CN114931533A - 一种具有多重护肤功效的龙胆多组分组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具有多重护肤功效的龙胆组合物及其制备方法与应用，旨在提供一种具有多重护肤功效的龙胆多组分组合物，该组合物具有祛痘消肿，去屑抑菌，舒缓舒敏，晒后修复等功效；其技术方案包括丁二醇5‑25％，戊二醇4‑10％，氮酮1‑10％，龙胆提取物A，20‑30％，龙胆提取物B 10‑15％，余量为去离子；属于日化技术领域。

Description

一种具有多重护肤功效的龙胆多组分组合物及其制备方法与 应用

技术领域

本发明公开了一种组合物，具体地说，是一种具有多重护肤功效的龙胆多组分组合物，本发明还涉及组合物的制备方法及应用，属于日化领域。

背景技术

龙胆是常见的中药材，是龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag.龙胆Gentiana scabra Bge.三花龙胆Gentiana triflora Pall.或坚龙胆Gentiana rigescensFranch.的干燥根和根茎。前三种习称“龙胆”，后一种习称“坚龙胆”。春、秋二季采挖，洗净，干燥。

龙胆，苦，寒。归肝、胆经。清热燥湿，泻肝胆火。用于湿热黄疸，阴肿阴痒，带下，湿疹瘙痒，肝火目赤，耳鸣耳聋，胁痛口苦，强中，惊风抽搐。经典名方为龙胆泻肝汤，具有显著的保肝护肝功效。

作为经典药材，龙胆在传统皮肤外科应用较少，但近年来上海伽誉生物科技有限公司，广州伽能生物科技有限公司、广东迪美生物技术有限公司等企业、甚至集团规模伽蓝(集团)股份有限公司，完美世界控股集团有限公司，中国药科大学等纷纷发现了龙胆在敏感皮肤上具有一定的抗刺激效果，但是其存在活性物单一，功效单一，药材利用度不高，萃取设备和工艺复杂、制备成本高的问题。

此外，由于其活性物环烯醚萜苷的亲水性强，自身穿过皮肤屏障能力弱，为达到良好抗刺激效果，需要加大活性物添加量，这就造成了成本高、原料造成刺激、过敏等问题，严重限制了龙胆的化妆品领域的应用。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的是提供一种具有多重护肤功效的龙胆多组分组合物，该组合物具有祛痘消肿，去屑抑菌(马拉色菌)，舒缓舒敏，晒后修复等功效。

为解决上述技术问题，本申请提供的第一个技术方案为：

一种具有多重护肤功效的龙胆组合物，由以下质量百分比的组分制成：丁二醇5-25％，戊二醇4-10％，氮酮1-10％，龙胆提取物A，20-30％，龙胆提取物B10-15％，余量为去离子。

进一步的，上述的具有多重护肤功效的龙胆组合物，由以下质量百分比的组分制成：丁二醇10-15％，戊二醇6-8％，氮酮3-8％，龙胆提取物A，22-28％，龙胆提取物B11-13％，余量为去离子。

进一步的，上述的具有多重护肤功效的龙胆组合物，所述的龙胆提取物A通过下述步骤制备的：

将龙胆根茎切段后粉碎至40-60目粉末，以35％乙醇-20％乙酸铵水为萃取溶剂，料液比体积比1∶50-70，微波功率400-600W，萃取时长10-20min，萃取完成后静置10-20min，待分层，分别取下层乙酸铵水相和上层乙醇相；

取下层乙酸铵水相，真空减压浓缩至0.2g/mL浓度，以活化的AB-8树脂上样吸附，以纯水冲洗去除乙酸铵，冲洗至无色，以30％乙醇洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至1g/mL 得到龙胆提取物A。

进一步的，上述的具有多重护肤功效的龙胆组合物，所述的龙胆提取物B通过下述步骤制备的：

将龙胆根茎切段后粉碎至40-60目粉末，以35％乙醇-20％乙酸铵水为萃取溶剂，料液比体积比1∶50-70，微波功率400-600W，萃取时长10-20min，萃取完成后静置10-20min，待分层，分别取下层乙酸铵水相和上层乙醇相；

取上层乙醇相，加入0.2％活性炭煮沸30min，趁热抽滤2次，滤液真空减压浓缩至0.2g/mL，上大孔树脂，以纯水洗脱至无色，以60％乙醇洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至 1g/mL，得到龙胆提取物B。

