KR20170061753A

KR20170061753A - 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물의 제조방법 및 그렇게 제조된 발효 뽕나무 추출물

Info

Publication number: KR20170061753A
Application number: KR1020150166329A
Authority: KR
Inventors: 신흥묵; 소재현; 임유미; 이한샘; 천소현; 김민아; 김진희; 박정은; 손은경
Original assignee: 재단법인 한국한방산업진흥원
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2017-06-07

Abstract

본 발명은 항산화 및 항염증 활성을 증가시킨 발효 뽕나무 추출물의 제조방법과 그렇게 제조된 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물에 관한 것이다. 본 발명에서는 뽕나무 추출물을 얻는 단계와; 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 배양시킨 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 방치한 다음 여과 및 원심분리시켜 상등액인 미생물 조효소액을 얻는 단계와; 상기 뽕나무 추출물에 상기 미생물 조효소액을 가하고 30~42℃에서 1~24시간 반응시켜 미생물 조효소액으로 처리된 발효 뽕나무 추출물을 얻는 단계;를 포함하는, 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물의 제조방법이 제공된다. 본 발명은 일반적인 상엽, 상백피, 상지, 상심자, 상기생 등을 원료로 한 뽕나무 추출물에 본 발명에 따른 미생물 조효소액 처리를 통해, 항산화 및 항염증활성이 크게 증가된 생물전환 발효 뽕나무 추출물을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물은 기능성식품의 원료로 활용될 수 있다.

Description

항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물의 제조방법 및 그렇게 제조된 발효 뽕나무 추출물 {Method of preparing fermented extract of mulberry having increased antioxidant and anti-inflammatory activity, and the fermented extract}

본 발명은 항산화 및 항염증 활성을 증가시킨 발효 뽕나무 추출물의 제조방법과 그렇게 제조된 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물에 관한 것이다.

최근 건강에 대한 관심이 증가하고 유리기 산소에 의한 산화 및 염증이 다양한 질환과 관련이 있다는 사실이 밝혀지면서 천연물이나 각종 식품류에서 항산화 및 항염증과 관련된 새로운 물질을 탐색하는 연구가 활발하게 진행 중에 있다. 뿐만 아니라, 식품의 가공방법 중 하나인 가열처리, 가압처리, 식품 미생물을 이용한 발효처리 등과 같은 현대적 개념의 생물전환방법을 한약재 및 천연물에 응용하여 약효를 증강시키거나, 유용한 성분의 함량을 증가시키고자 하는 연구가 보고되고 있다(1).

뽕나무과(Moraceae)에 속하는 낙엽교목인 뽕나무(Morus alba. L)는 열매(桑子)에서 잎(桑葉), 가지(桑枝), 뿌리껍질(桑白皮) 및 겨우살이(桑寄生)에 이르기까지 하나도 버릴게 없는 신목(神木)으로서 예로부터 한방에서 당뇨, 각기, 부종, 기침 및 가래 등의 치료에 널리 이용되어 왔다(2,3).

뽕나무 열매(상심자)는 항산화성 안토시아닌 색소를 다량으로 함유하고 있을 뿐 아니라 항고혈압 성분의 rutin과 항노화 성분의 dihydroquercetin, 항당뇨 성분인 moracin 유도체 그리고 항암, 항고지혈증, 항염증 및 피부탄력증진물질로 알려진 resveratrol를 함유하고 있어 최근 웰빙건강식품으로 크게 각광을 받고 있다(4,5).

뽕나무 잎(상엽)은 예로부터 누에 먹이로서 양잠용으로 사용해 왔으나 최근에는 당뇨, 고혈압, 고지혈증 및 발암 억제 등 성인병에 효능이 있다고 보고되면서 고부가가치 식의약 소재로 활용되고 있다(6).

뽕나무 가지(상지)는 동의보감에서 ‘편풍과 함께 모든 풍을 다스리고 소화를 촉진하고 기를 내리며, 입이 마르는 것을 다스린다’고 적혀 있다. 또한, 최근 상지에는 항암, 항고혈압, 항염증 및 항당뇨 성분인 oxyresveratrol, resveratrol 및 moracin 등이 함유되어 있다고 보고된 바 있다(7).

