KR20140131101A - 홍삼박의 유효성분을 함유하는 애완동물용 사료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍삼박 추출물을 감압농축한 후 건조하여 제조함으로써 홍삼의 유효성분이 함유되어 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 나타내는 애완동물용 사료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

홍삼박의 유효성분을 함유하는 애완동물용 사료 조성물{Feed composition for pet animal containing red ginseng residues}

본 발명은 애완동물용 사료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍삼박 의 유효성분이 함유되어 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 나타내는 애완동물용 사료 조성물에 관한 것이다.

한반도가 원산지인 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피나무과 (Araliaceae) Panax 속에 속하는 다년생 식물로서 뿌리를 식용 또는 약용으로 이용하고 있다.

인삼의 생리활성물질로 알려진 인삼 사포닌은 30여 종이며, 이중 다량으로 존재한다고 알려진 주요 사포닌은 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Re, Rg₁ 등으로, 주요 생리활성을 나타내는 성분은 인삼 사포닌인 것으로 알려져 있으며, 항당뇨활성 (Yokozawa et al., 1985), 항암작용 (Mochizuki et al., 1995), 항산화작용 (Jeong et al., 2002), 동맥경화 및 고혈압예방 (Jung and Cho, 1985; Yoon and Joo, 1993), 간기능 촉진 및 숙취제거효과 (Matsuda et al., 1991), 항 피로 및 항 스트레스 작용 (Saito et al., 1974), 항염활성(Matsuda et al., 1990) 등이 보고되었다.

홍삼식품에 대한 관심이 꾸준히 증가함에 따라 국내 홍삼 시장 규모는 2010년 이후 1조 원대를 형성하고 있고, 건강기능식품의 품목별 판매현황에서도 50%이상의 독보적 점유율로 1위를 차지하고 있다. 홍삼의 소비가 증가함에 따라 부산물로 얻어지는 홍삼박은 전국적으로 연간 약 8천여 톤이 생산되는 것으로 추정되고 식품소재와 동물사료로 일부 활용되고 있지만 대부분은 산업폐기물로 폐기되고 있는 실정이다.

홍삼박은 홍삼을 물 또는 알코올 등의 용매로 추출하고 남은 잔여물로서 홍삼을 수회 반복 추출하더라도 내부의 유효성분을 모두 추출할 수 없고, 또한 추출용매에 따라 물 또는 알코올에 용해되는 성분만 추출되고 용해되지 않은 사포닌, 폴리아세틸렌, 단백질 등의 유효성분이 대략 20 ~ 40% 정도 잔류하게 된다. 홍삼박은 이러한 면역활성을 갖는 다당체를 많이 함유하고 있어 사료화연구가 진행되고 있으나 비육도의 문제점이 있어 사료 소재로서 실용화되지 못하고 있다.

국외 애완동물 관련 시장은 미국, 일본 유럽 등에서 총 600억 불(약 60조 원) 시장으로 연간 1.3%씩 계속 성장하고 있으며, 국내 애완(반려)동물 관련 산업은 90년대 후반에 이르러 급속하게 발전하여 현재는 애견시장 1조, 애견인 500만, 애견(반려동물 포함) 300만 마리에 달하는 것으로 집계되고 있다. 또한 고령인구증가는 반려동물의 시장규모 향상에 기여하고 있으며, 반려동물의 건강향상에 많은 시간과 노력을 기울이고 있고, 브리더 인구가 증가함에 따라 프리미엄 기능성 동물사료 개발이 매우 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-0863607호 "홍삼박 및 한약재박을 포함하는 동물용 사료 첨가제 조성물 및 이의 제조방법"에서는 홍삼박 건조분말 및 한약재박 건조분말을 장용제피로 코팅하여 사료 첨가제 조성물을 제조하는 방법이 기재되어 있다.

그러나 이러한 방법은 가축을 사육하여 불포화지방산의 함량은 높고, 콜레스테롤 함량은 낮고, 조단백질 함량이 높은 양질의 육류 및 계란을 생산할 수 있는 효과를 얻기 위한 것으로 사육의 목적이 아닌 건강증진효과를 얻기 위한 애완동물용 사료로는 적합하지 않은 문제점이 있다.

