KR102467971B1 - 카우다틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents
카우다틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 카우다틴 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이며, 또한 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 에틸아세테이트 분획물 및 상기 분획물로부터 분리한 카우다틴 화합물은 암 줄기세포의 증식 및 성장을 억제할 수 있고, 암 줄기세포의 마커 유전자들의 발현을 억제할 수 있으며, 유방암 줄기세포의 맘모스페어 형성을 억제하고 유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor)의 분해를 유도하며 GR 신호경로 차단을 통해 암 줄기세포를 억제할 수 있는 활성이 있어, 암을 예방 또는 치료하기 위한 의약품 및 건강기능식품 등의 산업에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 카우다틴 화합물의 신규 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 카우다틴 화합물의 암 줄기세포 성장억제 활성을 확인함으로써 카우다틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
종래 개발된 항암제들은 종양 내 암 세포들을 표적화하여 효과적으로 치료하지 못하고, 종양의 재발 및 전이가 진행됨에 따라 최근에는 암 줄기세포를 타겟으로 하는 새로운 항암제의 개발에 대한 연구가 대두되고 있다. 특히 암 줄기세포는 천천히 증식하는 특징을 가지고 있어 빠르게 증식하는 암 세포에 독성을 유발하는 종래의 항암요법으로는 암 줄기세포를 억제하지 못하는 문제점이 있다. 따라서 암을 효과적으로 완전하게 예방 또는 치료하기 위해서는 암 세포뿐만 아니라 암 줄기세포에 대한 표적치료도 가능한 새로운 항암제의 개발이 필요하다.
암 줄기세포는 화학 요법과 방사선 치료에 대한 약제 내성 및 방사선 내성을 가지고 있고, 암의 재발과 전이를 유발한다. 따라서 암 줄기세포에 대한 표적 치료는 암 치료에 필수적이다. 암 줄기세포는 Oct4, Sox2, Nanog 및 알데히드 탈수소효소-1 (ALDH)을 포함하는 특정 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다. ALDH는 유전 독성의 알데히드를 산화하는 효소이며, 이의 효소 활성은 백혈병, 두경부, 방광, 뼈, 결장, 간, 폐, 췌장, 전립선, 갑상선 및 자궁경부암의 암 줄기세포 (CSC) 마커로 널리 사용되고 있고, 암 줄기세포의 치료표적으로 알려져 있다. 또한, 임상 표본에서 CD44 high /CD24 low를 발현하는 유방암 집단에서 종양을 형성하는 능력이 뛰어난 것으로 알려져 있다.
암 줄기세포에 대한 항암제의 필요는 유방암 치료에 있어서 더욱 필요한데, 기저세포형 (basal cell phenotype) 유방암은 분화과정의 초기 단계의 유선 모세포 (earliest mammary progenitor cell)에서 기원한 것으로 여겨지며, 예후가 불량하고 기존의 항암요법에 내성을 나타낸다고 알려져 있으며, 항암 치료의 실패원인이 암 줄기세포에 대한 표적치료가 제대로 이루어지지 못하기 있기 때문이다.
한편, 유방암은 여성에서 흔한 암이며, 여성 암 환자에서 주요 사망의 원인으로 알려져 있다. 조기 유방암에 폴리항암화학요법 (polychemotherapy), 타목시펜과 함께 광범위한 유방 X 선 촬영 및 보조 요법이 유방암의 사망률을 줄였으나, 유방암은 여전히 재발과 전이로 인해 가장 위험한 질병으로 알려져 있다. 최초로 암 줄기세포 (Cancer stem cell, CSCs)가 골수성 백혈병에서 확인되었고, 이후, 유방, 뇌, 결장, 난소, 췌장, 및 전립선 암 등 다양한 고형암의 집단에서 발견되었다. 암 줄기세포는 종양-시작 세포 (tumor initiating cells)와 암 줄기 유사 세포 (cancer stem-like cell)로도 불린다. 또한 유방암을 포함한 다양한 암 유형이 종양의 소집단이라고 할 수 있는 암 줄기세포 (CSC; cancer stem cell)로부터 유래되는 것으로 나타났다. 이러한 집단은 자가 재생 (self-renewal) 및 분화를 통해 종양 부피에 변화를 유발하는 것으로 알려져 있다.
그러므로 암 줄기세포에 대한 효과적인 억제제를 개발한다면 유방, 뇌, 결장, 난소, 췌장, 및 전립선 암 등 다양한 고형암에 대한 효과적인 암 치료가 가능할 것이다.
이에 본 발명자들은 암 줄기세포를 타겟으로 하는 효과적인 새로운 항암제를 개발하기 위해 연구하던 중, 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 추출물로부터 분리한 카우다틴 (Caudatin) 화합물이 암 줄기세포의 성장 및 증식을 억제하는 활성이 있음을 확인함으로써 암 줄기세포를 타겟으로 하는 새로운 항암제로 사용 가능함을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포의 성장억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 줄기세포에 카우다틴 화합물을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 메탄올 추출물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은, 암 줄기세포의 성장억제; 암 세포의 증식억제; CD44+/CD24- 및 탈수소효소 (ALDH)를 발현하는 암 세포의 성장억제; 맘모스페어(mammosphere)의 형성 억제 또는 맘모스페어의 성장억제; 또는 유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor) 분해 활성 및 GR (glucocorticoid receptor) 신호경로 차단; 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계 (central nervous system;CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체선종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물에는 카우다틴 (Caudatin) 화합물을 포함하고 있는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포의 성장억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계 (central nervous system;CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체선종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 메탄올 추출물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은, 암 줄기세포의 성장억제; 암 세포의 증식억제; CD44+/CD24- 및 탈수소효소 (ALDH)를 발현하는 암 세포의 성장억제; 맘모스페어 (mammosphere)의 형성억제 또는 맘모스페어의 성장억제; 또는 유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor) 분해 활성 및 GR (glucocorticoid receptor) 신호경로 차단; 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계 (central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체선종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물에는 카우다틴 (Caudatin) 화합물을 포함하고 있는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은 암 줄기세포에 카우다틴 화합물을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 에틸아세테이트 분획물 및 상기 분획물로부터 분리한 카우다틴 화합물은 암 줄기세포의 증식 및 성장을 억제할 수 있고, 암 줄기세포의 마커 유전자들의 발현을 억제할 수 있으며, 유방암 줄기세포의 맘모스페어 형성을 억제하고 유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor)의 분해를 유도하며 GR 신호경로 차단을 통해 암 줄기세포를 억제할 수 있는 활성이 있어, 암을 예방 또는 치료하기 위한 의약품 및 건강기능식품 등의 산업에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 이엽우피소의 메탄올 추출물의 물 분획물에 대한 에틸아세테이트 분획물을 컬럼크로마토그래피로 총 5개 분획물을 수득하고 각 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과로서, A는 에틸아세테이트 분획물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 수행한 결과이고, B는 상기 실리카 겔 컬럼크로마토그래피로 수득한 총 5개의 분획물에 