뽕나무 뿌리껍질(상백피)은 동의보감에 ‘폐에서 숨이 차고 그득하며, 기침이 있거나 피를 토하는 토혈(吐血)을 치료한다’고 적혀있다. 최근 상백피로부터 혈압강하 및 피부 항노화 물질인 mulberrofuran, oxyresveratrol 및 prenylflavonoid 유도체가 보고(8)된 바가 있으며, 아울러 항염증, 항암, 및 항노화 활성이 밝혀진 바가 있다(9).

뽕나무 겨우살이(상기생)는 겨우살이과에 속하고 뽕나무에서 채취된다. 산후요통, 동상, 진정, 통경 및 동맥경화 등의 치료약으로서 사용되어 왔으며 민간에서는 면역증강 및 항암보조요법제로 널리 사용되어왔다(10).

이와 같이 뽕나무는 부위별로 다양한 생리활성과 기능성 물질을 함유하고 있어 이들 추출물을 이용한 기능성 소재 및 식품으로의 개발 가능성이 크다.

대한민국 등록특허공보 10-1438543 대한민국 공개특허공보 10-2012-0031800 대한민국 등록특허공보 10-0362511 대한민국 등록특허공보 10-1223146

1. Kim SI, Kim JE, So JH, Rhee IK, Chung SK, Lee KB, Yoo YC and Song KS. (2004). Changes in chemical composition and biological activities of oriental crude drugs by food processing techniques (Ι)-changes in liquiritigenin contents in licorice extract treated by the crude enzyme exctract from aspergillus kawachii. Kor J Pharmacogn. 35: 309-314. 2. Kim SK. (1991). Beneficial medicine, mulberry tree. In Bonchohak. Younglimsa, Seoul, Korea. p 598-601. 3. Zhu YP. (1998). Chinese Materia Medica: Chemistry, pharmacology and applications. Harwood Academic Publisher, Amsterdam, Netherlands. p 273-274. 4. Kim JS, Ha TY, Ahn JY, Kim HK, Kim S. (2008). Composition and quantitative analysis of stilbenoids in mulberry (Morus alba L.) leaves and fruits with DAD/UV HPLC. J Korean Soc Food Sci Nutr 37: 124-128. 5. Kim EO, Lee YJ, Lee HH, Seo IH, Yu MH, Kang DH, Choi SW. (2010). Comparison of nutritional and functional constituents, and physicochemical characteristics of mulberrys from seven different Morus alba L. cultivars. J Korean Soc Food Sci Nutr 39: 1. 6. Lee WC, Kim AJ, Kim SY. (2003). The study on the functional materials and effects of mulberry leaf. Food Sci Industry 36: 2-14 7. Oh H, Ko EK, Jun JY, Oh MH, Park SU, Kang KH, Lee HS, Kim YC. (2002). Hepatoprotective and free radical scavenging activities of prenylflavonoids, coumarin, and stilbene from Morus alba. Planta Med 68: 932-934. 8. Ko HH, Yu SM, Ko FN, Teng CM, Lin CN. (1997). Bioactive constituents of Morus australis and Broussonetia papyrifera. J Nat Prod 60: 1008-1011. 9. Kuete V, Fozing DC, Kapche WF, Mbaveng AT, Kuiate JR, Ngadjui BT, Abegaz BM. (2009). Antimicrobial activity of the methanolic extract and compounds from Morus mesozygia stem bark. J Ethnopharmacol 124: 551-555. 10. Park JH, Seo YB. (2001). Experimental studies on the immunnomodulational effects of Taxilli ramulus. Kor J Herbology 16: 1. 11. Blois MS. (1958). Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 181: 1199-1200. 12. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med 26: 1231-1237 13. Szabo MR, Idioiu C, Chambre D, Lupea AX. (2007). Improved DPPH determination for antioxidant activity spectrophotometric assay. Chem. Pap. 61: 214-216 14. Que F, Mao L, Zhu C, Xie G. (2006). Antioxidant properties of Chineses yellow wine, its concentrate, and volatiles. LWT-Food Sci. Technol. 39: 111-117 15. Kim JY, Jung KS, Jeong HG. (2004). Suppressive effects of the kahweol and cafestol on cyclooxygenase-2 expression in macrophages. FEBS Lett 569: 321-326. 16. Mori, M. (2007). Regulation of nitric oxide synthesis and apoptosis by arginase and arginine recycling. J. Nutr. 137, 1616-1620. 17. Iwalewa, E. O., McGaw, L. J., Naidoo, V. and Eloff, J. N. (2007). Inflammation: the foundation of diseases and disorders. A review of phytomedicines of south african origin used to treat pain and inflammatory conditions. Afr. J. Biotechnol. 6, 2868-2885. 18. Kang, C. H., Choi, Y. H., Choi, I. W., Lee, J. D. and Kim, G. Y. (2011). Inhibition of lipopolysaccharide-induced iNOS, COX-2, and TNF-α expression by aqueous extract of Orixa Japonica in RAW 264.7 cells via suppression of NF-κB activity. Trop. J. Pharm. Res. 10, 161-168. 19. Kim, R. G., K. M. Shin, S. K., Chun, S. Y. Ji, S. H. Seo, H.J. Park, J. W. Choi, and K. T. Lee. (2002). In vitro antiinflammatory activity of the essential oil from ligularia fischerivar. spiciformis in murine macrophage RAW 264.7 cells. Yakhak Hoeji. 46, 343-347. 20. Lin, W. J. and W. C. Yeh. (2005). Implication of Toll-like receptor and tumor necrosis factor alpha signaling in septic shock. Shock 24, 206-9.

