KR102093817B1 - 면역기능 증진 활성이 있는 연잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조방법 - Google Patents

면역기능 증진 활성이 있는 연잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역기능 증진 활성이 있는 연잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조방법에 관한 것으로 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 45 내지 70 중량%, 산성 다당(uronic acid)은 20 내지 45 중량%, KDO 유사 물질은 0.5 내지 10 중량%, 단백질 3 내지 20 중량% 및 페놀 0.1 내지 5 중량%를 포함함으로써, 면역기능이 우수하게 향상되며 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있어 장기적으로 일상생활의 식이 및 생활습관을 통하여 면역기능을 향상시킬 수 있다.

Description

면역기능 증진 활성이 있는 연잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조방법{Polysaccharide fraction isolated from Nelumbo nucifera leaf with immune-enhancing activity and method for producing the same}
본 발명은 면역기능이 우수하게 향상되며 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있어 장기적으로 일상생활의 식이 및 생활습관을 통하여 면역기능을 향상시킬 수 있는 연잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 생활수준이 높아지고 식생활이 서구화되면서 영양과잉, 운동부족 등으로 인한 비만, 당뇨, 고혈압 및 심장병 등과 같은 생활 습관병(성인병) 발병이 높아지고 있다. 또한, 평균수명 연장으로 인한 노령화 사회로의 진입 속도가 빨라지면서 건강증진에 대한 관심이 높아지고 있다.
건강증진(health promotion)이란 질병, 특히 만성 퇴행성질환이나 감염증, 계속되는 스트레스에 대한 저항력의 증가 그리고 일상의 활동력의 증대를 꾀하는 것으로 그 방책으로는 영양의 개선, 면역기능 강화, 적절한 운동과 휴식, 정신적 활동의 지속 등 생활양식 전반에 미치는 관리가 필요하다.
특히, 면역력이 높으면 평소에 질병이 잘 걸리지 않으며, 설혹 질병에 걸리더라도 회복이 빠르다. 이러한 건강한 상태를 지속적으로 유지하면서 나이를 먹으면 수명이 연장되는 것은 자명한 일이다. 따라서 면역력은 인간의 건강과 수명에 직결되어 있으며, 건강을 유지하고 수명을 연장하기 위해서는 면역력을 관리하는 것이 필수적이라고 할 수 있겠다.
면역(Immune)이란, 인간 및 동물의 체내에서 외래성 및 내인성 이물질을 생리적으로 인식하여 배제하고, 항상성을 유지시키기 위한 기작을 일컫는다. 여기에서 이물질을 항원(antigen)이라고 하며, 이를 제거하는 과정에 수많은 종류의 백혈구 세포와 단백질이 관여한다. 면역은 크게 태어날 때부터 지니고 있는 선천면역과 후천적으로 생활 등에 적응되어 얻어지는 획득면역으로 구분된다.
선천면역(innate immunity)은 자연면역, 자연저항이라고도 한다. 항원에 대해 비특이적으로 반응하며 특별한 기억작용은 없다. 선천적인 면역체계로는 항원의 침입을 차단하는 피부·점액조직, 상산성의 위산, 혈액에 존재하는 보체(complement) 등이 있다. 세포로는 식균작용을 담당하는 대식세포(macrophage)와 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leukocyte), 감염세포를 죽일 수 있는 K세포 등이 있다. 또한, 대식세포에 의해 생산되는 사이토카인(cytokine)이 있다. 실제로 대부분의 감염은 상기 선천면역에 의해 방어된다.
획득면역(acquired immunity)은 선천면역을 보강하는 역할을 하며 후천면역, 적응면역(adaptive immunuty)이라고도 한다. 항원이 체내에 침입하면 림프구에 의한 면역반응이 일어나 항원에 대한 강한 저항성이 기억되어 다시 항원이 침입할 때 특이적으로 반응하여 효과적으로 항원을 제거할 수 있다. 여기에서 림프구 (lymphocytes)는 척추동물 및 포유류에서 면역 반응을 맡고 있는 백혈구 가운데 하나로 전체 백혈구 중 약 25% 정도를 차지하고 있으며, 흉선(thymus)에서 성숙되고 변형되어 면역항체를 보유하고 있어서 항원이 체내에 침입하면 그 항원이 몸 안에서 해로운 반응을 하지 못하도록 인체의 면역반응에 일차적으로 반응하는 세포이다.
획득면역에는 두 종류의 림프구가 있는데 세포성 면역(cellular immunity)을 담당하는 T세포와 체액성 면역(humoral immunity)을 담당하는 B세포로 크게 구분된다. T세포는 가슴샘의 상피세포에서 특수한 내부 환경과 흉선의 액성인자에 의해 림프구로 분화하는 세포로, B세포에 항체생산 자극을 주고 종양 세포 등의 항원을 직접 공격한다. B세포는 가슴샘과는 독립되어 골수에서 림프구로 분화하는 세포로, 항원자극 및 T세포를 매개로 한 자극에 따라 항체생산세포로 성숙하여 IgM, IgG, IgA, IgE의 항체를 생산하고 분비한다.
항원 감염에 대한 최초의 인식은 주로 대식세포(macrophage)가 수행한다. 대식세포가 항원을 탐식하는 과정에서 면역반응을 매개하는 사이토카인(cytokine)이 생산된다.
사이토카인은 신체의 방어체계를 제어하고 자극하는 신호물질로 사용되는 당단백질로 면역, 감염병, 조혈기능, 조직회복, 세포의 발전 및 성장에 중요한 기능을 한다. 사이토카인은 국소부위에 염증을 유발함으로서 면역세포가 감염부위에 모이게 하는 기능을 가지고 있어, 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)이라 불리기도 한다. 가장 중요한 면역기능은 인터루킨(Interleukin-1,-6,-12), 인터페론 감마(IFN-γ), 종양괴사인자(TNF)로 알려진 사이토카인의 집단에 의해 수행된다.
