KR20150087657A

KR20150087657A - 비파 분획추출물을 함유하는 면역증강용 조성물

Info

Publication number: KR20150087657A
Application number: KR1020140007863A
Authority: KR
Inventors: 김병운; 이정민; 김옥경; 남다은; 호진녕
Original assignee: (주)제노필
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2015-07-30

Abstract

본 발명은 비파엽 추출 분획물을 함유하는 면역조절능 및 항염조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 비파엽 추출 분획물들을 대상으로 한 면역조절능 및 항염 효능억제활성을 실험한 결과, RAW 264.7 대식세포의 탐식능 활성을 증가시키고, Natural killer (NK) 세포 활성을 증가시켜 변역능을 증가시키고; Nitric oxide 생성을 농도의존적으로 감소시키고; TNF-α 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인함으로서 면역 기능을 증가시켜 면역조절을 하는 면역증강활성 및 항염 활성을 나타냄을 확인함으로써, 상기 조성물을 면역증강 및 염증 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

비파 분획추출물을 함유하는 면역증강용 조성물 {Composition comprising the purified extract of Eriobotrya japonica Radix for immune activity}

본 발명은 비파 추출분획물을 함유하는 면역증강 및 염증 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

[문헌 1] Richard A. Goldsby, et al., KUBY Immunology, 2000

[문헌 2] Dawson T.M., et al., Annu . Rev . Med , 47, pp.219-227, 1996

[문헌 3] Abul K. Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology 6th, p.298-301, 2007

[문헌 4] Rosenthal AS. Immunol Rev 40, p.136-152, 1978

[문헌 5] Ding AH et al., J Immunol 141, p.2407-2412, 1988

[문헌 6] Medzhitov R et al., Curr Opin Immunol, 9, p.4-9, 1997

[문헌 7] Chace JH et al., Clin Immunol Immunopathol 84, 185-193, 1997

[문헌 8] 정보섭외 향약대사전, 영림사, p610-612, 1998년

[문헌 9] Sansonetti, P, Semin Immunol, 13, p.381390, 2001

[문헌 10] Makar VR et al., Bioelectromagnetics, 26, p.10-9, 2005

[문헌 11] Green LC et al., Anal Biochem, 126, p.131-138, 1982

[문헌 12] Sampaio EP et al., J Exp Med, 173, p.699-703, 1991

인체는 외부의 병원체 침입이 일어나면 이를 식별하고 제거하는 면역작용을 통하여 몸을 보호하며 항상성을 유지하는 생체방어 반응을 일으킨다. 피부, 소화관, 호흡기 등을 통해 침입한 유해물질로부터 신체를 보호하는 방어체계로 외부 자극물질을 제거하는 대식 작용을 하거나, 상처에 발생한 심각한 염증을 줄이는 작용을 통해 항상성 유지 활동을 한다. 체내 병원균의 유입으로 인해 활성화 되었던 염증 반응을 포함한 모든 면역작용은 병원균의 제거가 이루어지고 나면 정상의 상태로 돌아오게 되지만 면역 조절에 어려움이 있는 경우, 면역 반응이 정상인 사람에 비해 현저히 높거나 낮게 발생한다. 면역기능이 결핍되거나 저하된 상태를 ‘면역부전’이라고 하며 이 상태에서는 면역반응의 제대로 활성이 되지 못하여 체내의 이물질에 대한 반응을 제대로 못하여 감염을 일으키게 된다. 반대로 ‘면역과민반응’은 일부의 면역반응이 과하게 반응하여 면역체계가 불균형을 이루어 결과적으로 알레르기 반응을 일으키는 것이다.

면역계는 자연저항, 비특이성 면역체계 및 특이성 면역체계로 구분할 수 있다. 자연저항(1차 방어선)이란 미생물을 위시한 모든 침입자들을 그들의 종류에 관계없이 막아내는 해부생리학적 요소들을 말하며, 비특이적 면역(2차 방어선)은 자연저항을 돌파하여 체내로 들어온 침입자들을 제거하는 식세포로 구성된 방어체계를, 그리고 특이성 면역계(3차 방어선)는 림프구들로 구성된 면역체계를 말하는데, 이중 특이성 면역계는 기억능 그리고 자기와 비자기를 구분할 수 있는 능력을 지닌 고도로 발달한 면역체계이다 (Richard A. Goldsby, et al., KUBY Immunology, 2000).