본 발명에서는 다양한 뽕나무 부위별 추출물에 대해 미생물 조효소액을 처리를 통해 생리활성을 높이는 방법과 그렇게 얻어진 생리활성이 높은 발효 뽕나무 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해 본 발명에서는 먼저 식품 미생물 유래의 조효소액을 만들고, 이를 뽕나무 부위별 추출물에 처리한 후 변화되는 성분 및 처리 전후의 항산화, 항염증에 대한 기초적 활성 비교를 통해 유효성을 확인함으로써 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물을 제공하고자 한다.

본 발명에서는,

상엽, 상백피, 상지, 상심자, 상기생 중 어느 하나 이상으로부터 뽕나무 추출물을 얻는 단계와;

아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시켜 얻은 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 0~10℃에서 1~24 시간 방치한 다음 여과 및 원심분리시켜 상등액인 미생물 조효소액을 얻는 단계와;

상기 뽕나무 추출물에 상기 미생물 조효소액을 가하고 30~42℃에서 1~24시간 발효시켜 발효 뽕나무 추출물을 얻는 단계;를 포함하는, 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 뽕나무 추출물은 바람직하게는 상엽, 상백피, 상심자 중 어느 하나 이상으로부터 얻어진 것이며, 더욱 바람직하게는 상엽으로부터 얻어진 것이다.

본 발명에서 상기 뽕나무 추출물은 한약재로 판매되는 상엽, 상백피, 상지, 상심자, 상기생 중 어느 하나 이상을 용매로 추출하여 얻거나 또는 뽕나무 잎, 열매, 가지, 뿌리껍질, 뽕나무 겨우살이 등을 채취 후 분쇄, 건조시킨 후 용매 추출하여 얻을 수 있다. 상기 용매는 생약 추출용매로서 사용 가능한 용매면 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 에탄올 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 한약재로 판매되는 상엽, 상백피, 상지, 상심자, 상기생을 구입한 후 각각의 한약재 500 g에 대해 3.5 L의 70% EtOH을 가하고 3시간씩 2회 반복 환류 추출하여 얻었다. 이렇게 얻어진 추출물을 그대로 다음 단계에서 이용하거나, 또는 이 추출물을 여과한 후 감압 농축하였다가 사용 시 증류수에 2~20배 정도로 희석하여 사용할 수 있다.

아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)는 백색 또는 담황색을 나타내어 일명 백국균(흰색 누록곰팡이)으로도 명명되는 곰팡이 균이다. 당화효소 뿐만 아니라 유기산도 생산하기 때문에 코지(koji) 제조에 용이하고 술덧의 pH를 산성으로 만드는 균이며 최적 생육온도는 30℃ 정도로 알려져 있다. 주류 제조 등에 많이 사용되는 균으로서 시판되는 균주를 구입하여 사용할 수도 있으며, 식품으로부터 직접 분리하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 실시예에서는 된장으로부터 직접 분리한 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 이용하였다.

