KR101719126B1 - 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아로니아의 열수, 에탄올, 메탄올, 초음파, 초고압, 고압펄스, 고압균질 및 냉동·해동 추출 공정을 이용하여 수득한 추출물이 우수한 항산화 효과 및 항노화 효과가 있어 노화 및 노화와 관련된 질환의 치료를 위한 소재로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Composition comprising extract of aronia as an active ingredient for preventing and treating aging related disease}

본 발명은 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 외부의 오염물질, 세균, 스트레스 등의 다양한 환경적 요인뿐만 아니라 태양빛이나 자외선에 노출됨으로써 반응성이 매우 큰 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)으로 유도된 광산화적 손상을 지속적으로 받게 된다고 알려져 있다. 이들 활성 산소종은 피부 광 손상에 있어서 중요한 역할을 하며, 이들은 피부 항산화제 파괴, 지질 과산화반응의 개시, 단백질 및 DNA 산화, 결합조직 성분(콜라젠, 히아루론산 등)의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합에 의한 주름생성, 멜라닌 생성 과정 등에 참여하여 피부노화를 가속시킨다고 보고되어지고 있다.

이러한 활성산소를 조절할 수 있는 항산화제로 알려진 페놀계 합성 항산화제인 butylated hydroxyanisole (BHA)와 butylated hydroxytoluene (BHT) 등은 탁월한 항산화력과 값이 싸다는 경제성 등으로 널리 이용되어 왔으나 안정성 논란으로 인하여 대부분 사용 규제를 받고 있는 실정이다.

따라서, 새로운 천연 항산화제의 개발을 통해 피부 노화를 억제하고 노화로 인한 질환을 치료할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 아로니아(Aronia melanocarpa)은 장미과에 속하는 베리류로서, 동북 아메리카 및 동유럽에서 자생하고 있다. 검붉은색을 띠는 아로니아는 근래에는 전 세계에 널리 재배되고 있으며, 원예종에서 2품종간에 교배육종으로 재배되고 있다. 아로니아는 특히, 안토시아닌이 자연계 식물들 중에서 가장 높은 군에 속한다고 알려져 있다. 아로니아는 Cyanidin-3-galactoside, Cyanidin-3-glucoside, Cyanidin-3-arabinoside, Delphinidin-3-glucoside 등 많은 종류의 안토시아닌이 함유 되어있으며, 그 밖에도 다량의 페놀이 함량 되어 있다고 알려져 있다. 이러한 아로니아는 연구를 통해 뛰어난 항산화 효과와 항염증과 면역의 증강에 효능을 보일 뿐만 아니라, 당뇨 및 각 종 심혈관계 질환과 향장 관련 효능에 대해서도 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 아직까지 아로니아가 항노화와 관련되어 보고된 자료는 없다.

이에 본 발명자들은 새로운 노화 관련 질환의 치료제로서 유효성분으로 아로니아 추출물을 사용할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였고, 나아가 항노화 활성이 우수한 아로니아 추출물을 수득할 수 있는 공정을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국공개특허 제2014-0033609호

