KR101592560B1 - 신규 플라보노이드 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 플라보노이드 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

신규 플라보노이드 및 그 용도{A NOVEL FLAVONOID AND USE OF THE SAME}
본 발명은 신규 플라보노이드 및 그 용도에 관한 것이다.
상처가 발생할 때, 활성화되고 협동되는 경로 및 일련의 복잡한 세포내 기작이 있다. 일반적으로 상처 복구 과정은 세 단계로 구분될 수 있다:염증, 새로운 조직 형성 및 리모델링. 이 단계들 중에서, 조직 형성은 상처 후 수일 후에 일어나고 여러 다른 세포 타입의 증식 및 이동의 특징을 가진다. 이 단계의 시작은 종종 주된 피부 세포 타입 중 하나인 각질세포의 이동이다(Wound repair and regeneration. Geoffrey C. Gurtner…. Nature Vol 453 May 2008).
일반적으로 플라보노이드는 저밀도 지단백질의 혈장 농도 감소, 혈소판 응집 저해, 유리 라디칼 소거(scavenging), 세포 증식 감소 및 혈관 긴장도(vascular tone) 조절을 포함한 여러가지 생물학적 작용을 나타내는 것으로 여겨지는매우 크고 광범위한 식물 유래 화합물 군이다.
많은 수의 플라보노이드가 동정되었는데, 이들은 하이드록실화 또는 메틸화의 위치, 벤제노이드 치환체의 위치,불포화 정도 및 부착된 치환체의 유형에 있어 서로 상이하다. 수많은 플라보노이드의 일반적인 3개의 고리 구조(A, B 및 C 고리)는 2-페닐-4H-1-벤조피란-4-온을 기본으로 한다.
[선행특허 문헌]
대한민국특허공개번호제1020040025877호
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 상처 복구에 관여하는 신규한 화합물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식1의 플라보노이드 유도체를 제공한다.
Figure 112013055490876-pat00001
[화학식 1]
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 플라보노이드 유도체는 각질세포의 이동을 유도하고, 각질세포에서 콜라겐 I, III 및 피브로넥틴의 RNA 및 단백질 레벨의 다운조절을 야기하고, 피부 섬유아세포 증식을 개선하고 피부 섬유아세포에서 콜라겐 I, III 및 피브로넥틴의 RNA 및 단백질 레벨의 업조절을 야기하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 본 발명의 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 플라보노이드 유도체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 유효성분으로 포함하는 상처 재생용 약학 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 플라보노이드 유도체 및 식품학적으로 수용가능한 담체를 유효성분으로 포함하는 상처 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 노화 방지 및 주름 억제용 조성물을 제공한다.
일반적으로 콜라겐과 피브로넥틴은 섬유아세포에서 증가한다. 그것이 섬유아세포에　 의한 노화 방지 및 주름억제의 원인이 되는 것이다. 따라서 본 발명의 플라보이드는 노화 방지 와 주름 억제 효능을 가지며, 각질세포에서의 그들의 감소는 피부재생시 이동에 관한 것으로, 두 세포가 서로 다른 일을 하고 있으므로 각질세포와 피부아세포에서 반대효과를 나타내는 것이 모두 중요하다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 각질세포 이동 유도용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 플라보노이드 유도체를 각질세포에 처리하여 각질세포의 이동을 유도하고, 각질세포에서 콜라겐 I, III 및 피브로넥틴의 RNA 및 단백질 레벨의 다운조절시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 플라보노이드 유도체를 피부 섬유아세포에 처리하여 섬유아세포의 증식을 개선하고 피부 섬유아세포에서 콜라겐 I, III 및 피브로넥틴의 RNA 및 단백질 레벨을 업조절시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 a)1,4-다이옥산(dioxane) 용매에 5-메톡시-2-하이드록시벤즈알데히드와 탄산칼륨를 녹인 후 아크롤레인(acrolein)을 가하고 환류시켜 화학식 2의 화합물을 얻는 단계;
Figure 112013055490876-pat00002
[화학식 2]
b)에탄올 용매에 p-나이트로벤조산을 녹인 후, 하이드라진 모노하이드레이트를 혼합하고 그 반응 용액에 황산을 가하고 환류시켜서 하기 화학식 3의 화합물을 얻는 단계; 및
Figure 112013055490876-pat00003
[화학식 3]
c)상기 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 에탄올에 녹인 후, 염산을 가하여 상기 본 발명의 화학식1의 플라보노이드 유도체를 합성하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "약제학적으로 수용가능한"은 바람직하지 못한 생물학적 효과를 유발하거나 그것이 함유된 약제학적 조성물의 어떠한 다른 성분들과 해로운 방식으로 상호작용하는 일 없이 환자에게 투여될 수 있다. 담체는 천연적으로 당업자들에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 활성 성분의 어떠한 분해든지 최소화하고 환자에게서 어떠한 해로운 부작용이라도 최소화하기 위해 선택될 수 있다.
