KR20080105674A

KR20080105674A - 항-마우스 ｇｉｔｒｌ 단일클론 항체 또는 항-인간ａｉｔｒｌ 단일클론 항체 및 이를 유효성분으로 함유하는염증성 장질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20080105674A
Application number: KR1020070053543A
Authority: KR
Inventors: 권병세; 최범규; 이선경; 김영호
Original assignee: 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2007-05-31
Filing date: 2007-05-31
Publication date: 2008-12-04

Abstract

본 발명은 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체의 GITR/GITRL 또는 AITR/AITRL 신호 차단을 통한 TNBS 유도성 대장염의 치료 효과를 확인함으로써, 본 발명은 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

항-마우스 GITRL 단일클론 항체, 항-인간 AITRL 단일클론 항체, 염증성 장질환

Description

항-마우스 ＧＩＴＲＬ 단일클론 항체 또는 항-인간 ＡＩＴＲＬ 단일클론 항체 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 및 치료용 조성물{An anti-mouse GITRL monoclonal antibody or an anti-human AITRL monoclonal antibody and the composition comprising the same for preventing and treating inflammatory bowel disease}

도 1은 글루타티온 레진을 사용하여 실제 분리한 AITRL이 27KDa의 크기임을 나타낸 도이고,

도 2는 정상 Balb/c 마우스의 림프절로부터 세포를 분리하여 유세포 분석한 결과를 나타낸 도이며,

도 3은 TNBS 투여전 림프절과 라미나 프로프리아의 세포를 분리하여 CD25, CD62L 및 GITR의 발현을 확인한 도이고,

도 4는 TNBS 투여 5일 후 림프절과 라미나 프로프리아의 세포를 분리하여 CD25, CD62L 및 GITR의 발현을 확인한 도이며,

도 5는 TNBS 주사 10일째의 Balb/c 마우스의 생존율을 나타낸 도이고,

도 6은 TNBS 투여 10일째 랫트 IgG 및 항-GITR 실험군 생쥐의 대장을 나타낸 도이며,

도 7은 TNBS 투여 10일째 각 실험군 대장의 조직 절편을 염색한 결과를 나타낸 도이고,

도 8은 랫트 IgG 및 항-GITR 투여군의 조직병리학적 분석 결과를 나타낸 도이며,

도 9는 TNBS 투여 10일째 각 실험군의 생존율을 나타낸 도이고,

도 10은 각 실험군의 조직병리학적 분석 결과를 나타낸 도이며,

도 11은 항-GITR 투여에 의한 IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF, IL-12p70의 발현 정도를 나타낸 도이고,

도 12는 항-GITR 항체 투여에 의한 IgG1의 발현 정도를 나타낸 도이며,

도 13은 항-GITR 항체 투여에 의한 IgG2a의 발현 정도를 나타낸 도이고,

도 14는 항-GITR 항체 투여에 의한 IgG2b의 발현 정도를 나타낸 도이며,

도 15는 항-GITR 항체 투여에 의한 IgA의 발현 정도를 나타낸 도이고,

도 16은 항-인간 AITRL 항체의 작용기전을 나타낸 도이며,

도 17은 항-인간 AITRL 항체를 투여한 관절염 화자의 활액막 조직의 현미경 관찰 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항 체 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증성 장질환(IBD, inflammatory bowel disease)은 T 세포의 비정상적인 반응이 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-12 등의 염증성 사이토카인 및 케모카인을 분비하여 염증세포를 축적하고 조직 파괴를 유도함으로써 발병되며, 대표적인 예로 크론씨병(Crohn's disease)과 궤양대장염(ulcerative colitis)이 있다. 또한, 무균상태에서 사육된 쥐는 염증성 장질환을 발생시키지 않지만, 장내 미생물에 대한 지속적인 면역 반응의 결함이 염증성 장질환을 유발하는 것으로 알려져 있다(Itoh J et al., Decreased Bax expression by mucosal T cells favours resistance to apoptosis in Crohn's disease. Gut, 49, pp35-41, 2001).

