KR20210090543A - 커피 실버스킨 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 세포독성이 없고 항마이오스타틴의 활성에 효과가 뛰어나므로 근 기능 저하, 근육 감소, 근육 위축, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용할 수 있다.
Description
본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
대한민국은 2000년 노인인구가 전체인구의 72%를 차지하여 고령화 사회에 진입하였으며, 2050 년에는 초고령화사회(20% 이상)에 진입할 것으로 예측된다(2013년 고령자 통계, 통계청) 사람의 근육양은 나이가 들면서 감소하고(50~70세에 10~15% 정도, 그리고 70세~80세에서 30% 이상 감소), 이에 따라 근력과 근기능도 약화되는데, 이를 노인성 근감소증(sarcopenia)이라 한다. 노인성 근감소증은 활동장애와 보행장애를 유발하여 노인들의 독립적인 생활을 제한하는 주요 원인이 된다. 또한, 근감소증은 기초대사율을 저하시켜 인슐린 저항성을 높이고 2형 당뇨병 발생을 촉진하며, 고혈압 및 심혈관계 질환 발생위험을 3-5배 증가시킨다. 현재 근감소증 치료용도로 승인된 의약품은 전무한 실정이며, myostatin 억제물질 또는 기존 FDA 승인을 받은 타질환 치료제를 근감소증에 적용하는 약물재배치(drug repositioning) 기술이 개발 중에 있다.
근육은 크게 골격근(skeletal muscle), 심장근(cardiac muscle), 평활근(visceral muscle)으로 구분되고, 이중 골격근은 인체에서 가장 많은 양으로 존재하는 조직으로, 체중의 40-45%를 차지한다. 골격근은 건(tendon)을 통해 뼈(bone)에 붙어서 뼈의 움직임 또는 힘을 만들어 내는 역할을 한다. 하나의 근육은 수많은 근섬유로 구성되어 있으며, 다시 근섬유는 액틴과 미오신으로 구성된 수많은 근원섬유로 만들어진다. 액틴과 미오신이 서로겹쳐서 움직이면 근육의 길이가 짧아지거나 길어지면서 전체적인 근육의 수축과 이완을 유발하게 된다. 근원섬유 크기의 증가는 근섬유 두께의 증가를 의미하고, 그 결과 근육의 증가가 일어나게 된다.
근육을 구성하는 근섬유의 유형은 ATP를 발생시키는 대사과정과 수축속도에 의해 주로 TypeⅠ, Type ⅡA 그리고 Type ⅡB로 구분된다. ‘타입Ⅰ 근섬유’는 수축속도가 느리고 많은 수의 미오글로빈과 미토콘드리아를 함유하고 있어 지속적이면서 낮은 강도의 유산소활동을 하는데 적절하다. 타입Ⅰ 근섬유는 적색을 띄고 있어서 적색근이라고도 일컬어지며 대표적으로 가자미근(soleus)이 이에 속한다. 반면, ‘타입 ⅡB 근섬유’는 수축속도가 빨라 매우 짧지만 높은 강도의 무산소 운동을 하는데 쓰이며, 미오글로빈의 함량이 적어 백색을 띄고 있다. ‘타입 ⅡA 근섬유’는 앞서 언급한 두 가지 근섬유의 중간적인 특성을 띈다. 나이가 듦에 따라 근육의 부위별 타입Ⅰ, Ⅱ 근섬유의 조성이 달라질 뿐 아니라 모든 타입의 근섬유가 감소하게 된다.
골격근은 환경에 따라 재생되어 유지되는 특징을 가지고 있으나, 이러한 특징은 나이가 듦에 따라 소실되고 결과적으로 노화가 진행되면서 근육양이 감소될 뿐 아니라 근력 역시 상실된다.
이러한 근육량의 감소와 관련하여 골격근의 성장을 억제하는 마이오스타틴의 연구가 되고 있으며, 마이오스타틴의 기능만을 억제하기 위한 항체를 제조하였으나, 부작용이 나타났으며, 천연물을 이용한 항마이오스타틴 소재에 대한 연구는 진행되고 있으나 아직까지 세포 수준에서의 연구가 대부분이며 임상실험에 도달한 연구는 전무한 상황이다.
이에 본 발명자들은 커피 실버스킨 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물이 세포독성이 없고 항마이오스타틴의 활성에 효과가 우수한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 근 기능 저하, 근육 감소, 근육 위축, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 근 기능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근 기능 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근 기능 저하, 근육 감소, 근육 위축, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X는 H 또는 
이고;
R1은 C5-30의 직쇄 또는 측쇄 알킬이다).
또한, 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
나아가 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
또한, 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
나아가 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
또한, 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근 기능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
나아가 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용 건강식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
또한, 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 건강식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
나아가 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근 기능 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
본 발명의 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 세포독성이 없고 항마이오스타틴의 활성에 효과가 뛰어나므로 근 기능 저하, 근육 감소, 근육 위축, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용할 수 있다.
도 1은 커피실버스킨 추출물의 분획트리를 나타낸 것이다.
도 2는 커피실버스킨 분획물로부터 마이오스타틴 길항제를 분리하기 위한 Sep-Pak C18 Cartridge를 이용하여 분리과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 커피실버스킨 분획물로부터 초고속액체크로마토 그래피를 사용하여 용출시간에 따라 분리된 화합물을 확인한 결과(a 및 b) 및 용출시간에 따라 분리된 화합물의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과(c)이다.
도 4는 초고속액체크로마토 그래피를 사용하여 분리한 첫번째 피크 화합물의 NMR 데이터 결과이다.
도 5는 초고속액체크로마토 그래피를 사용하여 분리한 두번째 피크 화합물의 NMR 데이터 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2-1 내지 2-6 화합물의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 2-7 내지 2-12 화합물의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예 2-13 및 2-14 화합물의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과이다.
도 9는 실시예 2-15(세로토닌), 데칸산(Decanoic acid) 및 운데칸산(Undecanoic acid)의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 실시예 2-1 내지 2-4 및 실시예 2-15(세로토닌)의 GDF11에 대한 억제활성을 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 실시예 2-1 내지 2-4 및 실시예 2-15(세로토닌)의 ActivinA에 대한 억제활성을 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 실시예 2-1 및 2-2의 농도에 따른 마이오스타틴 억제활성(a, b), GDF11 억제활성(c, d) 및 Activin A 억제활성(e, f)을 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명의 실시예 2-1, 2-2 및 2-11의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 실시예 2-1 처리에 따른 마이오스타틴 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 15는 커피실버스킨 추출물의 물, 헥산 클로로포름 및 60% 에탄올 분획에 의한 마이오스타틴 활성 억제를 확인한 결과이다.