본 발명의 목적은 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아로니아는 블랙초크베리, 레드초크베리, 아로니아 멜라노카파 아론, 아로니아 멜라노카파 네로, 아로니아 멜라노카파 바이킹 및 아로니아 멜라노카파 메킨지으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아로니아 추출물은 물, 에탄올 또는 메탄올을 이용하여 추출한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아로니아 추출물은 물, 에탄올 또는 메탄올에 황산, 염산, 아세트산, 인산 또는 붕산을 첨가하여 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물, 에탄올 또는 메탄올을 이용하여 추출한 추출물은 이후 초음파, 초고압, 고압펄스, 고압균질 또는 냉동/해동 과정을 추가로 더 수행하여 수득한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 초음파 추출물은, (a) 아로니아와 물 또는 아로니아와 70% 에탄올을 1:10 (W/W)의 중량비로 혼합한 후, 30~120 kHz의 초음파로 30분 내지 60분 동안 추출 단계; (b) 초음파 처리 후, 60℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열추출 하는 단계; 및 (c) 초음파 처리하여 추출된 아로니아 추출물을 여과, 감압농축 및 동결건조하는 단계를 통해 수득할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 초고압 추출물은, (a) 아로니아와 물을 1:10 (W/W)의 중량비로 혼합하고 200~500MPa의 압력에서 10분 내지 30분 동안 추출 하는 단계; (b) 초고압 처리 후, 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열 추출 하는 단계; 및 (c) 초고압 처리하여 추출된 아로니아 추출물을 여과, 감압농축 및 동결건조하는 단계를 통해 수득할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고압펄스 추출물은, (a) 아로니아 건조 분말을 입자크기 1~10㎛ 로 분쇄하는 단계; (b) 분쇄된 아로니아 분말을 물에 첨가하여 연속적으로 교반시키는 단계; (c) 교반하면서 펄스형 레이저(Nd-YAG)를 이용하여 파장 300~500nm의 가시광선을 펄스폭 10ns(FWHM), 펄스 반복률 10Hz, 펄스에너지 100~300mJ로 5~7분씩 3단계로 나누어 순차적으로 아로니아 분말 입자 표면에 조사하는 단계; (d) 고압 펄스 처리된 아로니아를 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열 추출 하는 단계; 및 (e)고압 펄스 처리하여 수득한 아로니아 추출물을 여과, 감압농축 및 동결건조하는 단계를 통해 수득할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고압균질 추출물은, (a) 건조 분말 형태의 아로니아를 1L 증류수에 10중량%의 양으로 첨가한 후 20,000rpm으로 15분 동안 파쇄하는 단계; (b) 고압 균질기에서 10000~30000psi 이상의 압력을 가하는 단계; (c) 고압 균질 처리된 아로니아를 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열 추출하는 단계; 및 (d)고압 균질 처리하여 수득한 아로니아 추출물을 여과, 감압농축 및 동결건조하는 단계를 통해 수득할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 냉동/해동 추출물은, (a) 아로니아를 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열 추출하는 단계; (b) 가열 추출된 아로니아를 -70℃에서 급속 냉동하는 단계; 및 (c) 냉동상태의 아로니아를 2450 MHz의 세기의 마이크로파를 이용하여 급속 해동하는 단계를 통해 수득할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 노화 관련 질환은 피부 주름, 광노화증, 흑화증, 피부 색소침착증, 피부화상, 피부 염증, 또는 피부암일 수 있다.

본 발명의 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 개선용 약학적 조성물은 항산화 효과가 증진되어 항노화 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 아로니아 추출물의 ROS 측정 결과이다.
도 2는 아로니아 추출물의 RT-PCR을 측정한 결과이다.
도 3은 아로니아 추출물의 텔로머라아제 활성 변화를 타나낸 결과이다.
도 4는 아로니아 추출물의 피부주름 개선 효과를 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명은 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 노화를 억제할 수 있는 신규 천연 치료제로서 아로니아 추출물을 연구대상으로 하여 이의 항노화 활성을 확인하였으며, 최대의 항노화 활성을 갖는 아로니아 추출물의 제조방법을 확립하였다.

특히, 본 발명의 일실시예에 따르면, 기존의 아로니아 추출 방법에 비하여 개선된 공정법으로 수득한 추출물의 경우, 안토시아닌 함량이 높고, 추출 수율도 증진될 뿐만 아니라 항노화 활성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 아로니아 추출물은 In Vitro 및 In Vivo 실험을 통해 세포내에 모두 독성을 유발시키지 않아 안정성이 있는 추출물인 것으로 나타났다.

한편, 본 발명의 아로니아 추출물은 노화 또는 노화 관련 질환을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 효과가 있다.

