KR20170061756A

KR20170061756A - 항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물의 제조방법 및 그렇게 제조된 발효 용담 추출물

Info

Publication number: KR20170061756A
Application number: KR1020150166343A
Authority: KR
Inventors: 신흥묵; 소재현; 임유미; 이한샘; 천소현; 김민아; 김진희; 박정은; 손은경
Original assignee: 재단법인 한국한방산업진흥원
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2017-06-07

Abstract

본 발명은 항산화 및 항염증 활성을 증가시킨 발효 용담 추출물의 제조방법과 그렇게 제조된 항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물에 관한 것이다. 본 발명에서는 용담 추출물을 얻는 단계와; 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 배양시킨 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 방치한 다음 여과 및 원심분리시켜 상등액인 미생물 조효소액을 얻는 단계와; 상기 용담 추출물에 상기 미생물 조효소액을 가하고 30~42℃에서 1~24시간 발효시켜 발효 용담 추출물을 얻는 단계;를 포함하는, 항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물의 제조방법이 제공된다. 본 발명은 일반적인 용담 추출물에 본 발명에 따른 미생물 조효소액 처리를 통해, 항산화 및 항염증 활성이 크게 증가된 생물전환 발효 용담 추출물을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물은 기능성식품의 원료로 활용될 수 있다.

Description

항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물의 제조방법 및 그렇게 제조된 발효 용담 추출물 {Method of preparing fermented extract of Gentiana scabra having increased antioxidant and anti-inflammatory activity, and the fermented extract}

본 발명은 항산화 및 항염증 활성을 증가시킨 발효 용담 추출물의 제조방법과 그렇게 제조된 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 용담 추출물에 관한 것이다.

용담(Gentiana scabra Bunge)은 용담과에 속하는 다년생 초본으로 간경, 담경 및 위경에 작용한다고 알려져 있다. 용담은 다양한 종류의 알칼로이드를 함유하고 있으며 gentiopicrin 및 sweroside, swertiamarin, amaroswerin, amarogentin 등의 성분을 포함하고 있다. 약리 작용으로는 항균, 소염 작용, 면역증강 작용, 간기능 보호 작용, 이담 작용 등이 있다고 알려져 있다[1].

한편, 흡연 및 음주 등에 의해 유발되는 산화 스트레스(Oxidative stress)는 세포 사멸뿐만 아니라 염증 반응의 개시 등 인체에 유해한 질병들을 야기시킨다고 알려져 있다[2]. 체내 산화 스트레스가 증가하게 되면 염증 반응이 촉진되고 이는 다양한 만성 질환으로 이어지는데 항산화 효과가 뛰어난 성분의 섭취는 이러한 산화 스트레스를 감소시키고 만성적인 염증 반응 또한 저하된다고 보고되고 있다[3]. 염증 반응이 만성적으로 일어나게 되면 염증 매개 물질이 과도하게 분비 되고 그 결과 암세포의 성장 촉진, 인슐린 저항성 증가, 동맥경화 유발 등의 다양한 병리학적 기전을 초래한다고 보고되어 있다. 염증 반응에 관여하는 macrophage는 cytokine 등에 의해 활성화되며 pro-inflammatory cytokine, nitric oxide (NO) 등을 생성하여 통증, 부종, 열 등의 염증 반응과 함께 염증 부위로 면역세포의 이동을 촉진시킨다. NO synthase (NOS)에 의해 L-arginine 으로부터 생성되는 NO는 반응성이 높은 물질로 세포 매개성 면역 반응 및 혈관 이완 등에 작용하며, 크게 constitutive NOS와 inducible NOS (iNOS) 두 가지로 나누어진다[3, 4]. 특히, 대식 세포가 LPS로 자극 받으면 iNOS 발현이 증가되고 활성화된 대식 세포는 interleukin (IL)-1β, IL-6 및 IL-10, tumor necrosis factor-α (TNF-α)와 같은 pro-inflammatory cytokine과 prostaglandin E₂ (PGE₂) 등을 생산하게 되어 염증 반응을 야기시킨다[4]. 지금까지 개발된 항산화 및 항염증제는 실험 동물에서 간, 폐, 신장 등에 영양을 주어 신장염 및 심장 질환 등을 초래하는 안전성 문제로 인해 사용이 일부 제한되어 있으며 따라서 보다 안전한 천연 물질을 탐색하는 연구가 활발히 이루어지고 있다[5].

