JP5878928B2 - ベンプロペリン誘導体を有効成分として含有する、血管新生関連疾患の予防及び治療用組成物 - Google Patents

ベンプロペリン誘導体を有効成分として含有する、血管新生関連疾患の予防及び治療用組成物 Download PDF

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Description

本発明は、下記化学式1で表されるベンプロペリン(benproperine)誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、血管新生関連疾患の予防及び治療用の薬学的組成物に関する。本発明によるベンプロペリン誘導体及びその薬学的に許容される塩は、がん細胞の移動及び血管新生を阻害してがん転移を効果的に抑制することができるので、抗がん剤としてだけでなく、異常な血管新生により生じる疾患の予防及び治療に有用である。
Figure 0005878928
前記式において、R及びRは独立して水素原子又はヒドロキシである。
血管新生(angiogenesis)とは、組織や臓器に新たな血管が生成される生物学的過程であり、具体的には、既存の微細血管から新たな毛細血管が生成されることを意味し、成長後の体内で血管が生成される根本的な過程である。人体で正常に観察される生理的血管新生は、胚及び胎児の発達、子宮の成熟、胎盤の増殖、黄体の形成、創傷の治癒などの非常に限られた状況でのみ生じ、この時期にも非常に厳密に調節されるので、必要な機能が達成されると血管新生は停止する。新たな血管新生は血管新生調節因子により厳密に調節され、血管新生の表現型は血管新生刺激因子の上方調節(up-regulation)と血管新生抑制因子の下方調節(down-regulation)の全体的なバランスにより異なることが報告されている(非特許文献1)。
新生血管が生成される過程は非常に複雑かつ精巧であるが、要約すると次の通りである。第一に、血管新生のための刺激が既存の血管に伝わると、血管が膨張して膜透過度が増加する。第二に、膨張した血管を通じてフィブリン(fibrin)が血管の外に抜け出て血管周囲の細胞質基質に沈積する。第三に、既存の血管の基底膜を分解するための酵素が活性化されて基底膜が破壊され、その間から内皮細胞が血管を抜け出て周囲の細胞の基質において増殖し、移動する。最後に、一列に配列した内皮細胞が脈管を形成することにより新たな血管を生成する(非特許文献2)。
病的な状態で生じる血管新生に関する疾患は、関節炎のような炎症性疾患、糖尿病性網膜症のような眼科疾患、乾癬(psoriasis)のような皮膚科疾患、及び最も代表的な疾患であるがんに大きく分けられる(非特許文献3)。特に、原発性腫瘍と転移性腫瘍は、それらの成長のために血管新生を必要とする(非特許文献4、非特許文献5)。特に、血管新生に関する疾患のうち最も重篤なケースは固形がんであり、血管新生は腫瘍において2つの重要な役割を果たす。一つは血管新生が腫瘍の成長と増殖に必要な栄養と酸素を供給することであり、もう一つは潰瘍に侵入した新生毛細血管が、転移するがん細胞の血液循環系に入る機会を提供してがん細胞の転移(metastasis)を促進することである。転移はがん患者の死亡の主な原因であるので、がん完治率及び生存率を画期的に改善するためには、がんを完全になくしたり、死滅させるだけでなく、外科手術後のがんの転移を未然に防止したり、既に微小な転移が存在する場合も、転移したがん細胞がそれ以上成長せず、局所部位に留まるようにすることが重要である。よって、腫瘍は血管新生活性が抑制されたり、除去されると成長できないので、腫瘍の血管新生阻害が前記疾患の長期的な治療に効果的であることが多数報告されている。
また、血管新生による眼科疾患としては、加齢性黄斑変性症(macular degeneration)、糖尿病の合併症により網膜の毛細血管が硝子体に侵入して結局目が見えなくなる糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)、未熟児網膜症、新生血管緑内障などのような疾病があり、このような疾病により毎年全世界で数百万人が失明している。
さらに、関節炎は自己免疫異常が原因で生じるが、病気の進行過程で滑液腔に生じた慢性炎症が血管新生を誘導することが知られており、新たな毛細血管が関節に侵入することにより軟骨が破壊されて生じる疾病である。さらに、乾癬も皮膚に生じる慢性の増殖性疾患であるが、急速な増殖のためには多くの血液の供給を要するので、血管新生が活発に生じざるを得ない。
よって、固形がん、眼科疾患、関節炎、乾癬のような過度の血管新生に関連する疾患は血管新生を抑制することが根本的な治療方法となるが、現在用いられている血管新生抑制剤は一般に有機合成方法で製造されたものであるので、その効果が十分でなく、副作用も激しい。特に、がん治療において、がん細胞に直接作用することなく腫瘍に栄養を供給する血管を標的とする血管新生抑制剤は、がん細胞の薬物耐性を避けることができるという利点があるので、現在最も有望な抗がん治療方法の一つとされている。
一方、1−[1-メチル-2−[2−(フェニルメチル)フェノキシ]エチル]ピペリジンの化学名を有するベンプロペリン(benproperine)は、咳や空咳(nonproductive cough)の鎮咳剤(antitussive activity)として用いられ、毒性が少なく、経口投与される薬剤である(非特許文献6)。しかし、いまだがん細胞又は血管内皮細胞の移動抑制によるがん転移又は血管新生阻害に関するベンプロペリンの効果については報告されていない。
よって、本発明者らはがん細胞の移動及び血管新生抑制によりがんの転移を遮断することができる物質を得るべく鋭意研究を重ねた結果、従来は鎮咳剤及び咳止め薬としての効果しか知られていなかったベンプロペリンががん細胞の移動を遮断し、血管新生を阻害し、がんの転移を効果的に抑制できることを見出し、新たな抗がん治療剤としてだけでなく、血管新生関連疾患の予防及び治療剤としてベンプロペリンが有用であることを確認することにより、本発明を完成するに至った。
Folkman, J. (1995) J. Nature Med. 1: 27-31 Risau, W. (1997) Nature 386: 671-674 Folkman, J. (1995) Nature Med. 1: 27-31 Folkman, J. (1971) New Engl. J. Med., 285: 1182-1186 Folkman, J. (1992) J. Biol. Chem. 267: 10931-10934 Yan Liら, (2006) Journal of Chromatography B, 830: 71-80
本発明は、ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、血管新生関連疾患の予防及び治療用の薬学的組成物を提供することを目的とする。