인터루킨(Interleukin)은 면역반응이 일어나는 여러 단계에 작용하여 면역반응을 조절함으로써 인체의 방어작용에 중요한 역할을 하는 물질로, 그 종류는 IL-1,6,12 등이 있다. 이 중 IL-12는 p35와 p40 단백질로 구성된 사이토카인으로, 선천면역과 획득면역을 서로 연결시키는 매우 중요한 면역학적 기능을 하며, 내인성 항원의 제거에 관여하는 여러 가지 작동세포 즉, 대식세표(macrophage), NK 세포 및 T-세포의 활성화를 유도한다.
종양괴사인자인 TNF(tumor necrosis factor)는 세균벽에서 나오는 내독소인 지다당체에 의해 T세포에서 분비되는 종양을 괴사시키는 물질을 말하는 것으로, 가장 중요한 염증인자이며 때때로 중증의 전신적 염증을 유발하기도 한다. 그러나 면역학적 측면에서 TNF는 감염부위로 혈액 내 백혈구인 호중구 및 단핵구를 집합시키고 감염세포의 살해능을 가지는 작동세포로의 분화 및 활성화를 유도하는 것으로 보고 있다. 이러한 TNF의 기능은 화학주성을 가지는 사이토카인의 생산 유도능과 함께 혈관내피세포 및 백혈구 간의 부착분자(adhesionmolecule)의 친화력을 높이는 기능에 의한다.
이와 같이 면역기능은 대식세포, 림프구(T세포, B세포) 등의 매우 다양한 세포와 인터루킨, TNF 등의 사이토카인과 같은 단백질의 작용에 의해 이루어진다.
한편, 연(蓮)(Nelumbo nucifera, Sacred lotus)은 수련과(Nymphaeaceae)에 속한 다년생 수생 식물로서 아시아 남부, 북호주가 원산지이다. 인도와 중국을 중심으로 열대, 온대의 동부아시아를 비롯한 한국, 일본 등에 널리 분포하고 있는 식물로 수심 2.5 m 이내의 범람지역, 호수, 습지, 늪, 호수 및 연못 등에서 서식하며 특히 불교에서는 예로부터 연을 신성시하여 관상용으로 많이 재배하였다. 국내에서 식용을 목적으로 연을 재배하기 시작한 것은 약 50년 전으로 알려져 있으며 최근에는 농가에서 수익성 작물로 연못이나 논에 연을 심어서 대량으로 인공재배하는 곳이 늘고 있다.
상기 연은 뿌리인 연근, 홍색 또는 백색의 연꽃, 열매인 연밥과 연잎으로 나뉜다. 즉, 연은 연잎(lotus leaf), 연자육(lotus seed), 연근(lotus root) 등의 부위에 따라 식용 및 약용으로 널리 사용되어 왔으며, 연꽃은 관상용과 차의 재료로 이용해 왔다. 아시아 지역에서는 잎으로 밥을 싸서 먹거나, 어린 잎 또는 어린 줄기를 다른 채소와 함께 샐러드나 피클로 만들어 먹기도 하며, 뿌리를 각종 요리의 재료로 다양하게 조리하여 스프(soup), 튀김 등으로 섭취해 왔다. 우리나라에서는 예전부터 반찬용으로 연근(땅속줄기)의 사용이 많았으며, 백련의 꽃과 잎을 건조시켜 연꽃차와 연잎차로 활용하며 당뇨병 및 간 기능 증진에 효과가 알려져 차(茶)로 음용하고 있다.
연잎은 nelumboside, nuciferine, coclaurine, roemerine 등과 같은 알칼로이드성분을 함유하고 있어 진정작용과 해열작용이 있으며, 당뇨 및 고지혈증에 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 또한 gallic acid와 methyl gallate 등의 aromatic acid류 및 quercetin, isoquercitrin, hyperoside, rutin, kaempferol 등의 flavonoid류 등의 생리활성 성분을 함유하는 것으로 알려져 있다. 또한 주석산, 구연산, 사과산, 호박산, 탄닌 등의 성분에 대한 연구도 보고된 바 있다.
한편, 연잎의 일반성분 분석 결과에 의하면 연잎 분말은 수분함량 0-2.98%, 조지방 함량 0.93-1.0%, 조단백질 함량 16.9-23.9%, 조회분 함량 8.1-9.3%, 탄수화물 함량 63.8-65.2% 수준을 나타낸다고 보고되었다(Lee 등, 2008; Park 등, 2009; Park 등 2010). 즉, 당질(sugar) 성분은 건조된 연잎의 60% 이상으로 고함유되어 있는 주요한 성분이다. 그럼에도 불구하고 연잎의 당 성분의 효능에 대한 연구는 Zeng 등(2016)이 임신성 당뇨쥐에서 연잎 유래 셀레늄-다당체의 항당뇨 활성을 보였다고 보고하였을 뿐, 연잎 유래 당 성분의 면역활성 등 그 외의 효과에 대한 연구는 미비한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2015-0000219호 대한민국 등록특허 제10-1176435호
본 발명의 목적은 면역기능을 향상시킬 수 있는 연잎 유래 다당 분획물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 연잎 유래 다당 분획물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진을 위한 건강식품 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증진을 위한 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 연잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 45 내지 70 중량%, 산성 다당(uronic acid) 20 내지 45 중량% 및 KDO 유사 물질 0.5 내지 10 중량%로 포함될 수 있다.