KR 10-0863607 B1, 2008년 10월 08일

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 연구를 지속하던 중, 홍삼박에 다당체가 많이 함유되어 있어 애완동물의 사료 조성물로서 면역증진효과 및 지방세포분화억제 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 홍삼박 추출물을 함유함으로써 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 가지는 애완동물용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍삼박 추출물을 함유하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 홍삼박 추출물 제조에 있어서, 건조된 홍삼박을 조분쇄한 후 증류수를 첨가하여 45 내지 90℃의 진탕배양기(셰이킹 인큐베이터, shaking incubator)에서 1 내지 2시간 동안 추출하는 단계 및 상기 추출액을 원심분리한 후 상등액을 감압농축하여 건조하는 단계로 제조하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 건조된 홍삼박을 조분쇄 또는 미세 분쇄하여 분말 형태로 제조하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 상기 홍삼박은 홍삼으로부터 추출물을 제조하고 난 부산물로서 식이섬유, 단백질, 지방 성분뿐만 아니라, 홍삼의 유효성분인 사포닌, 폴리아세틸렌, 각종 생리활성성분이 대략 20 ~ 40% 정도 잔류될 수 있다. 통상의 홍삼추출물을 제조하는 과정에서 부산물로 생성되는 홍삼박은 수분함량이 70 ~ 95중량% 정도를 지니게 된다.

본 발명은 홍삼박 추출물의 유효성분 함량을 높이기 위해서 홍삼박을 통상적인 방법으로 자연건조 또는 열풍건조하여 전체 수분함량이 5 내지 10% 정도가 되도록 건조하여 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 건조된 홍삼박을 일정 크기로 조분쇄 또는 미세 분쇄하여 분말 형태로 애완동물용 사료 조성물을 제조할 수 있다.

이때, 조분쇄 또는 미세 분쇄는 당업계에서 널리 사용되는 분쇄기를 사용하며, 입자의 크기는 기존의 사료에 혼합하여 급여하기 용이하도록 알갱이가 육안으로 확인될 수 있을 정도의 크기 또는 밀가루처럼 고운 가루 형태로 제조할 수 있다.

이때, 별도의 번거로운 제조공정을 거치지 않기 때문에 제조에 소요되는 비용 및 시간을 절감할 수 있어 경제적인 효과를 가질 수 있다.

이때, 건조된 홍삼박 자체를 분쇄하여 제조하는 경우에는 홍삼박의 사포닌 유효성분뿐만 아니라 홍삼박에 포함되어 있는 식이섬유, 단백질 등의 영양성분들을 함께 섭취할 수 있는 장점이 있다.

또한, 기존의 일반 애완동물용 사료와 함께 혼합하여 급여할 수 있으므로 애완동물이 섭취하기 용이하여 적용범위가 넓다.

본 발명은 홍삼박의 유효성분 추출효율을 높이기 위해서 상기 건조된 홍삼박을 일정크기로 조분쇄하여 사용할 수 있으며, 이때 분쇄기는 당업계에서 일반적으로 널리 사용하는 것으로서 종류에 구애받지 않는다.

본 발명은 상기 조분쇄한 홍삼박에 중량대비 5 내지 10배의 증류수를 첨가하여 45 내지 90℃, 바람직하게는 50 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 50 내지 60℃ 정도의 진탕배양기(셰이킹 인큐베이터, shaking incubator)에서 120rpm으로 1 내지 2시간, 바람직하게는 1시간 동안 추출하여 홍삼박 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명은 상기 제조된 홍삼박 추출물을 원심분리한 다음 상등액을 감압농축하여 건조할 수 있다. 이때 원심분리, 감압농축 및 건조는 당업계의 통상적인 방법에 의하며 그 방법에 구애받지 않는다.

여기서, 홍삼박 추출물을 원심분리에 의하여 사포닌 등 유효성분의 함량이 높은 상등액을 얻을 수 있다.