대한 TLC 분리 및 UV 조사 결과를 나타낸 것이며, C는 총 5개의 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 도 1에서 수득한 총 5개 분획물 중에서 2번째 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과로서, A는 2번째 분획물을 역상 C18 (ODS) 겔 크로마토그래피로 분리한 결과를 나타낸 것이고, B는 상기 2번째 분획물의 역상 C18 (ODS) 겔 크로마토그래피로 분리된 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 도 2에서 암 줄기세포 억제능을 보이는 분획물 (30~50%)을 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피를 이용하여 다시 3개의 분획물로 분리하고 각 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 것으로, A는 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피를 수행한 결과를 나타낸 것이고, B는 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피로 수득한 총 3개의 분획물에 대한 TLC 분리 및 UV 조사 결과를 나타낸 것이며, C는 상기 총 3개의 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 도 3에서 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피로 분리된 3개의 분획물 중, 암 줄기세포에 대한 억제능을 갖는 1번째 분획물을 다시 TLC 분리를 수행한 후 UV 조사하여 형광 가시화한 결과를 나타낸 것이고 (A 및 B), C는 상기 TLC 분리로 얻은 총 4개의 밴드에 대한 분획물에 대하여 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 도 4에서 암 줄기세포 억제능을 보인 3번 분획물을 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)를 수행하여 활성성분의 화합물을 분리한 결과를 나타낸 것으로, A는 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이고, B는 HPLC 크로마토그램으로 용출된 활성 성분을 포함한 분획에 대한 TLC 분리를 수행한 결과이며, C는 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 이엽우피소 추출물로부터 분리된 활성 성분인 카우다틴 화합물에 대한 NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 카우다틴 화합물을 함유한 분획물의 추출공정 (A), 카우다틴 화합물의 암 줄기세포 억제능 분석결과 (B) 및 카우다틴 화합물의 화학 구조식 (C)을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 카우다틴 화합물의 유방암 세포의 증식 및 mammosphere 형성에 미치는 영향을 분석한 것으로, A는 MDA-MB-231 세포에 카우다틴을 농도별로 처리한 후 세포 증식 정도를 분석한 결과이고, B는 카우다틴 및 ciclesonide을 각각 처리하고 MDA-MB-231 세포 유래의 mammosphere 형성 정도를 MFE (mammosphere formation efficiency)로 분석한 결과 및 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이고, C는 카우다틴에 처리된 MDA-MB-231 세포에 대한 세포사멸 정도를 Annexin V/propidium iodide (PI) 염색으로 확인한 결과이며, D는 카우다틴에 의해 사멸된 세포를 Hoechst 33,342 시약으로 염색하여 관찰한 사진을 나타낸 것이고, E는 MDA-MB-231 세포에 대하여 카우다틴 화합물 처리 여부에 따른 세포 이동정도를 화합물의 처리 농도 및 시간별 스크래치 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, F는 카우다틴에 의한 암세포 이동 및 침윤 여부를 트랜스웰 분석으로 확인한 것이며, G는 카우다틴을 농도별 MDA-MB-231 세포에 처리한 후, 콜로니의 형성여부를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 마우스 동물모델에서 카우다틴 처리에 따른 종양 억제 효과를 확인한 것으로, MDA-MB-231 암세포를 암컷 누드 마우스에 주입한 후, 카우다틴을 투여한 군 및 대조군으로 DMSO를 투여한 군에 대하여, 체중의 변화 (A), 종양 부피변화 (B) 및 종양의 무게 (C)를 각각 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 암 세포주 (MDA-MB-231)에서 카우다틴 처리에 따른 CD44high/CD24low 및 ALDH (aldehyde dehydrogenase) 양성 세포 집단의 변화를 분석한 것으로, A는 유세포 분석기를 통해 카우다틴 처리군 및 대조군에서 CD44high/CD24low 세포집단을 분석한 것이고, B는 ALDEFLUOR 분석 및 FACS 분석결과를 나타낸 것으로, 오른쪽 그래프들은 ALDH 억제제인 DEAB를 처리한 군에서의 ALDH 양성 세포집단을 분석한 것이고, 왼쪽 그래프들은 DEAB를 처리하지 않은 군에서의 ALDH 양성 세포집단을 분석한 것이다.
도 11은 카우다틴의 유비퀴틴 의존적 GR 분해를 통한 GR (glucocorticoid receptor) 신호전달의 억제활성을 확인한 것으로, A는 카우다틴 처리에 따른 MDA-MB-231 유래 mammospheres에서 GR 단백질의 발현정도를 웨스턴블럿으로 확인한 것이고, B는 카우다틴 처리 후, mammospheres에서 GR 유전자의 전사체 수준을 RT-qPCR을 수행하여 확인한 결과이며, C는 mammospheres를 카우다틴과 반응시킨 후, anti-GR 항체로 면역침강 수행 후, anti-ubiquitin 및 anti-GR 항체를 이용한 웨스턴블럿 결과를 나타낸 것이며, D는 mammospheres를 카우다틴 및 MG132와 24시간 동안 반응시킨 후 웨스턴블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다. E는 mammospheres를 카우다틴과 반응시킨 후, MDA-MB-231로부터 유래된 mammospheres의 세포질 분획 및 핵 분획에 대해 GR의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 것이고, F는 카우다틴이 처리된 MDA-MB-231에서 GR의 발현 및 위치를 면역형광분석을 통해 확인한 것이며, G는 GR 특이적 siRNA에 의한 GR 넉다운 시, mammospheres 형성에 미치는 영향을 분석한 결과이고, H는 GR에 대한 길항제인 RU-486 처리에 의한 mammospheres 형성에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 카우다틴의 YAP 핵 내로의 위치 억제활성 및 암 줄기세포의 형성 제어능을 분석한 결과로서, A는 mammospheres에 카우다틴을 처리하고 MDA-MB-231로부터 유래된 mammospheres에서 YAP의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 결과이고, B는 RT-qPCR을 수행하여 YAP 유전자의 전사체 수준을 측정한 것이며, C는 카우다틴이 처리된 MDA-MB-231에서 YAP의 발현 (빨간색) 및 위치를 면역형광분석을 통해 확인한 것이고, D는 mammospheres에 카우다틴을 처리 후, MDA-MB-231로부터 유래된 mammospheres의 세포질 분획 및 핵 분획에 대해 YAP 의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 것이고, E는 GR 특이적 siRNA가 처리된 MDA-MB-231 세포에서 GR 및 YAP의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 것이며, F는 YAP 특이적 siRNA 처리에 의한 mammosphere 형성에 미치는 영향을 분석한 것이며, G는 YAP/TEAD 복합체의 억제제인 verteporfin 처리에 의한 mammosphere 형성에 미치는 영향을 분석한 것이고, H~J는 카우다틴, GR siRNA 및 verteporfin를 각각 처리한 군에서 CYR61 및 CTGF 유전자의 발현수준을 RT-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 암 줄기세포의 마커 단백질의 발현 및 mammospheres 성장에 대한 카우다틴 화합물의 영향을 분석한 것으로, A는 카우다틴이 처리된 mammospheres 에서 c-Myc, Oct4, Sox2 및 CD44의 단백질 수준을 웨스턴블럿으로 분석한 결과이며, B는 mammospheres에 카우다틴을 처리한 군과 처리하지 않은 군에 대하여 시간별 단일세포로 분리되어진 세포수를 각각 측정한 결과이고, C는 카우다틴의 GR 분해작용 및 YAP 신호경로 조절을 통한 암 줄기세포의 세포사멸 메커니즘 모델을 나타낸 것이다.