생물전환(bioconversion)이란 생물공정(bioprocessing), 생합성(biosynthesis) 그리고 생촉매(biocatalysis) 등의 용어로 불리며, 미생물을 이용하여 전구물질로부터 새로운 산물을 제조하는 기술을 말한다. 상대적으로 간단한 원료 물질에서 출발하는 발효 공정과는 달리 생물전환 공정은 미생물 또는 효소 기질에 대한 특이성을 이용하여 전구 물질로부터 원하는 산물을 생산한다는 점에서 차이를 보이고 있다. 따라서 생물전환 공정은 발효 기술을 고도화시킨 에너지 절약형의 첨단기술 분야로 특히, 의약품이나 화장품의 개발에 여러 가지 방법으로 이용되어 제품의 유용성 및 효과성을 향상시키는데 기여할 수 있는 것으로 알려져 있다[6].

대한민국 등록특허공보 10-0593511 대한민국 공개특허공보 10-2014-0147482 대한민국 공개특허공보 10-1997-0021020 대한민국 공개특허공보 10-2013-0039309

1. Choi, H. W., In, M. H., Mun, Y. J., Lim, K. S. and Woo. W. H. 2015. Study on pharmacological activation as cosmetic material of Gentianae scabrae bunge extract. J Physiol & Pathol Kor Med 29(3), 223-229. 2. Lee, S. G., Jeong, H. J., Lee, E. J., Kim, J. B. and Choi, S. W. 2011. Antioxidant and anti-inflammatory activities of ethanol extracts from medicinal herb mixtures. Kor J Food Sci Technol 43(2), 200-205. 3. Kim, Y. S., Lee, S. J., Hwang, J. W., Kim, E. H., Park, P. J. and Jeong, J. H. 2012. Anti-inflammatory effects of extracts from Ligustrum ovalifolium H. leaves on RAW 264.7 macrophages. J Kor Soc Food Sci Nutr 41(9), 1205-1210. 4. Bae, G. S., Park, H. J., Kim, D. Y., Seo, S. W., Park, K. B., Kim, B. J., Song, J. M., Lee, K. Y. Na, C., Shin, B. C., Park, S. J., Song H. J. and Hwang, S. Y. 2008. Inhibitory effect of extract of Teucrium veronicoides on the production of inflammatory cytokines. Kor J Herb 23(3), 119-125. 5. Kim, C. H., Lee, M. A., Kim, T. W., Jang, J. Y. and Kim, H. J. 2012. Anti-inflammatory effect of Allium hookeri root methanol extract in LPS-induced RAW 264.7 cells. J Kor Soc Food Sci Nutr 41(11), 1645-1648. 6. Cho, Y. H., Cho, J. S. and Lee, G. W. 2011. Antioxidant activity of wood vinegar by bioconversion. J Kor Academia-Industrial Cooperation Soc 12(10), 4434-4442. 7. Blois, M. S. 1958. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 26, 1198-1200. 8. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M. and Rice-Evans, C. 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology & Med 26(9), 1231237. 9. Park, S. C. and Son, D. Y. 2011. Inhibitory effects of Euphorbia supina Rafin on the production of pro-inflammatory mediator by LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. J Kor Soc Food Sci Nutr 40(4), 486-492. 10. You, K. S., Bang, C. S., Lee, K. J., Ham, I. H. and Choi, H. Y. 2011. Anti-inflammatory effects of Chrysanthemum boreale flower. Kor J Herb 26(4), 31-37. 11. Jeoung, Y. J., Choi, S. Y., An, C S., Jeon, Y. H., Park, D. K. and Lim, B. O. 2009. Comparative effect on anti-inflammatory activity of the Phellinus linteus and Phellinus linteus grown in germinated brown rice extracts in murine macrophage RAW 264.7 cells. Kor J Med Crop Sci 17(2), 97-101. 12. Heo, S. J., Yoon, W. J., Kim, K. N., Ahn, G. N., Kang, S. M., Kang, D. H., Affan, A., Oh, C., Jung, W. K. and Jeon, Y. J. 2010. Evaluation of anti-inflammatory effect of fucoxanthin isolated from brown algae in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages. Food and Chem Toxi 48, 20452051. 13. Goupy, P., Dufour, C., Loonis, M. and Dangles, O. 2003. Quantitative kinetic analysis of hydrogen transfer reactions from dietary polyphenols to the DPPH radical. J Agric Food Chem 51, 615-622. 14. Lee, J. M., Chang, P. S. and Lee, J. H. 2007. Comparison of oxidative stability for the thermally-oxidized vegetable oils using a DPPH method. Kor J Food Sci Technol 39, 133-137. 15. Lee, S. H., Kang, K. M., Park, H. J. and Baek, L. M. 2009. Physiological characteristics of medicinal plant extracts for use as functional materials in seasoning sauce for pork meat. Kor J Food Sci Technol 41(1), 100-105. 16. Jung, E. H., Hwang, I. K. and Ha, T. Y. 2010. Properties and antioxidative activities of phenolic acid concentrates of rice bran. Kor J Food Sci Technol 42(5), 593-597. 17. Kim, M. J., Lee, H. H., Seo, M. J., Kang, B. W., Park, J. U. and Jeong, Y. K. 2013. Antioxidation activities of organic solvent fractions obtained from seaweed Hizikia fusiformis. J Life Sci 23(3), 361-367. 18. Lowenstein, C. J. and Snyder, S. H. 1992. Nitric oxide, a novel biologic messenger. Cell 70, 705-707. 19. Sunyer, T., Rothe, L., Jiang, X., Anderson, F., Osdoby, P. and Collin-Osdoby, P. 1997. Ca2+ or phorbol ester but not inflammatory stimuli elevate inducible nitric oxide synthase messenger ribonucleic acid and nitric oxide (NO) release in avian osteoclasts: autocrine NO mediates Ca2+-inhibited bone resorption. Endocrinology 138, 2148-2162. 20. Kim, M. S., Jeong, J. S., Lee, H. Y., Ju, Y. S., Bae, G. S., Seo, S. W., Cho, I. J., Park, S. J. and Song, H. J. 2011. The anti-inflammatory effect of Achyranthes japonica on lipopolysaccharide-induced inflammatory activity in murine macrophages. Kor J Herb 26(2), 51-57.