본원에는 상처, 조직 손상, 염증 또는 암 부위에 투여될 수 있는 어떠한 공지의 또는 새롭게 발견된 물질을 추가로 포함할 수 있는 조성물이 제공된다. 예를 들면 본 발명의 조성물은 하나 또는 그 이상의 다음과 같은 부류를 추가로 포함할 수 있다: 항생물질 (예컨대 아미노글리코시드, 케팔로스포린, 클로르암페니콜, 클린다마이신,에리트로마이신, 플루오로퀴놀론, 마크로리드, 아졸리드, 메트로니다졸, 페니실린, 테트라사이클린, 트리메토프림-술파메톡사졸, 반코마이신), 스테로이드 (예컨대 안드란류 (예컨대 테스토스테론), 클레스탄류 (예컨대 콜레스테롤), 콜산류 (예컨대 콜산), 코르티코스테로이드류 (예컨대 덱사메타손), 에스트란류 (예컨대 에스트라디올), 프레그난류 (예컨대 프로게스테론), 마취성 및 비-마취성 진통제 (예컨대 몰핀, 코데인,헤로인, 히드로몰핀, 레보르파놀, 메페리딘, 메타돈, 옥시돈, 프로폭시펜, 펜타닐, 메타돈, 날록손, 부프레노르핀, 부토르파놀, 날부핀, 펜타조신), 화학요법제 (예컨대 항암 약물, 예컨대 그것에 한정되는 것은 아니지만,알트레타민, 아스파라기나제, 블레오마이신, 부술판, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 디에틸스틸베스테롤, 에티닐 에스트라디올, 에토포시드, 플
록스우리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루타미드, 고세렐린, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드,류프롤리드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로르에타민, 에드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 메르캅토퓨린,메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미토크산트론, 파클리탁셀, 펜타스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 프리드니손, 프로카르바진, 스트렙토조신, 타목시펜, 테니포시드, 빈블라스틴, 빈크리스틴), 항-염증제 (예컨대 알클로페낙; 알클로메타손 디프로피오네이트; 알게스톤 아세토니드; 알파 아밀라제; 암시나팔; 암시나피드; 암페낙 나트륨; 아미프릴로스 염산염; 아나킨라; 아니롤락; 아니트라자펜; 아파존; 발살라지드 2나트륨; 벤다작; 베녹사프로펜; 벤지다민 염산염; 브로멜라인스; 브로페라몰; 부데소니드; 카르프로펜; 시클로프로펜; 신타존; 클리프로펜; 클로베타솔 프로피오네이트; 클로베타손 부티레이트; 클로피락; 클로티카손 프로피오네이트; 코르메타손 아세테이트; 코르토독손; 데카노에이트; 데플라자코르트; 델라세트트릴; 데포-데스토스테론; 데소니드; 데속시메타손; 덱사메타손 디프로피오네이트; 디클로페낙 칼륨; 디클로페낙 나트륨; 디플로라손 디아세테이트; 디플루미돈 나트륨; 디플루니살; 디플루프레드네이트; 디프탈론; 디메틸 술폭시드; 드로시노니드; 엔드리손; 엔리모마브; 에놀리캄 나트륨; 에피리졸; 에토돌락; 에토페나메이트; 펠비낙; 페나몰; 펜부펜; 펜클로페낙; 펜클로락; 펜도살; 펜피팔론; 펜티아작; 플라잘론; 플루아자코르트; 플루펜남산; 플루미졸; 플루니솔리드 아세테이트;플루닉신; 플루닉신 메글루민; 플루오코르틴 부틸; 플루오로메톨론 아세테이트; 플루쿠아존; 플루르비프로펜;플루레토펜; 플루티카손 프로피오네이트; 푸라프로펜; 푸로부펜; 할시노니드; 할로베타솔 프로피오네이트; 할로프레돈 아세네이트; 이부페낙; 이부프로펜; 이부프로펜 알루미늄; 이부프로펜 피코놀; 일로니답; 인도메타신;인도메타신 나트륨; 인도프로펜; 인독솔; 인트라졸; 이소플루프레돈 아세테이트; 이속세팍; 이속시캄; 케노프로펜; 로페미졸 염산염; 로목시캄; 로테르페드놀 에타보네이트; 메클로페나메이트 나트륨; 메클로페남산; 메클로리손 디부티레이트; 메페남산; 메살라민; 메세클라존; 메스테롤론; 메탄드로스테놀론; 메테놀론; 메테놀론 아세테이트; 메틸프레드니솔론 술레프타네이트; 모미플루메이트; 나부메톤; 난드롤론; 나프록센; 나프록센 나트륨;나프록솔; 니마존; 올살라진 나트륨; 오르고테인; 오르파녹신; 옥산드롤란; 옥사프로진; 옥시펜부타존; 옥시메톨론; 파라닐린 염산염; 펜토산 폴리술페이트 나트륨; 펜부타존 나트륨 글리세레이트; 피르페니돈; 피록시캄;피록시캄 신나메이트; 피록시캄 올라민; 피르프로펜; 프레드나제이트; 프리펠론; 프로돌산; 프로쿠아존; 프록사졸; 프록사졸 시트레이트; 리멕솔론; 로마자리트; 살코렉스; 살나세딘; 살살레이트; 상귀나리움 클로라이드; 세클라존; 세프메타신; 스타노졸롤; 수독시캄; 술린닥; 수프로펜; 탈메타신; 탈니플루메이트; 탈로살레이트; 네부펠론; 테니답; 테니답 나트류미 테녹시캄; 테시캄; 테시미드; 테스토스테론; 테스토스테론 블렌드; 테트리다민;티오피낙; 틱소코르톨 피발레이트; 톨메틴; 톨메틴 나트륨; 트리클로니드; 트리플루미데이트; 지도메타신; 조메피락 나트륨) 또는 항-히스타민제 (예컨대 에탄올아민 (디펜히드라민 카르비녹사민), 에틸렌디아민 (트리펠렌아민 피릴라민), 알킬아민 (클로르페니라민, 덱스클로르페니라민, 브롬페니라민, 트리프롤리딘), 다른 항-히스타민, 예컨대 아스테미졸, 로라타딘, 펙소페나딘, 브로페니라민, 클레마스틴, 아세트아미노펜, 슈도에페드린, 트리프롤리딘).
