するＶＬドメインまたはその１以上のＣＤＲを、軽鎖、例えば、完全長軽鎖を形成するために定常ドメインと結合させうる。完全長重鎖(なくてもよいＣ末端リシン(Ｋ)以外またはＣ末端グリシンおよびリシン(ＧＫ)以外)および完全長軽鎖を、完全長抗体を形成するために合わせる。
ここに記載するＶＨドメインは、例えば、さらにここに記載するように、天然に存在するものでも修飾されているものでもよいヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常ドメインと融合させ得る。例えば、ＶＨドメインは、次のヒトＩｇＧ１アミノ酸配列と融合した、ここに記載するＶＨドメインのいずれかのアミノ酸配列を有する。
ヒトＩｇＧ１定常ドメインは、またアロタイプバリアントのものでもよい。例えば、ＩｇＧ１のアロタイプバリアントはＲ１０７Ｋ、Ｅ１８９ＤおよびＭ１９１Ｌを含む(上で下線をし、配列番号７の番号付けに従う)。完全長重領域内で、これらのアミノ酸置換をＲ２１４Ｋ、Ｅ３５６ＤおよびＭ３５８Ｌと番号付けする。
ここに記載するＶＬドメインを、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖の定常ドメインと融合させ得る。例えば、ＶＬドメインは、次のヒトＩｇＧ１カッパ軽鎖アミノ酸配列に融合した、ここに記載するＶＬドメインのいずれかのアミノ酸配列を含み得る。
ある態様において、重鎖定常領域は、Ｃ末端にリシンまたは他のアミノ酸を含み、例えば、それは次の最後のアミノ酸を含む：重鎖についてＬＳＰＧＫ(配列番号２２０)。ある態様において、重鎖定常領域は、Ｃ末端で１以上のアミノ酸を欠き、例えば、Ｃ末端配列ＬＳＰＧ(配列番号２７６)またはＬＳＰを有する。
重鎖および軽鎖の例のアミノ酸配列を表１１に示し、重鎖について配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２および軽鎖について配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、５７、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７、３３８、３４１および３７１に対応する。
表１１に示す重鎖または軽鎖(またはその可変領域)のいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％同一のアミノ酸配列、例えば、配列番号１３〜１９、２６〜３２、４０〜４５、５２〜６１、７１〜７７、８４〜９０、９７〜１０５、１１６〜１２１、１２８〜１３７、２２７〜２７５、３３７〜３４１、３４８〜３５２、３６１、３６２および３７１を含む重鎖および軽鎖望ましい特徴を有する抗ヒトＧＩＴＲ抗体、例えば、ここにさらに記載するものを形成するために使用し得る。バリアントの例は、例えば、定常ドメインにアロタイプバリエーションおよび／または可変または定常領域にここに開示する変異のような変異を含むものである。表１１に示す重鎖または軽鎖(またはその可変領域)のいずれかから最大１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１アミノ酸異なる(置換、付加または欠失による)アミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を、望ましい特徴を有する抗ヒトＧＩＴＲ抗体、例えば、ここにさらに記載するものを形成するために使用し得る。
種々の態様において、上記抗体は、次の機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１または全てを示す；
(１) 例えば、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合する；
(２) 例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(３) 例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で、膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(４) 例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０でカニクイザルＧＩＴＲに結合する、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合する；
(５) (ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)増強されたＴ細胞増殖により証明されるような、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(６) 多価架橋結合を必要とせず、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(７) ＦＡＣＳにより測定して、ＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合を、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０で阻害する；
(８) ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を最大でも部分的に阻害する；
(９) 成熟ヒトＧＩＴＲ上の立体エピトープ(配列番号４)、例えば、アミノ酸配列ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)内の不連続エピトープに結合する；
(１０) Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両者に結合する；
(１１) Ｆｃ受容体への結合非存在下でアゴニスト活性を有するが、ここで、Ｆｃ受容体への結合がさらにアゴニスト活性を増強する；および
(１２) ヒトＧＩＴＲへの結合について、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０といずれかの方向でまたは双方向で競合する。
このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体を含む。
ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、グリコシル化(例えば、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化)および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両者に結合する。
ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、立体エピトープに結合する。
ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲアイソフォーム１、２または３(配列番号４)のアミノ酸残基１〜３９に対応するｍ成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)の次の領域内のアミノ酸残基と結合する：
ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲアイソフォーム１、２または３(配列番号４)のアミノ酸残基１〜２０に対応する、成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)の次の領域内のアミノ酸残基と結合する：
ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)の次の領域内のアミノ酸残基と結合する：
修飾重鎖定常ドメイン
ここにさらに記載するように、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖定常領域は、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４またはそれらの組み合わせおよび／またはその修飾体であってよい。抗ＧＩＴＲ抗体は、エフェクター機能を有しても、エフェクター機能が低減されていても無くなっていてもよい。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、抗体に増強された性質を提供する修飾重鎖定常領域を含む。実施例に示すように、ＩｇＧ２ヒンジを含む修飾重鎖定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体は、非ＩｇＧ２ヒンジを伴う以外、同じ可変領域を有する抗体より強力なアゴニストである。例えば、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１アイソタイプのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、エフェクター機能を備えるかまたは備えない抗体は、抗体とインキュベートされたＴ細胞からのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌の増強により測定して増強されたアゴニスト活性を有する。具体的な作用機序に限定する意図はないが、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＧＩＴＲ抗体は、大型抗体／抗原複合体を形成し、より効率的に内部移行し、それによりアゴニスト活性が増加すると仮説立てられる。大複合体の形成は、他のアイソタイプ(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４)のヒンジと比較して、ＩｇＧ２ヒンジの高い剛性によりもたらされると考えられる。さらに実施例に記載するように、増強されたアゴニスト活性は、抗体の高いまたは低い親和性と関係するように見えない。よって、ここに提供されるのは、修飾重鎖定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体であって、ここで、は増強されたアゴニスト活性を有し、修飾重鎖定常領域を有する抗体の親和性は、同じ可変領域であるが、異なる重鎖定常領域を有し、類似する親和性を有するＧＩＴＲと結合する。
よって、ここに提供されるのはまた、非ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＧＩＴＲ抗体を提供し、非ＩｇＧ２ヒンジをＩｇＧ２ヒンジに置き換えることを含む、抗ＧＩＴＲ抗体のアゴニスト活性を増強する方法である。このような修飾により利益を受け得る抗体は、当分野で知られるようなあらゆる抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、ＷＯ２００６／１０５０２１号に記載のような、６Ｃ８のＣＤＲを有する、例えば、抗体６Ｃ８またはヒト化抗体；ＷＯ２０１１／０２８６８３号、特開２００８−２７８８１４号、ＫＲ２００８０１０５６７４号、ＵＳ２００４００７２５６６号、ＵＳ２００１４７２５６５号、ＵＳ２０１４００６５１５２号またはＷＯ２０１５／０３１６６７号に記載の抗体を含む。
ある態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジ(“ＩｇＧ２ヒンジ”)およびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ある態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの少なくとも一つはＩｇＧ２アイソタイプではない。ＩｇＧ２ヒンは、ＩｇＧ２ヒンジが非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ抗体と比較して増強された活性を抗体に付与する能力を保持する限り、野生型ＩｇＧ２ヒンジ、例えば、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ(例えば、ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧ；配列番号２９１)またはそのバリアントであり得る。ある態様において、ＩｇＧ２ヒンジバリアントは、野生型ＩｇＧ２ヒンジと類似する強剛性または剛性を保持する。ヒンジの強剛性は、ヒンジを含む抗体の慣性半径を測定または比較するための、例えば、コンピューターモデリング、電子顕微鏡、スペクトロスコピー、例えば核磁気共鳴(ＮＭＲ)、Ｘ線結晶学(B-Factor)または沈降速度超遠心分析(ＡＵＣ)により決定できる。ヒンジは、ヒンジを含む抗体の、上に記載した試験の一つにより得た値が、異なるヒンジ、例えば、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体と５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％未満異なるならば、他のヒンジと類似するまたは高い強剛性を有し得る。当業者は、試験から、これらの試験の結果の解釈により、あるヒンジが、他のヒンジと少なくとも類似する強剛性を有するか否かを決定できる。ヒトＩｇＧ２ヒンジバリアントの例は、４システイン残基(すなわち、Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)の１以上の置換を含む、ＩｇＧ２ヒンジである。システインは、セリンで置き換え得る。ＩｇＧ２ヒンジの例は、Ｃ２１９Ｓ変異(例えば、ＥＲＫＳＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧ；配列番号２９２)を含むヒトＩｇＧ２ヒンジである。使用し得る他のＩｇＧ２ヒンジバリアントは、Ｃ２２０、Ｃ２２６および／またはＣ２２９置換、例えば、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓ変異(これはＣ２１９Ｓ変異と組み合わせてよい)を含むヒトＩｇＧ２ヒンジである。ＩｇＧ２ヒンジはまたヒンジの一部が他のアイソタイプのものであるＩｇＧ２ヒンジ(すなわち、キメラヒンジである)でもよいが、キメラヒンジの強剛性が、野生型ＩｇＧ２ヒンジと少なくとも類似することを条件とする。例えば、ＩｇＧ２ヒンジは、下部ヒンジ(表２に定義するように)がＩｇＧ１アイソタイプのものであり、例えば、野生型ＩｇＧ１下部ヒンジである、ＩｇＧ２ヒンジであり得る。ＩｇＧ２ヒンジにおいて使用し得るさらなるＩｇＧ２ヒンジ変異は、ＳＥ(Ｓ２６７Ｅ)、ＳＥＬＦ(Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ)、ＳＤＩＥ(Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ)、ＳＥＦＦおよびＧＡＳＤＡＬＩＥ(Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ)変異を含む。
“ハイブリッド”または“キメラ”ヒンジは、ヒンジの連続的アミノ酸の半分超がアイソタイプ由来であるならば、特異的アイソタイプのものであると称す。例えば、ＩｇＧ２の上部および中間部ヒンジおよびＩｇＧ１の下部ヒンジを有するヒンジは、ＩｇＧ２ヒンジと見なす。
ある態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプの野生型ＣＨ１ドメインであるＣＨ１ドメインを含む(それぞれ、“ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン”または“ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン”)。アイソタイプＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン(それぞれ“ＩｇＧ３ ＣＨ１ドメインおよび“ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン”)も使用し得る。ＣＨ１ドメインは、野生型ＣＨ１ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインのバリアントでもあり得る。ＣＨ１ドメインのバリアントの例は、Ａ１１４ＣおよびＴ１７３Ｃを含む。
ある態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ２ドメインであるＣＨ２ドメインを含む(それぞれ“ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン”、“ＩｇＧ２ ＣＨ２ドメイン”、“ＩｇＧ３ ＣＨ２ドメイン”または“ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン”)。ＣＨ２ドメインはまた野生型ＣＨ２ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのバリアントでもよい。ＣＨ２ドメインのバリアントは、ＡＤＣＣまたはＣＤＣのような抗体のＦｃ領域の生物学的活性を調節するまたは抗体の半減期もしくはその安定性を調節するバリアントを含む。ある態様において、ＣＨ２ドメインは、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインであり、ここで、ＣＨ２ドメインは、変異を有しない同じＣＨ２ドメインと比較して低下したエフェクター機能を有する。他の変異は、さらに本明細書の他の箇所に示す。
ある態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ３ドメインであるＣＨ３ドメインを含む(それぞれ“ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン”、“ＩｇＧ２ ＣＨ３ドメイン”、“ＩｇＧ３ ＣＨ３ドメイン”または“ＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン”)。ＣＨ３ドメインはまた野生型ＣＨ３ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのバリアントでもよい。ＣＨ３ドメインのバリアントの例は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣのような抗体のＦｃ領域の生物学的活性を調節するまたは抗体の半減期もしくはその安定性を調節するバリアントを含む。
一般に、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインのバリアントは、特異的バリアントを含む重鎖定常領域が必要な生物学的活性を保持する限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異および／または最大１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１変異または１〜１０または１〜５変異を含んでよくまたは対応する野生型ドメインのものと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列(それぞれＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン)を含んでよい。
表３は、ヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含むヒト重鎖定常領域の例を示し、ここで、各ドメインは、重鎖定常領域に望ましい生物学的活性を提供する野生型ドメインまたはそのバリアントである。表３の空欄のセルはドメインが存在するかまたは存在せず、存在するならば任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり得ることを示す。例えば、表３における重鎖定常領域１を含む抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域を含む抗体であり、これはまたＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインも含んでよく、存在するならば、そのＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。表３を理解するための他の例として、重鎖定常領域８を含む抗体は、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインを含む重鎖定常領域を含む抗体であり、これはＣＨ３ドメインを含んでも含まなくてもよく、これは、存在するならば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものであり得る。
＊ 修飾重鎖定常領域
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は表３に示す重鎖定常領域を含み、特異的重鎖定常領域を含まない重鎖定常領域を含む同じ抗体と比較して、増強されたアゴニスト活性を有する。ある態様において、表３に示す重鎖定常領域を含む抗体は、ＩｇＧ２ヒンジまたは同じＩｇＧ２ヒンジを含まない重鎖定常領域を含む同じ抗体と比較して、増強されたアゴニスト活性を有する。ある態様において、表３に示す重鎖定常領域を含む抗体は、非ＩｇＧ２ヒンジを含み、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ヒンジを含む同じ抗体と比較して、増強されたアゴニスト活性を有する。ある態様において、表３に示す重鎖定常領域を含む抗体は、１以上の同じＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを含まない重鎖定常領域を含む同じ抗体と比較して、増強されたアゴニスト活性を有する。例えば、ある態様において、表３に示す重鎖定常領域を含む抗体は、ＩｇＧ２ヒンジおよび特異的アイソタイプのＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含まない重鎖定常領域を含む同じ抗体と比較して、増強されたアゴニスト活性を有する。例えば、表３に示す重鎖定常領域２２を含む抗体は、(ｉ)ＩｇＧ２ヒンジを含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジ(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ヒンジ)を含む重鎖定常領域を含む同じ抗体；(ii)ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ１ ＣＨ１を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ１ ＣＨ１を含む重鎖定常領域を含む同じ抗体；(iii)ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ２を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２ ＣＨ２を含む重鎖定常領域を含む同じ抗体；(iv)ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ１ ＣＨ３を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ１ ＣＨ３を含む重鎖定常領域を含む同じ抗体；(ｖ)ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ１およびＩｇＧ２ ＣＨ２を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ１ ＣＨ１および／または非ＩｇＧ２ ＣＨ２を含む重鎖定常領域を含む同じ抗体；(vi)ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ１およびＩｇＧ１ ＣＨ３を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ１ ＣＨ１および／または非ＩｇＧ１ ＣＨ３を含む重鎖定常領域を含む同じ抗体；(vii)ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ２ ＣＨ２およびＩｇＧ１ ＣＨ３を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２ ＣＨおよび／または非ＩｇＧ１ ＣＨ３を含む重鎖定常領域を含む同じ抗体；(viii)またはＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＩｇＧ２ ＣＨ２およびＩｇＧ１ ＣＨ３を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ１ ＣＨ１および／または非ＩｇＧ２ ＣＨ２および／または非ＩｇＧ１ ＣＨ３を含む重鎖定常領域を含む同じ抗体と比較して、増強されたアゴニスト活性を有し得る。
抗ＧＩＴＲ可変領域、例えば、ここに記載するものに結合し得る修飾重鎖定常領域の例を表４に提供し、これは、ドメインの各々の同一性を示す。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号２９１、２９２、２９３または２９４を含むＩｇＧ２ヒンジまたはそのバリアント、例えば、(ｉ)配列番号２９１、２９２、２９３または２９４と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列番号２９１、２９２、２９３または２９４と最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列番号２９１、２９２、２９３または２９４と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるアミノ酸配列を含むおよび／または(iv)配列番号２９１、２９２、２９３または２９４と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＩｇＧ２ヒンジを含む修飾重鎖定常領域と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％を含みまたは９９％同一のアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域と比較して、抗ＧＩＴＲ抗体に増強されたアゴニスト活性を提供する。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号２７８を含むＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインまたは配列番号２７９を含むＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたは配列番号２７８もしくは２７９のバリアントを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号２７８または２７９と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列番号２７８または２７９と最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列番号２７８または２７９と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるアミノ酸配列を含むおよび／または(iv)配列番号２７８または２７９と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、抗ＧＩＴＲ修飾重鎖定常領域を含む抗体は、抗ＧＩＴＲ抗体であるが、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域を有するものと比較して、増強されたアゴニスト活性を有する。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号２８０または２８１または配列番号２８０または２８１のバリアントを含むＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号２８０または２８１と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列番号２８０または２８１と最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列番号２８０または２８１と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるアミノ酸配列を含むおよび／または(iv)配列番号２８０または２８１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、修飾重鎖定常領域は、抗ＧＩＴＲ抗体に、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域と比較して、増強されたアゴニスト活性を提供する。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号２８２または配列番号２８２のバリアントを含むＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む修飾重鎖定常領域を提供し、このバリアントは、(ｉ)配列番号２８２と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列番号２８２と最大５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列番号２８２と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるアミノ酸配列を含むおよび／または(iv)配列番号２８２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域また非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域と比較して、増強されたアゴニスト活性を提供する。
修飾重鎖定常領域はまた上記ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの組み合わせを含み得る。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０もしくは配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９もしくは２９０のバリアントを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０と最大１０、９、８、７、６,５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５、３〜５、１〜１０または５〜１０アミノ酸置換、付加または欠失により異なるアミノ酸配列を含むおよび／または(iv)配列番号２２３、２２４、２２５、２２６、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく、修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域また非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域と比較して、増強されたアゴニスト活性を提供する。
修飾重鎖定常領域は、(ｉ)野生型重鎖定常領域と比較して、類似する低下したまたは増加したエフェクター機能(例えば、ＦｃγＲへの結合)およびまたは(ii)野生型重鎖定常領域と比較して、類似する低下したまたは増加した半減期(またはＦｃＲｎ受容体への結合)を有してよい。
III. 特定の生殖系列配列を有する抗体
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
ここに示されるように、ヒト生殖系列ＶＨ ３−３３遺伝子、ＶＨ ３−１０遺伝子、ＶＨ ３−１５遺伝子、ＶＨ ３−１６、ＶＨ ＪＨ６ｂ遺伝子、ＶＨ ６−１９遺伝子、ＶＨ ４−３４遺伝子および／またはＶＨ ＪＨ３ｂ遺伝子の産物であるまたはこれらに由来する重鎖可変領域を含むＧＩＴＲに特異的なヒト抗体が製造されている。よって、ここに提供されるのは、ＶＨ ３−３３、ＶＨ ３−１０、ＶＨ ３−１５、ＶＨ ３−１６、ＶＨ ＪＨ６ｂ、ＶＨ ６−１９、ＶＨ ４−３４および／またはＶＨ ＪＨ３ｂからなる群から選択されるヒトＶＨ生殖系列遺伝子の産物であるまたはこれらに由来する重鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
ヒト生殖系列ＶＫ Ｌ６遺伝子、ＶＫ Ｌ１８遺伝子、ＶＫ Ｌ１５遺伝子、ＶＫ Ｌ２０遺伝子、ＶＫ Ａ２７遺伝子、ＶＫ ＪＫ５遺伝子、ＶＫ ＪＫ４遺伝子、ＶＫ ＪＫ２遺伝子およびＶＫ ＪＫ１遺伝子の産物であるまたはこれらに由来する軽鎖可変領域を含むＧＩＴＲに特異的なヒト抗体が製造されている。よって、ここに提供されるのは、ＶＫ Ｌ６、ＶＫ Ｌ１８、ＶＫ Ｌ１５、ＶＫ Ｌ２０、ＶＫ Ａ２７、ＶＫ ＪＫ５、ＶＫ ＪＫ４、ＶＫ ＪＫ２およびＶＫ ＪＫ１からなる群から選択されるヒトＶＫ生殖系列遺伝子の産物であるまたはこれらに由来する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
ここに記載する好ましい抗体は、図２〜１１に示すように、上に挙げたヒト生殖系列ＶＨ遺伝子の一つの産物であるまたはこれらに由来する重鎖可変領域を含み、また上に挙げたヒト生殖系列ＶＫ遺伝子の一つの産物であるまたはこれらに由来する軽鎖可変領域を含む。
ここで使用するヒト抗体は、抗体の可変領域をヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用するシステムから得るならば、特定の生殖系列配列の“産物である”またはそれに“由来する”重鎖または軽鎖可変領域を含む。このようなシステムは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを目的の抗原で免疫化するまたはファージ上に提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを目的の抗原でスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の“産物である”またはそれに“由来する”ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列とヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較し、ヒト抗体の配列と配列が最も近い(すなわち、最大同一性％)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することにより、そのようなものとして特定できる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の“産物である”またはそれに“由来する”ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞性変異または部位特異的変異の意図的導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸差異を含み得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は、一般にヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較したとき、ヒト抗体をヒトであるとして特定するアミノ酸残基を含む。ある場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列が少なくとも９５％または少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。一般に、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、１０を超えるアミノ酸差異を示さない。ある場合、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と５を超えるまたは４、３、２または１を超えるアミノ酸差異を示さない。
IV. 相同抗体
ここに包含されるのは、好ましいここに記載する抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体であり、ここで、抗体は、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の望ましい機能的性質を保持する。
例えば、単離抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでよく、ここで、
(ａ) 重鎖可変領域は配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるまたは配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変更(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む；
(ｂ) 軽鎖可変領域は配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるまたは配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変更(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む；
(ｃ) 抗体は、ＧＩＴＲに特異的に結合するおよび
(ｄ) 抗体は、次の機能的性質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全てを示す：
(１) 例えば、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合する；
(２) 例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(３) 例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で、膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(４) 例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０でカニクイザルＧＩＴＲに結合する、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合する；
(５) (ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)増強されたＴ細胞増殖により証明されるような、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(６) 多価架橋結合を必要とせず、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(７) ＦＡＣＳにより測定して、ＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合を、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０で阻害する；
(８) ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を最大でも部分的に阻害する；
(９) 成熟ヒトＧＩＴＲ上の立体エピトープ(配列番号４)、例えば、アミノ酸配列ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)内の不連続エピトープに結合する；
(１０) Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両者に結合する；
(１１) Ｆｃ受容体への結合非存在下でアゴニスト活性を有するが、ここで、Ｆｃ受容体への結合がさらにアゴニスト活性を増強する；
(１２) ヒトＧＩＴＲへの結合について、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および６Ｇ１０といずれかの方法または双方向で競合する。
種々の態様において、抗体は、上の(１)〜(１２)に挙げた機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９、１０、１１または全てを示し得る。抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
単離抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は重鎖および軽鎖を含んでよく、ここで、
(ａ) 重鎖は、配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるまたは配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変更(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含み、ただし、ある態様において、配列がエフェクターレス重鎖のものであるならば、重鎖をエフェクターレスとする変異は修飾されない(すなわち、Ａ２３４、Ｅ２３５、Ａ２３７、Ｓ３３０およびＳ３３１に修飾はしない)；
(ｂ) 軽鎖は、配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、５７、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７、３３８、３４１および３７１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるまたは配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、５７、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７、３３８、３４１および３７１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０アミノ酸変更(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む；
(ｃ) 抗体は、ＧＩＴＲに特異的に結合するおよび
(ｄ) 抗体は、次の機能的性質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全てを示す：
(１) 例えば、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合する；
(２) 例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(３) 例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で、膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(４) 例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０でカニクイザルＧＩＴＲに結合する、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合する；
(５) (ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)増強されたＴ細胞増殖により証明されるような、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(６) 多価架橋結合を必要とせず、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(７) ＦＡＣＳにより測定して、ＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合を、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０で阻害する；
(８) ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を最大でも部分的阻害
(９) 成熟ヒトＧＩＴＲ上の立体エピトープ(配列番号４)、例えば、アミノ酸配列ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)内の不連続エピトープに結合する；
(１０) Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両者への結合
(１１) Ｆｃ受容体への結合非存在下でアゴニスト活性を有するが、ここで、Ｆｃ受容体への結合がさらにアゴニスト活性を増強する；および
(１２) ヒトＧＩＴＲへの結合について、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および６Ｇ１０といずれかの方法または双方向で競合する。
また提供されるのは、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０の対応するＣＤＲと１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５アミノ酸変更(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)により異なる、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／またはＶＬＣＤＲ３を含む抗ＧＩＴＲ抗体である。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０における対応する配列と比較して、１、２、３、４、５または６のＣＤＲの各々に１〜５アミノ酸変更含む。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０におけるＣＤＲと比較して、全ＣＤＲにわたり、計１〜５アミノ酸変更を含む。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、２８Ｆ３のものからなるＶＨおよびＶＬ ＣＤＲを含み、ここで、１以上のＣＤＲにおける１以上のアミノ酸は、ここに開示する他の抗ＧＩＴＲ抗体の一つのものである。
例えば、ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＳＹＧＭＨ(配列番号２０)に対して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨＣＤＲ１を含み、例えば、次の縮重配列の一つを含み得る：
ＳＹＧＸＨ(配列番号３７２)(ここで、Ｘは任意のアミノ酸、例えば、ＭまたはＦである)；
Ｘ１ＹＧＸ２Ｈ(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、ＮまたはＤであり；そしてＸ２は任意のアミノ酸、例えば、ＭまたはＦである)；および
Ｘ１ＹＧＸ２Ｘ３(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｓ、ＮまたはＤであり；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、ＭまたはＦであり、そしてＸ３は任意のアミノ酸、例えば、ＨまたはＱである)。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＶＩＷＹＥＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号２１)に対して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨＣＤＲ２を含み、次の縮重配列の一つを含み得る：
ＶＩＷＹＸ１ＧＳＮＫＸ２ＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号３７３)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、ＥまたはＡであり；そしてＸ２は任意のアミノ酸、例えば、ＹまたはＦである)；および
ＶＩＷＹＸ１ＧＳＮＫＸ２ＹＸ３ＤＳＶＫＧ(配列番号３７４)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｅ、Ａ、ＧまたはＤであり；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、ＹまたはＦであり；そしてＸ３は任意のアミノ酸、例えば、ＡまたはＶである)。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＧＳＭＶＲＧＤＹＹＹＧＭＤＶ(配列番号２２)に対して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＨＣＤＲ３を含み、例えば、次の縮重配列の一つを含み得る：
ＧＧＳＸ１ＶＲＧＤＹＹＹＧＭＤＶ(配列番号３７５)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、ＭまたはＶ、Ｌ、ＩまたはＡである)。
ＧＧＳＸ１ＶＲＧＸ２ＹＹＹＧＭＤＶ(配列番号３７６)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、ＭまたはＶ、Ｌ、ＩまたはＡであり；そしてＸ２は任意のアミノ酸、例えば、ＤまたはＥである。Ｘ１およびＸ２の特定の組み合わせは実施例に示す)。
ＧＧ(６−７ａａ)ＭＤＶＷＹＹＸ１ＭＤＶＷ(配列番号３７７)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｇ、ＳまたはＶである。ある態様において、６〜７アミノ酸は、ここに開示する抗ＧＩＴＲ抗体のＶＨＣＤＲ３配列のその位置のアミノ酸に対応する)。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ(配列番号２３)に対して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＬＣＤＲ１を含み、例えば、次の縮重配列の一つを含み得る：
ＲＡＳＱＧＩＳＳＸＬＡ(配列番号３７８)(ここで、Ｘは任意のアミノ酸、例えば、ＡまたはＷ(またはＡ、ＷまたはＹ)である)；および
ＲＡＳＱＧ(２−３ａａ)ＳＸ１ＬＡ(配列番号３７９)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ｗ、ＹまたはＡであり、そして２−３アミノ酸は任意のアミノ酸、例えば、ＧＩ、ＳＶＳまたはＳＶＴである)。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＤＡＳＳＬＥＳ(配列番号２４)に対して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＬＣＤＲ２を含み、例えば、次の縮重配列の一つを含み得る：
ＤＡＳＳＬＸＳ(配列番号３８０)(ここで、Ｘは任意のアミノ酸、例えば、ＥまたはＱである)；および
Ｘ１ＡＳＳＸ２Ｘ３Ｘ４(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、Ａ、ＤまたはＧであり；Ｘ４は任意のアミノ酸、例えば、ＬまたはＲであり；Ｘ３は任意のアミノ酸、例えば、Ｑ、ＥまたはＡ；およびＸ４は任意のアミノ酸、例えば、ＳまたはＴである)。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＱＱＦＮＳＹＰＹＴ(配列番号２５)に対して１以上のアミノ酸修飾を含むＶＬＣＤＲ３を含み、例えば、次の縮重配列の一つを含み得る：
ＱＱＸＮＳＹＰＹＴ(配列番号３８１)(ここで、Ｘは任意のアミノ酸、例えば、ＦまたはＹである)；および
ＱＱＸ１Ｘ２ＳＸ３ＰＸ４Ｔ(配列番号３８２)(ここで、Ｘ１は任意のアミノ酸、例えば、ＦまたはＹであり；Ｘ２は任意のアミノ酸、例えば、ＮまたはＧであり；Ｘ３は任意のアミノ酸、例えば、ＹまたはＳであり；そしてＸ４は任意のアミノ酸、例えば、Ｙ、Ｗ、Ｉ、ＰまたはＱである)。
２８Ｆ３、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０のものと相同性を有する配列を有する抗体、例えば、それぞれ配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５および配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６のＶＨおよびＶＬ領域またはそれぞれ配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５および３３７および配列番号１６、１９、２９、３２、４２、４５、５６、６０、６１、７４、８７、９０、１０１、１０４、１０５、１１８、１２１、１３２、１３３、１３６、１３７および３３８の重鎖および軽鎖またはＣＤＲを有する抗体は、配列番号１４７、１５４、１５８、１６２、１６８、１７２、１７６、１８２、１８６、３５３および／または配列番号１４８、１５５、１５９、１６３、１６４、１６９、１７３、１７７、１７８、１８３、１８７、１８８、３５４または配列番号１４９、１５１、１５２、１５６、１６０、１６５、１７０、１７４、１７９、１８４、１８９、３５５および／または配列番号１５０、１５３、１５７、１６１、１６６、１７１、１７５、１８０、１８５、１９０、１９１、３５６をコードする核酸分子の変異誘発(例えば、部位特異的またはＰＣＲ介在変異誘発)、続くコード化された改変抗体の、機能(すなわち、上の(１)〜(１２)に示す機能)の保持について、ここに記載する機能的アッセイを使用する試験により得ることができる。
Ｖ. 保存的修飾を有する抗体
抗ＧＩＴＲ抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含んでよく、ここで、これらのＣＤＲ配列の１以上は、好ましいここに記載する抗体(例えば、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０)に基づき特定されたアミノ酸配列またはその保存的修飾体を含み、ここで、抗体は、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の望ましい機能的性質を保持する。よって、単離抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含んでよく、ここで：
(ａ) 重鎖可変領域ＣＤＲ３配列を含む配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列；
(ｂ) 軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
(ｃ) 抗体は、ＧＩＴＲに特異的に結合するおよび
(ｄ) 抗体は、次の機能的性質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全てを示す：
(１) 例えば、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合する；
(２) 例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(３) 例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で、膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(４) 例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０でカニクイザルＧＩＴＲに結合する、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合する；
(５) (ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)増強されたＴ細胞増殖により証明されるような、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(６) 多価架橋結合を必要とせず、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(７) ＦＡＣＳにより測定して、ＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合を、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０で阻害する；
(８) ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を最大でも部分的に阻害する；
(９) 成熟ヒトＧＩＴＲ上の立体エピトープ(配列番号４)、例えば、アミノ酸配列ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)内の不連続エピトープに結合する；
(１０) Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両者に結合する；
(１１) Ｆｃ受容体への結合非存在下でアゴニスト活性を有するが、ここで、Ｆｃ受容体への結合がさらにアゴニスト活性を増強する；および
(１２) ヒトＧＩＴＲへの結合について、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０といずれかの方向でまたは双方向で競合する。
好ましい態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の好ましい態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４または１〜５保存的アミノ酸置換体のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
種々の態様において、抗体は、上の(１)〜(１２)に挙げた機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９または全てを示し得る。このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
保存的アミノ酸置換はまた、ＣＤＲ以外のまたはＣＤＲに加えて他の場所にも行い得る。例えば、保存的アミノ酸修飾は、フレームワーク領域またはＦｃ領域に行い得る。可変領域または重鎖または軽鎖は、ここに提供される抗ＧＩＴＲ抗体配列に対して、１、２、３、４、５、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５または１〜５０保存的アミノ酸置換を含み得る。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、保存的および非保存的アミノ酸修飾の組み合わせを含む。
VI. ここに記載する抗体とＧＩＴＲ上の同じエピトープに結合するまたはＧＩＴＲの結合について競合する抗体
また提供されるのは、特定のここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０)とＧＩＴＲへの結合について競合する抗体である。このような競合する抗体は、標準ＧＩＴＲ結合アッセイにおいて１以上のモノクローナル抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＧＩＴＲへの結合を競合的に阻害するその能力に基づき同定できる。例えば、組み換えヒトＧＩＴＲタンパク質をプレートに固定化し、種々の濃度の非標識第一抗体を添加し、プレートを洗浄し、標識第二抗体を添加し、標識の量を測定する、標準ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合的ＥＬＩＳＡアッセイを使用できる。非標識(第一)抗体(“遮断抗体”とも呼ぶ)の濃度を増加させて標識(第二)抗体の結合が阻害されるならば、第一抗体は、プレート上の標的に対する第二抗体の結合を阻害するといえまたは第二抗体の結合と競合するといえる。これに加えてまたはこれとは別に、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して、抗体が競合する能力を試験できる。試験抗体がここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲへの結合を阻害する能力は、試験抗体が、抗体のＧＩＴＲへの結合と競合できることを示す。
よって、ここに提供されるのは、例えば、下の段落に記載するアッセイを使用するような、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳにより測定して、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の細胞、例えば、活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害するおよび／またはそれらの細胞、例えば、活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合が、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害される、抗ＧＩＴＲ抗体をいう。
例えば、第一抗体が、第二抗体の結合を遮断する(すなわち、“競合する”)か否かを決定するための競合実験の例は、次のように実施し得る：活性化ヒトＴ細胞を次のように調製する：末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)をフィコール勾配を使用してヒト全血から分離し、１０μg／mLフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ−Ｌ)(USBiol#P3370-30)および２００ＩＵ／mL組み換えＩＬ−２(Peprotech#200-02)で３日間活性化させる。活性化Ｔ細胞をＦＡＣＳ緩衝液(５％ウシ胎児血清含有ＰＢＳ)に再懸濁し、９６ウェルプレートのサンプルウェルあたり１０５細胞で播種する。プレートを氷上におき、続いてコンジュゲートしていない第一抗体を０〜５０μg／mLの範囲の濃度(５０μg／mLの最高濃度から開始して、３倍タイトレーション)で添加する。無関係のＩｇＧを第一抗体のアイソタイプ対照として使用し、同じ濃度で添加してよい(５０μg／mLの最高濃度から開始して、３倍タイトレーション)。５０μg／mL非標識第二抗体とプレインキュベートしたサンプルを、完全遮断(１００％阻害)のための陽性対照として包含させてよく、一次インキュベーションにおける抗体不含サンプルを、陰性対照(競合なし；０％阻害)として使用してよい。３０分インキュベーション後、標識、例えば、ビオチニル化第二抗体を、洗浄せずに、ウェルあたり２μg／mLの濃度で添加する。サンプルを、氷上でさらに３０分インキュベートする。非結合抗体を、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄することにより除去する。細胞−結合標識第二抗体を標識を検出する試薬、例えば、ビオチン検出のためのＰＥコンジュゲートストレプトアビジン(Invitrogen, catalog# S21388)で検出する。サンプルをFACS Calibur Flow Cytometer(BD, San Jose)上に獲得し、Flowjoソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)で解析する。結果を、％阻害として表し得る(すなわち、１００％から、遮断抗体非存在下で得た標識の量で除した各濃度での標識の量を減算)。一般に、同じ実験を次いで逆方向、すなわち、第一抗体が第二抗体および第二抗体が第一抗体で実施する。ある態様において、抗体は、少なくとも部分的に(例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％)または完全に(１００％)他の抗体の標的、例えばヒトＧＩＴＲまたはその一部への結合を遮断し、一方または他方の抗体が第一抗体であるとき、阻害が起こるかどうかに無関係である。第一および第二抗体は、抗体が互いに双方向で、すなわち、第一抗体を最初に添加する競合実験および第二抗体を最初に添加する競合実験において競合するとき、互いに標的への結合を“交差遮断”する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、あるエピトープマッピング法により決定して、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０)と同じエピトープに結合する。ここにさらに記載するように、２８Ｆ３抗体は、ヒトＧＩＴＲにおけるＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥ(配列番号２１５)内の領域内に結合する。よって、ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のアミノ酸残基１〜３９に対応する、領域ＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥ(配列番号２１５)内のアミノ酸残基と結合する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲの領域ＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１６)内のアミノ酸残基と結合する。ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、成熟ヒトＧＩＴＲの領域ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)内のアミノ酸残基と結合する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、実施例に示すプロトコールを使用して、ＨＤＸにより決定して、アミノ酸配列ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)と結合する。