본 발명에서는 용담 추출물에 대해 미생물 조효소액의 처리를 통해 생리활성을 높이는 방법과 그렇게 얻어진 생리활성이 높은 발효 용담 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해 본 발명에서는 먼저 식품 미생물 유래의 조효소액을 만들고, 이를 용담 추출물에 처리한 후 변화되는 성분 및 처리 전후의 free radical 소거 활성 및 lipopolysaccharide (LPS)로 염증을 유도하여 활성화된 RAW 264.7 대식세포에서 NO의 생성 억제 및 염증 관련 단백질 발현에 미치는 영향 등을 확인함으로써 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 용담 추출물을 제공하고자 한다.

본 발명에서는,

용담 추출물을 얻는 단계와;

아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시켜 얻은 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 0~10℃에서 1~24 시간 방치한 다음 여과 및 원심분리시켜 상등액인 미생물 조효소액을 얻는 단계와;

상기 용담 추출물에 상기 미생물 조효소액을 가하고 30~42℃에서 1~24시간 발효시켜 발효 용담 추출물을 얻는 단계;를 포함하는, 항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물의 제조방법이 제공된다.

본 발명에서 상기 용담 추출물은 한약재로 판매되는 용담을 용매로 추출하여 얻을 수 있다. 상기 용매는 생약 추출용매로서 사용 가능한 용매면 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 에탄올 등을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 한약재로 판매되는 용담 500 g에 대해 3.5 L의 70% EtOH을 가하고 3시간씩 2회 반복 환류 추출하여 얻었다. 이렇게 얻어진 추출물을 그대로 다음 단계에서 이용하거나, 또는 이 추출물을 여과한 후 감압 농축하였다가 사용 시 증류수에 2~20배 정도로 희석하여 사용할 수 있다.

아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)는 백색 또는 담황색을 나타내어 일명 백국균(흰색 누록곰팡이)으로도 명명되는 곰팡이 균이다. 당화효소 뿐만 아니라 유기산도 생산하기 때문에 코지(koji) 제조에 용이하고 술덧의 pH를 산성으로 만드는 균이며 최적 생육온도는 30℃ 정도로 알려져 있다. 주류 제조 등에 많이 사용되는 균으로서 시판되는 균주를 구입하여 사용할 수도 있으며, 식품으로부터 직접 분리하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 실시예에서는 된장으로부터 직접 분리한 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 이용하였다.