본 발명의 조성물은 국소적으로, 경구로, 또는 비경구로 투여될 수 있다. 예를 들면 조성물은 체외로, 두개골 내로, 질 내로, 항문 내로, 피하고, 피부 안으로, 심장 내로, 위 내로, 정맥 내로, 근육 내로, 복강내 주사에 의해, 경피적
으로, 비강 안으로, 또는 흡입에 의하여 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 "두개골 내 투여"는 물질을 키테테르 또는 주사바늘을 통해 뇌로 직접, 이를테면 예컨대 인트라테칼로(intrathecal), 인트라시스터널로(intracisternal), 심실내로, 또는 설상골을 통하여(transsphenoidal) 전달되는 것을 의미한다.
조성물의 비경구 투여는, 사용되는 경우 일반적으로 주사에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 한다. 주사가능한 것은 종래 형태로, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사 전에 액체의 현탁 용액에 적당한 고체 형태, 또는 에멀션으로서 제조될 수 있다. 보다 최근에 개선된 비경구 투여를 위한 접근법은 느린 방출 또는 지속적인 방출 시스템을 사용함으로써 일정한 용량이 유지되도록 사는 것을 포함한다 (미국 특허 3,610,795호 참조).
필요한 조성물의 정확한 양은 환자에 따라서 종, 연령, 체중 및 일반적인 환자의 상태, 치료되고 있는 알레르기성 장애의 심각성, 그것의 투여 방식 등에 따라 다를 것이다. 그러므로 모든 조성물에 대하여 정확한 양을 규명하는 것은 불가능하다. 그러나 적절한 양은 당업자에 의해 당업계에서 제공되는 교시에 따라 기본적인 실험만을 사용하여서도 결정될 수 있다.
본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만,당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈,수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제,결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제,환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분,칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제,유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제,동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 피부 상처 재생 개선 효과를 나타내는 본 발명의 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품을 제공한다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는,예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
또한, 피부 재생 촉진의 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물100 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 볼 발명의 화합물이 각질세포 이동, 섬유아세포의 증식 뿐 아니라 항 노화 유전자의 발현 및 최종적으로 흉터 형성보다 피부 재생을 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 먼저 인간 각질세포 HaCaT 세포주에 대하여 신규 플라보노이드를 유도하고 mRNA 및 단백질 레벨에서 이동 관련 유전자들의 발현을 조사하였다.
본 발명의 플라보노이드는 HaCaT 세포의 이동은 촉진하나 증식은 그러하지 아니함.
인간 각질세포에 대한 신규 플라보노이드의 이동 유도 활성을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 48시간 동안 스크래치 운드 힐링 에세이에서 여러 다른 농도의 플라보노이드로 HaCaT 세포를 처리하였다. 그 결과는 신규 플라보노이드는 HaCaT의 이동을 2uM 용량에서 크게 증가(167%)시킨 반면에 다른 농도에서는 큰 효과가 없었다(도 2). 본 발명자들은 다음 동일 농도의 플라보노이드로 MTT 에세이에 의하여 증식 실험을 수행하였고 각질세포 성장은 심지어 2uM 용량에서도 큰 변화가 없었다(도 3A). 예측한 것과 같이, p53, p21, p27 및 두 cyclin kinase D, E의 단백질 레벨은 비처리된 플라보노이드와 비교하여 큰 변화가 없었다(도 3B). 동시에, 전사 레벨은 세포 관련된 유전자들에서 비슷하게 변화가 없었다. 이들 결과는 신규 플라보노이드가 인간 각질세포의 이동은 유도할 수 있으나 증식은 그러하지 않다는 것을 시사한다.
신규 플라보노이드는 HaCaT 세포에서 MET ( mesenchymal - epithelial transition )은 유도하지만 EMT( epithelial - mesenchymal transition )은 그러하지 않았다
EMT는 상처 힐링 및 조직재생에 관여하는 과정이다. EMT는 각질세포 이동을 유도할 수 있다고 알려졌다(Journal of Dermatological Science. 58(2010) 97-104). 따라서 본 발명자들은 신규 플라보노이드가 EMT과정에 관련된 이동을 유도하는지를 조사하기 위하여 웨스턴 블럿과 RT-PCR에 의하여 플라보노이드 처리 후 Vimentin, E-cadherin 및 Slug와 같은 EMT 마커 발현을 조사하였다. 도 4A에 나타낸 것과 같이, 두 간엽성(mesenchymal) 마커, Vimentin 및 Slug는 시간 의존적으로 다운조절된 반면, E-cadherin, adherens junction 단백질은 크게 증가하고 처리 24시간 후 피크를 나타내었다.mRNA 레벨에서도 유사한 발현이 RT-PCR 결과에서 관찰되었다(도 4B). 이들 데이터는 신규 플라보노이드가 MET 과정을 EMT 과정보다 HaCaT 세포에서 유도하는 것을 나타낸다는 것을 시사한다.
이동 관련 단백질들은 플라보노이드 처리에 의하여 HaCaT 세포 상에서 다운 조절됨.
