KR20160042349A - 개똥쑥 어린잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 면역증강용 조성물 - Google Patents
개똥쑥 어린잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 면역증강용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 개똥쑥 어린잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 라디칼 소거 활성, 및 NO와 TNF-α를 증가시키므로 항산화 및 면역증강용 의약품 또는 건강기능식품으로 효과적으로 사용이 가능하다.
Description
본 발명은 개똥쑥(Artemisia Annua L.) 어린잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 면역증강용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 개똥쑥 어린잎 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 면역증강용 약학 조성물, 및 건강기능식품에 관한 것이다.
활성산소(ROS, reactive oxygen species)는 인간의 몸에서는 호기성 대사과정으로부터 생성되며, 이 중 약 5% 정도가 자유라디칼(유리기의 전자를 가지는 원자나 분자의 총칭)의 형태로 변형된다. 이런 라디칼은 대식세포(Macrophage), 호중구(neutrophil) 등과 같은 면역세포에서 생성되어서 외부로부터 침입한 병원균을 죽이는 역할을 수행하기도 하지만, 상태가 매우 불안정하고 반응성이 강하여 세포 내 구성성분인 단백질, 지질분자 뿐만아니라, 유전정보를 함유한 DNA에까지 산화적 손상을 입히기도 한다. 그 결과, 체내에 생성된 활성산소는 암을 비롯한 염증, 빈혈, 심근경색, 뇌성마비, 동맥경화증, 당뇨, 류머티즘성 관절염, 파킨슨씨 병, 피부손상, 및 자가면역질환 등의 각종 질병을 유발하는 것은 물론이고 노화의 중요한 원인으로 작용하는 것으로 알려져 있다(Halliwell et al., 1999; Diolock et al., 1998; Wickens, et al, 2001). 체내에는 이러한 활성산소에 대한 방어기구로 퍼옥시다아제(peroxidase), 카탈라아제(catalase) 등의 항산화 효소와 함께 비타민 E, 비타민 C 등의 항산화물질이 존재하여 스스로를 보호하지만, 방어기구에 이상이 초래되거나 각종 물리적, 화학적 요인들에 의하여 활성산소의 생성이 생체방어계의 용량을 초과 하게 될 경우에는 산화적 스트레스로 인한 손상을 피할 수없게된다.
최근 이러한 산화적 스트레스(oxidative stress)로부터 신체를 보호하기 위한 각종 항산화 물질들에 관한 연구가 활발히 진행 및 보고되고 있는데(Diolock et al., 1998; Mandade et al., 2011), 그 중에서도 합성 항산화제로는 BHA(Butylated hydroxy anisole), BHT(Butylated hydroxy toluene) 및 NDGA(Nordihydroguaiaretic acid) 등이 있다. 그러나 이러한 합성 항산화제들은 생체 내에서 독성을 나타내어 알러지와 종양을 발생시킬 수 있으며, 고온에 약하여 열을 가하면 쉽게 파괴되는 단점이 있다.
따라서 의약 및 건강기능 식품 등에 폭넓게 이용 가능한 안전하고 생체 내에서 안정적인 새로운 천연 항산화제에 필요와 선호도가 점차적으로 증가하고 있는 실정이다(Liu et al., 2012; Guo et al., 2012; Li et al., 2012; Ramaratham et al., 1995; Saito et al., 2003).
한편, 면역기능조절이란 환경오염물질, 의약품의 부작용, 질병 및 노화로 인하여 유발되거나 생체의 정상적인 면역기능의 변화를 조정하여 정상으로 회복시키거나 이러한 변화를 경감시키는 작용을 말한다. 면역기능조절은 바람직하지 않게 증가한 면역반응을 억제시키는 조절작용인 면역억제 작용과 감소된 면역반응을 증가시키는 조절작용인 면역증강작용으로 분류된다.