また、本発明は、ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、血管新生関連疾患の予防及び改善用健康機能食品を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ベンプロペリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する血管新生抑制用の薬学的組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ベンプロペリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん転移抑制用の薬学的組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ベンプロペリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における血管新生関連疾患を予防又は治療する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ベンプロペリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における血管新生を抑制する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ベンプロペリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがん転移を抑制する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、血管新生関連疾患の予防又は治療用薬剤を製造するための、ベンプロペリン誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、下記化学式1で表されるベンプロペリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、血管新生関連疾患の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
Figure 0005878928
前記式において、R及びRは独立して水素原子又はヒドロキシである。
本明細書で用いる「ベンプロペリン誘導体」という用語は、化学式1の構造を有し、ベンプロペリンと同等又は類似したレベルの生物学的活性を示す全ての化合物を含むものと意図される。
本発明によるベンプロペリン誘導体は、化学式1において、R及びRがどちらもHであるか、R=Hであり、R=OHであるか、又はR=OHであり、R=Hであることが好ましい。
よって、本発明によるベンプロペリン誘導体は、下記化学式2のベンプロペリン、下記化学式3の3−ヒドロキシベンプロペリン、又は下記化学式4の2−ヒドロキシベンプロペリンであってもよい。
Figure 0005878928
Figure 0005878928
Figure 0005878928
本発明による化学式1のベンプロペリン誘導体は、文献に開示された方法で合成するか、市販品を用いることができる。例えば、本発明によるベンプロペリン誘導体は、文献(非特許文献6)に記載された方法を参照して下記反応式1により直接製造することができる。
Figure 0005878928
前記式において、R及びRは独立して水素原子又はヒドロキシである。
本発明によるベンプロペリン誘導体は、薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。塩としては、薬学的に許容される遊離酸(free acid)により形成された酸付加塩が有用である。本明細書で用いる「薬学的に許容される塩」という用語は、患者に比較的無毒かつ無害な有効作用を示す濃度において、この塩による副作用が化学式1で表される化合物の有利な効能を低下させない前記化合物の任意の全ての有機又は無機付加塩を意味する。
酸付加塩は、通常の方法、例えば化合物を過剰量の酸水溶液に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン又はアセトニトリルを用いて沈殿させて製造する。等モル量の化合物及び水中の酸又はアルコール(例えば、グリコールモノメチルエーテル)を加熱し、次に前記混合物を蒸発させて乾燥させるか、又は析出した塩を吸引濾過してもよい。
ここで、遊離酸としては有機酸と無機酸を用いることができ、これらに限定されるものではないが、無機酸としては塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、酒石酸などを用いることができ、有機酸としてはメタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸(maleic acid)、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸(fumaric acid)、マンデル酸、プロピオン酸(propionic acid)、クエン酸(citric acid)、乳酸(lactic acid)、グリコール酸(glycollic acid)、グルコン酸(gluconic acid)、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸(glutaric acid)、グルクロン酸(glucuronic acid)、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸(hydroiodic acid)などを用いることができる。
また、塩基を用いて薬学的に許容される金属塩を形成することができる。アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩は、例えば化合物を過剰量のアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解し、溶解しない化合物の塩を濾過して濾液を蒸発、乾燥させて得る。ここで、金属塩としては、特にナトリウム、カリウム又はカルシウム塩を用いることが製薬上好ましいが、これらに限定されるものではない。また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩を適当な銀塩(例えば、硝酸銀)と反応させて得ることができる。
前記化学式1の化合物の薬学的に許容される塩は、特に言及されない限り、化学式1の化合物に存在する酸性又は塩基性基の塩を含む。例えば、薬学的に許容される塩としては、ヒドロキシ基のナトリウム塩、カルシウム塩、およびカリウム塩などがあり、アミノ基のその他の薬学的に許容される塩としては、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩(メシル酸塩)、p−トルエンスルホン酸塩(トシル酸塩)などがあり、当業界で公知の塩の製造方法で製造することができる。