도 16은 커피실버스킨 추출물의 헥산 분획층을 초고속액체크로마토 그래피를 사용하여 용출시간에 따라 분리된 화합물을 확인한 결과이다.
도 17은 커피실버스킨 추출물의 헥산 분획층 초고속액체크로마토 그래피를 통한 1H-NMR을 확인한 결과이다.
도 18은 커피실버스킨 헥산 분획층으로부터 분리한 카페인의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과이다.
도 19는 Sep-Pak C18 Cartridge 분획에 의한 마이오스타틴 활성 억제를 확인한 결과이다.
도 20은 마이오스타틴 길항제인 본 발명의 실시예 2-1 내지 2-4 화합물에 의한 Myostatin, GDF11 및 Activin A 활성의 억제를 확인한 결과이다.
도 21은 96주령 Balb/c 마우스에서 체중증가(a) 및 혈당(b)에 대한 마이오스타틴 길항제인 본 발명의 실시예 2-2(UHT11)의 경구 투여 효과를 나타낸 것이다(닫힌 원 ●과 열린 사각형 □은 각각 대조군 및 UHT11 처리 그룹 (0.35 mg / kg 체중)을 나타낸다).
도 22는 96주령 Balb/c 마우스에서 마이오스타틴 길항제인 본 발명의 실시예 2-2(UHT11)의 경구 투여가 근력(a), 근육 무게(b) 및 지방중량(c)에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 23은 96주령마우스에 본 발명의 실시예 2-2(UHT11)를 경구투여한 후, Quadriceps와 Gastronemius근육들로 부터 유전자 (mstn, fndc5, ppargc1a, ucp1)에 대한 유전자발현정도를 확인한 결과이다.
도 2는 커피실버스킨 분획물로부터 마이오스타틴 길항제를 분리하기 위한 Sep-Pak C18 Cartridge를 이용하여 분리과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 커피실버스킨 분획물로부터 초고속액체크로마토 그래피를 사용하여 용출시간에 따라 분리된 화합물을 확인한 결과(a 및 b) 및 용출시간에 따라 분리된 화합물의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과(c)이다.
도 4는 초고속액체크로마토 그래피를 사용하여 분리한 첫번째 피크 화합물의 NMR 데이터 결과이다.
도 5는 초고속액체크로마토 그래피를 사용하여 분리한 두번째 피크 화합물의 NMR 데이터 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2-1 내지 2-6 화합물의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 2-7 내지 2-12 화합물의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예 2-13 및 2-14 화합물의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과이다.
도 9는 실시예 2-15(세로토닌), 데칸산(Decanoic acid) 및 운데칸산(Undecanoic acid)의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 실시예 2-1 내지 2-4 및 실시예 2-15(세로토닌)의 GDF11에 대한 억제활성을 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 실시예 2-1 내지 2-4 및 실시예 2-15(세로토닌)의 ActivinA에 대한 억제활성을 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 실시예 2-1 및 2-2의 농도에 따른 마이오스타틴 억제활성(a, b), GDF11 억제활성(c, d) 및 Activin A 억제활성(e, f)을 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명의 실시예 2-1, 2-2 및 2-11의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 실시예 2-1 처리에 따른 마이오스타틴 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 15는 커피실버스킨 추출물의 물, 헥산 클로로포름 및 60% 에탄올 분획에 의한 마이오스타틴 활성 억제를 확인한 결과이다.
도 16은 커피실버스킨 추출물의 헥산 분획층을 초고속액체크로마토 그래피를 사용하여 용출시간에 따라 분리된 화합물을 확인한 결과이다.
도 17은 커피실버스킨 추출물의 헥산 분획층 초고속액체크로마토 그래피를 통한 1H-NMR을 확인한 결과이다.
도 18은 커피실버스킨 헥산 분획층으로부터 분리한 카페인의 마이오스타틴 활성을 확인한 결과이다.
도 19는 Sep-Pak C18 Cartridge 분획에 의한 마이오스타틴 활성 억제를 확인한 결과이다.
도 20은 마이오스타틴 길항제인 본 발명의 실시예 2-1 내지 2-4 화합물에 의한 Myostatin, GDF11 및 Activin A 활성의 억제를 확인한 결과이다.
도 21은 96주령 Balb/c 마우스에서 체중증가(a) 및 혈당(b)에 대한 마이오스타틴 길항제인 본 발명의 실시예 2-2(UHT11)의 경구 투여 효과를 나타낸 것이다(닫힌 원 ●과 열린 사각형 □은 각각 대조군 및 UHT11 처리 그룹 (0.35 mg / kg 체중)을 나타낸다).
도 22는 96주령 Balb/c 마우스에서 마이오스타틴 길항제인 본 발명의 실시예 2-2(UHT11)의 경구 투여가 근력(a), 근육 무게(b) 및 지방중량(c)에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 23은 96주령마우스에 본 발명의 실시예 2-2(UHT11)를 경구투여한 후, Quadriceps와 Gastronemius근육들로 부터 유전자 (mstn, fndc5, ppargc1a, ucp1)에 대한 유전자발현정도를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
약학적 조성물
본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근 기능 저하, 근육 감소, 근육 위축, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X는 H 또는 
이고;
R1은 C5-25의 직쇄 또는 측쇄 알킬이다).
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 근육질환의 예로는 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증, 악액질(cachexia), 경직성 척추 증후군(rigid spinesyndrome), 근위축성 측삭경화증(루게릭병, amyotrophic lateral sclerosis), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease) 또는 근육 감소증(sarcopenia)일 수 있다. 또한, 상기 근육 소모 또는 퇴화는 전적 요인, 후천적 요인, 노화 등을 원인으로 발생하며, 근육 소모는 근육량의 점진적 손실, 근육, 특히 골격근 또는 수의근 및 심장근육의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
본 발명의 약학적 조성물을 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용도로 사용한다는 관점에서, 근세포의 분화는 수축기관(미오피브릴)과 같은 근섬유의 성분들을 특정하는 근육 발생 프로그램(muscle developmental program)의 유도를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물을 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용도로 사용하거나, 근육량 증가용도로 사용한다는 관점에서, 근육의 성장은 섬유크기(fiber size)의 증가에 의해 및/또는 섬유수의 증가에 의해 일어날 수 있다. 상기 근육의 성장은 A) 습윤중량(wet weight)의 증가, B) 단백질 함량의 증가, C) 근섬유수의 증가, D) 근섬유 직경의 증가에 의해 측정될 수 있다. 근섬유 성장의 증가는 직경을 단면 타원체의 단축으로 정의할 때 직경의 증가로 정의될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물을 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용도로 사용한다는 관점에서, 근육재생은 근육 모세포로부터 새로운 근섬유가 형성되는 과정을 의미한다.