면역증강(Immunostimulation)은 암 및 염증 질환 등과 같은 다양한 질환에 대한 신체 방어 기전을 보강하는 중요한 치료학적 전략중 하나로서, 면역세포의 활성을 증가시켜 면역반응을 자극하여 면역증강 효과를 얻을 수 있다. 예컨데, 대식세포들은 면역반응에서 주요한 역할을 수행하는데 대식세포에서의 주요한 역할인 식세포 작용은 미생물 및 기타 발열성 입자들을 흡수하고, 또한 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor;TNF-α), 인터루킨-1β(interleukin; IL-1β), 인터루킨-12(interleukin; IL-12)와 같은 다수의 시토킨(cytokin) 및 일산화 질소 (nitric oxide; NO)과 같은 세포독성 및 염증성 물질을 분비함으로써 면역 반응을 자극시킨다 (Wolf et al., 1994; Lee and Hong, 2011; Murray and Wynn, 2011). 따라서 대식세포 활성을 증가시키는 것이 면역증강을 위한 하나의 수단이 될 수 있다.
천연물은 아시아 국가들에서 다양한 질환의 치료에 사용되어 왔는데, 특히 면역증강, 건강 유지 및 장수를 위한 강장제로 사용되어 왔으며, 다양한 구조의 구성성분들, 특히, 폴리사카라드(polysaccharides), β-글루칸(glucans), 사포닌(saponins) 및 쿠르쿠미노이드(curcuminoids) 등의 성분들은 임상 및 약물 적용에 있어 폭넓게 면역증강제로서 제시되어 왔다(Ragupathi et al., 2008; Won et al., 2011; Sun et al., 2005).
쑥은 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 초본으로 전국의 산야에 널리 자생하고 있으며, 녹엽 단백질과 필수지방산의 함량이 높아 영양적으로 우수한 식품으로 알려져 있다. 쑥의 기능성에 관한 다양한 연구가 수행되어져 있으며, 여러 가지 식품에 응용하고자 하는 시도가 활발하게 이루어지고 있다.
개똥쑥(Artemisia Annua L.)은 국화과에 속하는 일년생 초본으로 한방에서는 해열제, 지혈제, 피부병 치료제 및 살충제 등으로 사용하고 있으며, 그 외 항균, 항바이러스 작용 등이 알려져 있다.
또한 최근에는 유방암 세포를 선택적으로 괴사시키는 항암활성이 입증됨으로써 세계적으로 주목받고 있는 생약제로 평가되고 있으며, 주요 성분을 대량 생산하기 위한 조직배양 및 유전자 형질전환에 대한 연구도 이루어져 있으나 국내에서 개똥쑥의 생리활성에 관한 연구는 부족한 실정이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 항산화 및 면역증강 활성을 가지는 천연물질에 주목하게 되었다. 이에 따라, 개똥쑥 어린잎을 열풍건조 후, 이를 0.5mm내지 2mm입자크기로 분쇄를 한 다음 80 내지 100℃의 온도에서 추출한 개똥쑥 어린잎 추출물이 항산화 및 면역증강 활성이 있음을 규명하고, 이를 활용한 항산화 또는 면역증강용 조성물을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 하나의 목적은 개똥쑥 어린잎 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 면역증강용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 개똥쑥 어린잎 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 면역증강용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 개똥쑥(Artemisia Annua L.) 어린잎 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 면역증강용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 개똥쑥(Artemisia Annua L.)은 국화과에 속하는 일년생 초본을 말하며, 바람직하게는 본 발명의 개똥쑥 어린잎은 발아 후 5개월 이전의 개똥쑥 어린잎일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