대부분의 실험 모델에서 장내 미생물에 반응하는 CD4 T 세포는 염증성 장질환을 유발하는 세포로 나타났으며, CD4 T 세포를 제거할 경우 대장염이 완화될 것이라고 보고된 바 있다(Stronkhorst A et al., CD4 antibody treatment in patients with active Crohn's disease: a phase 1 dose finding study. Gut , 40, pp320-327, 1997). 또한, 선천적 혹은 후천적 면역 반응에 의해 생성된 IL-12 또는 IL-4와 같은 사이토카인은 CD4 T 세포가 Th1 또는 Th2 세포로 분화되도록 한다. 이렇게 생성된 Th1의 과도한 반응은 크론병을 유발하며, Th2의 과도한 반응은 옥사졸론(oxazolone) 유도성 대장염 및 TCRα가 결여된 생쥐모델에서 Th2 반응성 대장염(궤양대장염)을 유도하는 것으로 알려져 있다(Fuss IJ et al., CD4+lamina propria (LP) lymphocyte secretion profiles in inflammatory bowel disease. J. Immunol., 157, pp1261-70, 1996).

TNFR(tumour necrosis factor receptor)과 리간드 패밀리 등의 공동자극분자(costimulatory molecules)들은 그들이 가지는 면역 반응의 조절 기능 때문에 광범위하게 조사되어 왔으며, 이들을 통한 신호전달이 T 림프구의 활성, 생존, 분화를 조절하는데 필요하다고 보고되었다(Croft M. Co-stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T-cell immunity, Nat Rev Immunol, 3, pp609-20, 2003). TNFR의 한 종류인 GITR(glucocorticoid-induced TNFR family-related gene)은 비활성화된 CD4 및 CD8 T 세포에서 낮은 수준으로 발현되고, 비활성화된 조절 T 세포(Treg)에서는 높은 수준으로 발현되며, 세포가 활성화됨에 따라 그 발현수준이 증가한다(Shimizu J, Yamazaki S etal., Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat. Immunol. , 3, pp135-42, 2002). 이러한 GITR은 신호전달 과정을 통해 TCR/CD3 복합체를 자극하여 활성화된 T 세포를 자극하고, 조절 T 세포의 활성을 억제함으로써, T 세포에 의한 염증 질환에 관여하게 된다. 또한, 항-GITR 단일클론항체에 의한 GITR의 신호전달이 활성화되면 쥐의 천식과 콜라겐으로 유도된 관절염(CIA)을 악화시키고, Th1과 Th2의 사이토카인의 생산을 크게 증가시킨다고 보고된 바 있다(Patel M, Xu D, Kewin P, Choo-Kang B, McSharry C, Thomson NC, Liew FY. Glucocorticoid-induced TNFR family-related protein (GITR) activation exacerbates murine asthma and collagen-induced arthritis, Eur. J. Immunol., 35, pp3581-90, 2005). 하지만 장만이 가지는 독특한 면역학적 특성 때문에 GITR의 신호전달이 장의 염증에서 유 사한 반응을 가지는지는 확인된 바 없다.

이에 본 발명자들은 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체가 GITR/GITRL 또는 AITR/AITRL 신호를 차단함으로써 염증성 장질환을 치료하는데 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 염증성 장질환은 크론씨병, 궤양대장염, 베쳇병 또는 옥사졸론 유도성 대장염, 바람직하게는 크론씨병 또는 궤양대장염을 포함한다.

본 발명의 약학조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 항-인간 AITRL 단일 클론 항체를 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 함유하는 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 포함하는 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 포함하는 조성물은 1일 0.0001 내지 100㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항 체를 포함하는 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 포함하는 조성물은 염증성 장질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 및 항-인간 AITRL 단일클론 항체 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 및 항-인간 AITRL 단일클론 항체는 염증성 장질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 항-인간 AITRL 단일클론 항체의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적 이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. GST - AITRL 재조합 단백질의 발현과 분리

AITRL 세포밖 도메인(extracellular domain)을 클로닝하기 위하여 프라이머를 제작하였고, 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

하기 표 1의 AITRL GST-센스와 AITRL GST-안티센스를 이용하여 PCR을 수행하여 얻은 PCR 산물을 BamH I / EcoR I 으로 잘라서 같은 제한효소로 절단한 pGEX-6p-1 플라스미드에 라이게이션한 후, 형질전환(transformation)과 플라스미드 추출을 거쳐 클로닝하였다.

