KR20190081812A - 산수유, 비파엽 및 올리브잎의 복합 추출물을 함유하는 면역기능 개선용 조성물 - Google Patents
산수유, 비파엽 및 올리브잎의 복합 추출물을 함유하는 면역기능 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 허브 복합 추출물을 함유하는 면역기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 산수유, 비파엽 및 올리브잎의 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 복합 추출물은 iNOS 및 COX2의 발현량을 증가시키고, NK cell 활성을 증가시키고, 면역저하 동물모델에서 간, 비장 및 흉선 조직 중량을 증가시키고, 손상된 비장 조직을 회복시키고, 혈중 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2 수치를 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 TNF-α, IFN-γ, IL-2와 같은 Cytokine 조절을 통하여 면역기능 개선 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 복합 추출물은 iNOS 및 COX2의 발현량을 증가시키고, NK cell 활성을 증가시키고, 면역저하 동물모델에서 간, 비장 및 흉선 조직 중량을 증가시키고, 손상된 비장 조직을 회복시키고, 혈중 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2 수치를 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 TNF-α, IFN-γ, IL-2와 같은 Cytokine 조절을 통하여 면역기능 개선 효과를 나타낼 수 있다.
Description
본 발명은 허브 복합 추출물을 함유하는 면역기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 산수유, 비파엽 및 올리브잎의 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
면역반응은 감염성 질환으로부터의 인체를 보호하는 작용으로, 외부물질을 인지하여 중화 또는 제거하여 생체의 항상성을 유지시키는 역할을 하며 항원에 대한 대응 방식에 따라 자연면역체계(innate immunity)와 획득면역체계(adaptive immunity)로 분류된다.
T 세포는 면역체계 전반을 통제하는 중심적인 세포로 세포내 병원체를 통제하고 대부분 항원에 대한 B세포의 반응을 활성화시키는 역할을 한다. T세포에서는 IFN-γ, IL-2, IL-4. IL-5, IL-6와 TNF-α등이 생성되어 외부 항원에 대항하는 작용을 한다.
인체의 면역반응은 건강한 삶을 위해 반드시 필요한 요소이며, 현대인들은 다양한 면역 기능 증진 보조제 및 면역 기능 증진에 효과적인 식품에 대한 관심이 높다. 그러나, 면역 기능을 증진시킬 수 있는 기능성식품의 상품화 사례는 일부 홍삼 제품을 제외하고 매우 부진한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 산수유, 비파엽 및 올리브잎의 3가지를 조합한 천연 허브 복합 추출물이 항원에 대한 면역반응을 활성화시키는 TNF-α, IFN-γ, IL-2와 같은 각종 사이토카인을 생성을 증가시키고 면역저하 동물모델에서 손상된 비장 조직을 회복시키는 면역기능 증진효과가 있을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 면역기능 증진 효과를 갖는 천연 허브 복합 추출물을 함유하는 면역기능 개선용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 면역기능 개선용 약학 조성물 또는 기능성 식품을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 산수유, 비파엽 및 올리브잎의 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능 개선용 조성물을 제공한다.
산수유(Corni fructus)는 긴 타원형 열매로 8-10월에 녹색에서 붉은 색으로 변하며 약간의 단맛과 함께 떫고 강한 신맛이 난다. 육질과 씨앗을 분리하여 육질은 술과 차 및 한약의 재료로 사용한다. 과육에는 코르닌(cornin), 모로니사이드(Morroniside), 로가닌(Loganin), 탄닌(Tannin), 사포닌(Saponin) 등의 배당체와 포도주산, 사과산, 주석산 등의 유기산이 함유되어 있고, 그 밖에 비타민 A와 다량의 당(糖)도 포함되어 있다.
비파엽(Eriobotryae Folium)은 장미과(Rosaceae)에 속하는 상록교목인 비파(Eriobotrya japonica)의 잎 부위이다. 한방에서는 열매, 뿌리, 줄기껍질 및 잎을 약용으로 사용한다. 비파엽의 효능으로는 폐를 맑게 하고 위를 조화시키며 기를 강화시키고 담을 삭이는 효능이 있다고 알려져 있다. 비파엽의 주요 성분으로는 우르솔산, 올레아놀산, 마스리닌산, 토메틱산을 비롯한 트리테르페노이드 화합물이 많이 함유되어 있다.