本発明のベンプロペリン塩としては、薬学的に許容される塩であり、ベンプロペリンと同等のがん細胞移動及び血管新生抑制効果を示すベンプロペリン塩であれば、いずれも用いることができ、ベンプロペリンリン酸塩(phosphate benproperine)、ベンプロペリンナトリウム塩(sodium benproperine)、ベンプロペリンカリウム塩(potassium benproperine)、ベンプロペリンマグネシウム塩(magnesium benproperine)などを用いることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
本発明によるベンプロペリンは、肺の伸張受容器(stretch receptor)を特異的に麻酔させる非麻薬性の薬剤であり、以前から安全性及び毒性に問題のないことが確認され、鎮咳剤及び咳止め薬として用いられてきた。しかし、本発明においては、鎮咳剤及び咳止め薬としての医学的用途以外にベンプロペリンががん細胞の移動及び血管新生に対する阻害活性を示すことを確認し、これをがん転移抑制剤、がんの予防及び治療剤だけでなく、血管新生関連疾患の予防及び治療剤として用いる新たな医学的用途を提案する。
具体的には、本発明の好ましい実施形態において、がん転移関連遺伝子であるPRL−3が過剰発現された大腸がん細胞株を対象にベンプロペリン誘導体及びその薬学的に許容される塩の細胞移動阻害活性を分析した。その結果、本発明によるベンプロペリン誘導体及びその薬学的に許容される塩は、5μMの低濃度においてもがん細胞移動を80%以上阻害して優れた細胞移動阻害活性を示すことが確認された(図3及び図4参照)。また、本発明によるベンプロペリン誘導体は、大腸がん細胞株以外の他の様々ながん細胞株においても、同等の細胞移動阻害活性を示した(図5参照)。
本発明の他の好ましい実施形態においては、血管内皮細胞HUVEC(human umbilical vein endothelial cells)を対象に試験管内の内皮形態形成分析法(in vitro endothelial morphogenesis assay)を用いてベンプロペリン誘導体及びその薬学的に許容される塩の血管新生阻害活性を分析した。その結果、本発明によるベンプロペリン誘導体及びその薬学的に許容される塩は、10μMの低濃度においても血管内皮細胞の管形成(tube formation)を効果的に阻害し、優れた血管新生阻害活性を有することが確認された(図6参照)。
前述したように、本発明のベンプロペリン、その誘導体及びその薬学的に許容される塩は、がん転移に不可欠ながん細胞移動及び血管新生の形成を阻害する活性を有するので、がん転移抑制剤及び抗がん剤としてだけでなく、過度の血管新生によって生じる疾患の予防及び治療に有用である。
よって、本発明は、ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、血管新生関連疾患の予防及び治療用の薬学的組成物を提供する。
このようなカテゴリーにおいて、本発明は、ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する血管新生抑制用の薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん転移抑制用薬学的組成物を提供する。
本発明において、「予防」とは、本発明の組成物の投与によりがん疾患又は血管新生関連疾患の発生、拡散又は再発を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、本発明の組成物の投与により前記疾患の症状が好転又は有利に変化するあらゆる行為を意味する。
本発明において、「血管新生」とは、血管が新しく形成される過程、すなわち、新たな血管が細胞、組織又は器官内に発生することを意味し、「新生血管」とは、血管新生過程により新たに生成された血管を意味する。本発明において、「血管新生」と「新生血管」は相互互換的に用いられる。本発明において、「血管新生関連疾患」とは、前述したような血管新生が異常に進行して生じる疾患を意味する。
本発明の薬学的組成物により予防又は治療できる血管新生関連疾患は、がん、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶反応、新生血管緑内障、紅皮症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節症、アテローム性動脈硬化プラーク内の毛細血管増殖、ケロイド、創傷肉芽形成、血管癒着、関節リウマチ、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄症、アテローム性動脈硬化症、腸管癒着、猫ひっかき病、潰瘍、肝硬変症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、臓器移植拒絶反応、腎糸球体症、糖尿病、炎症又は神経退行性疾患である。
本発明の薬学的組成物により予防又は治療できるがん疾患は、子宮頸がん、肺がん、膵がん、非小細胞肺がん、肝がん、結腸がん、骨肉腫、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、皮膚黒色腫、眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肝がん、脳腫瘍、膀胱がん、血液がん、胃がん、肛門周囲腺がん、結腸がん、乳がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病(Hodgkin's disease)、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系(CNS; central nervous system)腫瘍、原発性CNSリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫などを含む。本発明の薬学的組成物は、がん細胞の移動を効果的に抑制するので、がん転移を予防及び治療するのに有用である。
本発明の薬学的組成物は、それぞれの使用目的に応じて、通常の方法で散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エアゾール剤などの経口剤形、滅菌注射溶液の注射剤など様々な形態に剤形化して用いることができ、経口投与することもでき、静脈内、腹腔内、皮下、直腸、局所投与などの様々な経路で投与することもできる。これらの組成物に含まれるのに適合した担体、賦形剤又は希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。本発明の組成物は、充填剤、抗凝集剤、滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、前記組成物に少なくとも1種の賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混合して剤形化する。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑剤も用いられる。
経口用液体製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、通常用いられる通常の希釈剤である水、液体パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが用いられる。