백혈구는 2차 또는 3차 방어선을 구성하여 1차 방어선을 돌파하여 체내에 들어온 이물을 담당하게 되며, 세균, 바이러스 감염 또는 염증 반응 시, 대식세포 및 림프구 활성의 조절은 의약품의 치료 효과의 결정에 있어서 중추적인 역할을 한다. 대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 산화적 스트레스 상황에서 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 일산화산소(NO)를 생성하여 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포에서 리포다당류(Lipopolysaccharide; LPS), 사이토카인, TNF-α와 같은 자극에 의해 발현되는 iNOS는 장시간 동안 다량의 NO를 생산하여, NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 활성화된 대식세포에 의한 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, O₂-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)와 같은 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 및 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생산은 비특이적 면역에 있어서 중요한 세포독성 및 세포활성억제기작이다. 대식세포에 의한 ROS 및 NO의 생성에 어떤 천연화합물이 영향을 미치는지 많은 연구들이 수행되어 왔다. 대식세포는 항원을 제시하거나(antigen-presenting), 종양을 없애거나(tumoricidal) 미생물세포를 죽이는(microbicidal) 세포로서, 세포매개 (cell-mediated) 또는 체액성 면역(humoral immunity)에 중심적인 역할을 하는 조절세포로, 활성화된 대식세포에서 생산되는 NO는 비특이적 숙주방어기작인 대식작용, 그리고 세균 및 암세포의 증식억제활성을 보인다(Dawson T.M., et al., Annu . Rev . Med , 47, pp.219-227, 1996).

방사성치료 또는 화학치료와 같은 항암 치료 시 조혈모세포들이 손상을 입게 되어 조혈세포와 면역세포들이 감소되고, 이로 인해 종종 조혈과 면역작용의 형성에 장애가 발생한다. 결과적으로, 환자들은 빈혈과 림프구 감소증, 혈소판 감소증 또는 과립백혈구 감소증을 경험하게 되며, 이것은 심각하고 치명적인 감염을 일으키고 환자들의 사망률을 높이게 된다. 임상적으로, 항암치료나 골수이식후에 골수성장인자인 G-CSF, GM-CSF, IL-1 ∼12, M-CSF 및 EPO 등을 사용하고 있으며, 이들 성장인자는 서로 상승작용을 일으키면서 CFU 와 BFU에서부터 세포 분화 및 생성을 촉진시키고, 세포의 이동, 식세포 작용, 슈퍼옥사이드 생성, 항체 자극에 따른 백혈구의 세포 독작용 등도 증가시킨다(Abul K. Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology 6th, p.298-301, 2007).

병원균이 인체에 침입하여 조직 내에서 복제를 시작하면 대식세포의 활성이 일어나 박테리아나 바이러스, 암세포 등을 인지하고 이에 대한 탐식작용(phagocytosis)을 일으켜 제거함으로서 방어작용을 하며, 뿐만 아니라 면역 반응 및 염증 반응에 기여하는 nitric oxide(NO) 와 tumor necrosis factor-α(TNF-α) 등의 cytokines을 생산한다(Rosenthal AS. Immunol Rev 40, p.136-152, 1978). 이물질이 침입하였을 때에는 NO를 이용하여 박테리아나 바이러스 등을 막아 생체 방어 기전에 중요한 조절자로서 역할을 하지만 lipopolysaccharide (LPS)와 같은 자극에 의해 활성화될 경우 과도한 NO가 생성되고 이는 염증에 관여하여 유전자 변이, 신경 손상 등을 유발한다(Ding AH et al., J Immunol 141, p.2407-2412, 1988). 활성화된 대식세포에 의해 분비되는 TNF-α는 질병에 있어 면역을 증강시키고 염증 반응을 매개하며 이물질을 감염부위로 유인하여 방어 작용을 하는 cytokine이지만, 전신적으로 유리되어 과도하게 생성될 때 염증성 질환을 유발시킬 수 있다(Medzhitov R et al., Curr Opin Immunol, 9, p.4-9, 1997). 이러한 대식세포에 의해 생산된 cytokines이나, 바이러스 증식을 방해하는 interferon에 의해 NK 세포의 활성화가 일어나 바이러스에 감염된 세포를 선별적으로 사멸시키게 된다. 따라서 대식세포에 의한 NO와 TNF-α등의 적절한 생성은 면역 체계를 조절하는데 중요한 역할을 한다(Chace JH et al., Clin Immunol Immunopathol 84, 185-193, 1997).