또한, 상기 상등액을 감압농축함으로써 중량대비 홍삼의 유효성분 함량을 높일 수 있다.

여기서, 상기 건조단계에서 건조 홍삼박 추출물을 제조함으로써 기능성 애완동물용 사료 제조시 구성성분으로 첨가할 수 있으며 기존의 일반적인 애완동물용 사료와 동시에 혼합하여 급여할 수 있다.

본 발명은 홍삼박을 주재료로 이용하여 홍삼의 유효성분만을 추출하여 사용함으로써 홍삼 특유의 강한 향이 제거되어 애완동물이 거부감없이 섭취할 수 있도록 한다.

본 발명에 따른 애완동물용 사료 조성물은 사포닌성분과 각종 생리활성성분이 함유되어 있는 홍삼박 추출물을 이용함으로써 사포닌 등의 유효성분에 의하여 애완동물의 면역력 증진효과 및 지방세포분화억제에 의한 항비만 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 RAW 264.7 세포에 대한 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 세포생존율을 측정한 그래프이다.
도 2는 RAW 264.7 세포에서 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 NO 생성량을 측정한 그래프이다.
도 3은 RAW 264.7 세포에서 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 TNF-α 생성량을 측정한 그래프이다.
도 4는 T 세포의 활성화 유도물질인 LPS 와 B 세포 활성화 유도물질인 concanavalin A(Con A)에 대한 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 비장세포 증식 억제능을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 α-glucosidase 억제율을 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 3T3-L1 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 3T3-L1 세포의 지방분화 억제 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[ 실시예 1] 본 발명에 따른 홍삼박 추출물 제조

건조된 홍삼박을 조분쇄하여 20g에 증류수 100ml을 첨가한 후 50℃ shaking incubator(진탕배양기)에서 1시간 동안 추출(120rpm)한 후 원심분리하여 상등액을 감압농축 건조하여 6.2g의 홍삼박 추출물을 얻었다.

[ 실험예 1] 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 면역증진 활성 평가

(1) 세포배양

마우스의 대식세포주인 Raw 264.7 cell은 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

(2) 세포 생존율 측정

세포에 대한 독성 측정은 MTT 방법으로 분석하였다. Raw 264.7 세포 2×10⁴cells/mL를 96 well plate에 분주하고 시료를 농도별 (25, 50, 100, 200 μg/mL)로 24시간 동안 처리하였다. EZ-Cytox(Daeil, Korea)을 이용하여 Well당 10μl 용액을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader(Molecular devices, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 세포에 대한 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 세포생존율 측정에서 200ug/mL의 고농도에서 98.0%의 세포생존율을 보여 면역세포에 대한 독성이 없음을 확인하였다.

(3) Nitric Oxide ( NO ) 생성량 측정

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 NO assay kit (Intron, Korea)를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 2×10⁴cells/mL로 조절한 후 96 well plate에 분주하고, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 배양 후 PBS로 수세한 후 양성대조군으로 1μg/mL의 LPS와 시료를 25, 50, 100, 200μg/mL를 첨가한 후 24시간 배양하였다. Nitric oxide detection kit (Intron, Korea)를 사용하여 Sulfanilamide in the reaction buffer 50μL를 넣고 10분 동안 반응시켰다. 그 후 Naphthylethylenediamine in the stabilizer buffer를 50μL을 넣고 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader (Molecular devices, USA)에서 흡광도 540nm를 측정하여 sodium nitrite의 검량선으로부터 NO 대사물인 nitrite의 생성 정도를 산출하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 시료를 처리하지 않은 대조군에서는 NO의 생성량이 8.9uM이었으나 본 발명에 따른 홍삼박 추출물을 25ug/mL, 50ug/mL, 100ug/mL, 200ug/mL로 처리한 군에서는 각각 16.1, 17.2, 18.0, 18.3uM로 NO의 생성을 유의(p<0.05)하게 증가시켜 면역증진효과가 있음을 확인할 수 있었다.