개똥쑥은 열대아시아를 원산지로 하여 전 세계적으로 분포되어 있으며, 우리나라에서는 전국 각지의 길가나 들판에 무리지어 야생하고 있다. 한방에서는 개똥쑥의 지상부를 청호(菁蒿)라는 이름으로 해열제, 지혈제, 피부병 치료제 및 살충제 등으로 사용하고 있으며, 그 외 항균, 항바이러스 작용 등이 알려져 있다. 중국에서는 예부터 말라리아 치료를 위한 약초로 사용되어 왔는데 테르페노이드(terpenoid)계 세스퀴테르펜 락톤(sesquiterpene lactone)의 일종인 아르테미시닌(artemisinin)은 강력한 항말라리아 효능을 지니므로 현재 의약품으로도 이용되고 있으며, 이 물질은 성숙한 식물체의 화기와 잎의 선모 등에서도 발견되고 초식성 곤충과 포유동물에게 강한 기피 작용을 일으킬 뿐만 아니라 말라리아와 같은 병원성 원충에게는 치명적인 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
또한 최근에는 유방암 세포를 선택적으로 괴사시키는 항암활성이 입증됨으로써 세계적으로 주목받고 있는 생약제로 평가되고 있다. 개똥쑥의 주요 성분으로는 아르테아누인(arteannuin), 스코폴레틴(scopoletin), 쿠마린(coumarin) 및 유파틴(eupatin) 등이 있으며 이러한 성분들이 항암 및 항균 작용과 관계가 깊어 이들의 화학적 구조를 밝혀내는 연구가 수행되었으며, 주요 성분을 대량 생산하기 위한 조직배양 및 유전자 형질전환에 대한 연구도 이루어져 있다. 개똥쑥으로부터 클로로겐산(chlorogenic acid), 쿠마린산(coumaric acid), 쿠마린(coumarin), 6,7-디메톡시-쿠마린(6,7-dimethoxy-coumarin), 루테올린-7-글루코시드(luteolin-7-glucoside), 루틴(rutin), 쿼세틴(quercetin), 루테올린(luteolin) 및 카엠프페롤(kaempferol) 등의 페놀 화합물이 주요 활성 화합물로 분리동정된바 있다.
그러나, 개똥쑥 열수추출물의 항산화 또는 면역증강 활성에 대해서는 아직까지 알려진 바 없었다. 그에 따라 본 발명자들은 개똥쑥 열수추출물이 항산화 또는 면역증강 활성이 있으며, 이러한 활성이 개똥쑥 어린잎에서 훨씬 우수한 효능을 보이는 것을 확인하였는바, 본 발명에서는 상기 개똥쑥 어린잎 열수추출물이 항산화 및 면역증강 활성이 있음을 밝힌 것이다.
본 발명에서 용어 "추출물"은 상기 개똥쑥 어린잎의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명에서 용어 열수추출물은 뜨거운 물에 의해 용출될 수 있는 모든 제형의 추출물을 의미하며, 바람직하게는 80 내지 100℃에서 열수추출한 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 개똥쑥 어린잎 열수추출물을 얻기 위한 방법으로 바람직하게는 하기 방법에 의해 추출된 것일 수 있다.
1) 개똥쑥 어린잎을 열풍 건조하는 단계;
2) 상기 각 건조물을 분쇄하는 단계;
3) 상기 혼합물을 80 ~ 100℃의 온도에서 5시간 열수 추출 하는 단계.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 열수추출 방법은 상기 단계 3 이후에 추출물을 농축하는 단계(단계 4)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "열풍 건조"는 열풍건조기를 이용하여 건조하는 방식을 의미한다. 일반적으로 온도의 범위는 50 내지 60℃의 온도 범위를 의미한다. 본 발명에서 상기 열풍 건조는 수일 동안, 바람직하기로 1 내지 3일 동안 수행할 수 있다. 상기 열풍 건조 시간은 개똥쑥 어린잎의 수분 함량에 따라 적절히 조절될 수 있다.
상기 단계 2는, 상기 각 건조물을 분쇄하는 단계로서, 항산화, 또는 면역증강 성분의 추출 효율 증가를 위한 전처리로써 개똥쑥 어린잎 건조물을 일정 크기로 분쇄시키는 단계이다. 상기 분쇄는 분쇄기를 사용하여 0.5 내지 2 mm의 크기의 입자로 분쇄하는 것이 바람직하다.
상기 단계 3은, 상기 분쇄물을 80 ~ 100 ℃의 온도에서 증류수를 이용하여 5시간 동안에서 추출하여 추출물을 얻는 단계이다.
본 발명의 일 실시예에서는 개똥쑥 어린잎(발아 후 5개월 이전)을 건조 분쇄물로 분말화 한 후, 분말화 된 개똥쑥 어린잎을 80 내지 100 ℃ 온도에서 5시간 교반하면서 열수추출하였다(실시예 1).
