KR20190053607A - 고압 분쇄추출 공정을 이용한 아로니아 추출물의 제조방법 및 이에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 약학 조성물 - Google Patents

고압 분쇄추출 공정을 이용한 아로니아 추출물의 제조방법 및 이에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 아로니아 추출물의 제조방법에 따르면, 아로니아 분말에 펙티나아제를 적절히 처리하여 아로니아 과피의 견고함을 감소시킨 후, 고속 및 초고압 분쇄혼합 공정으로 아로니아 입자를 나노미터 크기까지 분쇄하고, 이를 저온으로 가열해 아로니아 추출물을 제조함에 따라, 아로니아에 포함된 유효성분을 현저히 높은 효율로 추출할 수 있을 뿐만 아니라, 아로니아에 포함된 안토시아닌의 변성 및 파괴를 효과적으로 방지할 수 있어 항산화 활성이 높은 아로니아 추출물을 제조할 수 있다. 또한 상기 아로니아 분쇄물에 탄나아제를 처리하여 아로니아의 떫은 맛을 경감시킬 수 있었다.
상기한 아로니아 추출물은 항산화 활성이 높아 면역 증진용 약학적 조성물 또는 기능성 식품 등의 다양한 용도에 활용 가능하다.

Description

고압 분쇄추출 공정을 이용한 아로니아 추출물의 제조방법 및 이에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 약학 조성물{Method for preparing Aronia extract comprising high pressure homogenization process and pharmaceutical composition for improving immunity comprising Aronia extract prepared thereby as active ingredients}
본 발명은 고압 분쇄추출 공정을 포함하는 아로니아 추출물의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 효소 처리, 고속 및 고압 분쇄 공정을 이용한 아로니아 추출물의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 약학 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
최근, 고령화 사회로의 진입이 가속화됨에 따라 건강에 대한 관심이 증가하고 있다. 이에 따라, 스트레스, 식습관의 변화, 환경오염 등에 적절하게 대응을 하지 못하면 면역력 감소 및 염증 유발의 우려가 있어 이에 대한 효과적인 대응 방안이 요구되고 있다.
한편, 면역반응은 생명체의 자기방어 수단으로 림프구, 대식세포 등의 다양한 면역세포들에 의해 일어나는 현상으로, 염증유발 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 등에 의해 조절되며 비정상적으로 과도하게 분비되는 경우 알레르기 또는 만성 염증과 같은 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은, 면역의 조절은 자유 라디칼(free radical), 항산화(anti-oxidant)와 밀접한 관계가 되어 있다고 알려져 있다. 따라서, 항산화력이 높은 기능성 식품을 개발하여 면역력을 향상시키기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다. 특히, 천연물의 경우, 경험적으로 안전성과 유효성이 입증되었기 때문에 부작용이 적고 개발 기간과 비용을 절감할 수 있어, 천연물을 이용하여 면역력을 향상시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
일례로, 천연물 중 아로니아(Aronia melanocarpa)는 동북 아메리카 및 동유럽에서 자생하는, 장미과에 속하는 베리류로서 항산화성이 높은 천연물로 알려져 있다. 상기 아로니아에는 항산화물질로 알려진 안토시아닌이 자연계 식물들 중에서 가장 많이 함유하는 군에 속한다고 알려져 있는데, 아로니아에 포함된 안토시아닌의 예로서는 시아니딘-3-갈락토시드(cyanidin-3-galactoside), 시아니딘-3-글루코사이드(cyanidin-3-glucoside), 시아니딘-3-아라비노사이드(cyanidin-3-arabinoside), 델피니딘-3-글루코사이드(delphinidin-3-glucoside) 등이 있다. 그 밖에도, 다량의 페놀이 함유되어 있는 것으로 알려져 있어 뛰어난 항산화 효과와 항염증에 효능을 보일 뿐만 아니라, 당뇨 및 각종 심혈관계 질환과 향장 관련 효능을 갖는 것으로 알려져 있다.
그러나, 아로니아의 유용 성분인 안토시아닌의 안정성은 온도, pH, 빛, 저장기간에 큰 영향을 받기 때문에 추출 간에 안토시아닌의 파괴가 발생하여 본래의 높은 성분함량에 비하여 상응하는 활성을 나타내지 못해 활용도가 기대치에 미치지 못하는 문제점이 있었다.