상기 연잎 유래 다당 분획물은 단백질 3 내지 20 중량% 및 페놀 0.1 내지 5 중량%를 더 포함할 수 있다.
상기 중성 다당은 아라비노오스(arabinose), 람노오스(rhamnose), 갈락토오스(galactose), 자일로스(xylose), 글루코스(glucose), 만노스(mannose) 및 푸코스(fucose)를 포함할 수 있다.
상기 산성 다당은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것일 수 있다.
상기 KDO 유사 물질은 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)로 이루어진 것일 수 있다.
상기 연잎 유래 다당 분획물은 분자량이 5 내지 550 KDa의 다당이 50 중량% 이상 함유된 것일 수 있다.
상기 연잎 유래 다당 분획물은 면역 기능 증진활성이 있을 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 연잎 유래 다당 분획물을 제조하는 방법은 (A) 연잎 분말과 용매를 혼합하여 추출하여 추출물을 수득하는 단계; 및 (B) 상기 추출물을 용매 침지 또는 비열처리 공정으로 분획하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 (A)단계에서 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있다.
상기 (B)단계에서 분획된 연잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 45 내지 70 중량%, 산성 다당(uronic acid) 20 내지 45 중량%, KDO 유사 물질 0.5 내지 10 중량%를 포함할 수 있다.
상기 연잎 유래 다당 분획물은 단백질 3 내지 20 중량% 및 페놀 0.1 내지 5 중량%를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 면역기능 저하로 기인되는 질환은 감염성 질환, 염증성 질환, 알러지 질환 또는 만성피로로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 면역기능 증진을 위한 건강식품 조성물은 상기 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 면역기능 증진을 위한 화장료 조성물은 상기 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 연잎 유래 다당 분획물은 면역 기능을 증진시키는 효능이 매우 뛰어나며, 독성이 없으므로 장기적으로 일상생활의 식이 및 생활습관을 통하여 면역기능을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 연잎 유래 다당 분획물은 경쟁력있는 면역 증강용 식품, 면역 증강용 화장품 및 면역 증강용 의약품 제조에 효과적이다.
도 1a는 본 발명의 비교예 1에 따라 제조된 열수추출 상등액(LLW)에 대한 분자량 그래프이고, 도 1b는 본 발명의 비교예 2에 따라 제조된 열수추출 분획물(LLW-S)에 대한 분자량 그래프이며, 도 1c는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 에탄올 침전을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1)에 대한 분자량 그래프이고, 도 1d는 본 발명의 실시예 2에 따라 제조된 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2)에 대한 분자량 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 에탄올 침전법을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1), 실시예 2에 따라 제조된 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2), 비교예 1에 따라 제조된 열수추출 상등액(LLW) 및 비교예 2에 따라 제조된 열수추출 분획물(LLW-S)에 대한 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 에탄올 침전법을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1), 실시예 2에 따라 제조된 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2), 비교예 1에 따라 제조된 열수추출 상등액(LLW) 및 비교예 2에 따라 제조된 열수추출 분획물(LLW-S)에 대한 산화질소(NO) 생성능을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 에탄올 침전법을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1), 실시예 2에 따라 제조된 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2), 비교예 1에 따라 제조된 열수추출 상등액(LLW) 및 비교예 2에 따라 제조된 열수추출 분획물(LLW-S)에 대한 IL-6 수준을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 에탄올 침전법을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1), 실시예 2에 따라 제조된 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2), 비교예 1에 따라 제조된 열수추출 상등액(LLW) 및 비교예 2에 따라 제조된 열수추출 분획물(LLW-S)에 대한 TNF-α 생성능을 측정한 그래프이다.
본 발명은 면역기능이 우수하게 향상되며 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있어 장기적으로 일상생활의 식이 및 생활습관을 통하여 면역기능을 향상시킬 수 있는 연잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 면역기능 증진 활성이 있는 연잎 유래 다당 분획물의 원재료로 사용되는 연잎은 가능한 6월 초순부터 10월 중순에 채취하게 되는데 통상 연잎은 6월 초순에 나기 시작해서 10월 중순이 되면 연잎이 퇴색하기 때문에 가능한 그 전에 채취하여 사용하고, 크기는 지름 40 cm 정도의 반패모양과 유사하게 생겼다. 하엽(荷葉)이라 불리는 연잎은 주로 건조된 형태로써 사용되며 맛이 쓰고 성질은 유하며 예로부터 출혈성 위궤양이나 위염, 치질, 출혈, 설사, 두통과 어지럼증, 토혈, 산후 어혈치료, 야뇨증, 해독작용 등에 대한 민간치료제로 사용되어 왔다.
본 발명의 연잎 유래 다당 분획물은 (A) 연잎 분말과 용매를 혼합하여 추출하여 추출물을 수득하는 단계; 및 (B) 상기 추출물을 용매 침지 또는 비열처리 공정으로 분획하는 단계;를 포함하여 제조된다.
먼저, 상기 (A)단계에서는 연잎 분말과 용매를 1 : 20 내지 50 중량비로 혼합한 후 2 내지 8시간, 바람직하게는 3 내지 5시간 동안 90 내지 110 ℃에서 추출한 후 상기 추출액을 3 내지 7 ℃에서 5000 내지 8000xg로 10 내지 30분 동안 원심분리한 다음 잔사를 제거하고 상등액을 분리한다.
상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있다.
다음으로, 상기 (B)단계에서는 상기 추출물(또는 분리된 상등액)을 에탄올 및 메탄올과 같이 유기용매에 침전시켜 분획하거나 비열처리 공정으로 분획한다.