본 발명에서 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)로부터 미생물 조효소액을 얻는 과정은, 먼저 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시키며, 바람직하게는 3~7일 정도 배양시킨다. 이렇게 배양시켜 얻어진 배양체, 즉 배양된 아스퍼질러스 카와치와 배지 성분을 모두 포함하는 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 0~10℃에서 1~24 시간 방치한다. 이때 인산나트륨 완충용액은 1~1,000 mmol의 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 50~500 mmol, 더욱 바람직하게는 100±50 mmol의 pH 7인 것을 사용한다. 상기 완충용액을 가한 후 더욱 바람직하게는 4℃ 정도에서 1~12시간, 특히 바람직하게는 5±1 시간 정도를 방치한다. 그런 다음 여과 및 원심분리시켜 상등액을 얻는데, 이 상등액이 바로 본 발명의 미생물 조효소액이다. 이렇게 얻어진 본 발명의 조효소액에는 각종 당가수분해 효소가 함유되어 있으며, 그 중에서도 β-glucosidase 활성이 주를 이루게 된다.

상기와 같이 얻어진 미생물 조효소액을 상기에서 얻은 용담 추출물에 가하고 일정온도에서 일정시간 반응시키면, 목적물, 즉 미생물 조효소액으로 처리된 발효 용담 추출물을 얻을 수 있다. 이때 미생물 조효소액을 용담 추출물에 가한 후 바람직하게는 30~42℃에서 1~24시간 반응시키며, 더욱 바람직하게는 37±2℃에서 10±2 시간 정도 반응시킨다. 이렇게 하면, 미생물 조효소액으로 처리된, 본 발명의 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 용담 추출물이 얻어진다.

또한, 본 발명에서는,

상기와 같은 제조방법으로 얻어진, 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 용담 추출물이 제공된다.

본 발명에 따라 얻어진 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 용담(Gentiana scabra Bunge) 추출물은, 용담 추출물에 대하여 된장으로부터 분리된 미생물 (Aspergillus kawachii) 조효소액을 처리하여 생물전환을 통해 생성된 것으로서, 용담의 발효 추출물의 분획물에 대해 항산화 및 항염증 효과를 비교하고 분석하였을 때 큰 활성 증가 및 새로운 성분의 생성이 확인되었다.

또한, 본 발명에서는 상기 항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품을 제공한다. 본 발명의 실험결과를 토대로 항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물은 각종 기능성식품 및 건강식품의 원료로 이용될 수 있다. 이하 본 발명에서 "기능성 식품"은 기능성식품, 건강식품 및 건강기능성 식품을 모두 포함하는 의미로 정의된다.

본 발명은 일반적인 용담 추출물에 본 발명에 따른 미생물 조효소액 처리를 통해, 항산화 및 항염증활성이 크게 증가된 생물전환 발효 용담 추출물을 제공한다. 본 발명에 따른 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 용담 추출물은 기존 용담 추출물에 비해 큰 항산화 및 항염증 효과를 기대할 수 있으므로, 기능성식품의 원료로 활용될 수 있다.

도 1은 용담 EtOAc 분획물의 생물전환 전, 후 UPLC chromatogram 이다. (A)는 UV 280 nm 효소 처리된 EtOAc fraction이고, (B) UV 280 nm 효소 처리되지 않은 EtOAc fraction이다. 빨간 화살표는 새로운 피크를 나타낸다.
도 2는 용담의 생물전환 전, 후 DPPH radical 소거 활성이다. All data are presented as means±SD. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 compared to control. # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001 compared to bioconversion of EtOAc fraction. ¹⁾ enzyme(+): Treated enzyme. ²⁾ enzyme(-): Untreated enzyme.
도 3은 용담의 생물전환 전, 후 분획물의 ABTS radical 소거 활성이다. All data are presented as means±SD. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 compared to control. # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001 compared to bioconversion of EtOAc fraction. ¹⁾ enzyme(+): Treated enzyme. ²⁾ enzyme(-): Untreated enzyme.
도 4는 MTT assay를 이용한 용담의 RAW 264.7 세포에 대한 세포 독성을 측정한 결과이다. All data are presented as means±SD. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 compared to control. # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001 compared to bioconversion of EtOAc fraction. ¹⁾ enzyme(+): Treated enzyme. ²⁾ enzyme(-): Untreated enzyme.
도 5는 NO 생성에 대한 용담의 효과를 분석한 결과이다. All data are presented as means±SD. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 compared LPS group. # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001 compared to bioconversion of EtOAc fraction. ¹⁾ enzyme(+): Treated enzyme. ²⁾ enzyme(-): Untreated enzyme.
도 6은 용담의 iNOS 및 p-Erk/Erk 발현을 분석한 결과이다. All data are presented as means±SD. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 compared to LPS group. # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001 compared to each concentration of EtOAc fraction. ¹⁾ enzyme(-): Untreated enzyme. ²⁾ enzyme(+): Treated enzyme.
도 7은 LPS로 유도된 IL-6 및 IL-1β 생성에 있어서 용담의 억제 효과를 mRNA 발현양을 통해 분석한 결과이다. All data are presented as means±SD. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 compared to LPS group. # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001 compared to each concentration of EtOAc fraction. ¹⁾ enzyme(-): Untreated enzyme. ²⁾ enzyme(+): Treated enzyme.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[재료 및 방법]