본 발명에서 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)로부터 미생물 조효소액을 얻는 과정은, 먼저 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시키며, 바람직하게는 3~7일 정도 배양시킨다. 이렇게 배양시켜 얻어진 배양체, 즉 배양된 아스퍼질러스 카와치와 배지 성분을 모두 포함하는 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 0~10℃에서 1~24 시간 방치한다. 이때 인산나트륨 완충용액은 1~1,000 mmol의 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 50~500mmol, 더욱 바람직하게는 100±50mmol의 pH 7인 것을 사용한다. 상기 완충용액을 가한 후 더욱 바람직하게는 4℃ 정도에서 1~12시간, 특히 바람직하게는 5±1 시간 정도를 방치한다. 그런 다음 여과 및 원심분리시켜 상등액을 얻는데, 이 상등액이 바로 본 발명의 미생물 조효소액이다. 이렇게 얻어진 본 발명의 조효소액에는 각종 당가수분해 효소가 함유되어 있으며, 그 중에서도 β-glucosidase 활성이 주를 이루게 된다.

상기와 같이 얻어진 미생물 조효소액을 상기에서 얻은 뽕나무 추출물에 가하고 일정온도에서 일정시간 반응시키면, 목적물, 즉 미생물 조효소액으로 처리된 발효 뽕나무 추출물을 얻을 수 있다. 이때 미생물 조효소액을 뽕나무 추출물에 가한 후 바람직하게는 30~42℃에서 1~24시간 반응시키며, 더욱 바람직하게는 37±2℃에서 10±2 시간 정도 반응시킨다. 이렇게 하면, 미생물 조효소액으로 처리된, 본 발명의 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물이 얻어진다.

또한, 본 발명에서는,

상기와 같은 제조방법으로 얻어진, 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물이 제공된다.

본 발명에 따라 얻어진 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무(Morus alba L.) 추출물은, 뽕나무 추출물에 대하여 된장으로부터 분리된 미생물 (Aspergillus kawachii) 조효소액을 처리하여 생물전환을 통해 생성된 것으로서, 뽕나무의 부위별 발효 추출물에 대하여 분획물의 항산화 및 항염증효과를 비교하였을 때 상엽(Mori Folium)이 가장 큰 활성 증가를 나타내었다. 본 발명의 실험예에 따르면, 조효소액 처리 후 상엽의 EtOAc층은 DPPH 라디칼 소거능이 농도 0.2 mg/mL에서 37.55±0.68% 증가하였으며 ABTS assay에서도 0.1 mg/mL에서 32.86±1.17% 증가하여 항산화능이 크게 증가하였다. 또한 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에 LPS를 처리하여 NO생성량을 보았을 때 조효소액을 처리한 상엽의 EtOAc층에서 29.96±0.03%만큼 감소시키는 것으로 확인되었으며, NO 생성에 직접적인 영향을 주는 iNOS 와 COX2의 발현량 역시 상엽 추출물에서 가장 많이 감소시키는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명에서는 상기 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품을 제공한다. 본 발명의 실험결과를 토대로 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물은 각종 기능성식품 및 건강식품의 원료로 이용될 수 있다. 이하 본 발명에서 "기능성 식품"은 기능성식품, 건강식품 및 건강기능성 식품을 모두 포함하는 의미로 정의된다. 특히, 본 발명의 조효소액 처리 후 활성이 가장 많이 증가한 상엽 발효 추출물의 경우, 기존의 상엽 보다 더 큰 항산화, 항염증효과를 기대할 수 있으므로, 기능성식품의 원료로 크게 이용될 수 있다.

본 발명은 일반적인 상엽, 상백피, 상지, 상심자, 상기생 등을 원료로 한 뽕나무 추출물에 본 발명에 따른 미생물 조효소액 처리를 통해, 항산화 및 항염증활성이 크게 증가된 생물전환 발효 뽕나무 추출물을 제공한다. 본 발명에 따른 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물은 기존 뽕나무 추출물에 비해 큰 항산화 및 항염증효과를 기대할 수 있으므로, 기능성식품의 원료로 활용될 수 있다.