또한, 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
본 발명의 약학적 조성물을 근육 양 증가 또는 근육 생성 촉진용도로 사용한다는 관점에서, “근육 양 증가”는 신체 성분 중에서도 특히 근육의 성장을 향상시키는 것으로, 육체적 운동 및 지구력 향상을 통해 근육량을 증가시킬 수 있고, 근육 증가 효과를 가지는 물질을 체내에 투여하는 방식으로 근육량을 증가시킬 수 있으며, 근육의 종류는 제한되지 않는다.
상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물의 바람직한 예로는 하기 화합물들을 들 수 있다:
(1) 데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(2) 운데실-5-하이드록시트립타마이드;
(3) 도데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(4) 트리데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(5) 미리스틸-5-하이드록시트립타마이드;
(6) 펜타데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(7) 팔미틸-5-하이드록시트립타마이드;
(8) 헵타데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(9) 스테아릴-5-하이드록시트립타마이드;
(10) 노나데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(11) 에이코사노일-5-하이드록시트립타마이드;
(12) 헤네이코사노일-5-하이드록시트립타마이드;
(13) 도코사노일-5-하이드록시트립타마이드;
(14) 트리코사노일-5-하이드록시트립타마이드; 또는
(15) 5-하이드록시트립타민.
본 발명에서 용어, "실버스킨(silver skin)"은 은피라고도 하며, 커피 생두를 원두로 로스팅하는 과정에서 생성되는 껍질 또는 껍질의 일부인 것이다.
본 발명에서 상기 실버스킨을 추출하는 사용되는 추출용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로 물 또는 에탄올이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 에탄올은 1 내지 100%일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 추출물은 열수 추출물 또는 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 항마이오스타틴(anti Myostatin) 활성을 갖는 것이다.
본 발명의 용어, "마이오스타틴(Myostatin, MSTN)"은 근육성장을 조절하는 단백질로서 transforming growth factor-β TGF-β) 계열에 속하고 성장분화 인자 (growth and differentiation factor-8, GDF-8)이다.
본 발명에서 사용되는 용어 “근”은 심줄, 근육, 건을 포괄적으로 지칭하고, “근 기능”은 근육의 수축에 의해 힘을 발휘하는 능력을 의미하며, 근육이 저항을 이겨내기 위하여 최대한으로 수축력을 발휘할 수 있는 능력인 근력, 근육이 주어진 중량에 얼마나 오랫동안 또는 얼마나 여러 번 수축과 이완을 반복할 수 있는지를 나타내는 능력인 근지구력, 단시간 내에 강한 힘을 발휘하는 능력인 순발력을 포함한다. 이러한 근 기능은 근육량에 비례하고, “근 기능 개선”은 근 기능을 더 좋게 향상시키는 것을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
건강기능식품 또는 건강식품 조성물
본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용 건강식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
또한, 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 건강식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
또한, 본 발명은 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 건강식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다).
본 발명에서 용어, "실버스킨(silver skin)"은 은피라고도 하며, 커피 생두를 원두로 로스팅하는 과정에서 생성되는 껍질 또는 껍질의 일부인 것이다.
본 발명에서 상기 실버스킨을 추출하는 사용되는 추출용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로 물 또는 에탄올이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 에탄올은 1 내지 100%일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 추출물은 열수 추출물 또는 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 건강기능식품 및 건강식품 조성물로 사용하는 경우, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태일 수 있으며, 건강식품의 예로는 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품 및 건강식품 조성물을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 및 건강식품 조성물 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 커피 실버스킨 추출물, 분획물의 제조
커피의 로스팅 과정에서 생산된 실버스킨을 20 mg/ml의 농도로 에탄올 추출을 하였다. 에탄올 추출은 100% 에탄올을 이용하여 상온, 암실에서 24시간 동안 추출하였다. 준비된 커피실버스킨 에탄올추출물에 포함되어 있는 마이오스타틴 길항제를 분리하기 위해서 다양한 유기용매의 용해도에 의한 유기용매분획을 통하여 분리하였다. 먼저 에탄올 추출물에서 에탄올을 완전히 제거한 후 클로로폼과 물을 1:1 (v/v)의 비율로하여 클로로폼층과 물층으로 나누었다. 그런 후, 클로로폼층에 90%에탄올과 핵산을 1:1(v/v)의 비율로 하여 90%에탄올층과 핵산층으로 나누었다. 다시 90%에탄올층에 클로로폼과 60%에탄올을 1:1(v/v)의 비율로 하여 60%에탄올층과 클로로폼층으로 나누어서 최종적으로 클로로폼층, 60%에탄올층, 핵산층, 그리고 물층으로 4가지층을 얻었다.
<실험예 1> 커피 실버스킨 분획물의 항마이오스타틴 활성 (Luciferase assay) 분석
<1-1>
상기 실시예 1에서 수득한 분획물의 항마이오스타틴 활성을 확인하기 위해, HEK293 세포는 DMEM 배지 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycine, 1% geneticine)에서 96 well plate에 well 당 2.0×104 cell로 seeding 하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 배지는 FBS가 제거된 DMEM으로 교체하였고, 1 nM의 재조합 마이오스타틴 (R&D system, USA)과 커피실버스킨 에탄올 추출물로부터 유기용매분획한 각 층 (최종농도 10 ㎍/ml)을 처리하여 CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 뒤 배지를 제거하고 65 ㎕의 DMEM 배지와 65 ㎕의 reagent (Bright-Glo luciferase assay system, USA)를 처리하여 micro plate luminometer에서 발광을 측정하였다. 측정된 수치는 positive와 negative control의 수치를 이용하여 항마이오스타틴 활성을 %로 나타내었다.
그 결과 헥산 및 클로로폼층에 마이오스타틴 길항제 (myostatin antagonist)가 포함되어 있는 것을 확인하였다(도 15참조).
<1-2>
상기 실험예 1-1의 헥산 및 클로로폼층에 마이오스타틴 길항제 (myostatin antagonist)가 포함되어 있는 것을 확인하고, 헥산층에 포함된 마이오스타틴 활성 억제물질 중 하나를 분리하여 초고속액체크로마토 그래피(도 16 참조) 및 H-NMR(도 17참조)을 분석한 결과 분자량이 194인 하기 화학식 2로 표시되는 카페인으로 확인하였다.