일반적으로 노화란 시간이 지남에 따라 일어나는 신체의 모든 생리적 변화를 통칭하는 것으로 개체에 따라 수많은 요인에 의해 매우 다양하게 일어나는 생명 현상이다.암, 심혈관계 부전증, 비만, 비-알코올성 지방 간 등 많은 질환을 가져다주는, 세포, 조직 및 기관의 퇴화와 연관이 있을 뿐만 아니라 대부분의 생리학적 성능 한도가 쇠약해지는 것과 연관이 있다. 노화는 개체마다 그 양상과 속도가 다르고, 한 개체 내에서도 각 조직마다 그 양상이 다르므로 노화를 개체 수준에서 연구하는 것은 많은 어려움이 있다. 한편, 노화 현상을 구체적으로 살펴보면 각 구성 기관 및 조직의 기능 변화가 일어나는 것으로, 이는 구성단위인 세포들의 기능 변화에 기인한다. 즉, 뇌의 신경세포 소실로 인해 인지기능이 저하된다든지, 피하 지방 세포의 소실로 피부의 탄력이 감소한다든지, 모근 멜라닌 세포가 멜라닌 색소 생성 능력을 소실함으로써 머리가 희어지는 등, 개체의 노화는 결국 그 개체를 구성하는 세포들의 노화에 기인한다.

또한, 피부 노화(skin aging)는 피부 진피층에 존재하는 세포외기질(extracellular matrix)의 구조적인 변화로 발생되는데, 그 구성요소 중 탄력섬유(elastic fiber)의 변성과 교원질(collagen)양의 감소가 피부의 주름을 야기한다. 또한, 피부의 노화를 이끄는 주요 요인 중에는 콜라겐의 감소와 관련하여 자외선이나 스트레스에 의한 활성산소의 생성을 들 수 있다. 피부에서의 활성 산소의 생성은 세포막을 공격함으로써 세포에 손상을 입혀 그 기능을 상실하게 한다. 피부세포로써의 기능 상실은 피부의 거친 상태를 형성하거나 유지시키고, 윤기를 없애는 결과를 초래함으로써 피부의 주름을 유발하게 된다. 결국, 생체 내 활성산소의 생성은 MMPs 유전자와 콜라겐 분해효소의 연쇄적인 활성화를 유도함으로써 콜라겐의 구조적인 파괴를 유발하고, 피부의 탄력을 감소시키는 피부주름의 형성을 이끌게 된다[8]. 따라서 피부노화는 콜라겐 분해효소와 활성산소의 생성억제, 콜라겐의 합성을 촉진시킴으로써 피부노화의 완화 효과를 나타낼 수 있다.

이러한 점에서 본원발명에 따른 아로니아 추출물은 우수한 항산화 활성을 가지고 있으며, 털로머라제 활성을 증진시킬 수 있어 항노화 활성이 우수하다는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 아로니아로는 이에 제한되지는 않으나, 블랙초크베리, 레드초크베리, 아로니아 멜라노카파 아론, 아로니아 멜라노카파 네로, 아로니아 멜라노카파 바이킹 및 아로니아 멜라노카파 메킨지 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 유효성분, 즉 아로니아 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 아로니아 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1ug/ml 내지 600ug/ml의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 아로니아 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 아로니아 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 아로니아 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 노화 또는 노화 관련 질환을 예방 및 치료를 위한 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 관절염 및 골다공증의 예방 및 치료를 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 아로니아 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 아로니아 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 갯방풍 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 아로니아 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 아로니아 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

나아가 본 발명자들은 추출물의 제조공정을 달리하여 아로니아 추출물을 수득하였고, 각 제조방법으로 수득한 추출물의 항노화 활성을 분석한 결과, 물, 에탄올 또는 메탄올만을 이용하여 수득한 용매 추출물에 비해 산처리를 하거나 또는 초음파, 초고압, 고압펄스, 고압균질 또는 냉동/해동 과정을 추가로 처리한 경우 그 효과가 현저하게 우수한 것을 알 수 있었다.