일예로, 상기 연잎 상등액을 에탄올 및 메탄올과 같이 유기용매에 침전시켜 분획하는 방법은 상기 상등액에 최종 농도가 70 내지 75%가 되도록 유기용매를 첨가한 후 -10 내지 -30 ℃에서 10 내지 30시간 동안 정치하면서 다당을 침전시킨 다음 상기 다당 침전물을 3 내지 7 ℃에서 5000 내지 8000xg로 10 내지 30분 동안 원심분리하여 회수하고 이를 투석하는 과정을 포함한다.
상기 유기용매로는 70 내지 95%의 유기용매 수용액이 바람직하다.
다른 일례로는, 상기 연잎 상등액을 비열처리 공정, 바람직하게는 한외여과장치로 처리하는 과정을 포함한다.
상기 연잎 유래 다당 분획물은 분자량이 5 내지 550 KDa의 다당이 50 중량% 이상, 바람직하게는 60 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 70 중량% 이상, 가장 바람직하게는 80 중량% 이상으로 함유된 것으로서, 일예로 이러한 함량의 다당을 함유하는 연잎 유래 다당 분획물은 30 KDa의 여과막을 구비한 한외여과장치로부터 수득되며, 바람직하게는 30 KDa의 여과막을 통과하지 않은 분자량이 큰 분획물이다. 상기 다당은 중상 다당과 산성 다당을 합한 것을 의미한다.
상기 연잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 45 내지 70 중량%, 산성 다당(uronic acid) 20 내지 45 중량% 및 KDO 유사 물질 0.5 내지 10 중량%, 단백질 3 내지 20 중량% 및 페놀 0.1 내지 5 중량%를 포함한다.
상기 산성 다당은 갈락투론산(galacturonic acid) 및 글루쿠론산(glucuronic acid)으로 이루어지며; 상기 중성 다당은 아라비노오스(arabinose), 람노오스(rhamnose), 갈락토오스(galactose), 자일로스(xylose), 글루코스(glucose), 만노스(mannose) 및 푸코스(fucose)로 이루어진다.
또한, 상기 KDO 유사 물질은 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)로 이루어진다.
상기 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물로는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 면역 증진용 건강식품 조성물 또는 면역기능 향상을 위한 화장료 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 연잎을 언급하면서 사용되는 용어 '분획물'은 추출용매를 처리하여 얻은 분획물뿐만 아니라 연잎 유래 다당 분획물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 연잎 유래 다당 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 연잎 유래 다당 분획물은 광의로는 연잎을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 연잎의 가공물, 예컨대, 연잎 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 연잎 유래 다당 분획물로 실험을 진행하긴 하였으나, 연잎의 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 함유하는'이란 연잎 유래 다당 분획물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 연잎 유래 다당 분획물은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 연잎 유래 다당 분획물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 연잎 유래 다당 분획물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피부 외용제, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태(경구제)로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 면역기능 향상을 위한 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 연잎 유래 다당 분획물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 연잎 유래 다당 분획물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물이 함유된 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 연잎 유래 다당 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 연잎 유래 다당 분획물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 인체 면역기능 향상을 위한 의약 또는 식품의 제조를 위한 연잎 유래 다당 분획물의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 연잎 유래 다당 분획물은 면역기능 향상을 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 연잎 유래 다당 분획물을 투여하는 것을 포함하는 면역기능 향상방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 대파의 엽초부, 엽신부 또는 이들 혼합물의 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에는 상기의 화장료 조성물과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있으며, 이러한 배합 성분으로서는 물, 유분, 계면활성제, 보습제, 점증제, 방향제, 보존제, 중화제, 에몰리언트제, 피부보호제 및 피부컨디셔닝제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상 사용되는 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있으며, 그 예로 스킨, 유액, 에센스, 로션, 미용액, 바디로션, 바디젤, 바디에센스, 바디세정제, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징 겔, 팩, 마사지크림, 마사지겔, 영양크림, 수면크림 및 수분크림으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 에탄올 침전법을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1)
연잎은 서울 경동시장(Korea)에서 구입하여 조분쇄 후 시료로 사용하였다. 조분쇄한 연잎에 30배(w/v)의 증류수를 가하고 90 ℃에서 4시간 동안 가열처리한 후 상기 수득된 열수추출액을 4 ℃, 6,000ㅧg에서 20분간 원심분리한 다음 잔사를 제거하고 상등액(LLW)을 분리하였다.
상기 분리한 상등액에 최종농도가 75%가 되도록 3배 부피(v/v)의 주정을 가하여 -20 ℃에서 하룻밤(12시간)동안 정치하면서 다당을 침전시켰다. 이때 발생한 침전물을 4 ℃, 6,000Xg에서 20분간 원심분리한 후 상등액(비교예 2로 이용)을 제외한 물질을 회수하여 소량의 증류수에 재용해하고 3일간 투석(MWCO : 6,000-8,000 Da)한 후 동결건조(Tokoyo Rikakikai Co. Ltd, FD-1000, Tokyo, Japan)함으로써 연잎 유래 조다당 분획물(LLW-P1)을 얻었다.
실시예 2. 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2)
연잎은 서울 경동시장(Korea)에서 구입하여 조분쇄 후 시료로 사용하였다. 조분쇄한 연잎에 30배(w/v)의 증류수를 가하고 90 ℃에서 4시간 동안 가열처리한 후 상기 수득된 열수추출액을 4 ℃, 6,000Xg에서 20분간 원심분리한 다음 잔사를 제거하고 상등액(LLW)을 분리하였다.