비파엽(枇杷葉)는 배나무과(Malaceae)에 속하는 상록소교목인 비파나무( Eriobotrya japonica)의 잎으로, 네롤리돌(nerolidol), 파르네솔(farnesol), 피넨(pinene), 캄펜(camphene), 미르센(myrcene), 시멘(cymene), 리날룰(linalool) 아미그달린(amygdalin), 우루솔산(ursolic acid), 올레아놀산(oleanolic aicd), 사과산, 포도당 등의 성분을 함유하고 있고, 객담, 비혈증 등의 치료에 사용된다고 알려져 있다(정보섭외 향약대사전, 영림사, p610-612, 1998년).

그러나, 상기 문헌들의 어디에도 비파엽 추출 분획물을 함유하는 면역증강 및 염증 질환에 대한 억제활성은 개시되거나 교시된 바가 없다.

이에 본 발명자는 면역 조절 효능의 가능성이 있는 비파 잎 추출물의 분획별 면역조절능 및 항염 효능억제활성을 실험한 결과, RAW 264.7 대식세포의 탐식능 활성을 증가시키고(실험예 1), Natural killer (NK) 세포 활성을 증가시켜 면역능을 증가시키고 (실험예 2); Nitric oxide 생성을 농도의존적으로 감소시키고(실험예 3); TNF- 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인함으로서 면역 기능을 증가시켜 면역조절을 하는 면역증강활성 및 항염 활성을 나타냄을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비파엽 추출분획물을 함유하는 면역증강 및 염증 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파엽 추출분획물을 함유하는 면역증강 및 염증 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 비파엽 추출분획물은 조추출물을 분획하여 얻은 비극성용매 가용 추출물 또는 극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 비극성용매 가용 추출물은 물에 현탁한 조추출물을 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 클로로포름 용매로 분획하여 얻은 비극성용매에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 극성용매 가용 추출물은 물에 현탁한 조추출물을 비극성용매로 분획하고 남은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 부탄올, 보다 바람직하게는 부탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 조추출물은 정제수를 포함한 물, 주정, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 주정 혼합용매, 보다 바람직하게는 60~100% 주정에 가용한 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 염증 질환은 천식 및 아토피 피부염, 알레르기성 염증 질환, 급성 또는 만성 염증질환, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염 및 비염, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증, 동맥경화, 심장병 질환, 다발성 경화증, 파킨슨씨 병, 알쯔하이머 병, 결장암 등을 비롯한 질환, 바람직하게는, 천식 및 아토피 피부염, 비만세포 매개성 알레르기성 염증 질환, 보다 바람직하게는, 천식 및 아토피 피부염을 포함한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 추출분획물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.

예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 비파엽 추출분획물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 건조된 비파엽을 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 주정, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 주정 혼합용매, 보다 바람직하게는 60~100% 주정을 수회 섞은 다음에 30℃ 내지 150℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 48시간, 바람직하게는 1시간 내지 12시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 열수 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 비파엽 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 60 내지 90% 에탄올 조추출물 중량의 약 0.0005 내지 0.005배, 바람직하게는 0.05 내지 0.5배 부피 (v/w%)의 물을 가한 후, n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 이용한 통상적인 분획과정을 수행하여 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 등의 비극성 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출 분획물; 및 부탄올, 물 등의 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출 분획물을 각각 수득할 수 있다.

본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 비파엽 추출 분획물들을 대상으로 한 면역조절능 및 항염 효능억제활성을 실험한 결과, RAW 264.7 대식세포의 탐식능 활성을 증가시키고(실험예 1), Natural killer (NK) 세포 활성을 증가시켜 변역능을 증가시키고 (실험예 2); Nitric oxide 생성을 농도의존적으로 감소시키고(실험예 3); TNF- 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인함으로서 면역 기능을 증가시켜 면역조절을 하는 면역증강활성 및 항염 활성을 나타냄을 확인함으로써, 상기 조성물을 면역증강 및 염증 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 비파 추출분획물을 유효성분으로 함유하는 면역증강 및 염증 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

또한, 비파엽은 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

본 발명의 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 및 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지 및 글리 세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 0.0001 ~ 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 50 중량%의 함량으로 배합될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 및 뇌혈관내 (intracere broventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 비파 추출분획물을 유효성분으로 함유하는 면역증강 및 염증 질환의 예방 및 개선용 건강기능 식품을 제공한다.