또한, 아로니아는 과피가 두껍고 떫은 맛이 강해 생과를 그대로 이용하기 어려워 착즙 등을 통한 농축액이나 분말 형태로 이용되고 있으나 이마저도 아로니아 원과의 착즙수율이 낮고 떫은 맛이 강하여 아로니아를 음료 및 건강기능식품의 기능성 원료로 사용하는데 어려움이 있는 실정이다.
타닌(Tannin)은 많은 식물에 널리 분포하고 수용액은 수렴성이 강하여 떫은맛을 가지는 화합물의 총칭으로 에피카테닌(Epicatechin), 에피카테닌 갈레이트(Epicatechin gallate), 카테닌-3-갈레이트(catechin-3-gallate), 갈로카테닌-3-갈레이트(gallotechhin-3-gallate) 등의 여러가지 폴리페놀류가 중합한 고분자물질이다. 아로니아는 이 타닌성분이 많이 함유되어 있어 떫은맛이 강하게 느껴지며 이러한 타닌 성분은 탄나아제(Tannase)에 의해 분해될 수 있다.
이에 따라, 상기한 바와 같은 문제점을 효과적으로 해결할 수 있도록, 유효성분의 함량이 높은 아로니아 추출물을 제조하고, 이를 면역 증진을 위해 활용할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다.
한국공개특허 제10-2016-0074249호 (공개일 : 2016.06.28)
본 발명의 발명자들은, 아로니아에 포함된 면역 활성물질의 용출을 증진시키기 위한 다양한 연구를 수행하던 중, 펙티나아제 처리와 고속 및 초고압 분쇄 추출 공정을 활용하여 아로니아 추출물을 제조하면, 아로니아의 면역 활성물질의 추출효율을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
이에 본 발명에서는, 펙티나아제 처리와 고속 및 초고압 분쇄추출 공정을 이용하여 유효 성분의 함량이 높은 아로니아 추출물을 제조하는 방법과 이에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하여 면역 증진을 위한 목적으로 활용할 수 있는 조성물 및 건강 기능성 식품에 대한 기술내용을 제공하고자 하는 것이다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서, 본 발명은 (a) 아로니아 분말을 정제수와 혼합한 후 펙티나아제(pectinase)를 처리하여 효소 반응물을 제조하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 효소 반응물과 용매의 혼합물을 고속 분쇄방법으로 분쇄하여 제1 분쇄 혼합물을 제조하는 단계; (c) 상기 단계 (b)에서 얻은 제1 분쇄 혼합물을 초고압 분쇄혼합 공정으로 분쇄하여 제2 분쇄 혼합물을 제조하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 얻은 제2 분쇄 혼합물을 가열하여 아로니아 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 아로니아 추출물의 제조방법을 제공한다(도 1 참고).
일 실시예에서, 상기 아로니아는 블랙초크베리(black chokeberry), 레드초크베리(red chokeberry), 아로니아 멜라노카파 아론(Aronia melanocarpa Aron), 아로니아 멜라노카파 네로(Aronia melanocarpa Nero), 아로니아 멜라노카파 바이킹(Aronia melanocarpa Viking) 및 아로니아 멜라노카파 메킨지(Aronia melanocarpa Mckenzie)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
일 실시예에서, 단계 (a)는 아로니아 분말에 1~20 중량%의 펙티다아제를 40℃에서 30분 내지 2시간 동안 처리함으로써 수행된다.
일 실시예에서, 단계 (b)의 용매는 40~70 중량%의 메탄올일 수 있다.
일 실시예에서, 단계 (b)의 고속 분쇄방법은 10,000 내지 30,000 rpm의 속도로 5~30분 동안 수행되는 것일 수 있다.
일 실시예에서, 단계 (c)의 초고압 분쇄혼합 공정은 10,000 내지 40,000psi의 압력에서 수행될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 단계 (d)에서는, 상기 제2 분쇄 혼합물을 60 내지 90 ℃의 온도로 3~24시간 동안 가열하여 수행될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 아로니아 추출물은 시아닌(cyanin), 시아니딘 (cyanidin), 델피닌(delphinin), 델피니딘(delphinidin), 말빈(malvin), 말비딘 (malvidin), 펠라르고닌(pelargonin), 펠라르고니딘(pelargonidin), 페오닌 (peonin), 페오니딘(peonidin), 페튜닌(petunin) 및 페튜니딘(petunidin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 안토시아닌을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제조 방법은 단계 (c)와 단계 (d)의 사이에 상기 제2 분쇄 혼합물에 1~20%의 탄나아제(tannase)를 40℃에서 30분 내지 2시간 동안 처리하여 2차 효소 반응물을 얻는 단계;를 추가로 포함할 수 있다(도 2 참고).