보다 바람직하게 초음파를 이용하여 아로니아 추출물을 수득하는 공정은, (a) 아로니아와 물 또는 아로니아와 70% 에탄올을 1:10 (W/W)의 중량비로 혼합한 후, 30~120 kHz의 초음파로 30분 내지 60분 동안 추출 단계; (b) 초음파 처리 후, 60℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열추출 하는 단계; 및 (c) 초음파 처리하여 추출된 아로니아 추출물을 여과, 감압농축 및 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 초고압을 이용하여 아로니아 추출물을 수득하는 공정은, (a) 아로니아와 물을 1:10 (W/W)의 중량비로 혼합하고 200~500MPa의 압력에서 10분 내지 30분 동안 추출 하는 단계; (b) 초고압 처리 후, 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열 추출 하는 단계; 및 (c) 초고압 처리하여 추출된 아로니아 추출물을 여과, 감압농축 및 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 고압펄스를 이용하여 아로니아 추출물을 수득하는 공정은, (a) 아로니아 건조 분말을 입자크기 1~10㎛ 로 분쇄하는 단계; (b) 분쇄된 아로니아 분말을 물에 첨가하여 연속적으로 교반시키는 단계; (c) 교반하면서 펄스형 레이저(Nd-YAG)를 이용하여 파장 300~500nm의 가시광선을 펄스폭 10ns(FWHM), 펄스 반복률 10Hz, 펄스에너지 100~300mJ로 5~7분씩 3단계로 나누어 순차적으로 아로니아 분말 입자 표면에 조사하는 단계; (d) 고압 펄스 처리된 아로니아를 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열 추출 하는 단계; 및 (e)고압 펄스 처리하여 수득한 아로니아 추출물을 여과, 감압농축 및 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 고압균질 처리를 이용하여 아로니아 추출물을 수득하는 공정은, (a) 건조 분말 형태의 아로니아를 1L 증류수에 10중량%의 양으로 첨가한 후 20,000rpm으로 15분 동안 파쇄하는 단계; (b) 고압 균질기에서 10000~30000psi 이상의 압력을 가하는 단계; (c) 고압 균질 처리된 아로니아를 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열 추출하는 단계; 및 (d)고압 균질 처리하여 수득한 아로니아 추출물을 여과, 감압농축 및 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 냉동/해동 공정을 이용하여 아로니아 추출물을 수득하는 공정은, (a) 아로니아를 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열 추출하는 단계; (b) 가열 추출된 아로니아를 -70℃에서 급속 냉동하는 단계; (c) 냉동상태의 아로니아를 2450 MHz의 세기의 마이크로파를 이용하여 급속 해동하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징적인 부분 및 제조 방법 등에 관련하여 후술되는 실시예들을 참조하면 될 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

< 1-1> 아로니아의 추출물( 열수 , 에탄올 및 메탄올 추출물) 제조

아로니아의 추출물을 제조하기 위해 다음과 같이 수행하였다. 하기 실험에서 사용하기 위한 아로니아 추출물로서 열수추출물, 에탄올 추출물, 메탄올 추출물을 수득하였는데, 먼저 건조된 아로니아 100g을 1L의 물, 에탄올 또는 메탄올과 각각 혼합한 후, 열수 추출은 100℃, 에탄올 추출은 80℃ 및 메탄올 추출은 60℃에서 각각 24시간 추출한 다음 감압 여과장치를 통해 각각의 추출물을 여과시켰다. 이후, 여과된 아로니아의 열수, 에탄올 및 메탄올 추출물은 감압농축한 후에 동결건조하여 분말의 형태로 제조하였다.

<1-2> 산처리한 아로니아 추출물( 열수 , 에탄올 및 메탄올 추출물)의 제조

또한 본 발명자들은 <1-1>의 방법과 달리, 산 처리한 아로니아의 추출물을 제조하기 위해, 건조된 아로니아 100g을 1L의 물, 에탄올 또는 메탄올과 각각 혼합한 후에 황산, 염산, 아세트산, 인산 및 붕산의 산을 1L의 물, 에탄올 또는 메탄올 대비 3 (%, V/V)로 첨가하였고, 이후 열수 추출은 100℃, 에탄올 추출은 80℃ 및 메탄올 추출은 60℃의 온도에서 각각 24시간 추출한 후, 감압 여과장치를 통해 추출물을 여과시켰다. 이후, 여과된 열수, 에탄올 및 메탄올 추출물을 감압농축한 후에 동결건조하여 분말의 형태로 제조하였다.