[화학식 2]
<1-3>
상기 <1-2>에서 확인한 카페인과 상업적으로 판매되는 카페인 (Sigma-Aldrich에서 구매)에 대한 마이오스타틴 활성억제능을 luciferase assay통하여 확인하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 7.5 ㎍/㎖에서 마이오스타틴 활성억제가 가장 높게 나타났으며, 그 보다 높은 농도인 15 ㎍/㎖에서는 억제능이 낮아지는 것으로 나타났다.
그러므로 카페인 자체만으로는 마이오스타틴의 활성을 억제하는 것은 아닌 것으로 판단된다.
<실험예 2> 커피 실버스킨 분획물로부터 화합물의 분리
<2-1>
상기 실험예 1의 결과를 통해 마이오스타틴 길항제 (myostatin antagonist)의 분리하여 구조를 밝히기 위해서 두번째 방법은 Sep-Pak C18 Cartridge을 이용하여 분리하였다(도 2참조). 유기용매분획을 통하여 클로로포름(Chloroform)층에 포함된 마이오스타틴 길항제를 분리하기 위해서 아래와 같은 방법으로 진행하였다. Sep-Pak C18 Cartridge을 활성화를 시키고 분리된 추출물을 에탄올에 녹인 후 C18 카트리지(Cartridge)에 추출물을 로딩(loading)한 후 메탄올을 이용하여 추출하였다.
- FT은 C18 Cartridge에 결합하지 않은 층
- DW(증류수) (0% MeOH)는 추출물은 C18 Cartridge에 결합시킨 후 DW (0% MeOH)로 용출한 층
- 20% MeOH(메탄올)는 추출물은 DW (0% MeOH)로 용출한 다음, 20% MeOH로 용출한 층
- 40% MeOH는 추출물은 20% MeOH로 용출한 다음, 40% MeOH로 용출한 층
- 60% MeOH는 추출물은 40% MeOH로 용출한 다음, 60% MeOH로 용출한 층
- 80% MeOH는 추출물은 60% MeOH로 용출한 다음, 80% MeOH로 용출한 층
- 100% MeOH는 추출물은 80% MeOH로 용출한 다음, 100% MeOH로 용출한 층
그 결과 FT, 80% 메탄올(MeOH), 그리고 100% 메탄올(MeOH층)에 마이오스타틴 길항제가 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 19참조). 활성이 가장 강한 100% MeOH층을 이용하여 다음단계로 진행하였다.
<2-2>
상기 실험예 2-1의 C18 Cartridge로부터 분리된 100% MeOH(메탄올)층에 포함된 마이오스타틴 길항제 (myostatin antagonist)을 분리하기 위해서 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)에 적용하였다. 칼럼은 Pursuit XRs 5 C18 (Agilent technology)을 사용하였고, 주입한 시료는 3mg이다. 그리고 detector는 210nm와 280nm로 측정하였으며, 용출속도(flow rate)는 1분당 3.5ml이다. HPLC의 이동상의 프로그램은 80% MeOH로 10분간 isocratic를 진행하고, 다음으로 100% MeOH로 30분간 진행하여 마이오스타틴 길항제를 분리하였다. 그 결과 용출시간(retention time)이 16분 (peak 1, SS-P1E)과 19분 (peak 2, SS-P2E)에서 나타났다(도 3참조). 정제된 마이오스타틴 길항제 (Peak 1, SS-P1E)의 구조를 확인하기 위해서 1H-NMR과 13C-NMR은 Bruker AVANCE HD 800 MHz NMR spectrometer (Bruker, Germany)를 이용하여 실시하였다. 1D 및 2D-NMR 분석을 통하여 최종적으로 Peak 1 (SS-P1E)은 Eicosanoyl-5-hydroxytryptamide (EHT20, C30H50N2O2, MW 470.74)로 규명되었다(도 4참조).
또한, 정제된 마이오스타틴 길항제 (Peak 2, SS-P2E)의 구조를 확인하기 위해서 1H-NMR과 13C-NMR은 Bruker AVANCE HD 800 MHz NMR spectrometer (Bruker, Germany)를 이용하여 실시하였다. 1D 및 2D-NMR 분석을 통하여 최종적으로 Peak 2 (SS-P2E)은 Docosanoyl-5-hydroxytryptamide (DHT22, C32H54N2O2, MW 498.42)로 규명되었다(도 5참조).
<실시예 2> 리포트립타마이드 유사체 합성
커피실버스킨으로부터 분리된 EHT20와 DHT22가 마이오스타틴의 길항제로서 밝혀졌다. 이에 EHT20와 DHT22의 유사체(analog)들을 합성하였다. 유사체는 세로토닌과 다양한 길이의 지방산 (탄소가 10부터 탄소수가 23개인 지방산)을 각각 구입하여 유사체를 합성하였다.
세로토닌과 지방산 사이의 반응의 합성은 변형된 방법에 따라 수행되었다. N2 대기하에 0 ℃에서 건조 디메틸포름아마이드(dimethylformamide, DMF) 중 지방산 (1 당량)의 교반된 용액에 하이드록시벤조트리아졸 (Hydroxybenzotriazole, HOBT) (1 당량) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC) (1 당량)를 첨가 하였다. 20 분 동안 교반 한 후, 세로토닌 히드로클로라이드(Serotonin hydrochloride, 1.2 당량)를 첨가 한 후, 10 분에 걸쳐 트리 에틸 아민 (1.5 당량)을 첨가 하였다. 반응 혼합물을 실온온도로 가온하고 24 시간 동안 교반 하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 분별 깔때기로 옮겼다. 물을 첨가하고 유기 층을 에틸 아세테이트로 3회추출 하였다. 유기 층을 합하고 물 (5회), 포화 NaHCO3 (2회), 1N HCl (1회) 및 염수 (1회)로 연속적으로 세척 하였다. 유기 층을 MgSO4상에서 건조시킨 후, 여과하고 회전 증발기로 감압하에 증발시켰다. 각 반응으로부터 매우 순수한 고체 또는 액체 생성물을 수득 하였다. 액체 생성물을 -10 ℃ 이하의 냉장고에 보관하고 상응하는 고체 생성물로 전환시켰다. 생성물을 추가 정제없이 생물학적 평가에 사용하였다.