EMT 과정은 상기와 같이 플라보노이드의 이동 유도와 관련이 없으므로, 본 발명자들은 metalloproteinase family (MMPs), collagen I, III와 같은 다른 이동 관련 단백질들을 조사하였다. 최근에 이들 단백질들은 각질세포의 이동 및 증식을 조절할 수 있다고 알려졌다. [Growth factors and cytokines in wound healing. Stephan Barrientos 1,2; Olivera Stojadinovic, MD.. Wound Repair and Regeneration ;Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Metalloproteinases : Structure, Function, and Biochemistry . Circulation Research. Robert Visse and Hideaki Nagase3,4]
본 발명자들은 24h 플라보노이드 처리 후 collagen I, III의 RNA 및 단백질 레벨에서의 현저한 다운조절을 관찰하였고(도 5A,B), 이것은 MMP1, collagenase의 증가에 의하여서 설명될 수 있다(도 6A). 이 프로테네이즈는 신규 플라보노이드로 처리할 때 그것의 높은 레벨로 인하여 collagen I, III를 분해하는 것 같다. 흥미롭게도, 본 발명의 플라보노이드로 유도한 경우에 다른 타입의 extracellular matrix, fibronectin를 높게 발현되었다(도 5A,B). 그것은 기질 절단으로 피브로넥틴을 사용할 수 있기 때문에 MMP7의 다운조절과 관련될 것 같다(도 6B).
또한 두 다른 metalloproteinase, MMP2 및 MMP9도 대조군과 비교하여, 다소 증가하였다는 것을 RT-PCR결과에서 알 수 있다(도 6B). 이것은 MMP2 및 MMP9의 젤라티네이즈 활성에 대한 자이모그래피 에세이의 데이터로 알 수 있다(도 6C). 일반적으로 각질세포 이동은 본 발명의 플라보노이드로 유도시에 높게 발현된 콜라게네이즈에 의한 콜라겐의 분해로 설명될 수 있다.
본 발명의 플라보노이드 유도된 NADPH oxidase 발현 및 ROS 생성
본 발명의 플라보노이드에 의한 각질세포 이동의 기작에 대한 이해를 얻기 위하여, 본 발명자들은 다음에 세포 이동과 관련된 신호전달 경로 및 NADPH oxidase 발현 및 ROS 생성을 결정하였다. 도 7A에 나타낸 것과 같이, NADPH oxidase 4는 시간 의존적으로 증가하고 처리 2시간 후에 단백질 및 mRNA 레벨 모두에서 피크였다. 이것은 2시간에 피크인 ROS 생성의 업레귤레이션을 이끈다(도 7B). 이 초기 효과와 일치하게, 세포 신호전달 경로도 2시간에 약간 변화를 갖는다. 세포 이동과 관련된 두 경로 AKT 및 ERK의 인산화 활성은 pERK가 30분에 일찍 증가할 경우에도 2시간까지 다운조절되었다. 또한, JNK 경로의 활성화도 2시간에 피크에 도달하였다(도 7C). 이 결과들은 2시간에 ROS 생성의 초기 증가 및 세포내 신호전달 경로에서 수반되는 변화 사이 관계가 있다는 것을 시사한다.
본 발명의 플라보노이드는 ROS 생성을 통하여 신호전달 경로에 영향을 미침.
본 발명의 플라보노이드의 신호전달 경로 및 ROS 생성에 대한 기작을 파악하기 위하여, 본 발명자들은 DPI (NADPH 저해제) 또는 NAC (ROS 스캐빈져)을 전처리하고 2시간 동안 본 발명의 플라보노이드로 처리하였다. 예측한 것과 같이, NADPH oxidase 4는 DPI 및 NAC 전처리에 의하여 저해되었다. NAC 또한 2시간에 본 발명의 플라보노이드에 의한 증가된 JNK 및 ERK의 인산화를 감소시킨 반면 이 효과는 DPI로는 일어나지 않았다. 흥미롭게도, 2시간에 플라보노이드에 의하여 다운조절된 AKT의 활성화는 NAC 및 DPI에 의하여 현저하게 완화되었다(도 8). 이 결과들은 본 발명의 플라보노이드가 JNK 및 ERK의 인산화를 2시간에 ROS 생성을 통하여 유도하였지만 AKT는 그러하지 않았다는 것을 시사한다.
본 발명의 플라보노이드 인간 피부 섬유아세포의 증식을 개선함
상처 힐링의 두번째 단계인 조직 형성은 여러 다른 세포 타입의 증식 및 이동과 관련된다. 각질세포의 이동 시작 후, 섬유아세포는 종종 더 빠르게 성장한다. 따라서 본 발명자들은 인간 피부 섬유아세포에 대한 본 발명의 플라보노이드의 전체 효과를 조사하였다. 먼저 본 발명자들은 여러 다른 용량의 본 발명의 플라보노이드로 48시간 처리한 피부 섬유아세포의 증식을 조사하였다. MTT 에세이의 데이터는 용량 의존적인 형태로 피부 섬유아세포를 더 빠르게 성장하는 것을 나타내었다(도 9). 2uM 및 5uM의 농도의 섬유아세포 증식 사이의 차이가 거의 없기에, 본 발명자들은 다음 실험을 위하여 2uM를 사용하기로 하였다.