본 발명의 추출물은 목적 질환의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 및 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제 및 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 목적 질환의 예방 및 치료를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리 사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량 부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 비파엽 추출 분획물들을 대상으로 한 면역조절능 및 항염 효능억제활성을 실험한 결과, RAW 264.7 대식세포의 탐식능 활성을 증가시키고(실험예 1), Natural killer (NK) 세포 활성을 증가시켜 변역능을 증가시키고 (실험예 2); Nitric oxide 생성을 농도의존적으로 감소시키고(실험예 3); TNF- 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인함으로서 면역 기능을 증가시켜 면역조절을 하는 면역증강활성 및 항염 활성을 나타냄을 확인함으로써, 상기 조성물을 면역증강 및 염증 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하다.

도 1는 RAW 264.7 cell에서 비파 분획물의 탐식능에 미치는 영향을 나타낸 도이며(여기에서, Control: cell only, Positive control: cell + zymosan이며; 결과값은 평균±표준오차(n=3)로 기재하였음. 통계학적 분석은 ANOVA검정을 이용하여 수행하였으며 p 값은 p < 0.05으로 설정함);
도 2는 RAW 264.7 cell에서 비파 분획물의 Natural killer (NK) 세포 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이며(여기에서, Control: cell only, Positive control: cell + zymosan이며; 결과값은 평균±표준오차(n=3)로 기재하였음. 통계학적 분석은 ANOVA검정을 이용하여 수행하였으며 p 값은 p < 0.05으로 설정함);
도 3는 RAW 264.7 cell에서 비파 분획물의 NO생성에 미치는 영향을 나타낸 도이며(여기에서, Control: cell only, Positive control: cell + zymosan이며; 결과값은 평균±표준오차(n=3)로 기재하였음. 통계학적 분석은 ANOVA검정을 이용하여 수행하였으며 p 값은 p < 0.05으로 설정함);
도 4는 RAW 264.7 cell에서 비파 분획물의 TNF-생성에 미치는 영향을 나타낸 도이다(여기에서, Control: cell only, Positive control: cell + zymosan이며; 결과값은 평균±표준오차(n=3)로 기재하였음. 통계학적 분석은 ANOVA검정을 이용하여 수행하였으며 p 값은 p < 0.05으로 설정함);

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 비파 추출 추출분획물의 제조

1-1. 주정 조추출물의 제조

전남지역에서 재배한 비파엽의 건조한 잎 5 kg에 물 4 L 및 주정 16 L을 첨가하고 90℃로 중탕하여 얻은 추출물을 감압 농축하여 80% 주정 조추출물을 얻었다.(이하 “EJC"라 함)

1-2. 극성 용매 및 비극성용매 가용 추출물의 분획

실시예 1-1에서 얻은 80% 주정 조추출물 증류수에 현탁(suspension)하고, 당업계에 통상적인 분획방법에 따라 에틸아세테이트(ethylacetate), n-부탄올(BuOH)로 차례대로 분획하고 감압 건조하여 에틸아세테이트(ethylacetate) 가용 분획물 (38 g; 이하, EJ-E라 함), n-BuOH 가용 분획물 (364 g; 이하, EJ-B라 함), 및 water 잔류물은 동결건조하여 3950 g을 얻었다(이하, EJ-W라 함).

실험예 1. RAW 264. 7세포에서의 탐식작용 활성 측정

상기 실시예에서 얻은 시료들의 RAW 264.7세포에서의 탐식작용 활성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Sansonetti, P, Semin Immunol, 13, p.381390, 2001)

1-1. 세포배양

실험에 사용한 RAW 264.7세포(ATCCTIB71™)와 YAC-1 세포(ATCCTIB-160™)는 American type culture collection(ATCC, Manassas, VA)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포는10% fetal bovine serum(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA), 2 mmol/L glutamine, 100 mg/L penicillin-streptomycin를 첨가한 DMEM(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA)를 이용하였고, YAC-1 세포는 10% fetal bovine serum(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA), 2 mmol/L glutamine, 100 mg/L penicillin-streptomycin를 첨가한 RPMI 1640(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO₂로 조절된 incubator(Heraeus BB15, Thermo scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.

