KR101929460B1 - 당유자 추출물을 이용한 면역억제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당유자 추출물이 정상 면역세포와 면역원인 콘카나발린 A(concanavalin A)로 자극된 면역세포 모두에 세포독성을 보이지 않으면서 그 증식을 농도 의존적으로 억제하고 T 세포의 활성화 및 분화를 억제함과 함께 면역세포의 IL-2의 생성을 억제하고 TH1 및 TH2의 면역 반응 모두를 억제하는 활성을 지닌 당유자 추출물을 이용한 면역억제용 조성물을 개시한다.

Description

당유자 추출물을 이용한 면역억제용 조성물{Immunosuppressive Composition Using an Extract Of Citrus grandis}
본 발명은 당유자(Citrus grandis) 추출물을 이용한 면역억제용 조성물에 관한 것이다.
모든 생명체는 박테리아, 바이러스 등의 침입자들의 공격을 방어할 수 있는 복잡하고 다양한 기작을 가지고 있으며, 이러한 인체의 방어체계를 ‘면역체계’라고 한다[1]. 최근에 환경오염물질 등과 같은 다양한 환경적 요인들로 인해 체내 면역력이 저하되고 감염에 대해 더 자주 노출되고 있으며, 더구나 새로운 균, 바이러스 또는 내성균, 내성바이러스들이 꾸준히 출현함으로써, 단순한 항생제 요법으로는 감염증에 대한 치료가 용이하지 않게 되었을 뿐만 아니라 감염의 재발이나 만성화를 초래하기도 한다[2]. 또한 농약, 살충제 등의 사용량 및 식품 내 잔류량 증가, 식품 보존제, 방부제, 착색제 등이 첨가된 가공식품 소비의 증가, 수질·토양·대기오염의 증가, 현대인의 스트레스의 증가, 활동량의 감소 그리고 풍요로운 식생활로 인한 비만 등의 문제들로 인해 암, 재발성, 난치성, 만성화된 호흡기 질병 등 다양한 질병의 환자가 늘어나고 있다.
면역반응(immune response)의 조절은 면역계(immune system)의 이상으로 야기되는 다양한 면역질환의 예방, 완화 및 치료에 있어 중요한 역할을 한다. 생체는 이종단백질이나 외부에서 침입한 바이러스, 세균 등의 항원에 대하여 이를 자기의 체성분과 다르다고 인식하는 면역계를 가지고 있어 이를 제거하려는 면역반응을 일으킨다. 면역계의 주 기능은 자기(self)와 비자기(nonself)를 구분하는 것으로, 자기에 대해서는 면역관용을 보이는 반면 비자기에 대해서는 면역반응을 일으키게 된다. 면역계에 이상이 발생하면 병원체나 외부 침입물질에 대한 대응능력이 부족하게 되고 감염질환, 암 그리고 자가면역질환(autoimmune diseases)과 같은 질병이 발생한다[3]. 때문에 자가면역질환의 예방, 완화 및 치료를 위해서 면역계의 면역 반응을 효율적으로 조절하는 것은 매우 중요하다.
도움 T 세포(Helper T cell)는 사이토카인(cytokine) 분비 양상에 따라 TH1형 사이토카인과 TH2형 사이토카인을 분비하는 두 세포집단으로 나눌 수 있다. TH1 세포는 대표적으로 IFN-γ를 분비하여 대식세포 등을 활성화함으로써 세포성 면역반응을 유도하고 B 림프구의 분화도 세포성 면역반응을 강화하는 방향으로 이끈다[4]. TH2 세포는 IL-4, IL-5 등의 사이토카인을 분비하는데 이들은 호산구를 유인하여 기생충에 대한 방어를 담당하며 B 림프구가 IgE를 생산하도록 유도함으로써 기생충 방어 및 알레르기 반응을 일으킨다[5]. 성숙한 CD4+ T 림프구가 TH1과 TH2 작동세포로 분화하는 것은 미세 환경의 사이토카인 조건에 의해서 큰 영향을 받는다. IL-12는 TH1으로의 분화를 유도하고 IL-4는 TH2로의 분화를 유도하지만 TH1 사이토카인인 IFN-γ는 TH2 생산을 억제하고, IL-4는 TH1 생산을 억제하기 때문에 TH1과 TH2로의 분화는 상호 배타적 또는 경쟁적으로 일어난다[6]. TH1/ TH2 패러다임이 제안되면서 TH1 세포와 TH2 세포의 불균형 때문에 면역이상 질환이 유발된다고 알려지고 있는데, TH1으로의 분화가 과도하게 진행되는 경우는 자가면역질환이 유발되고, TH2으로 과도한 분화는 비염, 아토피 등과 같은 알러지 질환이 유발된다고 생각되고 있다[7].