도 1은 조효소액 처리에 의한 뽕나무 부위별 분획물의 UPLC pattern 변화를 비교한 결과이다. (A)는 Mori Folium, (B)는 Mori Cortex, (C)는 Mori Ramulus, (D)는 Mori Fructus, (E)는 Loranthi Ramulus 의 결과이다. 빨간 화살표는 새로운 피크를 나타낸다.
도 2는 조효소액 처리에 의한 뽕나무 부위별 분획물의 DPPH radical 소거능을 확인한 결과이다. B.B; before bioconversion (Treated inactivated enzyme), A.B; after bioconversion (Treated enzyme). *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 compared to control. #p < 0.05, ##p < 0.01 and ###p < 0.001 compared to bioconversion of EtOAc fraction.
도 3은 조효소액 처리에 의한 뽕나무 부위별 EtOAc 분획물의 농도별 DPPH radical 소거능을 비교한 결과이다. (A) Mori Folium, (B) Mori Cortex, (C) Mori Ramulus, (D) Mori Fructus, (E) Loranthi Ramulus. B.B; before bioconversion (Treated inactivated enzyme), A.B; after bioconversion (Treated enzyme). *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 compared to control.
도 4는 각 추출물의 EtOAc층의 농도별 ABTS radical 소거능을 나타낸 것이다. (A) Mori Folium, (B) Mori Cortex, (C) Mori Ramulus, (D) Mori Fructus, (E) Loranthi Ramulus . B.B; before bioconversion (Treated inactivated enzyme), A.B; after bioconversion (Treated enzyme). *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 compared to control.
도 5는 조효소액 처리에 의한 뽕나무 부위별 EtOAc층의 Nitric oxide 생성 저해 효과 비교한 결과이다. (A) Cell viability of Raw 264.7 cell(%). (B) Nitric oxide production(%). B.B; before bioconversion (Treated inactivated enzyme), A.B; after bioconversion (Treated enzyme). Values represents mean ±SD of relative OD obtained from three independent experiments performed. *p < 0.05 and **p < 0.01 compared to control cell. #p < 0.05 compared to bioconversion of EtOAc fraction.
도 6은 조효소액 처리에 의한 뽕나무 부위별 EtOAc층이 iNOS 및 COX2 발현에 미치는 효과 비교한 결과이다. (A)는 세포를 용해시킨 후 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 세포 단백질을 분리하고, 니트로 셀룰로스 막으로 transfer 한 것으로, 막은 표지된 항체로 프로브되고, 단백질은 ECL 검출 시스템을 사용하여 시각화되었으며, 액틴은 내부 대조군으로 사용되었다. (B)는 β-actin에 대한 iNOS의 fold intensities 이고, (C)는 β-actin에 대한 COX2의 fold intensities 이다. *p < 0.05 and **p < 0.01 compared to control cell.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[재료 및 방법]

1. 재료

실험에 사용된 상엽, 상백피, 상지, 상심자, 상기생은 국산으로 대구소재의 한약재상에서 구입하여 사용하였다. 각각의 한약재(500 g)를 3.5 L의 70% EtOH로 3시간씩 2회 반복 환류 추출하였다. 얻어진 추출물은 여과지로 필터한 후 회전 농축기로 감압 농축하였다.

2. 조효소액의 조제 및 처리

밀기울 10 g과 증류수 10 mL를 반죽하여 100 mL 삼각플라스크에 담아 121℃에서 15분간 고압증자한 후 Aspergillus kawachii를 접종하여 30°C에서 5일간 배양하였다. 실험에 사용한 Aspergillus kawachii는 된장으로부터 분리된 것을 사용하였다. 그런 다음 이 배양체에 100 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0) 100mL를 넣고 4°C에서 18시간 방치한 다음 거즈로 걸러 10000 rpm에서 15분간 원심분리한 상등액을 조효소액으로 사용하였다.