<1-3> 초음파, 초고압, 고압펄스, 고압균질 및 냉동/해동을 통한 아로니아의 추출물 제조

또한 본 발명자들은 조건을 각기 달리한 상태에서 아로니아 추출물을 수득하였는데, 먼저 초음차 추출물을 수득하기 위해, 건조된 아로니아 100g을 1L의 물 또는 70% 에탄올과 1:10 (w/w)의 중량비율로 혼합한 다음, 90 kHz의 초음파 조건에서 50분 동안 추출 한 후, 80℃의 온도에서 10시간 동안 가열 추출 하였다, 이후 수득한 아로니아 초음파 추출물은 여과 및 감압농축 한 후, 동결건조하여 분말의 형태로 제조하였다.

아로니아 초고압 추출물은 건조된 아로니아와 물을 1:10 (w/w)의 중량비율로 혼합하고 4000MPa의 압력에서 20 동안 추출 한 후, 초고압 처리된 아로니아를 80℃의 온도에서 10시간 동안 가열 추출하였다. 추출 후 얻어진 아로니아 초고압 추출물을 여과 및 감압농축 한 후, 동결건조하여 분말의 형태로 제조하였다.

아로니아 고압펄스 추출물의 제조는 아로니아 건조 분말 100g을 고속 분쇄 공정을 거쳐 5㎛ 크기의 입자로 분쇄하였다. 분쇄된 아로니아를 1L의 증류수에 첨가하여 연속적으로 교반시켜 주면서 펄스형 레이저(Nd-YAG)를 이용하여 파장 400nm의 가시광선을 광학용 유리로 만들어진 투과창을 이용하여 펄스폭은 10ns(FWHM), 펄스 반복률은 10Hz로 하고 펄스에너지 100, 200, 300mJ로 5분씩 3단계로 나누어 순차적으로 용액 중에 담겨 있는 입자 표면에 조사해 주었다. 이후, 고압 펄스 처리된 아로니아를 80℃의 온도에서 10시간 동안 가열 추출하였고, 추출물을 여과 및 감압농축 한 후, 동결건조하여 분말의 형태로 제조하였다.

아로니아 고압균질 추출물은 건조 분말 형태의 아로니아 100g을 1L 증류수에 10%(중량%)의 양으로 첨가한 후 고속 분쇄기에 20,000rpm으로 15분 동안 파쇄하였다. 파쇄된 아로니아를 고압 균질기에 70㎛ 크기의 관을 통과시켜 30000psi 이상의 압력을 가하였다. 이후, 고압 균질 처리된 아로니아를 80℃의 온도에서 10시간 동안 가열 추출하였고 얻어진 아로니아 추출물을 여과 및 감압농축 한 후, 동결건조하여 분말의 형태로 제조하였다.

아로니아 냉동/해동 추출물의 제조는 아로니아 100g을 80℃의 온도에서 10시간 동안 가열 추출을 한 후, 추출된 아로니아를 용기에 넣어 -70℃에서 급속 냉동하였다. 이후, 냉동상태의 아로니아를 2450 MHz의 세기의 마이크로파를 이용하여 급속 해동하여 추출물을 수득한 후 여과 및 감압농축 한 후, 동결건조하여 분말의 형태로 제조하였다.

< 실험예 1>

아로니아 추출물들의 항산화 활성 측정

상기 실시예에서 제조된 각각의 아로니아 추출물들에 대해 항산화 활성을 측정하였다. 항산화 활성 실험은 각각 DPPH 소거 활성 측정, 환원력 측정, 총 페놀 함량 측정 실험을 하였다. 이때 하기 표에서 열수 및 에탄올 추출물은 <1-1>에서 제조한 추출물을 사용하였다.

상기의 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 아로니아 추출물들에 대한 항산화 활성 측정 결과는 열수 추출물이나 에탄올 추출물에 비해 추가적인 공정인 초음차, 초고압, 고압펄스, 고압균질 및 냉동/해동 과정을 수행하여 수득한 추출물에서 더 우수한 항산화 활성을 나타내었고, 특히 초고압 처리한 군에서 DPPH 라디칼 소거능이 우수하고 총 페놀함량도 가장 높은 것으로 나타났다.