상기 분리한 상등액을 분자량(MWCO; molecular weight cut off)이 30 KDa인 여과막을 사용한 한외여과장치(Sartocon-Mini system, Sartorius Co., Gㆆttingen, Germany)에 통과하지 않은 물질을 분리하여 동결건조(Tokoyo Rikakikai Co. Ltd, FD-1000, Tokyo, Japan)함으로써 연잎 유래 조다당 분획물(LLW-P2)을 얻었다.
상기 한외여과장치는 1L 용량의 공급액조, 공급액 펌프, 여과 카트리지 및 공급액과 한외여과 투과액에 대한 압력 게이지로 구성되는 실험실 규모의 한외여과 장치(Sartocon-Mini system, Sartorius Co., Gㆆttingen, Germany)를 사용하여 수행하였다.
비교예 1. 열수추출 상등액(LLW)
상기 실시예 1에서 제조된 상등액(LLW)을 이용하였다.
비교예 2. 열수추출 분획물(LLW-S)
상기 실시예 1에서 에탄올을 가하여 -20 ℃에서 하룻밤(12시간)동안 정치한 하여 침전된 침전물로부터 원심분리하여 분리한 상등액을 여과하고 동결건조하여 열수추출 분획물(LLW-S)을 얻었다.
<시험예>
시험예 1. 분자량 측정
도 1a는 본 발명의 비교예 1에 따라 제조된 열수추출 상등액(LLW)에 대한 분자량 그래프이고, 도 1b는 본 발명의 비교예 2에 따라 제조된 열수추출 분획물(LLW-S)에 대한 분자량 그래프이며, 도 1c는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 에탄올 침전법을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1)에 대한 분자량 그래프이고, 도 1d는 본 발명의 실시예 2에 따라 제조된 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2)에 대한 분자량 그래프이다.
상기 실시예 및 비교예에 따라 제조된 연잎 유래 조다당 분획물의 정제도 및 분자량을 측정하기 위하여 20 mg/mL의 농도로 증류수에 희석하여 0.45 μm 여과지(Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan)를 통해 여과한 후, 50 mM 포름산 암모늄(ammonium formate)(pH 5.5)로 평형화된 Asahi-Pak GS-520+GS-320 packed column (각각 0.76 X 30 cm, Showa denco Co., Tokyo, Japan)이 장착된 고속액체크로마토그래피(HPLC)(Agilent Technologies Co., Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 분자량 측정은 표준물질 pullulan series(1.32, 6, 10, 48.8, 113, 366K)를 이용하여 retention time을 구한 후, 각 분자량에 대한 Kav값을 산출하여 작성한 표준곡선으로부터 환산하여 결정하였다.
도 1a 내지 도 1d에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 에탄올 침전법을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1, 수율:0.64)은 1 kDa 이하의 저분자물이 제거된 비교적 정제된 연잎 유래 고분자물로 수득되었으며, 주요 피크로서 20-50 kDa과 5-15 kDa의 고분자를 함유하는 것으로 확인하였다. 또한, 실시예 2의 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2, 수율: 0.122%)은 더욱 효과적으로 1 kDa 이하의 저분자물을 제거할 수 있었으며, 5-15 kDa 이상의 고분자물을 주로 함유하는 것을 확인하였다.
반면, 비교예 1의 열수추출 상등액(LLW, 수율: 12.01%)은 1 kDa 이하의 저분자물인 것으로 확인되었으며, 비교예 2의 열수추출 분획물(LLW-S, 수율 10.81%) 역시 1 kDa 이하의 저분자물이 주요성분으로서 상기 LLW에 포함된 저분자물이 LLW-S 분획으로 이동했음을 알 수 있었다.
시험예 2. 성분분석
중성 다당 함량은 갈락토오즈(galactose)를 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid법(Dubois 등, 1956)으로, 산성 다당(uronic acid) 함량은 갈락투론산(galacturonic acid)을 표준물질로 하여 m-하이드록시비페닐(m-hydroxybiphenyl)법(Blumenkrantz & Asboe-Hansen, 1973)으로, 단백질 함량은 표준물질로 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 사용하여 Bradford법(Bradford MM, 1976)으로, TBA-positive material의 함량은 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid(KDO)를 표준물질로하여 thiobarbituric acid 비색정량법(Karkhanis 등, 1978)을 실험실 여건에 맞게 변형하여 사용하였다. 또한, 총 페놀함량은 갈릭산(gallic acid)을 표준물질로 사용하여 Singleton 등 (1999)의 방법에 따라 folin-Ciocalteu reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 측정하였다.
하기 [표 1]은 각 성분의 함량을 나타낸 것이고, [표 2]는 각 함량을 중량%로 나타낸 것이다.
구분(단위:mg/g) 실시예 1 실시예 2 비교예 1 비교예 2
중성 다당 401.2±1.71 483.2±7.22 327.8±4.05 321.0±2.97
산성 다당 208.3±2.88 296.8±3.73 123.8±0.61 119.3±7.22
단백질 42.0±1.39 66.1±1.89 23.4±2.65 25.2±0.95
KDO 유사물질 6.64±0.17 12.6±0.50 5.02±0.09 4.70±0.21
총 페놀 2.38±0.08 6.83±0.79 6.88±0.27 7.43±0.16
총 함량 660.5±5.76 865.5±3.74 486.8±3.80 477.6±9.33
구분(단위:중량%) 실시예 1 실시예 2 비교예 1 비교예 2
중성 다당 60.7±0.27 55.8±0.62 67.3±0.65 67.2±0.70
산성 다당 31.5±0.16 34.3±0.50 25.4±0.22 25.0±1.04
단백질 6.36±0.16 7.64±0.25 4.80±0.53 5.27±0.30
KDO 유사물질 1.00±0.03 1.46±0.06 1.03±0.02 0.98±0.06
총 페놀 0.36±0.01 0.79±0.09 1.41±0.06 1.55±0.02
총 함량 100 100 100 100
위 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 2에 따라 제조된 연잎 유래 조다당 분획물은 비교예 1 및 2의 분획물에 비하여 중성 다당, 산성 다당, 단백질 및 KDO 유사 물질에 대한 함량이 높으며, 총 성분함량 역시 높은 것을 확인하였다.
