KR101452376B1 - 신규한 암 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하고 c-Myc 과발현을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이의 유도체는 발암유전자를 과발현하는 암세포에 대하여 특이적으로 세포증식을 억제하고 세포사멸을 유도함으로써 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 암 예방 및 치료용 약학적 조성물 {Novel pharmaceutical composition for preventing and treating cancer}

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이의 유도체는 발암유전자를 과발현하는 암세포에 특이적으로 작용하여 세포증식을 억제하고 세포사멸을 유도할 수 있으므로 항암제로서 암 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다. 이러한 암을 유발하는 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 요인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.

암이란 “제어되지 않은 세포성장”을 특징으로 하며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다. 암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환이다.

암의 유발 요인으로는 여러 가지가 있으나, 내적 요인과 외적 요인으로 구분하기도 한다. 정상세포가 어떠한 기전을 거쳐 암세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지는 않았으나, 적어도 80 내지 90%가 환경요인 등 외적 요인에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다. 암의 발생에 관여하는 유전자에는 발암유전자(oncogenes)와 종양억제유전자(tumor suppressor genes)가 있는데, 위에서 설명한 내적 혹은 외적 요인들에 의해 이들 사이의 균형이 무너질 때 암이 발생하게 된다.

지난 수십 년간 암을 정복하기 위해 세포주기나 세포사멸(apoptosis)의 조절과 발암유전자나 종양억제유전자를 포함하는 새로운 표적을 모색함에 있어서 눈에 띄는 발전을 거듭해 왔음에도 불구하고 암의 발생률은 문명이 발달됨에 따라 증가하고 있다. 현재, 암환자의 치료법은 외과적 수술, 방사선 치료, 40여종의 강한 세포독성을 보이는 항암물질 투여에 의한 화학요법에 의존하고 있는데, 이들 치료법도 대부분 조기 암환자나 특정 암에만 국한되어 암으로 인한 사망은 계속 증가하고 있는 추세이다.

현재 사용되고 있는 항암제들은 효소제제나 백신 등의 생물학적 제제, 순수합성 의약품 및 천연물 유래의 의약품 등으로 크게 구분할 수 있다. 이 중 유전자, 효소, 백신 등을 이용한 항암제는 실용단계에 있는 상태가 아니며, 화학요법에 의해 개발된 많은 항암제는 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에, 암 치료 시에 문제점으로 지적되고 있다. 또한 항암제는 암세포의 성장을 효과적으로 억제하기도 하지만, 때로는 정상세포에 대해서 독성을 나타내기도 한다. 따라서 항암제의 이 같은 독성의 작용기전을 밝히기 위하여 많은 연구가 수행되고 있고, 근래에는 세포 배양 기술이 급격히 발달함에 따라 각종 세포를 배양한 후, 여러 독성물질을 투여함으로써 이들의 세포독성에 대한 기전을 세포 수준에서 규명하려는 연구도 활발히 진행되고 있다.

이에 본 발명자들은 인체에 무해하고 부작용이 없으며, 암세포 특이적 성장 억제 및 사멸 효과가 뛰어난 물질을 개발하기 위하여 예의 연구하던 중, 상기 화학식 1의 화합물이 발암유전자 특이적으로 다양한 인체 암 세포주의 성장을 억제하고 암세포의 사멸을 유도함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하고 c-Myc 과발현을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하고 c-Myc 과발현을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 (Z)-에틸-2-(4-아세톡시-3-메톡시벤질리덴)-7-메틸-5-(3-니트로페닐)-3-옥소-3,5-다이하이드로-2H-티아졸로[3,2-a]피리미딘-6-카르복실레이트의 화합물명을 갖는 화합물로, 화합물 자체의 구조만 알려져 있을 뿐 그의 의학적 용도, 특히 항암제로서의 용도에 대해서는 전혀 보고된 바 없다.

본 발명에 사용되는 화학식 1의 화합물은 공지의 제조방법에 의해 당업자가 용이하게 제조하여 사용할 수 있으며, 혹은 상업적으로 이용가능한 기 제조된 화학식 1의 화합물을 구매하여 사용할 수도 있다. 구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 ChemDiv사에서 제조하여 상업적으로 판매하고 있는 화학식 1의 화합물을 구입하여 본 발명의 약학적 조성물을 제조하였다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 "약학적으로 허용가능한 염"이란 표현은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.