본 발명은 또한 상기 제조 방법에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 제조 방법에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 건강 기능성 식품 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 아로니아 추출물의 제조방법에 따르면, 아로니아에 포함된 유효성분을 현저히 높은 효율로 추출할 수 있을 뿐만 아니라, 아로니아에 포함된 안토시아닌의 변성 및 파괴를 효과적으로 방지할 수 있어 항산화 및 면역 활성이 개선된 아로니아 추출물을 제조할 수 있다. 또한 아로니아 추출물에 탄나아제를 처리하여 아로니아 특유의 떫은 맛을 내는 탄닌을 감소시킬 수 있다.
따라서, 상기한 아로니아 추출물은 항산화 활성 및 면역 증진 효과가 개선된 약학 조성물 또는 기능성 식품 등의 다양한 용도에 효과적으로 활용이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 아로니아 추출물의 제조방법을 나타낸 공정도이다.
도 2는 본 발명에 따른, 쓴 맛이 감소된 아로니아 추출물의 제조 방법을 나타낸 공정도이다.
도 3은 가열시 온도에 따른 안토시아닌의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 및 비교예에 따른 아로니아 추출물로 처리한 섬유아 세포(LPS 처리)에서 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 1에 따른 아로니아 추출물로 처리한 대식세포(LPS 처리)에서 IL-6의 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 1에 따른 아로니아 추출물로 처리한 대식세포(LPS 처리)에서 TNF-a의 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1에 따른 아로니아 추출물로 처리한 면역 세포(LPS 처리)에서 IgE 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 및 비교예에 따른 아로니아 추출물로 처리한 면역 세포에서의 T 세포 생존성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 및 비교예에 따른 아로니아 추출물로 처리한 면역 세포에서의 B 세포 생존성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 1 및 2에 따른 아로니아 추출물 중의 총 탄닌 함량을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.
본 발명은, 본 발명은 (a) 아로니아 분말을 정제수와 혼합한 후 1~20 중량%, 바람직하게는 5~15 중량%의 펙티나아제를 처리하여 40℃에서 30분 내지 2 시간 동안 진탕 배양함으로써 효소 반응물을 제조하는 단계; (b) 단계 (a)에서 얻은 상기 효소 반응물과 용매의 혼합물을 고속 분쇄방법으로 분쇄하여 제1 분쇄 혼합물을 제조하는 단계; (c) 단계 (b)에서 얻은 상기 제1 분쇄 혼합물을 초고압 분쇄혼합 공정으로 분쇄하여 제2 분쇄 혼합물을 제조하는 단계; (d) 단계 (c)에서 얻은 상기 제2 분쇄 혼합물을 가열하여 아로니아 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 아로니아 추출물의 제조방법을 제공한다(도 1 참고).
아로니아는 폴리페놀 및 안토시아닌 등을 함유하고 있어 항산화성이 높고 다양한 생리활성을 가지는 반면, 과피가 단단하여 추출 및 착즙 수율이 낮고 떫은 맛이 강하여 식품에 그대로 사용하기 어려웠다. 그러나, 안토시아닌 등의 유효 물질이 과피에도 다량 포함되어 있는바, 과피를 완전히 제거할 수 없는 문제점이 있었다. 이에, 본 발명에서는 단계 (a)에서 과피를 포함하는 아로니아 건조 분말에 대해 1~20 중량%의 펙티나아제를 전처리함으로서 아로니아의 추출 효율을 높이고자 하였다.
또한, 상기 단계 (b) 및 (c)에서는 아로니아를 용매와 혼합한 혼합물을 고속 및 초고압 분쇄 방법으로 분쇄하여, 아로니아를 나노 크기의 미세한 입자로 균일하게 분쇄할 수 있다. 단계 (d)에서는 아로니아 분쇄액을 가열하여 안토시아닌 등의 유효 물질 추출, 및 상기 전처리 공정에 사용된 펙티나아제 실활을 도모하였다.