준비된 뽕나무 부위별 추출물 10 g을 증류수 100 ml에 분산시킨 다음 상기와 같이 Aspergillus kawachii로부터 얻은 조효소액 100 ml을 처리하여 이를 37℃에서 12시간 정치하였다. 대조군으로서는 100℃에서 30분간 가열처리를 하여 불활성화시킨 효소를 처리한 추출물을 사용하였다. 실험군 및 대조군의 추출물은 각각 n-Hexane과 EtOAc, n-BuOH을 이용하여 극성에 따라 순차적으로 분배추출한 후 회전농축기로 감압농축하였다.

3. UPLC 분석조건

UPLC는 Waters 사의 ACQUITY Ultra Performance LC systems H class를 사용하였으며 조건은 0.1% formic acid가 함유된 MeOH를 0%에서 100%가 되도록 10분간 농도구배를 주어 분석하였으며, 유속은 0.3 mL/min, column은 ACQUITY UPLC CSH C18 (1.7 , 2.1×100 mm)를 사용하였으며 검출은 UV 280 nm를 이용하였다. 샘플은 각각 메탄올에 분산시킨 다음, 0.22 membrane filter로 여과후 5 ㎍을 injection 시켰다.

4. Radical 소거활성 측정

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) assay는 free radical에 대한 시료의 항산화 활성을 평가하기 위한 방법으로 각각의 샘플 10 μL에 150 μM DPPH 용액 190 μL를 첨가하여 상온 암상태에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정한 다음 소거활성 = {(C-S)/C}×100의 계산식에 의하여 소거활성을 나타내었다(11). 여기서 C는 시료를 포함하지 않는 10 μL의 dimethyl sulfoxide(DMSO)용액의 흡광도치이며, S는 시료를 가하였을 때의 흡광도치다. 결과치는 3반복 실험 후 평균치로 나타내었다.

ABTS[2,2´-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical 소거활성은 ABTS radical cation decolorization assay를 이용하여 측정하였다(12). 7.4 mM의 ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온암소에서 24시간 동안 방치하여 radical을 형성시킨 다음 실험 직전에 ABTS 용액을 734 nm에서 흡광도가 0.700±0.030(mean±SE)이 되도록 phosphate-buffered saline(pH 7.4)으로 희석 하여 사용하였다. 농도별 추출물 50 μL에 ABTS 용액 950 μL를 첨가하여 암소에서 10분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 시료를 녹인 용매인 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 대조군으로 사용하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었으며, 소거활성 = {(1-S)/C}×100의 계산식에 의하여 나타내었다.

5. 세포배양

실험에 사용된 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 실험에 사용하였다. RAW 264.7 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, Grand Island, NY, USA)과 항생제(250 units/mL, penicillin, 250 mg/mL streptomycin, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 포함하는 DMEM(Gibco) 배지를 사용 하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였고, 2일 후 RAW 264.7 cells이 80% confluent 한 상태에서 세포를 분리하여 800 rpm에서 5분간 원심분리 한 후 현탁하여 사용하였다.

6. 세포독성 측정

각각의 추출물이 세포의 생존에 미치는 영향은 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Amresco, Solon, OH, USA) 방법을 이용하여 측정하였다. 96 well plates에서 5×10⁵ cells/well 농도로 RAW 264.7 세포를 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 다음 농도별 추출물을 세포에 처리한 후 1시간 뒤에 lipopolysaccharides(LPS)를 1 μg/mL씩 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거한 후 0.5 mg/mL 농도의 MTT 용액을 100 μL씩 넣어 37℃에서 4시간 반응시킨 다음 배지를 제거한 후 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 100 μL씩 가해 10분간 교반하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 추출물 대신 DMSO를 처리한 대조군에 대한 백분율을 산출하였다.

7. Nitric oxide (NO) 생성 평가

RAW 264.7 cells을 5×10⁵ cells/well 농도로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후 각각의 추출물을 5, 10, 25 μg/mL의 농도로 각각 처리한 다음, 1시간 후에 LPS를 1 μg/mL씩 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포 배양 상층액 100 μL를 96 well plate에 취하여 동량의 Griess 시약을 넣어 상온의 어두운곳에서 10분간 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 농도는 sodium nitrite (NaNO₂)를 사용하여 얻은 표준 직선과 비교하여 산출하였다.