(4) Tumor necrosis factor -α( TNF -α) 생성량 측정

세포 배양액 내의 TNF-α 생성량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 2×10⁴cells/mL로 6 well plate에 분주하고, 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양하였다. 세포에 양성대조군으로 1μg/mL의 LPS 및 0, 25, 50, 100, 200μg/mL의 시료를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 배지를 취하여 TNF-α(BD, USA)를 ELISA reader(Molecular devices, USA)를 이용하여 450nm에서 측정하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 세포에서 본 발명에 따른 홍삼박 추출물을 25ug/mL, 50ug/mL, 100ug/mL, 200ug/mL로 처리한 군에서 각각 88.2, 140.7, 154.3, 155.9ng/mL로 TNF-α생성을 농도 의존적으로 유의(p<0.05)하게 증가시켜 면역세포를 활성시키는 것으로 확인되었다.

(5) 세포 내 염증관련 단백질 발현 양상 측정

염증 효과를 알아보기 위하여 염증과 관계된 iNOS, COX-2 단백질의 양을 측정하였다. 대식세포주(Raw264.7)를 이용하여 2×10⁴cells/mL로 6 well plate에 배양한 뒤 시료를 처리한 다음 24시간 후에 PBS로 세척한 후 원심분리 하여 세포를 수집하고, RIPA buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다. 세포 lysate에 함유된 단백질의 양은 Bradford 법으로 측정하였다. 단백질 20μg을 10% polyacrylamide를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF membrane으로 electroblot 120 V에서 1시간을 실시하였다. 이어 PVDF membrane을 5% skim milk에서 1시간 방치한 뒤 primary antibody에서 4℃에서 overnight하여 주었다. 다시 tris-buffered saline and tween 20 (TBST)으로 세 번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세 번 세척하고 ECL kit (Amersham-Pharmacia, USA)와 반응시켜 Chemidoc (Bio-rad, USA) 이용하여 밴드 현상을 측정하였다.

(6) 비장세포 증식 측정

면역세포의 증식에 미치는 효과를 측정하기 위하여 생쥐의 비장세포를 이용하였다. 먼저 생쥐의 비장을 분리한 다음, mesh를 통하여 분쇄하고 원심분리하여 상층액을 제거하여 비장세포를 회수하였다. 이후 RBC lysis buffer로 잔여 적혈구를 제거한 뒤 RPMI 1640 배지를 이용하여 2회 세척하였다. 분리한 비장세포는 5×10⁶cell/mL으로 희석한 다음 96 well plate에 넣고 여기에 T 세포의 활성화 유도물질인 lipopolysaccharide (LPS) 및 B 세포 활성화 유도물질인 concanavalin A(Con A)를 넣고 시료를 농도별로 희석한 것을 넣고 48시간 5%, CO2 incubator에 배양한 후, 각 well당 10μL의 CCK-8 kit (Dojindo Laboratories, Japan) 용액을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 배양하고 450nm에서 흡광도를 측정하여 활성을 비교하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, T 세포의 활성화 유도물질인 LPS 와 B 세포 활성화 유도물질인 concanavalin A(Con A)에 대한 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 비장세포 증식능을 측정하였다. 본 발명에 따른 홍삼박 추출물은 LPS 및 Con A 유도 비장세포 증식능을 농도 의존적으로 억제하였다. 따라서 본 발명에 따른 홍삼박 추출물은 세포성 면역 및 체액성 면역에 모두 관여하는 것으로 확인되었다.

[ 실험예 2] 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 항비만 활성 평가

(1) α- Glucosidase 저해 활성 측정

1 unit/mL의 효모 기원의 α-glucosidase(Sigma, USA) 20μL에 각 시료를 20μL을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 1mM ρ-nitrophenyl α-D-glucoprytanoside(ρNPG, in potassuin phophate buffer, pH 6.9)를 40μL 첨가하였다. 37℃에서 30분간 반응시킨 후 1M Na₂CO₃를 첨가하여 반응을 종결시키고, 405nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 acarbose를 사용하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 홍삼박 추출물을 α-glucosidase에 농도별로 처리하였을 때 농도 의존적으로 유의하게 억제효과를 보였다. 잘 알려진 α-glucosidase 억제제인 acarbose와 같은 농도로 비교했을 때에 acarbose는 53%, 본 발명에 따른 홍삼박 추출물은 37%의 억제율을 보였다.