1-2. RAW 264. 7세포에서의 탐식작용 활성 측정

RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1×10⁶cells/well 씩 분주한 후 24시간 동안 배양시켜 Cytoselect 96 well phagocytosis assay kit(Cell biolabs Inc., San Diego, USA)를 이용하여 대식세포의 탐식능을 측정하였다.

본 실험에서 대식세포를 활성화시켜 탐식능을 증가시키기 위해 kit에 포함된 zymosan 입자를 사용하였다. zymosan을 첨가하고 sample처리하여 15분 동안 배양하였다. 그 후 serum free DMEM으로 세척 후 fixation solution(Cell biolabs Inc., San Diego, USA)을 첨가하고 5분 동안 상온에 방치하였다. 모든 well을 Dulbecco’s phosphate bufferd saline(LB001 DPBS; welgene, Korea)로 세척 후 1X blocking reagent(Cell biolabs Inc., San Diego, USA)를 첨가하고 orbital shaker(SHO-1D, Daihan scientific Co., Ltd, Korea)를 이용하여 60분 동안 방치하였다. 모든 well을 DPBS로 세척 후 1X permeabilization solution(Cell biolabs Inc., San Diego, USA)을 첨가하고 5분 동안 상온에 방치하였다. 모든 well을 DPBS로 세척 후 1X detection reagent(Cell biolabs Inc., San Diego, USA)를 첨가한 후 orbital shaker를 이용하여 60분 동안 방치하였다. 모든 well을 DPBS롤 세척 후 detection buffer(Cell biolabs Inc., San Diego, USA)를 첨가하고 orbital shaker를 이용하여 10분 동안 방치 후 substrate(Cell biolabs Inc., San Diego, USA)를 첨가하고 10분 동안 배양하였다. ELISA reader (VERSAMAXSL-20 Molecular Devices, Seoul, Korea)를 이용하여 흡광도 405 nm에서 측정하였다.

대식세포는 거의 모든 조직에 존재하여 체내에 외부 물질이 침입하면 탐식작용을 하여 체내에서 중요한 일차 방어로 작용한다. 이러한 탐식작용의 활성능을 평가한 결과는 도 1과 같다. 비파 Butanol 분획물 50 μg/mL(105.39±5.92%)은 zymosan을 처리한 positive control(100±9.40%)과 유의적인 차이가 없었지만 100 μg/mL(123.74±6.71%)에서는 유의적으로 탐식능이 증가되었음을 확인하였다. Ethyl acetate 분획물은 50 μg/mL(118.41±7.21%)에서도 positive control과 유의적인 차이가 있었으면 100 μg/mL에서는 130.23±8.70%으로 농도 의존적으로 탐식능이 증가 되었다. 이러한 결과에서 Butanol 분획물보다 Ethyl acetate 분획물이 탐식능의 활성을 더 증가시켰음을 확인하였다.

실험예 2. YAC -1에 대한 Natural killer ( NK ) 세포 활성측정

상기 실시예에서 얻은 시료들의 YAC-1에 대한 Natural killer (NK) 세포 활성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Makar VR et al., Bioelectromagnetics, 26, p.10-9, 2005)

C57BL/6 마우스(중앙동물실험, 25±2 g, female)로부터 비장을 적출하여 마쇄한 후 10% fetal bovine serum, 2 mmol/L glutamine, 100 mg/L penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI 1640(SH30027.01, Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA)으로 세척한 후 red blood cell lysing buffer(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 적혈구를 용혈시켜 비장세포 부유액을 만들어 96 well plate에 각 well당 1×10³cells/well 씩 분주한 후 effector 세포로 이용하였다. Target 세포는 YAC-1 세포를 이용하였으며 effector 세포와 target 세포의 비율을 5:1로 조정하여 seeding하고 sample을 처리하였다. 37℃, 5% CO₂에 4시간 동안 배양한 후 유리된 Lactate dehydrogenase(LDH)를 cytotox 96 non radioactive cytotoxicity assay kit(TB163, Promega Corporation, Woods Hollow RoadMadison, USA)를 사용하였다. ELISA reader(VERSAMAXSL-20 Molecular Devices, Korea)를 이용하여 흡광도 490 nm에서 측정하여 계산하고 YAC-1세포의 사멸정도를 NK cell activity(%)로 나타내었다.