하기 표 1에 화합물 14종의 구조 및 이름을 표기하고, 1H NMR 데이터를 첨부하였다.
| 실시예 | 화합물이름 | 구조 |
| 실시예2-1 (DHT10) |
Decanoyl-5-hydroxytryptamide (C20H30N2O2) |
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| 실시예2-2 (UHT11) |
Undecyl-5-hydroxytryptamide (C21H32N2O2) |
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| 실시예2-3 (DHT12) |
Dodecanoyl-5-hydroxytryptamide (C22H34N2O2) |
 |
| 실시예2-4 (THT13) |
Tridecanoyl-5-hydroxytryptamide (C23H36N2O2) |
 |
| 실시예2-5 (MHT14) |
Myristyl-5-hydroxytryptamide (C24H38N2O2) |
 |
| 실시예2-6 (PHT15) |
Pentadecanoyl-5-hydroxytryptamide (C25H40N2O2) |
 |
| 실시예2-7 (PHT16) |
Palmityl-5-hydroxytryptamide (C26H42N2O2) |
 |
| 실시예2-8 (HHT17) |
Heptadecanoyl-5-hydroxytryptamide (C27H44N2O2) |
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| 실시예2-9 (SHT18) |
Stearyl-5-hydroxytryptamide (C28H46N2O2) |
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| 실시예2-10 (NHT19) |
Nonadecanoyl-5-hydroxytryptamide (C29H48N2O2) |
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| 실시예2-11 (EHT20) |
Eicosanoyl-5-hydroxytryptamide (C30H50N2O2) |
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| 실시예2-12 (HHT21) |
Heneicosanoyl-5-hydroxytryptamide (C31H52N2O2) |
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| 실시예2-13 (DHT22) |
Docosanoyl-5-hydroxytryptamide (C32H54N2O2) |
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| 실시예2-14 (THT23) |
Tricosanoyl-5-hydroxytryptamide (C33H56N2O2) |
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| 실시예2-15 (serotonin) |
5-Hydroxytryptamine (C10H22N2O) |
 |
<실시예 2-1(DHT10)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)decanamide (C 10 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.80 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.66 (t, J = 7.5 Hz,, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.44 (m, 2H), 1.20 (m, 12H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-2(UHT11)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)undecanamide (C 11 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.80 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.66 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.20 (s, 14H), 0.85 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-3(DHT12)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)dodecanamide (C 12 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.80 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.22 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.44 (m, 2H), 1.20 (s, 16H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-4(THT13)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)tridecanamide (C 13 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.80 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.22 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.44 (m, 2H), 1.20 (s, 18H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-5(MHT14)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)tetradecanamide (C 14 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.79 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.20 (s, 20H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-6(PHT15)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)pentadecanamide (C 15 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.79 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.20 (s, 22H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-7(PHT16)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)palmitamide (C 16 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.79 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.20 (s, 24H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-8(HHT17)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)heptadecanamide (C 17 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.79 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.20 (s, 26H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-9(SHT18)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)stearamide (C 18 ):1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.79 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.20 (s, 28H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-10(NHT19)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)nonadecanamide (C 19 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.79 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.20 (s, 30H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-11(EHT20)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)icosanamide (C 20 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.79 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.20 (s, 32H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-12(HHT21)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)henicosanamide (C 21 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.79 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.20 (s, 34H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-13(DHT22)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)docosanamide (C 22 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.79 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.20 (s, 36H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실시예 2-14(THT23)>
N -(2-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)ethyl)tricosanamide (C 23 ): 1H NMR (400 MHz, DMSO-D 6) δ10.42 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.79 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.20 (s, 38H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
<실험예 3> 리포트립타마이드 화합물의 항마이오스타틴 활성 (Luciferase assay) 분석
상기 실시예 2에서 합성한 화합물의 항마이오스타틴 활성을 분석하기 위해, HEK293 세포를 DMEM 배지 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycine, 1% geneticine)에서 96 well plate에 well 당 2.0×104 cell로 seeding 하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 배지는 FBS가 제거된 DMEM으로 교체하였고, 1 nM의 재조합 마이오스타틴 (R&D system, USA)과 상기 실시예 2의 화합물을 처리하여 CO2 배양기에서 배양하였다. 상기 실시예 2의 화합물의 농도는 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10μM의 농도로 처리하였다. 24시간 뒤 배지를 제거하고 65 ㎕의 DMEM 배지와 65 ㎕의 reagent (Bright-Glo luciferase assay system, USA)를 처리하여 micro plate luminometer에서 발광을 측정하였다. 측정된 수치는 positive와 negative control의 수치를 이용하여 항마이오스타틴 활성을 %로 나타내었다
그 결과, 도 6 내지 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 2-1(DHT10), 실시예 2-2(UHT11), 실시예 2-3(DHT12), 및 실시예 2-4(THT13)의 10 μM에서 90% 마이오스타틴 활성억제가 90%이상 나타났다. 이 중 실시예 2-2(UHT11)의 경우에는 1 μM에서도 마이오스타틴 활성억제가 90%이상 나타났다. 그러므로 luciferase assay의 결과 14종의 리포트립타마이드 중 실시예 2-2(UHT11)이 가장 좋은 활성을 나타났다.
또한 세로토닌에 의한 활성여부를 확인하기 위해서 세로토닌에 대한 활성을 측정한 결과 도 9에 나타낸 바와 같이, 10μM까지 활성이 40% 미만으로 나타났다. 그리고 탄소수가 10개인 데칸산(Decanoic acid)과 탄소수가 11개인 운데칸산(Undecanoic acid)과 같은 지방산만으로 마이오스타틴 활성을 측정한 결과 활성이 20% 미만으로 나타났다(도 9참조). 그러므로 세로토닌 단독 또는 지방산 단독이 아닌 세로토닌과 지방산이 결합된 실시예 2의 리포트립타마이드화합물이 마이오스타틴활성을 억제하는것으로 나타났다.
<실험예 4> 리포트립타마이드 화합물의 ActivinA와 GDF11 저해 활성 분석
상기 실시예 2의 화합물의 ActivinA와 GDF11 저해 활성을 확인하기 위하여 발광 효소 분석(luciferase assay) 시스템을 통해 확인하였다. 구체적으로, 마이오스타틴과 같은 superfamily에 속해있는 activinA와 GDF11의 저해활성을 확인하여 마이오스타틴에 대한 실시예 2의 리포트립타마이드 화합물의 마이오스타틴 특이성을 알아보고자 하였다.