일 실시예에서, 다양한 종류의 아로니아를 사용하여 아로니아 추출물을 제조할 수 있다. 상기 아로니아는 블랙초크베리, 레드초크베리, 아로니아 멜라노카파 아론, 아로니아 멜라노카파 네로, 아로니아 멜라노카파 바이킹 및 아로니아 멜라노카파 메킨지로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 아로니아는 건조 분말, 절편, 생과 등 형태에 제한받지 않고 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아로니아 분말을 사용할 수 있다. 아로니아 분말을 사용하는 경우 유효 성분의 생체 흡수율을 더욱 높일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 단계 (b)의 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 40~70%의 메탄올을 사용할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 단계 (b)의 고속 분쇄 공정은 10,000 내지 30,000 rpm의 속도로 5~30분 동안 수행될 수 있다. 상기 고속 분쇄 방법은 고속 회전모터가 구비된 분쇄장치를 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 회전모터를 10,000 내지 30,000 rpm의 속도로 가속하고, 분쇄를 5 내지 30분 동안 수행되도록 구성하여 마이크로 크기로 미세 분쇄된 아로니아 입자를 포함하는 제1 분쇄 혼합물을 제조할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 단계 (c)의 초고압 분쇄혼합 공정은 10,000~40,000 psi의 압력, 바람직하게는 30,000psi의 압력하에서 수행될 수 있다. 상기 단계 (c)에서는 마이크로미터 크기의 아로니아 입자가 포함된 제1 분쇄 혼합물을 초고압 분쇄혼합공정에 의해 재분쇄하여 나노미터 크기의 아로니아 입자를 포함하는 제2 분쇄 혼합물을 제조할 수 있어, 아로니아 유효성분의 추출효율을 현저히 증가시킬 수 있다.
상기 초고압 분쇄혼합 공정은, 수십 마이크로미터 단위의 미세한 관이 구비된 초고압 분쇄 혼합기(High Pressure Homogenizer)에 제1 분쇄 혼합물을 공급하고, 고압을 가해 아로니아 입자를 음속 이상으로 가속시켜, 가속된 아로니아 입자가 관을 통과하면서 고에너지를 전달받게 됨에 따라, 이러한 고에너지는 분산도의 균일성과 입자크기의 축소효능을 가진 나노미터 크기의 아로니아 입자를 만들 수 있게 한다.
일 실시예에서, 상기 단계 (d)에서는, 상기 제2 분쇄 혼합물을 40~100 ℃, 바람직하게는 60~90 ℃, 가장 바람직하게는 80℃의 온도로 3~24시간 동안, 바람직하게는 6~12 시간 동안 가열하여 수행될 수 있다.
상기 단계 (c)는 상기 제2 분쇄 혼합물을 가열하여 아로니아 입자에 포함된 유효성분을 효과적으로 추출하도록 구성할 수 있다. 상기 아로니아는 고온에서 쉽게 분해되는 안토시아닌 성분을 다량 포함하므로, 고온 공정에 의한 추출시 아로니아 추출액의 항산화능 등의 생리 활성이 떨어지는 등의 문제점이 있었다. 본 발명에서는 상기 문제를 해결하고자, 그리고 전처리된 펙티나제 실활을 위해 안토시아닌이 최대한 파괴되지 않는 적정 온도로 가열 공정을 수행하였다. 안토시아닌은 90℃ 이하에서 크게 파괴되지 않는 것으로 알려져 있다(도 3 참고).
상기 가열 온도가 40℃ 미만이거나, 가열을 3시간 미만으로 수행할 경우, 아로니아 유효성분의 추출 효율이 다소 떨어질 수 있다. 또한 가열 온도가 100℃를 초과하면, 안토시아닌 다량 파괴의 우려가 있고, 24시간 이상 가열하더라도 유효성분의 추가적인 추출이 어려울 수 있다.
상기와 같이, 본 발명에서는 펙티나아제 전처리 후, 고속 및 초고속 분쇄방법으로 분쇄한 아로니아 분말을 저온으로 가열하여 아로니아 추출물을 제조함에 따라, 종래에 사용되어 왔던 아로니아 열수 추출 또는 에탄올 추출 방법 등에 비하여 추출 수율이 현저히 증진됨에 따라, 안토시아닌 함량이 매우 높은 아로니아 추출물을 제조할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 아로니아 추출물은 시아닌, 시아니딘, 델피닌, 델피니딘, 말빈, 말비딘, 펠라르고닌, 펠라르고니딘, 페오닌, 페오니딘, 페튜닌 및 페튜니딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 안토시아닌을 포함할 수 있으며, 기존의 아로니아 추출물에 비해 세포 독성은 낮으면서도, 항산화 활성이 높은 아로니아 추출물을 제조할 수 있다.
따라서, 상기한 아로니아 추출물은 항산화 활성이 높아 체내 도입시 면역 증진효과를 기대할 수 있어 이를 이용해 면역 증진을 목적으로 한 다양한 조성물 또는 식품 제조를 위해 용이하게 활용가능하다.