유전자(Gene)		프라이머 서열 (Primer Sequence)
AITRL	GST-센스(sense) : 서열번호 1	CGCGGATCCCAATTAGAGACTG
AITRL	GST-안티센스(anti-sense) : 서열번호 2	CCGGAATTCCTAGGAGATGAATTG

이것을 JM109 이콜라이(E. coli, Stratagene)에 형질전환한 뒤 0.1mM IPTG를 이용하여 단백질을 발현시켰다. 발현된 재조합 단백질은 GST 태그를 포함하고 있기 때문에 글로타티온 레진(클론테크)을 사용하여 분리하였다(도 1 참조). AITRL 세포밖 도메인(domain)은 384bp의 DNA로부터 발현되는 14KDa 폴리펩타이드와 26KDa의 GST 태그를 포함하고 있으므로 40KDa이 발현되게 된다. 하기 도 1은 글루타티온 레진을 사용하여 실제 분리한 AITRL이 27KDa의 크기를 나타낸다는 것을 나타내고 있으며, 분리된 단백질은 단일클론 항체를 제작 과정중 Balb/c 마우스의 면역화 및 ELISA 스크리닝을 위한 항원으로 사용되었다.

실시예 2. 항-인간 AITRL 단일클론 항체의 제조

2-1. 마우스의 면역화(immunization)

Balb/c 마우스(잭스원 연구소, Bar Harbor, ME)를 구입하여, 울산대학교 면역제어연구소 동물사육실에서 SPF(specific pathogen-free) 조건하에 사육하여, 12~14 주령이 되었을 때 실험에 사용하였다. 상기 실시예 2에서 분리한 GST-AITRL 단백질을 CFA(complete Freund's Adjuvant)와 1:1의 비율로 유화시켜 Balb/c 마우스에 20ug을 피하 주사하였다. 3주 후 GST-AITRL 단백질을 IFA(incomplete Freund's Adjuvant)와 1:1 비율로 유화시켜 10ug을 2주 간격으로 3회 피하 주사하였다.

2-2. SP2/0 세포 배양

SP2/0 세포주(ATCC)를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 페니실린(100IU/ml), 스트렙토마이신(100㎕/ml)이 포함된 고농도 글루코스 DMEM(Dulbeccos Modified Eagle Medium, GIBCO/BRL)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

2-3. Sp2/0와 B 세포 융합

상기 실시예 2-1에서 면역화한 BALB/c 마우스에서 마지막으로 주사한 4일째에 비장을 떼어내어 주사기로 비장림프구를 준비하였다. 50㎖ 코니칼 튜브에 세포를 이동시켜 세럼-프리(serum-free) DMEM 배지로 가득 채운 후 1000rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 두 번 더 세척한 후, 상층액을 버리고 저삼투압 용해(hypotonic lysis) 방법으로 적혈구를 제거하고 배양액을 채운 후 원심분리 하였다. 마지막 세척과정 동안 sp2/0 세포를 모았다. 비장림프구와 SP2/0 세포를 배지로 재현탁 시킨 후, 혈구계선반(hematocytometer)을 이용하여 세포의 수를 확인하였다. 50㎖ 코니칼 튜브에 비장림프구와 SP2/0 세포를 2:1 비율로 섞어서 800rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 천천히 볼텍싱(vortexing) 하면서 50% PEG (polyethylene-glycol 3000 in DMSO, 시그마사)를 1ml을 1분간 첨가하여 융합을 하였으며, 첨가된 PEG 용액은 고농도 글루코스 (high glucose) DMEM 배지를 1ml/분(min) 2회, 5ml/분(min) 2회, 10ml/분(min) 2회 첨가함으로써 희석하여 세척하였다. 고농도 글루코스 DMEM 배지로 두 번 더 세척한 후 융합된 세포는 HAT이 포함된 배지에 혼탁하여 96 웰 플레이트에 분주함으로서 융합된 세포만을 선별하였다.