산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 석신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 1의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 하이드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 하이드로브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물의 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 화학식 1의 화합물과 균등한 범위에서 발암유전자 특이적으로 암세포 사멸을 유도하여 항암효과를 나타내는 염이면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 (Z)-에틸-2-(4-아세톡시-3-메톡시벤질리덴)-7-메틸-5-(3-니트로페닐)-3-옥소-3,5-다이하이드로-2H-티아졸로[3,2-a]피리미딘-6-카르복실레이트 나트륨, (Z)-에틸-2-(4-아세톡시-3-메톡시벤질리덴)-7-메틸-5-(3-니트로페닐)-3-옥소-3,5-다이하이드로-2H-티아졸로[3,2-a]피리미딘-6-카르복실레이트 칼륨, (Z)-에틸-2-(4-아세톡시-3-메톡시벤질리덴)-7-메틸-5-(3-니트로페닐)-3-옥소-3,5-다이하이드로-2H-티아졸로[3,2-a]피리미딘-6-카르복실레이트 마그네슘 등이 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물의 유도체로는 화학식 1의 화합물과 균등한 범위에서 발암유전자 특이적으로 암세포 사멸을 유도하여 항암효과를 나타내는 유도체라면 모두 사용가능하다.

본 발명에서는 상기 화학식 1의 화합물이 발암유전자 특이적으로 암세포에 대한 세포사멸 효과를 나타냄을 확인하고 이를 암의 예방 및 치료제로 사용하는 새로운 의학적 용도를 제안한다.

구체적으로, 본 발명의 바람직한 실시형태에서는, 발암유전자로 EGFR, c-Myc, Bcl-XL 및 K-Ras 각각이 과발현되는 세포주를 제작한 다음(도 1 참조), 발암유전자 과발현 세포주에 4000여종의 화합물 라이브러리를 적용하여 발암유전자 특이적으로 세포 생존에 영향을 미치는 화합물을 선별하였다. 그 결과, 화학식 1의 화합물이 c-Myc이 과발현되는 세포주에서 특이적으로 암세포의 증식을 저해하고 세포사멸을 유도하여 세포생존율을 저하시키는 것을 확인하였다(도 2 내지 도 5 참조).

본 발명의 화학식 1의 화합물은 또한 대장암, 자궁경부암 등의 다양한 암세포주에서 세포증식 억제 및 세포사멸 유도 효과가 있음을 확인하였다(도 6 참조).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이들의 유도체는 발암유전자 myc이 과발현된 세포주 및 암세포주에 특이적으로 세포증식을 억제하고 세포사멸을 유도하는 활성을 가지므로 항암제로서 각종 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 유도체를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 일차, 국소 또는 전이 암 조직의 조절, 제거, 변형 또는 확산의 지연을 포함하는, 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암 질환은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 간암, 뇌종양, 방광암, 혈액암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 대장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 본 발명의 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제가 사용될 수 있다.

경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

암을 치료 또는 예방하기에 효과적인 화학식 1의 화합물의 양은 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 추가로, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 분석이 최적의 투여 범위를 확인하는 것을 돕기 위하여 선택적으로 적용될 수 있다. 유효량은 또한 투여 경로, 및 질병 또는 장애의 경중에 달려 있으며, 전문의의 판단 및 각 환자의 상태(체중, 성별, 연령 등)에 따라 결정되어야 한다. 다른 실시형태에서, 정맥 투여의 유효량은 경구 투여량의 약 10% 수준으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 치료학적으로 유효한 양의 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 유도체를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에게서 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "대상"은 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 동물을 의미하고, 일 실시예에서는 포유류를, 또 다른 실시예에서는 인간을 의미한다.