NK 세포는 interferon이나 대식세포 유래 cytokines에 의하여 활성화되며 MHC class 발현의 변화를 인식함으로서 감염세포만 선택적으로 세포사멸을 유도시킨다. 따라서 대식세포 활성과 함께 NK세포 활성은 면역기능에서 중요한 역할을 한다. Yac-1 cell의 lysis를 통하여 NK 세포의 활성도를 측정한 결과, 도 2에서는 비파 Butanol 분획물 50 μg/mL(17.93±3.35%)은 control군과 유의적인 차이가 없었지만 100 μg/mL(28.66±3.90%)에서는 유의적으로 활성이 증가되었다.

Ethyl acetate 분획물은 50 μg/mL에서 40.32±7.50%, 100 μg/mL에서 50.76±4.21%으로, 전체적으로 Butanol 분획물의 처리보다 활성도를 증가시켰으며 농도의존적으로 유의적인 차이를 보였다. 이러한 결과는 탐식능 활성과 같은 경향을 보여 Ethyl acetate분획물이 Butanol 분획물보다 면역기능을 증가시키는 데 효과적임을 판단할 수 있었다.

실험예 3. Nitric oxide 생성 측정

상기 실시예에서 얻은 시료들의 Nitric oxide 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Green LC et al., Anal Biochem, 126, p.131-138, 1982).

RAW264.7 세포를 96-well plate에 각 well 당 1x10³cells/100 μL로 seeding하여 overnight한 후, sample과 LPS(Sigma Aldrich. St. Louis, MO, USA)1 μg/mL를 처리하고 72시간 동안 37℃, 5% CO₂incubator에서 배양하였다. 상층액 50 μL을 96-well plate에 옮기고 Griess reagent(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 50 μL를 첨가한 후 15분 이내에 흡광도 540 nm에서 ELISA reader(VERSAMAXSL-20 Molecular Devices, Korea)를 이용하여 측정하였다.

과량의 NO는 정상적인 세포조직에게 독성물질로 작용할 수 있으며 염증질환 및 자가 면역 질환 등의 면역관련 질환과 패혈성 쇼크를 일으킬 수 있다. 본 연구에서는 LPS로 NO의 과량 생산을 유도시켜 비파 분획물의 NO 생성 억제활성을 살펴보았다. Butanol 분획물 50 μg/mL, 100 μg/mL에서는 각각 10.67±1.45 μM, 8.25±1.19 μM으로 LPS처리군(14.25±1.86 μM) 보다 모두 유의적으로 NO 생성이 감소되었으며 이는 농도의존적으로 감소되었음을 확인하였다. Ethyl acetate 분획물 50 μg/mL(8.87±0.93 μM)은 Butanol 분획물 100 μg/mL과 유의적인 차이가 없을 정도로 NO생성을 감소시켰으며 Ethyl acetate 100 μg/mL에서 6.58±0.86 μM으로 농도의존적으로 감소시켰다. NO생성량 결과에서도 Butanol 분획물보다 Ethyl acetate 분획물의 효능이 더 컸음을 확인하였다.

실험예 4. TNF - 생성 측정

상기 실시예에서 얻은 시료들의 TNF- 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Sampaio EP et al., J Exp Med, 173, p.699-703, 1991).

RAW264.7 세포를 96-well plate에 각 well 당 2x10⁶ cells/200 μL로 seeding한 후, LPS(Sigma Aldrich. St. Louis, MO, USA) 1 μg/mL를 처리하고 2시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator(Heraeus BB15, Thermo scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양한 후 sandwich ELISA mouse kit(DY410, R&D system, Mckinley place NE, USA)를 사용하여 TNF- 양를 측정하였고, 흡광도 650 nm에서 ELISA reader (VERSAMAXSL-20 Molecular Devices, Korea)를 이용하여 측정하였다.