본 발명에서 용어 "항산화"란, 좁은 범위로는 체내에서 생성되는 자유라디칼, 상기 자유라디칼로부터 생성되는 과산화수소 또는 과산화물, 상기 과산화수소로부터 생성되는 하이드록시 라디칼의 생성 또는 반응을 억제, 감소 또는 제어하는 작용을 의미하고, 넓은 범위로는 자연계에서 발생하는 산화반응의 생성을 억제, 감소 또는 제어하는 작용을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항산화는 좁은 범위의 항산화로서 이해되고, 주로 세포수준에서 발생되는 자유라디칼 또는 과산화수소의 생성 또는 반응을 억제, 감소 또는 제어하는 작용으로서 이해될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 개똥쑥 어린잎 열수추출물이 DPPH 라디칼 소거능이 있음을 확인함으로써(실험예 1), 본 발명의 개똥쑥 어린잎 열수추출물이 항산화 용도에 적합하다는 것을 밝혔다.
본 발명의 용어 "면역증강"은, 생체 내 암, 염증 등 다양한 질환에 대한 신체 방어기전을 보강하는 모든 현상을 의미하는 것으로, 바람직하게는 대식세포와 같은 면역세포의 활성을 증진시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 개똥쑥 어린잎 열수추출물이 대식세포에서 아질산염 활성을 증가시키고, TNF-α 생성능을 증가시킴으로써(실험예 2 및 3), 본 발명의 개똥쑥 어린잎 열수추출물이 면역증강 용도에 적합하다는 것을 밝혔다.
본 발명에서 용어 약학 조성물은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 개똥쑥 어린잎 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 면역증강용 건강기능식품을 제공한다.
상기 개똥쑥 어린잎 열수추출물, 및 이의 항산화 또는 면역증강 활성에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 목적상, 개똥쑥 어린잎 열수추출물은 항산화 또는 면역증강용으로 사용될 수 있기 때문에, 식품 첨가제로 포함되어 건강기능식품에 첨가될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품첨가물공전에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.
상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 개똥쑥 어린잎 열수추출물이 세포 독성이 없다는 것을 확인함으로써(실험예 4), 본 발명의 개똥쑥 어린잎 열수추출물이 약학 조성물 및 건강기능식품으로의 사용에 적합하다는 것을 밝혔다.
본 발명의 개똥쑥 어린잎 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 라디칼 소거 활성, 및 NO와 TNF-α를 증가시키므로 항산화 및 면역증강용 조성물로 사용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 3에서 얻어진 추출물의 농도(500, 1,000, 5,000, 10,000ppm)에 따른 DPPH 라디칼 소거능에 대한 모니터링 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 3에서 얻어진 추출물의 농도(10, 30, 100㎍/㎖)에 따른 시험관 내 아질산염 분석(in vitro Nitrite assay) 측정을 통하여 개똥쑥 어린잎 추출물의 면역세포에 대한 활성을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 내지 3에서 얻어진 추출물의 농도(10, 50, 100㎍/㎖)에 따른 TNF-α 생성능 측정을 통하여 개똥쑥 어린잎 추출물의 면역세포에 대한 활성을 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 내지 3에서 얻어진 추출물에 대한 농도별(10, 30, 100㎍/㎖) 안전성 세포독성 평가 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 지표성분인 클로로겐산(chlorogenic acid)을 농도별(31.25ppm, 62.5ppm, 250ppm)로 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1의 추출물(80℃ 열수 추출물 및 100℃ 열수 추출물)에 대한 지표성분(chlorogenic acid)을 HPLC로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 3에서 얻어진 추출물의 농도(10, 30, 100㎍/㎖)에 따른 시험관 내 아질산염 분석(in vitro Nitrite assay) 측정을 통하여 개똥쑥 어린잎 추출물의 면역세포에 대한 활성을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 내지 3에서 얻어진 추출물의 농도(10, 50, 100㎍/㎖)에 따른 TNF-α 생성능 측정을 통하여 개똥쑥 어린잎 추출물의 면역세포에 대한 활성을 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 내지 3에서 얻어진 추출물에 대한 농도별(10, 30, 100㎍/㎖) 안전성 세포독성 평가 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 지표성분인 클로로겐산(chlorogenic acid)을 농도별(31.25ppm, 62.5ppm, 250ppm)로 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1의 추출물(80℃ 열수 추출물 및 100℃ 열수 추출물)에 대한 지표성분(chlorogenic acid)을 HPLC로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
먼저, 개똥쑥 어린잎으로부터 항산화 및 면역활성이 높은 성분을 효율적으로 얻고, 상기 활성의 효과를 확인하기 위하여, 개똥쑥 어린잎으로부터 열수 추출물, 주정 추출물, 초임계유체 추출물을 제조하였다.