올리브 잎은 물푸레나무 과에 속하는 올리브 나무의 잎 부위이다. 올리브 나무는 다양한 기관이 이용되고 있으며, 올리브 열매에는 불포화 지방산, 비타민 A, C, D, E, F 및 리놀레인산 등이 많이 포함되어 있으며, 올리브 잎에는 히드록시티로솔(hydroxythyrosol), 티로솔(thyrosol), 카페산(caffeic acid), 올러유러핀(oleuropein) 등의 다양한 폴리페놀이 포함되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 종래에 사용되어진 어떠한 용매로도 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 5의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 한다. 상기 저급알코올에는 주정도 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에에서, 상기 추출물은 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 추출하는 유기용매에 따라 약재의 유효성분의 추출 정도와 손실 정도가 차이날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출방법은 특별히 제한되지 않고 예를 들어 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출 및 환류 추출 등이 있다. 추출액을 농축할 경우에는 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 분무건조, 열풍건조, 동결건조, 진공건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 복합 추출물은 산수유 : 비파엽 : 올리브잎을 1 내지 10 : 1 내지 10 : 1 내지 10의 혼합 중량비율, 바람직하게는 1 내지 2 : 2 내지 4 : 4 내지 8의 혼합 중량비율로 추출된 것을 특징으로 하는 면역기능 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 산수유, 비파엽, 올리브 잎을 1:1:8, 1:2:7, 1:3:6, 1:5:4 의 비율로 혼합하여 NO 억제 활성 및 세포생존률을 평가한 결과 1:3:6의 비율에서 농도별로 증가하는 최적의 NO 억제 활성 및 세포생존률을 나타내었다.본 발명에 있어서, 상기 복합 추출물은 각 천연물을 추출한 다음 추출물을 혼합하거나 천연물을 혼합한 다음 한꺼번에 추출할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복합 추출물은 iNOS 및 COX2의 발현량을 증가시키고, NK cell 활성을 증가시키고, 면역저하 동물모델에서 간, 비장 및 흉선 조직 중량을 증가시키고, 손상된 비장 조직을 회복시키고, 혈중 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2 수치를 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물인 것을 면역기능 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 인체의 면역기능을 증진하거나 개선할 수 있는 약학 조성물 또는 기능성 식품의 원료로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 분말화하거나 과립화하여 차 조성물의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선용 조성물을 제공한다. 상기 차 조성물은 예컨대 티백제품이나 캡슐제품으로 제품화될 수 있으며 물에 타거나 물과 함께 쉽게 음용할 수 있다.
분말화하는 경우, 상기 추출물은 70 내지 95℃에서 Spray dry(SD) 분말화 하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 물 추출물의 경우에는 85 내지 95℃에서, 에탄올 추출물의 경우에는 65 내지 80℃에서 Spray dry(SD) 분말화 하는 것이 바람직하다.
과립화하는 경우, 상기 분말에 정제수를 첨가하여 반죽한 후, 압출 과립기를 사용하여 12~20 mesh 체망을 통과시켜 과립성형물을 얻어 40~50℃의 oven에서 4~5시간 열풍건조한 후 과립물을 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 타블렛, 캡슐, 티백 또는 현탁액의 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 건강기능식품의 형태로 제품화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 차, 음료 또는 건강기능식품의 형태로 구강으로 섭취될 수 있다. 이때 본 발명에 따른 홀리바질 추출물의 섭취량은 면역기능이 필요한 정도에 따라 다를 수 있으나, 100~600mg/kg 체중의 양으로 섭취하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 실시예에서는 본 발명의 조성물의 면역기능 개선 효과를 In vitro와 In vivo에서 실험으로 증명하였는 바, 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
(1) In vitro 시험 결과
전남지역 천연자원(산수유, 비파엽) 및 올리브 잎의 비율은 최종적으로 1:3:6의 비율을 설정하였다. 추출조건은 스프레이 건조(SD)를 이용하여 80°C의 온도에서 추출시에 NO 활성이 낮음을 확인 하였다. NO 억제량이 아닌 생산량을 확인해 본바 생산량 또한 억제량과 유사한 경향성을 보이는 것이 확인 되었다.
Western-blot을 통하여 iNOS와 COX2 단백질의 발현양을 비교하고자 하였다. iNOS는 복합물의 최고농도에서 증가하는 것을 확인하였다. COX2는 농도에 비례하여 발현이 증가하였다. Real time PCR을 통하여Cytokine 인자 중에 TNF-α와 IL-6의 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과 IL-6는 효능을 나타내지 않았으며, TNF-α는 농도에 비례하여 증가 됨을 확인하였다. 특히, TNF-α는 단독으로 처리했을시에도 증가됨이 확인 되었다. NO가 억제 됨에 따라 염증과 Cytokine 관련 인자들이 줄어들 것으로 생각되었으나, 예상과 달라 추후의 실험 방법을 수정하였다.
Spelnocyte 및 YAC-1 cell의 세포생존률을 평가 한 후 그 결과를 바탕으로 NK cell 활성 평가를 진행하였다. 복합물은 최대 농도에서 약 38% 정도 NK cell 활성이 증가되는 것을 확인 하였다. 보통 10~20 % 증가되는 것과 비교하여 보았을 때 이는 매우 높은 것으로 생각 된다.
본 결과들을 바탕으로 동물실험을 수행하였다.
(2) In vivo 시험 결과
Cyclophosphamide를 이용한 면역억제 동물모델을 사용하여 동물 실험을 진행 하였다. 양성 대조군으로 홍삼을 사용하였다.
희생 후 몸무게, 먹이섭취량, 수분섭취량등에 큰 차이가 없는 것으로 보아 동물실험이 잘 진행되었다는 것을 확인하였다. 조직 무게에서는 간과 비장의 무게는 농도에 비례하여 증가하며 특히 800 mg/kg에서 가장 무거운 것을 확인하였다. 흉선은 400 mg/kg부터 증가하기 시작하였다. 복합물은 조직의 무게를 회복시키는 효과가 있음을 확인하였다. 혈액분석을 통하여 백혈구, 림프구, 호중구의 변화량을 측정하였다. 그러나 유의한 차이를 보이지 않았다. 복합물은 혈액에는 영향을 미치지 않는 것으로 생각된다. Cytokine 분석 결과 TNF-α는 800 mg/kg 투여시 홍삼투여군과 유사하게 증가됨을 확인하였다. IFN-γ또한 800 mg/kg에서 홍삼 투여군과 유사하게 증가 됨을 확인하였다. IL-2는 통계적인 유의성은 없었으나 농도에 비례하여 증가하는 경향성을 확인하였다. 복합물은 TNF-α, IFN-γ, IL-2와 같은 Cytokine 조절을 통하여 면역증진개선 효능을 보이는 것으로 생각 된다.