본 발명의 플라보노이드로 처리된 섬유아세포의 증식의 증가를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 전사 및 번역 레벨에서 세포 주기 관련 유전자들의 발현을 RT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 조사하였다. 도 10에 나타낸 것과 같이, p21 및 p53, cyclin D kinase 저해제 및 종양 suppressor 단백질의 단백질 레벨 각각은 본 발명의 플라보노이드 2uM로 24시간 처리한 후 현저하게 다운조절되었다. 유사한 결과들이 mRNA 레벨에서도 관찰되었다(도 10). 이들 데이터는 2uM 본 발명의 플라보노이드로 24시간 처리 후 섬유아세포의 증식이 실질적으로 증가하였다는 것을 시사한다.
피부 섬유아세포는 본 발명의 플라보노이드 유도에 의하여 extra cellular matrix 축적을 촉진함.
ECM(Extra cellular matrix)은 상처 힐링 물질에서 필수적인 구성요소인 collagen I, collagen III 및 fibronectin을 포함한다. 피부 섬유아세포는 이들 단백질들의 생성 세포 타입이다. 따라서 본 발명자들은 24시간 본 발명의 플라보노이드로 유도된 섬유아세포의 ECM 단백질 분비를 조사하였다. 배양된 섬유아세포 배지의 면역블럿팅 결과들은 본 발명의 플라보노이드로 24시간 유도 후 collagen I, collagen III 및 fibronectin의 높은 생성을 나타내었다(도 11A). RT-PCR은 유사한 데이터의 전사 레벨을 주었다. 또한 또 다른 간엽성 마커, Vimentin도 대조군과 비교하여 현저하게 증가하였고, 이것은 근섬유아세포 분화 및 가능한 이동 활성이 있다는 것을 시사한다. 특히, metalloproteinase 1 (MMP1), 콜라게네이즈 단백질은 본 발명의 플라보노이드로 처리된 경우에 현저하게 감소되었다(도 11B). 이 결과는 콜라겐 I 및 collagen III의 높은 발현을 본 발명의 플라보노이드로 처리한 경우에 부분적으로 설명될 수 있다.
흥미롭게도, 두 다른 metalloproteinases, MMP2 및 MMP9, 이것은 gelatinase A 및 gelatinase B는 반대 발현을 가졌다. MMP2는 업레귤레이트된 반면에 MMP9는 감소하였다.
본 발명의 플라보노이드는 섬유아세포에서 사이토카인 TGF - beta1 분비를 유도
본 발명자들은 TGF-베타 발현 및 섬유아세포에서 콜라겐 축적뿐만 아니라 증식 사이에 관련이 있는지를 알기 위하여 본 발명의 플라보노이드로 처리할 때 섬유아세포에서 TGF-베타 생성을 조사하였다. 배양된 섬유아세포 배지에 대한 웨스턴 블럿 결과는 단백질 레벨에서 TGF-beta의 발현이 약간 증가한 반면에 전사 레벨에서는 현저하게 더 높았다(도 12). 이것은 본 발명의 플라보노이드 처리가 TGF-beta 증가에 의한 섬유아세포에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다.
본 발명의 플라보노이드는 TGF - beta 유도를 통하여 세포내 신호전달 경로를 조절
본 발명자들은 본 발명의 플라보노이드 처리에 의하여 야기된 TFG-베타 증가 및 섬유아세포에서 세포적 변화 사이의 상관관계를 조사하였다. 본 발명자들은 본 발명의 플라보노이드로 처리된 섬유아세포에서 신호전달 경로 특히 TGF-beta 관련된 경로에서 변화를 조사하였다. 그 결과들은 잠재적인 온코진인 Akt의 인산화가 시간 의존적인 형태로 증가한다는 것을 나타내었다. 또한, TGF-beta 경로는 1시간에 pSmad2의 초기 활성화 및 6시간에 JNK의 현저한 활성화와 관련된 pSmad3의 높은 인산화를 가졌다(도 13A,B). 이것은 본 발명의 플라보노이드의 경향은 섬유아세포의 증가된 증식을 지지하는 JNK/pSmad3L/c-Myc 발암유전자 경로를 활성화하는 것을 야기하였다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, ERK 경로의 인산화는 1시간 초기 증가 후에 다운조절, 심지어 정상 레벨보다 더 낮았다(도 13C). 이 결과들은 특히 TGF-beta 경로는 섬유아세포의 증가된 증식에 대한 지원을 조절한다는 것을 시사한다.
TGF-beta 유도에 의한 이들 효과를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 TGF-beta 수용체 저해제 (TGFRI) 전처리로 실험을 반복하였다. 이 데이터는 TGFRI로 전처리한 경우에 pSmad2, pSmad3, JNK 및 Akt 인산화와 같은 모든 신호전달 경로의 현저한 저해를 나타내었다. 그리고 ERK 인산화도 TGFRI 전처리에 의하여 야기된 정상 레벨로 다시 증가하였다(도 14).
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 플라보노이드는 TGF-beta 분비를 증가하여서 세포 신호전달 경로를 조절한다는 것을 알 수 있었다.