최근 대기오염과 수질오염 등으로 인한 이상기온 등 지구환경변화로 체력 및 면역력이 약한 노령층을 중심으로 비정상적인 호르몬 분비, 수분, 산·염기 불균형 등으로 인체의 면역반응과 관련된 각종 자가면역질환이 급증하고 있는 추세이다. 자기면역질환은 면역체계의 이상으로 질병을 물리쳐야 할 세포들이 오히려 체내 조직을 공격하게 만드는 질병으로 바이러스, 약물, 햇빛 또는 방사선으로 인한 정상적인 체내 물질의 변화로 인해 나타나며, 유전적 요인이나 체내 항체를 생성하는 세포의 기능 이상으로 자가면역반응이 일어나게 된다[8]. 아토피, 비염, 1형 당뇨, 류마티스 관절염 등의 면역질환으로부터 우리 몸을 보호하고 인체 내 건강한 면역체계를 구축하기 위한 기술개발은 아직 부족한 실정이다.
IL-2(Interlukin-2)는 면역력(immunity)과 면역관용(tolerance) 등 면역계에서 중요한 기능을 하며 주로 생체 내에서 항원에 대한 저항성을 나타내어 T 세포가 증식할 수 있도록 하고, 작동 T 세포(effector T cell)와 기억 T 세포(memory T cells)로의 분화를 촉진하며, 조절 T 세포 및 자연살해세포(natural killer cell)를 활성화시키는데[9,10], IL-2 억제제는 부적절한 T 세포의 증식과 기능을 효과적으로 억제할 것으로 생각되고 있다[11].
당유자는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 운향과에 속하는 귤나무로 제주 자생 감귤류의 일종으로 주로 식용 및 약용으로 이용되어 왔다[12]. 다양한 연구에 의하면 당유자 과육에서 항암 효과[13], 항산화 효과 및 항당뇨 효과[14] 등이 보고되었고, 또한 당유자 과육뿐만 아니라 당유자 잎에서도 항암 효과[15]가 있다고 보고되었다. Lee 등에 따르면 RAW 264.7 cell과 HaCaT cell에서 당유자에 의해 IL-6, iNOS 및 Cox-2의 발현이 억제되었다고 보고하였으며[16], Yang 등은 LPS(lipopolysaccharide)로 자극한 RAW 264.7 cell에서 IL-6와 iNOS의 발현을 억제하여 항염 효과를 유도하는 것으로 보고하였다[17].
본 발명은 당유자의 이러한 항암, 항산화, 항당뇨, 항염 활성 이외에 면역억제 활성을 개시한다.
참조문헌
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[16] Lee H, Kang G, Yoon W, Kang H, Kim Y, Kim S. Anti-inflammatory effect of unripe fruit of Citrus grandis Osbeck in RAW264. 7 and HaCat cells. Korean J Pharmacog. 2006.
[17] EJ Y, HJ L, GJ K, SS P, WJ Y, HK K. Anti-inflammatory Effect of Dangyuja (Citrus grandis Osbeck) Leaves in LPS-stimulated RAW 264.7 Cells. Food Sci Biotechnol . 2009; 18(5):1063-70.
본 발명의 목적은 당유자 추출물을 이용한 면역억제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 당유자 추출물이 정상 면역세포와 면역원인 콘카나발린 A(concanavalin A)로 자극된 면역세포 모두에 세포독성을 보이지 않으면서 그 증식을 농도 의존적으로 억제하고 면역반응의 중추적 역할을 담당하는 T 세포의 활성화 및 분화를 억제함과 함께 면역세포의 IL-2의 생성을 억제하고 TH1 및 TH2 면역 반응 모두를 억제함을 확인할 수 있었다.