비장 조직을 H&E staining 을 통하여 염색 분석을 실시 했다. 복합물의 800 mg/kg에서 비장 조직이 회복되는 효과를 확인 하였다. 샘플의 고농도는 홍삼 투여군과 유사한 효과를 나타내었다.
(3) 결론
복합물은 대식 세포에서 NO 활성 억제를 나타냈으며, NK cell 활성을 38% 증가 시켰다. 또한 면역억제 동물 모델에서 손상된 조직의 회복과 Cytokine을 조절하는 효능을 나타내었다. 마지막으로 손상된 비장 조직을 회복시키는 효능을 나타냈었다. 이를 통하여 전남 지역 천연자원(산수유, 비파엽) 및 올리브 잎 복합추출물은 잠재적인 면역증강 효능이 있는 것을 확인 하였다.
본 발명에 따르면, 상기 복합 추출물은 iNOS 및 COX2의 발현량을 증가시키고, NK cell 활성을 증가시키고, 면역저하 동물모델에서 간, 비장 및 흉선 조직 중량을 증가시키고, 손상된 비장 조직을 회복시키고, 혈중 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2 수치를 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 TNF-α, IFN-γ, IL-2와 같은 Cytokine 조절을 통하여 면역기능 개선 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 복합 추출물의 NO 활성 억제 평가 및 세포생존률을 평가한 그래프이다.
도 2는 추출조건에 따른 복합 추출물의 NO 억제 활성 평가 및 세포생존률을 평가한 그래프이다.
도 3은 복합 추출물의 NO 생산량을 평가한 그래프이다.
도 4는 복합 추출물의 iNOS 및 COX2 단백질 발현량을 측정한 그래프이다.
도 5는 복합 추출물의 IL-6 및 TNF-αmRNA 발현량을 측정한 그래프이다.
도 6는 복합추출물의 NK cell activity 활성을 평가한 그래프이다.
도 7은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 주간 체중 변화에 미치는 영향을 평가한 그래프이다. HCE: 복합추출물, RGE: 홍삼추출물
도 8은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 주간 식이음수섭취량에 미치는 영향을 평가한 그래프이다. A: 식이 섭취량, B: 음수 섭취량.
도 9는 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 간 조직 중량에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 10은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 비장 조직 중량에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 11은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 흉선 조직 중량에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 12는 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 백혈구 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 13은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 림프구 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 14는 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 호중구 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 15는 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 TNF-alpha 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 16은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 IFN-gamma 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 17은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 IL-2 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 18은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 비장 조직에 미치는 영향을 조직학적 분석으로 평가한 사진이다. A: Normal, B: Control, C: HCE 200, D: HCE 400, E: HCE 800, F: RGE 800. (X10), scale bar = 100 μm.
도 2는 추출조건에 따른 복합 추출물의 NO 억제 활성 평가 및 세포생존률을 평가한 그래프이다.
도 3은 복합 추출물의 NO 생산량을 평가한 그래프이다.
도 4는 복합 추출물의 iNOS 및 COX2 단백질 발현량을 측정한 그래프이다.
도 5는 복합 추출물의 IL-6 및 TNF-αmRNA 발현량을 측정한 그래프이다.
도 6는 복합추출물의 NK cell activity 활성을 평가한 그래프이다.
도 7은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 주간 체중 변화에 미치는 영향을 평가한 그래프이다. HCE: 복합추출물, RGE: 홍삼추출물
도 8은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 주간 식이음수섭취량에 미치는 영향을 평가한 그래프이다. A: 식이 섭취량, B: 음수 섭취량.
도 9는 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 간 조직 중량에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 10은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 비장 조직 중량에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 11은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 흉선 조직 중량에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 12는 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 백혈구 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 13은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 림프구 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 14는 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 호중구 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 15는 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 TNF-alpha 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 16은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 IFN-gamma 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 17은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 혈중 IL-2 수치에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 18은 복합 추출물이 면역저하 동물모델의 비장 조직에 미치는 영향을 조직학적 분석으로 평가한 사진이다. A: Normal, B: Control, C: HCE 200, D: HCE 400, E: HCE 800, F: RGE 800. (X10), scale bar = 100 μm.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 복합 추출물의 제조
산수유, 비파엽, 올리브 잎을 다양한 중량비율(1:1:8, 1:2:7, 1:3:6, 1:5:4 등)별로 혼합한 후 50% 에탄올(주정)으로 80℃, 4시간 추출하였습니다. 상기 복합 추출물을 진공 증발기로 용매를 증발시켜 농축한 후 동결건조(FD) 또는 스프레이 건조(SD)시켜 시료로 사용하였다. 상기 시료는 25 μg/ml 부터 400 μg/ml 까지 농도로 처리하였다. 이하 실험에서, 상기 복합 추출물을 HCE, 양성대조군인 홍삼추출물을 RGE로 약칭한다.