ここに記載する抗体と“ＧＩＴＲ上の同じエピトープ”に結合する抗体を決定する方法は、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析のような、エピトープマッピング法を含む。他の方法抗原配列中のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失がしばしばエピトープ成分の指標と見なされる、抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異した異形への結合をモニターする。さらに、エピトープマッピングのためのコンピューターによるコンビナトリアル法も使用できる。方法はまた目的の抗体が、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的短ペプチド(未変性三次元形態または変性形態のいずれかで)を親和性単離する能力も利用し得る。ペプチドを、次いで、ペプチドライブラリーのスクリーニングに使用する抗体に対応するエピトープの定義のためのリードと見なす。エピトープマッピングのために、コンピューターによるアルゴリズムも開発されており、これは、立体構造的不連続エピトープをマッピングすることが示されている。
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体と結合について競合するまたは同じエピトープに結合する抗体を、当分野で知られる方法を使用して同定し得る。例えば、マウスをここに記載するようなヒトＧＩＴＲで免疫化し、ハイブリドーマを産生し、得られたモノクローナル抗体を、ＧＩＴＲへの結合についてここに記載する抗体と競合する能力についてスクリーニングし得る。マウスを抗体が結合するエピトープを含むＧＩＴＲの小フラグメントで免疫化もできる。エピトープまたはエピトープを含む領域を、例えば、ＧＩＴＲにまたがる一連の重複ペプチドへの結合についてスクリーニングすることにより、局所化できる。あるいは、Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994の方法を、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体と同じエピトープ、それゆえに類似する性質を有する抗体の選択を導くために使用し得る。ファージディスプレイを使用して、まず抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖を(好ましくはヒト)軽鎖のレパートリーと対形成させて、ＧＩＴＲ結合抗体を選択し、次いで新規軽鎖を(好ましくはヒト)重鎖のレパートリーと対形成させて、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体と同じエピトープまたはエピトープ領域を有する(好ましくはヒト)ＧＩＴＲ結合抗体を選択する。あるいはここに記載する抗体のバリアントを、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの変異誘発により得ることができる。
ＧＩＴＲにおけるアミノ酸残基のCunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085に記載のようなアラニンスキャニング変異誘発またはいくつかの他の形態の点変異誘発も抗ＧＩＴＲ抗体のための機能的エピトープを決定するために使用し得る。変異誘発試験は、しかしながら、またＧＩＴＲの全体的三次元構造に重要であるが、抗体−抗原接触には直接関与しないアミノ酸残基も明らかにし、それゆえに、他の方法が、この方法を使用して決定された機能的エピトープを確認するために必要であり得る。
特異的抗体により結合されるエピトープまたはエピトープ領域(“エピトープ領域”はエピトープを含むまたはエピトープと重複する領域である)はまた、ＧＩＴＲのフラグメント、例えば、非変性または変性フラグメントを含むペプチドへの抗体の結合の評価によっても決定し得る。ＧＩＴＲ(例えば、ヒトＧＩＴＲ)の配列に包含される一連の重複ペプチドを合成し、結合について、例えば直接ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ(ペプチドがマイクロタイタープレートのウェルに結合したＧＩＴＲに抗体が結合するのを妨げる能力を評価する)またはチップ上でスクリーニングし得る。このようなペプチドスクリーニング法は、ある不連続機能的エピトープ、すなわちＧＩＴＲポリペプチド鎖の一次配列に沿って連続していないアミノ酸残基を含む機能的エピトープを検出できないかもしれない。
エピトープはまた水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)のようなＭＳベースのタンパク質フットプリント法およびFast Photochemical Oxidation of Proteins(ＦＰＯＰ)によっても同定できる。ＨＤＸ−ＭＳは、例えば、さらに実施例およびWei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95(その方法は、ここに引用することにより特に本明細書に包含させる)に記載するように実施できる。ＦＰＯＰは、例えば、Hambley and Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057(その方法は、ここに引用することにより特に本明細書に包含させる)に記載するように実施できる。
抗ＧＩＴＲ抗体により結合されるエピトープはまた、Ｘ線結晶構造決定(例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３号)、分子モデリングおよびＧＩＴＲにおける不安定なアミド水素の、遊離時および目的の抗体との複合体で結合時のＨ−Ｄ交換率のＮＭＲ決定を含む核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピーのような、構造的方法によっても決定できる(Zinn-Justin et al. (1992) Bio化学 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Bio化学 32, 6884-6891)。
Ｘ線結晶学に関して、結晶化は、マイクロバッチ(例えば Chayen (1997) Structure 5:1269-1274)、ハンギング・ドロップ蒸気拡散法(例えばMcPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303)、シーディングおよび透析を含む、当分野で知られる方法のいずれかを使用して達成され得る(例えばGiege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23)。少なくとも約１mg／mL、好ましくは約１０mg／mL〜約２０mg／mLの濃度を有するタンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、約１０％〜約３０％(ｗ／ｖ)範囲の濃度で、ポリエチレングリコール１０００〜２０,０００(ＰＥＧ；平均分子量約１０００〜約２０,０００Da範囲)、好ましくは約５０００〜約７０００Da、より好ましくは約６０００Daを含む沈殿剤溶液中で最良に達成され得る。約０.５％〜約２０％の濃度範囲で、タンパク質安定化剤、例えばグリセロールを含むのも望ましいことがある。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムのような適当な塩も、沈殿剤溶液中で望ましいことがあり、好ましくは約１mM〜約１０００mMの濃度範囲である。沈殿剤は、好ましくは約３.０〜約５.０、好ましくは約４.０のｐＨに緩衝化する。沈殿剤溶液において有用な具体的な緩衝液は変わってよく、当分野で周知である(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York)。有用な緩衝液の例は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸を含むが、これらに限定されない。結晶は、２℃、４℃、８℃および２６℃を含む広範な温度で成長し得る。
抗体：抗原結晶を周知のＸ線回折法を使用して試験してよく、Ｘ−ＰＬＯＲ(Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.;例えばBlundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press参照；米国特許出願公開２００４／００１４１９４号)およびＢＵＳＴＥＲ(Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323)のようなコンピューターソフトウェアを使用して精緻化してよく、これらの記載は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
抗ＧＩＴＲ抗体は、ここに記載する方法のような、エピトープマッピング法により決定して、ここに記載するアミノ酸配列を有する抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかと同じエピトープに結合し得る。
VII. 改変および修飾抗体
ＶＨおよびＶＬ領域
また提供されるのは、修飾抗体を操作するために出発物質としてここに開示するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上を有する抗体を使用して製造できる改変および修飾抗体であり、この修飾抗体は、出発抗体から改変された性質を有し得る。抗体は、可変領域の一方または両方(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)、例えば１以上のＣＤＲ領域および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上の残基の修飾により操作され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を変えるために、定常領域内の残基の修飾により操作できる。
実施できるあるタイプの可変領域エンジニアリングはＣＤＲ移植である。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体でより多様である。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用を担うため、異なる性質を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された特異的な天然に存在する抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的な天然に存在する抗体の性質を模倣する組み換え抗体を発現することが可能である(例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033；米国特許５,２２５,５３９号、Winterおよび米国特許５,５３０,１０１号、５,５８５,０８９号、５,６９３,７６２号および６,１８０,３７０号、Queen et al.参照)。
よって、ここに記載する他の態様は、それぞれ配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２、配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３および配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびそれぞれ配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５、配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６および配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。それゆえに、このような抗体は、モノクローナル抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含み、さらに、これらの抗体と異なるフレームワーク配列を含み得る。
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のための生殖系列ＤＮＡ配列は、“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖系列配列データベース(インターネット上のwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用可能)ならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of V-H Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798;およびCox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836に見ることができ、これらの各々の内容を、引用により本明細書に明示的に包含させる。
ここに記載する抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、ここに記載する抗体により使用されるフレームワーク配列と構造的に類似するものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるのと同一配列を有するフレームワーク領域に移植してよく、またはＣＤＲ配列を生殖系列配列と比較して１以上の変異を含むフレームワーク領域に移植してよい。例えば、ある場合において、抗体の抗原結合能を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有利であることが判明している(例えば、Queen et al.の米国特許５,５３０,１０１号、５,５８５,０８９号、５,６９３,７６２号および６,１８０,３７０号参照)。
ここに記載する改変抗体は、例えば、抗体の性質を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾がなされているものを含む。一般にこのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行う。例えば、一つの方法は、１以上のフレームワーク残基の対応する生殖系列配列への“復帰突然変異”である。より具体的に、体細胞性変異を受けている抗体は、該抗体が由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列と、該該抗体が由来する生殖系列配列を比較することにより特定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列配置に戻すために、体細胞性変異を、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発により、生殖系列配列に“復帰突然変異”させ得る。このような“復帰突然変異”抗体も、包含されることが意図される。
他のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより該抗体の免疫原性の可能性を減らすために、フレームワーク領域内または１以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基を変異させることを含む。この方法は“脱免疫化”とも呼ばれ、Carr et al.の米国特許公開２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
他のタイプの可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それにより目的の抗体の１以上の結合特性(例えば、親和性)を改善することである。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ介在変異誘発を、変異を導入するために実施でき、抗体結合または他の目的の機能的性質に対する効果を、ここに記載し、実施例に提供するインビトロまたはインビボアッセイにより評価できる。好ましくは保存的修飾(上記)を導入する。変異はアミノ酸置換、付加または欠失であってよいが、好ましくは置換である。さらに、一般にＣＤＲ領域内の１、２、３、５、または５を超えない残基が改変される。
よって、また提供されるのは、(ａ)配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２と比較して１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１領域；(ｂ)配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２領域；(ｃ)配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３領域；(ｄ)配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１領域；(ｅ)配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２領域；および(ｆ)配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む、単離抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
抗体のＣＤＲにおけるメチオニン残基は酸化してよく、化学分解の可能性および結果としての抗体の効力の低下を生じる。よって、また提供されるのは、酸化的分解を受けないアミノ酸残基で置き換えられた重鎖および／または軽鎖ＣＤＲにおける１以上のメチオニン残基を有する抗ＧＩＴＲ抗体である。ある態様において、抗体２８Ｆ３、１８Ｅ１０、１９Ｄ３および６Ｇ１０のＣＤＲにおけるメチオニン残基は、酸化的分解を受けないアミノ酸残基に置き換えられる。
同様に、特にＣＤＲにおいて、脱アミド部位を、抗ＧＩＴＲ抗体から除去し得る。
Ｆｃおよび修飾Ｆｃ
ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃに結合(例えば、共有的に結合または融合)してよく、これは、あらゆるアロタイプまたはイソアロタイプ、例えば、ＩｇＧ１についてについて：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１(ａ)、Ｇ１ｍ２(ｘ)、Ｇ１ｍ３(ｆ)、Ｇ１ｍ１７(ｚ)；ＩｇＧ２について：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３(ｎ)；ＩｇＧ３について：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１(ｇ１)、Ｇ３ｍ２８(ｇ５)、Ｇ３ｍ１１(ｂ０)、Ｇ３ｍ５(ｂ１)、Ｇ３ｍ１３(ｂ３)、Ｇ３ｍ１４(ｂ４)、Ｇ３ｍ１０(ｂ５)、Ｇ３ｍ１５(ｓ)、Ｇ３ｍ１６(ｔ)、Ｇ３ｍ６(ｃ３)、Ｇ３ｍ２４(ｃ５)、Ｇ３ｍ２６(ｕ)、Ｇ３ｍ２７(ｖ)；およびＫについて：Ｋｍ、Ｋｍ１、Ｋｍ２、Ｋｍ３であり得る(例えば、Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域を、１以上の活性化Ｆｃ受容体(ＦｃγＩ、ＦｃγIIａまたはＦｃγIIIａ)に結合するＦｃと結合させ、それによりＡＤＣＣを刺激し、Ｔ細胞枯渇を引き起こし得る。ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域を、枯渇を引き起こすＦｃと結合する。さらに実施例に記載するように(実施例１６および１７)、マウスＩｇＧ２ａおよびラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ(マウス活性化ＦｃＲへの結合においてマウスＩｇＧ２ａと同等)は、いくつかのマウス腫瘍モデルにおいて、腫瘍増殖の最大阻害を誘発した。抗ＧＩＴＲ ｍＧ２ａ、ｍＧ２ｂおよびｒＧ２ｂアイソタイプは、末梢のＴｒｅｇ集団にほとんど効果を有しないか、わずかな増加を誘発させたのに対し、腫瘍環境において腫瘍増殖阻害と相関する顕著なＴｒｅｇ枯渇を誘発した。逆に、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプは、腫瘍部位でＣＤ８＋細胞のパーセンテージの増加を起こし、一方ｍＩｇＧ１およびラットＩｇＧ２ｂは、ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを増加させないか、最低限度の増加しか誘発しなかった。よって、ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域はヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３ Ｆｃに結合し、すなわち、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのものである。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は枯渇抗体であり、特に、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞を枯渇させるが(そしてそれにより抗腫瘍活性を増強する)、腫瘍微小環境に存在し、抗腫瘍効果を仲介するＴｅｆｆ細胞を顕著に枯渇させずおよび／または腫瘍外、例えば、末梢のＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞を顕著に枯渇させない。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、腫瘍部位でＴｒｅｇ細胞枯渇または排出および付随するＴｅｆｆ細胞の活性化を刺激する、アイソタイプ(天然に存在するまたは天然に存在しない(例えば、変異を含む)アイソタイプ)である。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、好ましくは、腫瘍外、例えば、末梢のＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞を顕著に枯渇させることなく、強力な抗腫瘍活性の指標である腫瘍部位での高いＴｅｆｆ対Ｔｒｅｇ比を作る。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｔｒｅｇの免疫抑制性活性を遮断する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＦｃＲ結合が無くまたは低く、例えば、活性化ＦｃＲへの結合が低く、Ｆｃ受容体に結合する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、増強されたアゴニズムを提供できる、ＦｃＲIIｂに結合するまたは増強された結合を有するＦｃを有する。
ある態様において、内因性免疫応答を増強する抗ＧＩＴＲ抗体の効力を、抗体のＦｃ領域を、該Ｆｃ領域の活性化Ｆｃ受容体への結合が増強されるように、選択、操作または修飾することを含む方法で、増強、最適化または最大化する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体はＴＲＸ−５１８である。
ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域を、エフェクターレスまたは大部分はエフェクターレスＦｃ、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４に結合させる。
ここに記載する抗ＧＩＴＲ可変領域を、腫瘍環境におけるＴｒｅｇ枯渇を増強するためのように、天然に存在しないＦｃ領域、例えば、エフェクターレスＦｃまたは１以上の活性化Ｆｃ受容体(ＦｃγＩ、ＦｃγIIａまたはＦｃγIIIａ)に対する増強された結合を有するＦｃと結合させてよい。
一般に、ここに記載する可変領域を、一般に、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞・細胞毒性のような抗体の１以上の機能的性質を改変するために、１以上の修飾を含むＦｃと結合させてよい。さらに、ここに記載する抗体を、抗体の１以上の機能的性質を改変するために、化学的に修飾(例えば、１以上の化学部分を抗体に結合できる)しても、そのグリコシル化を変えるために修飾してもよい。これらの態様の各々を下にさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵ指標のものである。
Ｆｃ領域は、定常領域のフラグメント、アナログ、バリアント、変異体または誘導体を含む、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの定常領域由来のドメインを含む。適当な免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭのような他のクラスを含む。免疫グロブリンの定常領域は、天然に存在するまたは合成により製造した免疫グロブリンＣ末端領域に相同のポリペプチドとして定義され、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ４ドメインを別々にまたは組み合わせて含み得る。
免疫グロブリンの定常領域は、Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)結合および補体固定を含む多くの重要な抗体機能を担う。ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭとして分類される、重鎖定常領域の５個の主要なクラスがあり、各々、アイソタイプにより指定される特徴的エフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４として知られる４サブクラスに分類される。
Ｉｇ分子は、複数のクラスの細胞受容体と相互作用する。例えばＩｇＧ分子は、ＩｇＧクラスの抗体に特異的な３クラスのＦｃγ受容体(ＦｃγＲ)、すなわちＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIと相互作用する。ＩｇＧのＦｃγＲ受容体への結合に重要な配列は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに位置することが報告されている。抗体の血清半減期は、抗体がＦｃ受容体(ＦｃＲ)に結合する能力に影響される。
ある態様において、Ｆｃ領域は、望ましい構造的特徴および／または生物学的活性を提供するために、バリアントＦｃ領域、例えば、親Ｆｃ配列(例えば、バリアントの産生のためにその後修飾される非修飾Ｆｃポリペプチド)に対して、修飾(例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入により)されているＦｃ配列である。
例えば、親Ｆｃと比較して、(ａ)増加したまたは低減した抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)、(ｂ)増加したまたは低減した補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)、(ｃ)増加したまたは低減したＣ１ｑに対する親和性および／または(ｄ)増加したまたは低減したＦｃ受容体に対する親和性を有するＦｃバリアントを産生するために、Ｆｃ領域に修飾をしてよい。このようなＦｃ領域バリアントは、一般にＦｃ領域に少なくとも１アミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾の組み合わせは、特に望ましいと考えられる。例えば、バリアントＦｃ領域は、２、３、４、５等の置換をその中に、例えばここに定義する特異的Ｆｃ領域位置に含んでよい。
バリアントＦｃ領域はまた配列変更も含んでよく、ここで、ジスルフィド結合形成に関与するアミノ酸が除かれるか、他のアミノ酸に置換される。このような除去は、ここに記載する抗体の産生に使用する宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を避け得る。システイン残基が除去されたときでも、一本鎖Ｆｃドメインはなおまだ、非共有的に一緒に維持される、二量体Ｆｃドメインを形成できる。他の態様において、Ｆｃ領域を、選択された宿主細胞とより適合性となるように修飾し得る。例えば、プロリンイミノペプチダーゼのような大腸菌における消化酵素により認識され得る、典型的未変性Ｆｃ領域のＮ末端近辺のＰＡ配列を除去し得る。他の態様において、Ｆｃドメイン内の１以上のグリコシル化部位を除去し得る。一般にグリコシル化される残基(例えば、アスパラギン)は、細胞溶解応答を付与し得る。このような残基を、削除するかまたは非グリコシル化残基(例えば、アラニン)に置換し得る。他の態様において、Ｃ１ｑ結合部位のような補体との相互作用に関与する部位を、Ｆｃ領域から除去し得る。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を除去または置換し得る。ある態様において、Ｆｃ受容体への結合に影響する部位、好ましくはサルベージ受容体結合部位以外の部位を除去してよい。他の態様において、Ｆｃ領域を修飾して、ＡＤＣＣ部位を除去し得る。ＡＤＣＣ部位は当分野で知られる；例えば、ＩｇＧ１におけるＡＤＣＣ部位に関してMolec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)参照。バリアントＦｃドメインの具体例は、例えば、ＷＯ９７／３４６３１号およびＷＯ９６／３２４７８号に開示されている。
ある態様において、Ｆｃのヒンジ領域を、ヒンジ領域におけるシステイン残基数が変わる、例えば、増えるまたは減るように修飾する。この方法は、Bodmer et al.の米国特許５,６７７,４２５号にさらに記載される。Ｆｃのヒンジ領域におけるシステイン残基数を、例えば、軽鎖と重鎖の結合が促進されるようにまたは抗体の安定性が増加もしくは減少するように変える。ある態様において、抗体のＦｃヒンジ領域を、抗体の生物学的半減期を減らすように変異する。より具体的に、未変性Ｆｃ−ヒンジドメインブドウ球菌プロテインＡ(ＳｐＡ)結合と比較して、抗体が障害されたＳｐＡ結合を有するように、１以上のアミノ酸変異をＦｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。この方法は、Ward et al.の米国特許６,１６５,７４５号にさらに詳細に記載される。
さらに別の態様において、Ｆｃ領域を、抗体のエフェクター機能を変えるために少なくとも１アミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることにより改変する。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１以上のアミノ酸を、抗体が、エフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を維持するように、異なるアミノ酸残基で置き換え得る。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分である。この方法は、両者ともWinter et al.の米国特許５,６２４,８２１号および５,６４８,２６０号にさらに詳細に記載される。
他の例において、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１以上のアミノ酸を、抗体が改変されたＣ１ｑ結合および／または低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害作用(ＣＤＣ)を有するように、異なるアミノ酸残基で置き換え得る。この方法は、Idusogie et al.の米国特許６,１９４,５５１にさらに詳細に記載される。
他の例において、アミノ酸２３１位および２３９位内の１以上のアミノ酸残基が改変され、それにより抗体が補体を固定する能力が改変される。この方法は、Bodmer et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１号にさらに記載される。
さらに他の例において、Ｆｃ領域を、次の位置の１以上のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存性細胞細胞毒性(ＡＤＣＣ)の増加および／またはＦｃγ受容体に対する親和性の増加のために修飾し得る：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９。置換の例は、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅを含む。バリアントの例は、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔおよび２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔを含む。ＦｃｙＲと補体の相互作用を増強する他の修飾は、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉおよび３９６Ｌを含むが、これらに限定されない。これらおよび他の修飾は、Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。
Ｆｃγ受容体への結合を増加させるＦｃ修飾は、Ｆｃ領域の任意の１以上のアミノ酸２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２５５位、２５６位、２５８位、２６５位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７９位、２８０位、２８３位、２８５位、２９８位、２８９位、２９０位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９８位、３０１位、３０３位、３０５位、３０７位、３１２位、３１５位、３２４位、３２７位、３２９位、３３０位、３３５位、３３７位、３３３８位、３４０位、３６０位、３７３位、３７６位、３７９位、３８２位、３８８位、３８９位、３９８位、４１４位、４１６位、４１９位、４３０位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位または４３９位のアミノ酸修飾を含み、ここで、Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指標のものである(ＷＯ００／４２０７２号)。
Ｆｃに付し得る他のＦｃ修飾は、ＦｃγＲおよび／または補体タンパク質への結合を減少または消失させるものであり、それによりＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣのようなＦｃ介在エフェクター機能を低減または消失させる。修飾の例は、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２６７位、２６９位、３２５位および３２８位の置換、挿入および欠失を含むが、これらに限定されず、ここで、ナンバリングはＥＵ指標に従う。置換の例は、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌおよび３２８Ｒを含むが、これらに限定されず、ここで、ナンバリングはＥＵ指標に従う。Ｆｃバリアントは２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃｙＲと補体の相互作用を減少させる他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖならびに変異的または酵素的手段またはタンパク質をグリコシル化しない細菌のような生物における産生による２９７位のグリコシル化の除去を含む。これらおよび他の修飾は、Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。
所望により、Ｆｃ領域は、当業者に知られるさらなるおよび／または代替的位置に天然に存在しないアミノ酸残基を含んでよい(例えば、米国特許５,６２４,８２１号、６,２７７,３７５号、６,７３７,０５６号、６,１９４,５５１号、７,３１７,０９１号、８,１０１,７２０号、ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４２０７２号、ＷＯ０１／５８９５７号、ＷＯ０２／０６９１９号、ＷＯ０４／０１６７５０号、ＷＯ０４／０２９２０７号、ＷＯ０４／０３５７５２号、ＷＯ０４／０７４４５５号、ＷＯ０４／０９９２４９号、ＷＯ０４／０６３３５１号、ＷＯ０５／０７０９６３号、ＷＯ０５／０４０２１７号、ＷＯ０５／０９２９２５号およびＷＯ０６／０２０１１４号参照)。
阻害性受容体ＦｃｙＲｌｌｂに対する親和性を増強するＦｃバリアントも使用し得る。このようなバリアントは、例えばＢ細胞および単球を含むＦｃｙＲｌｌｂ＋細胞に関係する、免疫調節性活性を備えたＦｃ融合タンパク質を提供し得る。ある態様において、Ｆｃバリアントは、１以上の活性化受容体に比してＦｃｙＲｌｌｂに対する選択的に増強された親和性を提供する。ＦｃｙＲｌｌｂへの結合を変える修飾は、ＥＵ指標に従う、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および３３２からなる群から選択される位置の１以上の修飾を含む。ＦｃｙＲｌｌｂ親和性を増強するための置換の例は、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅを含むが、これらに限定されない。置換の例は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙを含むが、これらに限定されない。ＦｃｙＲｌｌｂへの結合を増強するための他のＦｃバリアントは、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅおよび２６７Ｅ／３２８Ｆを含む。
Ｆｃ領域のそのリガンドへの親和性および結合特性は、平衡方法(例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)または放射免疫アッセイ(ＲＩＡ))または動態(例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析)および間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)のような他の方法を含むが、これらに限定されない、当業者に知られる多様なインビトロアッセイ法(生化学または免疫学ベースのアッセイ)により決定し得る。これらおよび他の方法は、試験する１以上の成分を利用するおよび／または発色性標識、蛍光性標識、発光性標識または同位体標識を含むが、これらに限定されない多様な検出方法を用いる。結合親和性および動態の詳細な記載は、抗体−免疫原相互作用に焦点を絞るPaul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見ることができる。
ある態様において、抗体を、その生物学的半減期を延長させるために修飾する。種々の方法が可能である。例えば、これは、Ｆｃ領域のＦｃＲｎに対する結合親和性の増加により行い得る。例えば、米国特許６,２７７,３７５号に記載のように、次の残基の１以上を変異してよい：２５２、２５４、２５６、４３３、４３５、４３６。置換の具体例は、次の１以上を含む：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓおよび／またはＴ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を延長するために、Presta et al.の米国特許５,８６９,０４６号および６,１２１,０２２号に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２ループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で改変し得る。ＦｃＲｎへの結合を増加させるおよび／または薬物動態性質を改善するバリアントの他の例は、例えば２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍを含む、２５９位、３０８位、４２８位および４３４位での置換を含む。ＦｃＲｎへのＦｃ結合を増加させる他のバリアントは、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ(Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604)、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ(Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)を含む。ＦｃＲｎ結合を調節するための他の修飾は、Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671に記載されている。ある態様において、特定の生物学的特徴を有するハイブリッドＩｇＧアイソタイプを使用し得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ１位置を２つのアイソタイプが異なる位置であるＩｇＧ３からのアミノ酸で置換することにより構築し得る。それゆえに、１以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２１、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体を構築し得る。ここに記載する他の態様において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ２位置を、２つのアイソタイプが異なる位置であるＩｇＧ１からのアミノ酸で置換することにより構築し得る。それゆえに、１以上の置換、例えば、１以上の次のアミノ酸置換を含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体を構築し得る：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ(２３６位へのグリシン挿入をいう)および３２７Ａ。
さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１の結合部位はマッピングされており、結合が改善したバリアントは記載されている(Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604参照)。２５６位、２９０位、２９８位、３３３位、３３４位および３３９位の特異的変異は、ＦｃγＲIIIへの結合を改善することが示された。さらに、次の組み合わせ変異体がＦｃγＲIII結合を改善することが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ(これは、増強されたＦｃγＲIIIａ結合およびＡＤＣＣ活性を示すことが示されている(Shields et al., 2001))。ＦｃγＲIIIａへの結合が高度に増強された他のＩｇＧ１バリアントが特定されており、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異を伴うバリアントを含み、これは、カニクイザルサルにおいてＦｃγＲIIIａに対する親和性の最大増加、ＦｃγＲIIｂ結合増加および強い細胞毒性活性を示した(Lazar et al., 2006)。アレムツズマブ(ＣＤ５２特異的)、トラスツズマブ(ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的)、リツキシマブ(ＣＤ２０特異的)およびセツキシマブ(ＥＧＦＲ特異的)のような抗体へのトリプル変異の導入は、インビトロの大きく増強されたＡＤＣＣ活性に転換され、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅバリアントは、サルにおけるＢ細胞枯渇に増強された能力を示した(Lazar et al., 2006)。さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルにおけるヒトＦｃγＲIIIａを発現するトランスジェニックマウスにおけるＦｃγＲIIIａに対する増強された結合および付随して増強されたＡＤＣＣ活性を示すＬ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ変異を含むＩｇＧ１変異体が同定されている(Stavenhagen et al., 2007; Nordstrom et al., 2011)。使用し得る他のＦｃ変異体は、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｌ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｌ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６ＬおよびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む。
ある態様において、ＦｃγＲへの結合が減少したＦｃを選択する。減少したＦｃγＲ結合を有するＦｃ、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃの例は、次の３アミノ酸置換を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａ。
ある態様において、補体固定が低減したＦｃを選択する。低減した補体固定を有するＦｃ、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃの例は、次の２アミノ酸置換を含む：Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。
ある態様において、本質的にエフェクター機能を有しない、すなわち減少したＦｃγＲ結合および低減した補体固定を有するＦｃを選択する。エフェクターレスであるＦｃ、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃの例は、次の５変異を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。これらの変異を含む重鎖の例を表１１に示す。
ＩｇＧ４定常ドメインを使用するとき、ＩｇＧ１におけるヒンジ配列を模倣し、それによりＩｇＧ４分子を安定化する置換Ｓ２２８Ｐを含むのが通常好ましい。
さらに他の態様において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を製造できる(すなわち、抗体はグリコシル化を欠く)。グリコシル化は、例えば、抗体の抗原に対する親和性を増加させるように改変し得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１以上の部位の改変により達成できる。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除と、それによりその部位のグリコシル化の排除をもたらす１以上のアミノ酸置換をなし得る。このような非グリコシル化は、抗体の抗原に対する親和性を増加させ得る。このような方法は、Co et al.の米国特許５,７１４,３５０号および６,３５０,８６１号にさらに詳細に記載されている。
定常領域のＮ２９７のグリコシル化は、Ｎ２９７残基を他の残基、例えば、Ｎ２９７Ａに変異させることによりおよび／または隣接アミノ酸、例えば、２９８を、それによりＮ２９７のグリコシル化が低減するように変異させることにより阻止し得る。
これに加えてまたはこれとは別に、フコシル残基の量が少ない低フコシル化抗体または二分されたＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体のような、他のタイプのグリコシル化を有する抗体を製造できる。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが示されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現することにより達成できる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、文献に記載されており、ここに記載する組み換え抗体を発現し、それにより改変されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用できる。例えば、Hanai et al.のＥＰ１,１７６,１９５号は、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株を記載し、これは、このような細胞株で発現された抗体が、低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼを発現する。PrestaのＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ(２９７)結合炭水化物に結合する能力が低減したバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞を記載し、また、この宿主細胞で発現された抗体の低フコシル化をもたらす(またShields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740参照)。Umana et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、操作された細胞株で発現された抗体が、該抗体のＡＤＣＣ活性増加をもたらす、二分されたＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、ベータ(１,４)−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII))を発現するように操作された細胞株を記載する(またUmana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照)。
ここに記載する抗体の他の修飾はペグ化である。抗体は、例えば、該抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を延長するために、ペグ化し得る。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントを、一般に、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントに結合する条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化を反応性ＰＥＧ分子(または類似の反応性水可溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施する。ここで使用する用語“ポリエチレングリコール”は、モノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドのような、他のタンパク質の誘導体化に使用されている、あらゆる形態のＰＥＧを含むことを意図する。ある態様において、ペグ化する抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当分野で知られ、ここに記載する抗体に適用できる。例えば、Nishimura et al. のＥＰ０１５４３１６号およびIshikawa et al.のＥＰ０４０１３８４号参照。
VIII. 抗体物理的性質
ここに記載する抗体は、軽鎖または重鎖可変領域に１以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗原結合化異変により、抗体の免疫原性の増加または抗体のｐＫの変更を引き起こし得る(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで生じることが知られている。ある場合、可変領域グリコシル化を含まない抗ＧＩＴＲ抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択することによりまたはグリコシル化領域内の残基の変異により達成できる。
ある態様において、ここに記載する抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミドはＮ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で生じ得て、ポリペプチド鎖にねじれを導入し、その安定性を低減させる(イソアスパラギン酸効果)、イソアスパラギン酸残基をもたらす。
各抗体は独特な等電点(ｐＩ)を有し、これは一般に６〜９.５のｐＨ範囲に入る。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、一般に７〜９.５のｐＨ範囲に入り、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、一般に６〜８のｐＨ範囲に入る。正常範囲外のｐＩを有する抗体は、インビボ条件下で、ある変性および不安定性を有すると推測される。それゆえに、正常範囲内に入るｐＩを含む抗ＧＩＴＲ抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲のｐＩを有する抗体の選択または荷電表面残基の変異により達成できる。
各抗体は、特徴的融解温度を有し、高い融解温度は、インビボでの高い全体的安定性を示す(Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。一般に、ＴＭ１(最初の変性温度)が６０℃超、好ましくは６５℃超、さらに好ましくは７０℃超であることが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52)または円偏光二色性(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)を使用して測定できる。
好ましい態様において、急速に分解しない抗体を選択する。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定できる(Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32)。
他の好ましい態様において、望まれない免疫応答の惹起および／または改変されたもしくは好ましくない薬物動態特性をもたらし得る凝集効果が最小の抗体を選択する。一般に、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下の凝集の抗体が許容される。凝集は、サイズ排除カラム(ＳＥＣ)、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)および光散乱を含むいくつかの方法で測定し得る。
IX. 抗体を操作する方法
上記のように、ここに開示するＶＨおよびＶＬ配列を有する抗ＧＩＴＲ抗体を、ＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれに結合した定常領域の修飾により新規抗ＧＩＴＲ抗体を製造するために使用できる。それゆえに、ここに開示する他の面において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体、例えば２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０の構造的特徴を使用して、ヒトＧＩＴＲおよびカニクイザルＧＩＴＲへの結合のようなここに記載する抗体の少なくとも１つの機能的性質を保持する構造的に関連する抗ＧＩＴＲ抗体を製造できる。例えば、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０の１以上のＣＤＲ領域またはその変異を、既知フレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み換えにより合わせ、上記のように、さらなる、組み換えにより操作した、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を製造できる。他のタイプの修飾は、前の部分に記載したものを含む。操作法のための出発物質は、ここに提供する１以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列またはその１以上のＣＤＲ領域である。操作された抗体を製造するために、ここに提供する１以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列または１以上のそのＣＤＲ領域を有する抗体を実際に製造する(すなわち、タンパク質として発現させる)必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として使用して、元の配列由来の“第二世代”配列を製造し、次いで“第二世代”配列を製造し、タンパク質として発現させる。
よって、ここに提供されるのは、
(ａ)(ｉ)配列番号２０、３３、４６、６２、７８、９１、１０６、１２２、１３８および３４２からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２１、３４、４７、６３、７９、９２、１０７、１２３、１３９および３４３からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号２２、３５、４８、６４、８０、９３、１０８、１２４、１４０および３４４からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；および(ii)配列番号２３、３６、４９、６５、６８、８１、９４、１０９、１１２、１２５、１４１、１４４および３４５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２４、３７、５０、６６、６９、８２、９５、１１０、１１３、１２６、１４２、１４５および３４６からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号２５、３８、５１、６７、７０、８３、９６、１１１、１１４、１２７、１４３、１４６および３４７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供し；
(ｂ)重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１アミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変された抗体配列を製造し；そして
(ｃ)改変された抗体配列をタンパク質として発現させる
ことを含む、抗ＧＩＴＲ抗体を製造する方法である。
標準分子生物法を使用して、改変された抗体配列を製造および発現できる。
好ましくは、改変された抗体配列によりコードされる抗体は、次のものを含む、こに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の機能的性質の１つ、いくつかまたは全てを保持するものである：
(１) 例えば、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＫＤで可溶性ヒトＧＩＴＲに結合する；
(２) 例えば、スキャッチャードにより測定して、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＫＤで膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(３) 例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１nM以下(例えば、０.０１nM〜１nM)のＥＣ５０で、膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(４) 例えば、ＦＡＣＳにより測定して、例えば、１０nM以下(例えば、０.０１nM〜１０nM)のＥＣ５０でカニクイザルＧＩＴＲに結合する、例えば、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合する；
(５) (ｉ)ＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生増加および／または(ii)増強されたＴ細胞増殖により証明されるような、ＣＤ３結合の存在下(例えば、最適以下の抗ＣＤ３濃度存在下)におけるような、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(６) 多価架橋結合を必要とせず、Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(７) ＦＡＣＳにより測定して、ＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合を、例えば、１μg／mL以下のＥＣ５０で阻害する；
(８) ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を最大でも部分的に阻害する；
(９)成熟ヒトＧＩＴＲ上の立体エピトープ(配列番号４)、例えば、アミノ酸配列ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)内の不連続エピトープに結合する；
(１０) Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両者に結合する；
(１１) Ｆｃ受容体への結合非存在下でアゴニスト活性を有するが、ここで、Ｆｃ受容体への結合がさらにアゴニスト活性を増強する；および
(１２) ヒトＧＩＴＲへの結合について、２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および／または６Ｇ１０といずれかの方向でまたは双方向で競合する。
改変された抗体は、上の(１)〜(１２)に示す機能的性質の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１または全てを示し得る。改変された抗体の機能的性質は、実施例に示すもののような(例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ)、当分野で利用可能および／またはここに記載する標準アッセイを使用して評価できる。
ここに記載する抗体を操作する方法のある態様において、変異を、抗ＧＩＴＲ抗体コード化配列の全てまたは一部に無作為にまたは選択的に挿入でき、得られた修飾抗ＧＩＴＲ抗体を、ここに記載する結合活性および／または他の機能的性質についてスクリーニングできる。変異性方法は文献に記載されている。例えば、ShortのＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０号は、飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリーまたはこれらの組み合わせを使用して、抗体変異を創製およびスクリーニングする方法を記載する。あるいは、Lazar et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９号は、抗体の生理化学的性質を最適化するためのコンピューターによるスクリーニング法を使用する方法を記載する。