본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 면역억제용 조성물은 당유자 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
본 명세서에서, "당유자 추출물"이란 추출 대상인 당유자 과실, 과육 또는 과피를 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방식을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 조추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물을 포함하고, 상기 조추출물을 상기 용매들을 극성이 증가 또는 감소하는 순으로 사용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 분획물을 포함하며, 나아가 크기, 전하, 소수성, 친화성 등의 성질을 이용한 크로마토그래피에 의하여 얻어진 분획물을 포함한다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 아래의 실시예를 참조할 때, 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물(특히 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물)을 의미한다.
또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또 본 명세서에서, "면역억제"란 이식편 숙주반응, 자가면역반응 및 알러지 반응을 억제하는 것을 의미한다. 구체적으로 이들 반응과 관련된 질환, 예컨대 이식편 숙주반응 질환, 류마티스 관절염, 과증식성 피부질환(아토피성 피부염, 접촉성 피부염 등), 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 천식(asthma), 기관지염(bronchitis), 비염 등을, 면역억제 반응을 통하여 치료 또는 예방하거나 그 증상을 경감시키거나 그 발병을 억제 또는 지연시키는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물은 그 유효성분을 용도(적응증), 제형 등에 따라 면역억제 활성 또는 치료를 의도하는 관련 질환의 개선, 치료, 예방 등의 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 15 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 치료 등의 목적상 필요한 기간 동안 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 본 발명의 조성물이 투여될 때, 면역억제 효과 또는 면역질환의 개선, 치료, 또는 예방에 있어 유효한 효과를 유도하기 위해 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 용량을 말한다. 이러한 유효량은 용도(적응증), 제형에 따라 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 건강기능식품에관한법률에 따른 건강기능식품이거나, 식품위생법의 식품공전(식약처 고시, 식품의 기준 및 규격)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 복용되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품위생법에 따른 식품첨가물공전(식약처 고시, 식품첨가물 기준 및 규격)에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 화학적 합성품, 천연 첨가물, 혼합 제제류로 구분하여 한정적으로 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능적 측면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분될 수 있다.
감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.
그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 식품위생법에 따른 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 관련 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 약사법에 따른 의약외품 또는 의약품이거나 의약품일 경우 일반의약품 또는 전문의약품일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약제학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.
약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 파악될 경우에도 그 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 샴푸, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등의 제품 형태를 띨 수 있다. 구체적인 제품 형태에 있어서는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형 등일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되는데, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에 통상적으로 행하여지는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 당유자 추출물을 이용한 면역억제용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 면역억제용 조성물은 식품, 화장품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.
도 1은 말초면역세포에 대한 당유자 추출물의 독성 평가 결과이다.
도 2는 말초면역세포의 증식율에 당유자 추출물이 미치는 영향의 평가 결과이다.
도 3은 말초면역세포의 phenotype에 당유자 추출물이 미치는 영향의 평가 결과이다.
도 4는 말초면역세포의 IL-2 분비에 당유자 추출물이 미치는 영향의 평가 결과이다.
도 5는 말초면역세포의 TH1, TH2 cytokine 분비에 당유자 추출물이 미치는 영향의 평가 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > 당유자 추출물의 제조
세분하여 동결 건조된 당유자의 과피를 가루로 분쇄한 후, 그 분쇄물에 80% 에탄올에 넣고 실온에서 24시간 침출시켰다. 침출시킨 당유자 과피를 감압 농축기(rotary evaporator)를 이용하여 농축한 후 동결 건조하여 분말 형태의 당유자 추출물을 얻어 실험에 사용하였다.