일 실시예에서, 상기 아로니아 추출물을 여과하고 감압농축하는 단계, 및 상기 아로니아 농축액을 동결 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이에 의해, 아로니아에 포함된 유효성분이 농축된 농축 아로니아 추출물 및 이의 건조 분말을 제조하여 다양한 용도로 활용할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 아로니아 추출물의 제조 방법은 상기 제2 분쇄 혼합물에는 1~20 중량%의 탄나아제를 40℃에서 1~2 시간 동안 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다(도 2 참고).
아로니아는 과피가 두껍고 떫은 맛이 강하여 약이나 식품으로서의 사용에 제한이 있었다. 그러나 본 발명에서는 추출 공정 중에 아로니아의 떫은 맛의 원인이 되는 탄닌 성분을 분해할 수 있는 탄나아제를 처리하여 아로니아 추출물의 떫은 맛을 감소시켜, 섭취시의 애로점을 완화하고자 하였다.
본 발명은 또한 상기에 기재된 방법에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 아로니아 추출물을 0.1 내지 90 중량%로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 본 발명의 조성물은 약학으로 허용 가능한 담체와 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 탄나아제를 처리하는 제조 방법에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 건강 기능성 식품 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 식품 조성물은 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 상기 면역 증진용 건강 기능성 식품 조성물은 형제, 결합제, 붕해제, 교미제, 착향제 등의 통상의 식품 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 아로니아의 떫은 맛을 더욱 개선하기 위하여 당류(설탕, 과당, 포도당, 물엿, 올리고당, 감초, 자일리톨, 쏠비톨 등), 및 산류 (구연산, 젖산, 사과산, 개미산, 식초, 레몬 등)를 추가로 사용할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물 및 식품 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 제형으로 제조 및 가공할 수 있고, 정제 또는 환의 제형인 경우 아로니아의 떫은 맛을 감소시키기 위해 필요에 따라 교미제, 착향제 등을 함유할 수 있으며, 백당 등의 제피제로 당코팅 될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
이하에서는 실시예 1 및 2, 비교예의 방법에 의해 아로니아 추출물을 제조하여 실험예에 사용하였고, 이를 하기 표 1에 간략하게 나타내었다.
구분 처리 방법
실시예 1 아로니아에 대한 펙티나아제, 고속 및 초고압 분쇄 공정 처리
실시예 2 아로니아에 대한 펙티나아제, 고속 및 초고압 분쇄 공정, 및
탄나아제 처리
비교예 아로니아의 에탄올 추출물
실시예 1: 초고압 분쇄 추출공정을 이용한 아로니아 추출물의 제조
건조 아로니아 분말 100g을 증류수 1ℓ에 첨가(10 중량%)한 후, 펙티나아제 5~10 중량%를 40℃에서 120 rpm으로 1시간 30분 동안 진탕 반응하였다. 상기 펙티나아제 처리된 아로니아를 고속 분쇄기를 이용해 20,000 rpm으로 15분 동안 파쇄하였다. 파쇄한 아로니아 분말을 70㎛ 크기의 관을 구비한 초고압 분쇄혼합기에 통과시켜 10000 내지 30000 psi의 압력을 가해 초고압 분쇄혼합 공정을 수행하여 아로니아 추출물을 수득하였고, 수득한 아로니아 추출물을 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열하였으며, 얻어진 아로니아 추출물을 여과 및 감압농축 한 후, 동결건조하여 아로니아 추출물 분말을 제조하였다.
실시예 2: 초고압 분쇄 추출공정 및 탄나아제 처리를 이용한 아로니아 추출물의 제조
건조 아로니아 분말 100g을 증류수 1ℓ에 첨가(10 중량%)한 후, 펙티나아제 5~10 중량%를 40℃에서 120 rpm으로 1시간 30분 동안 진탕 반응하였다. 고속 분쇄기를 이용해 20,000 rpm으로 15분 동안 파쇄하였다. 파쇄한 아로니아 분말을 70㎛ 크기의 관을 구비한 초고압 분쇄혼합기에 통과시켜 10000 내지 30000 psi의 압력을 가해 초고압 분쇄혼합 공정을 수행하여 아로니아 추출물을 수득하였다. 상기 아로니아 추출물에 1~10 중량%의 탄나아제를 처리하여 40℃에서 120 rpm으로 1시간 30분 동안 진탕 반응하였다. 수득한 아로니아 추출물을 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열하였으며, 얻어진 아로니아 추출물을 여과 및 감압농축 한 후, 동결건조하여 아로니아 추출물 분말을 제조하였다.