Ｘ. 核酸分子
ここに記載する他の面は、ここに記載する抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は全細胞、細胞ライセートまたは部分精製したまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当分野で周知のその他を含む標準方法により、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞性核酸(例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、単離されたＤＮＡに天然では連結している染色体ＤＮＡ)またはタンパク質からから精製して離されたとき、“単離された”または“実質的に純粋にされた”。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。ここに記載する核酸は、例えば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。ある態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
ここに記載する核酸は、標準分子生物法を使用して得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、下記のようにヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから作製したハイブリドーマ)により発現される抗体に関して、ハイブリドーマにより産生された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング方法により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー(例えば、ファージディスプレイ法を使用)から得た抗体に関して、抗体をコードする核酸を、ライブラリーから回収できる。
ここに記載する好ましい核酸分子は、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列の例は、それぞれ配列番号１４７、１５４、１５８、１６２、１６８、１７２、１７６、１８２、１８６および３５３に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列の例は、それぞれ配列番号１４８、１５５、１６３、１６４、１６９、１７３、１７７、１７８、１８３、１８７、１８８および３５４に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０の重鎖配列をコードするＤＮＡ配列の例は、それぞれ配列番号１４９、１５６、１６０、１６５、１７０、１７４、１７９、１８４、１８９および３５５に示す。２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０の軽鎖配列をコードするＤＮＡ配列の例は、それぞれ配列番号１５０、１５７、１６１、１６６、１６７、１７１、１７５、１８１、１８０、１８５、１９０、１９１および３５６に示す。
２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(同一可変領域)抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１４７および１４８に示す。２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１抗体の成熟重鎖をコードする核酸の例は、それぞれ配列番号１５１および１５２に示し、２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１抗体の成熟軽鎖をコードする核酸の例を、配列番号１５３に示す。
シグナルペプチドを伴う２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(同一可変領域)抗体のＶＨおよびＶＬドメインの例をそれぞれ配列番号３５７および３５８に示し、これらをコードするヌクレオチド配列の例を、それぞれ配列番号３５９および３６０に示す。
シグナルペプチドを伴う２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１抗体の重鎖の例をそれぞれ配列番号３６１および３６２に示し、これらをコードするヌクレオチド配列の例を、それぞれ配列番号３６３および３６４に示す。シグナルペプチドを伴う２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１抗体の軽鎖の例を配列番号３６５に示し、それをコードするヌクレオチド配列の例を配列番号３６６に示す。
２８Ｆ３.ＩｇＧ１の製造法は、重鎖および軽鎖を、シグナルペプチドと共に重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列、例えば、それぞれ配列番号３６３および３６５を含む細胞株で発現させることを含み得る。２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１の製造法は、シグナルペプチドと共に重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列、例えば、それぞれ配列番号３６４および３６６を含む細胞株で重鎖および軽鎖を発現させることを含み得る。これらのヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ここに包含させる。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントを、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準組み換えＤＮＡ法によりさらに操作できる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨコード化ＤＮＡフラグメントを、抗体定常領域または可動性リンカーのような他のタンパク質をコードする他のＤＮＡフラグメントと操作可能に結合する。この文脈で使用する用語“操作可能に結合された”は、２個のＤＮＡフラグメントが、２個のＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がフレーム内のままであるように連結されることを意味することを意図する。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨコード化ＤＮＡを重鎖定常領域をコードする他のＤＮＡ分子(ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３)に操作可能に結合することにより、完全長重鎖遺伝子に変換できる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られる(例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)そして、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子に関して、ＶＨコード化ＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に結合できる。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡを、ＶＬコード化ＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に結合することにより、完全長軽鎖遺伝子(ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子)に変換できる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントを標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。
ｓｃＦｖ遺伝子を製造するために、ＶＨ−およびＶＬコード化ＤＮＡフラグメントを、可動性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)３をコードする、他のフラグメントと、ＶＨおよびＶＬ配列が連続的一本鎖タンパク質として発現でき、ＶＬおよびＶＨ領域が可動性リンカーにより連結されるように、操作可能に結合される(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554参照)。
またここに提供されるのは、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０モノクローナル抗体と相同であるＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子である。核酸分子の例は、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるＶＨおよびＶＬ配列を含む。またここに提供されるのは、例えば、コドン最適化のために、保存的置換(すなわち、核酸分子の翻訳により得られるアミノ酸配列を変えない置換)された核酸分子である。
XI. 抗体産生
ここに記載するモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)に記載されている標準体細胞ハイブリダイゼーション法のような、多様な既知方法を使用して、製造できる。体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、原則的に、モノクローナル抗体を製造する他の方法、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ法も使用できる。
ハイブリドーマを製造する好ましい動物システムはマウスシステムである。マウスでのハイブリドーマ産生は、極めて良好に確立されている方法である。免疫化プロトコールおよび融合のために免疫化脾細胞を単離する方法は当分野で知られる。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合法も知られる。
ここに記載するキメラまたはヒト化抗体は、上記のように製造されるマウスモノクローナル抗体の配列に基づき製造できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスハイブリドーマから得て、標準分子生物法を使用して非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含むように操作できる。例えば、キメラ抗体を製造するために、マウス可変領域を、当分野で知られる方法を使用してヒト定常領域に結合できる(例えば、Cabilly et al.の米国特許４,８１６,５６７号参照)。ヒト化抗体を製造するために、マウスＣＤＲ領域を、当分野で知られる方法を使用してヒトフレームワークに導入できる(例えば、Winterの米国特許５,２２５,５３９号および米国特許５,５３０,１０１号；Queen et al.の米国特許５,５８５,０８９号、５,６９３,７６２号および６,１８０,３７０号参照)。
ある態様において、ここに記載する抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＧＩＴＲに対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウスシステムではなく、ヒト免疫系の一部を担持する、トランスジェニックまたは染色体導入マウスを使用して産生できる。これらのトランスジェニックおよび染色体導入マウスは、それぞれここでＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称し、まとめて“ヒトＩｇマウス”と称するマウスを含む。
ＨｕＭＡｂマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、非再配列ヒト重(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座位(miniloci)を、内在性μおよびκ鎖座位を不活性化する標的化変異と共に含む(例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859参照)。よって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現が低減しており、免疫化に対して不応答であり、導入ヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞性変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生じる(その全ては、その全体を引用により本明細書に特に包含させる、Lonberg, N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546)。ＨｕＭＡｂマウスの製造および使用およびそのようなマウスにより担持される遺伝子修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; and Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されており、その全ての内容を全体に引用により本明細書に特に包含させる。さらに、全てLonberg and Kayの米国特許５,５４５,８０６号、５,５６９,８２５号、５,６２５,１２６号、５,６３３,４２５号、５,７８９,６５０号、５,８７７,３９７号、５,６６１,０１６号、５,８１４,３１８号、５,８７４,２９９；および５,７７０,４２９号；Surani et al.の米国特許５,５４５,８０７号、全てLonberg and KayのＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９７／１３８５２号、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２号；およびKorman et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４号参照。
ある態様において、ここに記載する抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスのような、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを使用して惹起する。ここでは“ＫＭマウス”と称するこのようなマウスは、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８号に詳細に記載される。
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物システムが当分野で利用可能であり、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の惹起に使用できる。例えば、Xenomouse(Abgenix, Inc.)と称される代替トランスジェニックシステムを使用でき、このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許５,９３９,５９８号、６,０７５,１８１号、６,１１４,５９８号、６,１５０,５８４号および６,１６２,９６３号に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替の染色体導入動物システムが当分野で利用可能であり、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の惹起に使用できる。例えば、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両者を担持する、“ＴＣマウス”と称するマウスを使用でき、このようなマウスはTomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載される。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが、文献に記載されており(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の惹起に使用できる。
ヒト抗体、例えば、ヒト抗ＧＩＴＲ抗体の惹起について文献に記載されているさらなるマウスシステムは、(ｉ)内在性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組み換えにより、ヒト重鎖および軽鎖可変領域と置き換えられ、キメラ抗体(ヒトＶ／マウスＣ)がマウスを惹起するように内在性マウス定常領域に操作可能に結合され、続いて標準組み換えＤＮＡ法を使用して完全ヒト抗体に変換された、VelocImmune(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)；および(ii)マウスが非再配列ヒト重鎖可変領域を含むが、単一再配列ヒト共通軽鎖可変領域を含む、MeMo(登録商標)マウス(Merus Biopharmaceuticals, Inc.)を含む。このようなマウスおよび抗体惹起のためのそれらの使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７号、ＵＳ２０１０／００６９６１４号、ＷＯ２０１１／０７２２０４号、ＷＯ２０１１／０９７６０３号、ＷＯ２０１１／１６３３１１号、ＷＯ２０１１／１６３３１４号、ＷＯ２０１２／１４８８７３号、ＵＳ２０１２／００７０８６１号およびＵＳ２０１２／００７３００４号に記載されている。
ここに記載するヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーのスクリーニングのためのファージディスプレイ法によっても製造できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は当分野で確立されている。例えば、Ladner et al.の米国特許５,２２３,４０９号、５,４０３,４８４号および５,５７１,６９８号、Dower et al.の米国特許５,４２７,９０８および５,５８０,７１７号、McCafferty et al.の米国特許５,９６９,１０８号および６,１７２,１９７号およびGriffiths et al.の米国特許５,８８５,７９３号、６,５２１,４０４号、６,５４４,７３１号、６,５５５,３１３号、６,５８２,９１５号および６,５９３,０８１号参照。
ここに記載するヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化によりヒト抗体応答が生じ得るようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用しても、製造できる。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許５,４７６,９９６号および５,６９８,７６７号に記載されている。
免疫化
ＧＩＴＲに対する完全ヒト抗体を産生するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックまたは染色体導入マウス(例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス)を、他の抗原について、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856 859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４号に記載のように、ＧＩＴＲ抗原の精製または富化された調製物および／またはＧＩＴＲまたはそのフラグメントを発現する細胞で免疫化できる。あるいは、マウスをヒトＧＩＴＲまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡで免疫化できる。好ましくは、マウスは最初の注入時６〜１６週齢である。例えば、組み換えＧＩＴＲ抗原の精製または富化調製物(５〜５０μg)を、ＨｕＭＡｂマウスの腹腔内免疫化に使用できる。ＧＩＴＲ抗原の精製または富化された調製物を使用する免疫化が抗体を生じない場合には、免疫応答を促進するために、マウスをＧＩＴＲを発現する細胞、例えば、細胞株で免疫化もできる。細胞株の例は、ＧＩＴＲ過発現安定ＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞株を含む。
種々の抗原での経験の蓄積により、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスは、まずＲｉｂｉのアジュバント中の抗原で腹腔内(ＩＰ)または皮下(ＳＣ)免疫化し、続いて隔週でＲｉｂｉのアジュバント中の抗原でＩＰ／ＳＣ免疫化(最大で計１０回)したとき、最良の応答をすることが示されている。免疫応答を、後眼窩採血により得た血漿サンプルで、免疫化プロトコールをとおしてモニターできる。血漿を、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳでスクリーニングでき(上記のように)、抗ＧＩＴＲヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを、融合に使用する。マウスを、屠殺３日前に抗原の静脈内投与し、脾臓およびリンパ節を除去することによりブースとできる。各免疫化について２〜３融合を実施する必要があると予測される。６〜２４匹のマウスを、一般に各抗原について免疫化する。通常、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統を使用する。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２両者の導入遺伝子を、２種の異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する単一マウスに一緒に仕込み得る(ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２)。
ＧＩＴＲに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの産生
ここに記載するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを産生するために、免疫化マウスからの脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株のような適切な不死化細胞株に融合し得る。得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングできる。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧを用いてＳｐ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８１)に融合できる。細胞を、約２×１０５で平底マイクロタイタープレートに播種し、続いて、１０％fetal Clone Serum、１８％“６５３”条件培地、５％ｏｒｉｇｅｎ(ＩＧＥＮ)、４mM Ｌ−グルタミン、１mM ピルビン酸ナトリウム、５mM ＨＥＰＥＳ、０.０５５mM ２−メルカプトエタノール、５０単位／mlペニシリン、５０mg／mlストレプトマイシン、５０mg／ml ゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ(Sigma)含有選択培地で２週間インキュベーションする。約２週間後、細胞を、ＨＡＴがＨＴに置き換わっている培地で培養し得る。続いて、個々のウェルをＥＬＩＳＡでヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてスクリーニングし得る。広範なハイブリドーマ増殖が起きたら、培地を、通常１０〜１４日後に観察し得る。ハイブリドーマを分泌する抗体を再播種し、再びスクリーニングし、なおヒトＩｇＧが陽性であれば、モノクローナル抗体を、少なくとも２回限界希釈によりサブクローン化できる。次いで安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴付けのために組織培養培地に少量の抗体を産生させる。
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、２リットルスピナーフラスコでモノクローナル抗体精製用に増殖させ得る。上清を濾過し、濃縮し、その後プロテインＡ−セファロース(Pharmacia, Piscataway, N.J.)で親和性クロマトグラフィーし得る。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認し、純度を確定させ得る。緩衝液溶液をＰＢＳに交換してよく、濃度を１.４３透過係数を使用するＯＤ２８０で決定できる。モノクローナル抗体を小分けし、−８０℃で保存できる。
ＧＩＴＲに対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの産生
抗体を、例えば、当分野で周知のような、組み換えＤＮＡ法および遺伝子導入法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマ中に産生し得る(Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、一部またはまたは完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを標準分子生物法(例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング)により得ることができ、ＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列に操作可能に結合されるように発現ベクターに導入できる。この状況において、用語“操作可能に結合される”は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳の制御のその意図される機能を発揮するようにベクターにライゲートされることを意味することを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合性であるように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入しても、両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入してもよい。抗体遺伝子を、標準方法(例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しないならば平滑末端ライゲーション)により発現ベクターに挿入する。ここに記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用して、それらを、既に所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をコードしている発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに操作可能に結合され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに操作可能に結合されるように、挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を製造できる。
これに加えてまたはこれとは別に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結するように、ベクターにクローン化し得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)であり得る。
例示的態様において、ヒト抗体重鎖および軽鎖からの次のシグナルペプチドを使用し得る：ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣ(配列番号３１５)；ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ(配列番号３２１)；ＭＥＦＧＬＮＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣ(配列番号３２７)；ＭＥＦＧＬＳＷＩＦＬＡＡＩＬＫＧＶＱＣ(配列番号３２９)；ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ(配列番号３３３)；ＭＤＭＲＶＬＡＱＬＬＧＬＬＬＬＣＦＰＧＡＲＣ(配列番号３２３)；ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ(配列番号３２５)；ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ(配列番号３１７)；ＭＲＶＬＡＱＬＬＧＬＬＬＬＣＦＰＧＡＲＣ(配列番号３１９)；およびＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ(配列番号３３１)。
抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖および軽鎖を、それらがクローン化されたハイブリドーマにおける各鎖に結合していた各シグナル配列と共に発現できる。それらがクローン化されたハイブリドーマにおいて存在する種々の抗ＧＩＴＲ抗体のシグナル配列を下に記載し、このシグナル配列を使用して、同じ抗体または他の抗体を発現できる：
２８Ｆ３ ＶＨシグナル配列：
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣ(配列番号３１５)
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴ(配列番号３１６)
２８Ｆ３ ＶＬシグナル配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ(配列番号３１７)
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴ(配列番号３１８)
１８Ｅ１０ ＶＨシグナル配列：
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣ(配列番号３１５)
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴ(配列番号３１６)
１８Ｈ１０ ＶＬシグナル配列：
ＭＤＭＲＶＬＡＱＬＬＧＬＬＬＬＣＦＰＧＡＲＣ(配列番号３１７)
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴ(配列番号３１８)
１９Ｄ３ ＶＨシグナル配列：
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣ(配列番号３１５)
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴ(配列番号３１６)
１９Ｄ３ ＶＬシグナル配列：
ＭＲＶＬＡＱＬＬＧＬＬＬＬＣＦＰＧＡＲＣ(配列番号３１９)
ＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴ(配列番号３２０)
３Ｃ３ ＶＨシグナル配列：
ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ(配列番号３２１)
ＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＣ(配列番号３２２)
３Ｃ３ ＶＬ１シグナル配列：
ＭＤＭＲＶＬＡＱＬＬＧＬＬＬＬＣＦＰＧＡＲＣ(配列番号３２３)
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴ(配列番号３２４)
３Ｃ３ ＶＬ２シグナル配列：
ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ(配列番号３２５)
ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＣＧＧＡ(配列番号３２６)
８Ａ６ ＶＨシグナル配列：
ＭＥＦＧＬＮＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣ(配列番号３２７)
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴ(配列番号３２８)
８Ａ６ ＶＬシグナル配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ(配列番号３１７)
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴ(配列番号３１８)
９Ｇ７ ＶＨシグナル配列：
ＭＥＦＧＬＳＷＩＦＬＡＡＩＬＫＧＶＱＣ(配列番号３２９)
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＴＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴ(配列番号３３０)
９Ｇ７ ＶＬ１およびＶＬ２シグナル配列：
ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ(配列番号３３１)
ＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＣＧＧＡ(配列番号３３２)
１４Ｅ３ ＶＨシグナル配列：
ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ(配列番号３３３)
ＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＣ(配列番号３３４)
１４Ｅ３ ＶＬシグナル配列：
ＭＤＭＲＶＬＡＱＬＬＧＬＬＬＬＣＦＰＧＡＲＣ(配列番号３２３)
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴ(配列番号３２４)
１９Ｈ８ ＶＨシグナル配列：
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣ(配列番号３１５)
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴ(配列番号３１６)
１９Ｈ８ ＶＬ１シグナル配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ(配列番号３１７)
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴ(配列番号３１８)
１９Ｈ８ ＶＬ２シグナル配列：
ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ(配列番号３２５)
ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＣＧＧＡ(配列番号３２６)
６Ｇ１０ ＶＨシグナル配列：
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣ(配列番号３１５)
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴ(配列番号３１６)
６Ｇ１０ ＶＬシグナル配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ(配列番号３１７)
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴ(配列番号３１８)
シグナル配列ＭＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡ(配列番号３６７)を、重鎖および軽鎖の発現に使用し得る。
表１１に提供するような重鎖および軽鎖またはその一部を、ここに提供するシグナル配列と結合し得る。例えば、配列番号１３、１５、１７または１８を含む、例えば、２８Ｆ３重鎖またはその可変領域を、ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣ(配列番号３１５)またはＭＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡ(配列番号３６７)を含む、またはこれからなるシグナルペプチドに結合または融合し得る。例えば、配列番号１４、１６または１９を含む、２８Ｆ３軽鎖またはその可変領域を、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ(配列番号３１７)またはＭＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡ(配列番号３６７)を含むまたはこれからなるシグナルペプチドに結合または融合し得る。
抗体鎖遺伝子に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を担持し得る。用語“制御配列”は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図する。このような制御配列は、例えば、Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載されている。制御配列の選択を含む発現ベクターの選択は、形質転換する宿主細胞、所望のタンパク質発現レベルなどのような因子により得ることは当業者に認識される。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ))およびポリオーマ由来プロモーターおよび／またはエンハンサーのような、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素を含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターのような非ウイルス制御配列を使用し得る。なおさらに、制御要素は、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の末端反復配列からの配列を含むＳＲαプロモーターシステムのような、異なる源からの配列からなる(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列(例えば、複製起点)および選択可能マーカー遺伝子のようなさらなる配列を担持し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする(例えば、全てAxel et al.の米国特許４,３９９,２１６号、４,６３４,６６５号および５,１７９,０１７号参照)。例えば、一般に選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートのような薬物への耐性を付与する。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(メトトレキサート選択／増幅と共にｄｈｆｒ−宿主細胞で使用)およびｎｅｏ遺伝子(Ｇ４１８選択のため)を含む。
軽鎖および重鎖発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準方法で宿主細胞にトランスフェクトする。種々の形態での用語“トランスフェクション”は、原核生物または真核宿主細胞に外来性ＤＮＡを導入するための一般に使用される広範な方法、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−ホスフェート沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図する。原核生物または真核宿主細胞のいずれかでここに記載する抗体を発現させることは理論的に可能であるが、真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が、このような真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核生物細胞よりも凝集させ、適切に折りたたまれかつ免疫額的に活性な抗体を分泌させる可能性が高いため、最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性抗体の高収率での産生に無効であることが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。
ここに記載する組み換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ細胞)(ｄｈｆｒ− ＣＨＯ細胞、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載、例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載のように、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と使用するために、他の好ましい発現システムは、ＷＯ８７／０４４６２号、ＷＯ８９／０１０３６号およびＥＰ３３８,８４１号に開示のＧＳ遺伝子発現システムである。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するとき、抗体を、宿主細胞を、宿主細胞において抗体を発現させるために十分な時間または、より好ましくは、宿主細胞が増殖している培養培地に抗体を分泌させるために十分な時間インキュベートすることにより産生する。抗体を、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収できる。
XII. アッセイ
ここに記載する抗体を、例えば、標準ＥＬＩＳＡにより、ＧＩＴＲへの結合について試験できる。簡潔にいうと、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１〜２μg／mlの精製ＧＩＴＲで被覆し、５％ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液で遮断する。抗体の希釈物(例えば、ＧＩＴＲ免疫化マウスからの血漿の希釈物)を各ウェルに添加し、１〜２時間、３７℃でインキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)にコンジュゲートした二次試薬(例えば、ヒト抗体について、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬)と１時間、３７℃でインキュベートする。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質(Moss Inc.、製品：ABTS-1000)で展開し、ＯＤ ４１５〜４９５で分光光度計で分析する。免疫化マウスからの血清を、次いで、ヒトＧＩＴＲを発現する細胞株に結合するが、ＧＩＴＲを発現しない対照細胞株に結合しないフローサイトメトリーによりさらにスクリーニングする。簡潔にいうと、抗ＧＩＴＲ抗体の結合を、ＧＩＴＲ発現ＣＨＯ細胞と抗ＧＩＴＲ抗体を１：２０希釈でインキュベートすることにより評価する。細胞を洗浄し、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂで結合を検出する。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して行う。好ましくは、最高力価を発生させるマウスを融合に使用する。
上記ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体を、それゆえに、ＧＩＴＲ免疫原と正の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングできる。好ましくは、高親和性でＧＩＴＲと結合する抗体を産生するハイブリドーマを、次いでサブクローン化し、さらに特徴付けし得る。親細胞の反応性を保持する(ＥＬＩＳＡによる)各ハイブリドーマからの１区ローンを、次いで細胞バンクの産生および抗体精製のために選択できる。
抗ＧＩＴＲ抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製用２リットルスピナーフラスコで増殖させ得る。上清を濾過し、濃縮し、その後プロテインＡ−セファロース(Pharmacia, Piscataway, N.J.)で親和性クロマトグラフィーし得る。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認し、純度を確定させ得る。緩衝液溶液をＰＢＳに交換してよく、濃度を１.４３透過係数を使用するＯＤ２８０で決定できる。モノクローナル抗体を小分けし、−８０℃で保存できる。
選択された抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体が独特のエピトープに結合することを確認するために、各抗体を、市販の試薬(Pierce, Rockford, IL)を使用してビオチニル化できる。ビオチニル化ＭＡｂ結合を、ストレプトアビジン標識プローブを使用して検出できる。非標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を使用する競合試験を、上記のようなＧＩＴＲ被覆ＥＬＩＳＡプレートを使用して実施できる。
精製抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用して実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを１μg／mlの抗ヒト免疫グロブリンで、一夜、４℃で被覆できる。１％ＢＳＡで遮断後、プレートを、１μg／ml以下の試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と、環境温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼとコンジュゲートしたプローブと反応させ得る。上記のようにプレートを展開し、分析し得る。
モノクローナル抗体のＧＩＴＲを発現する生存細胞への結合を試験するために、実施例に記載するように、フローサイトメトリーを使用できる。簡潔にいうと、膜結合ＧＩＴＲを発現する細胞株(標準増殖条件下で増殖)を種々の濃度のモノクローナル抗体と、０.１％ＢＳＡ含有ＰＢＳと、４℃で１時間インキュベートする。洗浄後、細胞をフルオレセイン標識抗ＩｇＧ抗体と、一次抗体染色と同じ条件下で反応させる。サンプルを、光散乱および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳｃａｎ装置で分析し、単一細胞上でゲーティングし、標識抗体の結合を決定する。蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを、フローサイトメトリーアッセイに加えてまたはその代わりに使用し得る。細胞を上に的確に記載したように染色し、蛍光顕微鏡で試験できる。この方法は、個々の細胞の可視化を可能とするが、抗原の密度により感度が下がり得る。
抗ＧＩＴＲ抗体を、さらに、ウェスタンブロッティングによりＧＩＴＲ抗原との反応性について試験できる。簡潔にいうと、ＧＩＴＲを発現する細胞からの細胞抽出物を製造しドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し得る。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、２０％マウス血清で遮断し、試験するモノクローナル抗体でプローブし得る。抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)で展開して、ＩｇＧ結合を検出できる。
種々の抗ＧＩＴＲ抗体の結合親和性、交差反応性および結合動態を分析する方法は、当分野で知られる標準アッセイ、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ ２０００ ＳＰＲ装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用するＢｉａｃｏｒｅＴＭ表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析を含む。
ある態様において、抗体は、ヒトＧＩＴＲの細胞外領域に特異的に結合する。抗体は、ＧＩＴＲの細胞外ドメイン内の特定のドメイン(例えば、機能的ドメイン)に特異的に結合し得る。特定の態様において、抗体は、ＧＩＴＲ上のＧＩＴＲ−Ｌが結合する位置に特異的に結合する。ある態様において、抗体は、ヒトＧＩＴＲの細胞外領域およびカニクイザルＧＩＴＲの細胞外領域に特異的に結合する。好ましくは、抗体は、高親和性でヒトＧＩＴＲと結合する。
XIII. イムノコンジュゲート、抗体誘導体および診断学
ここに記載する抗体を、サンプル試験およびインビボ造影を含む診断目的で使用でき、この目的のために、抗体(またはその結合フラグメント)を適切な検出可能試薬とコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを形成させ得る。診断目的で、適切な試薬は、全身造影のための放射性同位体およびサンプル試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適当な抗体タグを含む、検出可能標識である。
検出可能標識は、金コロイドのような金属ゾルを含む粒子標識、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳまたはＮ４タイプのペプチド性キレート剤と共に提示されるＩ１２５またはＴｃ９９のような同位体、蛍光マーカー、発光性マーカー、リン光マーカーを含む発色団などならびにある基質を検出可能マーカーに変換させる酵素標識およびポリメラーゼ鎖反応のような増幅後に明らかにされるポリヌクレオチドタグを含む、現在インビトロ診断学の分野で使用される種々のタイプのいずれでもよい。適当な酵素標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどを含む。例えば、標識は、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン(ＡＭＰＰＤ)、ジナトリウム３−(４−(メトキシスピロ{１,２−ジオキセタン−３,２’−(５’−クロロ)トリシクロ{３.３.１.１ ３,７}デカン}−４−イル)フェニルホスフェート(ＣＳＰＤ)のような１,２−ジオキセタン基質ならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ｓｔａｒ(登録商標)または当業者に周知の他の発光性基質、例えばテルビウム(III)およびユーロピウム(III)のような適当なランタニドのキレートの変換後の化学発光の存在または形成を測定することにより検出される、酵素アルカリホスファターゼであり得る。検出手段は、選択した標識により決定される。標識またはその反応産物の出現は、標識が粒子であり、適切なレベルで集積するならば、裸眼でまたは分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計などのような装置を使用して達成でき、全て標準的な慣例に従う。
好ましくは、コンジュゲーション法は、実質的に(またはほぼ)非免疫原性である、例えば、ペプチド(すなわちアミド)結合、スルフィド結合(立体障害)、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合およびエーテル結合である結合を生じる。これらの結合はほぼ非免疫原性であり、血清内で妥当な安定性を示す(例えばSenter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244；ＷＯ２００９／０５９２７８号；ＷＯ９５／１７８８６号参照)。
成分および抗体の生化学的性質によって、異なるコンジュゲーション戦略を用いることができる。成分が、５０〜５００アミノ酸の天然に存在するまたは組み換え物であるならば、当業者により容易に追従され得るタンパク質コンジュゲートの合成のための化学を記載する教則本における標準法がある(例えばHackenberger, C. P. R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074参照)。ある態様において、抗体または成分内のマレイミド基とシステイン残基の反応を使用する。例えばＦａｂまたは抗体のＦａｂ’フラグメントを使用するとき、これは特に適したカップリング化学である。あるいはある態様において、抗体または成分のＣ末端へのカップリングを行う。タンパク質、例えばＦａｂフラグメントのＣ末端修飾を、例えば記載のように実施し得る(Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371)。
一般に、部位特異的反応および共有カップリングは、天然アミノ酸の、存在する他の官能基の反応性と直交性である反応性を有するアミノ酸への変換を含む。例えば、稀な配列構成内の特異的システインを、アルデヒドに酵素変換できる(Frese, M. A. and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427参照)。ある酵素のある配列構成における天然アミノ酸との特異的酵素反応性を利用して、所望のアミノ酸修飾を得ることも可能である(例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136参照; そしてBordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403によりＣ−Ｎ結合のプロテアーゼ触媒形成が使用される)。
部位特異的反応および共有カップリングを、末端アミノ酸と適切な修飾試薬の選択的反応によっても達成できる。
Ｎ末端システインとベンゾニトリルの反応性(Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662参照)を使用して、部位特異的共有カップリングを達成できる。
ネイティブ・ケミカル・ライゲーションはまたＣ末端システイン残基を利用する(Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96)。
ＥＰ１０７４５６３号は、負荷電アミノ酸のストレッチ内のシステインと正荷電アミノ酸のストレッチに位置するシステインの速い反応に基づくコンジュゲーション法を記載する。
成分はまた合成ペプチドまたはペプチド模倣体でもあり得る。ポリペプチドを化学合成するとき、直交性化学反応性を有するアミノ酸を、このような合成中に取り込ませ得る(例えばde Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295参照)。多種多様な直交性官能基が問題となっており、合成ペプチドに導入できるため、このようなペプチドのリンカーへのコンジュゲーションは標準的手段である。
単標識ポリペプチドを得るために、１：１化学量論のコンジュゲートを、他のコンジュゲーション副産物からクロマトグラフィーにより分離し得る。この方法は、色素標識結合対メンバーおよび帯電リンカーの使用により容易になり得る。電荷および分子量の差を分離に使用できるため、この種の標識および高度に負荷電した結合対メンバーの使用により、モノコンジュゲートポリペプチドは非標識ポリペプチドおよび１を超えるリンカーを担持するポリペプチドから容易に分離される。蛍光色素は、標識一価結合剤のような非結合成分から複合体を精製するのに有用であり得る。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体に結合する成分は、結合成分、標識成分および生物学的活性成分からなる群から選択される。
ここに記載する抗体はまた、抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)のようなイムノコンジュゲートを形成するために治療剤ともコンジュゲートさせ得る。適当な治療剤は代謝拮抗剤、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ介入物、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核排出阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはII阻害剤、ヒートショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および有糸分裂阻害剤を含む。ＡＤＣにおいて、抗体と治療剤は、好ましくはペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーのような開裂可能リンカーを経てコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ(配列番号２１９)、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕのようなペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許７,０８７,６００号、６,９８９,４５２；および７,１２９,２６１号、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０号、ＷＯ０７／０３８６５８号、ＷＯ０７／０５１０８１号、ＷＯ０７／０５９４０４号、ＷＯ０８／０８３３１２号；およびＷＯ０８／１０３６９３号、米国特許公開２００６００２４３１７号、２００６０００４０８１号；および２００６０２４７２９５号に記載のように製造でき、これらの開示を引用により本明細書に包含させる。
抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、ここに記載されているものは、ヒトＧＩＴＲのようなＧＩＴＲ、例えば、組織または組織サンプル中のヒトＧＩＴＲの検出にも使用し得る。抗体を、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーで使用し得る。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を細胞、例えば、組織中の細胞と、特異的結合が生じるのに適切な時間接触させ、次いで、抗ＧＩＴＲ抗体を検出する試薬、例えば、抗体を添加する。アッセイの例を実施例に提供する。抗ＧＩＴＲ抗体は完全ヒト抗体であってよくまたはヒト可変領域とマウス定常領域またはその一部を有する抗体のようなキメラ抗体であってもよい。サンプル(細胞または組織サンプル)中のＧＩＴＲ、例えば、ヒトＧＩＴＲを検出する方法の例は、(ｉ)サンプルと抗ＧＩＴＲ抗体を、抗ＧＩＴＲ抗体のサンプル中のＧＩＴＲへの特異的結合をさせるのに十分な時間接触させ、そして(２)サンプルと、抗ＧＩＴＲ抗体に、例えば、抗ＧＩＴＲ抗体のＦｃ領域に特異的に結合する検出試薬、例えば、抗体を接触させ、それにより、抗ＧＩＴＲ抗体によるＧＩＴＲ結合を検出することを含む。洗浄工程は、抗体および／または検出試薬とのインキュベーションの後に含まれ得る。これらの方法において使用する抗ＧＩＴＲ抗体は、別の検出剤を使用できるため、標識または検出剤と結合していなくてよい。
例えば、単剤療法または組み合わせ治療としての、抗ＧＩＴＲ抗体の他の使用は、本明細書の他の箇所、例えば、組み合わせ処置に関する箇所に提供される。
XIV. 二重特異性分子
ここに記載する抗体を、二重特異性分子の形成のために使用し得る。抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を、他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド)に誘導体化または結合して、少なくとも２の異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生し得る。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体を、ここに記載するタンパク質(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３に対する抗体)のような、組み合わせ処置の標的として恐らく使用可能である何らかのタンパク質に特異的に結合する抗体またはｓｃＦｖと結合し得る。ここに記載する抗体を、実際、２を超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異的分子を産生するために１を超える他の機能的分子と誘導体化または結合でき、このような多特異的分子も、ここで使用する用語“二重特異性分子”に包含されることを意図する。ここに記載する二重特異性分子を産生するために、ここに記載する抗体を、二重特異性分子が生じるように、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣体のような１以上の他の結合分子と機能的に結合させ得る(例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合またはその他による)。
よって、ここに提供されるのは、少なくとも１つのＧＩＴＲに対する第一結合特異性および第二標的エピトープに対する第二結合特異性を含む二重特異性分子である。二重特異性分子が多特異的であるここに記載する態様において、分子は、さらに、第三結合特異性を含み得る。
ある態様において、ここに記載する二重特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)を含む、少なくとも１抗体または抗体そのフラグメントを含む。抗体はまた軽鎖または重鎖二量体またはＦｖまたは一本鎖構築物のようなその何らかの最小フラグメントであってよく、Ladner et al.の米国特許４,９４６,７７８号に記載のとおりであり、その内容を、引用により明示的に本明細書に包含させる。
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、ここに記載する二重特異性分子で用い得る他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
ここに記載する二重特異性分子は、構成物結合特異性を当分野で知られる方法を使用してコンジュゲートすることにより製造できる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を別々に産生し、互いにコンジュゲートできる。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、多様なカップリングまたは架橋結合剤を共有コンジュゲーションのために使用できる。架橋結合剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)、ｏ−フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)を含む(例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648参照)。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375に記載のものを含む。好ましいコンジュゲート剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両者ともPierce Chemical Co.(Rockford, IL)から入手可能である。
結合特異性が抗体であるとき、それらは、２重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介してコンジュゲートされ得る。特に好ましい態様において、ヒンジ領域を、コンジュゲーション前に、奇数の、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾する。
あるいは、両結合特異性を同じベクターにおいてコードさせ、同じ宿主細胞で発現および集合させ得る。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、ｍＡｂ×(ｓｃＦｖ)２、Ｆａｂ×Ｆ(ａｂ’)２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき、特に有用である。二重特異性抗体は、各重鎖のＣ末端にｓｃＦｖを含む抗体を含み得る。ここに記載する二重特異性分子は、１個の一本鎖抗体と結合決定基または２結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子を含む一本鎖分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２個の一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を製造する方法は、例えば米国特許５,２６０,２０３号、米国特許５,４５５,０３０号、米国特許４,８８１,１７５号、米国特許５,１３２,４０５号、米国特許５,０９１,５１３号、米国特許５,４７６,７８６号、米国特許５,０１３,６５３号、米国特許５,２５８,４９８号および米国特許５,４８２,８５８号に記載されている。