< 실험예 > 면역 억제 활성 실험
<실험예 1> 면역원으로 자극시킨 말초면역세포에서 나타내는 세포독성 효과 측정
<실험예 1-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비
7~10주령 C57BL/6 마우스의 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 얻은 단일 세포 부유액을 염화 암모늄(ammonium chloride, ACK) 용액과 함께 10분간 실온에서 배양했다. 그 후 인산완충용액(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco BRL, Paisley, UK)으로 씻어내고, 10% 소태아 혈청(Gibco BRL)과 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco BRL)이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)에 부유시켰다. 이 후 비장세포의 단일세포부유액에 당유자 추출물을 농도별로 처리하였다. 면역원(면역원)을 이용하여 면역세포를 자극시킨 군은 콘카나발린 A(Concanavalin A)를 10㎍/ml 농도로 처리했다.
<실험예 1-2> 실험 방법
당유자 추출물이 정상말초면역세포와 면역원으로 자극시킨 말초면역세포에 대하여 독성을 나타내는지 확인하기 위해 MTT 분석법을 이용하여 말초면역세포의 생존율을 측정했다. 96-well plate에 위에서 얻은 말초면역세포를 1×105cells/well로 넣고 농도별 추출물과 함께 24시간 배양한 후, MTT용액(5mg/ml)을 각각의 well에 15㎕씩 넣고 4시간 배양한 후 버퍼(solubilization buffer, pH 4.7) 100㎕씩 첨가하여 포르마잔(formazan) 결정을 녹인 후, 570 nm와 630 nm에서 흡광도를 측정했다.
<실험예 1-3> 실험 결과
결과를 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하여 보면, 정상면역세포에서 당유자 추출물은 250㎍/ml까지의 고농도에서 독성을 보이지 않았다(도 1의 A). 면역원을 이용하여 면역세포를 자극시킨 경우 세포의 수가 150% 정도 유의적으로 증가하였으나 당유자 추출물 처리 시 자극된 면역세포의 수적 감소가 모든 처리 농도에서 일어나지 않은 것으로 보아, 당유자 추출물이 면역세포에 대해 독성이 나타내지 않음을 알 수 있었다(도 1의 B).
<실험예 2> 면역원으로 자극시킨 말초면역세포의 증식율에 미치는 영향 측정
<실험예 2-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비
7~10주령 C57BL/6 마우스의 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 얻은 단일 세포 부유액을 염화 암모늄(ammonium chloride, ACK) 용액과 함께 10분간 실온에서 배양했다. 그 후 인산완충용액(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco BRL, Paisley, UK)으로 씻어내고, 10% 소태아 혈청(Gibco BRL)과 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco BRL)이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)에 부유시켰다. 이 후 비장세포의 단일세포부유액에 당유자 추출물을 농도별로 처리하였다. 면역원을 이용하여 면역세포를 자극시킨 군은 콘카나발린 A를 10㎍/ml 농도로 처리했다.
<실험예 2-2> 실험 방법
당유자 추출물이 정상말초면역세포와 면역원으로 자극시킨 말초면역세포의 증식능에 미치는 영향을 확인하기 위해 3H-thymidine incorporation 실험을 수행했다. 96-well plate에 위에서 얻은 말초면역세포를 5×105cells/well로 분주하여 농도별 당유자 추출물과 함께 54시간 배양한 후, 3H-thymidine(42 Ci/mmol; Amersham, USA)을 각각의 well에 1μCi씩 넣고 18시간 배양한 후 유리섬유 여지에 포획하고 건조하여 방사선 측정기(TriLux, USA)를 이용하여 방사선 동위원소 양을 측정했다.
<실험예 2-3> 실험 결과
결과를 도 2에 나타내었다. 3H-thymidine incorporation 실험은 새로운 DNA 복제 시 방사성 동위원소가 포함된 양을 측정함으로써 세포의 증식능을 판단하는 것을 가능하게 한다.
도 2를 참조하여 보면, 정상면역세포 및 면역원으로 자극시킨 면역세포에서 당유자 추출물은 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250 ㎍/ml의 농도에서 농도 의존적으로 세포의 증식율을 감소시키는 것을 확인할 수 있다(A: 정상면역세포, B: 면역원으로 자극시킨 면역세포). 특히 15.6 ㎍/ml의 저농도에서도 면역원으로 자극시킨 말초면역세포의 증식률을 감소시키는 것을 확인하였다. 앞서 <실험예 1>에서 당유자 추출물이 모든 농도에서 독성을 나타내지 않은 것으로 보아 이러한 증식율 감소 효능은 독성에 의한 것이 아닌 것으로 사료된다.
