KR20140137101A

KR20140137101A - 인삼잎 조사포닌을 유효성분으로 함유하는 애완동물용 사료첨가제 조성물

Info

Publication number: KR20140137101A
Application number: KR1020130057533A
Authority: KR
Inventors: 표미경; 유지현; 홍세철; 이건희; 김보람; 이호주; 설수연; 박종대
Original assignee: 재단법인 금산국제인삼약초연구소
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2014-12-02

Abstract

본 발명은 인삼잎 추출물을 감압농축하여 제조함으로써 인삼잎 조사포닌을 유효성분으로 함유하여 항염증관련 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 나타내는 애완동물용 사료 첨가제를 제공할 수 있다.

Description

인삼잎 조사포닌을 유효성분으로 함유하는 애완동물용 사료첨가제 조성물{Feed additives for pet animal containing ginseng leaves }

본 발명은 애완동물용 사료첨가제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼잎 조사포닌을 유효성분으로 함유하여 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 나타내는 애완동물용 사료첨가제 조성물에 관한 것이다.

한반도가 원산지인 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피나무과 (Araliaceae) Panax 속에 속하는 다년생 식물로서 뿌리를 식용 또는 약용으로 이용하고 있다.

인삼의 생리활성물질로 알려진 인삼 사포닌은 30여 종이며, 이중 다량으로 존재한다고 알려진 주요 사포닌은 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Re, Rg₁ 등으로, 주요 생리활성을 나타내는 성분은 인삼 사포닌인 것으로 알려져 있으며, 항당뇨활성 (Yokozawa et al., 1985), 항암작용 (Mochizuki et al., 1995), 항산화작용 (Jeong et al., 2002), 동맥경화 및 고혈압예방 (Jung and Cho, 1985; Yoon and Joo, 1993), 간기능 촉진 및 숙취제거효과 (Matsuda et al., 1991), 항 피로 및 항 스트레스 작용 (Saito et al., 1974), 항염활성(Matsuda et al., 1990) 등이 보고되었다.

인삼은 주로 뿌리를 식용 또는 약용으로 이용하고 있으나 인삼의 조사포닌의 함량은 잎에 24.8%, 줄기에 4.6%, 뿌리에 5.3%로 뿌리나 줄기보다 잎에 훨씬 많은 것으로 알려져 있다(Cho et al. 2010).

인삼을 수확 후 폐기되는 인삼 잎에는 계절적 변동, 지리적 차이, 재배 기간의 길이에 따라 많은 차이가 있으나 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Re, Rg₁ 등이 전체 진세노사이드의 30-40%를 함유하고 있고, 특히 Re, Rd, F1, Rb₂의 함유량이 높은 것으로 알려져 있다(Jackson et al., 2003, Xie et al., 2004).

인삼잎에 함유되어 있는 인삼 사포닌의 조성비는 주로 PPT계열 사포닌인 Re, Rg1, F1 등이 PPD계열 사포닌인 Rd, Rb1, Rc, Rb2의 함량비에 비해 월등히 높은 것이 특징이다.

국외 애완동물 관련 시장은 미국, 일본 유럽 등에서 총 600억불(약 60조원) 시장으로 연간 1.3%씩 계속적으로 성장하고 있으며, 국내 애완(반려)동물 관련 산업은 90년대 후반에 이르러 급속하게 발전하여 현재는 애견시장 1조, 애견인 500만, 애견(반려동물 포함) 300만 마리에 달하는 것으로 집계되고 있다. 또한 고령인구증가는 반려동물의 시장규모 향상에 기여하고 있으며, 반려동물의 건강향상에 많은 시간과 노력을 기울이고 있고, 브리더 인구가 증가함에 따라 프리미엄 기능성 동물사료 개발이 매우 필요한 실정이다.

본 연구자들은 수확 후 폐기되는 인삼 잎이나 줄기에 함유된 생리활성 성분을 선별적으로 분리할 수 있는 기술을 개발하고 이를 특허출원(제10-2012-0036127호)한 바 있다.

