KR101797323B1 - 마메신을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물 - Google Patents

마메신을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 예방 또는 개선용 건강기능식품, 혈관신생 억제용 조성물 및 맥관형성 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 마메신이 VEGF-A로 유도된 혈관내피세포의 증식, 이동, 침투, 혈관형성 및 혈관형성 발아를 억제하는 약리활성을 가지는 것을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 마메신을 유효성분으로 포함하는 조성물은 혈관형성 억제용도로 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.

Description

마메신을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물 {Composition for inhibiting angiogenesis comprising marmesin}
본 발명은 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 예방 또는 개선용 건강기능식품, 혈관신생 억제용 조성물 및 맥관형성 억제용 조성물에 관한 것이다.
새로운 혈관을 형성하고 끌어들이는 혈관신생 (angiogenesis)은 발달, 장기 회복, 염증, 암 등과 같은 생리적, 병리적 과정에서 중요한 역할을 하며, 다양한 혈관신생인자 및 항-혈관신생인자에 의해 엄격하게 조절된다. 특히, 핵심 혈관신생인자인 VEGF-A (Vascular endothelial growth factor-A)와 VEGF 수용체-2 (VEGFR-2) 신호전달경로는 혈관내피세포의 증식, 이동 및 생존을 촉진하며, 이에 혈관신생반응에 대한 치료 표적으로 널리 알려져 있다 (Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3: 24-40). 그러나, 임상적 적용에 있어서 대부분의 항-혈관신생 약물은 질병의 재발 및 진행과 관련된 약물 저항성을 야기할 수 있다. 따라서, 혈관신생 반응의 작용 기전 및 표적을 더욱 이해하는 것이 혈관신생 관련 질환의 치료를 위한 치료 전략을 개발하는데 반드시 필요하다.
조직 미세환경에서 MMP (matrix metalloproteinase)에 의한 선택적 단백질 분해 (selective proteolytic degradation)는 세포 부착, 이동, EMT (epithelial to mesenchymal transition), 종양 혈관신생, 및 성장인자 방출 등의 변화에 영향을 주는데, 이는 정상 조직의 재구성뿐만 아니라 암과 같은 혈관신생 관련 질환과도 밀접하게 관련이 있다. 상기 MMP의 활성은 이들의 내인성 억제자 (endogenous inhibitor)인 TIMP (tissue inhibitors of metalloproteinase)에 의해 조절된다. 또한, TIMP는 MMP 억제 활성과 더불어, MMP와는 독립적인 기전으로 세포 성장, 이동 및 분화를 조절하는 것으로 알려져 있다 (Cell, 2003, 114: 171-180). 그러므로 조직 미세환경에서 MMP 및 TIMP의 발현 및 활성을 조절하는 작용 기전을 규명하는 것은 암, 염증 및 노화에 따른 시력 감퇴와 같은 다양한 혈관신생 관련 질환에 대한 주요 치료 전략이 되어왔다.
한편, 섬바디 (Dystaenia takeshimana), 페로니아 리모니아 (Feronia limonia), 페룰라 루테아 (Ferula lutea) 등 다양한 식물로부터 분리된 퓨라노쿠마린 (furanocoumarin) 화합물인 마메신 (marmesin)은 항염증, 항간독성 및 항암 활성을 가지는 것으로 보고된 화합물로서 (Arch. Pharm. Res., 2006, 29: 617-623), 염증과 암에서 마메신의 역할을 규명하기 위한 연구가 있었으나, 마메신의 혈관신생과 관련된 효과 및 작용기전은 현재까지 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 혈관신생을 억제하는 화합물을 발굴하기 위해 예의 노력한 결과, 마메신이 VEGF-A로 유도된 혈관내피세포의 반응 및 혈관신생을 억제하는 우수한 효과가 있음을 최초로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는 맥관형성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "마메신 (marmesin)"은 프소랄렌 (psoralen)의 전구체 화합물로서, 노다케네틴 (nodakenetin) 또는 (2S)-2-(2-하이드록시프로판-2-일)-2,3-디하이드로퓨로[3,2-g]크로멘-7-온 ((2S)-2-(2-hydroxypropan-2-yl)-2,3-dihydrofuro[3,2-g]chromen-7-one) 등으로 명명되며, 하기 화학식 1의 구조를 가진다.
[화학식 1]
Figure 112015127708140-pat00001