도 2는 도 1에서 수득한 총 5개 분획물 중에서 2번째 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과로서, A는 2번째 분획물을 역상 C18 (ODS) 겔 크로마토그래피로 분리한 결과를 나타낸 것이고, B는 상기 2번째 분획물의 역상 C18 (ODS) 겔 크로마토그래피로 분리된 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 도 2에서 암 줄기세포 억제능을 보이는 분획물 (30~50%)을 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피를 이용하여 다시 3개의 분획물로 분리하고 각 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 것으로, A는 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피를 수행한 결과를 나타낸 것이고, B는 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피로 수득한 총 3개의 분획물에 대한 TLC 분리 및 UV 조사 결과를 나타낸 것이며, C는 상기 총 3개의 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 도 3에서 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피로 분리된 3개의 분획물 중, 암 줄기세포에 대한 억제능을 갖는 1번째 분획물을 다시 TLC 분리를 수행한 후 UV 조사하여 형광 가시화한 결과를 나타낸 것이고 (A 및 B), C는 상기 TLC 분리로 얻은 총 4개의 밴드에 대한 분획물에 대하여 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 도 4에서 암 줄기세포 억제능을 보인 3번 분획물을 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)를 수행하여 활성성분의 화합물을 분리한 결과를 나타낸 것으로, A는 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이고, B는 HPLC 크로마토그램으로 용출된 활성 성분을 포함한 분획에 대한 TLC 분리를 수행한 결과이며, C는 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 이엽우피소 추출물로부터 분리된 활성 성분인 카우다틴 화합물에 대한 NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 카우다틴 화합물을 함유한 분획물의 추출공정 (A), 카우다틴 화합물의 암 줄기세포 억제능 분석결과 (B) 및 카우다틴 화합물의 화학 구조식 (C)을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 카우다틴 화합물의 유방암 세포의 증식 및 mammosphere 형성에 미치는 영향을 분석한 것으로, A는 MDA-MB-231 세포에 카우다틴을 농도별로 처리한 후 세포 증식 정도를 분석한 결과이고, B는 카우다틴 및 ciclesonide을 각각 처리하고 MDA-MB-231 세포 유래의 mammosphere 형성 정도를 MFE (mammosphere formation efficiency)로 분석한 결과 및 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이고, C는 카우다틴에 처리된 MDA-MB-231 세포에 대한 세포사멸 정도를 Annexin V/propidium iodide (PI) 염색으로 확인한 결과이며, D는 카우다틴에 의해 사멸된 세포를 Hoechst 33,342 시약으로 염색하여 관찰한 사진을 나타낸 것이고, E는 MDA-MB-231 세포에 대하여 카우다틴 화합물 처리 여부에 따른 세포 이동정도를 화합물의 처리 농도 및 시간별 스크래치 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, F는 카우다틴에 의한 암세포 이동 및 침윤 여부를 트랜스웰 분석으로 확인한 것이며, G는 카우다틴을 농도별 MDA-MB-231 세포에 처리한 후, 콜로니의 형성여부를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 마우스 동물모델에서 카우다틴 처리에 따른 종양 억제 효과를 확인한 것으로, MDA-MB-231 암세포를 암컷 누드 마우스에 주입한 후, 카우다틴을 투여한 군 및 대조군으로 DMSO를 투여한 군에 대하여, 체중의 변화 (A), 종양 부피변화 (B) 및 종양의 무게 (C)를 각각 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 암 세포주 (MDA-MB-231)에서 카우다틴 처리에 따른 CD44high/CD24low 및 ALDH (aldehyde dehydrogenase) 양성 세포 집단의 변화를 분석한 것으로, A는 유세포 분석기를 통해 카우다틴 처리군 및 대조군에서 CD44high/CD24low 세포집단을 분석한 것이고, B는 ALDEFLUOR 분석 및 FACS 분석결과를 나타낸 것으로, 오른쪽 그래프들은 ALDH 억제제인 DEAB를 처리한 군에서의 ALDH 양성 세포집단을 분석한 것이고, 왼쪽 그래프들은 DEAB를 처리하지 않은 군에서의 ALDH 양성 세포집단을 분석한 것이다.
도 11은 카우다틴의 유비퀴틴 의존적 GR 분해를 통한 GR (glucocorticoid receptor) 신호전달의 억제활성을 확인한 것으로, A는 카우다틴 처리에 따른 MDA-MB-231 유래 mammospheres에서 GR 단백질의 발현정도를 웨스턴블럿으로 확인한 것이고, B는 카우다틴 처리 후, mammospheres에서 GR 유전자의 전사체 수준을 RT-qPCR을 수행하여 확인한 결과이며, C는 mammospheres를 카우다틴과 반응시킨 후, anti-GR 항체로 면역침강 수행 후, anti-ubiquitin 및 anti-GR 항체를 이용한 웨스턴블럿 결과를 나타낸 것이며, D는 mammospheres를 카우다틴 및 MG132와 24시간 동안 반응시킨 후 웨스턴블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다. E는 mammospheres를 카우다틴과 반응시킨 후, MDA-MB-231로부터 유래된 mammospheres의 세포질 분획 및 핵 분획에 대해 GR의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 것이고, F는 카우다틴이 처리된 MDA-MB-231에서 GR의 발현 및 위치를 면역형광분석을 통해 확인한 것이며, G는 GR 특이적 siRNA에 의한 GR 넉다운 시, mammospheres 형성에 미치는 영향을 분석한 결과이고, H는 GR에 대한 길항제인 RU-486 처리에 의한 mammospheres 형성에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 카우다틴의 YAP 핵 내로의 위치 억제활성 및 암 줄기세포의 형성 제어능을 분석한 결과로서, A는 mammospheres에 카우다틴을 처리하고 MDA-MB-231로부터 유래된 mammospheres에서 YAP의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 결과이고, B는 RT-qPCR을 수행하여 YAP 유전자의 전사체 수준을 측정한 것이며, C는 카우다틴이 처리된 MDA-MB-231에서 YAP의 발현 (빨간색) 및 위치를 면역형광분석을 통해 확인한 것이고, D는 mammospheres에 카우다틴을 처리 후, MDA-MB-231로부터 유래된 mammospheres의 세포질 분획 및 핵 분획에 대해 YAP 의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 것이고, E는 GR 특이적 siRNA가 처리된 MDA-MB-231 세포에서 GR 및 YAP의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 것이며, F는 YAP 특이적 siRNA 처리에 의한 mammosphere 형성에 미치는 영향을 분석한 것이며, G는 YAP/TEAD 복합체의 억제제인 verteporfin 처리에 의한 mammosphere 형성에 미치는 영향을 분석한 것이고, H~J는 카우다틴, GR siRNA 및 verteporfin를 각각 처리한 군에서 CYR61 및 CTGF 유전자의 발현수준을 RT-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 암 줄기세포의 마커 단백질의 발현 및 mammospheres 성장에 대한 카우다틴 화합물의 영향을 분석한 것으로, A는 카우다틴이 처리된 mammospheres 에서 c-Myc, Oct4, Sox2 및 CD44의 단백질 수준을 웨스턴블럿으로 분석한 결과이며, B는 mammospheres에 카우다틴을 처리한 군과 처리하지 않은 군에 대하여 시간별 단일세포로 분리되어진 세포수를 각각 측정한 결과이고, C는 카우다틴의 GR 분해작용 및 YAP 신호경로 조절을 통한 암 줄기세포의 세포사멸 메커니즘 모델을 나타낸 것이다.
본 발명은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum) 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 카우다틴 (Caudatin) 화합물이 암 줄기세포 (cancer stem cells; CSC)에 대한 성장억제 활성이 우수하여 새로운 항암제로 사용 가능함을 규명하였다.
본 발명자들은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 대하여 다시 에틸아세테이트 분획물을 수득하였고, 상기 에틸아세테이트 분획물로부터 활성성분인 카우다틴 (Caudatin) 화합물을 분리하였고, 이들에 대한 항암 활성을 분석하였다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에 의하면, 이엽우피소의 메탄올 추출물의 물 분획물에 대한 에틸아세테이트 분획물을 수득하고, 상기 분획물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 통해 총 5개의 분획물을 얻은 다음, 이 중에서 암 줄기세포 억제능을 보이는 2번째 분획물을 다시 C18 오픈 컬럼크로마토그래피를 통해 총 4개의 분획물을 얻었으며, 이 중 암 줄기세포 억제능을 보이는 30~50% 분획물에 대하여 다시 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 통해 총 3개의 분획물을 수득하였다. 상기 3개의 분획물 중에서 1번째 분획물이 암 줄기세포에 대한 억제능이 있는 것으로 확인되어, 상기 1번째 분획물에 대한 HPLC를 수행하여 본 발명의 카우다틴 화합물을 최종적으로 분리 및 동정하였다.
나아가 본 발명의 다른 일실시예에서는, 본 발명에서 분리된 카우다틴 화합물에 대한 항암 활성여부를 확인하기 위하여, 카우다틴 화합물 처리에 따른 암 세포주에 대한 증식 억제능 및 맘모스페어 (mammosphere) 형성 억제능을 분석하였는데, 그 결과, 카우다틴 처리 농도 의존적으로 암 세포주에 대한 증식을 억제하고, 암 세포주의 세포사멸 (apoptosis)을 유도할 뿐만 아니라 암 줄기세포에 대한 성장 억제 및 맘모스페어 (mammosphere) 형성 억제 활성이 우수한 것으로 나타났다.
유방암 세포주 뿐만 아니라 폐암을 비롯한 다양한 암 세포주의 경우, 줄기세포의 성질을 가지는 세포들이 서로 부착되어 구형의 세포 덩어리를 형성할 수 있는데, 이를 투머스페어 (tumorsphere)라 한다. 상기 투머스페어는 하나의 암 줄기세포 또는 암 전구세포의 증식에 의해 발달된 종양구를 의미한다.