비교예 : 아로니아의 에탄올 추출물의 제조
건조 아로니아 분말 100g을 에탄올 1ℓ에 첨가(10 중량%)하여 혼합한 후, 80 로 24시간 동안 가열하여 아로니아 에탄올 추출물을 제조하였다. 제조한 에탄올 추출물을 여과장치를 통해 여과하였으며, 여과된 아로니아 에탄올 추출물을 감압농축한 후, 동결건조하여 아로니아 에탄올 추출물의 분말을 제조하였다.
<실험예>
실험예 1: 아로니아 추출물의 항산화 활성 분석
상기 실시예 1 및 비교예에 따른 방법에 의해 제조된 아로니아 추출물의 항산화 활성을 측정하였다. 이를 위해, 아로니아 추출물의 DPPH 소거 활성, 환원력 및 총 페놀 함량을 측정하여 아로니아 추출물의 항산화 활성을 분석하였으며, 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
비교예 실시예 1
DPPH 소거 활성 (%) 58.73 65.5
환원력 (O.D.) 0.412 0.602
총 페놀 함량 (㎎/㎖) 81.3 118.1
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 비교예의 방법으로 제조한 아로니아 추출물의 항산화 활성을 측정한 결과, 에탄올 추출방법을 이용한 비교예의 아로니아 추출물보다, 펙티나아제 처리와 고압 및 초고압 분쇄추출 방법을 이용한 실시예 1의 아로니아 추출물이 항산화 활성이 더욱 높은 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 통해, 본 발명에 의해 제조된 아로니아 추출물은 높은 항산화 활성을 나타내 체내 도입시 면역 증진작용이 우수할 것으로 판단되었다.
실험예 2: 아로니아 추출물의 세포독성 분석
제조한 아로니아 추출물의 체내 도입시 안정성 여부를 검증하기 위해, 실시예 1 및 비교예의 아로니아 추출물의 세포독성(cytotoxicity)을 분석을 수행하였다. 세포독성 분석은 MTT 시약을 사용하여 수행하였으며, 세포로는 섬유아 세포(CCD-986sk)를 사용하였고, 세포독성 측정 방법은 세포를 3.0×105 농도로 96-웰 플레이트(well plate)에 24시간 동안 배양한 후, 아로니아 추출물 시료를 농도별(0.3, 0.6 및 1.0 mg/ml)로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포에 200 ㎍/㎖ 농도의 MTT 시약을 암실에서 50㎕씩 주입하여 3시간 동안 추가로 배양한 후, PBS 완충 용액으로 2회 세척하고 DMSO를 각 웰에 200㎕씩 주입하여 20분 뒤에 570nm에서 흡광도(O.D 값)로 측정하였다. 또한, 세포 생존률의 측정은 하기 수학식 1을 이용하여 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
Figure pat00001
도 4에 나타난 바와 같이, 제조한 아로니아 추출물의 세포독성을 측정한 결과, 아로니아 추출물은 농도 의존적으로 세포독성이 높아지는 것을 확인하였으나, 실시예 아로니아 추출물의 세포독성이 더욱 낮은 것으로 확인되었다.
실험예 3: 아로니아 추출물의 면역 활성 분석
(1) 아로니아 추출물의 사이토카인 생성량 측정
제조한 아로니아 추출물의 면역 활성을 분석하기 위하여 대식세포에서의 인터루킨-6(IL-6)와 TNF-a(tumor necrosis factor-a)의 생성량을 측정하였다. 사이토카인(Cytokine)의 측정은 Quantikine ELISA 키트를 이용하였으며, 키트에 있는 실험방법을 참고하여 측정을 수행하였다.
먼저, RAW 264.7 세포를 2.5×105 세포/㎖ 농도만큼 96-웰 플레이트에 첨가하여 하루 동안 배양하였다. 그 후에 배지를 제거하고 LPS 및 실시예 1의 아로니아 추출물 시료(0.3, 0.6 및 1.0 mg/㎖)를 첨가하여 다시 24시간 동안 배양하여 배양액을 수득하였으며, 수득한 배양액을 이용하여 키트의 매뉴얼대로 사이토카인의 측정을 수행하였고, 키트에 포함된 기준(standard)을 이용해 대식세포에서의 IL-6 및 TNF-α의 생성량을 정량하였으며, 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.
도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 아로니아 추출물 시료를 첨가한 대식세포에서는 농도의존적으로 IL-6와 TNF-α의 생성량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 아로니아 추출물의 IgE 분비 억제능 측정
인간 유래 B 세포주인 U266B1 세포를 RPMI1640(GIBCO), 15% FBS(Hyclone) 및 1×Antibiotic-Antimycotic(GIBCO)을 혼합한 배지를 이용하여 5% CO2와 37℃가 유지되는 인큐베이터(Incubator)에서 배양하였다.