<실험예 3> 면역원으로 자극시킨 말초면역세포의 phenotype에 미치는 영향 측정
<실험예 3-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비
7~10주령 C57BL/6 마우스의 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 얻은 단일 세포 부유액을 염화 암모늄(ammonium chloride, ACK) 용액과 함께 10분간 실온에서 배양했다. 그 후 인산완충용액(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco BRL, Paisley, UK)으로 씻어내고, 10% 소태아 혈청(Gibco BRL)과 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco BRL)이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)에 부유시켰다. 이 후 비장세포의 단일세포부유액에 당유자 추출물을 농도별로 처리하였다. 면역원을 이용하여 면역세포를 자극시킨 군은 콘카나발린 A를 10㎍/ml 농도로 처리했다.
<실험예 3-2> 실험 방법
당유자 추출물이 말초면역세포의 phenotype 변화에 미치는 영향을 확인하기 위해 flow cytometry assay 법을 수행했다. 24-well plate에, 위에서 얻은 말초면역세포를 1×106cells/well로 분주하여 농도별 추출물과 함께 24시간 배양한 후, 면역세포 중 표면에 Fc receptor를 발현하는 세포들에 의한 비특이적 반응을 줄이기 위해 purified anti-mouse CD16/32 단클론항체 (5 ㎍/ml)를 이용하여 4℃에서 15분간 반응시킨 후, FITC- 또는 PE-labelled anti-mouse CD44, anti-mouse CD62L, anti-mouse CD4, anti-mouse CD8 단클론항체 (각 5 ㎍/ml)를 4℃에서 30분간 반응시켰다. 위의 모든 항체는 BD Bio-sciences (CA, USA)에서 구입하였다. 각 반응이 끝난 뒤에 washing buffer를 이용하여 2회에 걸쳐 세포를 세척하고, 염색이 완료된 세포를 1% paraformaldehyde가 포함된 stai-ning buffer에 보관하여 FACS CaliburTM flow cytometer와 Cell-QuestTM software (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
<실험예 3-3> 실험 결과
결과를 도 3에 나타내었다.
콘카나발린 A는 면역세포 중 T 세포의 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있는데, 면역세포에 당유자 추출물을 처리하였을 때 CD4 T 세포와 CD8 T 세포의 전체 수적 변화에는 차이가 없었다(도 3의 A). 그러나 CD44와 CD62L 표면분자의 발현정도를 기준으로 Naive T 세포(CD44-CD62L+), Central memory T 세포(CD44+CD62L+), memory effector T 세포(CD44+CD62L-)로 세분화하여 각 단계별 T 세포의 population을 평가한 결과, 당유자 추출물은 농도 의존적으로 Naive T 세포(CD44-CD62L+), Central memory T 세포(CD44+CD62L+)의 population을 감소시키는 것을 확인하였다(도 3의 B).
<실험예 4> 면역원으로 자극시킨 말초면역세포의 IL-2의 단백질 분비량에 미치는 영향 측정
<실험예 4-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비
7~10주령 C57BL/6 마우스의 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 얻은 단일 세포 부유액을 염화 암모늄(ammonium chloride, ACK) 용액과 함께 10분간 실온에서 배양했다. 그 후 인산완충용액(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco BRL, Paisley, UK)으로 씻어내고, 10% 소태아 혈청(Gibco BRL)과 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco BRL)이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)에 부유시켰다. 이 후 비장세포의 단일세포부유액에 당유자 추출물을 농도별로 처리하였다. 면역원을 이용하여 면역세포를 자극시킨 군은 콘카나발린 A를 10㎍/ml 농도로 처리했다.
<실험예 4-2> 실험 방법
당유자 추출물이 말초면역세포의 IL-2 생성량에 미치는 영향을 확인하기 위해 ELISA assay를 수행했다. 96-well plate에 위에서 얻은 말초면역세포를 1×106cells/well로 분주하여 농도별 추출물과 함께 72시간 배양한 후 각 well로부터 100㎕의 상층액을 얻어 ELISA kit(biolegend)을 사용하여 IL-2의 생성을 확인하였다.