二重特異性分子のその特異的標的への結合は、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)またはウェスタンブロットアッセイのような、当分野で認識されている方法を使用して確認できる。これらのアッセイの各々は、一般に目的の複合体に特異的な標識試薬(例えば、抗体)を用いることにより、特に興味深いタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
XV. 組成物
さらに提供されるのは、薬学的に許容される担体と製剤される、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の一つもしくは組み合わせまたは他の標的に対する抗体との組み合わせまたはそれらの抗原結合部分を含む、組成物、例えば、医薬組成物である。このような組成物は、抗体またはイムノコンジュゲートまたはここに記載する二重特異性分子の１個または(例えば、２以上の異なる)組み合わせを含み得る。例えば、ここに記載する医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するまたは相補的活性を有する抗体(またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性)の組み合わせを含み得る。
ある態様において、組成物は、抗ＧＩＴＲ抗体を少なくとも１mg／ml、５mg／ml、１０mg／ml、５０mg／ml、１００mg／ml、１５０mg／ml、２００mg／ml、１〜３００mg／mlまたは１００〜３００mg／mlの濃度で含む。
ここに記載する医薬組成物を、組み合わせ治療で、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、組み合わせ治療は、少なくとも１個の他の抗癌剤および／またはＴ細胞刺激(例えば、活性化)剤と組み合わせた、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を含み得る。組み合わせ治療で使用できる治療剤の例は、ここに記載する抗体の使用の部分に、極めて詳細に記載する。
ある態様において、ここに開示する治療組成物は、癌の処置に使用される他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤は、例えば、化学療法剤、小分子剤またはある癌に対する免疫応答を刺激する抗体を含み得る。ある場合、治療組成物は、例えば、１以上の抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗ＯＸ４０(ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる)抗体、抗ＣＤ１３７抗体または抗ＬＡＧ−３抗体を含む。
ここで使用する“薬学的に許容される担体”は、生理学的に適合性である任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含み得る。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与(例えば、注射または点滴による)に適する。投与経路によって、活性化合物、すなわち、抗体、イムノコンジュゲートまたは二重特異性分子を、化合物を不活性化し得る酸および他の天然条件の作用から化合物を保護する物質で被覆し得る。
ここに記載する医薬化合物は、１以上の薬学的に許容される塩を含み得る。“薬学的に許容される塩”は、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、何らかの望ましくない毒性学的効果を付与しない塩をいう(例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19参照)。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含み得る。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などのような無毒無機酸ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような無毒有機酸由来のものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのようなアルカリ土類金属ならびにＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのような無毒有機アミン由来のものを含む。
ここに記載する医薬組成物はまた薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、(１)アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水可溶性抗酸化剤；(２)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどのような油可溶性抗酸化剤；および(３)クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート剤を含む。
ここに記載する医薬組成物において使用し得る適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)および適当なこれらの混合物、オリーブ油のような植物油およびオレイン酸エチルのような注射可能有機エステルを含む。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散の場合は必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持され得る。
これらの組成物はまた防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントも含み得る。微生物の存在の予防は、上記滅菌法および種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含の両者により確実にし得る。組成物に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を包含させることも望ましいことがある。さらに、注射可能医薬形態の持続吸収を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤の包含により達成し得る。
薬学的に許容される担体は、無菌水溶液または分散および無菌注射可能溶液または分散の即時の調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野で知られる。何らかの慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、そのここに記載する医薬組成物への使用が意図される。医薬組成物は防腐剤を含んでよくまたは防腐剤を欠いてよい。補足の活性化合物を組成物に包含させてよい。
治療組成物は、一般に無菌であり、製造および保存の条件下で安定でなければならない。組成物を溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の高薬物濃度に適する秩序構造に製剤できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)を含む、溶媒または分散媒体および適当なこれらの混合物であり得る。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散の場合は必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコールまたは塩化ナトリウムを包含させることが好ましい。注射可能組成物の持続吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを包含させることにより達成し得る。
無菌注射可能溶液は、必要に応じて、上に挙げた成分の一つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒に必要な量の活性化合物を取り込ませ、続いて滅菌微量濾過することにより製造できる。一般に、分散は、塩基性分散媒体およびここに挙げたものからの必要な他の成分を含む無菌媒体に活性化合物を取り込ませることにより製造する。無菌注射可能溶液の製造のための無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、活性成分に加えて先に無菌濾過したその溶液からの何らかのさらなる望ましい成分の粉末を生じる真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。
単一投与形態を産生するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、処置する対象および特定の投与方法により変わる。単一投与形態を産生するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、一般に治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００％中、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分の約０.０１パーセント〜約９９パーセント、活性成分の好ましくは約０.１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
投与レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療応答)を提供するように調節される。例えば、単一ボーラスを投与してよく、数個の分割した用量を長時間で投与してよくまたは治療状況の切迫により示されるように、用量を比例的に低減または増加させてよい。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経腸組成物を投与単位形態に製剤するのが特に遊離である。ここで使用する投与単位形態は、処置する対象に対する投与量単位として適する物理的に分かれた単位であり、各単位は、必要な医薬担体と共に望ましい治療効果を生ずるように計算された予定した含量の活性化合物を含む。ここに記載する投与単位形態の仕様は、(ａ)活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療効果および(ｂ)個体における感受性の処置に対してこのような活性化合物を混合する分野で固有の制限により支持され、直接依存する。
抗体の投与について、投与量は、約０.０００１〜１００mg／kg、より一般には０.０１〜５または１０mg／宿主体重kgの範囲である。例えば投与量は、０.３mg／kg体重、１mg／kg体重、３mg／kg体重、５mg／kg体重または１０mg／kg体重または１〜１０mg／kgの範囲内である。処置レジメの例は、週に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、月に１回、３ヶ月毎に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体のための好ましい投与レジメンは、静脈内投与による１mg／kg体重または３mg／kg体重を含み、抗体は、次の投薬スケジュールの一つを使用して与えられる：(ｉ)４週間毎に６回投与、続いて３ヶ月毎；(ii)３週間毎；(iii)１回３mg／kg体重、続く１mg／kg体重３週間毎。
抗ＧＩＴＲ抗体はフラット用量で投与し得る(フラット用量レジメン)。
ある方法において、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与する各抗体の投与量は、示した範囲内に入る。抗体は、通常複数回投与する。１用量間の間隔は、例えば、週、月、３ヶ月毎または年であり得る。間隔はまた患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルの測定により示されるように、不規則でもよい。ある方法において、投与量を、約１〜１０００μg／ml、ある方法において約２５〜３００μg／mlの血漿抗体濃度が達成されるように調節する。
抗ＧＩＴＲ抗体を他の抗体と、該他の抗体の投与レジメンで投与し得る。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体を、ニボルマブ(オプジーボ)のような抗ＰＤ−１抗体と、疾患進行または許容されない毒性が生じるまで、２週間毎に、６０分にわたる静脈内点滴として投与し得る。抗ＧＩＴＲ抗体を、ペンブロリズマブ(KEYTRUDA)と、疾患進行または許容されない毒性が生じるまで３週間毎に、３０分にわたる静脈内点滴として投与し得る。
抗体を持続放出製剤として投与でき、この場合必要な投与頻度が少ない必要な投与頻度が少ない。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期により変わる。一般に、ヒト抗体が最長半減期を示し、続いてヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体である。投与量および投与頻度は、処置が予防的か治療的かで異なり得る。予防適用の場合、相対的に低投与量を、比較的低頻度の間隔で長期間にわたり投与する。一生涯処置を受け続ける患者がいる。治療適用において、比較的高投与量を、比較的短い間隔が、疾患の進行が低減または停止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的なまたは完全な改善を示すまで必要であることがある。その後、患者に予防レジメで投与してよい。
ここに記載する医薬組成物おける活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性となることなく、特定の患者、組成物および投与方法に対して望ましい治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変わり得る。選択される投与量レベルは、用いるここに記載する特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および病歴および医薬分野で周知の同様の因子を含む多様な薬物動態因子による。
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の“治療有効投与量”は、好ましくは疾患症状の重症度の軽減、疾患無症状期間の頻度および期間の増加または疾患苦痛による機能障害または身体障害の予防をもたらす。癌の状況において、治療有効用量は、好ましくは生存延長および／または癌と関係する身体症状のさらなる増悪の予防をもたらす。癌の症状は当分野で周知であり、例えば、異常な特色の黒子、非対称、境界、色および／または直径を含む黒子の見掛けの変化、新しく着色された皮膚領域、異常な黒子、爪の下の領域の黒ずみ、乳房腫瘤、乳頭変化、乳房嚢胞、乳房痛、死、体重減少、脱力感、過剰な疲労、摂食困難、食欲減退、慢性咳嗽、息切れ悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満感、鼓腸、腹水、膣出血、便秘、腹部膨満、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、疼痛)、疼痛、吐血、大汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋肉攣縮、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などを含む。
治療有効用量は、癌の発症を予防または遅延させ得て、例えば、疾患の早期または予備的徴候が存在するとき望ましい。化学(ＧＩＴＲレベルの測定を含む)、血液学、血清学および放射線学を含む臨床検査を癌の診断に利用する。よって、上記のいずれかをモニターするあらゆる臨床的または生化学アッセイを使用して、特定の処置が癌の処置のための治療有効用量であるか否かを決定し得る。当業者は、対象の体格、対象の症状の重症度および選択された特定の組成物または投与経路のような因子に基づき、このような量を決定できる。
ここに記載する組成物を、１以上の多様な当分野で知られる方法を使用して、１以上の投与経路により投与できる。当業者には認識されるように、投与の経路および／または方法は、望ましい結果により変わる。ここに記載する抗体のための好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語“非経腸投与”は、通常、注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含むが、これらに限定されない。
あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的のような非経腸ではない経路で投与できる。
活性化合物を、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のような、化合物を急速な放出から保護する担体と製剤できる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤の製造のための多くの方法が特許所得されているかまたは一般に当業者に知られる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
治療組成物を、当分野で知られる医療機器を用いて投与できる。例えば、好ましい態様において、ここに記載する治療組成物を、米国特許５,３９９,１６３号、５,３８３,８５１号、５,３１２,３３５号、５,０６４,４１３号、４,９４１,８８０号、４,７９０,８２４；または４,５９６,５５６号に開示のデバイスのような無針皮下注入デバイスを使用して投与できる。ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体と使用する周知のインプラントおよびモジュールの例は、コントロールされた速度で薬物を分配するための埋め込み型微量注入ポンプを開示する米国特許４,４８７,６０３号、皮膚を通して薬物を投与する治療デバイスを開示する米国特許４,４８６,１９４号、正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許４,４４７,２３３号、連続的薬物送達のための変流量埋め込み型注入装置を開示する米国特許４,４４７,２２４号、多チャンバー区画を有する浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許４,４３９,１９６号および浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許４,４７５,１９６号を含む。これらの特許は、引用により本明細書に包含させる。多くの他のこのようなインプラント、送達系およびモジュールが当業者に周知である。
ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、インビボでの適切な分布を確実にするために製剤できる。例えば、血液脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高親水性化合物を排除する。ここに記載する治療化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために(望むならば、例えば、脳癌のために)、例えば、リポソーム内に製剤できる。リポソームを製造する方法について、例えば、米国特許４,５２２,８１１号、５,３７４,５４８号および５,３９９,３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送され、そうして標的化薬物送達を増強する１以上の成分を含み得る(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。ターゲティング成分の例は、葉酸またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許５,４１６,０１６号参照)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；ｐ１２０(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)を含み、またK. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。
XVI. 使用および方法
ここに記載する抗体、抗体組成物および方法は、例えば、活性化ＧＩＴＲシグナル伝達による免疫応答の増強またはＧＩＴＲの検出を含む、多数のインビトロおよびインビボ有用性を有する。好ましい態様において、ここに記載する抗体はヒト抗体である。例えば、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、培養細胞に、インビトロまたはエクスビボでまたはヒト対象に、例えば、インビボで投与して、多様な疾患における免疫を増強し得る。よって、ここに提供されるのは、対象における免疫応答が修飾されるように、対象にここに記載する抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における免疫応答を修飾する方法である。好ましくは、応答は増強され、刺激されまたは上方制御される。
好ましい対象は、免疫応答の増強が望ましいヒト患者である。方法は、免疫応答(例えば、Ｔ細胞介在免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)の増強により処置できる障害を有するヒト患者の処置に特に適する。特定の態様において、方法は、インビボでの癌の処置に特に適する。免疫の抗原特異的増強を達成するために、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、目的の抗原と共に投与してよくまたは抗体は処置する対象に既に存在しているかもしれない(例えば、腫瘍担持またはウイルス担持対象)。ＧＩＴＲに対する抗体を他の薬剤と投与するとき、２剤を別々に投与しても同時に投与してもよい。
サンプルおよび対照サンプルを、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合するモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、抗体またはその一部とヒトＧＩＴＲの間の複合体の形成が可能である条件下、接触させることを含む、サンプル中のヒトＧＩＴＲ抗原の存在を検出するまたはヒトＧＩＴＲ抗原の量を測定する方法も提供される。複合体の形成を次いで検出し、ここで、対照サンプルと比較したサンプルとの複合体形成の差異がサンプル中のヒトＧＩＴＲ抗原の存在の指標である。さらに、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を使用して、免疫親和性精製によりヒトＧＩＴＲを精製できる。
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体がＴ細胞応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するまたは共刺激する能力を考慮して、ここに提供されるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激、増強または上方制御するためにここに記載する抗体を使用するインビトロおよびインビボ方法である。ある態様において、ＣＤ３刺激も提供され(例えば、膜ＣＤ３を発現する細胞との共インキュベーションによる)、この刺激は、抗ＧＩＴＲ抗体での刺激と同時、前または後に提供され得る。例えば、ここに提供されるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、該Ｔ細胞とここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体および所望により抗ＣＤ３抗体を、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように接触させることを含む、方法である。抗原特異的Ｔ細胞応答の任意の適当な指標を使用して、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定できる。このような適当な指標の非限定的例は、抗体存在下のＴ細胞増殖増加および／または抗体存在下のサイトカイン産生増加である。好ましい態様において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン−２および／またはインターフェロン−γ産生が刺激される。
抗ＧＩＴＲ抗体で増強または共刺激され得るＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞はＴｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞、Ｔヘルパー(Ｔｈ)細胞およびＴ細胞毒性(Ｔｃ)細胞であり得る。
対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)が刺激されるように対象にここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を投与することを含む、対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)を刺激する方法がさらに包含される。好ましい態様において、対象は腫瘍担持対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。腫瘍は固形腫瘍でも液性腫瘍、例えば、造血器腫瘍でもよい。ある態様において、腫瘍は免疫原性腫瘍である。ある態様において、腫瘍は非免疫原性である。ある態様において、腫瘍はＰＤ−Ｌ１陽性である。ある態様において、腫瘍はＰＤ−Ｌ１陰性である。対象はまたウイルス担持対象であってもよく、はまたウイルス担持対象であってもよく、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
さらに提供されるのは、対象における腫瘍の増殖が阻害されるように、対象にここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法である。また提供されるのは、対象においてウイルス感染が処置されるように、対象にここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を投与することを含む、対象におけるウイルス感染を処置する方法である。
またここに包含されるのは、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の枯渇を刺激するＦｃを含む、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の治療有効量を対象に投与することを含む、腫瘍、例えば、癌性腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境からＴｒｅｇ細胞を枯渇させる方法である。Ｆｃは、例えば、結合のようなエフェクター機能または増強されたエフェクター機能を有するまたは１以上の活性化Ｆｃ受容体への増強された結合を有するＦｃであり得る。好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇は、腫瘍微小環境におけるＴｅｆｆの顕著な枯渇または阻害なしにおよび腫瘍外微小環境、例えば、末梢におけるＴｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞の顕著な枯渇または阻害なしに生じる。ある態様において、対象は、例えば、腫瘍微小環境においてＴｅｆｆ細胞上より高いレベルのＧＩＴＲをＴｒｅｇ細胞に有する。
ある態様において、増強されたアゴニズム、例えば、阻害性ＦｃＲIIｂに結合するまたは増強された結合を有するＦｃを有する抗ＧＩＴＲ抗体で対象を処置する。ある処置は、１以上の活性化ＦｃＲに結合しないまたは低減された結合を有するＦｃを有する抗ＧＩＴＲ抗体を用いて行う。抗ＧＩＴＲ抗体は、腫瘍におけるＴｒｅｇおよび／または腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)におけるＴｒｅｇを枯渇させ得る。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、対象に補助的療法として与える。癌を有する対象の抗ＧＩＴＲ抗体での処置は、現在の標準治療に比して、生存延長、例えば、長期的な強い応答、少なくとも３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、１０年またはそれ以上の長期生存または少なくとも３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年または１０年またはそれ以上の無再発生存に至り得る。ある態様において、癌を有する対象の抗ＧＩＴＲ抗体での処置は、例えば、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年または１０年またはそれ以上、癌の再発を予防するかまたは癌の再発を遅延させる。抗ＧＩＴＲ処置を第一選択、第二選択または第三選択処置として使用できる。
好ましい態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体は、顕著に毒性ではない。例えば、ＧＩＴＲ抗体は、例えば、臨床試験で測定して、ヒトの臓器、例えば、肝臓、腎臓、脳、肺および心臓の１以上に顕著に毒性ではない。ある態様において、ＧＩＴＲ抗体は、望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫または炎症を顕著に誘発しない。
ある態様において、抗ＧＩＴＲアゴニスト(例えば、抗ＧＩＴＲ抗体)での対象の処置は、その後対象の免疫系が対象自身を攻撃する(例えば、自己免疫性応答)程度または、例えば、アナフィラキシーを生じる程度まで免疫系の過剰刺激をしない。それゆえに、抗ＧＩＴＲ抗体は、好ましくはアナフィラキシーを生じない。
ある態様において、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、２８Ｆ３のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体での対象の処置は、顕著な炎症性反応、例えば、免疫介在間質性肺炎、免疫介在大腸炎、免疫介在肝炎、免疫介在腎炎または腎臓機能不全、免疫介在下垂体炎、免疫介在甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症または他の免疫介在有害反応を生じない。ある態様において、抗ＧＩＴＲ２８Ｆ３のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体は、他の抗ＧＩＴＲ抗体より少ない炎症性反応、例えば、免疫介在間質性肺炎、免疫介在大腸炎、免疫介在肝炎、免疫介在腎炎または腎臓機能不全、免疫介在下垂体炎、免疫介在甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症、アナフィラキシーまたは他の免疫介在有害反応を生じる。他の免疫介在有害反応は、心臓障害、例えば、心室性不整脈；眼障害、例えば、虹彩毛様体炎；注入に伴う反応；アミラーゼ上昇、リパーゼ上昇；神経系障害、例えば、めまい、末梢および感覚運動性ニューロパチー；皮膚および皮下組織障害、例えば、発疹、掻痒、剥脱性皮膚炎、多形性紅斑、白斑症または乾癬；呼吸器、胸郭および縦隔障害、例えば、咳嗽；疲労；悪心；食欲減退；便秘；関節痛；および下痢を含む。
ある態様において、ＧＩＴＲ抗体は、免疫系を刺激する化合物(例えば、癌免疫療法剤)、例えば、ここに記載する化合物またはここに記載する標的を調節する化合物のような他の癌治療と組み合わせて相乗的抗腫瘍効果を提供する。
これらおよび他のここに記載する方法を、下にさらに詳述する。
癌
抗ＧＩＴＲ抗体によるＧＩＴＲの活性化は、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強できる。ここに提供されるのは、対象が処置されるように、例えば、癌性腫瘍の増殖が阻止または低減されるようにおよび／または腫瘍が退縮するようにおよび／または生存延長が達成されるように、対象にここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法である。抗ＧＩＴＲ抗体を、癌性腫瘍の増殖を阻害するために単独で使用し得る。あるいは、抗ＧＩＴＲ抗体を、下記のように、他の薬剤、例えば、他の免疫原性剤、標準癌処置または他の抗体と組み合わせて使用できる。
よって、ここに提供されるのは、対象にここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、２８Ｆ３.ＩｇＧ１または２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１またはその抗原結合部分の治療有効量を投与することを含む、例えば、腫瘍細胞の増殖の阻害による、対象における癌を処置する方法である。抗体はヒト抗ＧＩＴＲ抗体であり得る(例えばここに記載するヒト抗ヒトＧＩＴＲ抗体のいずれか)。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、２８Ｆ３または他のここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の配列を含むキメラまたはヒト化抗ＧＩＴＲ抗体であり得る。
本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る癌は、一般に免疫療法に応答性である癌および一般に免疫療法に応答性ではない癌を含む。癌は、固形腫瘍または血液悪性腫瘍(液性腫瘍)を伴う癌であり得る。処置のための癌の非限定的例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、扁平上皮非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、消化器癌、腎臓癌(例えば明細胞癌)、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(例えば、腎臓細胞癌(ＲＣＣ))、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、神経膠芽腫(多形神経膠芽腫)、頸部癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌および頭頸部癌(または癌)、胃癌、胚細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫(例えば、転移悪性黒色腫、例えば、皮膚または眼内悪性黒色腫)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門癌、精巣癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍(ＣＮＳ)、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄腫瘍、脳癌、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境的に誘発される癌、ウイルス関連癌またはウイルス起源の癌(例えば、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ関連または由来腫瘍))および２つの主要血液細胞系譜、すなわち、骨髄細胞株(顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する)またはリンパ系細胞株(Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する)のいずれか由来の血液系腫瘍、例えば、全てのタイプの白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病、例えば、急性白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、未分化ＡＭＬ(Ｍ０)、骨髄芽球性白血病(Ｍ１)、骨髄芽球性白血病(Ｍ２；細胞成熟を伴う)、前骨髄球性白血病(Ｍ３またはＭ３バリアント[Ｍ３Ｖ])、骨髄単球性白血病(Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４バリアント[Ｍ４Ｅ])、単球白血病(Ｍ５)、赤白血病(Ｍ６)、巨核芽球性白血病(Ｍ７)、孤発性顆粒球性肉腫および緑色腫；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、Ｂ細胞血液学的悪性腫瘍、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫、未分化(例えば、Ｋｉ １＋)大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性；およびリンパ腫／白血病(Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ性増殖性障害、新生組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫(ＬＢＬ)、リンパ系造血性腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性組織球性リンパ腫(ＤＨＬ)、免疫芽細胞大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫(ＣＴＬＣ)(菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる)およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫(ＬＰＬ)；骨髄腫、例えば、ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、くすぶり型骨髄腫(無痛性骨髄腫とも呼ばれる)、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞リンパ腫；線維肉腫および横紋筋肉腫を含む骨髄系造血性腫瘍、間葉性起源の腫瘍；精上皮腫、奇形癌腫、星状細胞腫、シュワン腫を含む中枢および末梢神経の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間葉性起源の腫瘍；および黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌腫、リンパ系造血性腫瘍、小細胞および大脳様細胞型のＴ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病(Ｔ−ＰＬＬ)を含むが、これらに限定されない、例えばＴ細胞およびＢ細胞腫瘍を含む他の腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒リンパ球性白血病(ＬＧＬ)；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫(多形性および免疫芽細胞サブタイプ)；血管中心性(鼻)Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌；急性骨髄リンパ腫ならびに該癌のあらゆる組み合わせを含む。ここに記載する方法を使用して、転移性癌、切除不能および／または難治性癌(例えば、先の、例えば、遮断ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１抗体での免疫療法に難治性の癌)および再発性癌も処置し得る。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ Ａｂを、先の処置、例えば、癌免疫療法剤での先の処置に対して不適切な応答を示す癌を有する患者または難治性または耐性である、内因性に難治性または耐性(例えば、ＰＤ−１経路アンタゴニストに難治性)または耐性もしくは難治性状態が後天的である癌を有する患者に投与する。例えば、第一処置に応答しないもしくは十分に応答しないまたは処置、例えば、抗ＰＤ−１処置後疾患進行が見られる対象を、抗ＧＩＴＲ抗体単独または他の治療との組合せで(例えば、抗ＰＤ−１処置と共に)投与することにより処置し得る。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、癌免疫療法剤、例えば、ＰＤ−１経路アンタゴニストを先に受けて((すなわち、処置されて)いない患者に投与する。
抗ＧＩＴＲ抗体を、標準治療処置とともに投与し得る。抗ＧＩＴＲ抗体を、維持療法、例えば、腫瘍の発生または再発を予防することを意図する治療として投与し得る。
抗ＧＩＴＲ抗体を他の処置、例えば、放射線、手術または化学療法とともに投与し得る。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体補助的療法を、微小転移が存在し得るリスクがあるときおよび／または再発のリスクを減らすために、投与し得る。
抗ＧＩＴＲ抗体は単剤療法としてまたは唯一の免疫刺激療法として投与できる。ＧＩＴＲに対する抗体、例えば、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体はまた、免疫原性剤、例えば、癌性細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞とも組み合わせ得る(He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドのような黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトした腫瘍細胞を含む(下にさらに記載)。
ヒトにおいて、黒色腫のようないくつかの腫瘍が免疫原性であることが示されている。ＧＩＴＲ活性化によりＴ細胞活性化の閾値を低下させることにより、宿主における腫瘍応答は活性化され、非免疫原性腫瘍または限定的免疫原性を有する腫瘍の処置を可能とする。
抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、ワクチン接種プロトコールと組み合わせ得る。腫瘍に対するワクチン接種についての多くの実験的戦略が考案されている(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; see also Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition参照)。これらの戦略の一つにおいて、ワクチンを自己または同種腫瘍細胞を使用して製造する。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入されたとき、最も有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種に対する抗原提示の強力なアクティベーターであることが示されている(Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43)。
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の特定に到っている(Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7)。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍および腫瘍が由来する細胞において発現される分化抗原、例えばメラニン形成細胞抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示され得る。ＧＩＴＲ活性化を、腫瘍において発現される組み換えタンパク質および／またはペプチドのコレクションと、これらのタンパク質に対する免疫応答をを産生するために、組み合わせて使用できる。これらのタンパク質は、通常免疫系に自己抗原として見られ、それゆえにそれらに対して認容性である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒト癌の８５％超および限られた数の体性組織にのみ発現するタンパク質テロメラーゼを含み得る(Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013)。腫瘍抗原はまたタンパク質配列を変えるか、２つの無関係の配列の間の融合タンパク質(すなわち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ)を産生するために体細胞性変異の癌細胞において発現される“ネオ抗原”またはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプでもあり得る。
他の腫瘍ワクチンは、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)のようなヒト癌と関係付けられているウイルスからのタンパク質を含み得る。ＧＩＴＲ活性化と組み合わせて使用できる他の形態の腫瘍特異的抗原は、腫瘍組織自体から単離された精製ヒートショックタンパク質(ＨＳＰ)である。これらのヒートショックタンパク質は、腫瘍細胞からのタンパク質のフラグメントを含み、これらのＨＳＰは、抗原提示細胞への送達で、腫瘍免疫を誘発が高度に効率的である(Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120)。
樹状細胞(ＤＣ)は、抗原特異的応答の誘発に使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣはエクスビボで産生され、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を搭載し得る(Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332)。ＤＣはまたこれらの腫瘍抗原を発現するように同様に遺伝学的手段によっても形質導入され得る。ＤＣはまた免疫化の目的で腫瘍細胞に直接融合もされている(Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336)。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化を効率的にＧＩＴＲ活性化と組み合わせて、より強力な抗腫瘍応答を活性化できる。
ＧＩＴＲ活性化を標準癌処置(例えば、手術、放射線および化学療法)とも組み合わせ得る。ＧＩＴＲ活性化を、化学療法レジメと効率的に組み合わせ得る。これらの場合、これらの場合、投与する化学療法剤の量を減らすことが可能であり得る(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組み合わせの例は、黒色腫の処置のためのダカルバジンと組み合わせた抗ＧＩＴＲ抗体である。このような組み合わせの他の例は、黒色腫の処置のためにインターロイキン−２(ＩＬ−２)と組み合わせた抗ＧＩＴＲ抗体である。ＧＩＴＲ活性化と化学療法の組み合わせ使用の後ろにある科学的論拠は、大部分の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベル増加をもたらすはずであるということである。細胞死によりＧＩＴＲ活性化と相乗作用を生じ得る他の組み合わせ治療は、放射線、手術およびホルモン欠乏である。これらのプロトコールの各々は、宿主に腫瘍抗原の供給源を産生する。血管形成阻害剤もＧＩＴＲ活性化と組み合わせ得る。血管形成阻害は腫瘍細胞死に至り、これが腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給し得る。
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体はまたＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞を標的とさせる二重特異性抗体と組み合わせても使用できる(例えば、米国特許５,９２２,８４５号および５,８３７,２４３号参照)。二重特異性抗体を使用して、２つの別々の抗原を標的とできる。例えば抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原(例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ)二重特異性抗体が、マクロファージを腫瘍部位を標的とさせるように使用されている。このターゲティングは、より効率的に腫瘍特異的応答を活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームは、ＧＩＴＲの活性化により増強される。あるいは、抗原を、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体の使用により、直接ＤＣに送達させ得る。
腫瘍は、多種多様な機構により宿主免疫監視を逃れる。これらの機構の多くは、腫瘍により発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化により克服し得る。これらは、とりわけＴＧＦ−β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの各々に対する抗体を抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用して、免疫抑制因子の効果を相殺し、宿主による腫瘍免疫応答を支持できる。
宿主免疫応答性を活性化する他の抗体を、抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性と効率的に置き換わることができ(Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478)、抗ＧＩＴＲ抗体とともに使用できる。ＣＴＬＡ−４(例えば、米国特許５,８１１,０９７号)、ＯＸ−４０(Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169)、４−１ＢＢ(Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997))およびＩＣＯＳ(Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)のようなＴ細胞共刺激分子に対する活性化抗体も、Ｔ細胞活性化レベルを増加させるために提供できる。ＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤も、抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用できる。
骨髄移植は、現在多様な造血器起源の腫瘍の処置に使用されている。移植片対宿主病はこの処置の結果であるが、治療利益が移植片対腫瘍応答から得られ得る。ＧＩＴＲ活性化を使用して、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増加できる。
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、抗原特異的Ｔ細胞をエクスビボ活性化および増大し、これらの細胞をレシピントに養子移入することを含む、いくつかの実験的処置プロトコールもある(Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51)。これらの方法を使用して、ＣＭＶのような感染因子に対するＴ細胞応答も活性化できる。抗ＧＩＴＲ抗体存在下のエクスビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の発生頻度および活性を増加できる。
感染症
ここに記載する方法を使用して、特定の毒素または病原体に曝されている患者も処置し得る。よって、ここに記載する他の面は、対象が感染性疾患について処置されるように、対象に抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における感染性疾患を処置する方法を提供する。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。
上記の腫瘍に対する適応に類似して、抗体介在ＧＩＴＲ活性化を、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激するために、単独でまたはワクチンと組み合わせてアジュバントとして使用できる。この治療手段が特に有用であり得る病原体の例は、現在有効なワクチンがない病原体または従来のワクチンが十分に有効とはいえない病原体を含む。これらはＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢおよびＣ)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア属、マラリア、リーシュマニア属、黄色ブドウ球菌、緑膿菌を含むが、これらに限定されない。ＧＩＴＲ活性化は、感染の間に提示される抗原が変わるＨＩＶのような因子による確立された感染に対して有用であり得る。これらの新規エピトープは、抗ヒトＧＩＴＲ抗体投与時点で外来として認識され、それゆえに、強いＴ細胞応答を引き起こす。
ここに記載する方法により処置可能な病原性ウイルスが原因の感染のいくつかの例は、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢまたはＣ)、ヘルペスウイルス(例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−IIおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスを含む。
ここに記載する方法により処置可能な病原性細菌が原因の感染のいくつかの例は、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、テタヌス、ボツリヌス中毒、炭疽、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌を含む。
ここに記載する方法により処置可能な病原性真菌が原因の感染のいくつかの例は、カンジダ(アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリスなど)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス(フミガーツス、ニガーなど)、ケカビ目(ムコール、ユミケカビ、クモノスカビ)、スポロトリックス・シェンキイ、ブラストミセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチスおよびヒストプラズマ・カプスラーツムを含む。
ここに記載する方法により処置可能な病原性寄生虫が原因の感染のいくつかの例は、赤痢アメーバ、大腸バランチジウム、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ属、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム属、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、ブルセイトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、トキソプラズマ原虫、ブラジル鉤虫を含む。
上記方法の全てにおいて、ＧＩＴＲ活性化を、サイトカイン処置(例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２)または二重特異性抗体治療のような他の形態の免疫療法と組み合わせることができ、これは、腫瘍抗原の増強された提示を提供する(例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123参照)。
自己免疫反応
抗ＧＩＴＲ抗体は、自己免疫応答を誘発および増幅させ得る。実際、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを使用する抗腫瘍応答の誘発は、多くの抗腫瘍応答が抗自己反応性を伴うことを明らかにする(van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4)。それゆえに、種々の自己タンパク質と組み合わせて抗ＧＩＴＲ抗体を使用して、疾患処置のためにこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に産生させるためにワクチン接種プロトコールを考案することを考慮することが可能である。例えば、アルツハイマー病は、脳におけるアミロイド沈着におけるＡβペプチドの不適切な蓄積を含み、アミロイドに対する抗体応答は、これらのアミロイド沈着を浄化することができる(Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177)。
アレルギーおよび喘息の処置のためのＩｇＥおよびリウマチ性関節炎のためのＴＮＦｃのような他の自己タンパク質も標的として使用できる。最後に、種々のホルモンに対する抗体応答が抗ＧＩＴＲ抗体の使用により誘発され得る。生殖ホルモンに対する抗体応答の中和を避妊に使用できる。特定の腫瘍の増殖に必要なホルモンおよび他の可溶性因子に対する抗体応答の中和も可能なワクチン接種標的として考慮し得る。
抗ＧＩＴＲ抗体の使用について上に記載したのと類似の方法を、アルツハイマー病におけるＡβを含むアミロイド沈着、ＴＮＦαおよびＩｇＥのようなサイトカインのような他の自己抗原の不適切な蓄積を有する患者を処置するために、治療自己免疫応答の誘発に使用できる。
ワクチン
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を使用して、抗ＧＩＴＲ抗体と目的の抗原(例えば、ワクチン)の共投与により、抗原特異的免疫応答を刺激できる。よって、ここに提供されるのは、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように、対象に(ｉ)抗原；および(ii)抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法である。抗体はヒト抗ヒトＧＩＴＲ抗体であり得る(例えばここに記載するヒト抗ＧＩＴＲ抗体のいずれか)。これに加えてまたはこれとは別に、抗体はキメラまたはヒト化抗体であり得る。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来抗原であり得る。このような抗原の非限定的例は、上記腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記ウイルス、細菌または他の病原体由来の抗原のような、上記のものを含む。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体が結合するエピトープを含むペプチドまたは融合タンパク質を、抗ＧＩＴＲ抗体の代わりにまたはそれに加えて、ワクチンとして使用する。
ここに記載する抗体組成物(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多特異的および二重特異性分子およびイムノコンジュゲート)のインビボおよびインビトロの適当な投与経路は当分野で周知であり、当業者により選択され得る。例えば、抗体組成物は注射(例えば、静脈内または皮下)により投与できる。使用する分子の適当な投与量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または製剤による。
先に記載のように、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体を、１以上の治療剤、例えば、細胞毒性剤、放射性毒剤または免疫抑制剤と共投与できる。抗体を該薬剤に連結でき(免疫複合体として)または薬剤と別に投与できる。後者(別々の投与)の場合、抗体を該薬剤の前、後または同時に投与してよくまたは他の既知治療、例えば、抗癌治療、例えば、放射線と共投与してよい。このような治療剤は、とりわけ、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラチン、ブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素のような抗新生物剤を含み、これは、それ自体、患者に毒性または準毒性であるレベルでしか有効ではない。シスプラチンは、１００mg／ml用量を４週毎に１回として静脈内投与され、アドリアマイシンは６０〜７５mg／ml用量を２１日毎に１回として静脈内投与される。ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合フラグメントと化学療法剤の共投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果を生じる異なる機構を介して働く２抗癌剤を提供する。このような共投与は、抗体に対して非反応性とする薬物に対する耐性の獲得または腫瘍細胞の抗原性の変化による問題を解決できる。
またここに記載する範囲内にあるのは、ここに記載する抗体組成物(例えば、ヒト抗体、二重特異性または多特異的分子またはイムノコンジュゲート)および使用指示を含むキットである。キットは、さらに、少なくとも１個のさらなる試薬または１以上のさらなるここに記載するヒト抗体(例えば、第一ヒト抗体と異なるＧＩＴＲ抗原のエピトープに結合する相補的活性を有するヒト抗体)を含み得る。キットは、一般にキットの内容物の意図される使用を指示するラベルを含む。用語ラベルは、キット上にまたはキットとともに提供されるまたは他の方法でキットに付随するあらゆる書面または記録媒体を含む。
組み合わせ治療
上に提供される組み合わせ治療に加えて、抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、ここに記載のものは、下記のように、例えば、癌の処置のために、組み合わせ治療にも使用できる。
ここに提供されるのは、抗ＧＩＴＲ抗体を、免疫応答の刺激に有効であり、それにより対象における免疫応答をさらに刺激または上方制御する、１以上のさらなる薬剤、例えば、小分子剤、抗体またはその抗原結合部分と共投与する、組み合わせ治療の方法である。実施例に示すように、マウスへのアゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニスト的抗ＰＤ−１抗体の投与は、腫瘍増殖阻止に相乗的効果を有した。
一般に、例えば、ここに記載する、抗ＧＩＴＲ抗体を、(ｉ)刺激性(例えば、共刺激性)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアゴニストおよび／または(ii)Ｔ細胞のような免疫細胞の阻害性シグナルまたは分子(例えば、受容体またはリガンド)のアンタゴニストと組み合わせることができ、この両者とも、抗原特異的Ｔ細胞応答のような免疫応答の増強をもたらす。ある面において、癌免疫療法剤は、(ｉ)刺激性(共刺激性を含む)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアゴニストまたは(ii)自然免疫に関与する細胞、例えば、ＮＫ細胞の阻害性(共阻害性を含む)分子(例えば、受容体またはリガンド)のアンタゴニストであり、ここで、癌免疫療法剤は自然免疫を増強する。このような癌免疫療法剤は、しばしば免疫チェックポイントレギュレーター、例えば、免疫チェックポイント阻害剤または免疫チェックポイント刺激剤と称される。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、免疫グロブリンスーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーである刺激性または阻害性分子を標的とする薬剤と投与する。例えば、ここに記載する、抗ＧＩＴＲ抗体を、例えば、対象に、免疫応答を増加させるためにＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とする薬剤と投与できる。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体を、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１(ＰＤ−Ｌ１)、Ｂ７−ＤＣ(ＰＤ−Ｌ２)、Ｂ７−Ｈ２(ＩＣＯＳ−Ｌ)、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５(ＶＩＳＴＡ)およびＢ７−Ｈ６を含む膜結合リガンドのＢ７ファミリーのメンバーを標的とする(または特異的に結合する)薬剤またはＢ７ファミリーメンバーに特異的に結合する共刺激性または共阻害性受容体と投与してもよい。