非経口投与製剤としては、滅菌済みの水溶液剤、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤などが挙げられる。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが含まれる。注射剤には、溶解剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤などの従来の添加剤が含まれる。
本発明の薬学的組成物は、薬学的有効量で投与する。本発明において、「薬学的有効量」とは、医学的治療に適用できる合理的な利益/危険性の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬剤の活性、薬剤感受性、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、同時に用いられる薬剤を含む要素、及びその他医学分野で公知の要素により決定される。本発明の組成物は、単独で又は他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤と順次又は同時に投与することができ、単一又は多重投与することができる。上記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大限の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定される。
具体的には、本発明の薬学的組成物において、化合物の有効量は患者の年齢、性別、体重により異なり、一般には体重1kg当たり1〜10mg、好ましくは1〜5mgを連日又は隔日投与するか、1日1〜3回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、疾病の重症度、性別、体重、年齢などにより増減するので、前記投与量はいかなる方法であれ本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与することができる。投与におけるあらゆる方式が予想され得るが、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、子宮内、硬膜又は脳室内(intracerebroventricular)注射により投与することができる。
さらに、本発明は、治療学的有効量のベンプロペリン、その薬学的に許容される塩、又はその誘導体を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における血管新生関連疾患を予防又は治療する方法を提供する。
これらのカテゴリーにおいて、本発明は、治療学的有効量のベンプロペリン、その誘導体、又はその薬学的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における血管新生を抑制する方法を提供する。
さらに、本発明は、治療学的有効量のベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがん転移を抑制する方法を提供する。
本発明において、「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を提供することを意味し、本発明の薬学的組成物の投与経路は、標的組織に送達できるものであれば、一般的なあらゆる経路を介して経口又は非経口投与することができる。また、本発明の組成物は、有効成分を標的細胞に送達する任意の装置を用いて投与することができる。
本発明において、「対象」とは、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、又はモルモットを含むが、これらに限定されない動物を意味し、一実施例においては哺乳類を、又他の実施例においてはヒトを意味する。
本発明において、有効成分と組み合わせて用いられる「治療学的有効量」という用語は、対象疾患を治療又は予防するのに有効なベンプロペリン、その薬学的に許容される塩、又はその誘導体の量を意味する。
本発明の薬学的組成物は、有効成分としてベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩以外に、公知の抗がん剤又は血管新生阻害剤をさらに含んでもよく、これらの疾患の治療のために公知の他の治療と併用することができる。他の治療には、化学療法、放射線治療、ホルモン治療、骨髄移植、幹細胞治療、他の生物学的治療、免疫治療などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の薬学的組成物に含まれる抗がん剤の例としては、DNAアルキル化剤(DNA alkylating agents)としてメクロレタミン(mechlorethamine)、クロラムブシル(chlorambucil)、フェニルアラニン(phenylalanine)、マスタード(mustard)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、イホスファミド(ifosfamide)、カルムスチン(carmustine: BCNU)、ロムスチン(lomustine: CCNU)、ストレプトゾトシン(streptozotocin)、ブスルファン(busulfan)、チオテパ(thiotepa)、シスプラチン(cisplatin)及びカルボプラチン(carboplatin)、抗がん性抗生物質(anti-cancer antibiotic)としてアクチノマイシンD(dactinomycin: actinomycin D)、ドキソルビシン(doxorubicin: adriamycin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、イダルビシン(idarubicin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、プリカマイシン(plicamycin)、マイトマイシン(mitomycin)及びCブレオマイシン(C Bleomycin)、並びに植物アルカロイド(plant alkaloid)としてビンクリスチン(vincristine)、ビンブラスチン(vinblastine)、パクリタキセル(paclitaxel)、ドセタキセル(docetaxel)、エトポシド(etoposide)、テニポシド(teniposide)、トポテカン(topotecan)及びイリノテカン(irinotecan)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の薬学的組成物に含まれる血管新生阻害剤の例としては、アンギオスタチン(angiostatin)(プラスミノーゲン断片)、抗血管新生アンチトロンビンIII、アンギオザイム(angiozyme)、ABT−627、Bay 