2-4. ELISA(Enzyme-linked immuno sorbent assay) 스크리닝

코팅 버퍼 (0.03M 탄산나트륨, 0.068M 탄화수소나트륨, pH9.4)에 상기 실시예 2의 GST-AITRL 단백질을 1㎍/㎖의 농도가 되도록 희석한 뒤에 ELISA 용 96 웰 플레이트에 100㎕/웰씩 분주하고 4℃에서 하루 동안 코팅시켰다. 상층액를 제거한 후 3% 탈지유를 100㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 플레이트에 PBS-T (0.05% Tween-20 in PBS)를 200㎕씩 분주하여 세 번 세척하였다. 융합된 세포의 상층액을 100㎕씩 분주하여 상온에서 두 시간 동안 반응시켰다. PBS-T를 200㎕씩 분주하여 네 번 세척한 후, PBS-T에 항-마우스 IgG-HRP를 1:5000으로 희석하여 웰 당 100㎕씩 분주하고 37℃에서 한시간 동안 반응시켰다. PBS-T로 세 번 세척한 후 HRP 기질 [invitrogen, TMB (tetramethylbenzidine)]을 웰 당 100㎕ 분주한 뒤 빛을 차단하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 stopping solution (2N H₂SO₄)을 동일 양 처리하여 OD₄₅₀nm에서 분석함으로서 양성 클론이 포함된 웰을 선택하였다. 1차 스크리닝에서 다수의 클론들이 얻어 졌으며, 이를 24 웰로 옮겨 배양한 후 단일 세포 클로닝을 각 2 회씩 실시하여, 단일 클론(EB11)을 얻었다.

실험예 1. TNBS 투여 후 CD4 T 세포에서 GITR 발현 여부

TNBS (2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid)를 투여하여 Balb/c 마우스의 대장염을 유도함으로써 CD4 T 세포와 GITR 발현 여부의 상관성을 알아보기 위해 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 실험을 수행하였다(Cong Y et al., CD4+T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease, J. Exp . Med., 16, p85564, 1998 ).

정상 마우스의 림프절(lymph node; LN)로부터 세포를 분리하여 0.5ug/ml 항-CD3 항체로 자극한 다음, 0시간, 24시간 또는 48시간 후에 항-GITR-FITC, 항-CD4 또는 항-CD8-PE 항체로 염색하여 유세포 분석을 수행하였다. 식염수(PBS; phosphate-buffered saline, pH 7.2)로 녹인 TNBS 용액을 동일 부피의 100% 에탄올과 섞어, 50% 에탄올 용액에 용해된 2% TNBS 용액을 만든 후, 3.5 프렌치(F) 카테터를 장착한 1ml 주사기를 이용하여 마취된 Balb/c(잭스원 연구소, Bar Harbor, ME) 마우스의 직장으로 TNBS 용액 100ul (40ug TNBS/g body weight)를 주사한 후, 약 30초간 거꾸로 마우스를 세워 TNBS 용액이 대장 전체로 퍼지도록 한 다음, TNBS 투여 전과 5일 후의 장간막 림프절과 라미나 프로프리아의 세포를 분리하여 항-GITR-FITC, 항-CD4-PE-Cy5, 항-CD25-PE 또는 항-CD62L-PE로 염색한 후, CD4 T 세포만을 분리하여 CD25, CD62L 및 GITR의 발현을 확인하였고, 모든 시표는 FCSCaliber(Bectpm Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.