또한, 유방암 세포주는 시험관 내에서 부착 없이도 세포사멸하지 않고 타원 형태로의 성장을 할 수 있는 줄기세포와 유사한 능력을 가진 세포의 부분집락을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 부유배양으로 기층이 없는 조건을 인공적으로 만들면 줄기세포의 성질을 가지는 세포들은 서로 부착되어 구형의 세포 덩어리를 만들게 되며, 이러한 세포 덩어리를 뉴로스페어 (neurosphere)라 불린다. 인간의 유방 줄기세포에 이러한 개념을 적용한 것이 "맘모스페어 (mammosphere)"이다.
맘모스페어는 일반 인간 유방 세포보다 8배 많은 전구 세포들이 존재하며 지속적으로 계대 배양이 가능하고, 여러 번의 계대 배양 후에는 100%의 세포가 모두 bi-potent 전구체로 자라는 특징이 있다. 맘모스페어는 성인 유방 세포인 유선 상피세포 (mammary gland epitherlial cell), 관 상피세포 (ductal epithelial cell), 엘비올라 상피세포 (alveolar epitherlial cell)들로 모두 분화가 가능하며, 마트리겔 (Matrigel) 내에서 삼차원 구조를 이루면서 복잡한 기능성 유방 구조물을 형성하는 것이 관찰된다. 맘모스페어는 줄기세포의 가장 특징 중의 하나인 자가 증식을 할 수 있는 성질이 있어서 하나의 맘모스페어에서 여러 개의 맘모스페어 또는 유방줄기세포를 다량으로 얻을 수 있다. 또한 조혈모 세포, 신경 줄기세포, 배아 줄기세포 등과 비교하여 많은 발현 유전자가 중복되는 것이 확인되어, 맘모스페어가 실제적인 유방암 줄기세포인 것으로 보고 되었다. 이러한, 암 줄기세포의 자가 재생 능력의 표준 분석 방법은 in vivo 에서의 이식 (transplantation) 및 in vitro에서의 맘모스페어 형성을 분석하는 것이다.
이러한 점에서 본 발명의 카우다틴 화합물은 유방암 줄기세포인 맘모스페어의 형성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 암 세포주의 콜로니 형성, 이동 및 침윤을 모두 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는, CD44+/CD24- 표현형과 ALDH1을 발현하여 악성종양의 특성을 유지하는 유방암 줄기세포에 대해 카우다틴 화합물을 처리한 결과, CD44+/CD24- 표현형과 ALDH1을 발현하는 유방암 줄기세포의 세포수가 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 본 발명자들은 카우다틴 화합물이 암 줄기세포를 타겟팅하는 보다 효과적인 새로운 암 치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 암 줄기세포에 대한 카우다틴 화합물의 활성 메커니즘을 확인하였는데, 이를 위해 유방암 세포주인 MDA-MB-231 맘모스페어에서 카우다틴 처리에 의한 GR (glucocorticoid receptor)의 발현변화를 측정하였다.
그 결과, 카우다틴 처리에 의해 총 GR의 단백질 수준이 감소한 것으로 나타났으며, 유비퀴틴화된 GR의 수준이 증가한 것으로 나타났고, 반면, 프로테아좀 억제제인 MG132를 처리한 군에서는 카우다틴에 의한 GR 분해가 억제되는 것으로 나타났다. 이를 통해 카우다틴이 유비퀴틴 (Ub) 관련 GR의 분해를 활성화시킬 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 유방암 줄기세포 (BCSC)에 GR-특이적 siRNA를 처리하여 GR 유전자의 발현을 넉다운 시킨 결과, 종양구 (tumorsphere)의 형성능이 현저하게 감소한 것으로 나타났고 맘모스페어의 형성이 억제되는 것으로 나타났다. 또한, GR 신호경로의 하위 인자인 YAP (Yes-associated protein)에 대한 카우다틴의 영향을 분석한 결과, 카우다틴이 처리된 맘모스페어에서 전사보조 활성화 인자 (transcription co-activator)인 YAP의 수준이 감소되어 있는 것으로 나타났고, 유방암 줄기세포의 형성에 관여하는 YAP의의 타겟 유전자인 CTGF 및 CYR61의 전사체 수준이 카우다틴 처리에 의해 감소되는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 GR/YAP의 신호전달 경로가 맘모스페어 형성에 관여하며 조절자로 작용한다는 것을 의미하며, 카우다틴 화합물이 암 줄기세포, 특히 유방암 줄기세포에서 유비퀴틴 의존적 분해를 통해 GR 신호전달의 이상을 유도하며, 암 줄기세포에 필요한 유전자들의 발현을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 카우다틴 화합물은 암 줄기세포에 대한 마커 유전자들의 발현 억제 활성이 있음을 확인하였는데, 카우다틴 처리 시, c-Myc, Oct4, Sox2 및 CD44를 포함한 줄기세포 마커 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
그러므로 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 메탄올 추출물로부터 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 카우다틴 화합물은, 암 줄기세포의 성장억제; 암 세포의 증식억제; CD44+/CD24- 및 탈수소효소 (ALDH)를 발현하는 암 세포의 성장억제; 맘모스페어 (mammosphere)의 형성 억제 또는 맘모스페어의 성장억제; 또는 유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor) 분해 활성 및 GR (glucocorticoid receptor) 신호경로 차단; 활성을 가지고 있어 효과적으로 암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서, 상기 "암"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. "암"이란 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로 과다증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미한다.
본 발명에서, 상기 "암 줄기세포"는 다양한 암세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화세포로, 상기 암으로는 결장암 및 직장암을 포함하는 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계 (central nervous system;CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 또는 뇌하수체선종일 수 있다. 보다 바람직하게는 유방암 일 수 있다.
본 발명에서 "암 줄기세포 성장 억제"는 암 줄기세포 유지 (maintenance) 억제, 암 줄기세포 악성화 (malignance) 억제, 암 줄기세포 이동 및 암 줄기세포 침윤활성 (invasive) 억제를 포함한다.
또한 “암 줄기세포 예방”은 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 암 줄기세포의 성장 또는 증식을 방지시키거나, 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 상기 "약학적으로 허용되는 염"은 상기 화합물의 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조된 염을 의미하며, 이러한 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용되는 염은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다.
예를 들어, 약제학적으로 허용되는 염기 부가 염들은 무기 및 유기 염기들로부터 제조될 수 있다. 무기 염기들로부터 유도된 염들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 및 마그네슘 염들을 포함할 수 있다. 유기 염기들로부터 유도된 염들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 일차, 이차 및 삼차 아민; 천연적으로 발생하는 치환된 아민들을 포함하는 치환된 아민들; 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민 (tromethamine), 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인 (procaine), 히드라바민 (hydrabamine), 콜린 (choline), 베타인 (betaine), 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민 (theobromine), 퓨린, 피페라진, 피페리딘, 및/또는 N-에틸피페리딘을 포함하는 시클릭 아민들의 염들을 포함할 수 있다. 또한, 다른 카르복실산 유도체, 예를 들어 카르복사미드 (carboxamides), 저급 알킬 카르복사미드, 디 (저급 알킬) 카르복사미드 등을 포함하는 카르복실산 아미드도 포함될 수 있다.
예를 들어, 약학적으로 허용되는 산 부가 염들은 무기 및 유기산들로부터 제조될 수 있다. 무기산들로부터 유도된 염들은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 유기산들로부터 유도된 염들은 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산 (malic acid), 말론산, 숙신산, 말레산 (maleic acid), 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산 (cinnamic acid), 만델산 (mandelic acid), 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔 술폰산, 및/또는 살리실산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 (carrier) 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용 (처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 "담체"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.
본 발명의 카우다틴은 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다. 상기 약학 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효성분인 PAA와 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 유효성분; 약학적으로 허용되는 적당한 담체; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용되는 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 유효성분은 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입 (infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태 (연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.
또한 본 발명은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 이엽우피소 메탄올 추출물에 대한 물 분획물의 에틸아세테이트 분획물은 암 줄기세포의 성장 억제 활성이 있음을 하기 실시예를 통해 확인하였고, 상기 에틸아세테이트 분획물에는 카우다틴 화합물이 포함되어 있다.