실시예 2: In vitro 실험
2.1. RAW 265.7 세포 (Mouse macrophage cell)배양
Mouse macrophage cell인 RAW 264.78 cell은 한국세포주은행에서 분양 받아 연구실에 계대 배양 하여 사용한다. RAW 264.7 mouse macrophage 세포를 세포 배양 접시에 부탁시키고 penicillin 및 streptomycin이 함유된 1% 항생제와 10% FBS를 첨가한 DMEM을 사용하여 5% CO2, 37°C incubator에서 배양한다. 배양액은 2~3일 간격으로 교체하였으며, Cell seeding 시에는 hemocytometer를 사용하여 세포를 계수한다
2.2. MTT assay
검증시료의 세포 독성 및 적정 비율을 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포를 이용하여 세포생존율을 확인 한다. RAW 264.7 세포를 96well에 1x104으로 cell/well에 분주한 다음 5% CO2, 37°C incubator에서 배양 한다. 24시간 후 FBS-free DMEM으로 배지를 교환하고 24시간 후에 검증 시료 sample을 각 농도로 단독처리 또는 복합 처리하고 5% CO2,37°C incubator에서 배양 한다. 배양 24시간 후, 각 well 당 MTT (10ul/well) 시약을 첨가하고 3시간 동안 37°C에서 배양한 후 MTT가 formazan으로 분해되는 양을 ELISA reader를 이용하여 460 nm에서 흡광도를 측정한다. 각 처리 군은 3 well 씩 3 회 반복실험을 진행하며, 검증 시료에 대한 세포 증식효과는 3번 반복실험의 평균값을 취한 후 아무것도 처리하지 않은 DMEM 용액에 배양한 대조군에 대한 백분율로 표시하여 나타낸다. 세포생존률 결과를 토대로 이후에 복합소재의 적정 비율을 설정한다.
2.3. NO assay
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1x104으로 cell/well에 분주한 다음 5% CO2,37°C incubator에서 배양 한다. 24시간 후 FBS-free DMEM으로 배지를 교환하고 24시간 후에 검증 시료 sample을 각 농도로 단독 처리 및 복합 처리하고 5% CO2,37°C incubator에서 배양 한다. 시료 처리 24시간 후에 세포배양 상등액 50ul와 Griess 시약 50ul을 혼합하여 10분동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정한다. 결과는 NO2로 Standard curve를 작성하여 세포배양 상등액에 함유되어있는 NO의 값을 계산한다.
2.4. iNOS 및 COX2 단백질 발현 확인(Western-blot)
6well plate에 1well 당 2×105/2ml이 되도록 접종한다. 24시간 배양한 후 배지를 제거한 후 DMEM HIGH GLUCOSE () FBS, (+) Antibiotics 배지 2ml로 배지 교환한다. 24시간이 지나면 추출물을 농도별로 1well 당 1ml씩 처리한다. 24시간 배양 후 배지를 모아서 냉동 보관 (모은 배지는 MMP-1 EIA 측정할 때 사용할 예정). 얼음 위에서 PBS로 두 번 세척한다. RIPA buffer 10ml에 Protease Inhibitor 10ul 넣어서 120ul로 세포 용해시킨다. 스크래퍼로 긁어서 E-tube에 모은다. 13000rpm, 15min, 4℃ 원심 분리한다. 상층액으로 BCA Protein assay kit를 사용하여 정량 한다. 단백질을 10% SDS-PAGE 상에서 전기 영동 하여 분리한다. Trnas-Blot Turbo (BIORAD) 이용하여 PVDF membrane에 옮긴다. 9~10ml blocking buffer를 membrane에 분주하여 30분간 실온에서 반응시킨다. TBS-T로 10분씩 3번 빠르게 세척한다. Can get singal solution 1으로 1차 항체 희석한다. (iNOS 1:500, COX2 1:1000) 4℃에서 느리게 하루 동안 반응시킨다. TBS-T로 10분씩 3번 빠르게 세척한다. Can get singal solution 2로 2차 항체 희석한다. (Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) BIORAD 1:1000) 실온에서 1시간 반응시킨다. 3회 세척 한 후 Chemiscope 3000 Fluorescence/Chemiluminescence Imaging System 으로 detection하여 band 확인한다.
2.5. Cytokine (IL-6, TNF-α) mRNA 발현 확인(Real time PCR)
RAW 264.7 세포를 6 well plate에 5x105으로 cell/well에 분주한 다음 5% CO2,37°C incubator에서 배양 한다. 4시간 후 FBS-free DMEM으로 배지를 교환하고 24시간 후에 검증 시료 sample을 단독 및 복합으로 처리하고 5% CO2,37°C incubator에서 배양한다. 이후에 QUIGEN kit를 사용하여 RNA를 추출하였고, 이를 통하여 cDNA 합성을 실시한다. TNF-와 IL-6 primer를 이용하여 Real-time PCR을 통하여 Cytokine 발현량을 측정한다.