실시예
1: 개똥쑥 어린잎
건조
분쇄물의
열수
추출
전처리로, 개똥쑥 어린잎을 60℃에서 1일 동안 열풍 건조한 후 분쇄기를 이용하여 0.5mm의 입자 크기로 분쇄함으로써 추출 원료를 준비하였다. 첫 번째 단계로, 상기 전처리된 원료 각각을 50 g의 양으로 주입하고 80 내지 100℃ 온도에서, 5시간 동안 교반하면서 추출을 실시하였다. 상기 회수된 샘플들을 농축기를 이용하여 농축하였다. 이들 각각에 대하여 수율은 하기 표 1에 나타내었다.
| 원료 | Extract Condition |
Weight (g) | Extract yield (%) |
|
| Original | Extract | |||
| 개똥쑥 어린잎 |
열수 추출 (80℃, 5h) | 50 | 12.53 | 25 |
| 열수추출(100℃, 5h) | 50 | 15.21 | 30.4 | |
실시예
2: 개똥쑥 어린잎
건조
분쇄물의
주정 추출
전처리로, 개똥쑥 어린잎을 60℃에서 1일 동안 열풍 건조한 후 분쇄기를 이용하여 0.5mm의 입자 크기로 분쇄함으로써 추출 원료를 준비하였다.
첫 번째 단계로, 상기 전처리된 원료 각각을 50 g의 양으로 주입하고 60℃ 온도에서, 30% 내지 50% 에탄올을 용매로 이용하여 5시간 동안 교반하면서 추출을 실시하였다. 상기 회수된 샘플들을 농축기를 이용하여 농축하였다. 이들 각각에 대하여 수율은 하기 표 2에 나타내었다.
| 원료 | Extract Condition |
Weight (g) | Extract yield (%) |
|
| Original | Extract | |||
| 개똥쑥 어린잎 |
50%주정 추출 (60℃, 5h) | 50 | 12.30 | 24.6 |
| 30%주정 추출 (60℃, 5h) | 50 | 11.25 | 22.5 | |
실시예
3: 개똥쑥 어린잎
건조
분쇄물의
초임계유체추출
전처리로, 개똥쑥 어린잎을 60℃에서 1일 동안 열풍 건조한 후 분쇄기를 이용하여 0.5mm의 입자 크기로 분쇄함으로써 추출 원료를 준비하였다.
첫 번째 단계로, 상기 전처리된 원료 각각을 150 g의 양으로 주입하고 초임계 추출 장치(ISA-SCFE-0050-0100-080-re, 일신오토클레이브, 한국)를 이용하여 50℃에서, 압력을 200bar 내지 400bar로 초임계 추출을 실시하였다. 초임계 이산화탄소의 유량은 60㎖/min으로 30분 동안 추출하였으며(SFE 추출법), 여기서 추출된 추출물을 회수하여 샘플로서 수득하였다.
상기의 단계에 대하여, 초임계 추출이 완료되면 초임계 추출 장치의 추출조 압력을 낮춰 초임계유체 상태를 해제하여 추출물을 샘플로서 회수하였다. 상기 회수된 각각의 단계에 대한 샘플들을 농축기를 이용하여 농축하였다. 이들 각각에 대하여 수율은 하기 표 3에 나타내었다.
| 원료 | Extract Condition |
Weight (g) | Extract yield (%) |
|
| Original | Extract | |||
| 개똥쑥 어린잎 |
초임계 추출(200bar 50℃) | 150 | 4.53 | 3.01 |
| 초임계 추출(400bar 50℃) | 150 | 5.91 | 3.94 | |
실험예
1: 추출 조건에 따른 개똥쑥 어린잎 추출물의
DPPH
라디칼
소거활성
DPPH 라디칼은 매우 안정한 자유 라디칼로 약 520 nm에서 진한 보라색을 띄는 화합물이다. 항산화제에 의해 탈색되므로 항산화 활성을 쉽게 측정할 수 있다(Zhang et al. 2012).