한국등록특허 제10-0767624호 "인삼엽 사료 첨가제의 제조방법"에서는 인삼엽에서 인삼엽 성분을 추출하여 여과, 농축, 건조하여 인삼엽 분말을 제조하고 인삼엽 분말과 덱스트린을 혼합하여 사료 첨가제를 제조하는 방법이 기재되어 있다.

그러나 이러한 방법은 돼지에게 인삼엽 추출분말로 개발된 인삼사료를 급여하여 사육함으로써 인삼 성분을 함유한 기능성 돈육을 생산하기 위한 것으로 가축사육의 목적이 아닌 건강증진효과를 얻기 위한 애완동물용 사료로는 적합하지 않은 문제점이 있다.

KR 10-0767624 B1, 2007년 10월 10일

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 연구를 지속하던 중, 인삼잎 조사포닌이 항염증관련 면역증진효과가 있고, 지방세포분화억제 효과가 있음을 확인하고 애완동물의 사료 첨가제로서 용도를 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인삼잎 조사포닌을 함유함으로써 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 가지는 애완동물용 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼잎 조사포닌을 함유하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 첨가제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 인삼잎 조사포닌 추출물 제조에 있어서, 건조된 인삼잎에 70% 에탄올을 첨가하여 45 내지 90℃에서 6 내지 8시간 동안 추출하는 단계, 상기 추출액을 여과한 후 감압농축하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계, 상기 에탄올 추출물에 n-hexane을 넣고 추출하여 지용성 성분을 제거하는 단계 및 상기 추출물에 물 및 수포화 n-BuOH를 첨가하여 분획한 후 n-BuOH층을 회수하여 감압농축하는 단계로 제조하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 건조된 인삼잎을 조분쇄 또는 미분쇄하여 분말 형태로 제조하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 첨가제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 인삼잎 추출물의 유효성분 함량을 높이기 위해서 인삼잎을 통상적인 방법으로 자연건조 또는 열풍건조하여 전체 수분함량이 5 내지 10% 정도가 되도록 건조하여 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 건조된 인삼잎을 일정 크기로 조분쇄 또는 미분쇄하여 분말 형태로 애완동물용 사료 첨가제를 제조할 수 있다.

이때, 조분쇄 또는 미분쇄는 당업계에서 널리 사용되는 분쇄기를 사용하며, 입자의 크기는 기존의 사료에 혼합하여 급여하기 용이하도록 알갱이가 육안으로 확인될 수 있을 정도의 크기 또는 밀가루처럼 고운 가루 형태로 제조할 수 있다.

이때, 별도의 번거로운 제조공정을 거치지 않기 때문에 제조에 소요되는 비용 및 시간을 절감할 수 있어 경제적인 효과를 가질 수 있다.

이때, 건조된 인삼잎 자체를 분쇄하여 제조하는 경우에는 인삼잎의 사포닌 유효성분뿐만 아니라 인삼잎에 포함되어 있는 식이섬유, 단백질 등의 영양성분들을 함께 섭취할 수 있는 장점이 있다.

또한, 기존의 일반 애완동물용 사료와 함께 혼합하여 급여할 수 있으므로 애완동물이 섭취하기 용이하여 적용범위가 넓다.

본 발명은 인삼잎의 유효성분 추출효율을 높이기 위해서 상기 건조된 인삼잎을 일정크기로 조분쇄하여 사용할 수 있으며, 이때 분쇄기는 당업계에서 일반적으로 널리 사용하는 것으로서 종류에 구애받지 않는다.

본 발명은 상기 건조된 인삼잎에 중량대비 5 내지 10배의 70% 에탄올을 첨가하여 45 내지 90℃, 바람직하게는 50 내지 80℃, 더욱 바람직하게는 70 내지 80℃ 정도에서 6 내지 8시간, 바람직하게는 6시간 동안 3회 반복추출하여 인삼잎 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명은 상기 제조된 인삼잎 추출물을 여과한 다음 감압농축하여 에탄올 추출물을 제조할 수 있다. 이때 여과 및 감압농축은 당업계의 통상적인 방법에 의하며 그 방법에 구애받지 않는다.