HEK293 세포를 DMEM 배지 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycine, 1% geneticine)에서 96 well plate에 well 당 2.0×104 cell로 seeding 하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 배지는 FBS가 제거된 DMEM으로 교체하였고, activinA 처리군은 activinA를 1 nM, GDF11 처리군은 GDF11를 1 nM를 각 well당 처리하고, 처리된 각 처리군에 상기 실시예 2-1 내지 2-4의 화합물을 0.1, 1 및 10μM의 농도로 처리하였다. CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 뒤 배지를 제거하고 65 ㎕의 DMEM 배지와 65 ㎕의 reagent (Bright-Glo luciferase assay system, USA)를 처리하여 micro plate luminometer에서 발광을 측정하였다. 측정된 수치는 양성대조구(positive control)와 음성대조구(negative control)의 수치를 이용하여 측정하였다. 측정된 수치는 양성대조구(positive control, activinA 또는 GDF11만 처리한 실험구, activinA only 또는 GDF11 only)와 음성대조구(negative control, activinA 또는 GDF11를 처리하지 않은 실험구, No activinA 또는 No GDF11)의 수치를 이용하여 아래와 같은 식을 이용하여 항activinA 또는 항GDF11 활성을 %로 나타내었다.
activinA 또는 GDF11 저해활성 (%) = (1 nM activinA 또는 1 nM GDF11만 처리한 실험구의 발광수치 - 실시예 2 처리구의 발광수치) x 100 / (1 nM activinA 또는 1 nM GDF11만 처리한 실험구의 발광수치 - 1 nM activinA또는 1 nM GDF11를 처리하지 않은 실험구의 발광수치)
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 실시예 2-1(DHT10)의 경우 10, 1, 0.1 μM에서 각각 2, 7, 9%의 억제능이 나타났으며, 실시예 2-2(UHT11)의 경우 10, 1, 0.1 μM에서 각각 20, 7, 5%의 억제능이 나타났다. 또한, 실시예 2-3(DHT12)의 경우 10, 1, 0.1 μM에서 각각 5, 15, 15%의 억제능이 나타났으며, 실시예 2-4(THT13)의 경우 10, 1, 0.1 μM에서 각각 20, 17, 16%의 억제능이 나타났다. 세라토닌의 경우 10, 1, 0.1 μM에서 각각 23, 20, 16%의 억제능이 나타났다.
또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, activin A에 대한 상기 실시예 2-1 내지 2-4의 화합물은 억제활성을 나타내지 않았다.
상기 실험결과에 나타난 바와 같이, 실시예 2-1 및 2-2 화합물이 마이오스타틴을 특이적으로 억제하는 것으로 확인하였다. 이에, 상기 실시예 2-1 및 2-2의 화합물을 0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10 μM의 농도로 처리하여 마이오스타틴, GDF11 및 Activin A에 대한 억제활성을 재확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 실시예 2-1 화합물의 경우, 마이오스타틴(Myostatin, MSTN)에 대한 억제활성은 10, 5 μM에서 90%이상의 억제하였고, GDF11에 대한 억제활성은 10 μM에서는 30% 억제하였고, 나머지농도에서는 억제가 10%미만이었다. 또한, Activin A에 대한 억제활성은 아무런 억제활성을 나타내지 않았다.
실시예 2-2 화합물의 경우, 마이오스타틴에 대한 억제활성은 10, 5, 2.5 μM에서 90%이상의 억제하였고, GDF11에 대한 억제활성은 10 μM에서는 40% 억제하였고, 나머지 농도에서는 억제가 10%미만이었다. 또한, Activin A에 대한 억제활성은 10 μM에서 10%미만, 그리고 나머지 농도에서는 아무런 억제활성을 나타내지 않았다.
따라서, 상기 결과로 인해 실시예 2-1 및 2-2 화합물의 5μM 농도에서 마이오스타틴에 대한 억제 특이성이 있는 것을 확인하였다.
<실험예 5> 리포트립타마이드 화합물의 항마이오스타틴 활성 및 ActivinA와 GDF11 저해 활성 분석
상기 실시예 2에서 합성한 화합물을 이용하여 마우스에 경구투여하고자 하였으나, 낮은 농도로 용해할 경우에는 DMSO에 잘 용해가 되었지만, 고농도로 용해할 경우에는 용해도가 낮아 결정이 형성되었다. 그래서 합성된 화합물을 고농도로 용해하고자 PEG300을 이용하였다. 상기 실험예 3의 결과를 바탕으로 Myostatin의 신호억제능이 높은 실시예 2-1(DHT10), 실시예 2-2(UHT11), 실시예 2-3(DHT12), 그리고 실시예 2-4(THT13)을 용매 PEG300에 녹여 Myostatin, GDF11, 그리고 Activin A에 대한 Luciferase assay를 확인하였으며, 농도는 10 uM로 하여 1 nM Myostatin, GDF11, 1nM GDF11, 및 1 nM Activin A에 대한 Luciferase assay 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 마이오스타틴에 대한 억제는 실시예2-2(UHT11), 실시예 2-3(DHT12), 실시예 2-4(THT13)가 동일하게 90% 정도의 억제활성이 나타났다. 하지만, 실시예 2-3(DHT12)의 경우는 Myostatin 뿐만 아니라, GDF11에 대해서도 높은 억제활성을 보였다. 반면, 실시예 2-4(THT13)의 경우, GDF11과 Activin A에 대해서 50% 정도의 억제활성이 나타났다.
따라서, 4개의 화합물중 마이오스타틴에 강한 억제활성을 가지고, GDF11과 Activin A에 대해서는 억제활성이 낮은 화합물은 실시예 2-2(UHT11)인 것을 확인하였다.
<실험예 6> 세포독성 측정
상기 실험예 4의 결과를 바탕으로 실시예 2-1의 DHT10 화합물과 실시예 2-2의 UHT11 및 커피실버스킨 추출물로부터 분리한 실시예 2-11의 EHT20에 대한 세포독성을 확인하였다. 세포독성실험은 96 well plate의 well에 HEK293세포를 1×105 cell/100 ㎕(in DMEM with 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin 그리고 1% geneticine) seeding 하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 실시예 2-1, 2-2 및 2011의 화합물을 농도별로 처리하여 5% CO2 배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 이후 WST reagent (DaeilLab, Korea)를 10 ㎕넣고 1시간 동안 반응 후 415 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 판단하였다. No treatment은 세포만 처리한 실험구(즉, 아무 약물을 처리하지 않은 실험군)이며, H2O2(0.8 M)는 세포사멸을 유도하는 과산화수소를 처리한 실험구이다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 화합물 농도가 10μM 농도까지 세포 독성이 없는 것으로 확인하였다.