进一步的，上述的具有多重护肤功效的龙胆组合物，所述的龙胆提取物A通过下述步骤制备的：

将龙胆根茎切段后粉碎至40-60目粉末，以35％乙醇(体积/体积)-20％乙酸铵水(体积/体积)为萃取溶剂，料液比体积比1∶60，微波功率500W，萃取时长15min，萃取完成后静置15min，待分层，分别取下层乙酸铵水相和上层乙醇相；

取下层乙酸铵水相，真空减压浓缩至0.2g/mL浓度，以活化的AB-8树脂上样吸附，以纯水冲洗去除乙酸铵，冲洗至无色，以30％乙醇洗脱，收集洗脱液；真空浓缩至1g/mL 得到龙胆提取物A。

进一步的，上述的具有多重护肤功效的龙胆组合物，所述的龙胆提取物B通过下述步骤制备的：

将龙胆根茎切段后粉碎至40-60目粉末，以35％乙醇(体积/体积)-20％乙酸铵水(体积/体积)为萃取溶剂，料液比体积比1∶60，微波功率500W，萃取时长15min，萃取完成后静置15min，待分层，分别取下层乙酸铵水相和上层乙醇相；

取上层乙醇相，加入0.2％活性炭煮沸30min，趁热抽滤2次，滤液真空减压浓缩至0.2g/mL，上大孔树脂，以纯水洗脱至无色，以60％乙醇洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至1g/mL，得到龙胆提取物B。

本发明提供的第二个技术方案是上述的具有多重护肤功效的龙胆组合物作为化妆品添加剂的应用；所述的添加量占化妆品总质量的0.1-20％。

本发明提供的第二个技术方案是上述的具有多重护肤功效的龙胆组合物的制备方法，依次包括下述步骤：

1)称取各个组分；

2)向龙胆提取物A、龙胆提取物B，加入丁二醇，戊二醇，氮酮，搅拌均匀，升温至60℃后继续搅拌10min，补足水分，分散均匀后过膜，即得。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：

1)本发明提供的技术方案提取物采用不同提取方法，解决单一植物提取物功能单一问题，充分利用植物原料成分的多样性，应用于同一化妆品中，使得提取物内组合物富含龙胆苦苷和龙胆黄酮、龙胆碱等等多种成分，功效范围广泛，具有祛痘消肿，去屑抑菌(马拉色菌)，舒缓舒敏，晒后修复等系列效果；温和、安全，适用于常规皮肤和敏感肌皮肤，经过了体外鸡胚测试和人体斑贴测试。

2)本发明提供的技术方案制备工艺巧妙；有效解决日化植物提取物制备工艺粗糙，活性物不清晰，萃取工艺无针对性等问题；采用微波双水相萃取工艺，节能，高效，省时，双水相萃取工艺较乙醇萃取成本低；且能分别收集水相和醇相，依据活性物相似相容特点，针对性富集目标成分，工艺设计针对性强；

3)本发明提供的技术方案剂型体系设计独特，使用方便，将活性物按比例组合为1个产品，便于添加，丁二醇加戊二醇体系承载力强，无活性物析出问题，且具有防腐效果，无防腐剂添加。

4)本发明提供的技术方案龙胆组合物内配制有独特设计的促渗剂组合物(氮酮加戊二醇)，能够针对性强化活性物经皮吸收，有效解决了活性物经皮渗透问题，强化活性物经皮功效，以较少用量及成本达到较好效果，有效解决活性物高成本。

附图说明

图1是龙胆提取物A色谱图；

图2是龙胆提取物B线性方程关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求保护范围内所做的非实质性改变，仍在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1

本发明提供的一种的具有多重护肤功效的龙胆组合物，包括下述重量百分比的组分：丁二醇10％，戊二醇6％，氮酮5％，龙胆提取物A 24％，龙胆提取物B12％，余量为去离子。

实施例2

本发明提供的一种的具有多重护肤功效的龙胆组合物，包括下述重量百分比的组分：丁二醇5％，戊二醇10％，氮酮8％，龙胆提取物A30％，龙胆提取物B15％，余量为去离子。

实施例3

本发明提供的一种的具有多重护肤功效的龙胆组合物，包括下述重量百分比的组分：丁二醇25％，戊二醇4％，氮酮6％，龙胆提取物A20％，龙胆提取物B10％，余量为去离子。

实施例4

本发明提供的一种的具有多重护肤功效的龙胆组合物，包括下述重量百分比的组分：丁二醇20％，戊二醇8％，氮酮1％，龙胆提取物A 22％，龙胆提取物B11％，余量为去离子。

