KR102154743B1 - 아로니아 발효 추출물을 함유하는 암 줄기세포 성장 억제 및 예방용 조성물의 제조방법 및 그 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 아로니아를 유산균 발효시키고 추출한 후 분획 또는/및 정제하여 암 줄기세포를 억제 또는 예방하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 조성물이 유방암 세포에서 맘모스페어 형성을 억제하는 것을 확인하였으며, 상기 조성물에 포함된 카테콜이 유방암 줄기세포에서 특징적으로 발현하는 것으로 알려진 Nanog, Sox2 및 Oct4로 선택되는 하나 이상의 자가 재생(self-renewal) 유전자의 발현을 억제하고, 유방암 줄기세포의 맘모스페어 형성에 관여하는 것으로 알려진 STAT3 신호전달 경로와 IL-6의 분비를 억제하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 제조방법으로 제조한 조성물은 유방암 등의 암의 치료에 활용이 가능하다.

Description

아로니아 발효 추출물을 함유하는 암 줄기세포 성장 억제 및 예방용 조성물의 제조방법 및 그 조성물{The manufacturing method of composition inhibiting and preventing the growth of cancer stem cells comprising the fermented extract of aronia, and the composition}

본 발명은 아로니아를 유산균 발효시킨 배양액을 추출 및 분획하여 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

항암치료가 종양내의 세포군을 효과적으로 표적화하여 치료하지 못하고, 종양의 재발 및 전이로 연결됨에 따라 암 줄기세포에 대한 관심이 대두되었다. 많은 세포독성 항암제는 대개 빠르게 증식하는 세포를 표적으로 하고 있어, 천천히 증식하는 특징을 가진 암 줄기세포는 세포독성 항암요법에서 살아남을 수 있게 된다. 기저세포형(basal cell phenotype) 유방암은 분화과정의 초기 단계의 유선 모세포(earliest mammary progenitor cell)에서 기원한 것으로 여겨지며, 예후가 불량하고 기존의 항암요법에 내성을 나타낸다고 알려져 있는데, 항암 치료의 실패원인이 암 줄기세포에 대한 표적치료가 실패하였기 때문이란 것을 지지하는 좋은 예라 할 수 있다.

한편, 유방암은 여성에서 흔한 암이며, 여성 암 환자에서 주요 사망의 원인으로 알려져 있다. 초기 유방암에 폴리항암화학요법(polychemotherapy), 타목시펜과 함께 광범위한 유방 X선 촬영 및 보조 요법이 유방암의 사망률을 줄였으나, 유방암은 여전히 재발과 전이로 인해 가장 위험한 질병으로 알려져 있다. 최초로 암 줄기세포(Cancer stem cell, CSCs)가 골수성 백혈병에서 확인되었고, 이후, 유방, 뇌, 결장, 난소, 췌장, 및 전립선 암 등 다양한 고형암에서 발견되었다. 상기 암 줄기세포는 종양-시작 세포(tumor-initiating cells)와 암 줄기 유사 세포(cancer stem-like cell)로 불리기도 한다. 또한 유방암을 포함한 다양한 암 유형이 종양의 소집단인, 암줄기세포(CSCs)로부터 유래되는 것으로 나타났다. 이러한 집단은 자가 재생(self-renewal) 및 분화를 통해 종양 부피에 변화를 유발하는 것으로 알려져 있다. Shh (Sonic hedgehog), Stat3, NF-κB, Wnt/β-catenin, TGF-β 및 Notch 신호 전달 경로는 CSCs의 자가 재생(self-renewal)에 결정적인 것으로 알려져 있다.

암 줄기세포는 화학 요법과 방사선 치료에 대한 약제 내성 및 방사선 내성을 나타내며, 암의 재발과 전이를 유발한다. 따라서 암 줄기세포에 대한 표적 치료는 암 치료에 필수적이다. 암 줄기세포는 Oct4, C-myc, Nanog, 및 알데히드 탈수소효소-1(Aldehyde dehydrogenase-1, ALDH)을 포함하는 특정 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다. 상기 ALDH는 유전 독성의 알데히드를 산화하는 효소이며, 이의 효소 활성은 백혈병, 두경부, 방광, 뼈, 결장, 간, 폐, 췌장, 전립선, 갑상선 및 자궁경부암의 CSC(cancer stem cells) 마커로 널리 사용되고 있다. ALDH는 암 줄기세포의 치료표적으로 알려져 있다. 또한, 임상 표본에서 CD44^high/CD24^low를 발현하는 유방암 집단에서 종양을 형성하는 능력이 뛰어난 것으로 알려져 있다.

Stat3(Signal transducers and activators of transcription 3)와 NF-κB는 CSCs에서 주로 활성화되어 있고, 맘모스페어(mammosphere) 형성은 JAK1/2-STAT3 및 NF-κB 경로와 관련이 있다. 분비된 IL-6는 JAK1/2-STAT3 경로를 활성화시키고, Oct4 유전자의 발현을 증가시킨다. IL-6/JAK1/2-STAT3 신호전달 경로는 NSCCs(Non-CSCs)의 CSCs로의 전환에 중요한 것으로 알려져 있다. STAT3 신호 전달경로를 차단하면 유방암 세포유래 CD44^high/CD24^low 줄기 세포 유사(stem cell-like) 세포의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. NF-κB(Nuclear factor-κB) 전사 인자는 결장, 유방, 간암을 포함하는 종양 세포에서 구조적으로(일정하게) 활성화되고, IκB 키나제(IKK) 복합체에 의해 조절된다. NF-κB의 억제제인 피롤리딘디티오카르바민산염(pyrrolidinedithiocarbamate, PDTC)는 유방암 줄기 유사 세포를 억제하는 것으로 알려져 있다.

상기 유방암 줄기세포는 CD44^high/CD24^low, ESA +(상피 특이 항원) 및 ALDH 같은 바이오 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다고 알려져 있다. 항암 화학 요법은 CD44^high/CD24^low를 발현하는 암세포의 비율과 맘모스페어 형성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. CSCs는 독소로부터 CSCs를 보호하기 위해 특이 ABC 수송체(ABC transporters)를 과발현한다. ABC 펌프는 side population(SP)를 분리하는데 사용되고, ABCG2 transporter-specific Hoechst 33342 dyes에 의해 분류될 수 있다. 유방 CSCs는 종양 세포(tumor cells)에 비해 반응성 산소종(ROS)을 낮은 수준 생성하기 때문에, 유방암 줄기세포 유사 세포(breast cancer stem-likes cells)는 방사선 저항이 있다. 왜냐하면, ROSs는 이온화 방사선-유도된 세포 사멸의 주요 매개체이기 때문에, CSCs는 비-줄기 암세포보다 DNA 손상이 덜한 것으로 알려져 있다.

유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB-231는 in vitro에서 부착 없이도 세포 자멸사를 하지 않고 타원 형태로의 성장을 할 수 있는 줄기 세포와 유사한 능력을 가진 세포의 부분집락을 가진 것으로 알려져 있다. 부유배양으로 기층이 없는 조건을 인공적으로 만들면 줄기세포의 성질을 가지는 세포들은 서로 부착되어 구형의 세포 덩어리를 만들게 되며, 이러한 세포 덩어리는 뉴로스페어(neurosphere)로 명명되었다. 인간의 유방 줄기세포에 이러한 개념을 적용한 것이 "맘모스페어(mammosphere)"이다. 맘모스페어에는 일반 인간 유방 세포보다 8배 많은 전구 세포들이 존재하며 지속적으로 계대 배양이 가능하고, 여러 번의 계대 배양 후에는 100%의 세포가 모두 bi-potent 전구체로 자라는 특징이 있다. 맘모스페어는 성인 유방 세포인 유선 상피세포(mammary gland epithelial cell), 관 상피세포(ductal epithelial cell), 엘비올라 상피세포(alveolar epithelial cell)들로 모두 분화가 가능하며, 마트리겔(Matrigel)내에서 삼차원 구조를 이루면서 복잡한 기능성 유방 구조물을 형성하는 것이 관찰된다. 맘모스페어는 줄기세포의 가장 특징 중의 하나인 자가 증식을 할 수 있는 성질이 있어서 하나의 맘모스페어에서 여러 개의 맘모스페어 또는 유방줄기세포를 다량으로 얻을 수 있다. 또한 조혈모 세포, 신경 줄기세포, 배아 줄기세포 등과 비교하여 많은 발현 유전자가 중복되는 것이 확인되어, 맘모스페어가 실제적인 유방 줄기세포인 것으로 보고되었다. 이러한, 암 줄기세포의 자가 재생 능력의 표준 분석 방법은 in vivo에서의 이식(transplantation) 및 in vitro에서의 맘모스페어 형성을 분석하는 것이다.