도 1은 화학구조: 본 발명의 플라보노이드
도 2는 HaCaT 세포에 대한 여러 다른 농도의 본 발명의 플라보노이드(＃45)의 이동 에세이. 세포를 스크래치 24시간 전에 3X104 세포/ml 밀도로 시딩하고 처리함. 스크래치의 거리는 신규 플라보노이드로 처리 48시간 후에 측정. 데이터는 적어도 3회 반복실험의 거리의 평균 퍼센트 ± SD로 나타냄, (*)P<0.05
도 3은 신규 플라보노이드 처리가 HaCaT 증식과 세포 주기 관련 단백질에 영향이 없다는 것을 보여주는 그림. (A) HaCaT 세포에 대한 여러 다른 농도의 본 발명의 플라보노이드(＃45)의 MTT 에세이. 세포를 처리 전에 오버나잇 시딩함. 여러 다른 농도의 플라보노이드로 24시간 배양 후, MTT 용액을 첨가하고 370C에서 4시간 배양. 측정은 흡광도 570nm에서 계산. (B) 플라보노이드(2uM)로 24시간 유도된 HaCaT 세포에서 세포 주기 관련 단백질들의 발현. 단백질 발현을 플라보노이드 처리 또는 비처리된 HaCaT에서 기재된 것과 같은 특정 항체로 웨스턴 블럿 분석에 의하여 조사. mRNA 발현을 기재된 것과 같은 특정 프라이머로 RT-PCR에 의하여 조사함. ImageJ 프로그램에 의한 데이터 분석의 결과를 보여주는 히스토그램. 값들은 적어도 3회 반복실험의 평균 ± SD를 나타냄. *P<0.05 대조군과 비교된.
도 4는 플라보노이드 처리된 시간 의존적인 형태의 EMT-관련된 유전자들의 발현. (A) 단백질 발현은 여러 다른 시간에 플라보노이드(2uM)로 처리된 HaCaT 세포에서 기재된 것과 같은 특정 항체로 웨스턴 블럿 분석에 의하여 조사.(B) mRNA 발현을 기재된 것과 같은 특정 프라이머로 RT-PCR에 의하여 조사함. ImageJ 프로그램에 의한 데이터 분석의 결과를 보여주는 히스토그램. 값들은 적어도 3회 반복실험의 평균 ± SD를 나타냄.
도 5는 플라보노이드로 유도된 경우 HaCaT 세포에서 extra cellular matrix (ECM) 단백질의 발현. (A) 24시간 배양 후 플라보노이드(2uM)로 처리된 HaCaT 세포에서 mRNA 발현을 기재된 것과 같은 특정 프라이머로 RT-PCR에 의하여 조사함. (B) 세포를 혈청 없는 배지에서 2μM 플라보노이드로 처리한 후, 조건화된 배지를 취하고 amicon 원심분리를 사용하여 농축. 다음 배지 내 단백질은 기재된 것과 같은 특정 항체에 의하여 Collagen I, Collagen III, Fibronectin에 대한 웨스턴 블럿에 의하여 분석. ImageJ 프로그램에 의한 데이터 분석의 결과를 보여주는 히스토그램. 값들은 적어도 3회 반복실험의 평균 ± SD를 나타냄. *P<0.05 대조군과 비교된.
도 6은 플라보노이드로 처리된 HaCaT 세포에서 이동 관련 유전자들의 발현. (A) 세포를 혈청없는 배지에서 2μM 플라보노이드로 처리한 후 조건화된 배지를 취하고 amicon 원심분리를 사용하여 농축. 다음 배지 내 단백질은 기재된 것과 같은 특정 항체에 의하여 MMP1에 대한 웨스턴 블럿에 의하여 분석. (B)24시간 배양 후 플라보노이드(2uM)로 처리된 HaCaT 세포에서 mRNA 발현을 기재된 것과 같은 특정 프라이머로 RT-PCR에 의하여 조사함. (C) 플라보노이드(2μM/24h)로 처리된 HaCaT 세포 유래 조건화된 배지의 자이모그래프 에세이. 아미콘에 의하여 농축 후에 배지 단백질을 젤라틴 자이모그래프로 분석. ImageJ 프로그램에 의한 데이터 분석의 결과를 보여주는 히스토그램. 값들은 적어도 3회 반복실험의 평균 ± SD를 나타냄. (*)P<0.05
도 7은 여러 다른 시간에서 플라보노이드 처리된 HaCaT에서 NAPDH 옥시데이즈, ROS 생산 및 신호전달경로. (A) NAPDH oxidase 4의 발현을 웨스턴 블럿 및 RT-PCR에 의하여 조사. (B) ROS 생성 레벨을 DCF-DA 에세이를 사용하여 시간 의존적인 형태로 처리된 HaCaT 세포에서 검출. 세포를 여러 다른 시간에서 2μM 플라보노이드로 처리한 후 DCF-DA로 염색하여 ROS 생성을 검출. H2O2를 양성 대조군으로 사용. (C) 신호전달 경로를 기재된 것과 같은 특정항체로 웨스턴 블럿을 하여 조사. ImageJ 프로그램에 의한 데이터 분석의 결과를 보여주는 히스토그램.
도 8은 DPI 또는 NAC 전처리가 ERK 및 JNK 경로의 활성화 및 NAPDH oxidase 4를 저해하는 것을 보여주는 그림. DPI (10uM) 또는 NAC (20uM)를 본 발명의 플라보노이드 24시간 배앙 전에 2시간 전처리한 후 그 신호전달 경로를 기재된 것과 같은 특정 항체들로 웨스턴 블럿에 의하여 조사하였다.ImageJ 프로그램에 의한 데이터 분석의 결과를 보여주는 히스토그램.