각 물질을 중량%로 계산하면, 실시예 1 및 2에 따라 제조된 연잎 유래 조다당 분획물에 함유된 산성 다당의 함량 비율이 비교예 1 및 2의 분획물에 함유된 산성 다당의 함량 비율에 비하여 높은 것을 확인하였다.
시험예 3. RAW 264.7 세포 증식 효과
세포 배양
마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. 상기 RAW 264.7 세포는 10% FBS 및 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 Dulbecco' modified Eagle' medium (DMEM: Gibco BRL, GrandIsland, NY, USA) 배지를 이용하여 37 ℃, 5% CO2로 조절된 배양기에서 배양하였다.
3.1 세포 생존율 측정
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 에탄올 침전법을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1), 실시예 2에 따라 제조된 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2), 비교예 1에 따라 제조된 열수추출 상등액(LLW) 및 비교예 2에 따라 제조된 열수추출 분획물(LLW-S)에 대한 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
RAW 264.7 cell에 대한 시료의 세포독성 수준을 측정하기 위해서 CCK-8 assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. RAW 264.7 세포를 2X105 cell/mL의 농도로 96-well plate에 분주하고 24시간 배양한 후 각각의 시료를 1, 10, 100 μg/mL의 농도로 처리하였다. 또한 양성대조군으로는 1 μg/mL의 지방질다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 처리하였으며 비처리 대조군으로는 DMEM 배지를 처리하여 20시간 추가 배양한 후 Ez-Cytox cell viability assay kit (Daeillab service co., LTD, Korea)을 사용하여 37 ℃에서 90분 동안 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
시료의 세포독성을 확인하기 위하여 1, 10, 100 μg/mL의 농도별로 처리한 결과 도 2에 도시된 바와 같이, 실시예 1(LLW-P1) 및 실시예 2(LLW-P2)의 연잎 유래 조다당 분획물을 1-100 μg/mL의 농도로 처리했을 때, 모든 농도에서 정상대조군(NC)과 비교하여 유의적으로 높은 세포생존율을 나타냈다.
반면, 비교예 1(LLW) 및 비교예 2(LLW-S)의 경우는 저농도에서 100% 이하의 생존율을 나타내었지만 정상대조군과 유의적인 차이가 없는 것을 확인하였다.
3.2 산화질소(NO) 생성능 측정
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 에탄올 침전법을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1), 실시예 2에 따라 제조된 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2), 비교예 1에 따라 제조된 열수추출 상등액(LLW) 및 비교예 2에 따라 제조된 열수추출 분획물(LLW-S)에 대한 산화질소(NO) 생성능을 측정한 그래프이다.
대식세포가 활성화되면 산화질소(II) 및 TNF-α 등의 사이토카인을 분비하는데, 이때 산화질소(II)의 생성은 면역계에서 종양세포나 세포내 감염된 미생물에 대한 방어 작용을 하는 중요한 신호전달 물질로 알려져 있다. 이때, 산화질소(II)의 과량 생성은 전신적 염증을 유발하여 생체에 여러 부정적인 영향을 미치나 적정량의 산화질소(II)의 생성은 오히려 선천성 면역의 중요한 인자로써 여겨진다.
면역증진 능력을 확인하기 위하여 griess reagent [1% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) 인산(phosphoric acid)과 0.1% (w/v) 나프틸에틸렌다이아민-염산(naphtylethylenediamine-HCl)]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 생성농도를 측정하였다. 즉, RAW 264.7 세포를 48-well plate에 5X105 cell/well의 농도로 분주하여 24시간 배양한 후에 농도별(0, 10, 100 μg/mL)로 시료를 각각 처리하였다. 이때 양성대조군으로써 지방질다당류(LPS)는 1 μg/mL로 하였으며 비처리 대조군으로는 DMEM 배지를 처리하여 20시간 동안 추가 배양하였다. 배양이 완료된 세포배양액의 상층액과 동량의 griess reagent를 혼합하여 상온에서 15분 반응시킨 후 540 nm에 서 흡광도를 측정하였으며 아질산소듐(sodium nitrite)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 산화질소(II) 농도를 구하여 환산하였다.
정상대조군(NC) 및 지방질다당류(LPS, 1 μg/mL)만 처리한 양성대조군과 함께 시료 실시예 1(LLW-P1), 실시예 2(LLW-P2), 비교예 1(LLW) 및 비교예 2(LLW-S)를 농도별(1, 10, 100 μg/mL)로 처리하였을 때 생성되는 산화질소(II) 양을 측정한 결과는 도 3과 같다.
도 3에 도시된 바와 같이, 실시예 1(LLW-P1)의 연잎 유래 조다당 분획물은 10 μg/mL 이상의 농도에서 유의적으로 증가하였으며, 특히 100 μg/mL 농도에서는 26.8 μM 수준으로 매우 높은 것을 확인하였다. 또한, 실시예 2(LLW-P2)의 연잎 유래 조다당 분획물은 1 μg/mL 이상의 농도에서 농도구배별로 유의적인 증가를 나타냈으며 100 μg/mL 농도에서 37.5 μM 수준으로 매우 높은 것을 확인하였다.