지금까지 암 줄기세포에 대한 연구에는 제한성도 많고, 종양의 형성이나 유지에서의 역할에 대해서는 확실하게 밝혀진 것은 없었다. 정상 줄기세포에는 손상을 주지 않으면서 암 줄기세포만을 표적으로 하는 치료를 효율적으로 수행하기 위해서는 암 줄기세포의 유지와 조절에 중요한 분자생물학적인 특성이나 그 조절 경로에 대한 지식과 이해가 필요하다. 그러나, 현재까지 암 줄기세포를 직접적으로 타겟팅하는 항암제나 천연물 유래 추출물의 연구는 부족한 실정이다.

초크베리(chokeberry) 등 신선한 베리는 최근에 주로 우수한 건강상의 이점 덕분에 소비자들에게 큰 인기를 끌고 있다. 블랙 초크베리(black chokeberry)라고도 불리우는 아로니아는 안토시아닌, 카로티노이드, 지방산, 플라보노이드, 페놀 화합물 및 비타민 등의 생체활성 화합물을 함유한다. 아로니아의 건강 증진 효력은 널리 인지되어 있고, 아로니아의 건강상의 이점에 대한 전임상 및 임상 연구가 진행 중에 있다. 또한, 최근 블랙베리의 항산화성을 유산균 발효를 통해 향상되었다는 연구가 보고된 바 있다.

이에 본 발명자는 락토바실러스에 의한 아로니아 발효 추출물을 이용하는 천연물 유래 암 줄기세포 치료제를 개발하였다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0122438호 대한민국 공개특허 제10-2016-0088623호

본 발명의 하나의 목적은, 아로니아를 유산균으로 발효시켜 발효 배양액을 제조하는 단계, 상기 발효 배양액에 유기용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된, 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아로니아 유산균 발효물의 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리된 카테콜을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자는 아로니아를 유산균으로 발효시킨 배양액을 에틸 아세테이트로 추출한 추출물의 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 분획물에 대한 유방암 줄기세포 성장 억제 효과를 확인하였고, 상기 추출물에서 생체분석 유도 분리를 통해 유방암 줄기세포 성장 억제 활성을 갖는 활성 성분을 분리하였다. 아로니아 발효 배양액의 추출물에서 분리된 활성 화합물인 카테콜이 유방암 세포의 증식 및 맘모스페어 형성을 억제하고, Stat3의 발현 및 IL-6의 분비를 감소시켜 Stat3 신호를 억제하여 암 줄기세포 성장(증식)을 억제함을 확인하였다. 이에 따라 아로니아 발효 추출물 및 이의 분획물이 암 줄기세포를 타켓팅함으로써, 유방암을 비롯한 암 줄기세포의 성장을 억제하고, 유방암을 비롯한 암치료에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로, 아로니아를 유산균으로 발효시켜 발효 배양액을 제조하는 단계 및 상기 발효 배양액을 이용하여 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 제조방법으로 제조된 조성물은 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방 활성을 가진다.

본 발명에서 “아로니아(Aronia)”는 블랙초크베리로 불리는, 장미과 다년생 식물 아로니아속(Aronia) 나무의 열매을 의미한다. 구체적으로 상기 아로니아는 아로니아 주스, 건조 아로니아, 동결 아로니아 또는 아로니아 생과일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “아로니아 발효 배양액”은 유산균 배양용 배지에 상기 아로니아를 혼합하고 유산균을 접종하여 배양한 발효 배양액을 의미한다. 상기 배양액은 원심분리하여 유산균 또는 부유물을 제거한 배양액의 상층액, 상기 상층액의 농축물 또는 상기 상층액의 동결건조물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 2%(w/v) 아로니아 건조 분말을 함유하는 유산균 배양용 MRS 배지에 락토바실러스 람노서스를 접종하여 30 또는 37℃에서 2일 또는 5일간 배양하여 아로니아 발효 배양액을 제조하였다.

따라서, 상기 아로니아 발효 배양액은 유산균 배양용 배지에 건조 아로니아 분말을 0.1 내지 10%(w/v) 첨가하여 유산균 발효시켜 제조될 수 있다.

또한, 상기 발효 배양액은 30 내지 37℃에서 배양되어 제조될 수 있으며 구체적으로, 유산균을 아로니아를 함유하는 배지에 접종하고 30 내지 37℃에서 1일 내지 6일, 보다 구체적으로 2일 내지 5일간 배양하여 제조될 수 있다.

본 발명에서 “아로니아 발효 추출물”은 상기 아로니아 발효 배양액에 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 제조한 추출물을 의미한다. 상기 아로니아 발효 추출물은 아로니아 발효 배양액에 배양액 부피의 0.5 내지 10배의 부피에 달하는 상기 용매를 이용하는 제조할 수 있다. 구체적으로 아로니아 발효 추출물은 아로니아 발효 배양액에 상기 용매를 0.5 내지 10배, 바람직하게는 1 내지 5배에 달하는 부피의 상기 용매를 사용하여 추출할 수 있으나, 항암 줄기세포 활성을 가지는 물질을 추출하는 방법이라면 제한 없이 이용될 수 있다.

구체적으로, 아로니아 발효 배양액의 1배 부피의 에틸 아세테이트로 추출하여 수득한 결과물일 수 있으나, 본 발명의 항 암 줄기세포 활성을 나타낼 수 있는 한, 이에 제한되지는 않으며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 상기 아로니아 발효 추출물을 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 수행하여 분획물을 제조하였다. 이동상은 물과 메탄올을 이용하였으며, 구배용리에 있어서 초기에 메탄올을 20%로 하여 20분까지 60%, 40분까지 100%로 증가시켰다. HPLC 수행시 254㎚ 및 220㎚에서 흡광도를 확인하였으며, 발효 2일차 및 5일차에, 0일차에 존재하지 않는 220㎚에서 흡광도를 나타내는 20% 메탄올 분획물(A 피크 분획물) 및 60% 메탄올 분획물(B 피크 분획물)을 분리하였다.

따라서, 본 발명의 제조방법은 상기 추출물에 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 아로니아 발효 추출물의 분획물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.

구체적으로 상기 아로니아 발효 추출물의 분획물을 제조하는 단계에서 제조된 아로니아 발효 추출물의 분획물은 210 내지 230㎚, 보다 구체적으로 220nm에서 흡광도를 가지는 분획물일 수 있으며, 메탄올 수용액의 구배용리에 따라 분리된 분획물일 수 있다. 더욱 구체적으로 20% 메탄올 분획물 또는 60% 메탄올 분획물일 수 있으며, 바람직하게는 60% 메탄올 분획물일 수 있다.

또한, 본 발명의 일실시예에서 도 1C 또는 도7에 도시된 생체분석 유도 분리 방법으로 아로니아 발효 배양액의 에틸아세테이트 추출물을 실리카 겔 크로마토그리피를 수행하여 1차 정제물을 제조하고, 맘모스페어 형성 억제효과를 가지는 1차 정제물 F4를 Sephadex LH 20(20x400mm)을 이용하여 크로마토그래피 수행하였으며 용출용매로 100% 메탄올을 사용하여 2차 정제물을 제조하였고, 상기 2차 정제물의 맘모스페어 형성 억제효과를 확인하였다. 그리고 2차 정제물 중에서 억제효과를 가지는 2차 정제물(F4-3)으로 박막 크로마토그래피를 수행하여 254㎚에서 흡광도를 가지는 3차 정제물을 제조하였다. 상기 3차 정제물 중 맘모스페어 형성 억제 효과를 가지는 3차 정제물(F4-3-1)로 HPLC를 수행하고 220㎚에서 흡광도를 가지는 분획물을 분리하였다.