본 발명의 실시예 1 내지 3에서 얻어진 개똥쑥 어린잎 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위하여, 하기의 과정을 따라 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다.
구체적으로는 50% 에탄올 0.4㎖에 0.1mM의 DPPH 용액 0.5㎖, 그리고 일정농도로 희석된 추출물 0.1㎖를 첨가하였다. 10초간 강하게 볼텍싱(vortexing) 후 냉암소에서 30분간 반응시킨 후, ELISA를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였으며, 항산화능의 정도는 50% 에탄올을 사용한 대조군의 흡광도를 기준으로 백분율로 표시하였다.
결과적인 프리 라디칼 소거능을 하기의 수학식 1에 의하여 계산하였다.
[수학식 1]
프리 라디칼 소거활성(%)= {1-(B/A)}/100
A: 아무것도 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도
B: 추출물 샘플을 처리한 실험군 웰의 흡광도(양성 대조군 비타민 C, 실시예 1 내지 3 각각)
그 결과를 하기 표 4, 표 5 및 도 1에 나타내었다.
| 비타민 C STD 농도 |
radical소거율(%) |
| 5,000ppm | 93.42 |
| 1,000ppm | 92.89 |
| 500ppm | 92.51 |
| 100ppm | 35.02 |
| 농도 | 열수_80℃ radical소거율(%) |
열수_100℃ radical소거율(%) |
30% 주정 radical소거율(%) |
50%주정 radical소거율(%) | SFE 200 radical소거율(%) |
SFE 400 radical소거율(%) |
| 10,000ppm | 97.07 | 91.29 | 82.21 | 78.13 | 54.49 | 27.50 |
| 5,000ppm | 76.87 | 65.22 | 73.17 | 73.00 | 35.50 | 11.69 |
| 1000ppm | 16.86 | 13.60 | 27.11 | 23.77 | 11.60 | 5.56 |
| 500ppm | 6.82 | 8.21 | 16.69 | 23.77 | 16.73 | 8.69 |
상기 결과를 통하여 실시예 1 내지 3의 추출물 모두에서 농도가 높아질수록 DPPH 라디칼 소거능이 높게 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히 열수추출물의 경우, 가장 높은 농도(10,000ppm)에서 90% 이상의 활성을 나타냄을 확인하였다. 따라서 본 발명의 개똥쑥 어린잎 추출물이 항산화 활성을 가짐을 알 수 있었다.
실험예
2: 개똥쑥 어린잎
추출물의 아질산염 분석(
Nitrite
assay
)
상기 실시예 1 내지 3에서 추출한 개똥쑥 어린잎 추출물의 면역증강 활성 여부를 확인하기 위하여 아질산염 분석(Nitrite assay)을 수행하였다. 실험에 사용된 세포는 대식세포인 Raw 264.7 세포이며, Raw 264.7 세포주(마우스 루케믹(leukaemic) 단핵구 대식세포): 10% 소태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin, 100U/㎖)과 스트렙토마이신(streptomycin, 100㎍/㎖)이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 대식세포를 96-웰 접시에 1×105 세포/웰의 농도로 분주되도록 1×106 세포/㎖의 세포를 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 배지를 버리고 배양세포 표면을 인산완충식염수(phosphate buffered saline,PBS) 용액으로 씻어주었다. 지질다당체(lipopolysaccharide, LPS, 1㎍/㎖), 배지에 녹인 시료(10, 30, 100㎍/㎖)를 각 웰에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 뒤 상층액과 같은 양의 그리스 시약(Griss reagent, 5% 인산용액에 0.1% N-1 나프틸에틸렌다이아민(N-1 naphthylethylenediamine)과 1% 설파닐아미드(sulfanilamide)가 1:1 비율로 존재)을 처리해 실온에서 10분 방치 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader, TECAN, CA, USA)를 이용하여 545 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 면역활성지표인 아질산염 분석 결과는 주정 추출물 및 초임계 추출물에서는 활성이 없으나, 열수 추출물에서 농도 의존적으로 증가 하는 것을 확인하였다(도 2). 따라서 본 발명의 개똥쑥 어린잎 열수 추출물이 면역증강 활성을 가짐을 알 수 있었다.