1. 조효소액의 제조

밀기울 10 g에 증류수 10 mL를 가하여 121℃에서 15분간 고압증자한 후, 된장으로부터 분리한 Aspergillus kawachii 균주를 접종하여 30℃에서 3일간 배양하였다. 그 후 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)를 100 mL 넣고 4℃에서 18시간 방치한 다음 여과하였다. 여과액은 10,000 rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 Aspergilius 조효소액으로 사용하였다.

2. 시료 추출 및 효소 처리

용담 500 g을 70% EtOH로 3시간씩 총 2회 환류추출한 다음 감압진공농축기를 사용하여 40℃에서 농축하였다. 증류수와 현탁한 농축물에 Aspergillus 조효소액을 가하여(1:1, v/v), 30℃에서 18시간 동안 반응시켰고, n-haxane (H), ethyl acetate (EtOAc), butanol (Bu)을 이용하여 순차적으로 계통 분획하였다. 각각의 분획층을 여과하여 감압 농축한 후 본 실험에 사용하였다.

3. UPLC chromatogram 분석 조건

UPLC 분석은 Waters ACQUITY Ultra Performance LC systems를 사용하였으며, 컬럼은 Acquity UPLC C18 (2.1 x 100 mm)을 이용하여 분석하였다. 각각의 분석 조건은 아래 표 1과 같다.

[표 1]

4. DPPH radical scavenging activity 측정

DPPH radical 소거 활성은 Blois [7]의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 150 mM DPPH 190 μL에 시료 2 μL와 DMSO 8 μL를 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 반응액을 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

[식 1]

DPPH radical scavenging activity (%) =

5. ABTS radical scavenging activity 측정

7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 2:1(v/v)로 혼합하여 12-16시간 동안 방치시킨 후, 5 mM phosphate buffer (pH 7.4)를 혼합하여 734 nm에서 흡광도가 0.7±0.02가 되도록 ABTS radical cation solution을 제조하였다. Solution 198 μL에 시료 2 μL를 혼합하여 1분 동안 반응시켰으며, 반응액은 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 용담의 ABTS 소거 활성은 다음의 식 2에 의해 계산하였다[8].

[식 2]

ABTS radical scavenging activity (%) =

6. 세포배양 및 처리

마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB 40071)에서 분양받아 사용하였다. Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 10% inactivated fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 배지를 배양액으로 CO₂ incubator 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

7. 세포독성측정

세포에 대한 독성 측정은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 측정으로 분석하였다. 96 well plate에 5×10⁴ cells/well의 RAW 264.7 세포를 분주하여 24시간 배양한 후에, 시료를 농도별(10, 25, 50, 100 ppm)로 처리하여 24시간 배양 하였다. Well 당 100 μL의 MTT solution을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 반응시킨 후, 575 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성은 세포만 배양한 무처리군의 생존도 100%를 기준으로 시료처리군의 상대적인 세포 생존도를 계산하였다[9].

8. NO production 측정

RAW 264.7 세포로 부터 생성되는 NO의 양을 세포 배양액 중 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 Griess reagent 반응법을 이용하여 측정하였다. 즉, 96 well plate에 5×10⁴ cells/well RAW 264.7 세포를 분주하여 24시간 배양한 후에 다양한 농도(10, 25, 50, 100 ppm)의 시료를 30분간 전처리한 다음, LPS (1 μg/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액에 동일한 양의 Griess 시약(1% sulfanilamide/0.1% NED in 5% H₃PO₄)을 넣은 후 각 10분간 반응시켜 540 nm 흡광도에서 측정하였다[9].