따라서 본 발명의 제조방법은 상기 추출물로 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제물을 제조하는 단계, 상기 1차 정제물로 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제물을 제조하는 단계, 상기 2차 정제물로 박막 크로마토그래피를 수행하여 240 내지 270nm에서 흡광도를 가지는 3차 정제물을 제조하는 단계 및 상기 3차 정제물로 220 내지 230nm에서 흡광도를 가지는 분획물을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 크로마토그래피는 구체적으로 실리카 겔 크로마토그리피, Sephadex LH 20 또는 박막 크로마토그래피를 이용할 수 있으나, 항 암줄기세포 활성을 가지는 물질을 분리하는 방법이라면 제한 없이 이용될 수 있다.

상기 1차 정제물은 상기 아로니아 발효 추출물을 농축하여 크로마토그래피를 수행하여 제조되며, 이동상의 용매로 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용할 수 있으며, 구체적으로 클로로포름-메탄올 혼합용매를 사용할 수 있으며, 더욱 구체적으로 클로로포름-메탄올(15~10:1~5, 부피비)의 용매를 사용하여 제조될 수 있다.

상기 2차 정제물은 상기 1차 정제물로 겔 크로마토그래피를 수행하고 이용상의 용매로 탄소수 1 내지 4의 알코올 용매로 사용하여 제조될 수 있으며, 구체적으로 메탄올을 용매로 사용하여 제조될 수 있다.

상기 3차 정제물은 상기 2차 정제물로 박막크로마토그래피를 수행하여, 240 내지 270nm에서 흡광도를 가지는 물질을 분리하여 제조되며, 구체적으로 실리카 겔이 코팅된 TLC판에서 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 이용하여 전개한 후, 254㎚에서 시각화하여 흡광도를 가지는 겔을 분리하고, 상기 겔을 메탄올로 추출하여 제조될 수 있다.

상기 4차 분획물은 상기 3차 정제물에서 220 내지 230nm 흡광도를 가지는 분획물을 분리하여 제조되며, 구체적으로 탄소수 1 내지 4의 알코올 수용액을 용매로 HPLC를 수행하여 220㎚에서 흡광도를 가지는 분획물을 분리하여 제조되며, 더욱 구체적으로 메탄올 수용액을 이용하여 분획물을 제조할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 상기 제조방법으로 제조한 아로니아 발효 추출물을 생체분석 유도 분리에 의해 분리된 4차 분획물과 아로니아 발효 추출물을 HPLC 수행하여 분리한 B 피크 분획물의 분석결과, 동일한 피크를 가짐을 확인하였으며, 상기 4차 분획물의 물질을 구조를 분석한 결과 카테콜(catechol)임을 확인하였다.

따라서, 상기 제조방법에 의해 제조된 조성물, 아로니아 발효 추출물 또는 이의 분획물은 카테콜(catechol)을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "암"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. "암"이란 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미한다.

본 발명에서, 용어 "암 줄기세포"는 다양한 암세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화세포로, 상기 암으로는 결장암 및 직장암을 포함하는 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system;CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 또는 뇌하수체선종일 수 있다. 이에 제한되지 않지만, 상기 암 줄기세포는 유방암의 줄기세포일 수 있다.

본 발명에서 용어 "유방암 줄기세포"는 유방암세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화세포를 의미한다.

본 발명에서 용어 "유방암 줄기세포 성장 억제"는 유방암 줄기세포 유지 (maintenance) 억제, 유방암 줄기세포 악성화(malignance) 억제, 유방암 줄기세포 이동 및 유방암 줄기세포 침윤활성(invasive) 억제를 포함하는 의미이다.

본 발명의 용어 “암 줄기세포 예방”은 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 암 줄기세포의 성장 또는 증식을 방지시키거나, 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 제조방법으로 제조된 아로니아 발효 추출물 의 분획물이 유방암 줄기세포의 성장을 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포로부터 유래된 1차 맘모스페어(mammosphere)에 아로니아 발효 추출물의 분획물을 처리하였으며, 그 결과, 아로니아 발효 추출물의 분획물이 유방암 세포주로부터 유래된 1차 맘모스페어의 형성을 억제하는 것을 확인하였다.

또한, 상기 아로니아 발효 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리한 카테콜에 의해 유방암 세포인 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포로부터 유래된 맘모스페어의 수가 감소하는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 맘모스페어의 크기도 감소하는 것을 확인하였다. 이에따라, 본 발명의 상기 아로니아 발효 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리한 카테콜은 맘모스페어(mammosphere)의 형성을 억제하거나, 맘모스페어의 증식을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 상기 제조방법에 의해 제조된 조성물, 아로니아 발효 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리된 카테콜은 유방암 유래의 맘모스페어(mammosphere)의 형성을 억제하거나, 또는 유방암 유래의 맘모스페어의 증식을 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 상기 유방암 줄기세포는 Nanog, C-myc, Oct4 및 Sox2로 선택되는 하나 이상의 자가 재생(self-renewal) 유전자를 발현할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 아로니아 발효 추출물 및 이의 분획물에서 분리되는 카테콜이 유방암 줄기세포에서 특징적으로 발현하는 것으로 알려진 Nanog, C-myc, Oct4, 및 Sox2와 같은 자가 재생 유전자의 발현을 억제하였으며, 유방암 줄기세포의 맘모스페어 형성에 관여하는 것으로 STAT3 신호전달 경로 및 IL-6의 분비를 억제하는 것을 확인하였다. 이에 따라, 상기 카테콜을 포함하는 아로니아 발효 추출물 또는 이의 분획물은 유방암 줄기세포의 성장을 억제할 수 있음을 확인하였다.

따라서 상기 제조방법에 의해 제조된 조성물, 아로니아 발효 배양액의 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리한 카테콜은 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물로 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로 상기 제조방법에 의해 제조된 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 “아로니아”, “아로니아 발효 배양액”,“추출물”, “분획물”, "암", "암 줄기세포", "암 줄기세포 성장 억제", "암 줄기세포 예방"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

상기 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물은 아로니아를 유산균으로 발효시켜 발효 배양액을 제조하는 단계 및 상기 발효 배양액을 이용하여 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되었다.

구체적으로 상기 조성물은 상기 추출물에 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 아로니아 발효 추출물의 분획물을 제조하는 단계를 더 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 상기 추출물로 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제물을 제조하는 단계, 상기 1차 정제물로 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제물을 제조하는 단계, 상기 2차 정제물로 박막 크로마토그래피를 수행하여 240 내지 270nm에서 흡광도를 가지는 3차 정제물을 제조하는 단계, 상기 3차 정제물로 210 내지 230nm에서 흡광도를 가지는 분획물을 분리하는 단계를 더 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 양태로 상기 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는 MCF-7 세포주와 MDA-MB-231 세포주에서 아로니아 발효 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리한 카테콜을 처리한 경우, 유방암 세포주들의 성장이 억제되는 것을 확인하였는 바, 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물로 이용이 가능하다. 본 발명에서 상기 암은 유방암일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 “아로니아”, “아로니아 발효 배양액”,“추출물”, “분획물”, "암", "암 줄기세포", "암 줄기세포 성장 억제", "암 줄기세포 예방"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 “암의 예방”은 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "암의 치료"란, 본 발명의 따른 조성물에 의해 암에 의한 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 "약학적으로 허용 가능한" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 "담체"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.