도 9는 본 발명의 플라보노이드 처리 또는 처리되지 않은 피부 섬유아세포의 증식을 나타낸 도면. 인간 피부 섬유아세포들을 24시간 처리 전에 3x104 세포/ml 밀도로 시딩하였다. MTT 에세이를 수행함.
도 10은 본 발명의 플라보노이드로 24시간 배양한 후에 피부 섬유아세포에서 세포 주기 관련 유전자들의 발현을 나타낸 그림. p21, p53, p27, cyclin E, cyclin D과 같은 세포 주기 관련 유전자들의 발현을 웨스턴 블럿 및 RT-PCR로 조사하였다. ImageJ 프로그램에 의한 데이터 분석의 결과를 보여주는 히스토그램. 값들은 적어도 3회 반복실험의 거리의 평균 퍼센트 ± SD로 나타냄. 대조군과 비교된 (*)P<0.05.
도 11은 extra cellular matrix 단백질 및 metalloproteinase 유전자들의 발현을 나타낸 도면. (A) 피부 섬유아세포를 혈청 없는 배지에서 2μM 본 발명의 플라보노이드로 처리한 후 조건화된 배지를 취하여 amicon 원심분리를 사용하여 농축함. 배지 내 단백질들을 기재된 것과 같은 특정 항체들에 의하여 Collagen I, Collagen III, Fibronectin, MMP1, Vimentin에 대하여 웨스턴 블럿에 의하여 조사함. (B) 본 발명의 플라보노이드(2μM/24h)로 처리된 피부 섬유아세포로부터 유래한 조건화된 배지의 자이모그래프 에세이. 아미콘에 의한 농축 후 배지 내 단백질을 젤라틴 자이모그래프에 의하여 분석. ImageJ 프로그램에 의한 데이터 분석의 결과를 보여주는 히스토그램. 값들은 적어도 3회 반복실험의 거리의 평균 퍼센트 ± SD로 나타냄. 대조군과 비교된 (*)P<0.05.
도 12는 본 발명의 플라보노이드를 유도한 경우 피부 섬유아세포의 TGF-beta 분비를 나타낸 도면. 피부 섬유아세포를 혈청 없는 배지에서 2μM 본 발명의 플라보노이드로 처리한 후 조건화된 배지를 취하여 amicon 원심분리를 사용하여 농축함. 배지 내 단백질들을 기재된 것과 같은 특정 항체들에 의하여 TGF-베타에 대하여 웨스턴 블럿에 의하여 분석함. mRNA 발현을 48시간 배양 후 2μM 본 발명의 플라보노이드로 처리한 섬유아세포에서 TGF-beta의 특정 프라이머로 RT-PCR에 의하여 조사함. ImageJ 프로그램에 의한 데이터 분석의 결과를 보여주는 히스토그램. 값들은 적어도 3회 반복실험의 평균 ± SD를 나타냄. 대조군과 비교된 (*)P<0.05.
도 13은 여러 다른 시간들에서 본 발명의 플라보노이드로 처리된 피부 섬유아세포에서 신호전달 경로를 나타낸 도면. 신호 전달 경로를 기재된 것과 같은 특정 항체들로 조사함. ImageJ 프로그램에 의한 데이터 분석의 결과를 보여주는 히스토그램.
도 14는 2시간 TGF-베타 수용체 저해제로 전처리되고 6시간 본 발명의 플라보노이드로 처리된 피부 섬유아세포에서 신호전달 경로를 나타낸 도면. 피부 섬유아세포를 본 발명의 플라보노이드로 6시간 배양 전에 TGF-beta 수용체 저해제 (TGFRI) 10mM로 전처리한 후 신호전달 경로를 기재된 것과 같은 특정 항체들로 조사함. ImageJ 프로그램에 의한 데이터 분석의 결과를 보여주는 히스토그램.
도 15는 본 발명의 플라보노이드 합성의 개략도.
도 16은 본 발명의 플라보노이드 1H-NMR 결과.
도 17은 본 발명의 플라보노이드 13C-NMR 결과.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 ㅂ범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 본 발명의 플라보노이드 합성
본 발명의 플라보노이드(도 1)는 하기와 같이 합성되었다.
화합물 1의 합성
15 mL의 1,4-dioxane 용매에 3g의 5-methoxy-2-hydroxybenzaldehyde (20mmol)와 탄산칼륨(3g, 22 mmol)를 녹인 후 acrolein (2mL, 28mmol)를 천천히 가하고 8시간 동안 환류 시킨다. 반응 혼합물을 상온으로 냉각 시킨 후, 물 50 mL 가하여 희석 시키고 ether 를 사용하여 추출한다 (70 mL x 3). 추출한 유기층을 합하여 MgSO4로 건조시키고 여과, 농축하여 도면 1의 화합물 1을 얻는다.
수율 : 86 %, 용융점 : 48-50 ℃
화합물 2의 합성
10 mL의 에탄올 용매에 p-Nitrobenzoic acid (1.67g, 10mmol)를 녹인 후, hydrazine monohydrate (64-65% , 2ml, 26mmol)를 천천히 가한다. 위의 반응 용액에 진한 황산을 촉매량으로 가하고 9시간 동안 환류 시킨다. 반응 혼합물을 상온으로 냉각시키고 형성된 고체를 감압 여과한다. 에탄올을 사용하여 고체를 재결정하여 도면 1의 순수한 화합물 2을 얻는다.