또한 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포의 성장억제용 조성물을 제공할 수 있다.
나아가 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있으며, 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
본 발명의 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물은 식품 조성물로 이용될 수 있는데, 이 경우, 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 구체적으로 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 기능성 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 식품의 예로서 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명의 식품에는 특수영양식품 (예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류 (예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품 (예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류 (예, 스넥류), 유가공품 (예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품 (각종 김치류, 장아찌 등), 음료 (예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료 (예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 기능성 식품, 음료, 식품첨가제 또는 음료첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 "기능성 식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병 방지와 회복등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강기능식품일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 "기능"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 유방암 줄기세포 성장 억제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
또한, 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.
나아가 본 발명은 암 줄기세포에 카우다틴 화합물을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법을 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 실험방법>
1) 시약
실리카 겔 60 및 박층 크로마토그래피 (TLC) 플레이트는 MERK (Darmstadt, 독일) 사에서 구입한 것을 사용하였고, Sephadex LH-20은 Pharmacia (스웨덴 웁살라) 사에서 구입하여 사용하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 Shimadzu 적용 시스템 (Shimadzu, Kyoto, 일본) 제품을 사용하였다. 세포 생존율 분석은 EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit (DoGenBio, Seoul, 대한민국) 제품을 사용하였고, Caudatin (순도는> 98%)은 ChemFaces Co. (중국 후베이) 사에서 구입하여 사용하였는데, 100% DMSO를 이용하여 100mM 농도로 용해한 후, -20°C에서 보관하였고, 최종 DMSO의 농도는 0.1 % 미만으로 사용하였으며, 대조군은 DMSO만 처리한 군을 사용하였다.
2) 식물준비
이엽우피소 (C. auriculatum)는 대구 시장에서 구입한 것을 사용하였고, 시료(2018_03 호)는 제주 대학교 바이오소재학과에 기탁되어 있다.
3) 세포배양 및 맘모스페어 (mammosphere) 형성 분석
인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포는 American Type Culture Collection (미국 메릴랜드 주 Rockville)에서 수득하여 사용하였고, 10% (V/V) 소태아 혈청 (FBS; HyClone, Thermo Fisher Scientific, CA, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, CA, USA)이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 유방암 세포주들은 초저 부착용 6-웰 플레이트에 웰당 1x104개 세포수로 배양하였는데, hydrocortisone (0.48ug/mL), heparin (4ug/mL) 및 caudatin (100uM)이 첨가된 MammoCult. culture medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada) 배지를 이용하여 7일 동안 배양하였다. 2 차 mammosphere 형성을 위해 1차 mammosphere를 개별적으로 코니칼 튜브에 수집한 후, 1000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 이후 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 1X EDTA/Trypsin으로 처리하고 단일 세포 현탁액을 2mL의 complete MammoCultTM 배지가 첨가된 6-웰 플레이트에 웰당 1x104개 세포수로 분주하여 배양하였고, 5일 동안 mammosphere 의 수와 크기를 대조군과 비교하여 분석하였다. Mammosphere의 형성은 NIST의 NICE (integrated colony enumerator) 프로그램을 이용하여 정량화 하였고, MFE%( mammosphere formation efficiency)로 측정하였다. 여기서 상기 MFE(%)는 하기 계산식으로 계산하였다.
MFE (%)= [대조군 또는 약물 처리군에서의 sphere 수/대조군(DMSO 처리군)에서의 sphere 수] x100
4) 세포증식 분석
유방암 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 1.5x104개 세포로 분주하고 24시간 동안 배양 후, 농도별 카우다틴 화합물 (25, 50, 100, 150, 300 및 400uM)을 상기 세포에 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 이후 EZ-Cytox kit (DoGenBio, Seoul, Korea)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 세포증식 정도를 분석하였으며 OD450 값은VERSA max 마이크로 플레이트리더기 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
5) Annexin V / PI (Propidium Iodide)을 이용한 세포 아폽토시스 및 Hoechst을 이용한 아폽토시스 핵의 염색
MDA-MB-231 세포를 6웰 플레이트에서 24시간 동안 카우다틴 (100uM)과 함께 배양하였다. 이후 Annexin V / PI 염색 키트를 사용하여 제조사 (BD, San Jose, CA, USA)의 지침에 따라 아폽토시스 분석을 수행하였다. 염색된 세포는 Accuri C6 (BD, San Jose, CA, USA)으로 분석하였다. 또한, MDA-MB-231 세포를 100uM caudatin과 함께 24시간 동안 배양한 다음, 세포를 37°C에서 10 분 동안 Hoechst 33,342 염색용액 (Invitrogen TM, 미국 캘리포니아주 Thermo Fisher Scientific)으로 염색한 후, 염색된 세포를 CELENA® S Digital Imaging System (Logos Biosystems, 안양, 한국)으로 분석하였다.
6) 스크래치 분석
MDA-MB-231 암세포를 DMEM/10% FBS와 함께 2×106개 세포수로 6-웰 플레이트에 분주하였다. 세포가 단층으로 성장하면, 마이크로 팁을 사용하여 스크래치를 주었다. 1X PBS로 2회 세척 후, 상기 세포에 50 또는 100uM의 카우다틴을 신선한 DMEM/0.5% FBS 배지와 함께 첨가하고 12시간 동안 배양하였다. 상처 부위에 대한 현미경 사진은 광학현미경으로 분석하였다. 세포들이 가로질러 이동한 흰색 선은 임의적으로 선택한 5개 영역에 대하여 측정하였고, 억제율 (%)은 아무것도 처리하지 않은 웰을 100%로 하여 계산되었다.
7) 트랜스웰 분석
새포 침윤 및 세포이동 분석은 8um 기공을 갖는 폴리카보네이트 멤브레인 (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)으로 상기 막은 24 웰 삽입물에 Matrigel 매트릭스 기저 (BD, San Jose, CA, USA)로 코팅된 것과 코팅되지 않은 것을 사용하였다. 0.5% FBS가 포함된 DMEM에 100uM 카우다틴 화합물이 처리된 200ul의 MDA-MB-231 세포 현탁액 (1x105 세포)을 상부 챔버에 첨가하였다. 그런 다음 화학주성인자 (chemoattractant)로서 20% FBS를 포함하는 900uL의 DMEM을 하부 챔버에 첨가하였다. 암 세포는 2일 동안 5% CO2 배양기에서 37℃ 온도 하에 배양하였다. 이후 막을 통과한 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정하고 0.03% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 이미지는 역광 현미경으로 수득하였다.
8) 콜로니 형성능 분석
MDA-MB-231 세포 (5x102개 세포/웰)를 6웰 플레이트에서 농도별 (50, 100, 150, 300 및 400uM) 카우다틴 화합물과 함께 7일 동안 배양하였다. 이후 콜로니는 3.7 % 포름알데히드로 10분 동안 고정하고 0.05 % 크리스탈 바이올렛으로 30분 동안 염색하였다. 성장한 콜로니는 스캐너 (Umax PowerLook 1100, lasersoft Imaging, 서울, 한국)를 이용하여 분석하였다.