2.6. Spleenocyte, YAC1 cell
실험에 사용하는 spleenocytes (비장세포)는 SD rat의 비장을 적출 후 핀셋과 메쉬를 이용하여 단일세포 부유액을 제조함. 단일세포 부유액을 RPMI-1640 배양액으로 3회 원심 침전(×1,000 g, 5 min, 4℃)하여 세척한 다음, Red blood cell lysing buffer (Sigma, CA, USA)를 3분간 처리하여 적혈구를 제거 후 실험에 사용함. Murine의 대식세포주인 Raw 264.7 또는 YAC-1 세포는 한국 세포주은행 (KCLB40071)에서 분양 받아 사용하며, DMEM에 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2조건에서 배양하여 실험에 사용한다.
2.7. Cell proliferation assay (Spleencyte, YAC1 cell)
세포 증식률에 미치는 효과를 알아보기 위하여 WST-1 assay kit (ITSBio, Seoul, Korea)를 이용함. 비장세포는 2×105cells/90μl/well, macrophage와 YAC-1은 1×104cells/90μl/well로 24시간 배양한 후 농도별 추출물과 함께 처리하여 37℃, 5% CO2에서 24시간과 48시간의 반응시켜 세포 증식률을 평가함. 세포 증식률은 WST-1 용액을 10 μl (/100 μl cell media)씩 첨가하고 1시간 동안 배양하여 Multi Detection Reader (Infinite 200, TECAN Group Ltd, Switzerland)로 405 nm에서 흡광도 값을 측정함. 대조군은 시료를 처리하지 않고 추출물을 용해한 용매만을 고농도 실험군과 동일 농도로 처리한 실험군으로 설정하며, 세포의 증식율은 다음의 식에 따라 계산
Cell proliferation assay (%)=(시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100
2.8. NK cell activity assay
비장 세포 부유액을 RPMI-1640 (10% FBS, 1% penicillin-streptomycin)배지로 희석하고, lysing buffer (BD PharmLyseTM Lysis Buffer, BD Biosciences, USA)에 3분간 현탁 시켜 적혈구를 제거한 뒤 원심분리 한 후 PBS로 세척함. 이 후 96 well plate에 5ⅹ106cells/ml농도가 되도록 RPMI-1640 (10% FBS, 1% penicillin-streptomycin)배지로 희석하여 접종함(effector cell). 공시료를 농도별로 처리하고, 표적세포로는 YAC-1 세포(Target cell)를 이용하여 effector cell과 target cell을 첨가한 후 37℃, 5% CO2incubator에서 24시간 배양함. 배양 후 면역세포 증식능을 알아보기 위해 WST-1을 각 well에 10 μl 처리하여 ELISA reader로 540 nm에서 측정한다.
실시예 3: In vivo 실험
3.1. 실험동물 및 사육환경
실험동물은 샘타코 바이오코리아(오산 한국)에서 Specific-pathogen free (SPF) 상태의 Wister rat 5주령을 분양받아 실험에 사용하였다. 사육기간 중 식이는 일반 고형사료(Samtako, Gyunggi, Korea)를 급여하며 순화기간 중 음수는 필터링 된 음용수를 매일 갈아주며 자유롭게 섭취하도록 하였다. 사육기간 중 온도는 23±1℃, 습도 50±5%, 소음 60 phone이하, 조명시간 08:00~20:00 (1일 12시간), 조도 150~300 Lux, 환기는 시간당 10회~12회의 환경을 유지하였다. 본 실험은 원광대학교의 동물실험윤리규정을 준수하여 수행하였다 (승인번호 WKU17-66).
3.2. 면역 저하 유도 모델
면역 저하물질로 알려진 Cyclophosphamide (CXT)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)사에서 구입하여 사용하였다. 선행 연구 결과 시험 진행에 있어 가장 적합한 CXT 투여 농도로 확인된 5 mg/kg를 투여농도로 설정하여 본 실험을 진행하였다. 본 시험에서 면역 저하물질인 CXT 는 시험물질과 동시에 투여하였으며, 투여 방법은 시험물질의 경우 각 농도 별로 혼합된 조제 사료를 공급하여 실험동물이 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였으며, CXT 의 경우 체중 대비 개체당 동일량을 공급하기 위하여 증류수에 용해한 CXT (5 mg/kg)를 경구 투여하였다.
3.3. 실험군 설정 및 시료 투여
사육기간 중 식이는 일반 고형사료(Samtako, Gyunggi, Korea)를 급여하며 순화기간이 끝난 실험동물은 체중값을 기준으로 난괴법을 사용하여 군간 평균값이 균일하도록 분리한 후 ear punch를 이용하여 개체식별 표시하였다. 실험군은 정상군(Normal group), 대조군(Control group), 복합 추출물 200 mg/kg 투여군(herb complex extract 200 mg/kg, HCE 200 group), 복합 추출물 400 mg/kg 투여군(herb complex extract 400 mg/kg, HCE 400 group), 복합 추출물 800 mg/kg 투여군(herb complex extract 800 mg/kg, HCE 800 group) 및 양성실험군으로 홍삼 추출물 800 mg/kg 투여군(Red ginseng extract, RGE 800 mg/kg)으로 구분하며 군당 10마리씩 실험에 사용하였다.