12−9566、ベネフィン(benefin)、ベバシズマブ(bevacizumab)、BMS−275291、軟骨由来阻害剤(cartilage-derived inhibitor, CDI)、CAI、CD59補体断片、CEP−7055、Col 3、コンブレタスタチン(combretastatin)A−4、エンドスタチン(endostatin)(コラーゲンXVIII断片)、フィブロネクチン断片、Gro−β(Gro-beta)、ハロフジノン(halofuginone)、ヘパリナーゼ、ヘパリンヘキササッカライド断片、HMV833、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン(hCG)、IM−862、インターフェロンα/β/γ、インターフェロン誘導タンパク質(IP−10)、インターロイキン−12、クリングル(Kringle)5(プラスミノーゲン断片)、マリマスタット(marimastat)、デキサメタゾン、メタロプロテアーゼ(metalloproteinase)阻害剤(TIMP)、2−メトキシエストラジオール、MMI 270(CGS 27023A)、MoAb IMC−1C11、ネオバスタット(neovastat)、NM−3、パンゼム(Panzem)、PI−88、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化阻害剤、血小板因子4(PF4)、プリノマスタット(prinomastat)、プロラクチン16 kD断片、プロリフェリン(proliferin)関連タンパク質(PRP)、PTK 787/ZK 222594、レチノイド、ソリマスタット、スクアラミン、SS 3304、SU 5416、SU6668、SU11248、テトラヒドロコルチゾール−S、テトラチオモリブデート(tetrathiomolybdate)、サリドマイド、トロンボスポンジン(Thrombospondin)−1(TSP-1)、TNP−470、形質転換(transforming)成長因子−β(TGF−β)、バスキュロスタチン(vasculostatin)、バソスタチン(カルレティキュリン(calreticulin)断片)、ZD6126、ZD6474、ファルネシル(farnesyl)トランスフェラーゼ阻害剤(FTI)、及びビスホスホネート(例えば、アレンドロネート、エチドロネート(etidronate)、パミドロネート、リセドローネート、イバンドロネート、ゾレドロネート(zoledronate)、オルパドロネート(olpadronate)、インカドロネート又はネリドロネート(neridronate))などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
さらに、本発明は、血管新生関連疾患の予防及び改善の効果を示すベンプロペリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする健康機能食品を提供する。
本発明のベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物は、血管新生関連疾患の予防及び改善に効果的な薬剤、食品及び飲料など様々に用いることができる。本発明のベンプロペリン及びその薬学的に許容される塩を添加できる食品としては、例えば各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあり、粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲料の形態で用いることができる。
本発明のベンプロペリン、その誘導体及びその薬学的に許容される塩は、当業界で長期間にわたって鎮咳剤及び咳止め薬として用いられ、その安全性、毒性及び副作用に問題のないことが確認されているので、疾患の予防及び改善目的で長期間服用する場合も安心して用いることのできる薬剤である。
本発明のベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩は、血管新生関連疾患の予防及び改善を目的として食品又は飲料に添加することができる。ここで、食品又は飲料中の前記化合物の量は、一般に食品の総重量の0.01〜15重量%となるように添加することができ、健康飲料組成物は100mlを基準として0.02〜10g、好ましくは0.3〜1gの割合で添加することができる。
本発明の健康機能食品は、所定の割合で必須成分として前記化合物を含有する以外に、食品学的に許容される食品補助添加剤、例えば様々な香味剤や天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。前述した天然炭水化物の例としては、ブドウ糖、果糖などの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類、デキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類のような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールがある。前述したもの以外の香味剤としては、天然香味剤(ソーマチン、ステビア抽出物(例えば、レバウディオサイドA、グリチルリチンなど))及び合成香味剤(サッカリン、アスパルテームなど)を用いることが有利である。前記天然炭水化物の割合は、本発明の健康機能食品100ml当たり一般に約1〜20g、好ましくは約5〜12gである。前述したもの以外に、本発明の健康機能食品は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル(電解質)、合成風味剤、天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤(チーズ、チョコレートなど)、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド、増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有してもよい。その他、本発明の健康機能食品は、天然フルーツジュース、及びフルーツジュース飲料並びに野菜飲料の製造に用いられる果肉を含有してもよい。これらの成分は独立して又は組み合わせて用いることができる。このような添加剤の割合はそれほど重要でないが、本発明の組成物100重量部当たり0〜約20重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
前述したように、本発明のベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩は、がんの転移に不可欠な細胞移動及び血管新生を阻害することにより、抗がん剤、がん転移抑制剤、及び血管新生関連疾患の予防及び治療剤として有用である。