우선, U266B1 세포를 10㎠ 세포배양 접시에서 유지 계대 배양 후, 건강한 상태의 세포를 96 웰 플레이트에 1~5 ×105/㎖ 농도로 계대하였다. 약 50% 정도 U266B1 세포가 증식하였을 때, 실시예 1의 아로니아 추출물, 양성 대조군(100㎍/㎖의 LPS 처리), 및 음성 대조군(무처리)을 각각 처리하여 72시간 배양하였다.
IgE 발현량은 배지를 수거하여 배지에 존재하는 IgE의 양을 ELISA를 통해 분석하였다. 이때 ELISA는 2회 반복 이상의 실험을 수행하였다. 즉, 96 well ELISA plate에 50㎕의 수거한 배지을 각각 넣어 주었다. Plate를 덮고, 2시간 동안 상온에서 배양하였다. TBS-T buffer를 가지고 Plate를 3회 세척하였다. 50㎕의 Biotinylated Antibody 용액을 넣어주고, 1시간 동안 배양하였다. TBS-T buffer를 가지고 Plate를 3회 세척하였다. 100㎕의 Streptavidin-HRP 용액을 넣어주고, 30분 동안 배양하였다. TBS-T buffer를 가지고 Plate를 3회 세척하였다.
100㎕의 TMB Substrate를 넣어주고, 암실에서 30분간 배양하였다. 100㎕의 Stop 용액을 넣고, ELISA reader 기기를 이용하여 450nm와 550nm의 흡광도를 측정하였다. 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 1이 IgE의 발현량을 약 30% 감소시키는 것을 알 수 있었다.
(3) 아로니아 추출물의 면역세포의 생존도 측정
제조한 아로니아 추출물의 면역 활성을 확인하기 위하여 면역 세포(T 세포 및 B 세포)의 생존성(viability)를 확인하였다. 각각의 면역 세포는 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum)을 포함하는 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institue 1640 media)에서 충분히 배양하여, 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 2.5×105 세포/㎖ 농도로 공급하여 24시간 동안 배양하여 배양물을 수득하였다. 수득한 배양물에 실시예 1 및 비교예의 아로니아 추출물 시료를 주입하고 7일 동안 배양하여, 면역 세포의 세포수를 확인하는 방식으로 면역 세포의 생육 정도를 측정하였ㄱ고, 면역 세포의 생존성은 혈구 계산기(hematocytometer)를 이용하여 확인하였다.
도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 비교예의 아로니아 추출물에 비해 실시예 1의 아로니아 추출물로 처리한 T 세포 및 B 세포 배양물이 생존성이 개선된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 탄닌 검정
본 발명의 비교예, 실시예 1 및 2의 아로니아 추출물에 포함된, 떫은맛을 내는 물질인 탄닌 함량을 확인하기 위하여 총 탄닌 함량 검정을 실시하였다.
총 탄닌 함량 검정은 Duval B & Shetty K 법으로 측정하였다. 상기 실시예 1 및 실시예 2의 아로니아 추출물을 시료로 하여, 상기 시료 1 ㎖에 95% 에탄올 1 ㎖과 증류수 1 ㎖를 혼합한 후 1N 폴린-시오칼토 시약(Folin-Ciocalteu's reagent) 0.5 ㎖를 첨가한다. 상기 혼합액을 3분간 반응시키고 5% Na2CO₃1㎖를 첨가하여 다시 실온에서 1시간 반응시킨 후 725nm에서 흡광도를 측정하여 총 탄닌 함량을 수치화하였다. 대조군은 효소를 사용하지 않은 착즙액을 사용하였다.
도 10과 같이 총 탄닌 함량은 탄나아제 처리된 실시예 2가 탄나아제 처리되지 않은 실시예 1 또는 비교예보다 약 25% 감소하였다.
실험예 5: 관능 검사
본 발명의 비교예, 실시예 1 및 2의 아로니아 추출물을 포함하는 음료 조성물을 20명의 패널에게 임의로 시음하게 한 다음, 떫은 맛, 단맛, 신맛, 향, 전체적인 기호도에 대해 설문 조사를 실시하였다.