수율 : 66 %, 용융점 : 144-146 ℃
화합물 3 의 합성
위에서 합성한 화합물1과 (285mg, 1.5mmol) 화합물2를(270mg, 1.5mmol) 20 mL의 에탄올에 녹인 후, 촉매량의 진한 염산을 가하고 2시간 환류 시킨다.화합물1과화합물2의 반응은 먼저 도 15의 아실히드라존 중간체I-i를 형성하고, 이 중간체가 다시 알데히드1과 반응하고 도 15의 중간체I-ii를 형성한다. 반응 혼합물을 상온으로 냉각시키면 노란색 고체를 형성하고 이를 감압여과 후, 차가운 에탄올로 세척하여 순수한 화합물 3을 얻는다.
수율 : 52 %, 용융점 : 246-250℃
실시예 2: 세포 배양
본 발명에서 본 발명자들은 두 종의 세포주를 사용하였다;HaCaT(Human spontaneously immortalized keratinocyte) 세포주 인간 피부 섬유아세포. HaCaT 세포주는 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (GIBCO), 1% Penicillin/Streptomycin (PAA)가 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. 인간 피부 섬유아세포는 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (GIBCO), 1% Penicillin/Streptomycin (PAA)가 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포들을 5% CO2를 가지는 37°C에서 배양하였다
실시예 3: 스크래치 상처 힐링 에세이
HaCaT 세포를 24h 상처 힐링 에세이 전에 48웰 플레이트 상에 시딩하였다. 그 다음 스크래치 상처를 배양된 디쉬의 바닥을 가로질러 선을 스크래칭하는 멸균된 p-200 피펫 팁을 사용하여 만들었다. 그 다음에 배양 배지를 제거하였다. 스크래치 후 새로운 배지를 본 발명의 플라보노이드 샘플 또는 대조군으로 dimethyl sulfoxide (DMSO) (Amresco)를 보충하였다. 처리 0시간, 48시간 후에 디지탈 카메라가 장착된 OLYMPUS IX70 현미경을 사용하여 4배에서 사진을 촬영하였다. 스크래치의 거리는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 초기 및 최종 넓이의 차이를 계산하였다.
실시예 4: MTT 에세이
세포를 96 웰 플레이트 상에 3X104 세포/milliliter 밀도로 시딩하였다. 세포를 본 발명의 플라보노이드 또는 DMSO로 HaCaT 세포주에서는 24시간 그리고 인간 피부 섬유아세포에서는 48시간 처리하였다. MTT 용액(Amresco) (5 mg/ml)을 각 웰에 첨가하고 37°C에서 4시간 배양하였다. 그 후에, 그 배지를 부드럽게 제거하고 150ul DMSO로 대체하고,30분 동안 교반하여 침전물을 용해하였다. 그 양을 흡광도 570 nm에서 측정하였다.
실시예 5: 웨스턴 블럿
세포를 본 발명의 플라보노이드 또는 DMSO로 시간 의존적인 형태 또는 용량 의존적인 형태로 처리하였다. 그 다음에 세포를 세포 스크래퍼로 모아서 RIPA 버퍼로 파쇄하였다. 단백질 농도를 BCA 키트 (Thermo scientific)로 결정하였다. 그 추출물을 SDS-PAGE 및 적당한 항체를 사용한 웨스턴 블럿에 의하여 분석하였다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식1의 플라보노이드 유도체.
    Figure 112013055490876-pat00004

    [화학식 1]
  2. 제 1항에 있어서, 상기 플라보노이드 유도체는 각질세포의 이동을 유도하고, 각질세포에서 콜라겐 I, III 및 피브로넥틴의 RNA 및 단백질 레벨의 다운조절을 야기하는 것을 특징으로 하는 플라보노이드 유도체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 플라보노이드 유도체는 피부 섬유아세포 증식을 개선하고 피부 섬유아세포에서 콜라겐 I, III 및 피브로넥틴의 RNA 및 단백질 레벨의 업조절을 야기하는 것을 특징으로 하는 플라보노이드 유도체.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1항의 플라보노이드 유도체를 인 비트로에서 각질 세포에 처리하여 인 비트로에서 각질 세포의 콜라겐 I, III 및 피브로넥틴의 RNA 및 단백질 레벨을 다운조절하고 각질세포의 이동을 유도하는 방법.
  10. 제 1항의 플라보노이드 유도체를 인 비트로에서 피부 섬유아세포에서 처리하여 인 비트로에서 피부 섬유아세포의 증식을 개선하고 피부 섬유아세포에서 콜라겐 I, III 및 피브로넥틴의 RNA 및 단백질 레벨을 업조절시키는 방법.
  11. a)1,4-다이옥산(dioxane) 용매에 5-메톡시-2-하이드록시벤즈알데히드와 탄산칼륨를 녹인 후 아크롤레인(acrolein)을 가하고 환류시켜 화학식 2의 화합물을 얻는 단계;
    Figure 112013055490876-pat00005

    [화학식 2]
    b)에탄올 용매에 p-나이트로벤조산을 녹인 후, 하이드라진 모노하이드레이트를 혼합하고 그 반응 용액에 황산을 가하고 환류시켜서 하기 화학식 3의 화합물을 얻는 단계; 및
    Figure 112013055490876-pat00006

    [화학식 3]
    c)상기 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 에탄올에 녹인 후, 염산을 가하는 단계를 포함하는 상기 제1항의 화학식1의 플라보노이드 유도체를 합성하는 방법.

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