본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환을 치료 또는 예방하는데 유효한 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 유도체의 양을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 유도체 이외에 공지된 항암제 또는 혈관신생 저해제를 추가로 포함할 수 있고, 암의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다. 다른 치료에는 화학요법, 방사선 치료, 호르몬 치료, 골수 이식, 줄기-세포 대체 치료, 다른 생물학적 치료, 면역치료 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 항암제의 예시에는 DNA 알킬화제(DNA alkylating agents)로 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin); 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)로 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토크산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신(mitomycin) 및 C 브레오마이신(C Bleomycin); 및 식물 알카로이드(plant alkaloids)로 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan) 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 혈관신생 저해제의 예시에는 안지오스타틴(angiostatin)(플라스미노겐 절편); 항-안지오제닉 항트롬빈 Ⅲ; 안지오자임(angiozyme); ABT-627; Bay 12-9566; 베네핀(benefin); 베바시주마브(bevacizumab); BMS-275291; 연골-유래 억제제(cartilage-derived inhibitor, CDI); CAI; CD59 보체 절편; CEP-7055; Col 3; 콤브레타스타틴(combretastatin) A-4; 엔도스타틴(endostatin)(콜라겐 ⅩⅧ 절편); 피브로넥틴 절편; 그로-베타(Gro-beta); 할로퓨리논(halofuginone); 헤파리나제; 헤파린 헥사사카라이드 절편; HMV833; 인간 융모막 고나도트로핀(hCG); IM-862; 인터페론 알파/베타/감마; 인터페론 유도 단백질(IP-10); 인터루킨-12; 크링글(Kringle) 5(플라즈미노겐 절편); 마리마스타트(marimastat); 덱사메타손; 금속단백분해효소(metalloproteinase) 억제제(TIMP); 2-메톡시에스트라디올; MMI 270(CGS 27023A); MoAb IMC-1C11; 네오바스타트(neovastat); NM-3; 판젬(Panzem); PI-88; 태반 리보뉴클레아제 억제제; 플라즈미노겐 활성화제 억제제; 혈소판 인자-4(PF4); 프리노마스타트(prinomastat); 프로락틴 16 kD 절편; 프로리페린(proliferin)-관련 단백질(PRP); PTK 787/ZK 222594; 레티노이드 소리마스타트; 스쿠알라민; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; 테트라하이드로코티솔-S; 테트라티오몰리브데이트(tetrathiomolybdate); 탈리도마이드; 트롬보스폰딘(Thrombospondin)-1(TSP-1); TNP-470; 형질전환(transforming) 성장인자-베타(TGF-β); 바스큘로스타틴(vasculostatin); 바소스타틴(칼레티큘린(calreticulin) 절편); ZD6126; ZD6474; 파네실(farnesyl) 트랜스페라제 억제제(FTI); 및 비스포스포네이트(예를 들어, 알렌드로네이트, 에티드로네이트(etidronate), 파미드로네이트, 리세드로네이트, 이반드로네이트, 졸레드로네이트(zoledronate), 올파드로네이트(olpadronate), 이칸드로네이트 또는 네리드로네이트(neridronate)) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 암-관련 질환의 예방 또는 개선 효과를 나타내는 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 유도체를 함유하는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 유도체를 포함하는 조성물은 암의 예방 및 개선에 효과적인 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이들의 유도체를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제, 예컨대 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예에는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예컨대, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이들의 유도체는 발암유전자 특이적으로 암세포의 세포사멸을 유도함으로써, 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 세포사멸 효과를 갖는 화합물의 선별에 사용된 STF 세포주에서 각각의 발암유전자가 특이적으로 과발현됨을 확인한 웨스턴 블롯팅 분석 결과이다.
도 2는 본 발명에 따라 발암유전자를 특이적으로 과발현하는 STF 세포주를 대상으로 화합물 라이브러리로부터 세포사멸 효과를 나타내는 화합물을 스크리닝하는 과정을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 각각 농도별로 다양한 발암유전자 과발현 세포주에 처리하고 48 및 96시간 경과 후, 세포생존율을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 1 μM 농도로 다양한 발암유전자 과발현 세포주에 처리한 후 세포생존율을 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 각각 0, 1 및 10 μM의 농도로 다양한 발암유전자 과발현 세포주에 처리한 후 세포사멸 관련 단백질들의 발현량 변화를 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 대장암 및 자궁경부암의 다양한 암세포주에 처리한 후 세포생존율을 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포사멸 효과를 갖는 화합물의 선별

먼저, 암세포 사멸 효과를 갖는 화합물을 선별하기 위하여 발암유전자를 과발현하는 세포주를 제조하였다. 먼저, 인간 섬유아세포 유래 STF 정상세포(Lonza, Cat# CC-2511)에 인간 TERT와 SV-40 T 항원 유전자를 발현하는 렌티바이러스를 이용하여 불멸화 및 p53의 발현 억제가 유도된 세포(대조군)를 제조한 후, 아데노바이러스를 이용하여 발암유전자 EGFR, c-Myc, Bcl-XL 및 K-Ras 각각을 과발현하는 4종의 STF 세포주를 제조하였다. 이때, 상기 인간 섬유아세포 유래 STF 정상세포는 10% FBS가 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)에서 배양하였고, 인간 TERT와 SV-40 T 항원 유전자를 발현하는 렌티바이러스의 형질도입을 위하여 초기 단계 세포(early passage cells: p2 또는 p3)를 사용하였다. 형질도입 후, SV-40 T 항원을 발현하는 세포는 제오신(zeocine)을, 인간 TERT를 발현하는 세포는 하이그로마이신(hygromycin)을 함유하는 배지에서 4일간 선별한 다음, 선택마커는 Cre를 발현하는 아데노바이러스 감염에 의하여 제공되는 Cre 재조합효소(recombinase)를 이용해 제거하였다.