抗ＧＩＴＲ抗体を、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹおよびＮＧＦＲのような、ＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーの分子(リガンドまたは受容体)を標的とする薬剤と投与してもよい(例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1参照)。
Ｔ細胞応答は、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１および１以上の次の薬剤の組み合わせにより刺激され得る：
(１) 上記のような、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＬＡＧ−３のような、Ｔ細胞活性化を阻害する(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)タンパク質のアンタゴニスト(阻害剤または遮断剤)および次のタンパク質のいずれか：ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４；および／または
(２) Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４−１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８ＨのようなＴ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト。
上記タンパク質の一つを調節し、癌の処置の処置のために、アゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体、例えば、ここに記載のものと組み合わせ得る薬剤の例は、ヤーボイＴＭ(イピリムマブ)またはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＢＭＳ−９３６５５８(ＰＤ−１に対するに対する)、ＭＫ−３４７５(ＰＤ−１に対する)、ＡＭＰ２２４(Ｂ７ＤＣに対する)、ＢＭＳ−９３６５５９(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＥＤＩ−５７０(ＩＣＯＳに対する)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ−３に対する)、ＢＭＳ−６６３５１３(ＣＤ１３７に対する)、ＰＦ−０５０８２５６６(ＣＤ１３７に対する)、ＣＤＸ−１１２７(ＣＤ２７に対する)、抗ＯＸ４０(Providence Health Services)、ｈｕＭＡｂＯＸ４０Ｌ(ＯＸ４０Ｌに対する)、アタシセプト(ＴＡＣＩに対する)、ＣＰ−８７０８９３(ＣＤ４０に対する)、ルカツムマブ(ＣＤ４０に対する)、ダセツズマブ(ＣＤ４０に対する)、ムロモナブ−ＣＤ３(ＣＤ３に対する)、イピルムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)を含む。
抗ＧＩＴＲ抗体はまたピディリズマブ(ＣＴ−０１１)とも投与できるが、そのＰＤ−１結合に対する特異性は疑問が残っている。
癌の処置のためにアゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせ得る他の分子は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストである。例えば、抗ＧＩＴＲアゴニスト的抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト(例えば、リリルマブ)と組み合わせ得る。
Ｔ細胞活性化は、可溶性サイトカインによっても制御され、抗ＧＩＴＲ抗体を、例えば、癌を有する、対象に、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカインのアンタゴニストまたはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストとともに投与し得る。
ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を、例えば、癌のような増殖性疾患を処置するために、免疫応答を刺激するために、(ｉ)ＩｇＳＦファミリーまたはＢ７ファミリーのタンパク質のアンタゴニスト(または阻害剤または遮断剤)またはＴ細胞活性化を阻害するＴＮＦファミリーまたはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン(例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ；“免疫抑制性サイトカイン”)のアンタゴニストおよび／または(ii)ＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーまたはＴＮＦファミリーの刺激受容体またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストと組み合わせて使用できる。
組み合わせ治療のためのさらに他の薬剤は、ＲＧ７１５５(ＷＯ１１／７００２４号、ＷＯ１１／１０７５５３号、ＷＯ１１／１３１４０７号、ＷＯ１３／８７６９９号、ＷＯ１３／１１９７１６号、ＷＯ１３／１３２０４４号)またはＦＰＡ−００８(ＷＯ１１／１４０２４９号；ＷＯ１３１６９２６４号；ＷＯ１４／０３６３５７号)を含む、ＣＳＦ−１Ｒアンタゴニスト的抗体のような、ＣＳＦ−１Ｒアンタゴニストを含むが、これらに限定されない、マクロファージまたは単球を阻害または枯渇する薬剤を含む。
抗ＧＩＴＲ抗体はまたＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する薬剤とも投与し得る。
抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせ得るさらなる薬剤は、腫瘍抗原提示を増強する薬剤、例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびイミキモドまたは腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療剤(例えば、アントラサイクリン)を含む。
抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせ得るさらに他の治療は、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇または遮断する治療、例えば、ＣＤ２５に特異的に結合する薬剤を含む。
抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせ得る他の治療は、インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼのような代謝酵素を阻害する治療である。
抗ＧＩＴＲ抗体と使用し得る他のクラスの薬剤は、アデノシン形成を阻害するまたはアデノシンＡ２Ａ受容体を阻害する薬剤を含む。
癌の処置のために抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせ得る他の治療は、Ｔ細胞アネルギーまたは疲弊を回復／予防する治療および腫瘍部位での自然免疫活性化および／または炎症を誘発する治療を含む。
抗ＧＩＴＲ抗体を１を超える癌免疫療法剤と組み合わせてよく、例えば、免疫経路の複数の要素を標的とするコンビナトリアルアプローチと組み合わせてよく、例えば、次の１以上と組み合わせてよい：腫瘍抗原提示を増強する治療(例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド)；例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２経路の阻害および／またはＴｒｅｇまたは他の免疫抑制細胞の枯渇または遮断による負の免疫制御を阻害する治療；例えば、ＣＤ−１３７、ＯＸ−４０および／またはＧＩＴＲ経路を刺激するおよび／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストで、正の免疫制御を刺激する治療；抗腫瘍Ｔ細胞の出現頻度を全身性に増加させる治療；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト(例えば、ダクリズマブ)の使用によりまたはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇により、腫瘍におけるＴｒｅｇのようなＴｒｅｇを枯渇または阻害する治療；腫瘍におけるサプレッサー骨髄細胞の機能に影響する治療；腫瘍細胞の免疫原性を増強させる治療(例えば、アントラサイクリン)；遺伝子修飾した細胞、例えば、キメラ抗原受容体により修飾された細胞を含む養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞移入(ＣＡＲ−Ｔ治療)；インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼのような代謝酵素を阻害する治療；Ｔ細胞アネルギーまたは疲弊を回復／予防する治療；腫瘍部位での自然免疫活性化および／または炎症を誘発する治療；免疫刺激性サイトカインの投与；または免疫抑圧的サイトカインの遮断。
ここに記載するアゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体を、１以上の正の共刺激受容体を連結する作動剤、阻害性受容体を経るシグナル伝達を減弱させる遮断剤、アンタゴニストおよび抗腫瘍Ｔ細胞の出現頻度を全身性に増加させる１以上の薬剤、腫瘍微小環境内の異なる免疫抑制経路に打ち勝つ薬剤(例えば、阻害性受容体結合(例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用)の遮断、Ｔｒｅｇの枯渇または阻害(例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体(例えば、ダクリズマブ)の使用またはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇による)、ＩＤＯのような代謝酵素の阻害またはＴ細胞アネルギーまたは疲弊の回復／予防)および腫瘍部位で自然免疫活性化および／または炎症を誘発する薬剤と共に使用できる。
ある態様において、対象がＢＲＡＦ Ｖ６００変異陽性であるならば、抗ＧＩＴＲ抗体を対象にＢＲＡＦ阻害剤と共に投与する。
ある態様において、他の免疫刺激抗体と共に総予する抗ＧＩＴＲ抗体は、ここに記載する抗体である。ある態様において、他の免疫刺激抗体と共に投与する抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば、ＷＯ２００６／１０５０２１号に記載のような、６Ｃ８のＣＤＲ配列を有する抗体、例えば、６Ｃ８のＣＤＲを有するヒト化抗体；ＷＯ２０１１／０２８６８３号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体；ＪＰ２００８２７８８１４号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体、ＷＯ２０１５／０３１６６７号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体またはここに記載または引用される他の抗ＧＩＴＲ抗体である。
ここに提供されるのは、例えば腫瘍増殖を阻害するまたは抗ウイルス応答を刺激するために、免疫応答が対象において刺激されるようにアゴニスト的抗ＧＩＴＲ分子、例えば、抗体および１以上のさらなる免疫刺激抗体、例えば、抗ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト的抗体、抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト的抗体、アンタゴニスト的抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト的抗体および／または抗ＬＡＧ３アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト的抗体を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法である。ある態様において、対象に、アゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニスト的抗ＰＤ−１抗体を投与する。ある態様において、対象に、アゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニスト的抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する。ある態様において、対象に、アゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニスト的抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与する。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体は、ここに記載する抗体のようなヒト抗体である。あるいは、抗ＧＩＴＲ抗体は、ここにさらに記載するもののような、例えば、キメラまたはヒト化抗体(例えば、マウス抗ＧＩＴＲ ｍＡｂから調製)であり得る。ある態様において、少なくとも１個のさらなる免疫刺激抗体(例えば、アンタゴニスト的抗ＰＤ−１、アンタゴニスト的抗ＰＤ−Ｌ１、アンタゴニスト的抗ＣＴＬＡ−４および／またはアンタゴニスト的抗ＬＡＧ３抗体)はヒト抗体である。あるいは、少なくとも１個のさらなる免疫刺激抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体(例えば、マウス抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＬＡＧ３抗体から調製)であり得る。
ここに提供されるのは、対象にアゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニストＰＤ−１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を治療量以下の用量で投与し、抗ＰＤ−１抗体を治療量以下の用量で投与するかまたは両者を治療量以下の用量で投与する。またここに提供されるのは、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−１抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置と関係する有害事象を改変する方法である。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、抗ＰＤ−１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＧＩＴＲ抗体はヒト配列モノクローナル抗体、ここに記載する２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体(例えば、２８Ｆ３.ＩｇＧ１または２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１)または他のここに記載するアゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体である。
ここに記載する方法において使用するための適当なＰＤ−１アンタゴニストは、リガンド、抗体(例えば、モノクローナル抗体および二重特異性抗体)および多価薬剤を含むが、これらに限定されない。ある態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは融合タンパク質、例えば、ＡＭＰ−２４４のようなＦｃ融合タンパク質である。ある態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
抗ＰＤ−１抗体の例は、ニボルマブ(ＢＭＳ−９３６５５８)または、ＷＯ２００６／１２１１６８号に記載される抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａｌ１一つのＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。ある態様において、抗ＰＤ１抗体は、ＷＯ２０１２／１４５４９３号に記載のＭＫ−３４７５(ランブロリズマブ)およびＷＯ２０１２／１４５４９３号に記載のＡＭＰ−５１４である。さらに既知のＰＤ−１抗体および他のＰＤ−１阻害剤は、ＷＯ２００９／０１４７０８号、ＷＯ０３／０９９１９６号、ＷＯ２００９／１１４３３５号、ＷＯ２０１１／０６６３８９号、ＷＯ２０１１／１６１６９９号、ＷＯ２０１２／１４５４９３号、米国特許７,６３５,７５７号および８,２１７,１４９号および米国特許公開２００９／０３１７３６８号に記載のものを含む。ＷＯ２０１３／１７３２２３号に開示の抗ＰＤ−１抗体のいずれかも使用し得る。これらの抗体の一つとＰＤ−１の結合について競合するおよび／または同じエピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体も組み合わせ処置に使用され得る。ＰＤ−１受容体を標的とする他の手法は、ＡＭＰ−２２４と呼ばれる、ＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメイン(Ｂ７−ＤＣ)からなる組み換えタンパク質である。
ある態様において、抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１に５×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＰＤ−１に１×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＰＤ−１に５×１０-９Ｍ以下のＫＤで結合するかまたはヒトＰＤ−１に１×１０-８Ｍ〜１×１０-１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
ここに提供されるのは、対象にアゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体およびアンタゴニストＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を治療量以下の用量で投与し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を治療量以下の用量で投与するかまたは両者を治療量以下の用量で投与する。ここに提供されるのは、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置と関係する有害事象を改変する方法である。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＧＩＴＲ抗体はヒト配列モノクローナル抗体、例えば、ここに記載する２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２および６Ｇ１０のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体(例えば、２８Ｆ３.ＩｇＧ１または２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１)または他のここに記載するアゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体である。
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９(ＷＯ２００７／００５８７４号および米国特許７,９４３,７４３号では１２Ａ４と称される)またはＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４号および米国特許７,９４３,７４３号に記載の３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６(別名抗Ｂ７−Ｈ１)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(別名ＲＧ７４４６)、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ(ＷＯ２０１３／７９１７４号)またはｒＨｉｇＭ１２Ｂ７である。ＷＯ２０１３／１７３２２３号、ＷＯ２０１１／０６６３８９号、ＷＯ２０１２／１４５４９３号、米国特許７,６３５,７５７号および８,２１７,１４９号および米国公開２００９／１４５４９３号のいずれかに開示の抗ＰＤ−Ｌ１抗体も使用し得る。これらの抗体と競合するおよび／または同じエピトープに結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体も、組み合わせ処置に使用し得る。
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に５×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＰＤ−Ｌ１に１×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＰＤ−Ｌ１に５×１０-９Ｍ以下のＫＤで結合するかまたはヒトＰＤ−Ｌ１に１×１０-８Ｍ〜１×１０-１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
ここに提供されるのは、対象にここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体およびＣＴＬＡ−４アンタゴニスト的抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。ある態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を治療量以下の用量で投与し、抗ＣＴＬＡ−４抗体を治療量以下の用量で投与するかまたは両者を治療量以下の用量で投与する。ここに提供されるのは、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置と関係する有害事象を改変する方法である。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヤーボイＴＭ(ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４号に記載のイピリムマブまたは抗体１０Ｄ１)、トレメリムマブ(以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６)、モノクローナルまたは次のＷＯ９８／４２７５２号；ＷＯ００／３７５０４号；米国特許６,２０７,１５６号；Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206);およびMokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304の刊行物のいずれかに記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される抗体たである。ＷＯ２０１３／１７３２２３号に開示の抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれも使用し得る。
ある態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヒトＣＴＬＡ−４に５×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＣＴＬＡ−４に１×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＣＴＬＡ−４に５×１０-９Ｍ以下のＫＤで結合するかまたはヒトＣＴＬＡ−４に１×１０-８Ｍ〜１×１０-１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
ここに提供されるのは、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＬＡＧ−３抗体を投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)を処置する方法である。さらなる態様において、抗ＧＩＴＲ抗体を治療量以下の用量で投与し、抗ＬＡＧ−３抗体を治療量以下の用量で投与するかまたは両者を治療量以下の用量で投与する。ここに提供されるのは、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および治療量以下の用量の抗ＬＡＧ−３抗体を投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置と関係する有害事象を改変する方法である。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＧＩＴＲ抗体はヒト配列モノクローナル抗体、例えば、ここに記載する２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２または６Ｇ１０のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体(例えば、２８Ｆ３.ＩｇＧ１または２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１)または他のここに記載するアゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体である。抗ＬＡＧ３抗体の例は、抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体であり、これは、米国特許公開ＵＳ２０１１／０１５０８９２号、ＷＯ１０／１９５７０号およびＷＯ２０１４／００８２１８号に開示されている。ある態様において、抗ＬＡＧ−３抗体はＢＭＳ−９８６０１６である。使用できる他の当分野で認識される抗ＬＡＧ−３抗体は、ＵＳ２０１１／００７０２３、ＷＯ０８／１３２６０１号およびＷＯ０９／４４２７３号に記載されているＩＭＰ７３１およびＩＭＰ−３２１である。これらの抗体のいずれかと競合するおよび／または同じエピトープに結合する抗ＬＡＧ−３抗体も、組み合わせ処置に使用し得る。
ある態様において、抗ＬＡＧ−３抗体は、ヒトＬＡＧ−３に５×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＬＡＧ−３に１×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合し、ヒトＬＡＧ−３に５×１０-９Ｍ以下のＫＤで結合するかまたはヒトＬＡＧ−３に１×１０-８Ｍ〜１×１０-１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体と、ＬＡＧ−３および／またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１のような１以上の第二標的抗原に対するアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト的抗体の投与は、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強し得る。本開示の抗体を使用して増殖がそがされ得る癌は、一般に免疫療法に応答性および一般に免疫療法に応答性ではない癌を含む。本開示の組み合わせ治療で処置される癌の代表例は、ここに挙げた癌を含む。
ある態様において、ここに記載する治療抗体の組み合わせを、薬学的に許容される担体中の単一組成物として同時にまたは薬学的に許容される担体中に各抗体を含む別々の組成物として同時に投与できる。他の態様において、治療抗体の組み合わせを逐次的に投与できる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体を先に投与し、抗ＧＩＴＲ抗体を２番目に投与するまたは抗ＧＩＴＲ抗体を先に投与し、抗ＣＴＬＡ−４抗体を２番目に投与するように、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＧＩＴＲ抗体を逐次的に投与できる。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ−１抗体を先に投与し、抗ＧＩＴＲ抗体を２番目に投与するまたは抗ＧＩＴＲ抗体を先に投与し、抗ＰＤ−１抗体を２番目に投与するように、抗ＰＤ−１抗体および抗ＧＩＴＲ抗体を逐次的に投与できる。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を先に投与し、抗ＧＩＴＲ抗体を２番目に投与するまたは抗ＧＩＴＲ抗体を先に投与し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を２番目に投与するように、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＧＩＴＲ抗体を逐次的に投与できる。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＬＡＧ−３抗体を先に投与し、抗ＧＩＴＲ抗体を２番目に投与するまたは抗ＧＩＴＲ抗体を先に投与し、抗ＬＡＧ−３抗体を２番目に投与するように、抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＧＩＴＲ抗体を逐次的に投与できる。
さらに、組み合わせ治療を１回を超えて逐次的に投与するとき、逐次投与の順番は各投与時に逆になっても同じ順番を守ってもよく、逐次投与を同時投与または任意のこれらの組み合わせと組み合わせ得る。例えば、組み合わせ抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＧＩＴＲ抗体の最初の投与は同時であってよく、２回目の投与は、ＣＴＬＡ−４抗体が最初で、抗ＧＩＴＲ抗体が２番目のように逐次であってよく、３回目の投与は、ＧＩＴＲ抗体が最初で、抗ＣＴＬＡ−４抗体が２番目であったよいなどである。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＰＤ−１抗体および抗ＧＩＴＲ抗体の最初の投与は同時であってよく、２回目の投与は、ＰＤ−１抗体が最初で、抗ＧＩＴＲ抗体が２番目のように逐次であってよく、３回目の投与は、ＧＩＴＲ抗体が最初で、抗ＰＤ−１抗体が２番目であったよいなどである。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＧＩＴＲ抗体の最初の投与は同時であってよく、２回目の投与は、ＰＤ−Ｌ１抗体が最初で、抗ＧＩＴＲ抗体が２番目のように逐次であってよく、３回目の投与は、ＧＩＴＲ抗体が最初で、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が２番目であったよいなどである。これに加えてまたはこれとは別に、組み合わせ抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＧＩＴＲ抗体の最初の投与は同時であってよく、２回目の投与は、ＬＡＧ−３抗体が最初で、抗ＧＩＴＲ抗体が２番目のように逐次であってよく、３回目の投与は、ＧＩＴＲ抗体が最初で、抗ＬＡＧ−３抗体が２番目であったよいなどである。他の代表的投薬スキームは、抗ＧＩＴＲが最初で、抗ＣＴＬＡ−４抗体(および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体)が２番目の逐次である最初の投与および続く投与は同時であり得るものを含み得る。
ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および癌免疫療法剤の投与により処置し、ここで、癌免疫療法剤はアゴニストＣＤ１３７抗体のようなＣＤ１３７(４−１ＢＢ)アゴニストである。適当なＣＤ１３７抗体は、例えば、ウレルマブまたはＰＦ−０５０８２５６６(ＷＯ１２／３２４３３号)を含む。
ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および癌免疫療法剤の投与により処置し、ここで、癌免疫療法剤は、アゴニストＯＸ４０抗体のようなＯＸ４０アゴニストである。適当なＯＸ４０抗体は、例えば、ＭＥＤＩ−６３８３、ＭＥＤＩ−６４６９またはＭＯＸＲ０９１６(ＲＧ７８８８；ＷＯ０６／０２９８７９号)を含む。
ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および癌免疫療法剤の投与により処置し、ここで、癌免疫療法剤は、アゴニストＣＤ４０抗体のようなＣＤ４０アゴニストである。ある態様において、癌免疫療法剤は、アンタゴニストＣＤ４０抗体のようなＣＤ４０アンタゴニストである。適当なＣＤ４０抗体は、例えば、ルカツムマブ(ＨＣＤ１２２)、ダセツズマブ(ＳＧＮ−４０)、ＣＰ−８７０,８９３またはＣｈｉ Ｌｏｂ ７／４を含む。
ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および癌免疫療法剤の投与により処置し、ここで、癌免疫療法剤は、アゴニストＣＤ２７抗体のようなＣＤ２７アゴニストである。適当なＣＤ２７抗体は、例えば、バルリルマブ(ＣＤＸ−１１２７)を含む。
ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および癌免疫療法剤の投与により処置し、ここで、癌免疫療法剤は、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)(ＷＯ１１／１０９４００号)である。
ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および癌免疫療法剤の投与により処置し、ここで、癌免疫療法剤は、リリルマブのようなＫＩＲアンタゴニストである。
ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および癌免疫療法剤の投与により処置し、ここで、癌免疫療法剤は、ＩＤＯアンタゴニストである。適当なＩＤＯアンタゴニストは、例えば、ＩＮＣＢ−０２４３６０(ＷＯ２００６／１２２１５０号、ＷＯ０７／７５５９８号、ＷＯ０８／３６６５３号、ＷＯ０８／３６６４２号)、インドキシモド、ＮＬＧ−９１９(ＷＯ０９／７３６２０号、ＷＯ０９／１１５６６５２号、ＷＯ１１／５６６５２号、ＷＯ１２／１４２２３７号)またはＦ００１２８７を含む。
ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および癌免疫療法剤の投与により処置し、ここで、癌免疫療法剤は、トール様受容体アゴニスト、例えば、ＴＬＲ２／４アゴニスト(例えば、カルメット・ゲラン桿菌)；ＴＬＲ７アゴニスト(例えば、ヒルトノールまたはイミキモド)；ＴＬＲ７／８アゴニスト(例えば、レシキモド)；またはＴＬＲ９アゴニスト(例えば、ＣｐＧ７９０９)である。
ある態様において、免疫系の刺激により利益を受け得る疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象を、対象に抗ＧＩＴＲ抗体および癌免疫療法剤の投与により処置し、ここで、癌免疫療法剤はＴＧＦ−β阻害剤、例えば、ＧＣ１００８、ＬＹ２１５７２９９、ＴＥＷ７１９７またはＩＭＣ−ＴＲ１である。
ある面において、抗ＧＩＴＲ抗体を、第二剤、例えば、癌免疫療法剤の投与前に逐次的に投与する。ある面において、抗ＧＩＴＲ抗体を、第二剤、例えば、癌免疫療法剤と同時に投与する。さらにある面において、抗ＧＩＴＲ抗体を、第二剤の後に逐次的に投与する。２剤の投与は、例えば、３０分、６０分、９０分、１２０分、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、５日、７日または１週間またはそれ以上離れている時点で開始してよくまたは第二剤の投与を、第一剤が投与されてから、例えば、３０分、６０分、９０分、１２０分、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、５日、７日または１週間以上後に開始してよい。
ある面において、抗ＧＩＴＲ抗体および第二剤、例えば、癌免疫療法剤を、患者に、同時に投与し、例えば、３０分または６０分にわたり、例えば、同時に点滴する。抗ＧＩＴＲ抗体を、第二剤、例えば、癌免疫療法剤と共製剤し得る。
所望により、唯一の免疫治療剤としての抗ＧＩＴＲまたは抗ＧＩＴＲ抗体および１以上のさらなる免疫療法抗体(例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３遮断)の組み合わせを、癌性細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞のような免疫原性剤とさらに組み合わせ得る(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドのような黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトした腫瘍細胞を含む(下にさらに記載)。組み合わせたＧＩＴＲ活性化および１以上のさらなる抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)も、さらに標準癌処置と組み合わせ得る。例えば、組み合わせたＧＩＴＲ活性化および１以上のさらなる抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)を、化学療法レジメと効率的に組み合わせ得る。これらの場合、本開示の組み合わせと投与する他の化学療法剤の用量を減らすことが可能である(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組み合わせの例は、黒色腫の処置のための、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体のようなさらなる抗体の併用の組み合わせであり、さらにダカルバジンと併用しても併用しなくてもよい。他の例は、黒色腫の処置のための、抗ＧＩＴＲ抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３抗体の組み合わせであり、さらにインターロイキン−２(ＩＬ−２)と併用しても併用しなくてもよい。ＧＩＴＲ活性化およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と化学療法の組み合わせ使用の後ろにある科学的論拠は、大部分の化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベル増加をもたらすはずであるということである。細胞死によりＧＩＴＲ活性化とＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断を併用または併用しない相乗作用を生じ得る他の組み合わせ治療は、放射線、手術またはホルモン欠乏を含む。これらのプロトコールの各々の各々は、宿主に腫瘍抗原の供給源を産生する。血管形成阻害剤も組み合わせたＧＩＴＲ活性化およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と組み合わせ得る。血管形成阻害は腫瘍細胞死に至り、これが腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給し得る。
唯一の免疫治療剤としての抗ＧＩＴＲアゴニスト的抗体またはＧＩＴＲアゴニストおよびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断抗体の組み合わせもはまたＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞を標的とさせる二重特異性抗体と組み合わせても使用できる(例えば、米国特許５,９２２,８４５号および５,８３７,２４３号参照)。二重特異性抗体を使用して、２つの別々の抗原を標的とできる。これらの応答のＴ細胞アームは、組み合わせたＧＩＴＲ活性化およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断により増強される。
他の例において、唯一の免疫治療剤としての抗ＧＩＴＲアゴニスト的抗体または抗ＧＩＴＲ抗体とさらなる免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３剤、例えば、抗体の組み合わせを、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、ゼヴァリン(登録商標)(イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、Lymphocide(登録商標)(エプラツズマブ)、アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)およびタルセバ(登録商標)(エルロチニブ)などのような抗新生物抗体と共に使用できる。例としてかつ理論に縛られることを望まないが、抗癌抗体または毒素とコンジュゲートした抗癌抗体での処置は癌細胞死(例えば、腫瘍細胞)を起こすことができ、これは、免疫刺激剤、例えば、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３剤、例えば、抗体が介在する免疫応答を増強する。例示的態様において、過増殖性疾患(例えば、癌腫瘍)の処置は、抗ＧＩＴＲおよび所望によりさらなる免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば、抗体と組み合わせた抗癌剤、例えば、抗体を同時にまたは逐次的にまたは任意のこれらの組み合わせで含むことができ、これは、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強できる。
腫瘍は、多種多様な機構により宿主免疫監視を逃れる。これらの機構の多くは、腫瘍により発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化により克服し得る。これらは、とりわけＴＧＦ−β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの各々に対する抗体を、さらに、さらなる免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば抗体併用するまたは併用しない抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用して、免疫抑制因子の効果を相殺し、宿主による腫瘍免疫応答を支持できる。
宿主免疫応答性の活性化に使用できる他の薬剤、例えば、抗体を、さらに、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体のようなさらなる免疫刺激剤を併用するまたは併用しない抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体(Ridge et al., supra)を抗ＧＩＴＲ抗体および所望によりさらなる免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば、抗体と組み合わせて使用できる。Ｔ細胞共刺激分子に対する他の活性化抗体(Weinberg et al., supra, Melero et al. supra, Hutloff et al., supra)も、Ｔ細胞活性化レベルを増加させるために提供できる。
上記のように、骨髄移植は、現在多様な造血器起源の腫瘍の処置に使用されている。抗ＧＩＴＲ免疫療法単独またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断との組み合わせを使用して、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増加できる。
腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、抗原特異的Ｔ細胞をエクスビボ活性化および増大し、これらの細胞をレシピントに養子移入することを含む、いくつかの実験的処置プロトコールもある(Greenberg & Riddell, supra)。これらの方法を使用して、ＣＭＶのような感染因子に対するＴ細胞応答も活性化できる。さらなる免疫刺激療法、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体を伴うまたは伴わない抗ＧＩＴＲ存在下のエクスビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の発生頻度および活性を増加すると予測できる。
ここに提供されるのは、対象に、抗ＧＩＴＲ抗体を、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３剤、例えば、抗体と併用してまたは併用せずに投与することを含む、免疫刺激剤での過増殖性疾患(例えば、癌)の処置と関係する有害事象を改変する方法である。例えば、ここに記載する方法は、免疫刺激性治療抗体誘発大腸炎または患者への非吸収性ステロイドの投与による下痢の発生率を減らす方法を提供する。ここで使用する“非吸収性ステロイド”は、肝臓での代謝後、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満であるように、広範な初回通過代謝を示すグルココルチコイドである。ここに記載するある態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは局所作用性グルココルチコステロイドであり、これは、経口投与後、広範に、主に肝臓で代謝される。ENTOCORT EC(登録商標)(AstraZeneca)は、回腸および結腸全体への薬物送達最適化するために開発されたブデソニドのｐＨおよび時間依存的経口製剤である。ENTOCORT EC(登録商標)は、回腸および／または上行結腸が関与する軽度〜中程度クローン病の処置に対して米国で承認されている。クローン病処置のためのENTOCORT EC(登録商標)の通常の経口投与量は６〜９mg／日である。ENTOCORT EC(登録商標)は、吸収される前に腸で遊離され、腸粘膜に維持される。腸粘膜標的組織を通過したら、ENTOCORT EC(登録商標)は、肝臓のチトクロムＰ４５０システムによりごくわずかなグルココルチコイド活性を有する代謝物に広範囲に代謝される。それゆえに、バイオアベイラビリティは低い(約１０％)。ブデソニドの低バイオアベイラビリティは、広範ではない初回通過代謝される他のグルココルチコイドと比較して、改善された治療比を有する。ブデソニドは、全身作用性コルチコステロイドより少ない視床下部−下垂体抑制を含む少ない有害作用をもたらす。しかしながら、ENTOCORT EC(登録商標)の慢性投与は、副腎皮質亢進および副腎抑制のような全身性グルココルチコイド効果をもたらし得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610参照。
さらに別の態様において、非吸収性ステロイドと組み合わせたＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断を伴うまたは伴わないＧＩＴＲ活性化(すなわち、免疫刺激性治療抗体抗ＧＩＴＲおよび所望により抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体)を、さらに、サリチレートと組み合わせてよい。サリチレートは、例えば：スルファサラジン(アザルフィジン(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；オルサラジン(DIPENTUM(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；バルサラジド(COLAZAL(登録商標)、Salix Pharmaceuticals, Inc.)；およびメサラミン(アサコール(登録商標)、Procter & Gamble Pharmaceuticals；ペンタサ(登録商標)、Shire US；CANASA(登録商標)、Axcan Scandipharm, Inc.；ROWASA(登録商標)、Solvay)のような、５−ＡＳＡ剤を含む。
ここに記載する方法によって、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３抗体および非吸収性ステロイドを伴うまたは伴わない抗ＧＩＴＲと組み合わせたサリチレートは、免疫刺激抗体により誘発される大腸炎の発生率を減らす目的で、サリチレートおよび非吸収性ステロイドのあらゆる重複または逐次投与を含み得る。それゆえに、例えば、ここに記載する免疫刺激抗体により誘発される大腸炎の発生率を減らす方法は、サリチレートおよび非吸収性ステロイドの同時または逐次の投与(例えば、サリチレートを、非吸収性ステロイドの６時間後に投与)または任意のこれらの組み合わせを含み得る。さらに、サリチレートおよび非吸収性ステロイドを同じ経路(例えば、両者を経口で投与)または異なる経路(例えば、サリチレートを経口投与および非吸収性ステロイドを直腸投与)で投与してよく、これは、抗ＧＩＴＲおよび抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体の投与に使用する経路と異なり得る。
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体および組み合わせ抗体治療をまた、処置適応症(例えば、癌)に対する特定の有用性について選択される他の周知治療とも組み合わせてよい。ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の組み合わせを、既知の薬学的に許容される薬剤と逐次的に使用してよい。
例えば、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体および組み合わせ抗体治療を、照射、化学療法(例えば、カンプトテシン(ＣＰＴ−１１)、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル(タキソール)、ドキソルビシン、５−ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ(６Ｘ ｃｏｍｂｏ)を使用)、１以上のプロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２)、１以上のＢｃｌ−２阻害剤(例えば、ＢＨ３Ｉ−２’(ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤)、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤(例えば、ＩＮＣＢ２４３６０、インドキシモド、ＮＬＧ−９１９またはＦ００１２８７)、ＡＴ−１０１(Ｒ−(−)−ゴシポール誘導体)、ＡＢＴ−２６３(小分子)、ＧＸ−１５−０７０(オバトクラックス)またはＭＣＬ−１(骨髄白血病細胞分化タンパク質−１)アンタゴニスト)、ｉＡＰ(アポトーシスタンパク質阻害因子)アンタゴニスト(例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｍａｃ模倣体、合成ｓｍａｃペプチド(Fulda et al., NatMed 2002;8:808-15参照)、ＩＳＩＳ２３７２２(ＬＹ２１８１３０８)またはＡＥＧ−３５１５６(ＧＥＭ−６４０))、ＨＤＡＣ(ヒストンデアセチラーゼ)阻害剤、抗ＣＤ２０抗体(例えば、リツキシマブ)、血管形成阻害剤(例えば、ベバシズマブ)、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲをターゲティングする抗血管形成剤(例えば、アバスチン)、合成トリテルペノイド(ＨHyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808参照)、ｃ−ＦＬＩＰ(細胞性ＦＬＩＣＥ阻害性タンパク質)モジュレーター(例えば、ＰＰＡＲγ(ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ)の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００)、キナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ)、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスのようなｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドマイド、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物のようなさらなる処置とみ合わせて(例えば、同時にまたは別々に)使用できる。
ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体および組み合わせ抗体治療を、さらに１以上抗増殖性細胞毒性剤と組み合わせて使用できる。抗増殖性細胞毒性剤として使用し得る化合物の群は、次のものを含むが、これらに限定されない：
アルキル化剤(窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼンを含むが、これらに限定されない)：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(シトキサンＴＭ)、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤(葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない)：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
アゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせる適当な抗増殖剤は、タキサン類、パクリタキセル(パクリタキセルは、タキソールＴＭとして市販)、ドセタキセル、ディスコデルモライド(ＤＤＭ)、ジクチオスタチン(ＤＣＴ)、Peloruside A、エポチロン類、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、[１７]−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、[１８]デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、ｔｒａｎｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、ｃｉｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモライド、パツピロン(ＥＰＯ−９０６)、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ(ディスコデルモライド)、ＴＺＴ−１０２７(ソブリドチン)、ＩＬＸ−６５１(タシドチン塩酸塩)、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシレート(Ｅ−７３８９)、ヘミアステリン(ＨＴＩ−２８６)、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ−３５５７０３、メイタンシノイドイムノコンジュゲート(ＤＭ−１)、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２(イスピネシブ)、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７ベータ−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ｈｏｍｏ−ｅｓｔｒａ−１,３,５(１０)−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４−ｅｐｉ−７−デヒドロキシ−１４,１６−ジデメチル−(＋)−ディスコデルモライドおよびクリプトチロン１とそれに加えて当分野で機知の他の微小管安定化剤を含むが、これらに限定されない。
異常増殖性細胞を、ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体の処置と共にまたはその前に静止状態にさせることが望ましいとき、ホルモンおよびステロイド(合成アナログを含む)、例えば１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、テストラクトン、メゲストロールアセテート、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン 、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロンアセテート、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックスＴＭも患者に投与できる。ここに記載する方法または組成物を用いるとき、アンチミメティックのような、臨床的状況において腫瘍増殖または転移の調節に使用される他の薬剤も、所望により投与してよい。
化学療法剤の安全かつ有効投与のための方法が当業者に周知である。さらに、それらの投与は標準文献に記載されている。例えば、化学療法剤の多くの投与は、Physicians' Desk Reference(ＰＤＲ)の、例えば、１９９６年版(Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA)に記載され、その開示を、引用により本明細書に包含させる。
化学療法剤および／または放射線治療を、当分野で周知の治療プロトコールにより投与できる。化学療法剤および／または放射線治療の投与は、処置する疾患およびその疾患に対する化学療法剤および／または放射線治療の既知効果により変わり得ることは当業者には明らかである。また、熟練臨床医の知識により、治療プロトコール(例えば、投与量および投与の時間)は、患者での投与した治療剤の観察される効果の観点および投与した治療剤に対する疾患の観察される応答の観点で変わり得る。
例示的態様
１. ヒトグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、次の性質を示す単離抗体またはその抗原結合部分：
(ａ) 可溶性ヒトＧＩＴＲに結合する；
(ｂ) 膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(ｃ) 膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合する；
(ｄ) Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(ｅ) ＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合を阻害する；
(ｆ) ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を最大でも部分的に阻害する；
(ｇ) 成熟ヒトＧＩＴＲ上の立体エピトープ(配列番号４)に結合する；
(ｈ) Ｏ結合およびＮグリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両者に結合する；
(ｉ) Ｆｃ受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、ここで、Ｆｃ受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強する；および
(ｉ)ヒトＧＩＴＲの１以上の抗体２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および６Ｇ１０との結合といずれかの方向または両方向で競合する。
２. 抗体が抗腫瘍免疫応答を刺激する、態様１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
３. 抗体が抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、態様１または２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
４. 抗体がＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
５. 抗体がＴ細胞増殖を増加させる、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
６. 抗体がＦｃ受容体に結合しない、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
７. 抗体が１以上の活性化ＦｃγＲに結合する、態様１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
８. 抗体が、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定して、可溶性ヒトＧＩＴＲに１０nM以下のＫＤで結合する、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
９. 抗体が、スキャッチャードにより測定して、膜結合ヒトＧＩＴＲに１nM以下のＫＤで結合する、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
１０. 抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、膜結合ヒトＧＩＴＲに１nM以下のＥＣ５０で結合する、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
１１. 抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに１０nM以下のＥＣ５０で結合する、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
１２. 抗体が多価架橋結合を必要とせずＴ細胞の活性化を誘発または増強する、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
１３. 抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、ＧＩＴＲリガンドのＧＩＴＲへの結合を１μg／mL以下のＥＣ５０で阻害する、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
１４. 抗体が成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)に結合する、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
１５. グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に特異的に結合し、次のものからなる群から選択される可変重鎖および可変軽鎖対にある３可変重鎖ＣＤＲおよび３可変軽鎖ＣＤＲを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ) 配列番号１３および１４；
(ｂ) 配列番号２６および２７；
(ｃ) 配列番号３９および４０；
(ｄ) 配列番号５２および５３；
(ｅ) 配列番号５２および５４；
(ｆ) 配列番号７１および７２；
(ｇ) 配列番号８４および８５；
(ｈ) 配列番号９７および９８；
(ｉ) 配列番号９７および９９；
(ｊ) 配列番号１１５および１１６；
(ｋ) 配列番号１２８および１２９；
(ｌ) 配列番号１２８および１３０；および
(ｍ) 配列番号３３５および３３６。
１６.