8. Western blot 분석

배양이 끝난 세포를 수집하여 2~3회 PBS (phosphate buffered saline)로 세척 한 후 1 mL의 lysis buffer을 첨가하여 30분간 lysis 시킨 후 12000 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA (bocine serum albumin)를 표준화 하여 Thermo Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. 15 μg의 lysate를 10% gel SDS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (BIO-RAD, Richmond, CA, USA)에 400mA로 80분간 transfer하였다. 그리고 membrane은 blocking buffer (5% nonfat dry milk in TBS-T(20 mM Tris-HCl pH7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween-20) buffer 200 mL에 1시간 동안 antibody의 비 특이적 결합 (non-specific binding)을 억제시키고, TBS-T로 세척하였다. iNOS, COX2, β-Actin 1차 항체를 상온에서 1시간 동안 배양시키고 TBS-T로 15분간 각각 3번 씻어내었다. 그 후 2차항체 역시 상온에서 1시간 동안 배양시킨 후 TBS-T로 15분간 각각 3번 씻어내고 ECL reagents를 사용하여 현상 후 분석하였다.

[결과 및 고찰]

1. 조효소액 처리에 의한 뽕나무 부위별 분획물의 UPLC pattern 변화

뽕나무부위별 에탄올 추출물에 미생물 조효소액을 처리한 후의 n-Hexane, EtOAc, n-BuOH 분획물과 가열 불활성화된 미생물 조효소액을 처리한 후의 각 분획물의 변화를 확인하기 위하여 UPLC pattern을 비교하였다. 이 때 대조군에 비해 실험군에서 새로운 peak 및 증가한 peak를 확인할 수 있었다. 특히, 상엽(Mori Folium)의 효소처리 후 EtOAc층과 n-BuOH층에서 불활성화 효소처리의 대조군에서 보이지 않았던 peak(t _R , 5.58 min)가 매우 높게 보이는 것을 확인할 수 있었다. 결과는 도 1과 같다.

2. 조효소액 처리에 의한 뽕나무 부위별 분획물의 항산화 활성의 변화

조효소액 처리에 의하여 변화되는 항산화 활성을 DPPH와 ABTS assay를 이용하여 확인하였다. DPPH assay는 수소 공여체를 측정할 수 있는 방법으로 페놀성 화합물, 방향족 아민류 및 아스코르빈산 등에 의해 수소나 전자를 받아 환원되어 보라색이 탈색되는 원리를 이용한 방법으로 항산화 물질을 탐색하기 위해 많이 이용되며 비교적 간단하고 짧은 시간 내에 항산화 활성을 측정할 수 있어 널리 사용되고 있는 방법이다(13). 조효소액을 처리한 후와 불활성화된 조효소액을 처리한 후의 각 분획물의 0.1 mg/mL 농도에서 DPPH radical 소거능을 확인한 결과 각각의 EtOAc층에서 대조군과 실험군의 차이가 가장 크게 나타나는 것을 알 수 있었다. 결과는 도 2와 같다. 이에 따라 실험군과 대조군의 EtOAc층에 대해 농도별 DPPH radical 소거능을 비교해 보았을 때 0.2 mg/mL에서 상엽(Mori Folium)이 37.55±0.68% 증가하여 가장 큰 증가를 보였으며 상심자(Mori Fructus)도 31.44±0.29% 증가한 것을 확인할 수 있었다. 결과는 도 3과 같다.

ABTS assay는 potassium persulfate와의 반응으로 생성된 peroxide radical 성격의 ABTS·⁺이 항산화성 물질에 의해 제거되면서 청록색이 탈색되어지는 것을 이용하여 항산화 활성을 측정하는 방법이다. 앞에서의 DPPH assay의 경우 유리 라디칼이 소거되어지는 것을 이용하는 것인 반면 ABTS assay는 양이온 라디칼이 소거되어지는 것을 이용하는 방법이다(14). 도 4는 각 추출물의 실험군과 대조군 EtOAc층의 농도별 ABTS radical 소거능을 나타낸 것으로 특히 0.1 mg/mL에서 상엽(Mori Folium)이 32.86±1.17% 증가하여 DPPH assay 결과와 같이 가장 큰 증가를 보였다.