정상적인 면역계에서는 TNF-α가 감염 부위에 작용하여 염증반응을 일으켜 다양한 방법으로 효과적인 숙주 방어의 역할을 담당하게 되지만 과량의 TNF-α분비가 일어나면 전신적으로 염증을 유발시켜 염증성질환을 일으키게 하거나, 혈관확장, 혈압강하, 혈관의 투과성 증가에 의해 쇼크를 일으킬 수 있다. 본 연구에서는 LPS로 염증반응을 유도하여 TNF-α의 과량분비를 유도시켜 비파의 TNF-α 생성 억제 효과를 살펴보았다. Butanol 분획물에서는 LPS처리(1630.98±66.86 pg/mL)에 의하여 증가된 TNF-α를 유의적으로 감소되었으며, 50 μg/mL(1203.07±154.40 pg/mL)와 100 μg/mL(1116.70±150.21 pg/mL) 두 농도사이에 유의적인 효과가 없었다. Ethyl acetate 분획물에서는 Butanol 분획물보다 유의적으로 TNF-α의 생성이 감소되었으며 50 μg/mL에서 807.36±139.13 pg/mL, 100 μg/mL에서 342.07±79.04 pg/mL으로 농도의존적으로 감소되었다. 이러한 결과로 인하여 비파 Butanol 분획물과 Ethyl acetate 분획물은 항염 효능이 있으며 Ethyl acetate 분획물에서 그 활성이 더 뛰어났음을 알 수 있었다.

결과적으로 본 연구를 통하여 비파 추출물의 Butanol 분획물과 Ethyl acetate 분획물은 면역 기능을 증가시켜 면역조절을 하는 효능이 있으며 이를 면역 조절 기능성 식품개발에 기초 자료가 되어 국내 기능성 소재로서의 활용을 기대 할 수 있다.

실험예 5. 독성검정

식약청의 예규에 따라 ICR 마우스 (male, 6 weeks, 오리에트사로부터 구입)를 대상으로 급성독성을 검정하였다. 그 결과, 비파엽 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 water 잔류물은 2 g/kg의 경구투여까지 급성독성을 보이지 않았다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

EJ-E --------------------------------------------- 300 mg

유당 --------------------------------------------- 100 mg

탈크 ---------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제 제예 2. 정제의 제조

EJ-E --------------------------------------------- 300 mg

옥수수전분 --------------------------------------- 100 mg

유당 --------------------------------------------- 100 mg

스테아린산 마그네슘 -------------------------------- 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

EJ-B --------------------------------------------- 300 mg

결정성 셀룰로오스 ---------------------------------- 3 mg

락토오스 ---------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 ---------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

EJ-W --------------------------------------------- 300 mg

만니톨 ------------------------------------------- 180 mg

주사용 멸균 증류수 ------------------------------ 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O --------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

EJ-E --------------------------------------------- 300 mg

이성화당 ------------------------------------------- 10 g

만니톨 ---------------------------------------------- 5 g

정제수 --------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

EJ-B ------------------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 ------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ------------------------------ 70 ㎍

비타민 E ---------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B₁---------------------------------------0.13 ㎎

비타민 B₂---------------------------------------0.15 ㎎

비타민 B₆----------------------------------------0.5 ㎎

비타민 B₁₂----------------------------------------0.2 ㎍

비타민 C ----------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ---------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 --------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 ----------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 ------------------------------------- 적량

황산제1철 -------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 --------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ----------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 -------------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 -------------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 --------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 ---------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ----------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

EJ-E ------------------------------------------- 300 ㎎

비타민 C ---------------------------------------- 15 g

비타민 E(분말) --------------------------------- 100 g

젖산철 --------------------------------------- 19.75 g

산화아연 --------------------------------------- 3.5 g

니코틴산아미드 --------------------------------- 3.5 g

비타민 A --------------------------------------- 0.2 g

비타민 B₁ ------------------------------------- 0.25 g

비타민 B₂ -------------------------------------- 0.3 g

물 ---------------------------------------------- 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동 안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

비파엽 추출 분획물을 함유하는 면역증강 및 염증 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 비파엽 추출분획물은 조추출물을 분획하여 얻은 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
제 2항에 있어서,
상기 조추출물은 조추출물을 분획하여 얻은 물, 주정, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
제 2항에 있어서,
상기 비극성용매 가용 추출물은 물에 현탁한 조추출물을 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트용매로 분획하여 얻은 비극성용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
제 2항에 있어서,
상기 극성용매 가용 추출물은 물에 현탁한 조추출물을 비극성용매로 분획하고 비극성용매 가용 추출물을 제거하고 남은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 염증 질환은 알레르기성 염증 질환, 급성 또는 만성 염증질환, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염 및 비염, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증, 동맥경화, 심장병 질환, 다발성 경화증, 파킨슨씨 병, 알쯔하이머 병, 결장암 등을 비롯한 질환임을 특징으로 하는 약학조성물.
비파엽 추출분획물을 함유하는 면역증강 및 염증 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 7항에 있어서
상기 건강기능식품은 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강기능성 식품류 형태인 건강기능식품.