여기서, 인삼잎 에탄올 추출물을 여과함으로써 조사포닌 등 유효성분의 함량이 높은 여과액을 얻을 수 있다.

또한, 상기 여과액을 감압농축함으로써 중량대비 인삼의 유효성분 함량을 높일 수 있다.

본 발명은 상기 에탄올 추출물에 중량대비 5 내지 10배의 n-hexane를 넣고 3회 반복 추출하여 클로로필, 잔류농약 등의 지용성 성분을 제거할 수 있다.

본 발명은 상기 지용성 성분을 제거한 추출물에 중량대비 5 내지 10배의 물 및 중량대비 5 내지 10배의 수포화 n-BuOH을 첨가하여 분획할 수 있다. 이때 바람직하게 2 내지 3회 분획할 수 있다.

본 발명은 상기 분획된 n-BuOH 층을 회수하여 감압농축함으로써 인삼잎 조사포닌 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명은 인삼잎을 주재료로 이용하여 인삼잎 조사포닌의 유효성분만을 추출하여 사용함으로써 인삼 특유의 강한 향이 제거되어 애완동물이 거부감없이 섭취할 수 있도록 한다.

본 발명에 따른 애완동물용 사료 첨가제는 사포닌성분과 각종 생리활성성분이 함유되어 있는 인삼잎 추출물을 이용함으로써 인삼잎 조사포닌의 유효성분에 의하여 애완동물의 항염증 관련 면역력 증진효과 및 지방세포분화억제에 의한 항비만 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌의 RAW 264.7 세포에 대한 세포생존율을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌의 LPS 유도 NO 생성 억제율을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌의 LPS 유도 PGE2 생성 억제율을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌의 LPS 유도 TNF-α 생성 억제율을 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌의 LPS 유도 iNOS 및 COX-2 생성 억제능을 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌의 LPS 및 ConA 유도 비장세포 증식 억제능을 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌의 α-glucosidase 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌의 3T3-L1 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌의 3T3-L1 세포의 지방분화 억제 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[ 실시예 1] 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌 추출물 제조

건조된 인삼잎 1 kg을 70% 에탄올을 넣고, 80℃에서 6시간 동안 3회 추출하여 여과한 후 여과액을 감압농축하여 245.3 g의 에탄올 추출물을 얻었다. 상기 에탄올 추출물에 500 mL의 n-hexane을 넣고 3회 반복추출하여 지용성 성분(클로로필, 잔류농약 등)을 제거한 후, 물 1 L와 수포화 n-BuOH 1 L를 넣고 2회 분획하여 n-BuOH층을 회수하여 감압농축기에서 농축하여 인삼잎 조사포닌 123.1 g을 얻었다.

[ 실험예 1] 인삼잎 조사포닌의 진세노사이드 함량 HPLC ( high performance liquid chromatography ) 분석

본 발명에 따른 인삼잎 추출물의 진세노사이드 분석은 Waters-PDA(Waters 1525, detector 2998, USA)를 활용하여 물(A액)과 ACN(B액)을 용매로 하여 하기 표 1과 같은 용매조건으로 flow rate 1.0 mL/min으로 하기 표 2의 분석조건으로 분석하였다.

본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌의 진세노사이드 함량을 HPLC로 분석한 결과를 하기 표 3과 도 1에 나타내었다.

상기 표 3과 도 1에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rg1이 80.5 mg/g, Re가 117.9 mg/g, Rf가 7.7 mg/g, Rb1이 51.2 mg/g, Rc가 13.1 mg/g, Rb2가 11.2 mg/g, F1이 30.2 mg/g, Rd가 55.2 mg/g으로 나타났으며, 이들을 모두 합한 총량은 367 mg/g으로 약 37% 이상의 사포닌을 함유함을 알 수 있었다.