c-Myc 발암유전자를 발현하는 렌티바이러스를 STF 세포에 형질도입한 후 블라스티시딘(blasticidin)을 처리하여 c-Myc 발현세포를 선별하였다. 블라스티시딘 선택마커는 Cre를 발현하는 아데노바이러스 감염에 의하여 제공되는 Cre 재조합효소를 이용해 제거하였다.

도 1은 상기에서 제조된 불멸화 STF 세포주, EGFR-STF 세포주, c-Myc-STF 세포주, Bcl-XL-STF 세포주 및 K-Ras-STF 세포주에서 발암유전자의 특이적 과발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석한 결과이다.

이와 같이 준비된 불멸화 STF 세포주, EGFR-STF 세포주, c-Myc-STF 세포주, Bcl-XL-STF 세포주 및 K-Ras-STF 세포주를 대상으로 암세포 사멸 효과를 갖는 화합물을 도 2의 과정에 따라 하기와 같이 선별하였다. 각 세포주를 10% 열-불활성화 FBS가 보충된 DMEM 배지에 접종하고 5% CO2 대기 하 37℃에서 배양한 후 배양된 세포를 2.5×10³ 세포/㎖ 농도로 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주하였다. 이때, 각 웰의 최종 부피는 100 ㎕/웰이었다. 이 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 각 웰에 4000여 종의 화합물 라이브러리(ChemDiv) 각각을 2일간 처리하였다. 이때, 시험 화합물은 모두 DMSO에 100 mM 농도로 용해시켜 사용하였고, 대조군으로는 DMSO를 사용하였다. 2일 후, EZ-cytox 분석(MTS) 및 쿠마시 블루 염색을 수행하여 세포생존율을 조사하였다. 구체적으로, 고 민감성 수용성 테트라졸륨 염(tetrazoilum salt)(EZ-cytox, Sigma) 시약 5 ㎕를 각 웰에 첨가하여 2시간 동안 처리한 후 제조사의 지침에 따라 쿠마시 블루로 염색하고 460 nm에서 흡광도를 측정하여 각 플레이트에서 세포사멸을 유도한 화합물을 선별하였다. 세포생존율은 DMSO 처리 대조군의 흡광도에 대한 시험 화합물 처리군의 흡광도를 상대적 백분율로 나타내어 계산하였다.

그 결과, 불멸화 STF 세포주와, EGFR, Bcl-XL 및 K-Ras를 과발현하는 STF 세포주에서는 처리된 모든 화합물에 대해 세포생존율에 변화가 없었으나, c-Myc를 과발현하는 STF 세포주에서는 화학식 1의 화합물의 처리에 의해 세포생존율이 저하됨을 확인하였다. 도 3은 상기 5종의 세포주에 화학식 1의 화합물 각각을 1 내지 10 μΜ 범위의 다양한 농도로 처리하고 48시간 및 96시간 경과 후 세포생존율을 조사한 결과로, 화학식 1의 화합물이 각각 c-Myc-STF 세포주 특이적으로 세포증식 억제 및 세포사멸 유도 효과를 나타냄을 알 수 있다.

도 4에 나타난 바와 같이, 화학식 1의 화합물은 1 μΜ의 매우 낮은 농도에서도 c-Myc STF 세포주에서 우수한 세포증식 억제 및 세포사멸 유도 효과를 나타내었다.

상기 결과로부터 4000여 종의 화합물 라이브러리로부터 c-Myc 과발현 세포주에 특이적으로 세포사멸 효과를 나타내는 화학식 1의 화합물을 항암제 후보물질로 선발하였다.

실시예 2: 화학식 1의 화합물의 세포사멸 기전 분석

상기 실시예 1에서 c-Myc 과발현 세포주에 특이적으로 세포사멸 효과를 나타내는 것으로 선발된 화학식 1의 화합물이 어떠한 기전으로 세포사멸을 유도하는지를 조사하기 위하여, 상기 실시예 1에서와 같이 불멸화 STF 세포주와, EGFR, c-Myc, Bcl-XL 및 K-Ras를 과발현하는 STF 세포주 각각에 화학식 1의 화합물 각각을 0, 1 및 10 μΜ의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 24시간 경과 후, 각각의 세포주로부터 단백질 시료를 추출하고 이를 대상으로 세포사멸에 관련된 단백질의 발현량 변화를 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 구체적으로 웨스턴 블롯팅 분석은 다음과 같이 수행하였다.