实施例5

实施例1转化为精华液，配方成分如下：卡波姆0.5％，丁二醇2％，1，3-丙二醇5％，甘油1％，实施例1提供的具有多重护肤功效的龙胆组合物10％，碱性中和剂0.5％，肤感调节剂生物多糖胶5％，防腐剂0.2％，剩余为去离子水。

制备工艺：

乳化锅中加入去离子水，开启搅拌形成漩涡后，加入卡波姆，均质分散均匀后，加入丁二醇、1，3-丙二醇、甘油，搅拌加热至80-85℃，保温10-15min，待溶解完全，降温至 45-50℃，加入碱性中和剂、肤感调节剂生物多糖胶、实施例1提供的具有多重护肤功效的龙胆组合和防腐剂，搅拌10-15min，混合均匀，即可过滤出料。

实施例6

实施例2转化为精华产品，配方成分如下：丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.5％，丁二醇5％，1，3-丙二醇2％，甘油3％，实施例1提供的具有多重护肤功效的龙胆组合物5％，生物多糖胶15％，碱性中和剂0.5％，防腐剂0.5％，剩余为去离子水。

制备工艺：

乳化锅中加入水，开启搅拌形成漩涡后，加入丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物，均质分散均匀后，加入丁二醇、1，3-丙二醇、甘油原料，搅拌加热至80-85℃，保温10-15min，待溶解完全，降温至45-50℃，加入碱性中和剂、生物多糖胶、实施例2 提供的具有多重护肤功效的龙胆组合物、耐低温的防腐剂，搅拌10-15min，混合均匀，即可过滤出料。

实施例7

实施例3转化为精华产品，配方成分如下：卡波姆0.1％，丁二醇2％，1，3-丙二醇3％，甘油5％，异壬酸异壬酯2％，鲸蜡硬脂醇1％，棕榈酸乙基己酯2％，辛酸/癸酸甘油三酯2％，甲基葡糖倍半硬脂酸酯1％，实施例1提供的具有多重护肤功效的龙胆组合物 2％，生物多糖胶5％，碱性中和剂0.1％，防腐剂0.2％，剩余为去离子水。

制备工艺：

1、水相锅加入水，开启搅拌形成漩涡后，加入卡波姆，搅拌分散均匀后，加入丁二醇、1，3-丙二醇、甘油，搅拌升温至80-85℃，保温10-15min溶解完全。

2、油相锅中加入异壬酸异壬酯，鲸蜡硬脂醇，棕榈酸乙基己酯，辛酸/癸酸甘油三酯，甲基葡糖倍半硬脂酸酯，开启搅拌，升温到80-85℃，保温10-15min溶解完全。

3、乳化锅中依次过滤加入水相料和油相料，开启搅拌，抽真空，均质乳化后，降温。

4、降温至45-50℃，加入碱性中和剂、肤感调节剂、龙胆提取物、防腐剂，搅拌10-15min，混合均匀，即可过滤出料。

实施例5-7中所述的碱性中和剂、防腐剂本领域常用的碱性中和剂和防腐剂，比如氢氧化钾或者氢氧化钠；所述的防腐剂为苯氧乙醇。

对比例1

一种组合物，包括下述重量百分比的组分：氮酮5％，龙胆提取物A 24％，龙胆提取物B12％，余量为去离子。

对比例2

一种组合物，包括下述重量百分比的组分：丁二醇10％，龙胆提取物A24％，龙胆提取物B12％，余量为去离子。

对比例3

一种组合物，包括下述重量百分比的组分：丁二醇10％，戊二醇6％，氮酮5％，龙龙胆提取物B 36％，余量为去离子。

对比例4

一种组合物，包括下述重量百分比的组分：丁二醇10％，戊二醇6％，氮酮5％，龙龙胆提取物A 36％，余量为去离子。

对比例5

一种组合物，包括下述重量百分比的组分：丁二醇10％，戊二醇6％，氮酮5％，龙胆提取物A 50％，龙胆提取物B5％，余量为去离子。

对比例6

一种组合物，包括下述重量百分比的组分：丁二醇10％，戊二醇6％，氮酮5％，龙胆提取物A 5％，龙胆提取物B30％，余量为去离子。

对比例7

一种组合物，包括下述重量百分比的组分：丁二醇10％，戊二醇6％，氮酮5％，常规龙胆提取物36％，余量为去离子。

对比例7所述的龙胆提取物采用下述方法提取的：

称取龙胆置于提取容器中，加入龙胆质量10倍去离子水，浸泡1h后，在80℃恒温条件下回流提取3h，分离提取液，药渣继续加入10倍去离子水，于80℃恒温条件下回流提取3h，得到二次提取液，合并两次提取液，得到二次提取液，合并两次提取液，过 100目滤网后，趁热用真空减压浓缩装置在-0.05MPa，下进一步浓缩至提取液与龙胆的质量比为1：1，过滤，制得龙胆提取物。(记为常规龙胆提取物)