[ 실험예 2] 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌 추출물의 면역증진 활성 평가

(1) 세포배양

마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

(2) 세포 생존율 측정

세포에 대한 독성 측정은 MTT 방법으로 분석하였다. Raw 264.7 세포 2×10⁴cells/mL를 96 well plate에 분주하고 시료를 농도별 (25, 50, 100, 200 μg/mL)로 24시간 동안 처리하였다. EZ-Cytox(Daeil, Korea)을 이용하여 Well당 10μl 용액을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader(Molecular devices, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 면역활성에 가장 많이 사용하는 RAW 264.7 세포에 대한 인삼잎 조사포닌의 세포 생존율 측정에서 100 ug/mL 및 200 ug/mL의 고농도에서 각각 100.8%, 96.0%의 세포 생존율을 보여 면역세포에 대한 독성이 없음을 확인하였다.

(3) Nitric Oxide ( NO ) 생성량 측정

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 NO assay kit(Intron, Korea)를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 2×10⁴cells/mL로 조절한 후 96 well plate에 분주하고, 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양하였다. 배양 후 PBS로 수세한 후 각각의 시료 25, 50, 100, 200 μg/mL을 첨가하였다. 시료 첨가 1시간 후에 1 μg/mL의 lipopolysaccharide LPS를 처리한 후 24시간 배양하였다. Nitric oxide detection kit(Intron, Korea)를 사용하여 Sulfanilamide in the reaction buffer 50μL를 넣고 10분 동안 반응시켰다. 그 후 Naphthylethylenediamine in the stabilizer buffer를 50μL을 넣고 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader(Molecular devices, USA)에서 흡광도 540nm를 측정하여 sodium nitrite의 검량선으로부터 NO 대사물인 nitrite의 생성정도를 산출하였다.

염증 반응이 일어나면 관련 세포에서 iNOS의 발현이 증가하여 많은 양의 NO를 생성하고, 과도하게 생성된 NO는 조직의 손상, 유전자 변이, 신경 손상 등을 유발하고, 혈관 투과성을 증가시켜 부종 등의 염증 반응을 촉진시킨다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 8.9 uM로 NO의 생성량이 아주 적은 것에 비해 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도하였을 때 NO의 생성량은 33.7 uM로 증가되었다. LPS로 유도하여 과량 생성되는 NO의 생성을 인삼잎 조사포닌 25 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL에서 각각 27.25, 24.50, 19.76, 15.25 uM로 농도 의존적으로 억제하여 인삼잎 조사포닌의 항염증관련 면역활성이 있는 것으로 확인되었다.

(4) Prostaglandin E2 ( PGE2 )와 TNF -α 생성량 측정

세포배양액 내의 PGE2, TNF-α 생성량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 2×10⁴cells/mL로 6 well plate에 분주하고, 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양하였다. 세포에 1 μg/mL의 LPS를 처리한 뒤 1시간 후에 0, 25, 50, 100, 200 μg/mL의 시료를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 배지를 취하여 PGE2(Cayman, USA)와 TNF-α(BD, USA)를 ELISA reader(Molecular devices, USA)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.

PGE2(Prostaglandin E2)는 통증과 발열에 주로 관여하는 염증 인자로서 염증반응이 일어나면 대식세포의 COX-2에 의해 생성된다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 대식세포의 일종인 RAW 264.7 세포에 의해 생성되는 PGE2를 측정한 결과 대조군 27.0 pg/mL에 비교하여 LPS로 유도하였을 228.7 pg/mL로 생성이 증가하는 것을 확인하였다. LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 인삼잎 조사포닌 25 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL을 첨가하였을 때 각각 192.5, 128.0, 98.3, 43.6 pg/mL로 농도 의존적으로 PGE2의 생성이 감소(p<0.05)되어 항염증효과가 있음을 확인할 수 있다.