< 실험예 2>

아로니아 추출물들의 ROS 소거 활성 평가

아로니아 추출물의 항노화 효과를 측정하기 위해, 세포 내부에서 발생하는 ROS에 대한 추출물의 영향을 분석하였다. 이를 위해 피부각질형성 세포인 HaCaT에서 ROS를 유도하기 위해 96 well black plate에 1×10⁵ cell/mL로 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 뒤에 serum free 배지로 한번 세척한 후, serum free 배지를 각 플레이트 당 200 μL씩 채운 뒤 각각의 아로니아 추출물을 500 μg/mL의 농도로 1시간 동안 전처리 하였다. 1시간 뒤 배지를 없애고, serum free 배지를 20 μL씩 분주하고 나서, UV를 100 mJ/cm2의 선량으로 세포에 조사한 뒤 serum free 배지를 180 μL씩 추가로 분주하였다. 이때 상기 배지에 아로니아 추출물을 처리할 때, 추출물의 처리 농도는 500 μg/mL이 되도록 하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 ROS 생성량을 측정하였는데, dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) 염색 방법을 사용하였다. 그 후, DCFH-DA의 농도는 2.5 μM로 처리 하였고, DCFH-DA 처리 후 1시간 뒤에 형광분석 ELISA reader기(Bio-Tek)를 통해 excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 530 nm를 이용해 분석하였으며, Positive control로는 NAC: N-Acetyl-Lcysteine를 사용하였다.

분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, UV 조사에 의해 세포내에서 발생된 ROS는 아로니아 추출물들을 처리한 군에서 현저하게 감소되는 것으로 나타났고, 특히 초음파 아로니아 추출물이 UV 조사 군에 비해 약 2.5배 정도 ROS생성능을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 열수 및 에탄올 추출물 군에 비해 추가적인 공정인 초음차, 초고압, 고압펄스, 고압균질 및 냉동/해동 과정을 수행하여 수득한 추출물에서 ROS의 생성이 더 억제되는 것으로 나타났다.

< 실험예 3>

아로니아 추출물의 MMP -1 억제효과 분석

아로니아 추출물의 항노화 활성을 측정하기 위해, 아로니아 추출물이 피부내의 콜라겐 붕괴를 촉진하는 MMP-1 (Matrix Metallo- Proteinase-1)의 유전자 발현을 저해하는 활성이 있는지 RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하여 분석하였다. 즉, 사람 섬유아세포를 60 mm 세포 배양 접시에 1× 10⁶의 세포수 밀도로 접종한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. UVA 6J을 조사한 후 각각의 아로니아 추출물 1.0 mg/mL을 첨가하여 24시간 배양하고, 세포에 트리졸 (Trizol, invitrogen, 미국) 1 mL을 첨가하여 인비트로젠사의 RNA 분리법에 따라 분리하였다. 자외선 검출기를 이용하여 260nm에서 RNA를 정량한 후, RT-PCR을 실시하였다. RT-PCR은 RT-PCR Kit (All-in-one RTPCR Kit, SuperBio, Korea)를 사용하였고, 프라이머는 하기의 표 2의 프라이머를 사용하였다. MMP-1 프라이머의 반응 조건은 50℃에서 30분간 역전하 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 1분, 48℃ 1분 및 72℃ 1분간 25회로 중합반응을 시켰다. Actin의 반응 조건은 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 1분, 62℃ 1분 및 72℃ 1분간 25회 중합반응 시켰다.

분석결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 모든 아로니아 추출물에서 control 보다 높은 유전자 억제 수준을 보이는 것을 확인 할 수 있었다.