上述实施例和对比例所述的龙胆提取物A通过下述步骤制备的：

将龙胆根茎切段后粉碎至40-60目粉末，以35％乙醇(体积/体积)-20％乙酸铵水(体积/体积)为萃取溶剂，料液比体积比1：60，微波功率500W，萃取时长15min，萃取完成后静置15min，待分层，分别取下层乙酸铵水相和上层乙醇相；

取下层乙酸铵水相，真空减压浓缩至0.2g/mL浓度，以活化的AB-8树脂上样吸附，以纯水冲洗去除乙酸铵，冲洗至无色，以30％乙醇洗脱，收集洗脱液；真空浓缩至1g/mL 得到龙胆提取物A。

龙胆提取物A依照chp-2020年药典检测，流动相：A∶C＝75∶25(v/v)；色谱柱：岛津C18柱(4.6×150mm，5μm)；检测波长：270nm；进行检测分析，以龙胆苦苷为标准品进行分析，参阅图1；标准品出峰，参阅表1。

表1龙胆苦苷浓度

上述实施例和对比例所述的龙胆提取物B通过下述步骤制备的：

将龙胆根茎切段后粉碎至40-60目粉末，以35％乙醇-20％乙酸铵水为萃取溶剂，料液比体积比1∶60，微波功率500W，萃取时长15min，萃取完成后静置15min，待分层，分别取下层乙酸铵水相和上层乙醇相；

取上层乙醇相，加入0.2％活性炭煮沸30min，趁热抽滤2次，滤液真空减压浓缩至0.2g/mL，上大孔树脂，以纯水洗脱至无色，以60％乙醇洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至 1g/mL，得到龙胆提取物B。

以龙胆提取物B以芦丁为标准品，以分光光度法在A510处测试总黄酮含量，参见表2和图2。

表2龙胆黄酮浓度

序号	样品	龙胆黄酮浓度(μg/mL)
			1	龙胆提取物B(1g/mL)	＞150
2	实施例1	15-22
			3	常规龙胆提取物	0.3

为了证明本申请提供的技术方案，下面给出本申请提供的技术方案的验证试验：

1、防腐挑战测试

防腐挑战原理：通过在待测样本中人为地接种若干种类、一定数量的微生物，在适当的温度下存放，定期分离样本的微生物，并根据微生物的数量变化情况评价样本的防腐性能。

防腐挑战测试方法：通过在产品中分别接入一定数量的细菌混合物和真菌混合物(分为有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌混合物1×10⁸CFU/mL-9.0×10⁸CFU/mL和白色念珠菌、黑曲霉混合物1.0×10⁷CFU/mL-9.0×10⁷CFU/mL)，并在第7天、14天、 28天检测产品中微生物含量，通过内部检测评判标准评判产品的防腐性能。

测试通过判断标准对数减少值：

细菌：7d：≥3，14d：≥3且NIb，28d：＞5

真菌：7d：≥2，14d：≥2且NIb，28d：＞4。

防腐挑战测试数据(细菌)测评结果如下表3所示。

防腐挑战测试数据(真菌)测评结果如下表4所示。

表3防腐挑战测试数据(细菌)

表4防腐挑战测试数据(真菌)

防腐挑战测试数据(细菌)-：表示未检测；

防腐挑战测试数据(真菌)-：表示未检测

由上述测试结果显示实施例1虽没有添加防腐剂，但是扔具有良好的防腐效果，通过防腐挑战实验。相反，对比例1中缺少无丁二醇和戊二醇体系承载性差，析出细粉，在 7d后菌落数量显著上升，并逐步不可控，微生物超标；无法通过防腐挑战测试，表明实施例1提供的组合物自带有设计巧妙的无防腐溶媒体系，能够针对植物原料的高营养环境进行针对性抑制菌落生长。

2、稳定性测试

稳定性测试原理：通过将待测样品放入高温、低温、冷热交替的环境中，观测待测样品状态、颜色等变化来评估样品的稳定性。

稳定性测试项目主要包括耐热45±1℃、耐寒-5℃、冷热交替循环测试48±1℃维持 24h，-20±1℃维持24h，交替循环，第7、14、21、30、60、90天分别进行样品观测，结果见下表5所示。

表5稳定性测试结果

从测试结果观测，实施例1提供从组合物1均未出现变色、析出等不稳定状态。对比例1提供的组合物耐寒出现颗粒析出问题，并逐步明显为絮状物析出，耐热则出现了菌落滋生问题，并进一步导致样品浑浊，取消测试。