<실험예 7> 리포트립타마이드 화합물의 마이오스타틴 신호 전달 분석
상기 실험예 5의 결과를 바탕으로 상기 실시예 2의 리포트립타마이드 화합물 중 가장 활성이 좋은 실시예 2-2(UHT11)(in PEG300)가 세포수준에서의 마이오스타틴 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인해 보기 위해 western blot을 통해 smad 3 전사인자의 인산화 정도를 확인하였다.
구체적으로, Western blot을 위해 HepG2 세포는 DMEM 배지 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycine)에서 6 well plater에 well 당 2.0×105 cell로 seeding 하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 배지는 FBS가 제거된 DMEM으로 교체하였고, 4시간 뒤 10 nM의 재조합 마이오스타틴과 30, 20, 10 및 5μM 농도의 실시예 2-2(UHT11)의 화합물을 30분간 처리하였다. 세포는 PBS로 2회 세척 후 RIPA buffer (20 mM tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2 EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxychloate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM NA3VO4, 1 ㎍/㎖ leupeptin, cell signaling, USA)와 protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail (Roche, USA)을 처리하였다.
세포는 sonicator를 이용하여 파쇄하였으며 4℃, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 상등액은 BCA assay를 통해 단백질 정량을 하였고, 10% polyacrylamide gel에 전기영동하였다. 전기영동 후 PVDF membrane에 transfer 하였고 5% BSA 또는 5% skim milk를 이용하여 상온에서 2시간 동안 blocking 하였다. Membrane은 TBS-T buffer를 이용하여 상온에서 10분간 3회 washing 하였고 1차 항체 (Samd3, P-Smad3, Cell signaling, USA)를 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 이후 TBS-T buffer을 이용하여 상온에서 10분간 3회 washing 하였고, 2차 항체 (anti-Rabbit IgG, Cell signaling, USA)를 상온에서 2시간 동안 반응하였다. Membrane은 TBS-T buffer를 이용하여 상온에서 10분간 3회 washing 하였고 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 x-ray 필름에 감광하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 2-2(UHT11)의 화합물이 마이오스타틴 신호 전달을 방해함으로써 세포 안쪽으로 진행되는 신호(Smad 전사인자의 인산화)를 저해하는 것을 확인하였다.
Lane 1은 control로서 세포에 아무것도 처리하지 않은 lane이고, Smad3의 인산화가 일어나지 않은 것을 확인하였다. Lane 2는 마이오스타틴만 처리한 lane으로 신호가 전달이 되어, 인산화된 smad3의 발현량이 높아진 것을 확인할 수 있다. 또한, Lane 3은 양성대조구(positive control)로서 마이오스타틴과 SB431542 (마이오스타틴이 결합하는 수용체의 인산화를 억제하는 small molecule)를 동시에 처리한 lane으로 마이오스타틴에 의해 높아져야할 인산화된 Smad3 발현량이 억제된 것을 확인하였다.
또한, Lane 4, 5, 6은 마이오스타틴과 실시예 2-2(UHT11)를 동시에 처리한 lane으로서 lane 4에서는 lane 3과 마찬가지로 인산화된 smad3의 발현이 억제된것을 확인하였고, lane 5, 6의 경우에는 실시예 2-2(UHT11)에 의해서 인산화된 Smad3의 발현을 억제하지 못한 것으로 확인되었다.
따라서, 상기 결과는 실시예 2-2의 UHT11 화합물이 마이오스타틴 신호 전달을 방해함으로써 세포 안쪽으로 진행되는 신호 (Smad 전사인자의 인산화)를 저해하는 것을 확인하였다.
<실험예 8> 동물모델에서 리포트립타마이드 화합물의 체중, 근력, 혈당, 근육량 및 지방량 변화 확인
상기 실험예 5의 결과를 바탕으로 상기 실시예 2의 리포트립타마이드 화합물 중 가장 활성이 좋은 실시예 2-2(UHT11)를 대상으로 자연노화시킨, 96주령 Balb/c마우스에 경구투여하여 체중, 근력, 혈당, 근육량, 지방량의 변화를 확인하여 근감소증을 예방 및 치료할 수 있는지를 확인하였다.
경구투여하지 않은 대조군(n=4)과 경구투여한 실험군(n=4)에 대하여 5주 동안 매일 1회 경구투여를 진행하였다. 경구투여는 마우스 kg당 실시예 2-2(UHT11)를 PEG300에 녹여 0.35 mg을 경구투여 하였다.
경구투여하는 5주 동안, 대조군과 실험군의 생활패턴 등 외관상 나타나는 부작용은 없었으며, 또한 해부시 각각의 조직들(신장, 간 등)을 외관상 살펴본 결과 독성이 없는 것으로 판단되었다.
그 결과, 도 21(a)에 나타낸 바와 같이, 체중 (Body weight)은 대조군과 마이오스타틴 길항제인 실시예 2-2(UHT11)를 경구투여한 실험군과 유의적으로 차이가 나지 않는 것을 확인하였으며, 또한, 도 21(b)에 나타낸 바와 같이, 혈당 (Blood glucose)은 대조군과 실시예 2-2(UHT11)를 경구투여한 실험군과 유의적으로 차이가 나지 않는 것을 확인하였다.
또한, 도 22(a)에 나타낸 바와 같이, 근력 (Grip strength)은 8일, 22일, 그리고 35일째 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 특히, 8일째는 대조군에 비해 3% 유의적으로 증가(P<0.05), 22일째는 18% 유의적으로 증가 (P<0.001), 그리고 35일째는 18% 유의적으로 증가(P<0.05)하는 것을 확인하였다.
도 22(b)에 나타낸 바와 같이, 근육량 (Muscle weight)은 3부위 (Soleus, Gastronemius, Quadriceps)로 나누어 측정하였다. 비장근(Soleus)과 대퇴사두근(Quadriceps)은 실험군과 대조군의 유의적 차이가 없었으나, 장딴지 근육(Gastronemiums)은 실험군이 대조군에 비해 28% 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 22(c)에 나타낸 바와 같이, 지방량 (Fat weight)은 3부위 (iWAT, eWAT, BAT)로 나누어 측정하였다. iWAT와 BAT는 실험군과 대조군의 유의적 차이가 없었으나, eWAT는 실험군이 대조군에 비해 17% 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
근감소증의 경우 근력과 근육량이 감소하고, 지방량이 증가하는 표현형을 가지고 있다.