본 발명의 아로니아 발효 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리된 카테콜은 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다. 상기 약학 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분인 상기 조성물, 아로니아 발효 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리된 카테콜과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용 가능한 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 상기 아로니아 발효 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리된 카테콜; 약학적으로 허용 가능한 적당한 담체; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우, 상기 조성물 내의 아로니아 발효 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 항 줄기세포 활성을 나타낼 수 있는 유효량을 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 상기 아로니아 발효 추출물 또는 이의 분획물의 양은 전체 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 중량% 이상, 구체적으로 0.001 중량% 이상일 수 있고, 80 중량% 이하, 구체적으로는 50 중량% 이하일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 조성물, 아로니아 발효 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리한 카테콜이 유방암 세포에서 CD44^high/CD24^low를 발현하는 모집단을 감소시켰으며, ALDH 양성 유방암 세포의 비율을 감소시킨 것을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명에서, 상기 암은 이에 제한되지 않지만, 유방암일 수 있으며, 상기 조성물은 CD44^high/CD24^low를 발현하는 유방암 세포의 성장을 억제할 수 있으며, 알데히드 탈수소효소(ALDH) 양성의 유방암 세포의 성장을 억제할 수 있다.

본 발명은 다른 하나의 양태로, 상기 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물을 포함하는, 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는 MCF-7 세포주와 MDA-MB-231 세포주에서 아로니아 발효 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리한 카테콜을 처리한 경우, 유방암 세포주들의 성장이 억제되는 것을 확인하였는 바, 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물로 이용이 가능하다. 본 발명에서 상기 암은 유방암일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 “아로니아”, “아로니아 발효 배양액”,“추출물”, “분획물”, "암", "암 줄기세포", "암 줄기세포 성장 억제", "암 줄기세포 예방", "암의 예방"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, "개선"은 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 개체에 투여하여 암의 증세가 호전되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물이 식품 조성물로 이용되는 경우, 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 구체적으로 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 기능성 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 식품의 예로서 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명의 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 기능성 식품, 음료, 식품첨가제 또는 음료첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

상기 "기능성 식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병 방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강기능식품일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 "기능"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 유방암 줄기세포 성장 예방의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

또한, 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물에서, 상기 아로니아 발효 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리된 카테콜의 양은 식품 조성물 총 중량의 0.00001 중량% 이상, 구체적으로 0.1 중량% 이상일 수 있고, 80 중량% 이하, 구체적으로 50 중량% 이하, 더욱 구체적으로 40 중량% 이하로 포함될 수 있으며, 상기 식품이 음료인 경우에는 식품 전체의 부피 100 ml를 기준으로 0.001 g 이상, 구체적으로 0.01 g 이상, 50 g 이하, 구체적으로 10 g 이하, 더욱 구체적으로 2g 이하의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다. 감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 구체적으로는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프록토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다. 풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 구체적으로는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또한, 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다. 생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로카테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다. 미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005 중량％ 내지 약 0.5 중량％ 범위를 의미한다. 사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

본 발명은 다른 양태로 아로니아 유산균 발효물의 추출물, 이의 분획물, 또는 이에서 분리된 카테콜을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 “아로니아”, “아로니아 발효 배양액”,“추출물”, “분획물”, "암", "암 줄기세포", "암 줄기세포 성장 억제", " 암 줄기세포 예방"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 일실시예에서 아로니아 유산균 발효물의 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리된 카테콜이 유방암 세포의 맘모스페어 형성을 억제함을 확인하였는바, 상기 아로니아 유산균 발효물의 추출물, 이의 분획물 그리고 이에서 분리된 카테콜은 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물로 이용할 수 있다.

또한 상기 암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 이용이 가능하다.

본 발명의 용어 “약학적 조성물” 또는 “식품 조성물”은 전술한 바와 같다.

본 발명의 아로니아 유산균 발효물의 추출물 또는 이를 분획하여 암 줄기세포를 억제 또는 예방하는 조성물의 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법으로 제조된 조성물이 유방암 세포에서 맘모스페어 형성을 억제하는 것을 확인하였으며, 상기 조성물, 아로니아 발효물의 추출물, 이의 분획물 또는 이에서 분리되는 카테콜이 유방암 줄기세포에서 특징적으로 발현하는 것으로 알려진 Nanog, Sox2 및 Oct4로 선택되는 하나 이상의 자가 재생(self-renewal) 유전자의 발현을 억제하고, 유방암 줄기세포의 맘모스페어 형성에 관여하는 것으로 알려진 STAT3 신호전달 경로와 IL-6의 분비를 억제하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 제조방법으로 제조한 조성물은 유방암 등의 암의 치료에 활용이 가능하다.

도 1은 아로니아 발효 추출물을 분석한 결과이다. 구체적으로, (A) 0일, 2일 및 5일간 유산균 발효한 아로니아 배양액의 에틸 아세테이트 추출물을 HPLC 분석한 결과이다.
(B) 도 1A에서 확인한 두 개의 다른 피크 A피크 분획물 및 B 피크 분획물을 사용하여 맘모스페어 형성억제를 확인한 결과이다.
(C) 아로니아 발효 추출물의 생체분석 유도 분리과정의 요약도 이다.
(D) 생체분석 유도 분리한 최종 분획물(4차 분획물)의 HPLC 결과이다.
(E) 생체분석 유도 분리한 최종 분획물(4차 분획물)의 TLC 결과이다
도 2는 최종 분획물에서 분리한 화합물의 화학구조를 분석한 결과이다. 구체적으로 (A) ESI 질량을 측정한 결과이다.
(B) 분리된 화합물의 구조를 나타낸 것이다.
(C 및 D) 아로니아 발효 추출물에서 정제한 카테콜과 표준 카테콜의 HPLC 및 TLC 결과를 비교한 것이다.
도 3은 카테콜의 유방암 세포 증식 및 맘모스페어 형성억제를 확인한 결과이다. 구체적으로 (A) 유방암 세포에서 농도에 따른 카테콜의 항증식 효과를 분석한 결과이다.
(B) 유방암 세포에서 유래한 맘모스페어에 카테콜 처리시 맘모스페어 형성 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 (A)카테콜의 유방암 세포에서 CD44^high/CD24^low 발현 모집단을 확인한 결과 및 (B) 카테콜의 ALDH 양성 유방암 세포의 비율에 미치는 영향을 ALDEFLUOR 분석한 결과이다.
도 5는 유방암 줄기세포에서 카테콜이 ERK, c-Myc 및 Stat3 단백질의 발현에 미치는 효과 및 Stat3 조절에 따른 맘모스페어 형성을 측정한 결과로, 구체적으로 (A) 유방암 줄기세포에서 카테콜에 의한 ERK, pERK, c-Myc, 및 p-c-Myc의 발현 변화를 측정한 결과이다.
(B) 유방암 줄기세포에서 카테콜 처리시 Stat3의 단백질 발현을 확인한 것이다.
(C) 유방암 줄기세포에서 카테콜 처리시 Stat3의 전사체 발현을 확인한 결과이다.
(D) MDA-MB-231 세포에서 siRNA-Stat3가 맘모스페어의 형성을 감소시킴을 확인한 결과이다.
(E) 유방암 줄기세포에서 Stat3 특이 저해제인 S31-201(100μM)의 맘모스페어 형성 억제효과를 확인한 결과이다.
도 6은 맘모스페어에서 카테콜의 Stat3 신호 경로 및 IL-6 분비 억제를 확인한 것으로, 구체적으로 (A) 카테콜 처리시 세포질(cytosol)과 핵 분획물(Nuclear fraction)에서 pStat, Stat 및 p65의 단백질 발현을 변화를 확인한 결과이다.
(B) Stat3와 우수한 친화도로 결합하는 바이오틴 표지 Stat 결합 프로브를 이용하여 카테콜을 처리한 핵 추출물에 결합하는 Stat3 DNA를 분석한 결과이다.
(C) 카테콜 처리시 Stat3 의존 루시퍼라제 활성 변화를 측정한 결과이다.
(D)는 카테콜 처리시 IL-6 분비의 변화를 확인하고자 맘모스페어 배양액의 IL-6 단백질 수준을 측정한 결과이다.
(E) 카테콜 처리시 자가 재생 유전자인 Nanog, Sox2 및 Oct4의 발현 변화를 확인한 결과이다.
(F) 카테콜의 맘모스페어 증식억제 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 아로니아 발효 배양액에서 에틸 아세테이트 추출물을 정제하는 방법을 묘사한 순서도이다.
도 8은 실리카 겔 크로마토그래피를 이용하여 아로니아 발효 배양액의 추출물에서 맘모스페어 형성 억제물질을 분리하는 1차 정제과정 및 1차 정제물의 TLC 결과이다.
도 9는 Sephadex LH-20 겔 크로마토그래피를 이용하여 아로니라 발효 배양액에서 맘모스페어 형성 억제물질을 분리하는 2차 정제과정 및 2차 정제물의 TLC 이미지이다.
도 10은 (A) preparatory TLC를 이용한 3차 정제 과정(빨간 화살표는 F4-3-1 밴드), (B) 3차 정제물(F4-3-1)의 TLC 분석 결과이며, (C) 3차 정제물(F4-3-1)의 맘모스페어 형성 억제를 확인한 결과이다.
도 11은 3차 정제물(F4-3-1)의 HPLC 크로마토그램 및 TLC 이미지이다.
도 12는 4차 분획물을 ¹H NMR, ¹³C NMR, COSY, HMBS 및 HMQC로 분석한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<A: 실험 재료 및 방법>