3、透皮促渗透效果试验

以经典FRANZ扩散法进行体外皮肤渗透，以1月龄乳猪皮为测试皮肤，进行体外透皮测试，以龙胆苦苷为标准品进行构建标准曲线进行检测分析，体外实验如下：

以FRANZ立式扩散池为试验再次，乳猪皮角质层朝上，以生理盐水作为接受液，设置32℃，磁力搅拌转速350rpm，连续透皮测试8h(参考化妆品使用时长)，进行试验，平行6组，计算累计透皮量，结果如表6所示。

表6透皮促渗透效果

结果表明，相对于对比例2缺少无氮酮和戊二醇，渗透性性变差，透皮数据减少10倍，实施例1提供的组合物的皮肤渗透效果显著优于对比例，其活性物穿过皮肤角质层，到达皮下组织的量显著高于对比例。

4、抑菌去屑

1)马拉色菌抑菌试验方法简述及评判标准：

以经典牛津杯抑菌圈方法进行马拉色菌抑菌试验测试方法，在牛津杯中加入受试物 200ul和空白对照组生理盐水200ul，然后进行厌氧培养，温度设置为36±1℃，恒温培养18～24小时后用工具尺测量出抑菌圈直径的大小。每个样品设置三个平行。

马拉色菌抑菌效果评判标准如下表7所示；待测样品对马拉色菌抑菌结果如表8所示。

表7马拉色菌抑菌效果评判标准

表8马拉色菌抑菌结果

结果分析：实施例1-4均为高效抑制马拉色菌，表现出良好的抑菌效果，对比例1也具有较好的抑菌数据，但是出现其它菌落，对比例3、5、6均为中效，表明龙胆提取物A 可能是抑制马拉色菌的主要活性物质，对比例3-6的抑菌效果随着龙胆提取物A的量变化，但是相对于实施例来讲，对比例5中含有较多的龙胆提取物A，但是抑菌效果并没有实施例强，表明可能单一的龙胆提取物A对马拉色菌极限抑菌效果仅能达到中效，对比例6中含有较多的龙胆提取物B，但是效果不佳，表明而适量浓度的龙胆提取物B对A 具有一定的增效效果，能够对抑菌圈进一步扩大；对比例7采用常规方法提取的龙胆提取物，效果不佳。

2)红色毛癣菌抑菌测试方法

简述及评判标准：

本方法采用涂布-生长面积法抑菌法进行红色毛癣菌抑菌测试。通过涂布法将5.0× 10³～5.0×10⁴CFU/ml的红色毛癣菌均匀涂布于已有含有待测样品的培养基的培养皿中，将平板放入28±1℃的培养箱中恒温培养7天后，观测菌落数量和菌落生长区域面积，根据我司内部红色毛癣菌抑菌评价标准，评估待测样品的抑菌效果。每组待测样品设置三个平行，评价标准如表9所示，测试结果如表10所示。

表9红色毛癣菌抑菌评价标准

表10样品红色毛癣菌抑菌测试结果

结果分析：实施例1-4抑菌效果最优，菌落数量最少，均小于15个，对比例菌落数量显著高于实施例，菌落数量均大于20个，对比例与实施例对比分析来看，对比例1相对于实施例，菌落个数突破50，表明氮酮等促渗剂对菌落细胞壁具有一定的破坏作用，能够显著强化活性物抑菌效果，对比例3-6存在促渗剂，效果相对于对比例2较好，对比例3-6的抑菌效果随着龙胆提取物A的量变化，但是相对于实施例来讲，对比例5中含有较多的龙胆提取物A，但是抑菌效果并没有实施例强，表明可能单一的龙胆提取物A对红色毛癣菌极限抑菌效果仅能达到30-40个菌落，对比例6中含有较多的龙胆提取物B，但是效果不佳，表明而适量浓度的龙胆提取物B对A具有一定的增效效果，能够对抑菌圈进一步扩大；对比例7中为含有较多的常规方法提取的龙胆提取物，但是效果不佳。

5、DPPH抗氧化效果

自由基DPPH清除试验方法简述DPPH自由基是人体中具有代表性的氧自由基，其含量可通过UV显色反应进行定量分析，通过比较添加受试物组和对照组的吸光度A值差异分析受试物对DPPH清除效果。