상기 실험결과로 인해 본 발명의 리포트립타마이드 화합물이 근력과 근육량을 증가시키고, 지방량을 감소하는 것을 유도하는 것을 확인하였으며, 근감소증을 예방하고 치료할 수 있는 것을 확인하였다.
<실험예 9> 동물모델에서 리포트립타마이드 화합물의 근육관련 유전자의 발현 정도 확인
상기 실험예 5의 결과를 바탕으로 상기 실시예 2의 리포트립타마이드 화합물 중 가장 활성이 좋은 실시예 2-2(UHT11)를 대상으로 자연노화시킨, 96주령마우스에 경구투여한 후, 대퇴사두근(Quadriceps) 및 장딴지(Gastronemius)근육들로부터 유전자(mstn, fndc5, ppargc1a, ucp1)에 대한 유전자발현정도를 확인하였다.
그 결과, 도 23(a)에 나타낸 바와 같이, 대퇴사두근(Quadriceps)에서는 실시예2-2(UHT11)를 경구투여한 실험군과 대조군의 유전자 발현에 대한 유의적 차이가 나타나지 않았다.
또한, 도 23(b)에 나타낸 바와 같이, 장딴지근육(Gastronemius)에서는 실시예 2-2(UHT11)를 경구투여한 실험군의 fndc5는 대조군에 비해 유의적으로 감소하였다 (p<0.01). 하지만, ucp1의 유전자발현은 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다 (p<0.05).
Fndc5(Irisin)는 백색지방을 갈색지방으로 유도한다고 알려져 있다. 또한, Ucp1(UCP1)는 미토콘드리아에서만 발현되는 유전자 marker로 알려져 있고, 에너지 생산에 관여한다.
따라서, 상기 실험 결과로 인해, 본 발명의 리포트립타마이드 화합물이 근육량을 증가시키고, 지방량을 감소하는 것을 유도하여, 근감소증을 예방하고 치료할 수 있는 것을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (16)
- 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근 기능 저하, 근육 감소, 근육 위축, 근육 소모 또는 근육 퇴화로 인한 근육 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X는 H 또는이고;
R1은 C5-30의 직쇄 또는 측쇄 알킬이다). - 제1항에 있어서,
상기 근육질환은 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증, 악액질(cachexia), 경직성 척추 증후군(rigid spinesyndrome), 근위축성 측삭경화증(루게릭병, amyotrophic lateral sclerosis), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease) 및 근육 감소증(sarcopenia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. - 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용 약학적 조성물:
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다). - 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 약학적 조성물:
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다). - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 커피 실버스킨은 생두(green bean)를 원두(coffee bean)로 로스팅(roasting)하는 과정에서 생성되는 껍질인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. - 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용 건강기능식품 조성물:
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다). - 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 건강기능식품 조성물:
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다). - 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근 기능 개선용 건강기능식품 조성물:
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다). - 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 커피 실버스킨은 생두(green bean)를 원두(coffee bean)로 로스팅(roasting)하는 과정에서 생성되는 껍질인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물. - 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 분말, 과립, 환제 또는 액제 형태인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물. - 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 분화 촉진, 근육 재생 또는 근육 강화용 건강식품 조성물:
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다). - 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근육 양(muscle mass) 증가 또는 근육 생성 촉진용 건강식품 조성물:
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다). - 커피 실버스킨(silver skin) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 근 기능 개선용 건강식품 조성물:
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
X 및 R1은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다). - 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 커피 실버스킨은 생두(green bean)를 원두(coffee bean)로 로스팅(roasting)하는 과정에서 생성되는 껍질인 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물. - 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 건강식품은 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물은,
(1) 데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(2) 운데실-5-하이드록시트립타마이드;
(3) 도데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(4) 트리데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(5) 미리스틸-5-하이드록시트립타마이드;
(6) 펜타데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(7) 팔미틸-5-하이드록시트립타마이드;
(8) 헵타데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(9) 스테아릴-5-하이드록시트립타마이드;
(10) 노나데카노일-5-하이드록시트립타마이드;
(11) 에이코사노일-5-하이드록시트립타마이드;
(12) 헤네이코사노일-5-하이드록시트립타마이드;
(13) 도코사노일-5-하이드록시트립타마이드;
(14) 트리코사노일-5-하이드록시트립타마이드; 및
(15) 5-하이드록시트립타민;
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| PCT/KR2021/000251 WO2021141439A1 (ko) | 2020-01-10 | 2021-01-08 | 커피 실버스킨 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200003606 | 2020-01-10 | ||
| KR20200003606 | 2020-01-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210090543A true KR20210090543A (ko) | 2021-07-20 |
| KR102566433B1 KR102566433B1 (ko) | 2023-08-17 |
Family
ID=77127384
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200167449A KR102566433B1 (ko) | 2020-01-10 | 2020-12-03 | 커피 실버스킨 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102566433B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230037802A (ko) | 2021-09-10 | 2023-03-17 | 광주여자대학교 산학협력단 | 항산화, 항균 효능을 갖는 커피 은피 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물 및 이를 포함하는 와인 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101528023B1 (ko) | 2012-05-16 | 2015-06-15 | 연세대학교 산학협력단 | 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 플라본계 화합물을 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물 |
| KR101980477B1 (ko) * | 2018-01-12 | 2019-05-20 | 강릉원주대학교산학협력단 | 커피 실버스킨을 이용한 막걸리 및 이의 제조방법 |
| KR20190088424A (ko) * | 2018-01-18 | 2019-07-26 | 강릉원주대학교산학협력단 | 커피 실버스킨 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물 |
-
2020
- 2020-12-03 KR KR1020200167449A patent/KR102566433B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101528023B1 (ko) | 2012-05-16 | 2015-06-15 | 연세대학교 산학협력단 | 캠페리아 파비플로라 추출물 또는 플라본계 화합물을 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물 |
| KR101980477B1 (ko) * | 2018-01-12 | 2019-05-20 | 강릉원주대학교산학협력단 | 커피 실버스킨을 이용한 막걸리 및 이의 제조방법 |
| KR20190088424A (ko) * | 2018-01-18 | 2019-07-26 | 강릉원주대학교산학협력단 | 커피 실버스킨 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230037802A (ko) | 2021-09-10 | 2023-03-17 | 광주여자대학교 산학협력단 | 항산화, 항균 효능을 갖는 커피 은피 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물 및 이를 포함하는 와인 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102566433B1 (ko) | 2023-08-17 |
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