9. Western blot 분석

Raw 264.7 세포를 100 mm dish에 5×10⁶ cells/dish로 분주한 다음 24시간 배양하였다. 배양액에 용담의 생물전환 전, 후 EtOAc 분획물을 50, 100 ppm 농도로 처리하고 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 시료를 처리한 세포를 모아 PBS로 1회 씻어낸 후 4℃에서 12,000 rpm으로 1분간 원심분리 하였다. 상등액을 버린 후 Pro-prep 시약 400 μL를 가하여 -20℃에서 30분간 방치한 뒤 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 세포 내 단백질 용액을 BCA protein assay kit (Thermo, USA)를 사용하여 단백질 농도를 정량하고 loading buffer와 혼합하여 95℃에서 5분간 가열한 후 -20℃에서 보관하였다. 완성된 sample은 10% SDS acrylamide gel에서 전기영동 시킨 후 PVDF membrane으로 단백질을 transfer시켰다. Transfer가 끝난 membrane은 5% skim milk 용액으로 실온에서 1시간 blocking 시킨 후, β-actin, iNOS, Erk primary antibody를 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. TBST로 10분씩 3회 세척한 후, rabbit secondary antibody를 1시간 동안 상온에서 배양시켰다. 다시 TBST로 10분씩 3회 세척한 후, ECL western substrate 용액과 1분간 반응시킨 후 현상하였고, Image J 1.48v (NIH, Bethesda, NC, USA)을 이용하여 정량하였다[10].

10. Reverse transcriptase(RT)-PCR

6 well에 1×10⁶ cells/well RAW 264.7 세포를 24시간 동안 배양한 후, 용담의 생물전환 전, 후 EtOAc 분획물을 50, 100 μg/mL 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. RNA를 분리하기 위해 Trizol reagent를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 즉, trizol 1 mL를 넣고 cell을 모은 다음 5분간 상온에서 방치시켰다. 그 후 chloroform 250 μL를 첨가하여 4℃, 10,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였으며 상등액을 취해 isopropanol 550 μL를 가하고 5분간 상온에서 방치시킨 후 4℃, 13,200 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 상등액을 제거한 후 75% EtOH in DEPC water 700 μL를 넣고 4℃, 9,500 rpm에서 5분간 원심분리 한 후에 DEPC water에 녹여 total RNA sample을 준비하였다. total RNA sample을 DEPC water로 20배 희석하여 PrimeScript^TM 1st strand cDNA synthesis kit (Takara, Japan)와 혼합한 후에 65℃에서 5분간 배양하고 얼음위에 방치시켰다. 그 후 42℃에서 45분, 95℃에서 5분 동안 PCR을 작동시켜 cDNA를 합성하였다. RT-PCR premix, antisense primer, cDNA를 넣어 최종부피가 50 μL가 되도록 한 후 RT-PCR을 수행 하였다. RT-PCR은 98℃에서 10분, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 과정을 30 cycle한 다음 1% agarose gel을 사용하여 100 volt에서 30분간 전기영동하여 UV에서 관찰하였다. β-actin의 유전자 증폭을 위하여 Forward primer: 5'-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3', Reverse primer: 5'-GGAGGAAGAGGATGCGGCAGT-3', iNOS는 Forward primer: 5'-C CCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3', Reverse primer: 5'-GGCTGTCAGAGCCTCGT GGCTTTGG-3', IL-6는 Forward primer: 5'-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3', Reverse primer: 5'-TGCTGGTGACAACCACGGCC-3', IL-1β는 Forward primer: 5'-CAGGATG AGGACATGAGCACC-3', Reverse primer: 5'-CTCTGCAGACTCAAACTCCAC-3'를 사용하였다[11, 12].

11. 통계처리

모든 실험결과는 평균±표준편차로 표기하였다. 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군간의 통계적 유의성 검증은 Student's t-test로 하였으며, P 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

[결과 및 고찰]

1. UPLC chromatogram

용담 EtOAc 분획물의 생물전환 전, 후 UPLC chromatogram은 도 1과 같다. 효소 처리하지 않은 대조군과는 달리 효소 처리한 용담의 EtOAc 분획물에서 새로운 peak (t_R, 5.00 min)가 매우 증가하는 양상을 보여 생물전환 전, 후의 peak pattern이 달라지는 것으로 나타났다.