이하의 표 2는 관능검사에 사용된 음료 조성물의 조성예이며, 상기 음료 조성물의 조성예가 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 아로니아 추출물을 정제수로 희석한 후, 여기에 탄나아제를 1 중량% 첨가하여 40℃, 120rpm으로 2시간 진탕 반응시킨다. 상기 단계에서 얻은 효소 반응액을 80℃ 이상에서 5~10분간 효소의 실활과 살균시킨 후 4℃에서 숙성시켜 본 발명의 아로니아 추출액을 제조하였다.
성분 함량(중량%)
비교예, 실시예 1 및 2 각각의 아로니아 추출물 0.1~10
액상과당 10
구연산 0.1
구연산나트륨 0.2
사과산 0.05
비타민 C 0.1
자일리톨 2
설탕 3
블루베리 착즙액 0.1~5
스트로베리 착즙액 0.1~5
정제수 잔량
합계 100
또한, 표 3은 패널들에 의한 설문 조사 결과를 나타낸 것이다.
실시예1 실시예2 비교예
떫은맛 4.7 2.0 4.5
단맛 3.0 3.9 3.2
신맛 2.8 3.1 2.9
향 4.5 4.6 4.2
전체적인 기호도 1.8 4.2 1.9
떫은맛, 단맛, 신맛 - 5: 매우 강하다, 4: 강하다, 3: 보통이다, 2: 약하다, 1: 매우 약하다; 향, 전체적인 기호도 - 5: 매우 좋다, 4: 좋다, 3: 보통이다, 2: 약하다, 1: 매우 약하다.
상기 표 4와 같이, 탄나아제를 처리한 실시예 2는 탄나아제를 처리하지 않은 실시예 1 또는 비교예에 비하여 떫은맛이 50% 이상 감소한 반면, 단맛은 약 25% 증가하였다. 또한 전체적인 기호도에서도 실시예 2는 실시예 1 또는 비교예에 비해 우수한 기호도를 나타내었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. (a) 아로니아 분말을 정제수와 혼합한 후 펙티나아제(pectinase)를 처리하여 효소 반응물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 효소 반응물과 용매의 혼합물을 고속 분쇄방법으로 분쇄하여 제1 분쇄 혼합물을 제조하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 얻은 제1 분쇄 혼합물을 초고압 분쇄혼합 공정으로 분쇄하여 제2 분쇄 혼합물을 제조하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)에서 얻은 제2 분쇄 혼합물을 가열하여 아로니아 추출물을 제조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 아로니아 추출물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아로니아는 블랙초크베리(black chokeberry), 레드초크베리(red chokeberry), 아로니아 멜라노카파 아론(Aronia melanocarpa Aron), 아로니아 멜라노카파 네로(Aronia melanocarpa Nero), 아로니아 멜라노카파 바이킹(Aronia melanocarpa Viking) 및 아로니아 멜라노카파 메킨지(Aronia melanocarpa Mckenzie)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 아로니아 추출물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    단계 (a)는 아로니아 분말에 1~20 중량%의 펙티다아제를 40℃에서 30분 내지 2시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 아로니아 추출물의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    단계 (b)의 용매는 40~70 중량%의 메탄올인 것을 특징으로 하는 아로니아 추출물의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    단계 (b)의 고속 분쇄방법은 10,000 내지 30,000 rpm의 속도로 5~30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 아로니아 추출물의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    단계 (c)의 초고압 분쇄혼합 공정은 10,000 내지 40,000psi의 압력에서 수행되는 것을 특징으로 하는 아로니아 추출물의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    단계 (d)에서는, 상기 제2 분쇄 혼합물을 40~100 ℃의 온도로 3~24시간 동안 가열하여 수행되는 것을 특징으로 하는 아로니아 추출물의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 아로니아 추출물은 시아닌(cyanin), 시아니딘(cyanidin), 델피닌 (delphinin), 델피니딘(delphinidin), 말빈(malvin), 말비딘(malvidin), 펠라르고닌(pelargonin), 펠라르고니딘(pelargonidin), 페오닌(peonin), 페오니딘 (peonidin), 페튜닌(petunin) 및 페튜니딘(petunidin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 아로니아 추출물의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    단계 (c)와 단계 (d)의 사이에 상기 제2 분쇄 혼합물에 1~20 중량%의 탄나아제(tannase)를 40℃에서 30분 내지 2시간 동안 처리하여 2차 효소 반응물을 얻는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 아로니아 추출물의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 아로니아 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 건강 기능성 식품 조성물.
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CN115925768A (zh) * 2022-11-23 2023-04-07 湖南艾嘉生物科技有限公司 从黑果腺肋花楸中提取高纯度矢车菊素半乳糖苷的方法

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