(ａ) それぞれ配列番号２０、２１および２２を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号２３、２４および２５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｂ) それぞれ配列番号３３、３４および３５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号３６、３７および３８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｃ) それぞれ配列番号４６、４７および４８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号４９、５０および５１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｄ) それぞれ配列番号６２、６３および６４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６５、６６および６７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｅ) それぞれ配列番号６２、６３および６４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６８、６９および７０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｆ) それぞれ配列番号７８、７９および８０を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号８１、８２および８３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｇ) それぞれ配列番号９１、９２および９３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号９４、９５および９６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｈ) それぞれ配列番号１０６、１０７および１０８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１０９、１１０および１１１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｉ) それぞれ配列番号１０６、１０７および１０８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１１２、１１３および１１４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｊ) それぞれ配列番号１２２、１２３および１２４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１２５、１２６および１２７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｋ) それぞれ配列番号１３８、１３９および１４０を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１４１、１４２および１４３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｌ) それぞれ配列番号１３８、１３９および１４０を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１４４、１４５および１４６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
(ｍ) それぞれ配列番号３４２、３４３および３４４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号３４５、３４６および３４７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含むグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
１７. 抗体がそれぞれ配列番号２０、２１および２２を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号２３、２４および２５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、態様１６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
１８. 抗体がそれぞれ配列番号３３、３４および３５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号３６、３７および３８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、態様１６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
１９. 抗体がそれぞれ配列番号４６、４７および４８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号４９、５０および５１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、態様１６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
２０. グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
２１. グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
２２. グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ) それぞれ配列番号１３および１４；
(ｂ) それぞれ配列番号２６および２７；
(ｃ) それぞれ配列番号３９および４０；
(ｄ) それぞれ配列番号５２および５３；
(ｅ) それぞれ配列番号５２および５４；
(ｆ) それぞれ配列番号７１および７２；
(ｇ) それぞれ配列番号８４および８５；
(ｈ) それぞれ配列番号９７および９８；
(ｉ) それぞれ配列番号９７および９９；
(ｊ) それぞれ配列番号１１５および１１６；
(ｋ) それぞれ配列番号１２８および１２９；
(ｌ) それぞれ配列番号１２８および１３０；および
(ｍ) それぞれ配列番号３３５および３３６。
２３. 重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、態様２２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
２４. 重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、態様２３に記載の抗体またはその抗原結合部分。
２５. 重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含む、態様２４に記載の抗体またはその抗原結合部分。
２６. 抗体が、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、態様２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
２７. 抗体が、配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、態様２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
２８. 抗体が、配列番号３９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または配列番号４０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、態様２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
２９. グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ) それぞれ配列番号１５および１６；
(ｂ) それぞれ配列番号１７および１９；
(ｃ) それぞれ配列番号１８および１９；
(ｄ) それぞれ配列番号２８および２９；
(ｅ) それぞれ配列番号３０および３２；
(ｆ) それぞれ配列番号３１および３２；
(ｇ) それぞれ配列番号４１および４２；
(ｈ) それぞれ配列番号４３および４５；
(ｉ) それぞれ配列番号４４および４５；
(ｊ) それぞれ配列番号５５および５６；
(ｋ) それぞれ配列番号５５および５７；
(ｌ) それぞれ配列番号５８および６０；
(ｍ) それぞれ配列番号５９および６０；
(ｎ) それぞれ配列番号５８および６１；
(ｏ) それぞれ配列番号５９および６１；
(ｐ) それぞれ配列番号７３および７４；
(ｑ) それぞれ配列番号７５および７７；
(ｒ) それぞれ配列番号７６および７７；
(ｓ) それぞれ配列番号８６および８７；
(ｔ) それぞれ配列番号８８および９０；
(ｕ) それぞれ配列番号８９および９０；
(ｖ) それぞれ配列番号１０２および１０４；
(ｗ) それぞれ配列番号１０３および１０４；
(ｘ) それぞれ配列番号１００および１０１；
(ｙ) それぞれ配列番号１００および３７１；
(ｚ) それぞれ配列番号１０２および１０５；
(ｚａ) それぞれ配列番号１０３および１０５；
(ｚｂ) それぞれ配列番号１１７および１１８；
(ｚｃ) それぞれ配列番号１１９および１２１；
(ｚｄ) それぞれ配列番号１２０および１２１；
(ｚｅ) それぞれ配列番号１３１および１３２；
(ｚｆ) それぞれ配列番号１３４および１３６；
(ｚｇ) それぞれ配列番号１３５および１３６；
(ｚｈ) それぞれ配列番号１３１および１３３；
(ｚｉ) それぞれ配列番号１３４および１３７；
(ｚｊ) それぞれ配列番号１３５および１３７；
(ｚｋ) それぞれ配列番号３３７および３３８；
(ｚｌ) それぞれ配列番号３３９および３４１；および
(ｚｍ) それぞれ配列番号３４０および３４１。
３０. 重鎖および軽鎖が(ａ)〜(ｚｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖を含む、態様２９に記載の抗体またはその抗原結合部分。
３１. 抗体が、配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、態様３０に記載の抗体またはその抗原結合部分。
３２. 抗体が、配列番号１８に示すアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、態様３０に記載の抗体またはその抗原結合部分。
３３. (ａ)ＧＩＴＲ上の態様２５の抗体と同じエピトープに結合するおよび(ｂ)ＦＡＣＳにより測定して態様２５の抗体の活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を少なくとも９０％する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
３４. 抗体が成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)に結合する、態様１５〜３３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
３５. 抗体がヒトおよびカニクイザル両者のＧＩＴＲに結合する、態様１５〜３４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
３６. 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントからなる群から選択される、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
３７. 抗体がＩｇＧ１抗体である、態様３６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
３８. 抗体がエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃを含む、態様３６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
３９. 抗体またはその抗原結合部分が、次の変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含むエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃを含む、態様３８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
４０. 抗体またはその抗原結合部分が活性化ＦｃγＲへの結合が増強されたＦｃを含む、態様３６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
４１. ＣＤＲ領域におけるメチオニン残基が、酸化を受けないアミノ酸残基に置換されている、先の態様のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
４２. 抗体またはその抗原結合部分がヒトまたはヒト化抗体である、態様１５〜４１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
４３. 第二結合特異性を有する分子に結合した先の態様のいずれかに記載の抗体を含む、二重特異性分子。
４４. 態様１〜４２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸。
４５. 態様４４に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
４６. 態様４５に記載の発現ベクターで形質転換された、細胞。
４７. 薬剤に結合した態様１〜４２のいずれかに記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
４８. 態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび担体を含む、組成物。
４９. 態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分または二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび使用指示を含む、キット。
５０. 抗体またはその抗原結合部分を態様４６に記載の細胞で発現させ、該細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離することを含む、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を製造する方法。
５１. 抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるようにＴ細胞と態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法。
５２. エフェクターＴ細胞と態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよびＣＤ３を接触させることを含み、ここで、エフェクターＴ細胞が活性化または共刺激される、エフェクターＴ細胞を活性化または共刺激する方法。
５３. Ｔ細胞と態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートの有効量を接触させることを含む、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる方法。
５４. Ｔ細胞と態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートの有効量を接触させることを含む、Ｔ細胞増殖を増加させる方法。
５５. Ｔ細胞からのＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させるために、態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含む、対象におけるＴ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる方法。
５６. 態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含み、ここで、該抗体またはその抗原結合部分が、腫瘍におけるＴ制御性細胞の数を減らすためのエフェクターまたは増強されたエフェクター機能を有する、処置を必要とする対象における腫瘍におけるＴ制御性細胞数を減少または枯渇させる方法。
５７. 対象における免疫応答が刺激されるように、対象に態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法。
５８. 対象が腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される、態様５７に記載の方法。
５９. 対象における腫瘍の増殖が阻害されるように、対象に態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻止する方法。
６０. 癌を処置するために、処置を必要とする対象に態様１〜４３および４７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、癌を処置する方法。
６１. 癌が膀胱癌、乳癌、子宮／頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、胚細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌からなる群から選択される、態様６０に記載の方法。
６２. 癌が転移性癌、難治性癌または再発性癌である、態様６０または６１に記載の方法。
６３. １以上のさらなる治療剤を投与することをさらに含む、態様５６〜６２のいずれかに記載の方法。
６４. さらなる治療剤が抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ−３抗体、ＣＴＬＡ−４抗体またはＰＤ−Ｌ１抗体である、態様６３に記載の方法。
６５. サンプルと態様１〜４２の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分を、抗体またはその抗原結合部分とＧＩＴＲの複合体を形成させる条件下で接触させ、複合体の形成を検出することを含む、サンプル中のグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)の存在を検出する方法。
６６. ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２アイソタイプではない少なくとも一つのＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む修飾重鎖定常領域を含む単離抗ＧＩＴＲ抗体であって、抗ＧＩＴＲ抗体が非ＩｇＧ２ヒンジ以外同一である抗ＧＩＴＲ抗体よりも増強されたアゴニスト活性を有するものである、単離抗ＧＩＴＲ抗体。
６７. 修飾重鎖定常領域が配列番号２２３〜２２６および２８３〜２９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域またはそれらと異なるのが多くて５アミノ酸であるもしくは配列番号２２３〜２２６および２８３〜２９０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域を含む、態様６６に記載の単離抗ＧＩＴＲ抗体。
６８. 重鎖が配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれと最大１０アミノ酸異なるかまたは配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖である、態様６７に記載の単離抗ＧＩＴＲ抗体。
本開示を、次の実施例によりさらに説明し、これは、さらなる限定と解釈してはならない。本出願において引用される全ての図面および全ての引用文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および特許公開公報を、引用により明示的に本命最初に包含させる。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ０９／０４５９５７号、ＷＯ０９／０７３５３３号、ＷＯ０９／０７３５４６号、ＷＯ０９／０５４８６３号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７２９１８号および米国特許公開２０１１／０１５０８９２号の内容を、引用により本明細書に明示的に包含させる。
実施例１：種々の抗ＧＩＴＲ抗体の産生
ヒト抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体を、ＨｕＭＡｂ(登録商標)トランスジェニックマウス(“ＨｕＭＡｂ”は、Medarex, Inc., Princeton, New Jerseyの商標である)のＨｃｏ７、Ｈｃｏ２７、Ｈｃｏ２０、Ｈｃｏ１２、Ｈｃｏ１７およびＨｃ２系統およびＫＭマウス(ＫＭマウス(登録商標)系統は、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８号に記載のようにＳＣ２０導入染色体を含む)で産生した。ＨＣ２／ＫＣｏ２７ ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスを、米国特許５,７７０,４２９号および５,５４５,８０６号に記載のように産生しており、その全開示を引用により本明細書に包含させる。
７遺伝子型のトランスジェニックマウス(ＫＭ、Ｈｃｏ７、Ｈｃｏ２７、Ｈｃｏ２０、Ｈｃｏ１２、Ｈｃｏ１７およびＨｃ２)を含む計９４マウスを、種々の免疫化戦略で免疫化した(異なる抗原、異なる用量、期間、投与経路(足蹠(ｆｐ)、腹腔内(ｉｐ)および皮下(ｓｃ)およびアジュバント(ＣＦＡ／ＩＦＡ、Ｒｉｂｉおよび抗体)など)。５４マウスからの３６融合を実施し、スクリーニングした。１５７抗体がこれらの３６融合から同定され、さらなる特徴付けにより、２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７、１４Ｅ３、１９Ｈ８および６Ｇ１０として命名した抗体を含む、特に興味深い抗体の単離に至った。
ｃＤＮＡ配列決定は、抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｄ１０、２Ｇ６、８Ａ６、１４Ｅ３および６Ｇ１０の各々について１重鎖および１軽鎖および抗体３Ｃ３、９Ｇ７および１９Ｈ８の各々について１重鎖および１軽鎖(軽鎖１または“Ｌ１”および軽鎖２または“Ｌ２”)を同定した。タンパク質分析により、単一軽鎖が抗体３Ｃ３および９Ｇ７について同定され、Ｎ末端配列決定および分子量決定により、それが３Ｃ３について軽鎖Ｌ１および９Ｇ７について軽鎖Ｌ２であることが示された。抗体１９Ｈ８に関して、ハイブリドーマにより発現された抗体の９３％が軽鎖Ｌ１を含み、３％が軽鎖Ｌ２を含んだ。抗体３Ｃ３−１および３Ｃ３−２は、それぞれ軽鎖Ｌ１およびＬ２を伴う抗体３Ｃ３に対応する。抗体９Ｇ７−１および９Ｇ７−２は、それぞれ軽鎖Ｌ１およびＬ２を伴う抗体９Ｇ７３に対応する。抗体１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２は、それぞれ軽鎖Ｌ１およびＬ２を伴う抗体１９Ｈ８に対応する。３抗体の各々の軽鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を表１１に提供する。
抗体２８Ｆ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０、３Ｃ３(３Ｃ３−１および３Ｃ３−２)、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７(９Ｇ７−１および９Ｇ７−２)、１４Ｅ３、１９Ｈ８(１９Ｈ８−１および１９Ｈ８−２)および６Ｇ１０の可変領域アミノ酸配列およびアイソタイプを図２〜３１に示す。各抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸およびヌクレオチド配列を表１１に提供する。２８Ｆ３の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列配列番号１５および１６からなる。１９Ｄ３の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列配列番号２８および２９からなる。１８Ｅ１０の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列配列番号４１および４２からなる。３Ｃ３の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列配列番号５５および５６からなる。２Ｇ６の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列配列番号７３および７４からなる。８Ａ６の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列配列番号８６および８７からなる。９Ｇ７の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列配列番号１００および１０１からなる。１４Ｅ３の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列配列番号１１７および１１８からなる。１９Ｈ８−１の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列配列番号１３１および１３２からなる。１９Ｈ８−２の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列配列番号１３１および１３３からなる。６Ｇ１０の重鎖および軽鎖はアミノ酸配列３３７および３３８からなる。これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を表１１に提供する。
実施例２：活性化ヒトおよびｃｙｎｏ Ｔ細胞への抗ＧＩＴＲ抗体の結合
実施例１において産生したヒトモノクローナル抗ＧＩＴＲ抗体を、表面上にＧＩＴＲを発現する活性化ヒトおよびｃｙｎｏ Ｔ細胞への結合について試験した。
ヒトまたはカニクイザルから単離した末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、プレート被覆抗ＣＤ３抗体(クローン：ヒトＴ細胞活性化用にＵＣＨＴ１；クローン：カニクイザルＴ細胞活性化用にＳＰ３４；両者ともBD Biosciences)および可溶性抗ＣＤ２８抗体(クローン：ヒトおよびカニクイザル両者用にＣＤ２８.２、BD Biosciences)で４日(ヒト)／または５日(カニクイザル)活性化させた。細胞を、フィコエリトリン(ＰＥ)コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体(Jackson ImmunoResearch)を使用する蛍光活性化セルソーティング(ＦＡＣＳ)ベースのアッセイにおいてＧＩＴＲ ｍＡｂ結合について試験した。サンプルを、BD FACS Canto Flow Cytometerで分析した。
抗ＧＩＴＲ抗体３Ｃ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および２８Ｆ３は活性化ヒトおよびカニクイザルＴ細胞両者に結合した。図３２に示すように、抗体３Ｃ３、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および２８Ｆ３は、それぞれ、０.０４９１６nM、０.３６３３nM、０.１４６１nMおよび０.１９１６nMのＥＣ５０値に反映されるように、活性化ヒトＴ細胞に強く結合した。同様に、抗体１８Ｅ１０および２８Ｆ３は、１８Ｅ１０および２８Ｆ３それぞれのＥＣ５０値０.９１３４nMおよび１.０４４nMで、活性化カニクイザルＴ細胞に結合した(図３３)。３Ｃ３はカニクイザルＴ細胞に顕著に結合しなかった。
実施例３：抗ＧＩＴＲ抗体の可溶性ＧＩＴＲへの結合
抗ＧＩＴＲ抗体の可溶性ＧＩＴＲへの結合をＢｉａｃｏｒｅにより測定した。抗ＧＩＴＲ抗体を、ヒトカッパ被覆チップ(〜５ＫＲＵｓ；Southernbiotech cat#2060-01)に捕獲し、組み換えヒトＧＩＴＲ(ｒＨＧＩＴＲ／Ｆｃ：R&D systems, CAT#689-GR)を、５００nM、２５０nM、１２５nM、６２nMおよび３１nMの濃度でチップを流した。ｍＡｂ／体積の捕獲濃度は２〜４０μg／mL(１０μL／分で５μL)であった。抗原結合時間は、１５μL／分で５分であり、抗原解離時間は６分であり、５０mM ＨＣｌ／５０mM ＮａＯＨ(１００μL／分で各１２μL)を用いて再生を実施した。２８Ｆ３およびいくつかの他の抗ＧＩＴＲ抗体で得られた結果を表５に示す。
結果は、抗ＧＩＴＲ抗体が可溶性ＧＩＴＲに１.２×１０−８〜３.５×１０−８Ｍの範囲のＫＤで結合することを示す。データは、３Ｃ３の２サブクローンについても提供され、１.３３×１０−８〜１.４４×１０−８Ｍの範囲のＫＤである。
別のＢｉａｃｏｒｅ実験において、３個の異なる定常領域と共に２８Ｆ３の可変領域を有する抗体の結合特徴を決定した。第一の２８Ｆ３抗体は野生型ＩｇＧ１定常領域(“ｇ１ｆ”、“ｇ１”または“ＩｇＧ１”または“ＩｇＧ１ｆ”とも称す；配列番号１７を有する重鎖および配列番号１９を有する軽鎖)。接尾辞“ｆ”はアロタイプを指す。第二の抗体は、Ｆｃ領域に３変異を有するエフェクターレスＩｇＧ１定常領域を有する(Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａを有する、“ｇ１.１ｆ”、“ｇ１.１”、“ＩｇＧ１.１”および“ＩｇＧ１.１ｆ”とも称する；配列番号１８を有する重鎖および配列番号１９を有する軽鎖)；および第三の２８Ｆ３抗体は、Ｎ２９７Ａ変異を有するＩｇＧ１定常領域を有する。
Ｂｉａｃｏｒｅ実験を、チップを抗ＣＨ１(Invitrogen Ref# 054500)で被覆した以外、上記のとおり実施した。表６に示す結果は、全３抗体が類似の結合特徴を有し、３.９３×１０−８Ｍ〜４.３９×１０−８Ｍ範囲のＫＤを有することを示す。
実施例４：抗ＧＩＴＲ抗体の活性化ヒトＴ細胞および３Ａ９−ｈｕＧＩＴＲ細胞に対する結合親和性
活性化ヒトＴ細胞および異所性にヒトＧＩＴＲを発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株(３Ａ９−ｈＧＩＴＲ)上のＧＩＴＲに対する抗ＧＩＴＲ抗体の結合を、スキャッチャード分析により決定した。このアッセイを、２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１(重鎖について配列番号１８および軽鎖について配列番号１９)で４.５９mg／mLで実施した。
活性化ヒトＴ細胞上のスキャッチャード分析を、次のとおり実施した。ヒトドナーから得たＴ細胞を培養培地(１０％ＦＢＳ、２mM Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール添加ＲＰＭＩ)で１回洗浄し、１μg／mL抗ＣＤ２８(ＣＤ２８.２、BD#555725)および１００Ｕ／mL ＩＬ−２(Peprotech#200-02)を添加した同じ培養培地に１０６細胞／mLで再懸濁した。各５×１０６細胞を、２０μg抗ＣＤ３(５mL、４μg／mL、一夜、４℃；UCHT-1, BD#555329)で被覆した６ウェルプレートの３ウェルに播種した。細胞を３日、３７℃でインキュベートし、これらの細胞の半分をスキャッチャード分析(“３日目”分析)に使用した。残りの半分の使用済み培地を５mLの新鮮培地に置き換え、細胞をもう１日インキュベートし、その後これらの細胞でのスキャッチャード分析(“４日目”分析)に使用した。
スキャッチャード分析に関して、２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１を、１２５Ｉ−Ｎａ(Perkin Elmer # NEZ033H001MC(１mCi))で、IODO-GEN(登録商標)固相ヨウ素化試薬(１,３,４,６−テトラクロロ−３ａ−６ａ−ジフェニルグリコールウリル；Pierce #28601)を使用して放射性ヨウ素化した。過剰のヨウ素を、脱塩カラム(Pierce #43243)を使用して除去した。標識抗体のフラクションを回収し、放射活性をWizard 1470ガンマカウンター(Perkin-Elmer)で分析した。各フラクションの１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１濃度を、InvitrogenのＱｕｂｉｔTM蛍光光度計で計算した。放射性純度を、ピークタンパク質および放射性フラクションの薄層クロマトグラフィーにより確立した(Pinestar Technology #151-005)。
活性化ヒトＴ細胞への放射性ヨウ素化２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１結合を、活性化ヒトＴ細胞とタイトレーションの１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１のインキュベーションにより証明した。非特異的結合を、１００倍モル濃度過剰の非標識抗体のタイトレーションの存在下の結合により決定し、特異的結合を計算するために総ＣＰＭから減算した。１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１濃度対ＣＰＭの直線状標準線を使用して、最大nM結合１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１を外挿し、それにより細胞あたりの受容体数を計算した。３日目の刺激ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞あたりのヒトＧＩＴＲ分子数は約８,４００、４日目は約１３,２００であった。スキャッチャード分析の結果は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１が、３日間刺激したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に０.７nMのＫＤで、そして４日間刺激したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に０.８７nMのＫＤで特異的に結合することを示す。
３Ａ９−ｈｕＧＩＴＲ細胞への放射性ヨウ素化２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１結合を、３Ａ９−ｈｕＧＩＴＲ細胞とタイトレーションの１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１のインキュベーションにより証明した。非特異的結合を、１００倍モル濃度過剰の非標識抗体のタイトレーションの存在下の結合により決定し、特異的結合を計算するために総ＣＰＭから減算した。１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１濃度対ＣＰＭの直線状標準線を使用して、最大nM結合１２５Ｉ−２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１を外挿し、それにより細胞あたりの受容体数を計算した。３Ａ９−ｈｕＧＩＴＲ細胞あたりのヒトＧＩＴＲ分子数は約１８０,０００であった。スキャッチャード分析の結果は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１が、０.５nMのＫＤで３Ａ９−ｈｕＧＩＴＲ細胞に特異的に結合することを示す。
他の実験において、２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１の、ヒトおよびｃｙｎｏドナーからの活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を決定した。ヒトおよびｃｙｎｏ ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をヒトおよびｃｙｎｏドナーから単離し、活性化のために抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で処理した。結果は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８.ＩｇＧ１.１が、それぞれ０.５５nMおよび０.６７nMのＥＣ５０で活性化ヒトＣＤ４＋細胞に同様に結合し、活性化ヒトＣＤ８＋細胞にそれぞれ０.５６nMおよび０.６５nMのＥＣ５０で同様に結合することを示す。２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８.ＩｇＧ１.１は、それぞれ１nMおよび０.８６nMのＥＣ５０で活性化ｃｙｎｏ ＣＤ４＋細胞に同様に結合し、それぞれ１.２６nMおよび０.７４nMのＥＣ５０で活性化ｃｙｎｏ ＣＤ８＋細胞に同様に結合する。
実施例５：ヒトモノクローナル抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲへの結合を阻害する
ＨｕＭａｂ抗ＧＩＴＲ抗体がＧＩＴＲリガンドのＧＩＴＲへの結合を阻害するか否か決定するために、異所性にヒトＧＩＴＲを発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株(ＧＩＴＲ−３Ａ９細胞)を、１０−４μg／mL〜１００μg／mLの濃度範囲のＧＩＴＲ ｍＡｂとプレインキュベートし、続いて、１０ng／mL濃度のＧＩＴＲリガンド(R&D Systems#6987-GL)とインキュベートした。細胞上のＧＩＴＲリガンドの結合を、ＰＥコンジュゲート抗ヘマグルチニン(ＨＡ)標識抗体を使用するＦＡＣＳベースのアッセイで決定し、サンプルを、BD FACS Canto Flow Cytometerで分析した。図３４Ａおよび３４Ｂに示すように、これらの条件下、抗体１９Ｄ３、２８Ｆ３およびＧＩＴＲ.３(３Ｃ３)は、全てＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲ−３Ａ９細胞への結合を遮断し、それぞれ０.７５４６、０.２７８３および０.０６９３４のＥＣ５０値であった。抗体１９Ｈ８で同様の結果が得られた。
他の一連の実験を異なる条件下で実施し、さらに抗ＧＩＴＲ抗体がＧＩＴＲへのＧＩＴＲ−Ｌ結合を遮断する程度を評価した。これらの実験において、１.０６×１０−９〜１００mg／ml濃度の可溶性組み換えｈＧＩＴＲ−Ｌ三量体を活性化ヒトＴ細胞に添加し、０.０１６μg／mlのＥＣ５０値でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に用量依存的様式で結合した(図３４Ｃ)。実験を次のように実施した。１.０６ｅ−９〜１００μg／mL濃度の組み換えｈＧＩＴＲ−Ｌ三量体(R&D Systems Cat. 6987-GL)をＰＨＡ活性化Ｔ細胞に添加した。３０分の一次インキュベーション後、細胞結合ＧＩＴＲ−Ｌを、ＰＥコンジュゲート抗ＨＡ標識(Miltenyi Cat. 120-002-687)を使用して検出した。サンプルをFACS Canto Flow Cytometer(BD, San Jose)に取得し、Flowjoソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)で分析した。
１.０６×１０−９〜１００μg／ml濃度のｒｈＧＩＴＲ−Ｌの活性化Ｔ細胞への前結合は、０.５μg／ml ２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１(約９０％の飽和度)の続く結合を、０.００２４μg／mlのＩＣ５０で遮断した。１００μg／mlでＭＦＩがベースライン(ＩｇＧ対照)にに行かなかったため、阻害は部分的であった(図３４Ｄ)。実験を次のように実施した。ＰＨＡ活性化Ｔ細胞を、まず、１００μg／mLから開始する、２４点、３倍タイトレーションの組み換えＧＩＴＲ−Ｌ三量体(R&D Systems 6987-GL)で、３０分処理した。２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１を、続いて０.５μg／mLの固定濃度で細胞混合物に添加し、これをさらに３０分インキュベーションした。細胞結合２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１を、ヒトＩｇＧ Ｆｃに対するＰＥコンジュゲート二次抗体(Jackson ImmunoResearch Cat. 109-116-098)を使用して検出した。無関係のｈＩｇＧ１ Ａｂを２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１のアイソタイプ対照として使用し、一方ＧＩＴＲ−Ｌのプレインキュベーション無しのサンプルを、遮断しないときの２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１の結合を示すために、包含させた。サンプルをFACS Canto Flow Cytometer(BD, San Jose)に取得し、Flowjoソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)で分析した。
活性化Ｔ細胞を１.０６×１０−９〜１００μg／ml濃度範囲の２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１ととプレインキュベートしたとき、０.６μg／ml(約９０％飽和)でのＧＩＴＲ−Ｌの結合は影響を受けなかった(図３４Ｅ)。しかしながら、ＧＩＴＲ−Ｌを、そのＥＣ５０付近の２０ng／mlの低濃度で添加したとき、その結合は、予め結合させた２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１により部分的に遮断され、０.０７６mg／mlのＩＣ５０であった(図３４Ｆ)。実験を次のとおり行った。ＰＨＡ活性化Ｔ細胞を、０.０００５６〜１００μg／mLの濃度範囲で２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１とプレインキュベートし、続いて０.６μg／mlまたは２０ng／mL ＧＩＴＲ−Ｌを添加した。細胞結合ＧＩＴＲ−ＬをＰＥコンジュゲート抗ＨＡ標識で検出した。無関係のｈＩｇＧ１を２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１のアイソタイプ対照として包含させ、一次抗体なしのサンプルを、遮断しないときのＧＩＴＲ−Ｌの結合を示すために使用した。サンプルをFACS Canto Flow Cytometer(BD, San Jose)に取得し、Flowjoソフトウェア(Tree Star, Inc, Ashland, OR)で分析した。
これらのデータは、２８Ｆ３−ｈＩｇＧ１が部分的リガンドブロッカーであり、これは、ＧＩＴＲ−ＬによるＧＩＴＲのいくぶんかのインビボ結合を可能とし得る。
実施例６：全抗ＧＩＴＲ抗体は一群のビンに入れられる
抗体ビニング実験を、次の抗ヒトＧＩＴＲ抗体で実施した：２８Ｆ３、１８Ｅ１０、１９Ｄ３、１４Ｅ３、８Ａ６、９Ｇ７、３Ｃ３および６Ｇ１０。
抗ＧＩＴＲ抗体を、Sensor Chip CM5チップ(Series S, GE Healthcare CAT# BR-1005-30)表面、フローセル２、フローセル３およびフローセル４(５０００RU)に固定化し、フローセル１を陰性対照として使用した。抗体を、出発濃度において１２０μg／mL(２×)に希釈した。一連の希釈を、力価測定曲線を得るために、８の異なる濃度(１２０μg／ml〜０.０μg／ml、２×)に抗体の１：３濃度に緩衝液で希釈することにより製造した。各抗体濃度シリーズを２分割した。濃度シリーズの最初の半分において、４０nM(２×)ＧＩＴＲ抗原(ｒＨＧＩＴＲ／Ｆｃ CAT# 689-GR)を添加して、各ウェルにおける最終濃度シリーズ(６０μg／ml〜０.０μg／ml)および２０nMの最終抗原濃度を得た。濃度シリーズの２番目の半分において、抗原の代わりに、緩衝液を添加して抗体を同じ濃度に希釈し、この半分をブランクとして処理した。複合体を２時間インキュベートした。４０μL 複合体を、抗体被覆表面に３０μL／分流速で注入した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を使用し、ランニング緩衝液は、ＨＢＥ−ＥＰ、GE Healthcare CAT# BR-1001-88、濾過脱気、０.０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、０.１５ ＮａＣｌ、３Ｍｍ ＥＤＴＡ、０.００５％界面活性剤Ｐ２０であった。表面を、２５mM ＮａＯＨ(注文番号：BR-1003-58, GE Healthcare)を、１００μL／分で５秒用いて再生した。データを、Microsoft Excelを使用して分析し、そこで、抗体の濃度シリーズを対応する応答単位に対してプロットし、力価測定曲線を得た。
結果は、全ての抗体は一群のビンに入れられることを示し、それらは、全て、ヒトＧＩＴＲの細胞外領域の類似領域に結合することを示す。
実施例７：抗ＧＩＴＲ抗体は立体エピトープに結合する
この実施例は、抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３および３Ｃ３が非変性ヒトＧＩＴＲに結合するが、変性ヒトＧＩＴＲに結合せず、結合がＮまたはＯ結合グリコシル化により影響されないことを示す。