실험 결과, 도 2 내지 도 4에 나타난 바와 같이, TNBS 투여 전CD4 T 세포와 CD8 T 세포는 낮은 수준으로 GITR를 발현하였으며, CD8 T 세포보다 CD4 T 세포에서 상대적으로 높은 수준의 GITR을 발현하였고(도 2 참조), 장간막 림프절에서는 GITR 발현이 조절 T 세포에 국한된 반면, 라미나 프로프리아에서는 많은 CD25-GITR+CD4+ T 세포들이 있었다(도 3 참조). TNBS 투여 후, 장간막 림프절과 라미나 프로프리아의 대부분의 CD4 T 세포는 CD25와 CD62 리간드의 발현 여부에 상관없이 GITR을 발현하였다(도 4 참조).이로부터 TNBS 투여에 의해 활성화된 T 세포는 GITR을 발현하는데 관여함을 알 수 있었다.

실험예 2. GITR 신호전달에 의한 TNBS 유도성 대장염의 악화

GITR 신호전달 과정에 의해 TNBS 유도성 대장염이 악화되는지 알아보기 위해 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Dohi T et al., Mice deficient in Th1-type and Th2-type cytokines develop distinct forms of hapten-induced colitis, Gastroenterology, 119, pp724-33, 2000).

TNBS 장염을 유도하기 위해, Balb/c(잭스원 연구소, Bar Harbor, ME) 마우스의 직장내로 마우스 몸무게 당 PBS, 50% 에탄올 또는 40ug TNBS을 투여하였고, 대조군으로 PBS 또는 50% 에탄올을 주입하여 사용하였으며, GITR 자극을 위해 TNBS를 투여한 마우스의 복강으로 500ug의 항-GITR 또는 랫트 IgG 항체를 TNBS 투여와 동시에 그리고 3일 후에 두 번 주사한 다음, TNBS 처리 후 5일째 직장을 이소펜탄(2-메틸부탄, 시그마-알드리치사)을 이용하여 냉동시킨 후, OCT(Tissue-Tek optimal cutting temperature) 용액(사쿠라 파인텍사, 토란스, 캘리포니아, 미국)에 담궈 얼렸고, 조직 절편을 6mm 두께로 준비한 후 헤마토실린과 에오신으로 염색한 후, 글리세롤 바이닐 알콜 수용액으로 덮어 광학현미경를 이용하여 조직병리학적으로 관찰하였고, 하기 표 2에 기재된 조건으로 조직병리학적 등급을 결정하였으며, 프리즘 4.0 그래프패드 (샌디에고, 캘리포니아)를 사용하여 통계학적으로 분석하였고, 각 실험군 간의 통계적 유의성을 결정하기 위해서 스튜던츠-t-테스트를 사용하였으며, 그 결과를 도 5 내지 도 8에 나타내었다.

염증성 장질환의 형태	조직병리학적 등급
염증성 장질환의 형태	0	1	2
장샘만곡	없음	부분적	전체적
배상세포가 감소된 장샘만곡	없음	10~12 장샘만곡 당 배상세포 감소가 3군데 이하일 경우	10~12 장샘만곡 당 배상세포 감소가 3군데 이하일 경우
만성 염증 (라미나 프로프리아 내 단핵세포의 침윤)	없음	국지적	다발적
급성 염증(다핵면역세포의 침윤으로 인한 궤양)	없음	표피적	점막층 전체

실험 결과, 도 5 내지 도 8에 나타난 바와 같이, TNBS가 투여된 마우스는 50-60%의 사망률을 보였지만 대조군은 100% 생존하였고(도 5 참조), 항-GITR 항체의 투여시 80% 이상으로 사망률이 증가하였으며, 결장의 길이 또한 짧아졌음을 알 수 있었다(도 6 참조). 특히, 항-GITR 항체투여에 의해 유발된 대부분의 사망은 TNBS 투여 후 4일 이내에 일어났고, 5일 이내에 죽은 대부분의 생쥐는 직장에서 심각한 궤양을 보였으며, GITR 자극은 배상세포의 파괴, 단핵구와 다핵구의 침윤, 궤양 그리고 장샘만곡(crypt distortion) 등을 증가시킴으로써 TNBS에 의해 유도된 대장염을 악화시킴을 알 수 있었다(도 7 참조). 배상세포 파괴와 장샘만곡의 증가는 통계학적 유의성이 없었지만, 급성과 만성 염증의 증가는 통계학적으로 의미가 있음을 알 수 있었다(도 8 참조). 이로부터 GITR 자극이 급성 염증과 만성 염증을 증가시킴으로써 TNBS 투여된 생쥐의 사망률을 증가시킴을 알 수 있었다.