测试原理：当人体产生的过量自由基能，会导致各种肌肤问题。通过体外DPPH自由基抑制实验检测受试物清除DPPH效果。

DPPH是一种稳定的以氮为中心的自由基，在519nm波长处有最大吸收值。DPPH的乙醇溶液呈深紫色，当自由基清除剂加入到DPPH溶液中时，DPPH的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光值随之减小。因此，可通过吸光值减弱的程度来判断物质清除DPPH自由基的能力。

将DPPH用无水乙醇配制成65.7mg/L的DPPH溶液工作液。取2mL待测样品与4mLDPPH溶液工作液混合，常温避光反应30min后于紫外分光光度计517nm波长检测吸光值。DPPH·的清除率(％)＝[1-(B-C)/A]*100％(A：对照液(无水乙醇代替待测样品) 测定的吸光值；B：受试物测定的吸光值；C：试样空白(无水乙醇液代替DPPH)吸光值)。各组案例DPPH自由基清除率效果如表11所示。

表11 DPPH自由基清除率数据

序号	样品	DPPH自由基清除率％
			1	实施例1	89.81％
2	实施例2	87.28％
			3	实施例3	90.35％
4	实施例4	94.28％
			5	对比例3	41.38％
6	对比例4	6.29％
			7	对比例5	32.98％
8	对比例6	47.25％
			9	对比例7	29.25％

结果分析：实施例1-4最优，均表现出高效的自由基清除效果，对比例3-6的抗氧化效果与龙胆提取物B的占比存在一定的关系，B组分较少时，清除效果不佳，但是对比例 6中B组分达到30％，其抗氧化效果也没有达到50％以上，相对于实施例，表明A组分的存在对B的抗氧化效果具有增效效果，对比例7效果不理想。

6、巨噬细胞抗炎测试

巨噬细胞抗炎测试方法简述通过刺激巨噬细胞分泌不同炎症因子构建炎症因子分泌模型，进一步添加受试物，与对照组进行比较炎症因子分泌数量差异。

1、LPS诱导巨噬细胞模型

通过LPS诱导巨噬细胞产生炎症因子TNF-a模型，通过受试物与空白对照组处理细胞后，检测TNF-a的含量。通过TNF-a的含量计算各测试组相对于空白组的TNF-a分泌抑制率。

将RAW264.7小鼠巨噬细胞调整为1×10⁵个/mL浓度并接种于6孔板内，每孔2mL，置于细胞培养箱中培养24h。弃去原培养基后分别加入2mL完全培养基，含有5ug/mL LPS 的完全培养基2mL，含有5ug/mL LPS且含有质量分数分别为10％样品的完全培养基2mL 继续培养24h。搜集细胞上清液，由ELISA试剂盒说明书进行TNF-a含量检测。每组设立三个复孔，检测结果如表12所示。

表12巨噬细胞抗炎测试结果

序号	样品	TNF-a分泌抑制率(Mean±SD)
			1	实施例1	72.33％±10.28
2	实施例2	80.28％±11.25
			3	实施例3	89.20％±12.54
4	实施例4	93.21％±12.19
			5	对比例2	65.23％±13.29
6	对比例3	20.15％±10.36
			7	对比例4	60.26％±10.23
8	对比例5	59.21％±16.27
			9	对比例6	30.10％±7.28
10	对比例7	39.50％±6.17

结果分析：相对于空白组，实施例均能够对巨噬细胞产生较为明显的抑制TNF-a分泌效果，而对比例相对于实施例而言效果偏弱，对比例3整体抑制率最低，因其缺乏龙胆提取物A，可以推测龙胆提取物A为主要抑制炎症因子释放的活性物质，对比例4在没有龙胆提取物B的情况下抑制率达到了60.26％，也验证了对比例3的推测，对比例5中龙胆提取物A比例达到50％，但是抑制率并没有进一步提升，表明A对炎症因子抑制率极限即在60％左右，从对比例5与实施例对比可知，在适当比例的A与B的组合情况下，A 与B具有协同抑制炎症因子分泌效果，常规提取的龙胆提取物效果对炎症因子分泌抑制效果不理想。

8、小鼠耳肿胀实验

小鼠耳肿胀实验方法简述：

实验原理：通过二甲苯试剂对KM小鼠进行处理造模。小鼠耳肿胀造模成功后，涂抹受试物后检测耳肿胀度，并计算耳肿胀率(％)。

实验方案：

选取SPF级KM小鼠，18～22g，共36只，雌雄各半。小鼠按体重随机分为3组，分别为：A.模型对照组、B.阳性药组(糠酸莫米松软膏)、样品组，每组12只。各取15 μL二甲苯试剂分别涂抹于小鼠右耳正反两面，共30μL，模型组不添加受试物不处理，样品组用移液枪吸取100微升样品均匀涂抹小鼠右耳两侧，分别于造模后0min、20min、 40min各涂抹一次；阳性药取0.1g软膏均匀涂抹小鼠右耳两侧，仅造模后涂抹一次。各组动物于造模后1h处死小鼠，剪下小鼠双耳，用6mm打孔器打孔取材，万分之一天平称量，记录数据，分析耳肿胀度耳肿胀率，耳肿胀度＝右耳片重量-左耳片重量，耳肿胀率＝(右耳片重量-左耳片重量)/左耳片重量*100％。