3. 조효소액 처리에 의한 뽕나무 부위별 EtOAc층의 Nitric oxide 생성 저해 효과 비교

NO는 NO합성효소에 의해 l-arginine으로부터 생성되는 무기 유리체로 농도에 따라 세포기능유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다(15). lipopolysaccharide (LPS) 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며 이에 의한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다(16). 이에 따라, NO생성에 대하여 조효소액을 처리한 뽕나무 부위별 EtOAc층의 효과를 알아보았다. 실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 마우스 대식세포주의 일종으로 그람 음성 세균의 세포벽 성분인 lipopolysaccharide (LPS)를 처리하면 toll like receptor(TLR)-4 신호전달 과정이 활성화되어 세포질에 있던 nuclear factor kappa B (NF-κB)가 핵으로 이동 후 염증매개물질이 생성되며 이 생성을 억제하는 물질은 항염증 치료제후보로 기대될 수 있기에 in vitro를 이용한 항염증 물질 선별검사에서 주로 이용되고 있는 세포이다(17,18).

결과는 도 5와 같다. RAW264.7 세포에 LPS(1 μg/mL)를 처리하였을 때 현저히 증가했던 NO생성량이 실험군과 대조군에서 감소하는 경향을 보였으며, 특히 상엽의 경우 LPS만 처리한 군의 NO 생성량을 100%로 뒀을 때 조효소액을 처리한 상엽의 EtOAc층은 29.96±0.03%까지 감소한 것을 확인하였으며 이는 불활성화된 조효소액을 처리한 대조군에 비하여 28.11±0.05%만큼 더 감소한 값으로 가장 탁월한 효과를 보였다. 뿐만 아니라 상백피 역시 조효소액을 처리한 군에서 46.47±0.01%로 감소한 것으로 나타났으며 이는 불활성화된 조효소액을 처리한 대조군에 비하여 13.09±0.05%만큼 더 감소한 값이다(도 5(B)). 또한 각각의 EtOAc층을 25 μg/ml까지 처리했을 때 세포독성이 없는 것을 MTT assay를 이용하여 확인하였기에 이 결과는 세포생존율에 영향을 미치지 않는 유의한 결과라 할 수 있다(도 5(A)).

4. 조효소액 처리에 의한 뽕나무 부위별 EtOAc층의 iNOS 및 COX2 발현에 미치는 효과 비교

inducible NO synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)는 NO발생에 직접적인 영향을 주는 상위 메커니즘으로서 iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있으며(19), COX-2 역시 급성염증반응에서 prostagladins의 합성에 관여하고, LPS 및 cytokine에 의해 발현이 유도된다고 알려져 있다(20). 즉, iNOS와 COX2의 발현정도를 비교하여 조효소액 처리에 의한 뽕나무 부위별 EtOAc층의 항염증효과에 대해 비교해 보았다. 결과는 도 6과 같다. 실험 결과, NO 생성 저해 효과와 마찬가지로 상엽의 경우 LPS만 처리한 군의 iNOS, COX2 발현량에 비해 조효소액을 처리한 상엽의 EtOAc층이 발현량을 현저히 억제시키는 것을 알 수 있었으며 이는 불활성화 조효소액을 처리한 대조군과 비교했을 때 보다 더 억제되는 것임을 확인하였다.

Claims

상엽, 상백피, 상지, 상심자, 상기생 중 어느 하나 이상으로부터 뽕나무 추출물을 얻는 단계와;
아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시켜 얻은 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 0~10℃에서 1~24 시간 방치한 다음 여과 및 원심분리시켜 상등액인 미생물 조효소액을 얻는 단계와;
상기 뽕나무 추출물에 상기 미생물 조효소액을 가하고 30~42℃에서 1~24시간 발효시켜 발효 뽕나무 추출물을 얻는 단계;를 포함하는, 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 뽕나무 추출물은 상엽, 상백피, 상심자 중 어느 하나 이상으로부터 얻어진 것임을 특징으로 하는, 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 뽕나무 추출물은 상엽으로부터 얻어진 것임을 특징으로 하는, 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 인산나트륨 완충용액은 50~500mmol 인 것을 특징으로 하는, 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조방법으로 얻어진, 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물.
제5항의 항산화 및 항염증활성이 증가된 발효 뽕나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품.