실시예 1: 시약

실리카겔 60A (35-75 micron) (ANALTECH, Newark, DE) 및 Sephadex LH-20 (25~100㎛) (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 컬럼 크로마토그래피에 사용하였다. 박막크로마토그래피(Thin-layer chromatography, TLC)는 Kieselgel 60 F254 플레이트(MERK, Darmstadt, Germany)를 사용하였고, TLC 전개용매는 클로로포름과 메탄올(15:1)을 이용하였으며, Spectroline UV 램프 (Westbury, NY, USA)를 사용하여 시각화하였다. 6- 및 24-웰의 조직 배양 플레이트는 코닝사(Corning)의 초저 부착 클러스터 플레이트(ultra-low attachment cluster plate)를 사용하였다. CellTiter 96^® 수성 일액형 세포 증식 검정 키트(Promega, WI, USA)를 사용하여 세포 생존력을 측정하였다. ALDEFLUOR™ 키트는 STEMCELL Technologies Inc.사에서 구입하였고, 카테콜 등 화학물질은 Sigma-Aldrich Co.사에서 구입하였다.

실시예 2: 식물 재료

대한민국, 제주도에서 재배한 아로니아는 도시 농부(대한민국, 제주, 서귀포)로부터 구입하였다. 아로니아 베리를 수돗물로 세척한 후 건조하여, 분쇄기(대한민국 서울, 한일)로 분쇄하였다. 바우처 표본(No. 2016_012)은 제주국립대학교 아열대/열대 생물 유전자 은행에 기탁되어 있다.

실시예3: 아로니아 분말을 이용한 유산균 배양 및 발효

락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus, ATCC 10863)는 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았다. 1 ml의 원액 배양물(stock cultures)은 25%(v/v) 글리세롤을 첨가한 락토바실리(Lactobacilli) MRS(de man, rogosa and sharpe) 배지(Difco, Detroit, USA)에 -80℃에서 보관하였다.

락토바실러스 람노서스는 200㎖의 멸균된 MRS 배지를 포함하는 1L 삼각 플라스크에서 150 rpm, 30℃ 및 37℃에서 24시간 배양하였다.

2%(w/v)의 아로니아 분말을 포함하는 MRS 배양액을 pH 6.5로 조정하고 멸균하였다. 전배양한 락토바실러스 람노서스 배양액을 2% 아로니아를 함유하는 멸균 MRS 배지에 넣고 37°C에서 150 rpm으로 2일 또는 5일간 배양하였다.

실시예 4-1: 아로니아 유산균 발효 추출물 및 HPLC분획물 제조

아로니아 발효에 의해 생성되는 유용물질을 확인하기 위하여, 아로니아 건조분말(1kg)은 락토바실러스 람노서스를 함유하는 MRS 배지(50L)에서 배양하고, 배양액을 원심 분리하였다. 배양액 50L를 에틸 아세테이트 50L로 추출하였다. 상기 에틸 아세테이트 추출물을 농축하고 100% 메탄올에 용해하여 HPLC를 수행하였다.

HPLC 분리를 위한 투여 부피는 500㎕이고 유동 속도는 5㎖/min이고 컬럼 온도는 실온이었으며, 흡광도는 220nm 및 254nm에서 측정하였다. 이동상은 물(A 용매) 과 메탄올(B 용매)을 이용하였으며, 구배용리에 있어서, 메탄올은 초기에 20%로 설정하고, 20분까지 메탄올 농도를 60%로 증가시키고, 40분까지 100%로 증가시켰다.

실시예 4-2: 아로니아 유산균 발효 추출물의 생체분석 유도 분리

도 1C 및 도 7에 생체분석-유도 분리 과정을 요약하였다. 먼저, 아로니아 건조분말(1kg)은 락토바실러스 람노서스를 함유하는 MRS 배지(50L)에서 배양하고, 배양액을 원심 분리하였다(도1 C의 단계1). 배양액 50L를 에틸 아세테이트 50L로 추출하였다(도1 C의 단계2). 상기 에틸 아세테이트 추출물을 농축하고 100% 메탄올에 용해하였다. 메탄올에 용해시킨 에틸 아세테이트 추출물의 농축물을 실리카겔 컬럼(25x350mm)으로 분리하였으며, 클로로포름-메탄올(15:1)로 용출하였다(도 8). 각 용출액을 박막 크로마토그래피(TLC)를 통해 관찰하였고, 7개의 1차 정제물(F1 내지 F7)을 수득하여(도1 C의 단계3) 맘모스페어(mammosphere) 형성 분석을 이용하여 검정하였다. 이중 1차 정제물 F4가 맘모스페어의 형성을 억제하였다. 따라서, 1차 정제물 F4를 Sephadex LH 20(20x400mm)을 이용하여 크로마토그래피 수행하였으며 용출용매로 100% 메탄올을 이용하였다(도 8). 각 용출액을 박막 크로마토그래피(TLC)를 통해 관찰하였고, 3개의 2차 정제물(F4-1 내지 F4-3)을 수득하여(도1 C의 단계4) 맘모스페어 형성 분석을 이용하여 검정하였다. 이중 2차 정제물 F4-3은 맘모스페어 형성을 크게 억제하였다. 따라서, 2차 정제물 F4-3을 예비 TLC(유리판, 20 x 20 cm)에 도포하여 TLC 유리 챔버를 이용하여 클로로포름-메탄올 용매(15:1)에 전개하였다. 전개 후, 플레이트를 제거하여 건조한 후, 자외선(UV 254nm 및 UV365nm)에서 형광으로 시각화하였다. 수술용 나이프를 이용하여 유리판에서 실리카 겔을 벗겨내어 각 밴드를 별도로 분리하고, 15 ml 코니컬 튜브에 수거하였다. 분리한 겔에 메탄올 5 mL로 넣고 혼합 후, 원심 분리하여 진공 건조하였다(도1 C의 단계5). 상기 겔에서 분리한 3차 정제물을 각각 분리하여 맘모스페어 형성 분석을 이용하여 검정하였다. 도 10의 붉은 화살표로 표시된 밴드에서 분리한 3차 정제물(F4-3-1)이 맘모스페어 형성 억제 활성을 가짐을 확인하였다.

따라서 활성을 확인한 상기 3차 정제물(F4-3-1)을 심팩(shim-pack) GIS-PREP-ODS, 10x250 mm C18 컬럼을 이용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 3차 정제물(F4-3-1)을 HPLC 분석하기 위해 0.2㎛ 실린지 필터로 여과하였다. HPLC 분리를 위한 투여 부피는 500㎕이고 유동 속도는 5㎖/min이고 컬럼 온도는 실온이었으며, 흡광도는 220nm 및 254nm에서 측정하였다. 이동상은 물(A 용매) 과 메탄올(B 용매)을 이용하였으며, 구배용리에 있어서, 메탄올은 초기에 20%로 설정하고, 20분까지 메탄올 농도를 60%로 증가시키고, 40분까지 100%로 증가시켰다. 4차 분획물은 HPLC 분석하여 220㎚에서 26분에 피크가 검출된 분획물을 이용하였다(도 1D, 도 11, 도1 C의 단계6).