各组小鼠按照体重随机分组，体重未见明显差异；造模前，各组小鼠状态未见明显异常；造模后，各造模组小鼠右耳出现不同程度肿胀。结果见表13。

表13对小鼠耳肿胀抑制试验结果(Mean±SD n＝12)

结果显示，模型组小鼠双耳肿胀度较大，达到11.18mg，阳性组相对于模型组耳肿胀度极显著降低至6.30mg，实施例1-4与模型对照组相比，均具有极显著抑制耳肿胀效果(P＜0.01)，实施例5与模型相比具有显著抑制效果(P＜0.05)，分析认为实施例5中含10％实施例1，测试浓度的降低和配方基质的影响可能是导致测试结果降低的相关因素。

对比例2、4、5相对于模型组，能够抑制显著抑制耳肿胀度(P＜0.05)，推测认为对比例2中缺乏促渗剂是导致效果减弱的主要因素，对比例3与模型组无差异，表明其没有耳肿胀抑制效果，推测认为缺乏A成分是主要因素，也表明A组分是主要的抑制炎症肿胀的关键成分，对比例5中含有较多的A组分，抑制效果达到了显著水平，综合对比例 3-5表明A是抑制炎症肿胀的主要物质，A物质与炎症抑制效果呈线性关系，B物质对A 物质的抑制耳肿胀效果具有协同效果。

9、安全性测试

鸡胚测试方法简述：

利用孵化10-14天的受精鸡胚中期绒毛尿囊膜(CAM)的血管结构和人眼结膜血管组成较为相似的特征原理，利用鸡胚测试方法检测样品的眼刺激性。将40ul受试物直接与鸡胚尿囊膜接触，同时设置阴性对照组(生理盐水)和阳性对照组(0.01mol/LSDS)，通过作用30min前后的图片进行对比，观察绒毛尿囊膜血管损伤(如鬼影血管、毛细血管充血或出血)程度，对不同的血管损伤程度进行评分，从而判断受试物的刺激性大小，血管效应评分标准如表14所示。

NC值：根据血管损伤程度评分的平均分大小(即NC)值来比较受试物的刺激性大小，表15所示。

安全性测试结果如表16所示。

表14血管效应评分标准

表15血管损伤程度评分

表16刺激性测试结果

序号	样品	测试浓度	NC分值	刺激分级
					1	实施例1	100％	1.32	无刺激
2	实施例2	100％	1.22	无刺激
					3	实施例3	100％	0.89	无刺激
4	实施例4	100％	0.10	无刺激
					5	实施例5	100％	0.40	无刺激

10、斑贴试验

斑贴测试方法简述斑贴测试是国家公认的过敏反应的基础方法，通过受试物与皮肤直接接触，观察皮肤是否出现过敏反应判断样品对人体皮肤的影响。

样品参照《化妆品安全技术规范》、国国家标准GB17149.1-1997《化妆品皮肤病诊断标准及处理原则》、国国家标准GB17149.2-1997《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》进行人体斑贴试验。本研究招募志愿者24名，并签署志愿者知情同意书，先将所有斑试器背面做样品序号标记并加入等量待测样品，对照组为不加任何物质的空白组，将处理好的斑试器贴敷于受试者的前臂曲侧，设置三组平行和一个空白组，分别持续24h、48h后观察皮肤状态。结果显示实施例5进行的24例志愿者斑贴测试均为阴性，无刺激。

11、人体测试

人体测试流程简述

选取面部有敏感肌、痤疮、粉刺等问题肌肤明显状的志愿者48名，年龄区间为20～30 岁，并签志愿者知情同意书。将志愿者随机分为两组，每组24人，一组志愿者使用空白基质组，另外一组志愿者使用实施例5提供的产品，产品使用3天后，通过消费者使用问卷调查形式。志愿者分别对皮肤红、肿、痒、痛、痘痘、粉刺等症状舒缓修复效果进行评分。评价结果如下表17所示.