(2) 3 T3 - L1 배양 및 분화 유도

실험에 사용한 3T3-L1adipocyte는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 배양 및 분화배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium high glucose에 10% calf serum, antibiotics를 첨가하여 5% CO2, 습도 37℃ incubator에서 계대 배양하였다. 분화 배양배지 Dulbecco's modified Eagle's medium high glucose에 10% fetal bovine serum (FBS), antibiotics를 첨가하여 5% CO₂, 습도 37℃ incubator에서 3∼4일 후 세포가 융합하게 되면 trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 분리하여 원심분리기 1000rpm. 5분에서 세포를 모은 후 세포밀도가 2×10⁶cell인 suspension용액을 만들어 1mL씩 plating하여 배양하였다. 4일 후 융합된 세포를 분화배지 DMEM 배양액에 0.5mM IBMX, 5μg/mL의Insulin, 0.25mM dexamethasome이 첨가된 배지를 처리하여 분화를 유도하였다. 2일 후 feeding medium DMEM 배양액에 5μg/mL의 insulin만 포함된 배지로 배지를 갈아준 후 2일에 한 번씩 feeding medium으로 갈아 주며 세포를 분화시켰다.

(3) 3 T3 - L1 지방세포 생존능에 미치는 영향 측정

도 6에 나타낸 바와 같이, 분화가 완료된 3T3-L1 지방세포에 본 발명에 따른 홍삼박 추출물을 농도별로 처리하고 MTT assay를 수행하여 세포 독성을 측정하였다. 본 발명에 따른 홍삼박 추출물의 농도가 증가할수록 지방세포의 생존율이 감소하는 것으로 관찰되었으며 200ug/mL의 시료 농도에서는 무처리 대조군에 비하여 80%로 유의하게 (p<0.05) 세포생존 저해율을 보였다.

(4) Oil red O 염색법

분화가 유도된 3T3-L1 adipocyte를 phosphate buffered saline(PBS)으로 2회 세척 후, 3% 완충용액으로 15분간 고정하고 PBS로 3회 세척 후 Oil red O로 20분 동안 염색하였다. 증류수로 세척한 다음 남아있는 물기를 건조시킨 뒤 광학현미경으로 염색된 지방구를 확인하였다. 확인 후 프로플렌 글리콜(propyleneglycol)로 다시 Oil red O 염료를 추출하였다. 이후 500nm에서 각각 흡광도를 측정하여 분화된 각 세포에 함유된 지방의 양을 측정하고, 추출물을 처리하지 않은 대조군에서 측정된 지방의 양에 대한 상대적인 비율을 산출하여 각 세포의 분화 정도를 확인하였다.

본 발명에 따른 홍삼박 추출물이 3T3-L1 지방세포의 lipid droplet 형성에 미치는 효능을 평가하기 위하여 Oil Red O를 이용하여 염색하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 홍삼박을 50ug/mL, 100ug/mL, 200ug/mL을 처리하고 현미경 및 육안으로 관찰한 결과 농도 의존적으로 지방세포 분화 및 지방세포 내 지방생성을 억제 효과를 확인할 수 있었다.

Claims (3)

1. 홍삼박 추출물을 함유하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 홍삼박 추출물은 건조된 홍삼박을 조분쇄한 후 증류수를 첨가하여 45 내지 90℃의 진탕배양기(셰이킹 인큐베이터, shaking incubator)에서 1 내지 2시간 동안 추출하는 단계; 및
   상기 추출액을 원심분리한 후 상등액을 감압농축하여 건조하는 단계로 제조하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 조성물.
3. 건조된 홍삼박 분쇄물을 함유하는 면역력 증진효과 및 항비만 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 애완동물용 사료 조성물.

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