실험예 3. 항- GITR 항체에 의한 대장염에서 CD4 T 세포와 CD8 T 세포의 역할

항-GITR 항체에 의해 악화된 대장염에서 CD4 T 세포와 CD8 T 세포의 역할을 조사하기 위해서 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Dohi T et al., Mice deficient in Th1- and Th2-type cytokines develop distinct forms of hapten-induced colitis, Gastroenterology, 119, pp724-33, 2000).

식염수(PBS; phosphate-buffered saline, pH 7.2)로 녹인 TNBS 용액을 동일 부피의 100% 에탄올과 섞어, 50% 에탄올 용액에 용해된 2% TNBS 용액을 만든 후, 3.5 프렌치(F) 카테터를 장착한 1ml 주사기를 이용하여 마취된 Balb/c(잭스원 연구소, Bar Harbor, ME) 마우스의 직장으로 TNBS 용액 100ul(40ug TNBS/g body weight)를 주사한 후, 약 30초간 거꾸로 마우스를 세워 TNBS 용액이 대장 전체로 퍼지도록 한 다음, TNBS 투여 후 1, 4 또는 8일째에 마우스 복강으로 항-GITR 항체 400ug과 함께 항-CD4 항체(ATCC; 하이브리도마로부터 자체 생산) 400ug 또는 항-CD8 항체(ATCC; 하이브리도마로부터 자체 생산) 400ug을 투여하였고, 조직학적 분석을 위해 각 실험군중 5 마리의 생쥐를 TNBS 투여 후 임의적으로 선택하여 냉동 절편을 준비하였으며, 이들 조직 절편은 각 직장 중 임의적으로 선택된 3 부분으로부터 준비되었다. 이소펜탄(2-메틸부탄, 시그마-알드리치사)을 이용하여 냉동시킨 후, OCT(Tissue-Tek optimal cutting temperature) 용액(사쿠라 파인텍사, 토란스, 캘리포니아, 미국)에 담궈 얼렸고, 조직 절편을 6mm 두께로 준비한 후 헤마토실린과 에오신으로 염색한 후, 글리세롤 바이닐 알콜 수용액으로 덮어 광학현미경를 이용하여 관찰하였으며, 상기 표 2에 기재된 조건으로 조직병리학적 등급을 결정하였고, 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.

실험 결과, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, CD4 또는 CD8 T 세포 제거시 마우스의 생존율이 조금 증가하였고, 항-GITR 항체 단독 또는 항-CD8 항체를 함께 투여한 생쥐는 TNBS 유도성 대장염이 악화되었지만, 항-CD4 항체를 함께 투여한 생쥐는 항-GITR 항체에 의한 질병악화가 유발되지 않았음을 알 수 있었다(도 9 참조). 또한, 조직분석 결과, 장샘만곡, 배상세포감소, 급성과 만성의 염증을 포함한 4 가지 요소 중, 급성 염증반응이 항-GITR 항체 단독 투여 또는 항 CD8 항체와 함께 투여시 높게 증가하였고, CD4 T 세포가 제거된 생쥐는 항-GITR 항체 투여시에도 질병의 정도가 낮았으며, 항-GITR 항체 처리 후 생존한 생쥐들은 좀 더 심각한 만성 염증을 보였다(도 10 참조). 따라서 항-GITR 항체 처리는 급성과 만성 염증의 증가를 야기하며, CD4 T 세포가 주로 항 GITR 항체에 의해 매개되는 대장염의 악화에 원인이 됨을 알 수 있었다.