9) 유세포 분석 및 ALDH1 활성분석
유세포 분석은 24시간 동안 카우다틴 (100uM) 처리 후, MDA-MB-231 세포를 1X 트립신/ EDTA를 처리하여 수득한 후, 항-CD24 PE-접합 항체 및 항-CD44 FITC-접합 항체 (BD, San Jose, CA, USA)를 처리하고 얼음 위에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 암세포를 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) 버퍼로 3회 세척하고 Accuri C6 세포 계측기 (BD, San Jose, CA, USA)로 분석하였다. MDA-MB-231 세포의 ALDH 활성은 ALDEFUOR TM-분석키트 (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada)를 사용하여 수행하는데, 암세포에 카우다틴 (100uM)을 24시간 동안 처리하고 ALDH 분석 버퍼에서 37°C의 온도로 30분 동안 반응시켰다. 이후 ALDH 양성 세포를 Accuri C6 (BD, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
10) 웨스턴 블럿
용해 버퍼를 사용하여 mammospheres 및 암 세포로부터 단백질 샘플을 수득하였다. 10% SDS 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 수행한 후, 단백질을 PVDF멤브레인 (Millipore, Burlington, MA, USA)으로 이동시켰다. 이후 멤브레인을 Odyssey 블록킹 버퍼로 실온에서 1시간 동안 블록킹 한 다음, 1차 항체로 밤새도록 반응시켰다. 이때 상기 항체는 항-c-Myc (551101, BD, San Jose, CA, 미국), anti-Oct4 (LF-MA30482) 및 anti-GAPDH (LF-PA0018) (AbFrontier, Seoul, Korea); anti-YAP (sc-101199), anti-Lamin B (sc-365962), anti-CD44 (sc-7297) 및 anti-Sox2 (sc-365923) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 및 anti-GR (# 12041, Cell Signaling Technology, Danvers, MA 미국)을 사용하였다. Tris-buffered saline/Tween 20을 사용하여 상기 멤브레인을 3회 세척한 후, 모든 멤브레인을 IRDye 680RD- 및 IRDye 800W- 표지된 2차 항체로 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 신호 이미지는 Odyssey CLx (Li-Cor, Lincoln, NE, USA)로 분석하였고, 웨스턴 블럿의 농도 측정은 Odyssey CLx의 Image Studio Ver 5.2 프로그램 (Li-Cor, Lincoln, NE, USA)을 사용하여 분석하였다.
11) 면역침강 (Immunoprecipitation; IP)
단백질 샘플은 프로테아제 억제제를 포함하는 IP 용해버퍼를 사용하여 mammospheres로부터 추출하였다. 단백질 농도 검출 후, 모든 샘플 (샘플 당 450ug)을 30ul의 Puredown Protein A/G-Agarose (GenDEPOT, DAWINbio, Hanam, Korea)와 반응시켜 비특이적 단백질을 제거하였다. 이후 제조업체의 프로토콜에 따라 anti-GR 단일클론항체(mAb) (# 12041, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 상기 단백질 샘플에 첨가하고 4°C에서 밤새도록 반응시켰다. 그 다음, 50uL의 Puredown Protein A/G-Agarose를 각 샘플과 혼합하고 4°C에서 4시간 동안 부드럽게 회전시켰다. 원심 분리 후, IP 용해버퍼로 세척 후 모든 샘플을 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
12) 유전자 발현분석
MDA-MB-231 세포 및 mammospheres 로부터 RNA를 분리하고 정제한 후, one-step RT-qPCR kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 실시간 RT-qPCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 하기 표 1에 기재하였다.
Real-time RT-qPCR에 사용한 프라이머들의 서열
13) 면역형광분석 (Immunofluorescence; IF)
24 시간 동안 카우다틴 (100uM) 처리 후, MDA-MB-231 세포를 3.7% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 0.5 % Triton X-100으로 15분 동안 permeabilized 시키고, 3% 소혈청 알부민 (BSA)으로 60분 동안 블록킹을 수행하였다. 이후 토끼 anti-GR mAb (# 12041, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 및 마우스 anti-YAP mAb (sc-101199, Santa Cruz Biotechnology, 댈러스, 텍사스, 미국)로 염색하였고, 이후 anti-토끼 Alexa 488-접합 이차 항체 (A32731) 및 anti-마우스 Alexa 555-접합 이차 항체 (A32727) (ThermoFisher, Waltham, MA, 미국)로 염색하였다. 마지막으로 암세포의 핵을 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 염색하고, GR 및 YAP는 형광 현미경 (Lionheart, Biotek, VT, USA)으로 시각화하였다.
14) siRNA 처리
MDA-MB-231 세포에 human GR- 및 YAP-특이적 siRNA (Bioneer, Daejeon, 한국)를 처리하여 mammosphere 형성에 대한 GR 및 YAP 단백질의 영향을 분석하였다. siRNA의 처리는 암 세포주에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 제조사의 지침에 따라 처리하였고, GR 및 YAP 단백질의 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.
15) 이종이식 (Xenograft Transplantation)
누드 마우스 실험은 4주된 암컷 누드 마우스를 OrientBio (대한민국 서울)로부터 수득하여 사용하였다. 상기 마우스는 각 독립된 케이스에서 일주일 동안 음식과 물을 섭취하도록 하면서 사육하였다. 14마리의 암컷 누드 마우스에MDA-MB-231 세포 (2x106 개의 세포/마우스)를 주입시키고, 음성 대조군과 카우다틴 화합물 처리군 (10mg/kg) 으로 나눴다. 이후 1달 동안 각 마우스 군에서의 종양부피를 계산식 [(width2 X length)/2]으로 측정하였다. 동물실험은 제주 대학교 동물병원 동물관리위원회 (IACUC)의 승인된 지침사항에 따라 수행하였다.
16) 통계처리
모든 데이터는 GraphPad Prism 7.0 소프트웨어 (GraphPad Prism, Inc., San Diego, CA, 미국)를 이용하여 분석하였다. 세 번의 독립적인 실험의 모든 데이터는 평균±표준편차 (SD)로 표시하였다. 데이터는 일원 분산분석을 사용하여 분석하였다. 0.05 미만의 p-value 값은 유의미한 값으로 간주하였다.
<실시예 1>
이엽우피소로부터 카우다틴 화합물의 분리 및 동정
<1-1> 이엽우피소로부터 카우다틴 화합물의 분리
이엽우피소 (C. auriculatum)를 분쇄한 후, 메탄올 추출을 수행하였는데, 분쇄한 이엽우피소 1kg에 메탄올 7.5L를 첨가하여 메탄올 추출물을 수득한 다음, 이를 농축하고 물을 첨가하여 혼합한 다음, 메탄올을 증발시켰다. 메탄올이 증발된 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 에틸아세테이트 분획물을 수득한 다음, 이를 농축하고 농축액을 실리카 겔 컬럼 (3x30 cm)에 로딩한 다음, 용출용매 (클로로포름:메탄올, 20:1 혼합용매)로 분획화하였다. 상기 과정으로 수득한 총 5개 분획물에 대해 mammosphere 형성 여부를 분석하였으며, 2번째 분획물이 mammosphere 형성 억제 활성이 있는 것으로 나타났다 (도 1 참조). 이후 2번째 분획물을 역상 C18 오픈 컬럼 (5x10 cm)에 로딩하여 4개의 분획물을 얻었으며, 이들 분획물에 대한 mammosphere 형성 여부를 분석하였다 (도 2 참조). 그 결과, 30~50%의 분획물에서 mammospher의 형성이 억제되는 것으로 나타났고, 30~50%의 분획물을 다시 Sephadex LH-20 컬럼 (2.5x30 cm)에 로딩하여 3개의 분획물을 수득하였다(도 3 참조). 3개의 분획물 중에서 1번째 분획물이 mammospher의 형성 활성이 있는 것으로 나타났다. 상기 1번째 분획물을 다시 TLC (glass plate; 20x20, layer thickness; 210-270um)에 로딩하고 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매 (20:1)로 TLC 유리 챔버에서 2시간 동안 현상화시켰다. 이후 플레이트를 제거하고 건조한 후, UV 방사선 (UV254 nm 및 UV365 nm)을 조사하여 형광으로 가시화시켰다. 각각의 밴드를 실리카겔 플레이트로부터 분리하고 메탄올로 용리시켰다. 각 분획물은 mammosphere 형성 여부를 분석하였다 (도 4 참조). 3번째 분획물을 Shimadzu HPLC 20A 기기 (Shimadzu, Tokyo, Japan)에 로딩하고 ODS 10x250 mm C18 컬럼(유속, 2 mL/분) 상에서 분리하였으며. 이때 상기 컬럼에 로딩하기 위한 시료는 0.2m 주사기 필터로 여과시켜 준비하였고, 500 uL를 주입하였다. 이동상 용매로 물 (용매 A)과 아세토니트릴 (용매 B)를 사용하였고, 용출은 아세토니트릴 용매가 초기에 20%로 시작하여 20 분에는 80%가 되도록 하였고, 최종 30 분에는 100%가 되도록 하였다. 그 결과, 유효성분이 포함된 분획물은 머무름 시간은 35 분에서 검출되었다 (도 5 참조).