2. DPPH radical scavenging activity

2, 2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH)는 간단하면서도 비교적 빠른 시간 내에 측정이 가능하여 항산화 측정에 널리 이용되고 있다[13]. DPPH는 짙은 보라색을 나타내는 안정한 free radical로 항산화 물질이 DPPH의 radical을 소거시켜 특유의 보라색을 탈색시키는데 항산화력이 강할수록 탈색되는 정도가 큰 것으로 알려져 있다[14, 15]. 용담의 생물전환 전, 후 DPPH radical 소거 활성은 도 2와 같으며 EtOAc 분획물에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다. 효소 처리하지 않은 EtOAc 분획물은 시료 농도별로 각각 13.54±0.55%, 18.85±0.35%, 25.02±0.71%, 30.87±1.55%의 활성을 보였으며, 효소 처리한 EtOAc 분획물은 각각 17.46±2.42%, 59.56±2.94%, 77.15±1.91%, 87.32±0.75%로 나타나 효소 처리 하지 않은 EtOAc 분획물보다 높은 활성을 보였다. 특히, 150 ppm 및 200 ppm에서 용담의 효소 처리 전 EtOAc 분획물보다 효소 처리 후 EtOAc 분획물이 50% 이상 높은 활성을 나타내 생물전환 후 DPPH radical 소거 활성이 크게 증가하는 것으로 나타났다.

3. ABTS radical scavenging activity

ABTS (2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)는 항산화 물질이 ABTS cation radical을 소거하여 탈색되는 정도를 측정하는 방법으로 free radical을 소거하는 DPPH와 달리 양이온을 제거한다는 차이를 보이며, 지용성 및 수용성 물질을 모두 측정할 수 있다[16, 17]. 용담의 생물전환 전, 후 분획물의 ABTS radical 소거 활성은 도 3과 같다. 생물전환 전 EtOAc 분획물은 농도별로 각각 17.01±0.96%, 20.77±2.61%, 43.99±0.64%, 75.95±2.42%로 나타났고 생물전환 후 EtOAc 분획물은 각각 20.38±0.67%, 27.57±1.06%, 64.22±0.96%, 94.43±0.15%로 나타나 생물전환 후 EtOAc 분획물의 활성이 더 높은 것으로 나타났다. 이는 DPPH radical 소거 활성과 비슷한 경향이었으며, 따라서 본 실험 결과 용담에 효소 처리를 하여 생물전환을 한 EtOAc 분획물이 효소처리 하지 않은 대조군 보다 더 높은 항산화력을 나타내는 것으로 사료된다.

4. 세포독성

MTT assay를 이용한 용담의 RAW 264.7 세포에 대한 세포 독성을 측정한 결과는 도 4에 나타내었다. 용담의 생물전환 전, 후 분획물을 농도별(10-100 ppm)로 처리한 결과 모든 농도에서 90% 이상의 높은 생존율을 보였으며, RAW 264.7 세포에 대한 독성을 나타내지 않은 것으로 확인되었다.

5. NO Production

NO는 L-arginine으로부터 생성되는 무기 유리체로 조직 손상 및 세포 독성 등 여러 가지 생물학적 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다[9, 11]. NO는 크게 endothelial NOS (eNOS), neuronal NOS (nNOS), inducible NOS (iNOS)의 세가지 합성 경로를 거치는데 특히 iNOS는 TNF-α, IL-1β, IFN-γ와 같은 염증성 자극에 의해 다량 유도되어 염증 반응을 일으킨다고 알려져 있다[9, 18, 19]. NO 생성에 대한 용담의 효과를 측정한 결과는 도 5와 같다. 생물전환 전 EtOAc 분획물은 10, 25, 50, 100 ppm 농도에서 각각 79.62±8.65%, 84.72±5.41%, 79.92±6.64%, 79.77±1.50%로 측정되었다. 반면, 생물전환 후 EtOAc 분획물은 농도별로 각각 51.65±3.57%, 45.66±4.76%, 20.15±7.31%, 5.85±7.62%로 나타나 NO 생성을 유의적으로 억제하였으며, 생물전환 전 EtOAc 분획물보다 높은 억제 효과를 나타내었다. 특히, 100 ppm에서는 LPS 처리군에 비하여 95%에 가까운 억제율을 나타내어 생물전환 후 NO 생성이 크게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