반면, 정상대조군(6.3 μM)과 비교하여 비교예 1(LLW) 및 비교예 2(LLW-S)의 경우에는 1-100 μg/mL의 모든 처리농도에서 정상대조군(NC)과 비교하여 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
3.3 사이토카인 생성 촉진능 측정
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 에탄올 침전법을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1), 실시예 2에 따라 제조된 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2), 비교예 1에 따라 제조된 열수추출 상등액(LLW) 및 비교예 2에 따라 제조된 열수추출 분획물(LLW-S)에 대한 IL-6 수준을 측정한 그래프이다.
또한, 도 5는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 에탄올 침전법을 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P1), 실시예 2에 따라 제조된 한외여과를 이용한 연잎 유래 다당 분획물(LLW-P2), 비교예 1에 따라 제조된 열수추출 상등액(LLW) 및 비교예 2에 따라 제조된 열수추출 분획물(LLW-S)에 대한 TNF-α 생성능을 측정한 그래프이다.
활성화된 대식세포는 선천성 면역 반응의 중요인자로 여겨지는 TNF-α, 인터루킨-6 및 인터루킨-12 등과 같은 사이토카인을 생산함으로써 이후의 면역반응을 유도한다고 알려져 있고, B세포의 항체생성 세포인 형질세포(plasma cell)의 최종 분화를 유도하는 B세포의 자극인자로서 면역글로불린의 합성을 증진하는 등 다양한 작용을 나타낸다.
대식세포에 본 발명의 연잎 유래 다당분획물을 농도별(1, 10, 100 μg/mL)로 처리했을 때의 IL-6 및 TNF-α 분비량을 측정함으로써 면역반응의 활성화 정도를 확인하고자 하였다.
세포배양액 내의 인터루킨-6(IL-6)와 종양괴사인자-α(TNF-α)의 생성량 측정은 RAW 264.7 세포를 48- well plate에 2X105 cell/mL의 농도로 분주 24시간 후 각각의 시료를 1, 10, 100 μg/mL의 농도로 처리하고 20시간 배양한 다음 상등액으로 분비된 IL-6 및 TNF-α의 양을 ELISA kit(BD Biosciences, USA)을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
정상대조군(NC) 및 지방질다당류(LPS, 1 μg/mL)만 처리한 양성대조군과 함께 시료 실시예 1(LLW-P1), 실시예 2(LLW-P2), 비교예 1(LLW) 및 비교예 2(LLW-S)를 농도별(1, 10, 100 μg/mL)로 처리하였을 때 생성되는 IL-6 수준을 측정한 결과는 도 4와 같다.
도 4에 도시된 바와 같이, 실시예 1(LLW-P1)의 연잎 유래 조다당 분획물은 10 μg/mL 이상의 농도에서 유의적으로 IL-6 수준이 증가하였고, 특히 100 μg/mL 농도에서 5161.1 pg/mL 수준으로 매우 높은 것을 확인하였다. 또한, 실시예 2(LLW-P2)의 연잎 유래 조다당 분획물은 처리농도 1-100 μg/mL 범위에서 농도 의존적으로 IL-6 증가 패턴을 보였으며, 특히 100 μg/mL 농도에서 5306.4 pg/mL 수준으로 LPS를 처리한 양성대조군(5345.7 pg/mL)과 유의적으로 유사한 수준을 나타내는 것을 확인하였다.
반면, 정상대조군(17.0 μg/mL)과 비교하여 비교예 1(LLW)은 IL-6 생성능이 유의적인 차이를 보이지 않았으며, 비교예 2(LLW-S)는 100 μg/mL 농도에서 64.9 pg/mL 수준으로 약간의 IL-6 생성 증가를 보였다.
또한, 염증성 사이토카인인 TNF-α 생성능에 대한 면역활성을 검토한 결과는 도 5와 같다.
도 5에 도시된 바와 같이, 실시예 1(LLW-P1)의 연잎 유래 조다당 분획물은 1, 10, 100 μg/mL의 농도범위에서 각각 1662.0 μg/mL, 10290.0 μg/mL, 및 17924.5 μg/mL 수준으로 높은 TNF-α 생성능을 나타내는 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1(LLW-P1)의 100 μg/mL의 농도에서의 TNF-α 생성 수준은 LPS를 처리한 양성대조군(17754.3 pg/mL)과 유의적으로 유사한 수준이었다.
또한, 실시예 2(LLW-P2)의 연잎 유래 조다당 분획물 역시 1-100 μg/mL 범위에서 농도 의존적으로 TNF-α 증가 패턴을 보였으며, 그 수준은 각각 15066.0 μg/mL, 15905.7 μg/mL, 및 16305.7 μg/mL으로 매우 높은 TNF-α 생성능을 보이는 것을 확인하였다.
반면, 정상대조군(227.3 μg/mL)과 비교하여 비교예 1(LLW)은 10 μg/mL 및 100 μg/mL 농도에서 각각 968.0 μg/mL 및 5886.3 μg/mL 수준으로 유의적으로 높은 TNF-α 수준을 나타냈다. 또한, 비교예 2(LLW-S)은 1-100 μg/mL의 모든 농도범위에서 TNF-α 증가 수준을 보이지 않았다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1에서 얻은 연잎 유래 조다당 분획물 500 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 1에서 얻은 연잎 유래 조다당 분획물 300 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1에서 얻은 연잎 유래 조다당 분획물 200 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1에서 얻은 연잎 유래 조다당 분획물 600 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1에서 얻은 연잎 유래 조다당 분획물 4 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 과립제의 제조
실시예 1에서 얻은 연잎 유래 조다당 분획물 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 얻은 연잎 유래 조다당 분획물 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
제제예 8. 유화 제형의 화장품의 제조
영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.
하기 표 3에 기재된 조성으로 유화제형의 화장품을 제조하였다. 제조방법은 하기와 같다.