실시예 5: 정제된 시료의 구조 분석

전기분무 이온화(ESI) 질량 스펙트럼을 QTRAP-3200 질량 분석기로 측정하였다(AppliedBiosystems, Foster City, Ca, USA). 핵 자기 공명 (NMR) 스펙트럼은 JEOL JNM-ECA600, 600 MHz FT-NMR Spectrometer에서 ¹H NMR에 있어서는 600 MHz 조건으로, ¹³C NMR에 있어서는 150 MHz 조건으로 CD3OD에서 수득하였다. 화학적 이동은 내부 표준 물질로서 테트라메틸실란을 이용하여 ppm(δ)로 표시하였다. NMR 스펙트럼에 있어서는, ¹H-¹H COSY, HMQC, HMBC 등 2차원 NMR뿐만 아니라 ¹H NMR, ¹³C NMR 등 1차원 NMR을 이용하였다.

실시예 6: 인간 유방암 세포의 배양과 맘모스페어의 형성

인간 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231를 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 얻었다. 10% 소태아 혈청(FBS; Hyclone), 100 U/㎖의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신(Hyclone)을 보충한 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Essential Medium; Hyclone, Logan, UT, USA)에서 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 성장시켰다. MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 37℃에서 5% CO2 습식 배양기에서 배양하였다. 세포를 10cm 배양 접시에 1x10⁶ 세포의 밀도로 플레이팅 하였다. 일차 맘모스페어를 형성하기 위해 단일 세포에 현탁한 MCF-7과 MDA-MB-231을 2 ml의 MammoCult™ 완전 배지를 포함하는 초저 부착 6-웰 플레이트에 3.5-4x10⁴ 및 0.5-4x10⁴ cells/well의 밀도로 접종하였다. MammoCult™ 완전 배지에 4μg/ml 헤파린, 0.48μg/ml 하이드로코르티손(Sigma-Aldrich), 100 U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신을 보충하였다. 세포를 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 7일간 배양하였다.

실시예 7: 맘모스페어의 자동 계수

배양 7일에, 세포 배양 플레이트를 스캐너에 배치하여 맘모스페어의 8 비트 그레이 스케일 사진을 얻었다(Epson Perfection V700 PHOTO, Epson, Tokyo, Japan). ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE에서 다운로드한 NICE 소프트웨어 프로그램을 이용하여 낮은 해상도(300 dpi) 사진을 로딩하였다. 계수를 위해, 원하는 수의 행렬(예컨대, 6-웰 플레이트에 있어서 2x3)을 선택하여 관심 영역 (ROIs)을 형성하고, NICE 프로그램의 타원형 설정을 선택한 후 구비된 ROI 형상을 움직이고 크기를 조절하여 ROI를 각각 정의하였다. 임계 알고리즘을 이용하여 사진의 배경 신호를 제거하고, 선택된 사진을 자동으로 계수하였다. 맘모스페어 형성 분석으로, 상술한 바와 같이 웰당 맘모스페어의 수/웰에 플레이팅된 전체 세포수 x 100에 대응되는 맘모스페어 형성 효율(MFE, 대조군의 %)을 결정한다.

실시예 8: 세포 증식 분석

CellTiter 96® 수성 원 솔루션 세포 증식 검정 키트(aqueous one solution cell proliferation assay kit)를 사용하여 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포의 증식 속도를 측정하였다. MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 카테콜(0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 및 0.7 mM)의 존재 하에 96-웰 플레이트에서 48시간 성장시켰다. 제조사의 프로토콜을 준수하였고, 490nm에서의 흡광도는 96-웰 플레이트 판독기(VersaMax ELISA Microplatee; Molecular Device, San Jose, Ca, USA)를 이용하여 측정하였다. 일련의 데이터는 각각 3회 측정하였다.

실시예 9: CD44 및 CD24 발현의 유동 세포 계측 분석

CD44 및 CD24의 발현은 MDA-MB-231 세포에서의 FACS 분석에 의해 결정했다. 1X 트립신/EDTA를 사용하여 세포를 수집하고 해리한 후, 백만 개의 세포를 현탁시키고 FITC-접합 항-인간 CD44 항체 및 PE-접합 항-인간 CD24 항체 (BD)로 표지하고, 4℃에서 30분간 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하여 유동 세포 계측기(BD, Accuri C6)로 분석하였다.

실시예 10: 실시간 PCR(RT-PCR)

제조사의 지시사항(Takara, Tokyo, Japan)에 따라 이중 나선 DNA 특이 염료로서 SYBR 그린을 이용하는 원스텝 SYBR PrimeScript RT-PCR 키트로 전사체 수준을 결정하였다. 반응마다 최종 부피 20 ㎕에 대하여, 총 RNA 1 μg, 2×원스텝 SYBR RT-PCR Buffer IV 10 ㎕, PrimeScript 1단계 Enzyme Mix II 1 μM, NANOG, OCT4, SOX2, β-액틴에 대한 PCR 순방향 프라이머 및 PCR 역방향 프라이머 10 μM를 사용하여 수행하였다.

상기 정방향, 역방향 프라이머는 다음과 같다.

NANOG 순방향 프라이머: ATGCCTCACACGGAGACTGT (서열번호 1)

NANOG 역방향 프라이머: AAGTGGGTTGTTTGCCTTTG (서열번호 2)

OCT4 정방향 프라이머: AGCAAAACCCGGAGGAGT (서열번호 3)

OCT4 역방향 프라이머: CCACATCGGCCTGTGTATATC (서열번호 4)

SOX2 정방향 프라이머: TTGCTGCCTCTTTAAGAGCTAGGA (서열번호 5)

SOX2 역방향 프라이머: CTGGGGCTCAAACTTCTCTC (서열번호 6)

β-액틴 정방향 프라이머: TGTTACCAACTGGGACGACA (서열번호 7)

β-액틴 역방향 프라이머: GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA (서열번호 8)

비교 CT법을 이용하여 표적 유전자의 상대적인 mRNA 발현 농도를 계산하였다. 적어도 3회의 독립적인 PCR 절차를 수행하여 통계 분석을 하였다. PCR 산물은 내부 대조군인 β-액틴 유전자로 표준화하였다.

실시예 11: ALDEFLUOR 분석

ALDEFLUOR 분석 시스템은 알데히드 탈수소효소(ALDH)의 활성을 바탕으로 CSC을 동정, 평가 및 분리하기 위한 새로운 방법을 제공한다. 활성 시약인 BODIPY-아미노아세트알데히드를 유방암 세포에 첨가하였고, 이는 알데히드 탈수소효소(ALDH)에 의해 형광성 BODIPY-아미노아세테이트로 변환되었다. 음성 대조군으로는 ALDH 저해제인 디에틸아미노벤즈알데히드(DEAB)를 사용하였다. MCF-7 세포는 100μM 카테콜로 24시간 동안 처리하였고, ALDH-양성 세포의 비율은 ALDEFLUOR 분석으로 분석하였다. ALDH-양성 및 음성 세포를 유동 세포 계측법 (Accuri C6)을 사용하여 분류하였다.

실시예 12: 웨스턴 블롯팅

카테콜(catechol)을 처리한 MCF-7 및 MDA-MB-231 맘모스페어에서 분리된 단백질을 10% SDS-PAGE에서 분리하고 폴리비닐리딘 디플루오라이드 막 (Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮겼다. 막은 PBS-Tween 20 (0.1%, v/v) 중 5% 탈지 분유로 30분간 실온에서 블로킹하였다. 블롯을 4℃에서 밤새 일차 항체와 함께 블로킹 용액 중에서 배양하였다. 사용한 일차 항체는 pERK, pc-Myc, Stat3, p65, lamin B, 및 phospho-Stat3이었다(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA). ERK 및 cMyc 항체는 Santa Cruz Biotechnology사 제품이었다. 로딩 대조군으로서 β-액틴 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA)을 이용하였다. PBS-Tween 20 (0.1%, v/v)으로 세척한 후, 블롯을 IRDye 800CW 및 IRDye 680RD 이차 항체로 배양하고, ODYSSEY CLx (LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA)를 사용하여 신호를 검출하였다.