배양된 세포를 웨스턴 블롯팅을 하기 전에 예시한 시간과 농도로 화학식 1의 화합물 각각으로 처리하였다. 단백질 시료를 5분간 95℃까지 가열시키고, 8 또는 10%(w/v) 아크릴아마이드 겔에서 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 의하여 분리한 다음, Bio-Rad 트렌스퍼 유닛(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)을 이용하여 100 V에서 1시간 동안 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 막으로 전이 시켰다. 막은 0.01 % Tween 20 및 5% 탈지우유(nonfat dried milk)를 함유한 TBS(Tris-buffered saline) 내에서 1시간 동안 차단하고, 2% BSA(bovine serum albumin)를 함유하는 TBST 내에서 EGFR, c-Myc, Bcl-XL 및 K-Ras에 대한 각각의 1차 항체[토끼 항-EGFR 항체(Cell Signaling, Cat# 2232); 마우스 항-c-Myc 항체(Santacruz Biotechnology, Cat# sc-40); 토끼 항-Bcl-XL 항체(Cell Signaling, Cat# 2764); 마우스 항-K-ras 항체(Santacruz Biotechnology, Cat# sc-30)]와 함께 2시간 동안 배양한 후, HRP(horseradish peroxidase)와 결합된 항-마우스 또는 항-토끼 2차 항체와 1시간 동안 배양하였다. 블롯팅은 ECL 키트(enhanced chemiluminescence kit: West-ZOLplus, Western Blot Detection System, Intron Biotechnology Inc., South Korea)를 이용하여 전개하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 c-Myc를 과발현하는 세포주 특이적으로 카스파제-3(caspase-3)의 절단을 유도하여 세포사멸을 유도함을 확인하였다.

실시예 3: 다양한 암세포주에서 화학식 1의 화합물의 세포사멸 효과 확인

다양한 암세포주에서 화학식 1의 화합물의 세포사멸 효과를 확인하기 위하여, 야생형 p53 유전자를 발현하거나 발현하지 않는 인간 대장암종 세포주(HCT116-wt, HCT116-p53-/-), 인간 자궁경부암 세포주(HeLa), 및 인간 대장선암종 등급 II 및 III 세포(HT29)를 대상으로 세포생존율을 분석하였다.

먼저, HCT116-wt, HCT116-p53-/- 및 HeLa 세포주는 10% 열-불활성화 FBS가 보충된 DMEM 배지에 접종하고, HT29 세포주는 10% 열-불활성화 FBS가 보충된 맥코이 5A(McCoys' 5A) 배지에 접종하여 5% CO2 대기 하 37℃에서 배양하였다. 배양된 각 세포에 화학식 1의 화합물을 100 μΜ 내지 10 nM의 농도로 처리하고 48시간 경과 후 실시예 1에서와 같이 세포생존율을 조사하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 100 μΜ의 농도에서 다양한 대장암 및 자궁경부암 세포주에 대해 우수한 세포증식 억제효과를 나타내어 암세포의 세포사멸을 유도하는 항암제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

제제예 1: 산제의 제조

화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 유도체와 유당, 탈크를 통상의 산제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2: 정제의 제조

화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 유도체와 옥수수전분, 유당, 스테아린산 마그네슘을 통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합한 후 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3: 캅셀제의 제조

화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 유도체와 결정성 셀룰로오스, 락토오스, 마그네슘 스테아레이트를 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4: 주사제의 제조

화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 유도체와, 만니톨, 주사용 멸균 증류수, Na₂HPO₄12H₂O를 통상의 주사제 제조방법에 따라 주사용 멸균 증류수에 상기의 성분들을 혼합한 후 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량이 되도록 주사제를 제조하였다.

제제예 5: 액제의 제조

화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 유도체와 이성화당, 만니톨, 정제수 적량을 통상의 액제 제조방법에 따라 정제수에 상기 성분들을 혼합한 후 정제수를 가하여 총 부피를 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (3)

1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하고 c-Myc 과발현을 특징으로 하는 자궁경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 c-Myc이 특이적으로 과발현된 세포주의 세포증식을 억제하고 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.

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