Ｎ結合グリコシル化を有するまたは有しない未変性または変性ＧＩＴＲに対する抗ＧＩＴＲ抗体の結合を、次のように決定した。未変性(すなわち、変性していない)および変性ヒトＧＩＴＲのサンプルを、酵素Ｎ−グリカナーゼＰＮＧａｓｅ Ｆと、３７℃でＰＢＳ中一夜インキュベートしてＮ−グリコシル化を除去するかまたは酵素非存在下でインキュベートした。ＧＩＴＲの変性を、３７℃で５０mM ジチオスレイトール および４Ｍ 塩酸グアニジンにより４５分還元させ、続いて、２０分、室温で１００mM ヨードアセトアミドでのアルキル化により行った。Ｎ結合グリコシル化を伴うまたは伴わない未変性ヒトＧＩＴＲのサンプルをＳＤＳゲル電気泳動に付し、Ｎ結合グリコシル化を伴うまたは伴わない変性ＧＩＴＲのサンプルを変性ＳＤＳゲル電気泳動に付した。タンパク質を、ウェスタンブロット分析用ニトロセルロース膜に移した。膜を２８Ｆ３抗体とインキュベートした。抗ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖に特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートした(ＨＲＰ標識)二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)とインキュベーションし、続いてフィルムに捕獲された発光検出により、結合を検出した。図３５に示す結果は、抗ＧＩＴＲ Ａｂ ２８Ｆ３が未変性ＧＩＴＲにのみ結合し、変性形態には結合せず、グリコシル化の存在または不在は結合に影響しないことを示す。抗ＧＩＴＲ抗体３Ｃ３で同様の結果が得られた。
それゆえに、抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３および３Ｃ３は、立体構造的であるエピトープに結合し、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化と無関係である。
実施例８：未変性ヒトＧＩＴＲペプチドへの２８Ｆ３および３Ｃ３の結合パターン
２８Ｆ３および３Ｃ３のヒトＧＩＴＲへの結合パターンを、これらの抗体の未変性ヒトＧＩＴＲから産生したペプチドへの結合をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により試験することにより調査した。実験を、次のとおり実施した。まず、未変性ヒトＧＩＴＲを、変性剤非存在下、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−ＣまたはエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎと２％ｗ／ｗ比で、３７℃でＰＢＳ中５時間インキュベーションすることによりタンパク質分解に付した。全反応混合物、各消化から２μgを次いで非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に付し、ウェスタンブロット分析用ニトロセルロースに移した。ウェスタンブロットを２８Ｆ３または３Ｃ３抗体とインキュベートし、抗ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖に特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした(ＨＲＰ標識)二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)とインキュベーションし、続いてフィルムに捕獲された発光検出により、結合を検出した。図３６に示す結果は、２８Ｆ３と３Ｃ３の結合パターンが異なることを示し、これらの抗体がヒトＧＩＴＲの正確に同じ領域に結合しないことを示唆する。
実施例９：抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３は、ヒトＧＩＴＲの細胞外ドメインのＮ末端に結合する
２８Ｆ３が結合するヒトＧＩＴＲ上の領域の位置を、種々の非変性ヒトＧＩＴＲのフラグメントに対する抗体の溶液における結合を試験することにより決定した。実験を次のように実施した。ヒトＧＩＴＲペプチドフラグメントを、変性剤非存在下、ヒトＧＩＴＲとエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−ＣまたはエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎを、２％ｗ／ｗ比で３７℃でＰＢＳ中５時間インキュベーションすることにより産生した。ペプチド混合物を、次いで抗ＧＩＴＲ ＡｂビーズとＰＢＳ中、室温で２時間インキュベートした。いくつかのサンプルを、ＰＢＳ中、１時間、異なる酵素とインキュベーションすることによりインサイチュ二次性開裂に付した。非結合ペプチドを、抗ＧＩＴＲ ＡｂビーズをＰＢＳで２回洗浄することにより除去した。抗ＧＩＴＲ Ａｂ ２８Ｆ３に結合したペプチドを２％ギ酸で溶出し、次いでＬＣ−ＭＳによる配列同定に付した。図３７にヒートマップとして示す結果は、２８Ｆ３が次のＮ末端アミノ酸ストレッチ：
ＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥ(配列番号２１５)(これは成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のアミノ酸残基１〜３９に対応)
または短いフラグメントＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲ(配列番号３７０)
内の立体エピトープに結合することを示す。
実施例１０：ヒトＧＩＴＲ上のＯ結合グリコシル化は２８Ｆ３の結合を妨害しない
ヒトＧＩＴＲの細胞外ドメイン上のＯ結合グリコシル化は知られておらずまたは実証されていない。しかしながら、配列番号２１５の残基Ｔ１８およびＴ２０は、Ｏ−グリコシル化コンセンサス配列を含む。これらの残基を、エピトープ配列において下線を引く：
ＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥ(配列番号２１５)。それゆえに、Ｏ結合グリコシル化が２８Ｆ３のヒトＧＩＴＲへの結合に影響するか否かを決定した。
２８Ｆ３の、配列番号２１５からなるグリコシル化または非グリコシル化ペプチドへの結合を次のように実施した。ヒトＧＩＴＲの部分的にグリコシル化されたおよび非グリコシル化Ｎ末端ペプチドを、マウスＦｃに結合したインタクト未変性ヒトＧＩＴＲ細胞外ドメインのタンパク質分解により産生した。配列番号２１５のアミノ酸残基１〜３９からなる非グリコシル化ＧＩＴＲペプチドも有機合成により産生した。２８Ｆ３をペプチドに結合させる方法は、先の部分に記載した(２８Ｆ３被覆ビーズを使用)。図３８Ｂに示すように、２ペプチドは２８Ｆ３被覆ビーズに結合することが判明し、これらは、ＬＣ−ＭＳによりＯ結合グリコシル化無しのＮ末端ペプチド(図３８Ａ)および配列番号２１５のＴ１８および／またはＴ２０にＯ結合グリコシル化を有する同じＮ末端ペプチドであるとして道程された(図３８Ｄ)。
それゆえに、２８Ｆ３は、アミノ酸Ｔ１８および／またはＴ２０上にＯ結合糖を有するか否かに関わらず、ヒトＧＩＴＲのＮ末端領域に結合する。
実施例１１：抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の２０量体への結合
先の実施例に記載した実験の一部として、Ｏ結合グリコシル化をいずれも有しない配列番号２１５を有する合成ペプチドを、最初に２８Ｆ３被覆ビーズに結合させ、さらにエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎを用いるインサイチュ消化により開裂させた。アミノ酸配列ＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１６)からなり、Ｏ結合グリコシル化を有しないアミノ酸残基Ｔ１８およびＴ２０を含む残存ペプチドは、２８Ｆ３に結合した(図３８Ｅ)。それゆえに、２８Ｆ３は、配列番号２１６からなる２０量体に結合する。
実施例１２：ＨＤＸ−ＭＳによるエピトープマッピング
水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)法は、溶液中のタンパク質構造および立体構造的動態を、主鎖アミド水素原子の重水素交換の速度および程度をモニタリングすることにより探索する。ＨＤＸレベルは、主鎖アミド水素原子およびタンパク質水素結合の溶媒到達性による。ＨＤＸによるタンパク質質量増加を、ＭＳにより厳密に測定できる。この方法を酵素消化と組み合わせたとき、ペプチドレベルでの構造特性が解決され、内側に折りたたまれているものから表面に露出されているペプチドを区別することが可能となる。一般に、重水素標識および続くクエンチング実験、その後オンラインペプシン消化、ペプチド分離およびＭＳ分析を実施する。
ＨＤＸ−ＭＳによるＧＩＴＲにおける２８Ｆ３.ＩｇＧ１ ｍＡｂ(それぞれ配列番号１７および１９からなる重鎖および軽鎖を有する)のエピトープマッピング前に、非重水素化実験を実施して、組み換えヒトＧＩＴＲ／Ｆｃ(R&D systems、１０μM、アミノ酸置換Ｔ２０Ａを含む)および組み換えヒトＧＩＴＲ／Ｆｃと２８Ｆ３.ＩｇＧ１ ｍＡｂのタンパク質複合体(１：２モル濃度比、１０μMおよび２０μM)の共通消化性ペプチドの一覧を作成し、ＧＩＴＲ Ｎ末端領域について８６％の配列包括度を達成した(図３９Ａ)。この実験において、１０mM リン酸緩衝液(ｐＨ７.０)を標識工程中使用し、続いてクエンチング緩衝液(４Ｍ ＧｄｎＣｌおよび０.５Ｍ ＴＣＥＰ含有２００mM リン酸緩衝液、ｐＨ２.５、１：１、ｖ／ｖ)を添加した。エピトープマッピング実験のために、５μLの各サンプル(ＧＩＴＲ／ＦｃまたはＧＩＴＲ／Ｆｃと２８Ｆ３.ＩｇＧ１ ｍＡｂ(１：２モル濃度比))を、５５μLのＤ２Ｏ緩衝液(１０mM リン酸緩衝液、Ｄ２Ｏ、ｐＤ７.０)で希釈し、標識反応を室温で開始させた。反応を、種々の時間行った：２０秒、１分、１０分、６０分および２４０分。各標識反応時間の終了時、反応をクエンチング緩衝液(１：１ ｖ／ｖ)の添加により終結させ、５０μLの反応停止サンプルを分析のためにWaters HDX-MSシステムに注入した。観察される共通消化性ペプチドを、２８Ｆ３.ＩｇＧ１ ｍＡｂの非存在下／存在下に重水素取り込みレベルについてモニターした。
ＧＩＴＲにおける２８Ｆ３.ＩｇＧ１ ｍＡｂのＨＤＸ−ＭＳ測定から得た図３９Ｂおよび３９Ｃに示す実験データは、２８Ｆ３.ＩｇＧ１ ｍＡｂが、ＧＩＴＲ Ｎ末端領域における２ペプチド領域からなる(またはその中にある)不連続エピトープを有することを示す：
ペプチド領域１：ＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＡ(配列番号２１７)
ペプチド領域２：ＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)
相対的重水素取り込みレベルの変化に基づき、２ペプチド領域は、領域１＞２としてランク付けでき、領域１が重水素取り込みにおける最も有意な変化を有し、領域２は統計的有意である。
実施例１３：抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｔ細胞からのＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を誘発する
抗ＧＩＴＲ抗体を、抗体とインキュべートしたＴ細胞により分泌されるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの量を測定することにより、インビトロでＴ細胞活性を増強する能力について試験した。
異所性にヒトＧＩＴＲを発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株(３Ａ９−ｈＧＩＴＲ)を、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および２８Ｆ３抗体の存在量を増やしながら、抗ＣＤ３モノクローナル抗体被覆プレートで培養した。５×１０４ ３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を、１μg／ml抗ＣＤ３抗体(クローン１４５−２Ｃ１１；BD Biosciences)で被覆したプレートで培養し、記載する濃度の抗体で２４時間処理した。図４０に示すように、抗体３Ｃ３(ＧＩＴＲ.３)、２８Ｆ３、１９Ｄ３および１８Ｅ１０は、Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を全て用量依存的様式で増強した。予想通り、対照ｈＩｇＧ１およびｈＩｇＧ２抗体は３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を増加させなかった。
刺激性ＣＤ３シグナル存在下の３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からの抗ＧＩＴＲ抗体増強ＩＬ−２分泌を考慮して、抗体が特異的抗原により活性化された３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を増強する能力を試験した。５×１０４ ３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を、０.４μM ＨＥＬ４８−６３ペプチドおよび記載する抗体の存在下、２.５×１０４ ＬＫ３５.２抗原提示細胞と２４時間共培養した。図４１Ａおよび４１Ｂに示すように、抗体１８Ｅ１０、１３Ｈ２(２８Ｆ３と同じ抗体)、２８Ｆ３、３Ｃ３および１９Ｄ３は、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を用量依存的様式で増強した。
さらなる実験において、Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌に対する２８Ｆ３の効果を、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ(ＯＫＴ３)発現ＣＨＯ細胞で刺激したヒトドナーＴ細胞で試験した。ＣＨＯ細胞は、抗ＧＩＴＲ抗体によるアゴニズムの観察が可能となる最適以下の刺激を促進するために低レベルのＯＫＴ３を発現した。ある一連の実験において、ドナーからのＣＤ３＋Ｔ細胞をＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および抗ＧＩＴＲ抗体で刺激し、ＩＦＮ−γ分泌を測定し、第二の一連の実験において、２ドナー(ＣＤ３＋Ｔ細胞のドナーと異なる)からのＣＤ４＋Ｔ細胞をＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および抗ＧＩＴＲ抗体で刺激し、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を測定した。実験を次のように行った。汎Ｔ細胞を、業者のプロトコールに従い汎Ｔ細胞単離キット(Miltenyi#130-091-156)でフィコール勾配(Amersham Bioscience 17-1440-03)から単離したヒトＰＢＭＣから得た。ＣＤ４＋Ｔ細胞での実験のために、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、業者のプロトコールに従いRosetteSepヒトＣＤ４＋Ｔ細胞富化カクテル(StemCell Technology#15062)を用いてヒトＰＢＭＣ(ドナー１および２)から得た。抗ＣＤ３ｓｃＦｖ(ＯＫＴ３)を発現するＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−ＯＫＴ３)をＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、５０K Radの線量での照射に付した。細胞を回収し、培養培地(１０％ウシ胎児血清、２mM Ｌ−グルタミン、５５ｎＭ β−メルカプトエタノール、１mM ピルビン酸ナトリウムおよび１００Ｕ／mLペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ−１６４０)に２.５×１０５／mLで再懸濁した。２.５×１０４ ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞および１×１０５ Ｔ細胞を、９６ウェルＴＣグレード平底プレート(Costar)のウェルあたりに播種した。２０μg／mLから出発する８点、３倍タイトレーションのＧＩＴＲ抗体と共に細胞をインキュベートした。無関係のｈＩｇＧ１を、アイソタイプ対照として２０μg／mLで添加した。細胞のみのサンプルを、何ら処置しないベースライン活性を示すために包含させた。各サンプルからの上清を、ＩＬ−２測定のために２日目(ＣＤ４＋Ｔ細胞でのアッセイのみ)(BD opt EIAヒトＩＬ−２ ＥＬＩＳＡキット；BD Bioscience#555190)およびＩＦＮ−γ測定のために３日目(BD optEIA human IFN-g ELISA Kit；BD Bioscience#555142)に回収した。
図４２Ｂ〜Ｅに示す結果は、両ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌の２８Ｆ３用量依存性増加を示す。
他の抗ＧＩＴＲ抗体で刺激されたドナーＴ細胞によるＩＦＮ−γの分泌も示された。アッセイを上記のように行った。図４２Ａに示すように、抗体２８Ｆ３、３Ｃ３、１９Ｄ３および１８Ｅ１０は、ＣＤ３＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を、全て用量依存的様式で増強し、抗体２８Ｆ３および３Ｃ３が試験抗体の最大効果を示した。
他の実験において、抗ＧＩＴＲ抗体、特に、２８Ｆ３存在下のＴ細胞増殖が、混合リンパ球反応(ＭＬＲ)において観察された。
集合的に、これらのデータは、抗体１８Ｅ１０、１９Ｄ３および２８Ｆ３が、Ｔ細胞からのサイトカイン分泌を増強するアゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体として機能することを示す。
実施例１４：抗ＧＩＴＲ抗体は、インビトロでＦｃＲ相互作用と無関係にＴ細胞応答を活性化する
インビボ活性のために、アゴニスト的抗ＴＮＦＲ抗体が、ＦｃγＲIIＢ共結合を必要とすることが報告されている(Li et al., Cell Cycle 2012;11:3343-3344)。この要求が抗ＧＩＴＲ抗体に及ぶか否かを決定するために、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を、実施例１３に記載のようにＬＫ３５.２細胞およびＨＥＬ４８−６３ペプチドと共培養し、完全長抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３(ｈＩｇＧ２)、２８Ｆ３のＦ(ａｂ’)２フラグメントまたは２８Ｆ３のＦａｂフラグメントで処理し、ｍＩＬ−２産生について評価した。図４３に示す結果は、完全長２８Ｆ３および２８Ｆ３のＦ(ａｂ’)２フラグメントの両者がｍＩＬ−２産生を増強するが、２８Ｆ３のＦａｂフラグメントは弱い効果を有し、一価結合ではなく、二価結合が、抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３の効果に貢献していることを示唆する。これらの結果は、集合的に、ＦｃγＲIIＢ共結合が、インビトロでのアゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体Ｔ細胞増強効果に必要ではないが、ＦｃγＲIIＢ受容体の結合がアゴニスト活性を増強させ得ることを示唆する。抗ＧＩＴＲ抗体を、アゴニズムを増強させるために、ＦｃγＲIIＢ受容体への結合が増加するように操作できる。
実施例１５：抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３はヒト扁桃におけるリンパ球を標識する
どの組織がＧＩＴＲを発現するか決定するために、種々の組織におけるＧＩＴＲの免疫組織化学的検出のために抗ＧＩＴＲ抗体２８Ｆ３を使用した。非リンパ系組織における特異的染色は見られなかった(心臓、肝臓、肺、腎臓、皮膚、末梢神経、甲状腺、精巣、前立腺を含む)。陽性染色は、リンパ系(扁桃、脾臓および胸腺を含む)およびリンパ系富(結腸、胃、子宮の粘膜固有層)組織におけるリンパ球および／または単核細胞の散在性サブセットにおいてのみ観察された。扁桃における染色を図４４に示す。陽性染色は、濾胞間／傍濾胞領域および胚中心における散在性リンパ球で観察された。単核細胞(上皮直下)および上皮浸潤性リンパ球の散在性クラスターも陽性に染色された。
実施例１６：ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるバリアント抗ＧＩＴＲアイソタイプの抗腫瘍活性
ＤＴＡ−１は、アゴニストラット抗マウスＧＩＴＲ抗体(Shimizu et al., 2002; eBioscience, San Diego, CA)である。このＩｇＧ２ｂ抗体は、Ｂ１６黒色腫の処置中、ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆの両者を調節することが示されている。さらに、ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇの両者によるＧＩＴＲ発現が、ＤＴＡ−１の完全な効果のために必要であった。Cohen et al.(2010)は、ＤＴＡ−１によるＧＩＴＲライゲーションが、Ｔｒｅｇ抑制性活性を包括的に抑制せず、それがＴｒｅｇ腫瘍浸潤を障害し、腫瘍内Ｔｒｅｇ内のＦｏｘｐ３発現の喪失に至ることを示唆し、抑制の局在型抑止を暗示すると示唆した。正味の結果は腫瘍内Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比の増強および腫瘍内の大きなＴｅｆｆ活性化および機能である。ＤＴＡ−１は、ＧＩＴＲとＧＩＴＲリガンド(ＧＩＴＲＬ)の相互作用を遮断し、可溶性抗体がインビトロでの細胞応答促進に有効である。それはまた種々の腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖阻止に有効である(例えば、Turk et al., 2004; Cohen et al., 2010参照)。
ａ)実験ＭＣ３８ ＃１
異なる抗ＧＩＴＲ(ＤＴＡ−１)アイソタイプの抗腫瘍活性を、ステージ分類されたＭＣ３８結腸腺癌腫瘍モデルで評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに各々２×１０６ＭＣ３８腫瘍細胞を皮下注射した。７日後、マウスを５処置群に無作為化し、試験抗体を、次のように２００μl容積で、１回あたり２００μgを、７日目、１０日目および１４日目にＩＰ投与した：群１：マウスＩｇＧ１対照(ＩｇＧ)；群２：抗ＧＩＴＲラットＩｇＧ２ｂ Ａｂ(ＤＴＡ−ｒＧ２ｂ)；群３：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ１ Ａｂ(ＤＴＡ−ｍＧ１)；および群４：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ２ａ Ａｂ(ＤＴＡ−ｍＧ２ａ)。腫瘍および脾臓を１５日目に採取した。
図４５Ｃは、ＩｇＧ１抗ＧＩＴＲ処置腫瘍が、マウスＩｇＧ１対照で処置した腫瘍と同等の速度で増殖し(図４５Ａ)、１０匹のマウスいずれも、マウスのモニタリング終了時無腫瘍(ＴＦ)ではなかったことを示す。しかしながら、ＤＴＡ−ｒＧ２ｂ(図４５Ｂ)およびＤＴＡ−ｍＧ２ａ(図４５Ｄ)は腫瘍増殖速度を有意に減速させ、それぞれ１０匹のマウス中３匹および２匹がＴＦであった。
異なる抗ＧＩＴＲアイソタイプで処置した群のマウスの平均腫瘍体積および中央腫瘍体積における変化を図４６Ａおよび４６Ｂにプロットする。これらのプロットは、ＩｇＧ２ｂアイソタイプの抗ＧＩＴＲ抗体がＭＣ３８腫瘍増殖に対する最も強力な阻害効果を示し、ＩｇＧ２ａアイソタイプのみはわずかに弱いことを示す、図４５に示す個々のマウスデータを確認する。ＩｇＧ１アイソタイプは、腫瘍増殖をほとんど阻害せず、平均および中央腫瘍体積は、マウスＩｇＧ対照で処置したマウスのものに類似した。
ＴＩＬおよび脾臓におけるＭＣ３８ Ｔ細胞サブセットに対する抗ＧＩＴＲアイソタイプの効果も決定した。異なる抗ＧＩＴＲアイソタイプで処置したマウスからのＭＣ３８ ＴＩＬおよび脾臓におけるＴ細胞サブセットの集団を比較した。脾臓において、ＤＴＡ−ｍ２ａおよびＤＴＡ−ｒ２ｂはＣＤ８＋細胞レベルをわずかに低下させ、一方９Ｄ９−ｍ２ａ(抗ＣＴＬＡ−４抗体)およびＤＴＡ−ｍ１はＣＤ８＋Ｔ細胞レベルを変えなかった(図４７Ａ)。試験したアイソタイプバリアントのいずれも、脾臓におけるＣＤ４＋またはＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージに有意な効果はなかった(図４７Ｂおよび４７Ｃ)。
ＴＩＬにおいて、９Ｄ９−ｍ２ａは、マウスＩｇＧ１対照の両者と比較して、ＣＤ８＋細胞のパーセンテージの少なくとも２倍増加をもたらした(図４７Ｄ)。ＤＴＡ−ｍ２ａはあまり明白でない効果を有し、ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを約５０％増加させ、一方ＤＴＡ−ｍ１およびＤＴＡ−ｒ２ｂは、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較して、ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを増加させないかまたは最低限度の増加をさせた(図４７Ｄ)。９Ｄ９−ｍ２ａは、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較してＣＤ４＋細胞のパーセンテージをわずかに増加させ、一方ＤＴＡ−ｍ１はＣＤ４＋を変化させなかった(図４７Ｅ)。対照的に、ＤＴＡ−ｍ２ａおよびＤＴＡ−ｒ２ｂの両者は、両マウスＩｇＧ１アイソタイプと比較してＣＤ４＋パーセンテージを４０〜５０％低下させた(図４７Ｅ)。
最も劇的な効果は、ＴＩＬの中でＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのレベルで見られた。ＤＴＡ−ｍ１は、Ｔ細胞のこの集団に効果を有しないが、９Ｄ９−ｍ２ａおよびＤＴＡ−ｍ２ａは、ＩｇＧ１アイソタイプおよびＤＴＡ−ｍ１と比較してＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇレベルの約６倍減少をもたらした(図４７Ｆ)。これらのデータは、抗ＧＩＴＲのＩｇＧ２ａバリアントが、腫瘍環境特異的にＴｒｅｇレベルを減少させることを示す。それゆえに、ＩｇＧ２ａ抗ＧＩＴＲアイソタイプは、腫瘍部位でのＣＤ８＋Ｔｅｆｆ増加およびＴｒｅｇ減少を誘発し、これは、強い抗腫瘍活性の指標であるＴｅｆｆ対Ｔｒｅｇ比上昇に翻訳される。ＤＴＡ−ｒ２ｂも、ＩｇＧ１対照と比較してＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇレベルの有意な減少を誘発したが、ラットＩｇＧ２ｂ Ｆｃ領域のマウス活性化ＦｃγＲへの低い結合に一致して、９Ｄ９−ｍ２ａおよびＤＴＡ−ｍ２ａにより誘発させるものほど明白な減少ではなかった。これらのデータは、アゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体が枯渇活性のために活性化ＦｃγＲの結合を必要とすることを示す。
ＭＣ３８ ＴＩＬおよび脾臓におけるＴ細胞の異なるサブセット上のＧＩＴＲ発現レベルのフローサイトメトリー測定は、ＧＩＴＲが腫瘍部位のＴｒｅｇで最も高く発現され、その発現レベルは、末梢におけるＴｒｅｇまたは腫瘍部位でのＣＤ８＋Ｔｅｆｆより高く、これは、さらに、末梢におけるＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔｅｆｆより高い発現を示すことを示した。ＧＩＴＲ発現の最低相対レベルは腫瘍部位のＣＤ４＋Ｔｅｆｆで見られた。これらのデータは、Ｆｃ融合タンパク質の標的が腫瘍部位のＴｅｆｆ上の標的の発現に比して腫瘍部位のＴｒｅｇで高度に発現されており、そして、Ｆｃ融合タンパク質が、標的細胞の枯渇に介在する活性化ＦｃＲに結合するならば、Ｔ細胞枯渇活性がＴ細胞応答を支え、それによりＦｃ融合タンパク質の抗腫瘍有効性を増強する機構を示唆する。
ｂ)実験ＭＣ３８ ＃２
ＤＴＡ−１バリアントで遭遇した凝集のために(市販の元の形態のＤＴＡ−ｒ２ｂ以外)、新規セットのアイソタイプバリアントを再操作して、凝集しないＤＴＡ−１抗体を得た。観察された凝集は、操作されたアイソタイプバリアントの軽鎖に不注意に取り込まれていた余分なアミノ酸であることが突き止められ、この外来性のアミノ酸の除去により問題は軽減された。再操作した抗体を、この実験＃２において使用した。再操作した抗ＧＩＴＲ(ＤＴＡ−１；ＧＩＴＲ.７シリーズ)アイソタイプの抗腫瘍活性を、ステージ分類したＭＣ３８モデルを使用して評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、各々２×１０６ＭＣ３８細胞を皮下移植した。７日後、マウスを、約１４８mm３／２の同等な平均腫瘍体積を有するように７処置群に無作為化し、試験抗体を、次のとおりに１回あたり２００μg(２００μg１回を投与したｍＩｇＧ対照以外)で７日目、１０日目および１４日目にＩＰ投与した：群１：マウスＩｇＧ１対照(ｍＩｇＧまたは“アイソタイプ”)；群２：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ１Ａｂ(ｍＧＩＴＲ.７.ｍｇ１)；群３：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ１Ｄ２６５Ａアイソタイプ(ｍＧＩＴＲ.７.ｍｇ１−Ｄ２６５Ａ)；群４：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ２ａ Ａｂ(ｍＧＩＴＲ.７.ｍｇ２ａ)；群５：抗ＧＩＴＲマウスＩｇＧ２ｂ Ａｂ(ｍＧＩＴＲ.７.ｍｇ２ｂ)；および群６：抗ＧＩＴＲラットＩｇＧ２ｂ Ａｂ(ｍＧＩＴＲ.７.ｒ２ｂまたはＤＴＡ−１−ｒＧ２ｂ)。腫瘍および脾臓を１５日目に採取した。
図４８Ｂおよび４８Ｃは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ抗ＧＩＴＲ処置腫瘍が、マウスＩｇＧ１対照で処置した腫瘍と同等な速度で増殖したことを示す(図４８Ａ)。各場合、９匹のマウス全て、インプラント後３５日のマウスモニタリング終了時までＴＦではなかった。しかしながら、実験ＭＣ３８ ＃１における結果に類似して、ｍＧＩＴＲ.７.ｍｇ２ａ(図４８Ｄ)は腫瘍増殖の最大阻害をもたらし、９匹のマウス中２匹がＴＦであった。マウスおよびラット抗ＧＩＴＲ−２ｂ抗体も、同程度腫瘍増殖の速度を有意に低下させたが(図４８Ｅおよび４８Ｆ)、ラット２ｂ抗体が１匹のＴＦマウスをもたらしたのに対し、マウス２ｂ抗体はインプラント後３５日でＴＦマウスをもたらさなかった。
平均腫瘍体積および中央腫瘍体積の変化を図４９Ａおよび４９Ｂに示す。ＩｇＧ２ａ抗ＧＩＴＲアイソタイプが最も強力なＭＣ３８腫瘍増殖阻害剤であり、ＩｇＧ２ｂアイソタイプが有意ではあるが腫瘍増殖阻止効力が低い意外、ＭＣ３８実験１における傾向と類似する。ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａアイソタイプは、マウスＩｇＧ対照と比較して、腫瘍増殖の低レベル阻害を示した。
処置マウスからのＴＩＬおよび脾臓におけるＴｒｅｇ集団に対する異なる抗ＧＩＴＲアイソタイプの効果を図５０に示す。実験＃１で見られたように、試験したアイソタイプバリアントは、全て、脾臓におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージに大きな効果はなく、最強効果は、ラット抗ＧＩＴＲ ＩｇＧ２ｂアイソタイプでの処置により誘発される４０％に満たない増加であり、一方、マウス抗ＧＩＴＲ ＩｇＧ２ｂアイソタイプはＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージをわずかに低下させた。試験した他の抗ＧＩＴＲアイソタイプおよび抗ＣＴＬＡ−４ ＩｇＧ２ａ(９Ｄ９−ｍＧ２ａ)抗体は、Ｔｒｅｇのパーセンテージをわずかに増加させた(図５０Ａ)。
対照的に、ＴＩＬにおいて、アイソタイプ対照と比較して何ら変化を起こさなかったＩｇＧ１アイソタイプ以外、試験した抗体の全てがＴｒｅｇのパーセンテージの有意な減少をもたらした。抗ＣＴＬＡ−４抗体９Ｄ９−ｍＧ２ａは、ＩｇＧ１アイソタイプと比較してＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇレベルの約４倍減少をもたらし、抗ＧＩＴＲマウス２ａおよび２ｂアイソタイプおよびラット２ｂアイソタイプは、全て、Ｔｒｅｇレベルを約２倍低下させ、ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ変異体は、わずかに低い減少をもたらした(図５０Ｂ)。これらのデータは、抗ＧＩＴＲ ｍＧ２ａ、ｍＧ２ｂおよびｒＧ２ｂアイソタイプが、腫瘍増殖阻害と相関する腫瘍環境における有意なＴｒｅｇ枯渇を誘発する、実験＃１で見られる効果を確認する。
実験ＭＣ３８ ＃２で得られたデータは実験＃１で得られたものと大きく一致し、抗体の凝集が抗体の活性を過度に妨害しなかったことが示唆される。恐らく、凝集抗体はマウスでを急速に消失し、それゆえに、抗体凝集は、本インビボアッセイで有意な問題とはならなかった可能性がある。
実施例１７：ステージ分類されたＳａ１Ｎ腫瘍モデルにおけるバリアント抗ＧＩＴＲアイソタイプの抗腫瘍活性
抗ＧＩＴＲの抗腫瘍活性を、Ａ／ＪマウスにおけるＳａ１Ｎ肉腫モデルでも評価した。マウスに、インプラントあたり２×１０６ Ｓａ１Ｎ細胞を皮下注射した。７日後、腫瘍体積を確定し、同等な平均腫瘍体積(約７５mm３／２)を有するように無作為化した。実施例１０、実験ＭＣ３８ ＃１に記載のように種々のアイソタイプを有するように操作した抗ＧＩＴＲ(ＤＴＡ−１)抗体を、１回あたり２００μgで７日目、１０日目および１２日目にＩＰ投与した。
腫瘍増殖に対する効果を図５１に示す。ＩｇＧ２ａ抗ＧＩＴＲ抗体での処置は、腫瘍増殖を完全に阻害し、全１０匹のマウスは、インプラント後約２０日目までにＴＦであり(図５１Ｂ)、ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプは類似効果を有し、１０匹のマウス中９匹が約２０日目にＴＦであった(図５１Ｃ)。ＩｇＧ１(図５１Ｄ)およびＩｇＧ１Ｄ２６５Ａ(図５１Ｅ)アイソタイプは、ＩｇＧ１アイソタイプ対照処置腫瘍(図５１Ａ)の非阻害増殖と比較してある程度腫瘍を阻害したが、これは、ｍＩｇＧ２ａおよびｒＩｇＧ２ｂアイソタイプで見られる阻害よりはるかに低かった。図５２Ａおよび５２Ｂに示す平均腫瘍体積および中央腫瘍体積の変化は、ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａアイソタイプにより示されるはるかに低い腫瘍増殖阻害と比較して、ｍＩｇＧ２ａおよびｒＩｇＧ２ｂ抗体の腫瘍増殖に対する実質的に完全な阻害効果を確認する。
集合的に、図５１および５２のデータは、抗ＧＩＴＲ ｍＩｇＧ２ａおよびｒＩｇＧ２ｂアイソタイプが、はるかに低い抗腫瘍活性を示すｍＩｇＧ１(およびｍＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ)アイソタイプとは対照的に、強力な抗腫瘍活性を示すことを示す、ＭＣ３８腫瘍モデルで得たデータ(実施例１０)を確認する。ｍＩｇＧ１およびＤ２６５Ａバリアント抗体のＳａ１Ｎモデルにおける抗腫瘍活性は、Ｔｒｅｇ枯渇無しのＧＩＴＲのアゴニズムの効果と一致する。
処置マウスからのＳａ１Ｎ ＴＩＬおよび脾臓におけるＴｒｅｇの集団に対する異なる抗ＧＩＴＲアイソタイプの効果を図５３に示す。試験した抗ＧＩＴＲアイソタイプバリアントの全てが、脾臓におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇレベルの約２０〜４０％の比較的少ない増加を誘発した。最高の増加は、マウス抗ＧＩＴＲ ＩｇＧ２ａアイソタイプでの処置により誘発され、これは、抗ＣＴＬＡ−４ ＩｇＧ２ｂ(９Ｄ９−Ｇ２ｂ)およびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ(９Ｄ９−Ｇ１−Ｄ２６５Ａ)抗体での処置と同程度の増加を起こした(図５３Ａ)。後者の抗ＣＴＬＡ−４アイソタイプを、Ｔｒｅｇ枯渇が先にＩｇＧ２ｂアイソタイプで観察されていたため、本ＧＩＴＲ研究における陽性対照として使用した。
末梢におけるＴｒｅｇの効果とは対照的に、抗ＧＩＴＲ ｍ２ａおよびｒ２ｂアイソタイプならびに抗ＣＴＬＡ−４ ２ｂアイソタイプは、全て少なくとも３.５倍腫瘍部位でのＴｒｅｇレベルを低下させた(図５３Ｂ)。抗ＧＩＴＲ ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ変異体両者は、Ｔｒｅｇのパーセンテージの約３５％の小さな低下を誘発し、一方抗ＣＴＬＡ−４ ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ変異体は、ＴＩＬにおけるＴｒｅｇのパーセンテージを変化させなかった(図５３Ｂ)。それゆえに、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて見られるように、抗ＧＩＴＲ ｍＧ２ａおよびｒＧ２ｂアイソタイプは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ抗体よりはるかに腫瘍環境において有意にＴｒｅｇ枯渇を誘発し、これは腫瘍増殖阻害と相関する。
実施例１８：抗ＧＩＴＲ抗体と抗ＰＤ１アンタゴニスト的抗体の組み合わせの相乗的活性
相乗的抗腫瘍効果が、ＤＴＡ−１抗体と、抗腫瘍機構に対する阻害性シグナルを提供する分子であるＰＤ−１と拮抗する抗体の組み合わせにより得られるか否かを決定するために、ステージ分類したＭＣ３８結腸腺癌モデルを使用する腫瘍体積に対する抗体組み合わせの効果を評価した。マウスを、(Ａ)対照ｍＩｇＧ１、(Ｂ)ｍＩｇＧ＋ＤＴＡ−１、(Ｃ)ｍＩｇＧ＋ＰＤ−１(クローン４Ｈ２、ＢＭＳ)および(Ｄ)ＰＤ−１＋ＤＴＡ−１で７日目、１０日目および１４日目に処置した。
腫瘍増殖に対する効果を図５４に示す。ＤＴＡ−１抗体または抗ＰＤ−１抗体個々での処置は、ある程度腫瘍増殖を阻害し、各々１０匹中２匹のマウスがＴＦであった。対照的に、ＤＴＡ−１抗体と抗ＰＤ−１抗体の組み合わせは、３０日目までにＴＦマウスの数を実質的に増加させ、１０匹中７匹のマウスがＴＦであった。予想通り、対照ｍＩｇＧ投与マウスで、ＴＦマウスはなかった。
これらの結果は、アゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体とアンタゴニスト的抗ＰＤ−１抗体の組み合わせが、腫瘍増殖阻害に相乗的に作用することを示す。
実施例１９：結合親和性に対するＣＤＲアミノ酸変異の効果
この実施例は、２８Ｆ３のＶＨ ＣＤＲ３におけるあるアミノ酸残基を、その結合親和性に顕著に影響することなく他のアミノ酸に置換できることを示す。
２８Ｆ３の４８変異体を、ＶＨ ＣＤＲ３における１以上の次のアミノ酸：Ｍ１０２、Ｄ１０６およびＭ１１１(ナンバリングは配列番号１３による)の変異により作製し、次の活性を試験した：３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞への結合およびプレートに結合した抗ＣＤ３存在下の３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞のＩＬ−２分泌。実験を、上記のように実施した。
結果を図５５Ａおよび５５Ｂ(３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞への結合)、図５６Ａ−Ｆ(ＩＬ−２分泌)および表７に示す。
結果は、いくつかの変異体が、２８Ｆ３と同等な結合および活性を有し、一方他の変異は結合およびＩＬ−２分泌のいずれかまたは両者が低下することを示す。次の変異体が同等な結合および活性データを有する：Ｍ９８Ｖ；Ｍ９８Ｖ／Ｄ１０６Ｅ；Ｍ９８Ｌ／Ｄ１０６Ｅ；Ｍ９８Ｉ／Ｄ１６０Ｅ；およびＭ９８Ａ／Ｄ１０６Ｅ。
実施例２０：ＧＩＴＲ抗体アゴニスト活性に対する定常領域修飾の効果
この実施例は、ＩｇＧ２ヒンジを含むＧＩＴＲ抗体が、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体と比較して、Ｔ細胞からＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を誘発する能力が増加していることを示す。
上記ＣＨＯ−ＯＫＴ３および３Ａ９アッセイにおいて、ＩｇＧ２定常領域を有するハイブリドーマ由来抗体が、重鎖定常領域がＩｇＧ１またはエフェクターレスＩｇＧ１(ＩｇＧ１.１)にスイッチされた同じ抗体よりも、サイトカイン分泌の刺激がより強力であることが観察されている。それゆえに、ＩｇＧ２定常領域またはヒンジの効果を、これらのアッセイにおける抗ＧＩＴＲ抗体でさらに試験した。
抗ヒトＧＩＴＲ抗体の重鎖可変領域は、次の重鎖定常領域に結合した。
まず、これらのＧＩＴＲ抗体の結合親和性を、ＩｇＧ１ヒンジを有するＧＩＴＲ抗体のものと比較した。結合親和性を、実施例２に記載のように決定した。図５７に示すように、ＩｇＧ２ヒンジを有する全３ＧＩＴＲ抗体は、ＩｇＧ１ヒンジを有するＧＩＴＲ抗体と活性化Ｔ細胞に対して類似する親和性を有した。
次に、ＩｇＧ１定常領域またはＩｇＧ２ヒンジ／ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するＧＩＴＲ抗体の、実施例１３に記載するような、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞で刺激したＴ細胞からのＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を誘導する能力を試験した。図５８Ａおよび５８Ｂに示すように、ＩｇＧ２ヒンジ／ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する抗体(“抗ＧＩＴＲ.Ｇ２.ｇ１ｆ”)は、ＩｇＧ１定常領域を有する抗体(“抗ＧＩＴＲ.ｇ１ｆ”)より高い程度でＴ細胞からＩＦＮ−γおよびＩＬ−２両者の分泌を誘発した。これらの定常ドメインのエフェクターレスバージョンで類似の結果が得られた(図５８Ｃ)。
さらにＩｇＧ２ヒンジを含む抗ＧＩＴＲ抗体でのＴ細胞活性化増加を確認するために、異なる実験形式でのＩＬ−２分泌を試験した。この実験において、実施例１３に記載のように、ＧＩＴＲ抗体が、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞(異所性にヒトＧＩＴＲを発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株)からＩＬ−２分泌を誘発する能力を試験した。図５９に示すように、ＩｇＧ２ヒンジを有する全抗体(抗ＧＩＴＲ.ｇ２、抗ＧＩＴＲ.ｇ２.ｇ１ｆおよび抗ＧＩＴＲ.ｇ２.ｇ１.１ｆ)は、ＩｇＧ１定常領域含有カウンターパート(抗ＧＩＴＲ.ｇ１ｆおよび抗ＧＩＴＲ.ｇ１.１ｆ”)より高い程度で、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を誘発した。
これらの結果は、集合的にＩｇＧ２ヒンジおよびｇ１またはｇ１.１定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体が、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体より強力であることを示唆する。このＩｇＧ２ヒンジ含有ＧＩＴＲ抗体の効果改善を説明する一つの可能性のある機構は、ＩｇＧ１ヒンジを含む同じ抗体と比較して、増加した内部移行および／または細胞表面におけるこれらの抗体の増加した複合体形成である。
実施例２１：抗ＧＩＴＲ抗体誘発増殖は、Ｔｅｆｆ細胞内因性である
ＧＩＴＲは、マウスおよびヒト両者の制御性Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞に発現される。文献におけるデータは、アゴニスト的抗ＧＩＴＲ抗体が、Ｔｒｅｇ細胞存在下のマウスＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔエフェクター(Ｔｅｆｆ)細胞の増殖を駆動することを示している。さらに、この効果が、Ｔｒｅｇ細胞サプレッサー機能に対する直接効果ではなく、むしろ主にＴｅｆｆ細胞への抗ＧＩＴＲ抗体結合により駆動されることが示唆されている。他の刊行物は、抗ＧＩＴＲ抗体がＴｒｅｇ細胞増殖を駆動し、Ｆｏｘｐ３喪失により特徴付けされるＴｒｅｇ細胞系譜不安定性を誘発し得ることを示す。
Ｔｒｅｇ細胞機能に対する抗ＧＩＴＲ抗体の効果を試験するために、Ｔｅｆｆ細胞を、ＡＰＣの存在下、抗ＣＤ３および種々のアイソタイプの抗マウスＧＩＴＲ ｍＡｂ ＤＴＡ−１で刺激し、Ｔｒｅｇ細胞数を試験するマウスＴｒｅｇ細胞抑制アッセイを実施した。結果は、ＤＴＡ−１抗体処置が、アイソタイプ対照と比較して増殖を増加させることを示した。さらに、ＩｇＧ１、２ａ、２ｂおよび不活性ＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａアイソタイプは、Ｔｅｆｆ細胞増殖増加に全て有効であり、それによりＦｃＲ結合がこのシステムにおける抗ＧＩＴＲ抗体機能に不要であることが示された。
先の実験から、増加したＴｅｆｆ増殖が、Ｔｒｅｇおよび／またはＴｅｆｆ細胞に作用する抗ＧＩＴＲ抗体によるものか否か明確ではなかった。この疑問に取り組むために、ヒトＧＩＴＲ“ノックイン”(ｈｕＧＩＴＲ ＫＩ)マウスを使用した。これらのマウスにおいて、マウスＧＩＴＲ、Ｔｎｆｒｓｆ１８をコードする遺伝子をヒトＴＮＦＲＳＦ１８遺伝子に置き換え、ヒトＧＩＴＲを野生型マウスでｍｕＧＩＴＲと同様に発現させ、ヒトＧＩＴＲは、Ｔｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞両方で発現され、後者でレベルが高い。抗ヒトＧＩＴＲ ｍＡｂ ２８Ｆ３は、ｈｕＧＩＴＲ ＫＩマウスからのＴｅｆｆ細胞の増殖を誘発できることが判明した。２８Ｆ３がヒトＧＩＴＲに結合するが、マウスＧＩＴＲに結合しないため、ＧＩＴＲが、Ｔｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞で差次的に標的化されるＴｒｅｇ抑制アッセイシステムの構築が可能であった。このシステムは、ヒトＩｇＧ１または不活性ＩｇＧ１.１ Ｆｃ領域のいずれかを有する２８Ｆ３間の機能的差異の試験も可能とした。
Ｔｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞を、ｈｕＧＩＴＲ ＫＩおよびＷＴマウスからＣＤ４およびＣＤ２５発現に基づきソートした。ＷＴおよびｈｕＧＩＴＲ Ｔｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞を、ＴｒｅｇまたはＴｅｆｆ細胞のいずれかと２８Ｆ３のユニコンパートメンタルターゲティングを可能にする組み合わせ(ｈｕＧＩＴＲ ＫＩ Ｔｅｆｆ細胞と野生型Ｔｒｅｇ細胞など)で混合した。対照として、２８Ｆ３がＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞に結合できるまたはいずれにも結合できないであろう条件を包含させた。Ｔｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞含有培養を、ＡＰＣおよび２８Ｆ３ ＩｇＧ１、２８Ｆ３ ＩｇＧ１.１またはアイソタイプ対照存在下、抗ＣＤ３で刺激した。
結果を図６０に提供する。予想通り、２８Ｆ３がＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞に結合できたときＴｅｆｆ細胞増殖の増加が観察され、この効果は、２８Ｆ３がＴｅｆｆ細胞にしか結合できない条件で維持された。対照的に、２８Ｆ３がＴｒｅｇ細胞にしか結合できないとき、アイソタイプ対照を超えるＴｅｆｆ増殖の増加はなかった。アイソタイプに関して、２８Ｆ３が効果を示した条件下で、ＩｇＧ１とＩｇＧ１.１ Ｆｃに差はなかった。これは、Ｆｃ架橋結合が抗ＧＩＴＲアゴニズムに必要ではないことを示す、上記データと一致する。まとめて、このシステムにおいて、抗ＧＩＴＲ抗体は、主に、Ｔｅｆｆ細胞機能を調節するその能力を介して働き、Ｔｒｅｇ細胞サプレッサー能の阻害によって作用しない。しかしながら、抗ＧＩＴＲ抗体がＴｒｅｇ細胞増殖を駆動し得るまたはＡＤＣＣまたはＡＤＣＰのためのＴｒｅｇ特異的標的を提供するため、インビボでのＴｒｅｇ細胞に対するＧＩＴＲシグナル伝達の役割を除外しない。
実施例２２：抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)
２８Ｆ３.ＩｇＧ１ｆおよび２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１ｆのインビトロＡＤＣＣ活性を、エフェクターとしてＮＫ９２／ＣＤ１６細胞または初代ＮＫ細胞のいずれかを使用し、ＧＩＴＲを発現することが知られる多様な細胞を標的として使用した。
アッセイ３日前に、標的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを陰性選択により単離し、ＴｒｅｇをＣＤ２５陽性選択によりＣＤ４＋Ｔ細胞からさらに単離した。Ｔ細胞サブセットの各々を、ＧＩＴＲの上方制御を誘発するためにＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ(Miltenyi Biotec)で３日刺激した。アッセイ１日前に、初代ＮＫ細胞を陰性選択により新鮮ＰＢＭＣから単離し(StemCell Technologies, Inc.)、一夜、５００ＩＵ／mL組み換えＩＬ−２(R&D systems)および１ｕＭヒドロコルチゾン(StemCell)添加MyeloCult H5100培地(StemCell)で培養した。アッセイ日に、エフェクター細胞(初代ＮＫ細胞またはＮＫ９２／ＣＤ１６)を、１μg／mL ２８Ｆ３.ＩｇＧ１ｆおよび２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１ｆ存在下、特定のエフェクター対標的比で、Calcein AM標識活性化Ｔ細胞とインキュベートした。
初代ＮＫ細胞またはＮＫ９２／ＣＤ１６細胞をエフェクターとして使用して、２８Ｆ３.ＩｇＧ１は活性化ＣＤ４＋ＴエフェクターおよびＴｒｅｇ細胞の溶解を誘発したが、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の観察される溶解は少なかった(図６１)。予想通り、２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１は、エフェクターとしてＮＫ９２細胞または初代ＮＫ細胞のいずれかを使用してあらゆる標的細胞にＡＤＣＣを介在しなかった。それゆえに、２８Ｆ３.ＩｇＧ１は、活性化ＣＤ４＋ＴエフェクターおよびＴｒｅｇ細胞の、そして少ない程度で活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の溶解を誘発し、２８Ｆ３.ＩｇＧ１により誘発される溶解レベルは、標的細胞上に発現されるＧＩＴＲレベルに比例するように見える。
実施例２３：ヒトＧＩＴＲノックインマウスにおける２８Ｆ３.ＩｇＧ１抗体の活性
この実施例は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１および２８Ｆ３ＩｇＧ１.１が、ヒト免疫系およびヒトＧＩＴＲタンパク質を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ３８腫瘍に抗腫瘍活性を有し、抗腫瘍活性が２８Ｆ３.ＩｇＧ１で強められることを示す。
ヒトＧＩＴＲノックインマウスの産生：Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、マウス膜貫通および細胞質配列はインタクトのまま、ヒトＧＩＴＲ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)をマウスＧＩＴＲ ＥＣＤの代わりに発現するように遺伝子操作した。ヒト／マウスキメラＧＩＴＲの発現を、抗ヒトＧＩＴＲ抗体での抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化脾臓細胞の染色により確認した。
ＭＣ３８細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ)、２mM Ｌ−グルタミン、４.５ｇ／Ｌ(４５％)グルコース(１０mL／Ｌ)および１mM ピルビン酸ナトリウム(１０mL／Ｌ)添加ＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を２日毎に１：１０に分けた。マウスの２コホートを使用し、両コホートについて、各マウスの右脇腹に、０.２mL ＰＢＳ中７５万ＭＣ３８細胞を、１cm３シリンジおよび２５ゲージ半インチ針を使用して皮下にインプラントした。コホート１について、インプラント後７日目に、４０マウスを、腫瘍体積(Ｌ×Ｗ×Ｈ／２)により各１２〜１３マウスの３群に無作為化した。全群は、約１７４mm３／２の平均腫瘍体積を有した。７日目、１０日目および１４日目に、媒体対照またはｍＡｂを１０mg／kgで投与した。コホート２について、インプラント後７日目に、１０マウスを、腫瘍体積(Ｌ×Ｗ×Ｈ／２)により各５マウスの２群に無作為化した。全群、約６９mm３／２の平均腫瘍体積を有した。７日目、１０日目および１４日目に、媒体対照または２８Ｆ３.ＩｇＧ１ ｍＡｂを１０mg／kgで投与した。
マウスに表９に要約する濃度および日程で腹腔内(ＩＰ)投与した。
腫瘍および体重を、実験終了まで週に２回測定した。腫瘍を、Fowler Electronic Digital Caliper(Model 62379-531; Fred V. Fowler Co., Newton, MA)で３寸法測定し、データをStudylog Systems, Inc.(South San Francisco, CA)のStudyDirectorソフトウェアを使用して記録した。
この腫瘍実験において、コホート１を、インプラント後５２目に終了した。Microsoft Excelを使用して、腫瘍体積および体重の平均、標準偏差(ＳＤ)および中央値を計算した。平均および中央値は、実験動物の１００％および少なくとも６０％が、それぞれ各処置群に残存しているときに計算した。コホート２におけるマウスからの腫瘍を１５日目に採取した。
結果は、実験における全マウスが生存していたときの最終日である腫瘍インプラント後２２日目に、１０mg／kg用量の２８Ｆ３.ＩｇＧ１が、アイソタイプ対照抗体と比較してＭＣ３８異種移植に対する６７％平均腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)を示したことを示す。腫瘍ＴＧＩを、表１０に処置群毎に要約する。処置群毎の腫瘍増殖曲線を図６２Ａ〜６２Ｃに示す。処置群毎の平均および中央腫瘍増殖曲線を図６３Ａ〜６３Ｂに示す。平均および中央体重変化が２０％未満であったため、全処置群で毒性は明白ではなかった。マウス体重および経時的パーセンテージ変化を図６４Ａ〜６４Ｂに示す。
結果は、インプラント後２２日目に２８Ｆ３.ＩｇＧ１が６７％ＴＧＩを有し、２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１ｆが２２％ＴＧＩを有することを示し、両抗体がＭＣ３８腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を低減させたことを示す。さらに、結果は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１によるＦｃ結合が、ＭＣ３８腫瘍モデルにおける抗腫瘍効力を増強させることを示唆する。
２８Ｆ３.ＩｇＧ１がＴ細胞集団に有する効果を試験するために、インプラント後１５日目に各処置群の５マウスから組織を回収した。脾臓および腫瘍を穏やかなMACS Octo DissociatorTM(Miltenyi, San Diego, CA)で処理した。単一細胞懸濁液を、フローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)を使用してＴ細胞マーカーについて染色した。抗体蛍光を、Fortessa(BD Biosciences, San Jose, CA)でのフローサイトメトリーにより検出し、結果をコンピュータープログラム、Flowjo(Flowjo, LLC, Ashland, OR)で分析した。
図６５および６６に示す結果は、アイソタイプ対照と比較して、２８Ｆ３.ＩｇＧ１処理マウスにおける枯渇と一致して、Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージを低下させたことを示す(図６５)。逆に、２８Ｆ３.ＩｇＧ１群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの増加があった(図６６)。
それゆえに、アイソタイプ対照と比較した２８Ｆ３.ＩｇＧ１処置マウスにおける免疫モニタリングは、ＴＧＩがＴｒｅｇ枯渇およびＣＤ８＋Ｔ細胞増加に介在し得ることを示唆する。
実施例２４：架橋結合２８Ｆ３.ＩｇＧ１は、その効力を増加させる
この実施例は、架橋結合２８Ｆ３.ＩｇＧ１が、Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌を増強させ、Ｔ細胞増殖を促進するその効力を増加させることを示す。
Ｔ細胞を、種々の濃度の抗ＧＩＴＲ抗体または対照試薬存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞またはＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ高のいずれかと共培養し、インターフェロン−γ(ＩＦＮ−γ)分泌および細胞増殖のレベルを測定した。ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ高細胞株は、その親ＣＨＯ−ＯＫＴ３クローンより極めて高レベルのＦｃ受容体ＣＤ３２ａおよびわずかに高いＯＫＴ３発現を有する。
アッセイを次のように実施した。レスポンダーＴ細胞を、業者のプロトコールに従いＣＤ４ Ｔ細胞単離キット(Life technologies, Cat. 113.31D)およびＣＤ２５マイクロビーズ(Miltenyi, Cat. 130-092-983)を使用してフィコール勾配(Amersham Bioscience 17-1440-03)から単離したヒトＰＢＭＣから得た。抗ＣＤ３ｓｃＦｖ(ＯＫＴ３)を発現するＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−ＯＫＴ３)または抗ＣＤ３ｓｃＦｖおよびＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ細胞をＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、５０K Radの線量での照射に付した。細胞を回収し、培養培地(１０％ウシ胎児血清、２mM Ｌ−グルタミン、５５nM β−メルカプトエタノール、１mM ピルビン酸ナトリウムおよび１００Ｕ／mLペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ−１６４０)に２.５×１０５／mLで再懸濁した。２.５×１０４ ＣＨＯ細胞および１×１０５ Ｔ細胞を、９６ウェルＴＣグレード平底プレート(Costar)のウェルあたりに播種した。細胞を、２０μg／mLから出発する８点、４倍タイトレーションのＧＩＴＲ抗体とインキュベートした。無関係のｈＩｇＧ１を、アイソタイプ対照として２０μg／mLで添加した。細胞のみのサンプルを、何ら処置しないベースライン活性を示すために包含させた。各サンプルからの上清をＩＦＮ−γ測定のために３日目(BD optEIA human IFN-g ELISA Kit；BD Bioscience#555142)に回収した。細胞増殖を、インキュベーションの最後の８時間の３Ｈ−チミジン取り込みにより評価した。図６７および６８に示す結果は、２８Ｆ３.ＩｇＧ１存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したものより、ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ高と共培養したＴ細胞から多くのＩＦＮ−γが分泌されることを示す(図６７)。予想通り、ＣＤ３２ａに結合しないエフェクターレス２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１ｆ抗体で有意差は観察されなかった。さらに、２８Ｆ３.ＩｇＧ１存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したものより、ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ高と共培養したＴ細胞でよりＴ細胞増殖が観察され、これは、エフェクターレス２８Ｆ３.ＩｇＧ１.１ｆ抗体では観察されなかった効果である(図６８)。それゆえに、架橋結合２８Ｆ３.ＩｇＧ１は、Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌を増強させ、Ｔ細胞増殖を促進するその効力を増加させる。この増強効果は、低レベルのＣＤ３２ａを発現するＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞でのＴ細胞増殖でも見られた。ＧＩＴＲ.６ｇ１.１ｆは、可溶性と比較して、架橋されているとき高レベルのＩＦＮ−γを示す。これは、恐らく、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と比較して、ＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＣＤ３２ａ高細胞で発現されるわずかに高いレベルのＯＫＴ３を反映する。架橋ＧＩＴＲ.６ｇ１ｆで観察される増加は、不活性アイソタイプで観察されるより大きく、架橋結合の積極的役割を示唆する。Ｇ１ｆバージョンは、可溶性抗体がバックグラウンドを超えるわずかなアゴニズムを示す低用量で、高レベルのＩＦＮ−γを促進し、また架橋結合の肯定的な役割を示唆する。
それゆえに、２８Ｆ３.ＩｇＧ１およびエフェクターレス２８Ｆ３.ＩｇＧ１抗体の両者は、ＩＦＮ−γの産生を刺激し、Ｔ細胞増殖を刺激するが、しかしながら、架橋結合２８Ｆ３.ＩｇＧ１は、ＩＦＮ−γ分泌を増強させ、Ｔ細胞増殖を促進するその効力を増加させる。
表１１は、成熟可変領域および重鎖および軽鎖の配列および特記するとき、シグナルペプチドを伴う配列を提供する。
均等物：
当業者は、ここに開示する具体的態様の多くの均等物を認識し、日常的なものを越えな
い実験を使用して確認できる。このような均等物は、特許請求の範囲に包含されると意図
される。
また、本願発明は以下の態様を含み得る。
（１）ヒトグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、次の性質を示す単離抗体またはその抗原結合部分：
(ａ) 可溶性ヒトＧＩＴＲに結合する；
(ｂ) 膜結合ヒトＧＩＴＲに結合する；
(ｃ) 膜結合カニクイザルＧＩＴＲに結合する；
(ｄ) Ｔ細胞活性化を誘発または増強する；
(ｅ) ＧＩＴＲリガンドの３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞上のＧＩＴＲへの結合を阻害する；
(ｆ) ＧＩＴＲリガンドの活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を最大でも部分的に阻害する；
(ｇ) 成熟ヒトＧＩＴＲ上の立体エピトープ(配列番号４)に結合する；
(ｈ) Ｏ結合およびＮグリコシル化および非グリコシル化ヒトＧＩＴＲの両者に結合する；
(ｉ) Ｆｃ受容体への結合の非存在下でアゴニスト活性を有するが、ここで、Ｆｃ受容体への結合がアゴニスト活性をさらに増強する；および
(ｊ)ヒトＧＩＴＲの１以上の抗体２８Ｆ３、３Ｃ３−１、３Ｃ３−２、２Ｇ６、８Ａ６、９Ｇ７−１、９Ｇ７−２、１４Ｅ３、１９Ｈ８−１、１９Ｈ８−２、１９Ｄ３、１８Ｅ１０および６Ｇ１０との結合といずれかの方向または両方向で競合する。
（２）抗体が抗腫瘍免疫応答を刺激する、（１）の抗体またはその抗原結合部分。
（３）抗体が抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、（１）または（２）の抗体またはその抗原結合部分。
（４）抗体がＧＩＴＲ発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる、（１）〜（３）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（５）抗体がＴ細胞増殖を増加させる、（１）〜（４）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（６）抗体がＦｃ受容体に結合しない、（１）〜（５）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（７）抗体が１以上の活性化ＦｃγＲに結合する、（１）〜（５）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（８）抗体が、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定して、可溶性ヒトＧＩＴＲに１０nM以下のＫ Ｄ で結合する、（１）〜（７）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（９）抗体が、スキャッチャードにより測定して、膜結合ヒトＧＩＴＲに１nM以下のＫ Ｄ で結合する、（１）〜（８）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（１０）抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、膜結合ヒトＧＩＴＲに１nM以下のＥＣ ５０ で結合する、（１）〜（９）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（１１）抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、膜結合カニクイザルＧＩＴＲに１０nM以下のＥＣ ５０ で結合する、（１）〜（１０）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（１２）抗体が多価架橋結合を必要とせずＴ細胞の活性化を誘発または増強する、（１）〜（１１）のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
（１３）抗体が、ＦＡＣＳにより測定して、ＧＩＴＲリガンドのＧＩＴＲへの結合を１μg／mL以下のＥＣ ５０ で阻害する、（１）〜（１２）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（１４）抗体が成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)に結合する、（１）〜（１３）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（１５）グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に特異的に結合し、次のものからなる群から選択される可変重鎖および可変軽鎖対にある３可変重鎖ＣＤＲおよび３可変軽鎖ＣＤＲを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ) 配列番号１３および１４；
(ｂ) 配列番号２６および２７；
(ｃ) 配列番号３９および４０；
(ｄ) 配列番号５２および５３；
(ｅ) 配列番号５２および５４；
(ｆ) 配列番号７１および７２；
(ｇ) 配列番号８４および８５；
(ｈ) 配列番号９７および９８；
(ｉ) 配列番号９７および９９；
(ｊ) 配列番号１１５および１１６；
(ｋ) 配列番号１２８および１２９；
(ｌ) 配列番号１２８および１３０；および
(ｍ) 配列番号３３５および３３６。
（１６）（ａ) それぞれ配列番号２０、２１および２２を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号２３、２４および２５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｂ) それぞれ配列番号３３、３４および３５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号３６、３７および３８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｃ) それぞれ配列番号４６、４７および４８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号４９、５０および５１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｄ) それぞれ配列番号６２、６３および６４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６５、６６および６７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｅ) それぞれ配列番号６２、６３および６４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号６８、６９および７０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｆ) それぞれ配列番号７８、７９および８０を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号８１、８２および８３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｇ) それぞれ配列番号９１、９２および９３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号９４、９５および９６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｈ) それぞれ配列番号１０６、１０７および１０８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１０９、１１０および１１１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｉ) それぞれ配列番号１０６、１０７および１０８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１１２、１１３および１１４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｊ) それぞれ配列番号１２２、１２３および１２４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１２５、１２６および１２７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｋ) それぞれ配列番号１３８、１３９および１４０を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１４１、１４２および１４３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；
(ｌ) それぞれ配列番号１３８、１３９および１４０を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号１４４、１４５および１４６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；または
(ｍ) それぞれ配列番号３４２〜３４４を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号３４５〜３４７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む、グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
（１７）抗体がそれぞれ配列番号２０、２１および２２を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号２３、２４および２５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、（１６）の抗体またはその抗原結合部分。
（１８）抗体がそれぞれ配列番号３３、３４および３５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号３６、３７および３８を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、（１６）の抗体またはその抗原結合部分。
（１９）抗体がそれぞれ配列番号４６、４７および４８を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および／またはそれぞれ配列番号４９、５０および５１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、（１６）の抗体またはその抗原結合部分。
（２０）グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が配列番号１３、２６、３９、５２、７１、８４、９７、１１５、１２８および３３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
（２１）グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が配列番号１４、２７、４０、５３、５４、７２、８５、９８、９９、１１６、１２９、１３０および３３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
（２２）グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ) それぞれ配列番号１３および１４；
(ｂ) それぞれ配列番号２６および２７；
(ｃ) それぞれ配列番号３９および４０；
(ｄ) それぞれ配列番号５２および５３；
(ｅ) それぞれ配列番号５２および５４；
(ｆ) それぞれ配列番号７１および７２；
(ｇ) それぞれ配列番号８４および８５；
(ｈ) それぞれ配列番号９７および９８；
(ｉ) それぞれ配列番号９７および９９；
(ｊ) それぞれ配列番号１１５および１１６；
(ｋ) それぞれ配列番号１２８および１２９；
(ｌ) それぞれ配列番号１２８および１３０；および
(ｍ) それぞれ配列番号３３５および３３６。
（２３）重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、（２２）の抗体またはその抗原結合部分。
（２４）重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、（２３）の抗体またはその抗原結合部分。
（２５）重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含む、（２４）の抗体またはその抗原結合部分。
（２６）抗体が、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、（２５）の抗体またはその抗原結合部分。
（２７）抗体が、配列番号２６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、（２５）の抗体またはその抗原結合部分。
（２８）抗体が、配列番号３９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または配列番号４０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、（２５）の抗体またはその抗原結合部分。
（２９）グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ) それぞれ配列番号１５および１６；
(ｂ) それぞれ配列番号１７および１９；
(ｃ) それぞれ配列番号１８および１９；
(ｄ) それぞれ配列番号２８および２９；
(ｅ) それぞれ配列番号３０および３２；
(ｆ) それぞれ配列番号３１および３２；
(ｇ) それぞれ配列番号４１および４２；
(ｈ) それぞれ配列番号４３および４５；
(ｉ) それぞれ配列番号４４および４５；
(ｊ) それぞれ配列番号５５および５６；
(ｋ) それぞれ配列番号５５および５７；
(ｌ) それぞれ配列番号５８および６０；
(ｍ) それぞれ配列番号５９および６０；
(ｎ) それぞれ配列番号５８および６１；
(ｏ) それぞれ配列番号５９および６１；
(ｐ) それぞれ配列番号７３および７４；
(ｑ) それぞれ配列番号７５および７７；
(ｒ) それぞれ配列番号７６および７７；
(ｓ) それぞれ配列番号８６および８７；
(ｔ) それぞれ配列番号８８および９０；
(ｕ) それぞれ配列番号８９および９０；
(ｖ) それぞれ配列番号１０２および１０４；
(ｗ) それぞれ配列番号１０３および１０４；
(ｘ) それぞれ配列番号１００および１０１；
(ｙ) それぞれ配列番号１００および３７１；
(ｚ) それぞれ配列番号１０２および１０５；
(ｚａ) それぞれ配列番号１０３および１０５；
(ｚｂ) それぞれ配列番号１１７および１１８；
(ｚｃ) それぞれ配列番号１１９および１２１；
(ｚｄ) それぞれ配列番号１２０および１２１；
(ｚｅ) それぞれ配列番号１３１および１３２；
(ｚｆ) それぞれ配列番号１３４および１３６；
(ｚｇ) それぞれ配列番号１３５および１３６；
(ｚｈ) それぞれ配列番号１３１および１３３；
(ｚｉ) それぞれ配列番号１３４および１３７；
(ｚｊ) それぞれ配列番号１３５および１３７；
(ｚｋ) それぞれ配列番号３３７および３３８；
(ｚｌ) それぞれ配列番号３３９および３４１；および
(ｚｍ) それぞれ配列番号３４０および３４１。
（３０）重鎖および軽鎖が(ａ)〜(ｚｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖を含む、（２９）の抗体またはその抗原結合部分。
（３１）抗体が、配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、（３０）の抗体またはその抗原結合部分。
（３２）抗体が、配列番号１８に示すアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、（３０）の抗体またはその抗原結合部分。
（３３）(ａ)ＧＩＴＲ上の請求項２５の抗体と同じエピトープに結合するおよび(ｂ)ＦＡＣＳにより測定して請求項２５の抗体の活性化Ｔ細胞上のＧＩＴＲへの結合を少なくとも９０％する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
（３４）抗体が成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)に結合する、（１５）〜（３３）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（３５）抗体がヒトおよびカニクイザル両者のＧＩＴＲに結合する、（１５）〜（３４）のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
（３６）抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントからなる群から選択される、（１）〜（２５）のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
（３７）抗体がＩｇＧ１抗体である、（３６）に記載の抗体またはその抗原結合部分。
（３８）抗体がエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃを含む、（３６）の抗体またはその抗原結合部分。
（３９）抗体またはその抗原結合部分が、次の変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含むエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃを含む、（３８）の抗体またはその抗原結合部分。
（４０）抗体またはその抗原結合部分が活性化ＦｃγＲへの結合が増強されたＦｃを含む、（３６）の抗体またはその抗原結合部分。
（４１）ＣＤＲ領域におけるメチオニン残基が、酸化を受けないアミノ酸残基に置換されている、（１）〜（４０）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（４２）抗体またはその抗原結合部分がヒトまたはヒト化抗体である、（１５）〜（４１）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分。
（４３）第二結合特異性を有する分子に結合した（１）〜（４２）のいずれかの抗体を含む、二重特異性分子。
（４４）（１）〜（４２）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸。
（４５）（４４）の核酸分子を含む、発現ベクター。
（４６）（４５）に記載の発現ベクターで形質転換された、細胞。
（４７）薬剤に結合した（１）〜（４２）のいずれかの抗体を含む、イムノコンジュゲート。
（４８）（１）〜（４３）および（４７）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび担体を含む、組成物。
（４９）（１）〜（４３）および（４７）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分または二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよび使用指示を含む、キット。
（５０）抗体またはその抗原結合部分を（４６）の細胞で発現させ、該細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離することを含む、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を製造する方法。
（５１）抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるようにＴ細胞と（１）〜（４３）および（４７）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法。
（５２）エフェクターＴ細胞と（１）〜（４３）および（４７）のいずれかに記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートおよびＣＤ３を接触させることを含み、ここで、エフェクターＴ細胞が活性化または共刺激される、エフェクターＴ細胞を活性化または共刺激する方法。
（５３）Ｔ細胞と（１）〜（４３）および（４７）のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートの有効量を接触させることを含む、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる方法。
（５４）Ｔ細胞と（１）〜（４３）および（４７）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートの有効量を接触させることを含む、Ｔ細胞増殖を増加させる方法。
（５５）Ｔ細胞からのＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させるために、（１）〜（４３）および（４７）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含む、対象におけるＴ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる方法。
（５６）（１）〜（４３）および（４７）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含み、ここで、該抗体またはその抗原結合部分が、腫瘍におけるＴ制御性細胞の数を減らすためのエフェクターまたは増強されたエフェクター機能を有する、処置を必要とする対象における腫瘍におけるＴ制御性細胞数を減少または枯渇させる方法。
（５７）対象における免疫応答が刺激されるように、対象に（１）〜（４３）および（４７）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法。
（５８）対象が腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される、（５７）の方法。
（５９）対象における腫瘍の増殖が阻害されるように、対象に（１）〜（４３）および（４７）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻止する方法。
（６０）癌を処置するために、処置を必要とする対象に（１）〜（４３）および（４７）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、癌を処置する方法。
（６１）癌が膀胱癌、乳癌、子宮／頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、胚細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌からなる群から選択される、（６０）の方法。
（６２）癌が転移性癌、難治性癌または再発性癌である、（６０）または（６１）の方法。
（６３）１以上のさらなる治療剤を投与することをさらに含む、（５６）〜（６２）のいずれかの方法。
（６４）さらなる治療剤が抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ−３抗体、ＣＴＬＡ−４抗体またはＰＤ−Ｌ１抗体である、（６３）の方法。
（６５）サンプルと（１）〜（４２）のいずれかの抗体またはその抗原結合部分を、抗体またはその抗原結合部分とＧＩＴＲの複合体を形成させる条件下で接触させ、複合体の形成を検出することを含む、サンプル中のグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)の存在を検出する方法。
（６６）ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２アイソタイプではない少なくとも一つのＣ Ｈ １、Ｃ Ｈ ２およびＣ Ｈ ３を含む修飾重鎖定常領域を含む単離抗ＧＩＴＲ抗体であって、抗ＧＩＴＲ抗体が非ＩｇＧ２ヒンジ以外同一である抗ＧＩＴＲ抗体よりも増強されたアゴニスト活性を有するものである、単離抗ＧＩＴＲ抗体。
（６７）修飾重鎖定常領域が配列番号２２３〜２２６および２８３〜２９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域またはそれらと異なるのが多くて５アミノ酸であるもしくは配列番号２２３〜２２６および２８３〜２９０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖定常領域を含む、（６６）の単離抗ＧＩＴＲ抗体。
（６８）重鎖が配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれと最大１０アミノ酸異なるかまたは配列番号１５、１７、１８、２８、３０、３１、４１、４３、４４、５５、５８、５９、７３、７５、７６、８６、８８、８９、１００、１０２、１０３、１１７、１１９、１２０、１３１、１３４、１３５、２２７〜２７５、３３７、３３９、３４０、３４８〜３５２、３６１および３６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖である、（６７）の単離抗ＧＩＴＲ抗体。

Claims (18)

  1. それぞれ配列番号２０、２１および２２を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列およびそれぞれ配列番号２３、２４および２５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、ヒトグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体(ＧＩＴＲ)に結合する単離抗体。
  2. 抗体が抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、請求項１に記載の抗体。
  3. 抗体が、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定して、可溶性ヒトＧＩＴＲに１００nM以下のＫＤで結合するおよび／またはスキャッチャード分析により測定して、細胞結合ヒトＧＩＴＲに１０nM以下のＫＤで結合する、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 抗体が、水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)により決定して、成熟ヒトＧＩＴＲ(配列番号４)のＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴ(配列番号２１７)およびＣＲＤＹＰＧＥＥ(配列番号２１８)に結合する、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。
  5. 配列番号１３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＧＩＴＲに結合する、単離抗体。
  6. 重鎖および軽鎖がそれぞれ完全長重鎖および軽鎖である、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体。
  7. それぞれ配列番号１５および１６で示される重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖が所望によりＣ末端リシンを欠いてよい、ヒトＧＩＴＲに結合する抗体。
  8. それぞれ配列番号１７および１９で示される重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖が所望によりＣ末端リシンを欠いてよい、ヒトＧＩＴＲに結合する抗体。
  9. それぞれ配列番号１８および１９で示される重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖が所望によりＣ末端リシンを欠いてよい、ヒトＧＩＴＲに結合する抗体。
  10. 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
  11. 抗体がヒト抗体である、請求項１〜６または１０のいずれかに記載の抗体。
  12. 請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体の重鎖および軽鎖、またはその可変領域をコードする核酸。
  13. 請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体および担体を含む、組成物。
  14. １以上のさらなる治療剤をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. さらなる治療剤が抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ−３抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
  16. 請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体を含む、癌を処置するための医薬。
  17. １以上のさらなる治療剤と併用することを特徴とする、請求項１６に記載の医薬。
  18. さらなる治療剤が抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ−３抗体、ＣＴＬＡ−４抗体またはＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１７に記載の医薬。
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