실험예 4. GITR 신호전달에 의한 염증성 사이토카인의 증가

GITR 신호전달이 CD4 T 세포 의존성 염증성 사이토카인의 증가를 유발하는지 알아보기 위해 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Keates AC et al., Interleukin 16 is up-regulated in Crohn's disease and participates in TNBS colitis in mice, Gastroenterology ,119, pp972-82, 2000 ).

balb/c(잭스원 연구소, Bar Harbor, ME) 마우스에 PBS, 항-CD4 단일클론 항체(ATCC; 하이브리도마로부터 자체 생산) 또는 항-CD8 단일클론 항체(ATCC; 하이브리도마로부터 자체 생산)를 주사하였고, 하루 후 식염수(PBS; phosphate-buffered saline, pH 7.2)로 녹인 TNBS 용액을 동일 부피의 100% 에탄올과 섞어, 50% 에탄올 용액에 용해된 2% TNBS 용액을 만들어 마우스의 직장으로 TNBS 용액 100ul(40ug TNBS/g body weight)를 주사함과 동시에 항-GITR 항체 400ug 또는 랫트 IgG 400ug을 투여하였으며, TNBS를 주사한지 5일째에 채혈하여 혈청을 준비하였고, 혈청에서 IL-6, IL-10, TNF-α, IL-12p70, MCP-1 등과 같은 다양한 사이토카인의 양을 시토메트릭 비드 어레이 키트(CBA, BD Biosciences)를 이용하여 제조사의 실험방법에 따라 측정하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

실험 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 항-GITR을 처리한 마우스에서IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-12p70의 양이 증가되었고, 항-CD8 단일클론 항체에 의해 CD8 T세포를 제거한 경우 사이토카인의 양에 큰 변화가 없었으며, 항-CD4 단일클론 항체에 의해 CD4 T 세포를 제거한 경우 사이토카인의 발현이 억제됨을 알 수 있었다. 이 결과는 IL-6, TNF-α, IL-12p70의 증가시 TNBS 유도성 대장염이 악화된다는 기존의 보고와 일치하고(Yamamoto M et al., IL-6 is required for the development of Th1 cell-mediated murine colitis, J Immunol , 164, pp4878-82,2000), GITR에 의한 IFN-γ와 IL-12p70과 같은 Th1-유형의 사이토카인과 IL-6와 같은 Th2-유형의 사이토카인이 증가되는 현상은 GITR의 자극에 의해 Th1/Th2 유형의 면역반응이 증가된다는 보고와도 일치하며(Diehl S, Rincon M., The two faces of IL-6 on Th1/Th2 differentiation, Mol Immunol, 39, pp531-6, 2002), 이로부터 GITR 신호전달이 CD4 T 세포와 더불어 염증성 사이토카인의 분비를 증가시킴으로써 TNBS 유도성 대장염을 악화시킴을 알 수 있었다.

실험예 5. 항 GITR 처리와 면역 반응

항 GITR을 처리함으로써 GITR 신호 전달 과정을 유도하게 되면 CD4 T 세포 의존적이며 항원 특이적으로 체액성 면역 반응을 증가시키는지 알아보기 위해 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Elson CO, Beagley KW, Sharmanov AT et al., Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance, J. Immunol ., 157, pp2174-85, 1996).

Balb/c(잭스원 연구소, Bar Harbor, ME) 마우스에서 TNBS에 대한 체액성 면역 반응을 나타내는 TNP 특이적인 혈청 IgG 와 배설물에서의 IgA의 양을 이뮤노퓨얼 단일클론 항체 이소타이핑 키트 I(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 측정하였다. 식염수(PBS; phosphate-buffered saline, pH 7.2)로 녹인 TNBS 용액을 동일 부피의 100% 에탄올과 섞어, 50% 에탄올 용액에 용해된 2% TNBS 용액을 만들어 마우스의 직장으로 TNBS 용액 100ul(40ug TNBS/g body weight)를 주사한 뒤 10일 후, 여섯 그룹의 생쥐에서 혈청과 배설물을 수집하였다. 이 후 TNP-BSA가 부착된 플레이트를 사용하여 항원 특이적인 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgA의 양을 이뮤노퓨얼 단일클론 항체 이소타이핑 키트 I(Pierce, Rockford, IL)을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 12 내지 도 15에 나타내었다.