< 실험예 4>

아로니아 추출물의 세포배양에 미치는 영향측정

본 발명에 따른 아로니아 추출물들이 인간유래 피부 내피세포인 Primary Dermal Microvascular Endothelial Cells (ATCCPCS-110-010™)에 미치는 영향을 다음과 같이 분석하였다. 즉 상기 세포를 Cell Growth Kit-BBE (ATCCPCS-110-040)에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 조건별 아로니아 추출물 1 mg/㎖을 첨가한 배지와 무처리 군의 배지를 이용하여 증식시켰다. 이후, 세포가 배양용기의 90% 정도로 자라면 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 얻어진 세포를 증식배지로 1:3의 비율로 희석하여 계대 배양을 수행하였다.

상기의 계대 결과를 표 3에 나타내었으며, 그 결과 10회를 기준으로 에탄올, 초음파, 초고압 및 고압균질 처리된 아로니아 추출물을 첨가하였을 경우 계대배양 횟수가 늘어나는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 5>

아로니아 추출물의 텔로머라아제 활성에 미치는 영향 측정

아로니아 추출물의 텔로머라아제 활성을 측정하여, 항노화 활성을 측정하였다. 텔로머라아제 활성은 텔로머라아제 탐지 키트 (Telomerase Detection Kit (TRAPeze RT Telomerase Detection Kit, CHEMICON, USA & Canada))를 사용하여 줄기세포의 텔로머라아제(telomerase) 활성을 확인하였다. 텔로머라아제는 열에 민감하므로, 각 측정은 열처리된샘플의 결과로 교정되었다.

분석결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 각 방법을 달리 하여 수득한 추출물 중에서 초음파 추출물이 텔로머라아제의 상대적 전사값이 가장 높은 것을 확인하였다. 따라서 초음파 추출물이 항노화 활성이 가장 우수할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실험예 6>

아로니아 추출물의 피부주름 개선활성

아로니아 추출물의 피부주름 개선 활성을 측정하기 위해, 건강한 여성 20명을 대상으로 실험을 하였다. 각각의 피검자에게 2개월 동안 1일 2회 (아침 및 취침전) 크림을 사용하도록 하였으며, 상기의 크림은 아로니아 추출물 성분을 0.05wt%를 함유하는 크림을 사용하였으며, 제품을 사용하기 전과, 사용 2, 4 및 6 주후에 주름 개선효과를 사진으로 측정하였다.

임상 시험 결과 실제 주름 개선 효과가 있음을 하기 도 4의 결과로 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

1. 아로니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방 또는 개선용 약학적 조성물로서, 상기 추출물은 물, 에탄올 또는 메탄올을 이용하여 추출한 후 고압펄스 또는 냉동/해동 과정을 수행하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 아로니아는 블랙초크베리, 레드초크베리, 아로니아 멜라노카파 아론, 아로니아 멜라노카파 네로, 아로니아 멜라노카파 바이킹 및 아로니아 멜라노카파 메킨지으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항에 있어서,
   상기 고압펄스 추출물은,
   (a) 아로니아 건조 분말을 입자크기 1~10㎛ 로 분쇄하는 단계;
   (b) 분쇄된 아로니아 분말을 물에 첨가하여 연속적으로 교반시키는 단계;
   (c) 교반하면서 펄스형 레이저(Nd-YAG)를 이용하여 파장 300~500nm의 가시광선을 펄스폭 10ns(FWHM), 펄스 반복률 10Hz, 펄스에너지 100~300mJ로 5~7분씩 3단계로 나누어 순차적으로 아로니아 분말 입자 표면에 조사하는 단계;
   (d) 고압 펄스 처리된 아로니아를 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열 추출 하는 단계; 및
   (e)고압 펄스 처리하여 수득한 아로니아 추출물을 여과, 감압농축 및 동결건조하는 단계를 통해 수득하는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 삭제
10. 제1항에 있어서,
    상기 냉동/해동 추출물은,
    (a) 아로니아를 80℃의 온도에서 6 내지 12시간 동안 가열 추출하는 단계;
    (b) 가열 추출된 아로니아를 -70℃에서 급속 냉동하는 단계;
    (c) 냉동상태의 아로니아를 2450 MHz의 세기의 마이크로파를 이용하여 급속 해동하는 단계를 통해 수득하는 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 삭제

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