表17消费者祛痘评价

由测试结果显示，实施例5提供的产品经使用3d后，对照组和实施例5提供的产品组分别24人显现出显著的不同效果，实施例5提供的产品对问题皮肤肌肤症状具有较好舒缓和修复效果，对痘痘，肿痛、瘙痒等方面显著优于对照空白组，针对泛红也具有58.33％的修复效果，实施例5提供的产品得到了测试志愿者的认可，表明实施例5提供的产品具有较好的舒缓修复效果。

Claims (9)

1.一种具有多重护肤功效的龙胆组合物，其特征在于，由以下质量百分比的组分制成：丁二醇5-25％，戊二醇4-10％，氮酮1-10％，龙胆提取物A，20-30％，龙胆提取物B 10-15％，余量为去离子。

2.根据权利要求1所述的具有多重护肤功效的龙胆组合物，其特征在于，由以下质量百分比的组分制成：丁二醇10-15％，戊二醇6-8％，氮酮3-8％，龙胆提取物A，22-28％，龙胆提取物B 11-13％，余量为去离子。

3.根据权利要求1所述的具有多重护肤功效的龙胆组合物，其特征在于，所述的龙胆提取物A通过下述步骤制备的：

将龙胆根茎切段后粉碎至40-60目粉末，以30-40％乙醇-15-25％乙酸铵水为萃取溶剂，料液比体积比1∶50-70，微波功率400-600W，萃取时长10-20min，萃取完成后静置10-20min，待分层，分别取下层乙酸铵水相和上层乙醇相；

取下层乙酸铵水相，真空减压浓缩至0.2g/mL浓度，以活化的AB-8树脂上样吸附，以纯水冲洗去除乙酸铵，冲洗至无色，以30％乙醇洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至1g/mL得到龙胆提取物A。

4.根据权利要求1所述的具有多重护肤功效的龙胆组合物，其特征在于，所述的龙胆提取物B通过下述步骤制备的：

将龙胆根茎切段后粉碎至40-60目粉末，以30-40％乙醇-15-25％乙酸铵水为萃取溶剂，料液比体积比1∶50-70，微波功率400-600W，萃取时长10-20min，萃取完成后静置10-20min，待分层，分别取下层乙酸铵水相和上层乙醇相；

取上层乙醇相，加入0.2％活性炭煮沸30min，趁热抽滤2次，滤液真空减压浓缩至0.2g/mL，上大孔树脂，以纯水洗脱至无色，以60％乙醇洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至1g/mL，得到龙胆提取物B。

5.根据权利要求3所述的具有多重护肤功效的龙胆组合物，其特征在于，所述的龙胆提取物A通过下述步骤制备的：

将龙胆根茎切段后粉碎至40-60目粉末，以35％乙醇-20％乙酸铵水为萃取溶剂，料液比体积比1∶60，微波功率500W，萃取时长15min，萃取完成后静置15min，待分层，分别取下层乙酸铵水相和上层乙醇相；

取下层乙酸铵水相，真空减压浓缩至0.2g/mL浓度，以活化的AB-8树脂上样吸附，以纯水冲洗去除乙酸铵，冲洗至无色，以30％乙醇洗脱，收集洗脱液；真空浓缩至1g/mL得到龙胆提取物A。

6.根据权利要求4所述的具有多重护肤功效的龙胆组合物，其特征在于，所述的龙胆提取物B通过下述步骤制备的：

将龙胆根茎切段后粉碎至40-60目粉末，以35％乙醇-20％乙酸铵水为萃取溶剂，料液比体积比1∶60，微波功率500W，萃取时长15min，萃取完成后静置15min，待分层，分别取下层乙酸铵水相和上层乙醇相；

取上层乙醇相，加入0.2％活性炭煮沸30min，趁热抽滤2次，滤液真空减压浓缩至0.2g/mL，上大孔树脂，以纯水洗脱至无色，以60％乙醇洗脱，收集洗脱液，真空浓缩至1g/mL，得到龙胆提取物B。

7.权利要求1所述的具有多重护肤功效的龙胆组合物作为化妆品添加剂的应用。

8.根据权利要求1所述的具有多重护肤功效的龙胆组合物作为化妆品添加剂的应用，其特征在于，所述的添加量占化妆品总质量的0.1-20％。

9.权利要求1所述的具有多重护肤功效的龙胆组合物的制备方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

1)按权利要求1所述的重量数称取各个组分；

2)向龙胆提取物A、龙胆提取物B，加入丁二醇，戊二醇，氮酮，搅拌均匀，升温至60℃后继续搅拌10min，补足水分，分散均匀后过膜，即得。

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