실험결과, 도 12 내지 도 15에 나타난 바와 같이, 항-GITR을 투여한 그룹은 TNBS 투여 후 IgG1과 IgG2a의 양은 거의 차이가 없었지만 IgG2b와 IgA의 양은 증가하였고, CD4 T 세포를 제거한 실험군에서는 TNP-특이적인 IgG1, IgG2b 및 IgA가 완전히 감소하였으며, IgG2a가 미미하게 감소하였고, CD8 T 세포를 제거한 실험군에서는 TNBS 단독 투여나 항 GITR을 처리한 그룹 모두에서 체액성 반응에 별다른 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 이로부터 항-GITR 항체 투여에 의한 TNBS 유도성 대장염의 악화가 CD4 T 세포 의존적인 성향으로 나타나는 IL-6, IFN-γ, TNF 와 IL-12p70의 증가와 더불어 TNP-특이적인 IgG2b와 IgA의 생산을 증가시킴을 알 수 있었다.

참고예 1. 항-인간 AITRL 항체의 작용기전

상기 실험예 1 내지 5를 통해 GITR을 통한 신호전달이 염증반응을 촉진함으로써 만성염증질환들을 악화시킴을 알 수 있었고, GITR/GITRL간의 신호를 차단할 수 있는 항-인간 AITRL 항체를 제작하여 사용할 경우 염증반응을 억제함으로써 질병을 완화시킬 수 있음을 알 수 있었으며, 본 발명의 항-인간 AITRL 항체의 작용기전을 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타난 바와 같이, 사람의 GITR 분자인 AITR(activation-inducible TNFR family member)의 리간드를 인식하는 본 발명의 항 인간 AITRL 단일클론항체(EB11 클론)는 AITR과 AITRL간의 상호작용을 억제함으로써 CD4 및 CD8 T 세포의 활성을 억제하고, 조절 T 세포의 면역억제기능을 강화하여 염증반응을 억제함으로써 염증성 장질환을 치료하는데 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다. (도 16 참조).

실험예 6. 항-인간 AITRL 항체의 선별

상기 실시예 1 내지 3의 과정을 거쳐서 제작된 항-인간 AITRL 항체들 중 가능성이 있는 항-인간 AITRL 항체를 선별하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

관절염환자의 활액막 조직(synovial tissue)으로부터 조직절편을 제작하여 항-인간 AITRL-FITC 항체로 염색하였고, 염색된 조직을 PBS로 세척한 다음 4% 파라포름알데하이드로 고정하였으며, 염색된 절편을 플루로마운트-G로 덮어 올림푸스 FV500 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 촬영하였고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.

실험 결과, 다수의 단일클론 항체 중 한 개의 클론(EB11 클론)이 AITRL과 높은 친화력을 나타냄을 알 수 있었다(도 17 참조).

하기에 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

항-인간 AITRL 단일클론 항체 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

항-인간 AITRL 단일클론 항체 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

항-인간 AITRL 단일클론 항체 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

항-인간 AITRL 단일클론 항체 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄ _,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

항-인간 AITRL 단일클론 항체 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

항-인간 AITRL 단일클론 항체 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

항-인간 AITRL 단일클론 항체 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기와 같이, 본 발명의 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물은 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체의 GITR/GITRL 또는 AITR/AITRL 신호 차단을 통한 TNBS 유도성 대장염의 치료 효과를 나타냄으로써, 염증성 장질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Ulsan university <120> an anti-mouse GITRL monoclonal antibody or an anti-human AITRL monoclonal antibody and the composition comprising the same for preventing and treating inflammatory bowel disease <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for AITRL GST-sense <400> 1 cgcggatccc aattagagac tg 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for AITRL GST-antisense <400> 2 ccggaattcc taggagatga attg 24

Claims

항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 크론씨병, 궤양대장염, 베쳇병 또는 옥사졸론 유도성 대장염인 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 0.1 내지 50% 중량으로 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체를 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 4항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품.