실험예
3: 개똥쑥 어린잎
추출물의
TNF
-α(
Tumor
Necrosis
Factor
-α)
생성
능 측정
상기 실시예 1 내지 3에서 추출한 개똥쑥 어린잎 추출물의 면역증강 활성 여부를 확인하기 위하여 TNF-α 생성능을 측정하였다.
TNF-α는 쥐에서 종양의 괴사를 일으키는 능력을 가진 물질로서 발견되었으나 이후의 많은 연구들에서 류마티스 질환에 강력한 친염증성 작용을 가지며 면역조절작용을 매개하는 물질로 역할이 강조되었다. TNF-α의 주요작용은 윤활막세포에서 콜라게나제(collagenase)와 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생산을 촉진하며, 골흡수를 촉진하고, 골형성 및 프로테오클리칸(proteoglycan)의 합성을 저해하는 것으로 알려져 있다.
실험에 사용된 세포는 Raw 264.7 세포이며, Raw 264.7 세포주 (마우스 루케믹 단핵구 대식세포): 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 페니실린(100U/㎖)과 스트렙토마이신(100㎍/㎖)이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 대식세포를 96-웰 접시에 1×105 세포/웰의 농도로 분주되도록 1×106 세포/㎖의 세포를 100㎕ 씩 넣고 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간동안 배양한 후, 배지를 버리고 배양세포 표면을 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS) 용액으로 씻어주었다. 지질다당체(lipopolysaccharide, LPS, 1㎍/㎖), 배지에 녹인 시료(10, 30, 100㎍/㎖)를 각 웰에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액에 분비된 TNF-α를 측정하기 위해서 마우스 TNF-α 효소면역분석 키트(ELISA Kit, invitrogen)를 이용하여 정량하였다. 정량한계는 4ng/㎖이었으며 표준 TNF-α에 대한 표준곡선의 R2값은 0.99 이상이었다.
그 결과, 열수추출물뿐만 아니라 주정추출물의 경우 TNF-α는 처리된 추출물의 농도 의존적으로 증가했으나 초임계추출물에 대한 유의적 증가는 나타나지 않았다(도 3). 따라서 개똥쑥 어린잎 열수추출물 및 주정 추출물이 면역증강 활성을 가짐을 알 수 있었다.
실험예
4: 개똥쑥 어린잎
추출물의 농도별 세포독성평가 측정 실험
상기 실시예 1 내지 3의 추출물의 약학 조성물 또는 건강기능식품으로 이용 가능성을 확인하기 위하여 농도별 세포독성평가 측정 실험을 수행하였다.
구체적으로 개똥쑥 어린잎 추출물의 세포 생존율 감소에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT(Microculture Tetrazolium) 분석을 실시했다. 96-웰 접시에 1×106 세포/㎖의 세포를 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간동안 배양한 후, 배지를 버리고 배양세포 표면을 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS) 용액으로 씻어주었다. 지질다당체(lipopolysaccharide, LPS, 1㎍/㎖), 배지에 녹인 시료(10, 30, 100㎍/㎖)를 각 웰에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 뒤 배양액을 제거하고 배지에 녹인 1mg/㎖ MTT (시그마, MO, 미국)를 100㎕씩 각 웰에 처리한 후, 알루미늄호일로 차광시키고 2시간 동안 같은 조건에서 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후 다이메틸설폭사이드(DMSO)를 100㎕ 처리하고 37℃에서 20분 방치한 다음, 마이크로플레이트 리더(microplate reader, 테칸, CA, 미국)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 열수추출물과 주정추출물에서는 세포 독성이 없었으나, 초임계 추출물의 경우 100㎍/㎖에서 세포독성이 나타남을 확인하였다(도 4). 따라서 열수추출물과 주정추출물은 약학 조성물 또는 건강기능식품에 이용될 수 있음을 알 수 있었다.