本発明による化学式2のベンプロペリンをH−NMRで分析した結果である。 本発明によるベンプロペリン誘導体の細胞毒性を測定した結果である。 本発明によるベンプロペリン誘導体及びその薬学的に許容される塩の細胞移動阻害活性を分析した結果である。 本発明による化学式2〜化学式4のベンプロペリン誘導体の細胞移動阻害活性を分析した結果である。 本発明によるベンプロペリン誘導体の様々なヒトの固形がん細胞に対する細胞移動阻害活性を分析した結果である。 本発明によるベンプロペリン誘導体の血管内皮細胞(HUVEC)に対する血管新生阻害活性を分析した結果である。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲が実施例により限定されるものではない。
参考例1:ベンプロペリン誘導体の合成
文献に報告された方法を参考に反応式1により化学式2〜化学式4のベンプロペリン誘導体を合成した(非特許文献6)。
Figure 0005878928
前記式において、R及びRは独立して水素原子又はヒドロキシである。
前述したように合成されたベンプロペリン誘導体のH−NMR分析結果は下記の通りである。
化学式2のベンプロペリン
H NMR(CDCl):7.23(6H,m),7.09(1H,d,J=6.6),6.86(2H,t,8.1),4.07(1H,m),3.98(2H,s),3.85(1H,m),2.97(1H,m),2.54(4H,m),1.55(4H,m),1.42(2H,m),1.11(3H,d,J=6.6)
化学式3の3−ヒドロキシベンプロペリン
H−NMR(CDCl):7.28(7H,m),6.85(2H,m),4.12(1H,m),4.01(2H,m),3.85(2H,m),3.68(5H,m),2.57(4H,m),1.21(3H,m)
化学式4の2−ヒドロキシベンプロペリン
H−NMR(CDCl):7.3(1H,m),7.18(1H,m),7.04(2H,m),6.93(2H,m),6.80(2H,m),4.09(1H,m),4.01(2H,d,J=8.76),3.89(2H,d,J=8.79),2.71(5H,m),1.7(5H,m),1.17(3H,d,J=3.3)
図1は化学式2のベンプロペリンのH−NMR分析スペクトルを示す図である。
ベンプロペリンの細胞毒性分析
参考例1で合成されたベンプロペリン誘導体の細胞毒性を検証するために、がん転移関連遺伝子であるPRL−3が過剰発現されたヒト大腸がん細胞株DLD−1細胞(ATCC CCL−221)を、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI培地で37℃、5%COを維持して培養し、その後0.05%トリプシンEDTAを用いて細胞を採取した。10%FBS含有培地を含む96ウェルプレートの各ウェルに血球計数器(hematocytometer)で計数した4×10個の細胞を接種し、5%COを含む培養器にて37℃で培養した。24時間経過後、各ウェルの培地を、対照群(0.1%DMSO)と参考例1で合成された化学式2のベンプロペリンを各濃度(5及び10μM)で含む新鮮な培地に交換し、5%CO培養器にて37℃で48時間培養した。前記プレートの各ウェルにWST−1(Roche)を10μlずつ添加して2時間培養し、その後ELISAリーダー(ELISA Reader, Bio-Rad)を用いて450nmにおける吸光度を測定した。
その結果、図2に示すように、本発明によるベンプロペリンは10μMの濃度でも細胞毒性を示さなかった。
試験管内の細胞移動阻害活性分析
本発明によるベンプロペリン誘導体の試験管内の細胞移動阻害活性を分析するために、PRL−3が過剰発現された大腸がん細胞株DLD−1細胞(ATCC CCL−221)を、RPMI培地を含む培養皿で約90%成長させ、その後培地を除去してPBSで洗浄した。洗浄した細胞をトリプシンEDTAで処理し、CO培養器にて37℃で15時間培養して細胞を採取した。これに10%FBS含有RPMI培地を添加してファルコンチューブ(falcon tube)に入れ、その後遠心分離して培地を除去した。得られた細胞にFBS非含有RPMI培地を添加し、遠心分離して培地を除去する過程を2回繰り返した。こうして得られた細胞にFBS非含有RPMI培地を添加して懸濁させ、その後血球計数器を用いて細胞数を計数した。
24ウェルプレートにトランスウェル(trans-well)を設置し、8×10細胞/200μlの細胞を添加した。ウェルプレート上にトランスウェルが設置された空間を利用して500μlのFBS非含有RPMI培地を添加し、CO培養器にて37℃で12〜16時間培養した。培養後、ハンドタオル(hand towel)上でトランスウェルを逆さにして培地を除去し、その後24ウェルプレートの各ウェルに500μlのクリスタルバイオレット(crystal violet,20%MeOH中で5mg/ml)を添加し、トランスウェルをCO培養器内に30分間静置した。染色したトランスウェルをPBSで洗浄し、ハンドタオル上で逆さにして残った溶液をしみ込ませた。細胞が移動しない方向を上にして膜をカバースリップ(cover slip)上に設置し、移動していない細胞を綿棒でよく拭き取った。カバースリップの縁部にマニキュアを少量塗布し、スライドガラスにかぶせて固定した。このように準備したサンプルをデジタルカメラが装着された倒立顕微鏡(TE 300, Nikon, Japan)で写真撮影し、移動した細胞数を計数した。
前述した方法で本発明による化学式2〜化学式4のベンプロペリン及びその薬学的に許容される塩の細胞移動阻害活性を観察し、下記数式1により細胞移動阻害度を計算した。
Figure 0005878928
前記式における対照試料は、本発明の化合物を添加せずに0.1%ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide, DMSO)のみ添加して観察したものである。
その結果、図3に示すように、本発明による化学式2のベンプロペリン及びそのリン酸塩は、大腸がん細胞の移動を5μMの濃度では対照試料の80%以上抑制し、10μMの濃度では対照試料の約90%以上抑制することが確認された。
図4は本発明による化学式2のベンプロペリン、化学式3の3−ヒドロキシベンプロペリン、及び化学式4の2−ヒドロキシベンプロペリンの大腸がん細胞株DLD−1に対する細胞移動阻害活性を分析した結果である。図4に示すように、本発明による化学式2〜化学式4のベンプロペリン誘導体は、全て対照試料である0.1%DMSOに比べて大腸がん細胞の移動を効果的に抑制することが分かる。
また、大腸がん細胞株DLD−1細胞以外に、膵がん細胞株AsPc−1細胞(ATCC CRL−1682)、黒色腫細胞株B16F10(ATCC CRL−6475)及びA375P(KCLB−80003)細胞、並びに乳がん細胞株MDA−MB−231(ATCC HT−26)細胞を対象に本発明によるベンプロペリンの細胞移動阻害活性を分析した結果、図5に示すように、DMSO処理した対照試料に比べて、10μMのベンプロペリン処理により全てのがん細胞株の細胞移動が著しく抑制されることが確認された。
試験管内の内皮形態形成分析法を用いた血管新生阻害活性分析
本発明によるベンプロペリンの血管新生阻害活性を、ヒト由来細胞株である血管内皮細胞HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)における試験管内の内皮形態形成(in vitro endothelial morphogenesis)分析法を用いて生体内と類似の環境で観察した。