실시예 13: 전기영동 이동성 이동 분석(Electrophoretic mobility shift assays, EMSA)

EMSA는 제조사 (Thermoscientific, Waltham, MA, USA)의 지침에 따라 EMSA 키트를 사용하여 검출하였다. Stat3 프로브 (5'-CTTCATTTCCCGGAAATCCCTA-Biotin3', 서열번호 9 및 5'-TAGGGATTTCCGGGAAATGAAG-Biotin 3', 서열번호 10)의 바이오틴-상부 및 하부 나선을 어닐링하고, 이중 나선 올리고뉴클레오티드는 말단에 바이오틴으로 표지하였다. 핵산 추출물은 상술한 바와 같이, MCF-7 및 MDA-231-MB 세포에서 준비하였다. 바이오틴이 표지된 DNA 프로브는 상온에서 20분간 1 ㎍/㎕ 폴리 [dI-dC]를 함유하는 최종 부피가 20 ㎕인 EMSA 완충 용액에서 카테콜 처리한 핵 단백질과 함께 배양하였다. 4℃에서 5% 폴리아크릴아미드, 0.5×TBE(45 mM 트리스 보레이트와 1 mM EDTA)를 함유하는 비변성 겔에서 전기 영동을 수행하고, 화학발광 핵산 검출 키트(Thermoscientific)를 사용하여 시각화하였다.

실시예 14: 일시적인 트렌스펙션(transfection) 및 리포터 유전자 분석

MDA-MB-231 유방암 세포를 5% CO2의 습한 대기 하에 37℃에서 10% 열-비활성화 소태아 혈청이 보충된 DMEM 배지(Dulbecco’s Minimum Essential Medium)에서 성장시켰다. MDA-MB-231 세포는 6-웰 디쉬에 0.3×10⁶ cells/well의 농도로 플레이팅하고, 형질 감염 후 밤새 배양하였다. 상술한 바와 같이, Lipofectamine 2000(Thermoscientific)을 이용하여 다양한 플라스미드를 동일한 몰 농도로 트렌스펙션시켰다. 6-웰 Lipofectamine 2000(Thermoscientific)을 사용하여 다양한 플라스미드를 동일한 몰량의 농도로 트렌스펙션시켰다. 요약하면, pStat3-LUC 프로모터의 루시퍼라제 분석을 위해 MDA-MB-231 세포에 첨가하기 전에 리포터 플라스미드 0.5 g을 Lipofectamine 2000 시약과 20분간 혼합하였다. 트렌스펙션 후 48시간 후에, 세포는 카테콜과 함께 성장시켰고, 인산 완충 식염수로 한번 세척하고, 용해 완충액(Promega)으로 용해하였다. 형질 감염 효율의 차이를 보정하기 위해, SV40 프로모터하에 β-갈락토시다제 유전자를 포함하는 1/5 몰비의 pCH110 (Amersham, City, State, USA)를 표준화를 위해 형질 감염에 도입하였다. 각 용해물의 루시페라제 및 갈락토시다제 활성을 제조자의 권장 사항에 따라 판단하였다 (각각 Promega 및 Tropics).

실시예 15: 작은 간섭 RNA (siRNA)

맘모스페어 형성에 Stat3가 미치는 효과를 판단하기 위해, MDA-MB-231 유래 맘모스페어를 인간 Stat3 siRNA(Bioneer, Daejeon, Korea)로 처리하였다. 후술하는 siRNA를 사용하였다: Stat3 siRNA (NM_1145658). 스크램블된 siRNA 대조군은 Bioneer사의 비표적 siRNA이다. siRNA의 형질 감염을 위해, MDA-MB-231 세포를 6-웰 플레이트에 24시간 동안 접종한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000 (Thermoscientific)을 사용하여 siRNA의 트렌스펙션을 수행하였다. Stat3 단백질 농도는 상술한 바와 같이 ant-Stat3을 사용하는 웨스턴 블롯으로 결정하였다.

실시예 16: 통계 분석

모든 데이터는 평균±표준 편차 (SD)로 나타내었다. 데이터는 Student’s t-test로 분석하였다. P값이 0.05 이하인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다 (GraphPad Prism 5 Software).

< B: 실험예> 유방암 줄기세포 및 유방암에 대한 효과 분석

실험예 1: 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 이용한 아로니아 발효에서 유래된 CSC 저해제의 분리

상기 실시예 4-1에서 2% 아로니아 분말을 포함하는 유산균 배양용 MRS 배지를 이용하여 L. rhamnosus를 배양하였다. 배양 전(0일), 2일 및 5일 배양한 배양액을 에틸 아세테이트(배양액: 에틸 아세테이트 = 1:1)을 이용하여 추출한 추출물의 HPLC크로마토그램의 프로파일을 확인하였다. 배양 전(0일)에서 존재하지 않던 두 개의 서로 다른 피크 A와 B를 확인하였다(도 1A).

유산균 발효에 의해 생성된 A 피크 및 B 피크 분획물을 사용하여 맘모스페어 형성 분석을 수행하였다. 상기 A 피크 분획물은 상기 실시예4-1에서 HPLC에 의해 분리된 메탄올 20% 분획물을 의미한다. 상기 B 피크 분획물 상기 실시예4-1에서 HPLC에 의해 분리된 메탄올 60% 분획물을 의미한다(실시예4-1).

분석결과, 상기 A 피크 분획물은 맘모스페어 형성 억제 효과가 미미하였으며, 상기 B 피크 분획물은 강한 맘모스페어 형성의 억제 효과를 보여주었다. 따라서 B 피크 분획물은 CSC 저해제를 포함하는 것으로 결론을 내렸다(도 1B).

또한, 유방 CSC 저해제를 스크리닝하기 위해 실시예4-2에서 생체분석 유도 분리(bioassay-guide isolation)를 수행하였다. 생체분석 유도 분리 과정은 도 1C 및 도 7에 요약하였다. 아로니아 유산균 발효 배양액의 에틸 아세테이트 추출물을 실리카겔, Sephadex LH 20, TLC 및 HPLC를 사용하여 분리하였으며, HPLC 및 TLC를 사용하여 최종 분획물을 확인하였다(도 1D 및 도 1E).

HPLC 분석결과, 실시예4-1의 B 피크 분획물와 실시예4-2의 생체분석 유도 분리를 통해 분리한 최종 분획물(4차 분획물)이 220㎚에서 동일한 피크가 검출되어 동일한 화합물을 포함함을 확인하였다.

실험예 2: 분리된 CSC 저해제(inhibitor)의 구조 결정

다음으로, 최종 분획물(4차 분획물)에서 분리된 화합물의 화학 구조를 질량 및 핵 자기 공명 측정법으로 판단하였다. ESI-질량 측정을 통해 활성 화합물의 분자량은 110로 결정하였고, 이는 m/z 109.0 [MH]-에서 유사분자 이온 피크를 나타내었다(도 2A). CD₃OD에서 측정된 ¹H NMR 스펙트럼은 벤젠 고리에 기인한 δ 6.75와 6.64에서 방향족 메틴 신호를 나타냈다. ¹³C NMR 스펙트럼에서는 δ 146.3, 120.9, 116.4에서 총 세 개의 탄소 피크가 자명하게 나타났다. 1H와 13C NMR 스펙트럼은 이 화합물이 대칭 구조를 갖고 있음을 암시한다. HMQC 스펙트럼은 자명하게 양성자 함유 탄소를 할당하고, HMBC는 δ 6.75 및 6.64에서의 메틴 양성자에서부터 δ 146.3에서 산소화된 sp² 4차 탄소까지 카테콜로 불리우는 1,2-디히드록시벤젠 화합물의 구조와 일치했다(도 12).