3.4. 주간 바이오마커 분석 및 부검
주간 체중변화는 주 1회 일정시간에 모든 실험군의 개체별 체중을 측정하였고 식이 섭취량은 급여 후 익일 잔량을 측정하여 주 1회 측정하였다. 부검은 ether로 마취 후 복대정맥에서 채혈하여 혈액 분석에 사용하였으며 간, 흉선, 비장 조직은 적출하여 중량을 측정하였고, 비장 조직만 formalin에 고정하였다.
3.5. 혈액 분석
혈액은 복대정맥에서 채혈하여 EDTA tube와 conical tube에 나눠 분석에 사용하였다. 일반 혈액학적 검사는 혈액을 EDTA tube (DB Caribe, Ltd., USA)에 담아 Roll mixer에 약 30분 회전시킨 후 혈액분석기(Hemavet 950Fs, Drew scientific inc, TX, USA)를 이용하여 백혈구(white blood cell), 임파구(lymphocyte), 호중구(Neutrophill) 등를 측정하였다.
반면 Conical tube에 채혈하는 혈액은 cytokine 분석을 위해 상온에서 30분 응고 시킨 후 원심분리기에 3000 rpm으로 10분 동안 분리하여 혈청을 회수하였다. 분리한 혈청은 TNF-α (tumor necrosis factor-α), IFN-γ (Interferon-γ), IL-2 (interleukin-2) 측정을 위하여 구입한 Biolegend (San Diego, CA, USA)의 ELISA kit로 분석하였다.
3.6. 비장 조직 분석
적출한 비장 조직은 10% formalin 액에서 고정시킨 검체를 절취하여(trimming) 재고정시킨 후 파라핀에 포매하여 4 μm의 두께로 절편/세절하였다. Hematoxylin-eosin 염색은 xylene에서 파리핀을 제거하고 탈수 과정을 거친 후 hematoxylin에 4분, eosin에 2분 동안 염색하였다. 이 후 봉입하여 염색된 조직 프레파라트는 광학현미경인 Olympus BX50 F4 (Olympus, Japan)를 이용하여 관찰 및 촬영하였다.
3.7. 통계 분석
모든 실험은 3회 이상 반복하여 결과를 도출했으며 통계 프로그램(SPSS ver.12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균 ± 표준편차(Mean ± S.D.)로 계산하였다. 각 실험군 간의 통계적 유의성 검정에 따른 통계분석은 ANOVA (one-way analysis of variance test)를 실시한 후 유의성이 있는 경우, p<0.05 미만일 때 Ducan's multiple range test로 사후 검정하였다.
[시험분석결과]
1. In vitro 시험 결과
1.1 복합 추출물의 최적비율 설정
산수유, 비파엽, 올리브 잎을 1:1:8, 1:2:7, 1:3:6, 1:5:4 의 비율로 혼합하여NO 억제 활성 평가를 수행하였다. 최적 비율은 1:3:6의 비율을 설정 되었다 (도 1).
1.2 복합 추출물의 추출 조건 설정
FD(동결건조)와 SD(분무건조) 및 추출온도에 따른 복합물의 NO 억제 활성 평가를 수행하였다. 그 결과 SD 추출 및 80°C 시료가 선택 되었다 (도 2).
1.3 복합 추출물의 NO 생산량 측정
주관기관의 요청에 따른 NO 생산량 측정 수행하였다. 그 결과 NO 생산량 또한 이전의 NO 억제 활성 평가와 유사한 경향성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3).
1.4 복합 추출물의 iNOS 및 COX2 단백질 발현량 측정(Western blot)
복합물을 통한 iNOS 및 COX2의 단백질 발현량 검증을 수행 하였다. iNOS 발현양은 최고농도 처리 시 증가됨이 확인 되었으며, COX2 발현양은 농도에 의존하여 증가됨을 확인 하였다. 이전의 실험에서 NO양의 감소로 인하여 iNOS 및 COX2가 감소될 것으로 생각했으나 반대로 나타나는 것을 확인하였다 (도 4).
1.5 복합 추출물의 IL-6 및 TNF-αmRNA 발현량 측정(Real time PCR)
복합물을 통한 IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현량 검증을 수행하였다. IL-6 발현양은 저해되는 효과를 나타내지 않았으며, TNF-α 발현양은 농도에 의존하여 증가됨을 확인 하였다. ( 샘플만 처리한 경우에도 TNF- α 가 증가) 복합물은 세포 수준에서 IL-6 및 TNF- α에 영향을 미치지 않는 것을 확인 하였다 (도 5). 이를 통하여 추후 실험 방향을 수정 하였다.
1.6 복합추출물의 NK cell activity 활성평가
Splenocyte 및 YAC 1 cell 의 세포생존률 평가를 완료 하였다. 세포생존률 결과를 통한 NK cell 활성 평가를 진행 하였다. 복합물은 최대 농도 에서 약 38% 활성 증가됨이 확인 되었다. 이는 Reference 참고 결과 매우 높은 수치 임(보통 10~20% 증가)
2. In vivo 시험 결과
2.1.주간 체중 변화
각 실험군간 주간 체중 변화를 확인한 결과 증류수만을 투여한 정상군(Normal group)과 비교하여 cyclophosphamide (Cy)만을 투여한 대조군(Control group)은 Cy의 농도가 높아짐에 따라 증체율이 감소된 것으로 나타났다. 실험 종료시점인 4주차에 각 실험군별 체중은 정상군이 240.2±5.3 g, 대조군이 238.8±3.0 g로 Cy를 투여에 따라 체중이 유의하게 감소된 것으로 확인되었다. 반면 대조군과 비교하여 Cy와 허브 복합 추출물(herb complex extract, HCE)을 200 mg/kg 투여한 실험군(HCE 200 group)은 237.2±3.6 g, Cy와 허브 복합 추출물 400 mg/kg 투여한 실험군(HCE 400 group)은 236.3±3.8 g, Cy와 허브 복합 추출물을 800 mg/kg 투여한 실험군(HCE 800 group)은 233.0±5.7 g, 양성 대조군으로 Cy와 홍삼 추출물을 800 mg/kg로 투여한 실험군(RGE 800 group)은 246.9±3.6 g으로 나타나 각 실험군간 유의적인 차이는 확인되지 않았다(도 7).