실험예
5: 개똥쑥 어린잎 추출물의 지표성분
HPLC
분석결과
실시예 1 내지 3의 개똥쑥 어린잎 추출물에서 지표성분으로 선정한 클로로겐산이 효과적으로 추출되었는지를 확인하기 위하여 HPLC 분석을 수행하였다.
먼저, 개똥쑥 어린잎 추출물의 지표성분으로 개똥쑥 어린잎의 주요 활성 화합물로 알려진 클로로겐산(Chlorogenic acid)을 선정하였다. 상기 실시예 1 내지 3의 추출물을 10,000ppm 으로 제조 한 후, 0.45㎛ 막 여과기(membrane filter)로 여과한 다음 HPLC(워터스, 미국)로 분석하였다. 분석조건으로 컬럼(columm)은 코스모실(COSMOSIL) C-18 PAQ (4.6mm*250mm)를 사용하였고, 이동상은 0.1% 포름산(formic acid)과 ACN(J.T. Baker, HPLC 등급)을 사용하였으며 40분 동안 분석하였다. 유속은 1 ㎖/분, 주입량은 10㎕, 컬럼의 온도는 30℃, 검출기는 UV 검출기를 이용하여 함량을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 6, 도 5, 및 도 6에 나타내었다.
지표로 선정한 클로로겐산의 함량을 측정한 결과, 전체 개똥쑥 어린잎 추출물에서 클로로겐산이 측정되었고, 항산화 및 면역증강 효과를 보이는 어린잎 80℃ 열수, 어린잎 100℃ 열수에서 각각 37.36ppm, 31.25ppm의 함량이 측정되었으며, 이를 표 6 및 도 6에 나타내었다.
| Tube | Sample Name | Area | Cone.(ppm) |
| 1 | 어린잎 80℃ 열수 | 55,570 | 37.36 |
| 2 | 어린잎 100℃ 열수 | 46,500 | 31.25 |
| 3 | 어린잎 50% 주정 | 151,892 | 102.28 |
| 4 | 어린잎 30% 주정 | 116,681 | 78.55 |
| 5 | 어린잎 초임계 200bar | 2,458 | 1.57 |
| 6 | 어린잎 초임계 400bar | 712 | 0.39 |
Claims (7)
- 개똥쑥 어린잎 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 면역증강용 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 개똥쑥 어린잎은 발아 후 5개월 이전의 개똥쑥 어린잎인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 열수추출은 80 내지 100℃에서 열수 추출한 것인, 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 개똥쑥 어린잎 열수추출물은 라디칼 소거능을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 개똥쑥 어린잎 열수추출물은 NO 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 개똥쑥 어린잎 열수추출물은 TNF-α 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
- 개똥쑥 어린잎 열수추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 면역증강용 건강기능식품.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140136142A KR20160042349A (ko) | 2014-10-08 | 2014-10-08 | 개똥쑥 어린잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 면역증강용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140136142A KR20160042349A (ko) | 2014-10-08 | 2014-10-08 | 개똥쑥 어린잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 면역증강용 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20160042349A true KR20160042349A (ko) | 2016-04-19 |
Family
ID=55917074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140136142A KR20160042349A (ko) | 2014-10-08 | 2014-10-08 | 개똥쑥 어린잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 면역증강용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20160042349A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115381867A (zh) * | 2021-05-09 | 2022-11-25 | 澳门大学 | 黄花蒿提取物在制备干细胞凋亡抑制剂中的应用 |
| KR20230067131A (ko) * | 2021-11-09 | 2023-05-16 | 주식회사 씨앤비바이오 | 개똥쑥 추출물부터 분리된 신규 화합물을 함유한 화장료 조성물 |
-
2014
- 2014-10-08 KR KR1020140136142A patent/KR20160042349A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115381867A (zh) * | 2021-05-09 | 2022-11-25 | 澳门大学 | 黄花蒿提取物在制备干细胞凋亡抑制剂中的应用 |
| KR20230067131A (ko) * | 2021-11-09 | 2023-05-16 | 주식회사 씨앤비바이오 | 개똥쑥 추출물부터 분리된 신규 화합물을 함유한 화장료 조성물 |
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