6. iNOS 및 p-Erk/Erk 발현

iNOS가 유도되면 장시간 동안 NO를 생성하게 되며 이렇게 생성된 NO는 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 등 인체에 유해한 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다[11]. 또한, LPS로 자극 될 경우 MAPK (mitogen activated protein kinases)가 활성화 되는데 이러한 MAPKs는 Erk (extracellular signalregulated kinase), JNK (c-jun-NH₂- terminal kinase), P38의 3가지로 정의되며, MAPKs의 신호경로들은 iNOS 및 염증성 세포활성물질 발현에 관여한다[20]. LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서 western blotting을 통한 용담의 iNOS 및 p-Erk/Erk 발현은 도 6과 같다. 50 ppm에서 용담의 생물전환 전, 후 EtOAc 분획물의 iNOS 발현양은 각각 1.25±0.01 및 0.77±0.01로 나타났으며, 100 ppm에서는 각각 0.76±0.01 및 0.65±0.01으로 나타나 생물전환 후에 iNOS 발현양이 감소하는 것으로 나타났다. p-Erk/Erk 발현양은 50 ppm에서 생물전환 전, 후 각각 0.81±0.03 및 0.55±0.01로 나타났으며 100 ppm에서 0.57±0.01 및 0.54±0.01로 나타나 iNOS와 마찬가지로 생물전환 후에 발현양이 감소하는 것으로 확인되었다. 본 연구 결과, 용담의 생물전환 후 EtOAc 분획물이 생물전환 전 보다 iNOS 및 p-Erk/Erk의 발현양을 저해시키는 것으로 나타났다.

7. iNOS, IL-6 및 IL-1β 발현

LPS로 자극되면 염증성 세포활성물질이 분비되고 활성화된 대식세포는 IL-6 및 IL-1β와 같은 pro-inflammatory cytokine을 생산하게 되며 cytokine의 과도한 발현은 인체질환을 악화시키는 원인이 된다고 보고되어 있다[20]. 따라서 iNOS, IL-6 및 IL-1β와 같은 염증매개물질을 억제시킨다면 각종 면역질환 등의 개선에 도움이 될 것으로 알려져 있다. LPS로 유도된 IL-6 및 IL-1β 생성에 있어서 용담의 억제 효과를 검증하기 위해 mRNA 발현양을 통해 검토하였으며, 결과는 도 7과 같다. 생물전환 전 용담의 iNOS 발현양은 50, 100 ppm에서 각각 1.14±0.03, 0.78±0.02로 나타났고 생물전환 후 용담의 iNOS 발현양은 농도별로 각각 0.77±0.02, 0.30±0.03으로 나타나 생물전환 전 보다 유의적으로 감소하였다. 생물전환 전 IL-6의 발현양은 농도별로 각각 0.60±0.02, 0.37±0.01로 나타났고 생물전환 후의 발현양은 0.54±0.02, 0.36±0.00으로 나타나 생물전환 후에 발현양이 억제된 것으로 나타났다. IL-1β의 발현양 역시 동일한 경향을 나타내었으며, 생물전환 전 농도별로 각각 0.77±0.00, 0.56±0.02, 생물전환 후 농도별로 각각 0.62±0.02, 0.29±0.01로 나타나 생물전환 후에 mRNA 발현양이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 본 실험 결과, 용담에 효소처리를 하여 생물전환을 한 EtOAc 분획물이 mRNA 수준에서 염증성 cytokine의 활성을 억제하는 것으로 나타났으며, 생물전환 전보다 억제율이 높은 것으로 확인되었다.

Claims

용담 추출물을 얻는 단계와;
아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시켜 얻은 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 0~10℃에서 1~24 시간 방치한 다음 여과 및 원심분리시켜 상등액인 미생물 조효소액을 얻는 단계와;
상기 용담 추출물에 상기 미생물 조효소액을 가하고 30~42℃에서 1~24시간 발효시켜 발효 용담 추출물을 얻는 단계;를 포함하는, 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 용담 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 용담 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는, 항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 인산나트륨 완충용액은 50~500 mmol인 것을 특징으로 하는, 항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조방법으로 얻어진, 항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물
제4항의 항산화 및 항염증 활성이 증가된 발효 용담 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품.