<1-2> 카우다틴 화합물의 구조분석
상기에서 최종적으로 분리된 분획물에 함유된 화합물의 규명을 위해, QTRAP-3200 기기 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용한 ESI (Electrospray ionization) 질량분석으로 수행하였다. NMR 스펙트라는 JEOL JNM-ECA 600 퓨리에 변환-핵자기 공명 스팩트럼 (FT-NMR)에서 수득하였는데, 1HNMR는 600MHz에서, 13C NMR는 150MHz에서 CD3OD 하에서 분석하였다. 분획물에 함유된 화합물의 분자구조는 질량분석법 및 NMR 분석으로 결정하였다. 분자량은 ESI 질량분석에 의해 포지티브 모드에서 m/z 513.0 [M+Na]+ 네거티브 모드에서 m/z 489.0 [M-H]- 이온 피크로 나타나 490Da으로 확인되었다. CDCl3에서의 1HNMR 스펙트럼은 δ5.46 및 5.31에서 2개의 올레핀계 메틴 양성자가 확인되었고, δ4.50 및 3.53에서 2개의 산화된 메틴 양성자가, δ1.05-2.81에서 2개의 메틴 및 7개의 메틸렌 양성자가, δ2.12, 2.07, 1.36, 1.08, 1.01 및 1.01에서 6개의 메틸 양성자 신호가 확인되었다. 13CNMR 스펙트럼에서는 28개의 탄소 피크가 검출되었는데, δ208.8 및 165.8에서 두 개의 카르보닐 탄소가 포함되어 있고, δ166.7 및 140.4에서 2개의 sp2 4차 탄소; δ117.6 및 112.8에서 2개의 sp2 메틴 탄소; δ91.4, 88.0 및 74.1에서 3개의 산화된 4차 탄소; δ71.4 및 70.6에서 두 개의 산화된 메틴 탄소; δ57.7 및 37.0에서 두 개의 4차 탄소; δ43.6 및 38.0에서 두 개의 메틴 탄소; δ38.6, 38.5, 34.1, 33.0, 31.7, 28.7 및 24.1에서 7개의 메틸렌 탄소; 및 δ27.0, 20.8, 20.7, 18.4, 16.4 및 9.3에서 6개의 메틸 탄소가 검출되었다(도 6 참조). 모든 양성자 베어링 탄소는 HMQC (heteronuclear multiple quantum coherence) 스펙트럼에 의해 어사인 되었고, 1H-1H COZY 스펙트럼은 6개의 부분 구조를 보였으며, 추가 구조규명은 이종 핵 다중결합 상관관계 (HMBC) 스펙트럼으로 수행하였는데, δ1.08의 메틸 양성자에서 δ140.4, 43.6, 38.6 및 37.0의 탄소까지; δ1.36의 메틸 양성자에서 δ91.4, 88.0, 71.4 및 57.7의 탄소까지; δ2.07 양성자에서 δ166.7, 112.8 및 38.0 탄소까지; δ 5.31의 메틴 양성자에서 δ 74.1 및 37.0의 탄소까지; δ5.46 및 4.50 메틴 양성자에서 δ165.8 에스테르 카보닐 탄소까지; 및 δ2.81/1.77의 메틸렌 양성자와 δ 2.12의 메틸 양성자에서 δ208.8의 케톤 카보닐 탄소까지 장거리 (long range) 상관관계를 보였다 (도 6 참조). 이러한 구조 분석을 통해 본 발명의 분획물에 포함된 유효성분의 화합물은 카우다틴 (caudatin)인 것으로 확인되었다.
상기 본 발명의 방법에 있어서, 카우다틴을 함유한 분획물의 추출공정 및 분리된 카우다틴 화합물의 구조식은 도 7에 나타내었다.
<실시예 2>
이엽우피소 추출물의 유방암 줄기세포 (BCSC) 억제능 분석
상기 실시예 1에서 수득한 이엽우피소의 용매 추출물 및 분획물에 대하여 mammosphere 형성 억제능 분석을 수행하였는데, 그 결과, 이엽우피소의 메탄올 추출물이 MDA-MB-231 세포주를 대상으로 mammosphere의 형성을 억제하는 활성이 있는 것으로 확인되었고 (도 7B), 메탄올 추출물의 에틸아세테이트의 분획물로부터 활성성분을 분리한 결과, 도 7에 기재된 화학구조식을 갖는 카우다틴 화합물을 동정하였다 (도 7C).
<실시예 3>
이엽우피소 추출물에서 분리한 카우다틴 화합물의 암세포 증식억제 및 맘모스페어 형성 억제능 분석
상기 실시예 1에서 이엽우피소 추출물로부터 분리 및 동정한 카우다틴 화합물이 항암 활성이 있는지를 확인하기 위해, 암 세포주에 대한 증식 억제능 및 mammosphere 형성 억제능 여부를 분석하였다. 이를 위해 MDA-MB-231 유방암 세포주에 카우다틴 화합물을 농도별로 처리한 후, 암세포 증식 억제 여부를 분석하였는데, 그 결과, 카우다틴 화합물 처리 농도 의존적으로 유방암 세포주의 성장이 억제되는 것으로 나타났다 (도 8A). 또한 MDA-MB-231 및MCF-7로부터 형성된 mammosphere에 카우다틴 화합물을 농도별 처리한 결과, 처리 농도 의존적으로 mammosphere의 형성이 억제되는 것으로 나타났으며, 2차의 mammosphere 형성도 억제하는 것으로 나타났다. 또한 카우다틴 화합물은 mammosphere의 수 및 크기를 모두 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다 (도 8B). 이러한 본 발명의 카우다틴 화합물의 활성은 mammosphere에 대한 억제제로 알려진 ciclesonide을 처리한 군과 거의 유사한 활성을 나타내었다 (도 8B).
나아가 본 발명의 카우다틴 화합물은 암세포의 세포사멸 (아폽토시스)을 유도하는 것으로 나타났는데, Annexin V-FITC 및 PI 염색 수행 결과, 카우다틴 화합물이 처리된 MDA-MB-231 세포에서는 초기 세포사멸된 세포가 증가하는 것으로 나타났고 (도 8C), Hoechst 염색을 통해 세포사멸체의 형성이 유도되는 것으로 나타났다 (도 8D). 또한 카우다틴 화합물은 유방암 세포의 콜로니 형성, 이동 및 침윤을 모두 억제할 수 있는 것으로 나타났다 (도 8E~G).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 카우다틴 화합물이 암 세포의 성장 및 mammosphere 형성을 억제할 뿐만 아니라 콜로니 형성, 암세포 이동 및 침윤도 모두 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4>
카우다틴 화합물의 이종이식 종양 성장의 억제활성 분석
카우다틴 화합물이 in vitro에서 유의미한 항암 효과를 보였기 때문에 in vivo 연구를 통해 상기 화합물의 종양 성장에 대한 영향을 더 면밀히 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 마우스 동물을 대상으로 대조군과 카우다틴을 처리한 마우스 군 (실험군)에 대하여 각 마우스의 체중, 종양의 부피와 무게를 각각 측정하였다.
그 결과, 대조군과 실험군 간의 체중의 차이는 거의 없는 것으로 나타났다 (도 9A). 한편, 종양의 부피 (도 9B) 및 무게 (도 9C)는 키우다틴 화합물을 처리한 군에서 대조군에 비해 유의하게 감소되어 있는 것으로 나타났다.
이를 통해 본 발명의 카우다틴 화합물이 종양의 성장을 효과적으로 감소시키는 활성이 있음을 동물실험을 통해 다시 한번 확인할 수 있었다.
<실시예 5>
카우다틴 화합물의 CD44
+
/CD24
-
및 ALDH 발현 암세포의 집단 억제능 분석
유방암 줄기세포의 집단은 CD44+/CD24- 표현형과 ALDH1을 발현하여 악성종양의 특성을 유지한다. 이에 본 발명자들은 카우다틴 화합물이 이러한 악성종양의 특성을 약화시킬 수 있는지 확인하기 위해, CD44+/CD24- 표현형을 갖는 유방암 세포주에 카우다틴 화합물을 처리한 후, CD44+/CD24- 표현형 세포수를 측정하였다.