具体的には、HUVEC(ATCC CRL−2873)を無血清培地で一晩培養して飢餓(starvation)状態にした。24ウェルプレートの各ウェルに0.2mlのマトリゲルマトリックス(BD biosciences)を添加し、培養器に37℃で1時間保管してウェル表面をコーティングした。マトリゲルマトリックスでコーティングされた各ウェルに前述したように準備した2×10個の細胞0.2mlを添加し、CO培養器にて30分間培養した。培養後、ベンプロペリンを1μM、5μM及び10μMの濃度で含有する新鮮な培地を各ウェルに添加し、1%血清を添加し、CO培養器にて24時間培養した。培養後、HUVECの管形成(tube formation)に対するベンプロペリンの阻害活性の程度を顕微鏡で観察した。
その結果、図6に示すように、本発明のベンプロペリンは、濃度依存的にHUVECの管形成を抑制し、特に10μMの濃度でDMSO処理対照群に比べて管形成が著しく抑制され、優れた新生血管阻害活性を有することが確認された。
生体内のがん転移抑制活性分析
本発明によるベンプロペリンの生体内の細胞移動阻害活性を分析するために、黒色腫細胞を移植した腫瘍モデルを用いてベンプロペリンのがん転移抑制活性を分析した。
具体的には、B16F10ヒト黒色腫細胞株(ATCC CRL−6475)を10%FBS(GIBCO, USA)含有DMEM(GIBCO, USA)培地に接種して5%CO、37℃で培養した。7週齢の特定病原体不在(SPF)C57BL/6雌マウスを、抗生物質無添加の固形飼料(サムヤン飼料(株)、韓国)と水道水を滅菌して十分に供給しながら、実験室環境に適応させてから実験に用いた。
培養されたB16F10ヒト黒色腫細胞を2×10細胞/mlの濃度でPBS 200μlに懸濁し、その後前記マウスの尾静脈に26ゲージの注射針を用いて皮下接種した。接種3時間後、マウスを2グループに分け、対照群には滅菌蒸留水を投与し、実験群にはベンプロペリンを50mg/kgの用量で1日1回ずつ計14回腹腔内投与した。前記投与を13日間持続し、その後終了した。投与後14日目に各グループのマウスを剖検し、肺を摘出して転移したがん細胞(黒色腫細胞)のコロニー数を計測した。
Figure 0005878928
その結果、表1に示すように、滅菌蒸留水を投与したマウス(対照群)では黒色腫細胞が転移して肺に多数のコロニー形成が観察されたのに対して、ベンプロペリンを投与したマウスでは相対的に黒色腫細胞の転移により生成されたコロニーの数が著しく減少したことが確認された。この結果は、本発明によるベンプロペリンを処理すると、対照群に比べてがん細胞転移を約45.1%抑制できることを示すものである。
ラットにおける経口投与急性毒性実験
本発明によるベンプロペリン及びその薬学的に許容される塩の毒性を確認するために、下記の通り実験動物における急性毒性実験を行った。
6週齢の特定病原体不在(SPF)SD系ラットを1群当たり2匹ずつに分け、各ラットに参考例1で製造されたベンプロペリンを注射用蒸留水に溶解して1000mg/kgの用量で単回経口投与した。試験物質投与後、動物の死亡の有無、臨床症状、体重変化を観察して血液学的及び血液生化学的検査を行い、剖検して肉眼で腹腔臓器及び胸腔臓器における異常の有無を観察した。
その結果、試験物質を投与した全ての動物において特記するほどの臨床症状や死亡はなく、体重変化、血液学的及び血液生化学的検査、剖検所見などでも毒性変化は観察されなかった。
よって、本発明によるベンプロペリン及びその薬学的に許容される塩は、全てのラットにおいて1000mg/kgまで毒性変化を示さないので、経口投与の最小致死量(LD50)が1000mg/kg以上の安全な物質であると判定された。
製剤例1:散剤の製造
ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩……………………20mg
ラクトース……………………………………………………………………………100mg
タルク……………………………………………………………………………………10mg
通常の散剤製造方法で前記成分を混合し、気密袋に充填して散剤を製造した。
製剤例2:錠剤の製造
ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩……………………10mg
トウモロコシデンプン………………………………………………………………100mg
ラクトース……………………………………………………………………………100mg
ステアリン酸マグネシウム………………………………………………………………2mg
通常の錠剤製造方法で前記成分を混合し、その後打錠して錠剤を製造した。
製剤例3:カプセル剤の製造
ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩……………………10mg
結晶性セルロース…………………………………………………………………………3mg
ラクトース…………………………………………………………………………14.8mg
ステアリン酸マグネシウム…………………………………………………………0.2mg
通常のカプセル剤製造方法で前記成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
製剤例4:注射剤の製造
ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩……………………10mg
マンニトール…………………………………………………………………………180mg
注射用滅菌蒸留水…………………………………………………………………2974mg
NaHPO12HO………………………………………………………………26mg
通常の注射剤製造方法で注射用滅菌蒸留水に前記成分を混合し、その後1アンプル当たり(2ml)前述した成分含有量となるように注射剤を製造した。
製剤例5:液剤の製造
ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩……………………10mg
異性化糖……………………………………………………………………………………10g
マンニトール…………………………………………………………………………………5g
精製水…………………………………………………………………………………………適量
通常の液剤製造方法で精製水に前記成分を混合し、その後精製水を加えて総体積を100mlに調節して茶色のビンに充填し、滅菌して液剤を製造した。
製剤例6:健康食品の製造
ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩……………………10mg
ビタミン混合物………………………………………………………………………………適量
ビタミンAアセテート…………………………………………………………………70μg
ビタミンE……………………………………………………………………………1.0mg
ビタミンB1………………………………………………………………………0.13mg