실험예 3: 카테콜의 유방암 세포의 증식 및 맘모스페어의 형성 억제

먼저 유방암 세포주인 MCF-7과 MDA-MB-231에 미치는 카테콜의 항증식 효과를 MTS 분석법으로 검사하였다. 카테콜 300μM이상의 농도로 48시간 처리시 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포의 증식이 억제되었다. 이러한 결과는 카테콜이 유방암 세포주 증식을 효과적으로 저해하는 것을 보여준다(도 3A).

카테콜이 맘모스페어의 형성을 억제할 수 있는지를 확인하기 위해서 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포에서 유래한 일차 맘모스페어에 카테콜을 처리하였다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, 카테콜은 유방암 세포주에서 유래된 일차 맘모스페어의 형성을 억제하였으며, 맘모스페어의 수를 90%로 감소시켰을 뿐만 아니라, 맘모스페어의 크기도 감소시켰다.

실험예 4: 카테콜 처리에 따른 CD44 ^high /CD24 ^low 발현 모집단과 ALDH 양성 유방암 세포의 비율 감소

MDA-MB-231 세포는 카테콜로 24시간 처리하고, 유방암 세포에서 CD44 ^high/CD24^low 발현 모집단을 확인하여 카테콜의 CSC 저해제의 효과를 조사하였다. 카테콜은 유방암 세포의 CD44^high/CD24^low 발현 모집단을 감소시켰다(도 4A). MDA-MB-231 세포는 카테콜로 24시간 처리하고, ALDEFLUOR 분석을 수행하여 카테콜이 ALDH 양성 유방암 세포의 비율에 미치는 영향을 조사하였다. 카테콜은 ALDH 양성 유방암 세포의 비율을 1.4%에서 0.5%로 감소시켰다(도 4B).

실험예 5: 유방암 줄기세포에서 ERK, c-Myc 및 Stat3 단백질의 발현 수준에 미치는 카테콜의 효과

ERK2는 카테콜의 직접적인 표적이고, 카테콜은 폐암 세포의 ERK를 직접 표적으로 하여 c-Myc 분해를 유도하는 것이 알려져 있다. 따라서 카테콜의 표적을 확인하기 위해, 유방 CSC의 ERK와 c-Myc의 발현 수준을 확인하였다. 카테콜은 ERK, pERK, c-Myc, 및 p-c-Myc의 수준을 변화시키지 않았다(도 5A). 카테콜 조절 단백질을 찾기 위해 카테콜 처리 후 Stat3 발현을 확인하였다. 카테콜은 유방 CSC에서 Stat3의 단백질과 전사체의 발현을 감소하였다(도 5B 및 도 5C).

실험예 6: Stat3의 CSC 형성의 저해 효과

CSC 생존 인자인 Stat3의 기능을 확인하기 위해 Stat3의 siRNA 유도 사일런싱(siRNA-inducing silencing)의 기능을 조사하였다. siRNA-Stat3은 MDA-MB-231 세포에서 맘모스페어의 형성을 감소시키는 것을 확인하였다(도 5D). 또한, Stat3 특이 저해제인 S31-201(100μM)을 처리하면 유방 CSC에서 농도 의존적으로 맘모스페어 형성을 저해하는 것을 확인하였다(도 5E). 결론적으로, Stat3가 CSC 형성을 저해하는 것을 확인하였다.

실험예 7: 맘모스페어에서 카테콜의 Stat3 신호 경로 및 IL-6 분비 억제

카테콜의 세포 기능을 조사하기 위해 카테콜 처리 하에 맘모스페어가 유도된 MDA-MB-231 세포에서 Stat3/IL-6 경로를 조사하였다. 카테콜은 대조군에 비해 핵 Stat3 단백질의 인산화를 감소시켰다. 그러나, 카테콜은 핵 p65의 단백질 수치를 낮출 수 없었다(도 6A).

또한, Stat3와 우수한 친화도로 결합하는 바이오틴 표지 Stat 결합 프로브를 이용하여 카테콜 처리한 핵 추출물에 결합하는 Stat3 DNA를 분석하였다. 도 6B에 나타낸 바와 같이, 카테콜은 Stat3의 바이오틴 표지 Stat 프로브와의 결합성을 저해하였다(도 6B, lane 3). pStat3/바이오틴 표지 Stat 프로브의 특이성은 표지되지 않은 과량의 자기 경쟁물질(도 6B, Lane 4)과 돌연변이 Stat 경쟁물질을 사용하여 확인하였다(도 6B, Lane 5).

pStat3LUC 리포터를 이용하여 카테콜 처리 후 Stat3의 전사 활성을 조사하였다. 카테콜은 Stat3 의존 루시퍼라제 활성을 감소시켰다(도 6C). 분비된 IL-6는 맘모스페어 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 분비된 IL-6의 생성을 확인하기 위해서 IL-6 항체를 사용하여 맘모스페어 배양액의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯에서 카테콜 처리 후, 분비된 IL-6의 생성 수치를 낮추는 것을 확인하였다. 내부 대조군은 카테콜을 처리하거나 미처리 상태의 맘모스페어의 수를 계수하는 데 사용되었다(도 6D).

이러한 데이터는 Stat3 신호 경로가 맘모스페어의 성장 및 자가 재생의 조절에 중요하고, 카테콜은 STAT3/IL-6 신호 경로를 통해 맘모스페어의 자가 재생 (self-renewal)을 억제하는 것을 시사하였다.

실험예 8: 카테콜의 CSC의 자가 재생 유전자 발현 및 맘모스페어의 증식 억제

카테콜이 자가 재생 유전자의 발현을 저해하는지 여부를 조사하기 위해서 실시간 PCR을 이용하여 자가 재생 유전자 발현을 조사하였다. 카테콜은 유방 CSC에서 Nanog, Sox2 및 Oct4와 같은 자가 재생 유전자의 발현을 감소시켰다(도 6E). 카테콜이 맘모스페어의 증식을 저해하는지를 확인하기 위해 맘모스페어를 카테콜로 처리하였고, 맘모스페어의 수를 측정하였다. 카테콜은 맘모스페어의 세포 사멸을 유도하고, 카테콜을 처리한 맘모스페어에서 적은 세포수가 관찰되었다. 이 결과는 카테콜이 유방암 줄기세포 증식의 현저한 감소를 초래하는 것을 확인하였다(도 6F). 이 결과는 카테콜이 CSC의 줄기성(stemness)과 증식을 억제함을 시사한다.

<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> The manufacturing method of composition inhibiting and preventing the growth of cancer stem cells comprising the fermented extract of aronia, and the composition <130> DP20180048 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG forward primer <400> 1 atgcctcaca cggagactgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG reverse primer <400> 2 aagtgggttg tttgcctttg 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 forward primer <400> 3 agcaaaaccc ggaggagt 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 reverse primer <400> 4 ccacatcggc ctgtgtatat c 21 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 forward primer <400> 5 ttgctgcctc tttaagagct agga 24 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 reverse primer <400> 6 ctggggctca aacttctctc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 7 tgttaccaac tgggacgaca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 8 ggggtgttga aggtctcaaa 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotin-upper strand of Stat3 probe <400> 9 cttcatttcc cggaaatccc ta 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotin-lower strand of Stat3 probe <400> 10 tagggatttc cgggaaatga ag 22

Claims (10)

1. 아로니아를 유산균으로 발효시켜 발효 배양액을 제조하는 1단계;
   상기 발효 배양액을 에틸아세테이트로 추출하여 추출물을 제조하는 2단계; 및
   상기 추출물에 60% 메탄올을 가하여 아로니아 발효 추출물의 60% 메탄올 분획물을 제조하는 3단계를 포함하는 유방암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 약학 조성물의 제조방법으로서,
   상기 유산균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)이고,
   상기 60% 메탄올 분획물은 카테콜을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 약학 조성물의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 발효 배양액을 제조하는 단계는 30 내지 37℃에서 1일 내지 6일간 발효되는 것을 특징으로 하는, 유방암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 약학 조성물의 제조방법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항의 제조방법에 의해 제조된, 유방암 줄기세포 성장 억제 또는 예방용 약학 조성물.
7. 삭제
8. 제6항의 조성물을 포함하는, 유방암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
9. 삭제
10. 삭제

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