1) 1 내지 9의 원료를 혼합한 혼합물을 65 내지 70 ℃로 가열하였다.
2) 10의 원료를 상기 단계 1)의 혼합물에 투입하였다.
3) 11 내지 13의 원료의 혼합물을 65 내지 70 ℃로 가열하여 완전히 용해시켰다.
4) 상기 단계 3)을 거치면서, 상기 2)의 혼합물을 서서히 첨가하여 8,000 rpm에서 2 내지 3분간 유화시켰다.
5) 14의 원료를 소량의 물에 용해시킨 후 상기 단계 4)의 혼합물에 첨가하고 2분간 더 유화시켰다.
6) 15 내지 17의 원료를 각각 평량한 후 상기 단계 5)의 혼합물에 넣고 30초간 더 유화시켰다.
7) 상기 단계 6)의 혼합물을 유화 후 탈기과정을 거쳐 25 내지 35 ℃로 냉각시킴으로써 유화제형의 화장품을 제조하였다.
조성 유화제형 1 유화제형 2 유화제형 3
1 스테아린 산 0.3 0.3 0.3
2 스테알리 알콜 0.2 0.2 0.2
3 글리세릴 모노스테아레이트 1.2 1.2 1.2
4 밀납 0.4 0.4 0.4
5 폴리옥시에틸렌솔비탄
모노라우린산 에스테르		 2.2 2.2 2.2
6 파라옥시안식향산 메틸 0.1 0.1 0.1
7 파라옥시안식향산 프로필 0.05 0.05 0.05
8 세틸에틸헥사노에이트 5 5 5
9 트리글리세라이드 2 2 2
10 사이클로메티콘 3 3 3
11 증류수 ~ 100 ~ 100 ~ 100
12 농글리세린 5 5 5
13 트리에탄올아민 0.15 0.15 0.15
14 폴리아크릴산 중합체 0.12 0.12 0.12
15 색소 0.0001 0.0001 0.0001
16 향 0.10 0.10 0.10
17 실시예 1의 분획물 0.0001 1 10
제제예 9. 가용화 제형의 화장품의 제조
하기 표 4에 기재된 조성으로 가용화제형의 화장품을 제조하였다. 제조방법은 하기와 같다.
1) 2 내지 6의 원료를 1의 원료(정제수)에 넣고 아직 믹서를 이용하여 용해시켰다.
2) 8 내지 11의 원료를 7의 원료(알코올)에 넣고 완전 용해시켰다.
3) 상기 단계 2)의 혼합물을 상기 단계 1)의 혼합물에 서서히 첨가하면서 가용화시켰다.
조성 가용화 제형 1 가용화 제형 2 가용화 제형 3
1 정제수 ~ 100 ~ 100 ~ 100
2 농글리세린 3 3 3
3 1,3-부틸렌글리콜 2 2 2
4 EDTA-2Na 0.01 0.01 0.01
5 색소 0.0001 0.0002 0.0002
6 실시예 1의 분획물 0.1 5 5
7 알코올(95%) 8 8 8
8 파라옥시안식향산 메틸 0.1 0.1 0.1
9 폴리옥시에틸렌
하이드로제네이디트에스테르		 0.3 0.3 0.3
10 향 0.15 0.15 0.15
11 사이클로메티콘 - - 2

Claims (14)

  1. 연잎 추출물을 한외여과 공정으로 분획한 연잎 유래 다당 분획물로서,
    상기 연잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 50 내지 59 중량%, 산성 다당(uronic acid) 32 내지 40 중량%, KDO 유사 물질 0.4 내지 10 중량%, 단백질 7 내지 15 중량% 및 페놀 0.6 내지 5 중량%를 포함하며,
    상기 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 유사 물질은 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)를 포함하는 것을 특징으로 하는 연잎 유래 다당 분획물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중성 다당은 아라비노오스(arabinose), 람노오스(rhamnose), 갈락토오스(galactose), 자일로스(xylose), 글루코스(glucose), 만노스(mannose) 및 푸코스(fucose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 연잎 유래 다당 분획물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 산성 다당은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 연잎 유래 다당 분획물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 연잎 유래 다당 분획물은 분자량이 5 내지 550 KDa의 다당이 50 중량% 이상 함유된 것을 특징으로 하는 연잎 유래 다당 분획물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 연잎 유래 다당 분획물은 면역 기능 증진활성이 있는 것을 특징으로 하는 연잎 유래 다당 분획물.
  7. (A) 연잎 분말과 용매를 혼합하여 추출하여 추출물을 수득하는 단계; 및
    (B) 상기 추출물을 한외여과 공정으로 분획하여 연잎 유래 다당 분획물을 수득하는 단계;를 포함하며,
    상기 연잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 50 내지 59 중량%, 산성 다당(uronic acid) 32 내지 40 중량%, KDO 유사 물질 0.4 내지 10 중량%, 단백질 7 내지 15 중량% 및 페놀 0.6 내지 5 중량%를 포함하고,
    상기 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 유사 물질은 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)를 포함하는 것을 특징으로 하는 연잎 유래 다당 분획물의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 상기 (B)단계에서 분획된 연잎 유래 다당 분획물은 분자량이 5 내지 550 KDa의 다당이 50 중량% 이상 함유된 것을 특징으로 하는 연잎 유래 다당 분획물의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 (A)단계에서 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 연잎 유래 다당 분획물의 제조방법.
  11. 제1항의 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역기능 증진용 약학적 조성물.
  12. 삭제
  13. 제1항의 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역기능 증진을 위한 건강식품 조성물.
  14. 제1항의 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역기능 증진을 위한 화장료 조성물.
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