ビタミンB2………………………………………………………………………0.15mg
ビタミンB6…………………………………………………………………………0.5mg
ビタミンB12………………………………………………………………………0.2μg
ビタミンC………………………………………………………………………………10mg
ビオチン…………………………………………………………………………………10μg
ニコチン酸アミド……………………………………………………………………1.7mg
葉酸………………………………………………………………………………………50μg
パントテン酸カルシウム……………………………………………………………0.5mg
無機混合物……………………………………………………………………………………適量
硫酸第一鉄…………………………………………………………………………1.75mg
酸化亜鉛……………………………………………………………………………0.82mg
炭酸マグネシウム…………………………………………………………………25.3mg
第一リン酸カリウム……………………………………………………………………15mg
第二リン酸カルシウム…………………………………………………………………55mg
クエン酸カリウム………………………………………………………………………90mg
炭酸カルシウム………………………………………………………………………100mg
塩化マグネシウム…………………………………………………………………24.8mg
通常の健康食品製造方法で前記成分を混合して顆粒を製造し、その後これを通常の方法で健康食品組成物の製造に用いることができる。
前記ビタミン及びミネラル混合物の組成比は比較的健康食品に適した複数の成分を好ましい実施例により混合して組成したものであり、その配合比を任意に変更して実施してもよい。
製剤例7:健康飲料の製造
ベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩……………………10mg
ビタミンC…………………………………………………………………………………15g
ビタミンE(粉末)……………………………………………………………………100g
乳酸鉄………………………………………………………………………………19.75g
酸化亜鉛…………………………………………………………………………………3.5g
ニコチン酸アミド………………………………………………………………………3.5g
ビタミンA………………………………………………………………………………0.2g
ビタミンB1…………………………………………………………………………0.25g
ビタミンB2……………………………………………………………………………0.3g
水………………………………………………………………………………………………定量
通常の健康飲料製造方法で前記成分を混合して85℃で約1時間攪拌加熱し、その後製造された溶液を濾過して滅菌された2リットル容器に入れた。この容器を密封滅菌して冷蔵保管し、その後健康飲料組成物の製造に用いた。
前記組成比は比較的嗜好飲料に適合した成分を好ましい実施例により混合して組成したものであり、需要階層、需要国、使用用途などの地域的、民族的嗜好度によりその配合比を任意に変更して実施してもよい。
本発明のベンプロペリン、その誘導体又はその薬学的に許容される塩は、がん転移に不可欠な細胞移動及び血管新生を阻害することにより、抗がん剤、がん転移抑制剤、及び血管新生関連疾患の予防及び治療剤として有用である。

Claims (10)

  1. 下記化学式1で表されるベンプロペリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、薬学的に許容される担体を含む、血管新生抑制又はがん転移抑制のための薬学的組成物。
    Figure 0005878928
    前記式において、R及びRは独立して水素原子又はヒドロキシである。
  2. ベンプロペリン誘導体が下記化学式2で表されるベンプロペリン、下記化学式3で表される3−ヒドロキシベンプロペリン、及び下記化学式4で表される2−ヒドロキシベンプロペリンからなる群から選択される請求項1に記載の薬学的組成物。
    Figure 0005878928
    Figure 0005878928
    Figure 0005878928
  3. ベンプロペリン誘導体の薬学的に許容される塩がベンプロペリンリン酸塩、ベンプロペリンナトリウム塩、ベンプロペリンカリウム塩及びベンプロペリンマグネシウム塩からなる群から選択される請求項1または2に記載の薬学的組成物。
  4. がんが子宮頸がん、肺がん、膵がん、非小細胞肺がん、肝がん、結腸がん、骨肉腫、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、皮膚黒色腫、眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、脳腫瘍、血液がん、胃がん、肛門周囲腺がん、乳がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、原発性CNSリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫又は脳下垂体腺腫である請求項1〜のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  5. 抗がん剤をさらに含む請求項1〜のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  6. 抗がん剤がDNAアルキル化剤、抗がん性抗生物質及び植物アルカロイドからなる群から選択される少なくとも1種である請求項に記載の薬学的組成物。
  7. 血管新生阻害剤をさらに含む請求項1〜のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  8. 下記化学式1で表されるベンプロペリン誘導体又はその薬学的に許容される塩及び食品学的に許容される添加剤を含む、血管新生抑制のための健康機能食品。
    Figure 0005878928
    前記式において、R及びRは独立して水素原子又はヒドロキシである。
  9. ベンプロペリン誘導体が下記化学式2で表されるベンプロペリン、下記化学式3で表される3−ヒドロキシベンプロペリン、及び下記化学式4で表される2−ヒドロキシベンプロペリンからなる群から選択される請求項に記載の健康機能食品。
    Figure 0005878928
    Figure 0005878928
    Figure 0005878928
  10. ベンプロペリン誘導体の薬学的に許容される塩がベンプロペリンリン酸塩、ベンプロペリンナトリウム塩、ベンプロペリンカリウム塩及びベンプロペリンマグネシウム塩からなる群から選択される請求項またはに記載の健康機能食品。
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