그 결과, 도 10A에 나타낸 바와 같이, CD44+/CD24- 표현형을 갖는 유방암 세포수가 카우다틴 화합물 처리에 의해 75.8%에서 68.6%로 감소한 것으로 나타났다. 또한, ALDH을 발현하는 세포수는 14.4%에서 1.4%로 현저하게 감소한 것으로 나타났다 (도 10B).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 카우다틴 화합물이 유방암 줄기세포의 마커 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었고 궁극적으로 유방암 줄기세포에 대한 억제 활성을 통해 항암 활성을 가질 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 6>
유방암 줄기세포에서 카우다틴 화합물의 유비퀴틴 의존적 GR 분해를 통한 GR 신호 차단능 분석
유방암 줄기세포 (BCSC)에 대한 카우다틴 화합물의 활성 메커니즘을 분석하기 위하여, MDA-MB-231 mammospheres에서 GR (glucocorticoid receptor) 수준을 측정하였다.
그 결과, 카우다틴 화합물 처리에 의해 유의미하게 총 GR의 단백질 수준이 감소한 것으로 나타났고 (도 11A), 이를 보상하기 위한 작용으로 카우다틴 화합물 처리군에서의 GR 유전자의 전사체의 수준은 증가한 것으로 나타났다 (도 11B).
또한 mammosphere 샘플을 대상으로 카우다틴 화합물을 처리한 후, GR에 대한 면역침강 및 웨스턴 블럿을 anti-ubiquitin 항체를 이용하여 수행하였는데, 그 결과, 유비퀴틴화된 GR의 수준이 증가한 것으로 나타났다 (도 11C). 프로테아좀 억제제인 MG132를 처리한 군의 경우, 카우다틴에 의한 GR의 분해가 억제되는 것으로 나타나 이를 통해 카우다틴이 Ub- 관련 GR의 분해를 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 즉, 카우다틴으로 유도된 GR의 하향조절은 MG132에 의해 상당히 억제되는 것으로 나타났다 (도 11D).
나아가 mammospheres 에서 GR 단백질의 세포질 및 핵에서의 발현수준 (도 11E) 및 MDA-MB-231 세포에서 GR의 발현수준 (도 11F)을 면역형광분석을 통해 분석하였는데, 그 결과, 카우다틴 처리에 의해 세포질 및 핵에서 GR의 발현수준이 모두 감소하는 것으로 나타났다.
유방암 줄기세포 (BCSC)에서 GR 단백질의 역할을 확인하기 위해, GR- 특이적 siRNA에 의한 mammosphere 형성을 분석하였는데, GR-특이적 siRNA를 MDA-MB-231 세포에 처리한 결과, 종양구 (tumorsphere)의 형성능이 50% 감소한 것으로 나타났다 (도 11G). GR에 대한 길항제인 RU486을 처리한 경우에도 유방암 세포에서 mammosphere 형성이 억제되는 것으로 나타났다 (도 11H).
이러한 결과들로 GR의 신호전달은 mammosphere 형성을 조절할 수 있다는 것을 알 수 있었고, 카우다틴이 BCSC에서 Ub 의존적 분해를 통해 GR 신호전달의 이상을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 7>
카우다틴 화합물의 GR-YAP 신호전달 경로조절
카우다틴 화합물이 GR-YAP 신호전달 경로를 억제하여 BCSC의 형성을 억제할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
그 결과, 카우다틴의 처리에 의해 YAP의 총 단백질 수준 (도 12A) 및 YAP의 전사체 수준 (도 12B)에는 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 한편, mammospheres의 핵 추출물에서의 단백질 수준 (도 12D) 및 MDA-MB-231 세포에서 YAP의 면역형광 (IF) 수준 (도 12C)은 카우다틴 처리에 의해 유의미하게 감소되는 것으로 나타났다.
또한 GR-특이적 siRNA 처리로 GR이 넉다운된 MDA-MB-231 세포에서는 YAP 단백질 발현이 감소된 것으로 나타났고 (도 12E), YAP-특이적 siRNA가 처리된 MDA-MB-231 세포는 종양구의 형성능이 50% 감소된 것으로 나타났다 (도 12F). YAP-TEAD 상호작용의 억제제인 Verteporfin은 유방암 세포에서 mammosphere 형성을 현저하게 억제하는 것으로 나타났다 (도 12G).
YAP 타겟 유전자들 (CTGF 및 CYR61)을 mammosphere에서 분석하였는데, CTGF 및 CYR61 유전자의 전사체 수준이 카우다틴, GR-특이적 siRNA 또는 Verteporfin 처리에 의해 감소되는 것으로 나타났다 (도 12H~12J). 이러한 결과는 카우다틴이 유방암 줄기세포 (BCSC) 형성에 필요한 GR-YAP 신호전달 경로를 조절하고 있음을 의미한다.
<실시예 8>
카우다틴 화합물의 암 줄기세포 (CSC) 마커 단백질 발현수준 및 맘모스페어 성장에 대한 조절능 분석
카우다틴이 암 줄기세포 (CSC)에 대한 마커 유전자의 발현을 조절할 수 있는지 확인하기 위해 웨스턴 블럿을 통해 마커 유전자들의 단백질 발현수준을 분석하였다.
그 결과, 카우다틴 처리 시, c-Myc, Oct4, Sox2 및 CD44를 포함한 줄기세포 마커 단백질의 발현이 MDA-MB-231 세포로부터 유래된 mammospheres에서 감소되는 것으로 나타났다 (도 13A).
다음으로, 카우다틴이 mammospheres를 억제하는지 확인하기 위해, mammospheres에 카우다틴을 처리하고 mammospheres 유래의 유방암 세포수를 정량분석하였다. 그 결과, 카우다틴 처리에 의해 암세포의 사멸이 증가한 것으로 나타났고 mammospheres에서 암 세포수가 감소한 것으로 나타났다 (도 13B).
이상의 결과들을 통해 본 발명자들은 카우다틴 화합물이 GR/YAP의 신호전달경로 억제를 통해 암 줄기세포의 성장을 억제할 수 있음을 알 수 있었다 (도 13C).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (17)
- 카우다틴 (Caudatin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 유방암 줄기세포 표적 치료제.
- 제1항에 있어서,
상기 카우다틴은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 메탄올 추출물로부터 유래된 것인, 유방암 줄기세포 표적 치료제. - 제2항에 있어서,
상기 카우다틴은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물로부터 유래된 것인, 유방암 줄기세포 표적 치료제. - 제1항에 있어서,
상기 카우다틴은,
유방암 줄기세포의 성장억제;
유방암 세포의 증식억제;
CD44+/CD24- 및 탈수소효소 (ALDH)를 발현하는 유방암 세포의 성장억제;
맘모스페어 (mammosphere)의 형성 억제 또는 맘모스페어의 성장억제; 또는
유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor) 분해 활성 및 GR (glucocorticoid receptor) 신호경로 차단; 활성을 갖는 것인, 유방암 줄기세포 표적 치료제. - 제1항에 있어서,
상기 유방암 줄기세포는,
Oct4 및 Sox2의 발현을 증가시키는 것인, 유방암 줄기세포 표적 치료제. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 카우다틴 (Caudatin) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 유방암 줄기세포 성장억제를 통한 유방암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제10항에 있어서,
상기 카우다틴은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 메탄올 추출물로부터 유래된 것인, 건강기능식품 - 제11항에 있어서,
상기 카우다틴은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물로부터 유래된 것인, 건강기능식품 - 제10항에 있어서,
상기 카우다틴은,
유방암 줄기세포의 성장억제;
유방암 세포의 증식억제;
CD44+/CD24- 및 탈수소효소 (ALDH)를 발현하는 유방암 세포의 성장억제;
맘모스페어 (mammosphere)의 형성 억제 또는 맘모스페어의 성장억제; 또는
유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor) 분해 활성 및 GR (glucocorticoid receptor) 신호경로 차단; 활성을 갖는 것인, 건강기능식품. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 유방암 줄기세포에 카우다틴 (Caudatin)을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 유방암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법.
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