2.2.주간 식이 및 음수 섭취량
허브 복합 추출물이 Cy에 의한 면역 저하 동물모델의 주간 식이 음수 섭취량 변화를 조사한 시험에서 각 실험군별 유의적인 차이를 보이지 않는 것으로 확인되었다 (도 8).
2.3. 조직 중량
2.3.1 간 중량
허브 복합 추출물이 면역 저하 모델의 조직 중량에 미치는 영향을 확인한 시험에서, 간 조직 중량은 정상군의 8.01±0.09 g과 비교하여 대조군은 6.75±0.04 g으로 유의하게 낮은 것으로 확인되었다. 반면 허브 복합 추출물을 투여한 실험군 중 저농도 투여군(200 mg/kg)과 중농도 투여군(400 mg/kg)에서는 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았으나 고농도 투여군(800 mg/kg)은 7.25±0.06 g으로 양성 대조군인 홍삼 투여군의 7.40±0.05 g과 함께 대조군보다 유의하게 높은 것으로 확인되었다 (도 9).
2.3.2 비장 중량
비장 조직의 경우 정상군은 0.55±0.01 g으로 나타났으나 대조군은 0.37±0.01 g으로 Cy 처리에 따라 조직 중량이 유의하게 감소한 것으로 확인되었다. 그러나 각 실험군은 HCE 200 실험군이 0.38±0.01 g, HCE 400 실험군이 0.41±0.01 g, HCE 800 실험군이 0.45±0.01 g, RGE 800 실험군이 0.43±0.01g으로 허브 복합 추출물을 투여한 실험군에서 대조군에 비해 증가하는 경향을 보이거나 유의하게 증가된 것으로 확인되었다. 특히 HCE 800 실험군의 경우 양성 대조군보다도 비장 중량이 높은 경향을 보이는 것으로 조사되었다(도 10).
2.3.3 흉선 중량
흉선조직은 대조군이 0.31±0.01 g으로 정상군의 0.54±0.01 g과 비교하였을 때 Cy를 처리함에 따라 중량이 유의하게 감소된 것으로 나타났다. 대조군과 비교하여 HCE 200 실험군은 0.34±0.01 g으로 유의한 차이를 보이지 않았으나, HCE 400 실험군과 HCE 800 실험군은 각각 0.36±0.01 g, 0.36±0.01 g으로 양성 대조군의 0.36±0.01 g 과는 유사한 수준을 보였으며, 대조군보다는 유의하게 증가된 것으로 조사되었다 (도 11).
2.4 일반 혈액학적 분석
2.4.1 백혈구 수치 분석
각 실험군별 혈중 백혈구(White blood cell, WBC) 수치는 정상군의 6.93±0.18 ×109/L와 비교하여 Cy를 투여한 대조군은 2.96±0.10 ×109/L으로 유의하게 낮은 수준을 보였다. 반면 허브 복합 추출물과 Cy를 함께 투여한 실험군의 경우 대조군과 비교하여 HCE 200 실험군은 2.78±0.13 ×109/L,HCE400실험군은 2.86±0.10 ×109/L,HCE800실험군은 3.01±0.08 ×109/L,RGE800실험군은 3.30±0.13 ×109/L으로 나타나 각 실험군간 유의적인 차이는 확인되지 않았다(도 12).
2.4.2 림프구 수치 분석
혈중 림프구(lymphocyte, LYM) 함량의 경우 정상군의 4.69±0.13 ×109/L에 비해 대조군이 1.89±0.07 ×109/L으로 유의적으로 낮게 조사되었다. 허브 복합 추출물을 투여한 실험군의 경우 HCE 200 실험군은 1.89±0.09 ×109/L,HCE400실험군은 1.89±0.07 ×109/L,HCE800실험군은 1.89±0.06 ×109/L,RGE800실험군은 2.19±0.07 ×109/L으로 각 실험군별 유의적인 차이는 확인되지 않았다 (도 13).
2.4.3 호중구 수치 분석
혈중 호중구(neutrophil, NEUT)의 함량을 비교해보면 정상군은 1.87±0.05 ×109/L,대조군은 0.90±0.03 ×109/L로 Cy를 투여함에 따라 호중구의 함량이 크게 감소한 것으로 나타났다. 반면 허브 복합 추출물을 투여한 실험군의 경우 HCE 200 실험군은 0.83±0.04 ×109/L,HCE400실험군은 0.98±0.05 ×109/L,HCE800실험군은 0.91±0.04 ×109/L,RGE800실험군은 0.93±0.05 ×109/L로 각 실험군간 유의한 차이는 없었다 (도 14).