<실험예 4-3> 실험 결과
결과를 도 4에 나타내었다.
여러 종류의 cytokine 중 IL-2는 effector T 세포의 expansion에 관여하여 세포의 증식에 영향을 미치는 중요한 인자이다. 본 실험에서 당유자 추출물이 말초면역세포의 IL-2 생성량에 미치는 영향을 확인하기 위해 ELISA assay를 수행한 결과, 정상면역세포 및 면역원으로 자극시킨 면역세포에서 당유자 추출물은 31.3, 62.5, 125, 250㎍/ml의 농도에서 농도 의존적으로 세포의 IL-2 생성량을 감소시키는 것을 확인하였다(A:정상면역세포, B:면역원으로 자극시킨 면역세포). 이러한 결과는 상기 <실험예 2>의 결과와 종합할 때 IL-2가 세포증식에 관여하는 인자이기 때문인 것으로 사료된다.
<실험예 5> 면역원으로 자극시킨 말초면역세포의 T H 1 , T H 2 단백질 분비량 변화에 미치는 영향 평가
<실험예 5-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비
7~10주령 C57BL/6 마우스의 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 얻은 단일 세포 부유액을 염화 암모늄(ammonium chloride, ACK) 용액과 함께 10분간 실온에서 배양했다. 그 후 인산완충용액(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco BRL, Paisley, UK)으로 씻어내고, 10% 소태아 혈청(Gibco BRL)과 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco BRL)이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)에 부유시켰다. 이 후 비장세포의 단일세포부유액에 당유자 추출물을 농도별로 처리하였다. 면역원을 이용하여 면역세포를 자극시킨 군은 콘카나발린 A를 10㎍/ml 농도로 처리했다.
<실험예 5-2> 실험 방법
당유자 추출물이 말초면역세포의 TH1, TH2 cytokine의 생성량에 미치는 영향을 확인하기 위해 ELISA assay를 수행했다. 96-well plate에 위에서 얻은 말초면역세포를 1×106cells/well로 분주하여 농도별 추출물과 함께 72시간 배양한 후, 각 well로부터 100㎕의 상층액을 얻어 ELISA kit (biolegend)을 사용하여 대표적인 TH1 cytokine인 IFN-γ와 TH2 cytokine인 IL-4의 생성량을 확인하였다.
<실험예 5-3> 실험 결과
결과를 도 5에 나타내었다.
helper T 세포는 cytokine 분비 양상에 따라 TH1과 TH2 의 세포로 나뉠 수 있는데, TH1 세포는 대표적으로 IFN-γ를 분비하여 대식세포 등을 활성화함으로써 세포성 면역반응을 유도하고, 반면 TH2 세포는 IL-4 등의 cytokine을 분비한다. 본 실험에서 당유자 추출물이 말초면역세포의 TH1, TH2 cytokine 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해 ELISA assay를 수행한 결과, 면역원으로 자극시킨 면역세포에서 당유자 추출물 125, 250㎍/ml의 농도에서 IFN-γ의 생성량을 크게 감소시키는 것을 확인하였다. 반면 TH2 cytokine인 IL-4의 생성량은 15.6㎍/ml 당유자 추출물 저농도 처리에 의해서도 감소하는 결과를 보였다. 이 결과를 통하여 당유자 추출물이 면원으로 자극된 면역세포에서 TH1의 면역반응과 TH2의 면역반응을 모두 억제하는 것을 알 수 있었다.

Claims (6)

  1. 당유자 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물로서,
    상기 면역억제는 TH1 세포의 면역반응의 억제인 것을 특징으로 하는,
    면역억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 당유자 과피 추출물은 당유자 과피를 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매에 의하여 추출하여 얻어진 것을 특징으로 하는 면역억제용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 면역억제는 면역질환의 개선, 예방 또는 치료이고,
    상기 면역질환은 자가면역질환인 것을 특징으로 하는 면역억제용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 면역억제용 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 면역억제용 조성물.





  6. 삭제
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