TNF-α(tumor necrosis factor-α)는 활성화된 대식세포에서 주로 생성되는 염증성 사이토카인으로 알려져 있다. 도 5에 나타낸 바와 같이, LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 인삼잎 조사포닌은 농도 의존적으로 TNF-α를 통계적으로 유의(p<0.05)하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

(5) 세포 내 염증관련 단백질 발현 양상 측정

염증 효과를 알아보기 위하여 염증과 관계된 iNOS, COX-2 단백질의 양을 측정하였다. 대식세포주(RAW264.7)를 이용하여 2×10⁴cells/mL로 6 well plate에 배양한 뒤 시료를 처리한 다음 24시간 후에 PBS로 세척한 후 원심분리 하여 세포를 수집하고, RIPA buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다. 세포 lysate에 함유된 단백질의 양은 Bradford 법으로 측정하였다. 단백질 20μg을 10% polyacrylamide를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF membrane으로 electroblot 120 V에서 1시간을 실시하였다. 이어 PVDF membrane을 5% skim milk에서 1시간 방치한 뒤 primary antibody에서 4℃에서 overnight하여 주었다. 다시 tris-buffered saline and tween 20 (TBST)로 세 번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세 번 세척하고 ECL kit(Amersham-Pharmacia, USA)와 반응시켜 Chemidoc(Bio-rad, USA) 이용하여 밴드 현상을 측정하였다.

염증 반응에서 대식세포 (macrophage)는 LPS와 반응하여 염증유발인자 (pro-inflammatory cytokine)을 생성하고, inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)를 합성하여 NO 및 prostaglandin E2 (PGE2)를 생성한다. 인삼잎 조사포닌의 항염증 효과를 확인하기 위해 NO와 PGE2의 생성 억제를 확인하였고, 이 결과와 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 억제와의 관련성을 확인하기 위하여 Western blot을 이용하여 두 단백질의 발현 정도를 비교하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, LPS로 유도되지 않은 대조군은 iNOS와 COX-2의 발현이 보이지 않았으나 LPS 유도군은 iNOS와 COX-2의 발현이 관찰되었고, 인삼잎 조사포닌을 첨가한 시험군에서는 시료의 농도가 증가할수록 NO와 PGE2의 생성 억제와 같은 양상으로 iNOS와 COX-2 단백질의 발현이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.

(6) 비장세포 증식 측정

면역세포의 증식에 미치는 효과를 측정하기 위하여 생쥐의 비장세포를 이용하였다. 먼저 생쥐의 비장을 분리한 다음, mesh를 통하여 분쇄하고 원심분리하여 상층액을 제거하여 비장세포를 회수하였다. 이후 RBC lysis buffer로 잔여 적혈구를 제거한 뒤 RPMI 1640 배지를 이용하여 2회 세척하였다. 분리한 비장세포는 5×10⁶cell/mL으로 희석한 다음 96 well plate에 넣고 여기에 T 세포의 활성화 유도물질인 lipopolysaccharide (LPS) 및 B 세포 활성화 유도물질인 concanavalin A(Con A)를 넣고 시료를 농도별로 희석한 것을 넣고 48시간 5%, CO₂ incubator에 배양한 후, 각 well당 10 μL의 CCK-8 kit (Dojindo Laboratories, Japan) 용액을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 배양하고 450 nm에서 흡광도를 측정하여 활성을 비교하였다.

T 세포의 활성화 유도물질인 LPS 와 B 세포 활성화 유도물질인 concanavalin A(Con A)에 대한 인삼잎 조사포닌의 비장세포 증식능을 측정하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 인삼잎 조사포닌은 LPS 및 Con A 유도 비장세포 증식능을 농도 의존적으로 억제하였다. 따라서 인삼잎 조사포닌은 세포성 면역 및 체액성 면역에 모두 관여하는 것으로 확인되었다.