2.5. 혈중 Cytokine 분석
2.5.1 TNF-α(tumor necrosis factor α) 분석
Cy에 의한 면역 저하 동물모델의 혈중 TNF-α 함량에 미치는 영향을 분석한 결과 정상군은 10.8±0.6 pg/ml로 대조군의 6.2±0.3 pg/ml와는 유의적인 차이를 보였다. 반면 허브 복합 추출물을 투여한 실험군의 경우 HCE 200 실험군과 HCE 400 실험군은 각각 6.2±0.8 pg/ml, 7.4±0.5 pg/ml로 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았으나 HCE 800 실험군은 9.3±0.7 pg/ml, RGE 800 실험군은 10.1±0.3 pg/ml으로 대조군에 비해 유의하게 증가된 것으로 조사되었다(도 15).
2.5.2 IFN- γ (interferon γ) 분석
각 실험군별 혈중 IFN-γ의 함량을 분석한 결과 정상군은 30.5±2.7 pg/ml로 대조군의 10.2±0.4 pg/ml보다 높은 수준을 보였다. 대조군과 비교하여 HCE 200 실험군과 HCE 400 실험군은 각각 14.9±2.7 pg/ml, 14.5±2.5 pg/ml으로 유의한 차이를 보이지 않았으나 HCE 800 실험군은 16.5±2.0 pg/ml로 혈중 IFN-γ의 수치가 증가하는 경향을 보였고 양성 대조군인 RGE 800 실험군은 21.5±1.6 pg/ml로 실험군 중 가장 높은 수치를 보여 대조군과도 유의한 차이를 나타내었다 (도 16).
2.5.3 IL-2 (interleukin 2) 분석
혈중 IL-2의 함량을 비교하여 보면 정상군은 44.7±5.0 pg/ml, 대조군은 27.8±3.2 pg/ml로 유의적인 차이를 보였다. Cy와 각 시료를 투여한 실험군에서 HCE 200 실험군은 32.6±3.4 pg/ml, HCE 400 실험군은 32.8±4.6 pg/ml, HCE 800 실험군은 43.0±7.4 pg/ml, RGE 800 실험군은 38.8±6.3 pg/ml로 나타나 대조군과 비교하여 HCE 800 실험군과 RGE 800 실험군이 높은 수치를 보였으나 유의적인 차이는 확인되지 않았다 (도 17).
2.6 조직학적 분석
본 연구에서는 허브 복합 추출물이 cyclophosphamide (CXT) 처리에 따른 비장의 기능변화에 미치는 영향을 확인하기 위해 각 실험군별 비장조직 병변을 광학현미경을 이용하여 관찰하였다. 정상군의 비장 조직은 중심정맥(central vein) 주변으로 백색수질이 고르게 분포되어 있으며, 림프소절(lymph nodule)이 가장자리 구역(marginal zone)에 둘러싸여 있어 적색수질(red pule)과의 경계가 명확하게 구분된 것으로 관찰되었다(도 18A, 18A).
반면 Cy를 처리한 대조군의 경우 가장자리 구역의 경계가 명확하지 않아 현저한 백색수질의 붕괴가 확인되었으며 적색수질에서는 응축된 세포들이 관찰되고 그 배열 또한 매우 불규칙한 것으로 나타났다(도 18B, 18B).
반면 허브 복합 추출물을 투여한 실험군의 비장조직을 관찰한 결과 HCE 200 실험군에서는 대조군과 비교하여 크게 호전되지는 않았으나 가장자리 구역이 국소적으로 관찰되었으며(도 18C, 18C), HCE 400 실험군에서는 적색수질 주변의 가장자리 구역이 명확하게 구분되어 대조군에서 관찰되던 백색수질의 붕괴는 확인되지 않았다(도 18D, 18D).
특히 허브 복합 추출물을 고농도로 투여한 HCE 800 실험군의 경우 Cy 처리에 의한 백색수질의 붕괴 및 적색수질의 세포 응축 현상은 크게 호전되었으며 전체적으로 조직 내 가장자리 구역이 선명하게 관찰되어 비교적 양호한 상태를 보이는 것으로 관찰되었다(도 18E, 18E). 양성 대조군인 RGE 800 실험군의 경우 대조군과 비교하여 백색수질의 붕괴는 관찰되지 않았고 적색수질 내의 세포응축현상은 크게 완화되어 HCE 800 실험군과 유사한 수준을 보였다 (도 18F, 18F).
Claims (7)
- 산수유, 비파엽 및 올리브잎의 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 5의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 복합 추출물은 산수유 : 비파엽 : 올리브잎을 1 내지 2 : 2 내지 4 : 4 내지 8의 혼합 중량비율로 추출된 것을 특징으로 하는 면역기능 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 복합 추출물은 iNOS 및 COX2의 발현량을 증가시키고, NK cell 활성을 증가시키고, 면역저하 동물모델에서 간, 비장 및 흉선 조직 중량을 증가시키고, 손상된 비장 조직을 회복시키고, 혈중 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2 수치를 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물인 것을 면역기능 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 분말화하거나 과립화하여 차 조성물의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 타블렛, 캡슐, 티백 또는 현탁액의 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 면역기능 개선용 조성물.
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