[ 실험예 3] 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌 추출물의 항비만 활성 평가

(1) α- Glucosidase 저해 활성 측정

1 unit/mL의 효모 기원의 α-glucosidase(Sigma, USA) 20μL에 각 시료를 20μL을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 1mM ρ-nitrophenyl α-D-glucoprytanoside(ρNPG, in potassuin phophate buffer, pH 6.9)를 40μL를 첨가하였다. 37℃에서 30분간 반응시킨 후 1M Na₂CO₃를 첨가하여 반응을 종결시키고, 405nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 Acarbose를 사용하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌을 a-glucosidase에 농도별로 처리하였을 때 농도 의존적으로 유의하게 억제효과를 보였다. 잘 알려진 a-glucosidase 억제제인 Acarbose와 같은 농도로 비교했을 때에도 Acarbose는 53%, 인삼잎 조사포닌은 43%의 억제율을 보여 Acarbose와 거의 비슷한 a-glucosidase 억제효과를 보였다.

(2) 3 T3 - L1 배양 및 분화 유도

실험에 사용한 3T3-L1 adipocyte는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 배양 및 분화배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium high glucose에 10% calf serum, antibiotics를 첨가하여 5% CO₂, 습도 37℃ incubator에서 계대 배양하였다. 분화 배양배지 Dulbecco's modified Eagle's medium high glucose에 10% fetal bovine serum (FBS), antibiotics를 첨가하여 5% CO₂, 습도 37℃ incubator에서 3∼4일 후 세포가 융합하게 되면 trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 분리하여 원심분리기 1000 rpm. 5분에서 세포를 모은 후 세포밀도가 2×10⁶cell인 suspension 용액을 만들어 1mL씩 plating하여 배양하였다. 4일 후 융합된 세포를 분화배지 DMEM 배양액에 0.5 mM IBMX, 5 μg/mL의Insulin, 0.25mM dexamethasome이 첨가된 배지를 처리하여 분화를 유도 하였다. 2일 후 feeding medium DMEM 배양액에 5μg/mL의 insulin만 포함된 배지로 배지를 갈아준 후 2일에 한 번씩 feeding medium으로 갈아 주며 세포를 분화시켰다.

(3) 3 T3 - L1 지방세포 생존능에 미치는 영향 측정

분화가 완료된 3T3-L1 지방세포에 인삼잎 조사포닌을 농도별로 처리하고 MTT assay를 수행하여 세포 독성을 측정하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 인삼잎 조사포닌의 농도가 증가할수록 지방세포의 생존율이 감소하는 것으로 관찰되었으며 200 ug/mL의 시료 농도에서는 무처리 대조군에 비하여 77%로 유의하게 (p<0.05) 세포생존 저해율을 보였다.

(4) Oil red O 염색법

분화가 유도된 3T3-L1 adipocyte을 phosphate buffered saline(PBS)으로 2회 세척 후, 10% formaldehyde로 4℃에서 1시간 동안 고정후 PBS로 3회 세척 후 Oil red O로 20분 동안 염색하였다. 증류수로 세척한 다음 남아있는 물기를 건조시킨 뒤 광학현미경으로 염색된 지방구를 확인하였다.

본 발명에 따른 인삼잎 조사포닌이 3T3-L1 지방세포의 lipid droplet 형성에 미치는 효능을 평가하기 위하여 Oil Red O를 이용하여 염색하였다. 인삼잎 조사포닌을 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL을 처리하고 현미경 및 육안으로 관찰한 결과 도 10에 나타낸 바와 같이, 농도 의존적으로 지방세포 분화 및 지방세포 내 지방생성을 억제하는 효과를 확인할 수 있었다.

Claims

인삼잎 조사포닌을 유효성분으로 함유하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 첨가제.
제 1 항에 있어서,
상기 인삼잎 조사포닌은 건조된 인삼잎에 70% 에탄올을 첨가하여 45 내지 90℃에서 6 내지 8시간 동안 추출하는 단계;
상기 추출액을 여과한 후 감압농축하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
상기 에탄올 추출물에 n-hexane을 넣고 추출하여 지용성 성분을 제거하는 단계;
상기 지용성 성분이 제거된 추출물에 물 및 수포화 n-BuOH를 첨가한 후 분획하는 단계; 및
상기 분획된 n-BuOH 층을 회수하여 감압농축하는 단계로 제조하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 첨가제.
건조된 인삼잎 분쇄물을 함유하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 첨가제.