마메신은 항염증, 항간독성, 항암 활성을 가지는 것으로 알려져 있으나, 혈관신생 관련 질환 치료에 유용하다거나 혈관신생 억제 효과가 있음은 현재까지 보고된 바 없다. 이에 본 발명자들은 마메신이 혈관신생을 억제하는 효능이 있음을 최초로 확인하고 본 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명에서 상기 마메신은 닥나무 (Broussonetia kazinoki), 섬바디 (Dystaenia takeshimana), 페로니아 리모니아 (Feronia limonia) 또는 페룰라 루테아 (Ferula lutea)로부터 분리된 것일 수 있으나 특별히 그 유래에 제한되는 것은 아니며, 상기 화학식 1의 구조를 가지는 화합물이라면 본 발명의 범위에 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, "혈관신생 (angiogenesis)"은 혈관이 새로 형성되는 과정, 즉, 새로운 혈관이 세포, 조직 또는 기관 내로 발생되는 것을 지칭하는 것이며, "신생혈관"은 혈관신생 과정을 통해 새로 생성된 혈관을 의미한다. 본 발명에서 "혈관신생"과 "신생혈관"은 상호 호환적으로 기재할 수 있다.
맥관형성 (vasculogenesis)은 이미 존재하는 모세관들 또는 후 모세관 세정맥으로부터 신생 혈관들이 형성되는 것을 말하며 내피 세포 전구 물질들인 혈관아세포로부터 발생하는 신생 혈관들의 형성으로 초래된다. 본 발명에서 "맥관형성"이라는 용어는 맥관형성 뿐만 아니라 현존하는 혈관, 모세관 및 세정맥의 분지화 및 발아 (sprouting)로 발생하는 것들에서 혈관의 신행 형성을 포함한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 마메신이 혈관 내피세포의 증식, 이동, 및 침투를 억제하고 (도 1b 내지 도 3b), MMP-2의 발현을 감소시켜 (도 3c 내지 도 3e), 혈관신생을 억제하는 효과를 가짐을 확인함으로써 (도 4a 및 4b), 본 발명의 마메신을 포함하는 조성물이 혈관신생 억제 및 맥관형성 억제 효능을 가짐을 확인하였다.
본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 상기 마메신에 의한 혈관신생 억제 효과는 VEGF-A 관련 신호전달 경로를 억제하여 발생하는 것임을 확인하였다 (도 5a 내지 5d).
이에 본 발명의 분리된 마메신을 포함하는 조성물은 혈관신생 억제 및 맥관형성 억제에 우수한 효과가 있으므로, 혈관신생 억제 및 맥관형성 억제 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 "혈관신생 관련 질환"은 상기한 바와 같은 신생혈관 형성이 비정상적으로 진행되어 야기되는 질환을 의미한다.
본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 혈관신생 관련 질환은 이에 제한되지는 않으나 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 또는 신경퇴행성 질환 등이 포함될 수 있다. 상기 혈관신생 또는 맥관형성을 억제함으로써 상기 혈관신생 관련 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 혈관신생 관련 질환의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 내혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분으로서 마메신 이외에 공지된 혈관신생 저해제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 혈관신생 저해제의 예시에는 안지오스타틴 (angiostatin)(플라스미노겐 절편); 항-안지오제닉 항트롬빈 III; 안지오자임 (angiozyme); ABT-627; Bay 12-9566; 베네핀 (benefin); 베바시주마브 (bevacizumab); BMS-275291; 연골 유래 억제제 (cartilage-derived inhibitor, CDI); CAI; CD59 보체 절편; CEP-7055; Col 3; 콤브레타스타틴 (combretastatin) A-4; 엔도스타틴 (endostatin)(콜라겐 X VIII 절편); 피브로넥틴 절편; 그로-베타 (Gro-beta); 할로퓨리논 (halofuginone); 헤파리나제; 헤파린 헥사사카라이드 절편; HMV833; 인간 융모막 고나도트로핀 (hCG); IM-862; 인터페론 알파/베타/감마; 인터페론 유도 단백질 (IP-10); 인터루킨-12; 크링글 (Kringle) 5 (플라즈미노겐 절편); 마리마스타트 (marimastat); 덱사메타손; 금속단백분해효소 (metalloproteinase) 억제제 (TIMP); 2-메톡시에스트라디올 MMI 270 (CGS 27023A); MoAb IMC-1C11; 네오바스타트 (neovastat); NM-3; 판젬 (Panzem); PI-88; 태반 리보뉴클레아제 억제제 플라즈미노겐 활성화제 억제제 혈소판 인자-4 (PF4); 프리노마스타트 (prinomastat); 프로락틴 16 kD 절편 프로리페린 (proliferin)-관련 단백질 (PRP); PTK 787/ZK 222594; 레티노이드 소리마스타트 스쿠알라민 SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; 테트라하이드로코티솔-S; 테트라티오몰리브데이트 (tetrathiomolybdate); 탈리도마이드 트롬보스폰딘 (Thrombospondin)-1 (TSP-1); TNP-470; 형질전환 (transforming) 성장인자-베타 (TGF-b); 바스큘로스타틴 (vasculostatin); 바소스타틴 (칼레티큘린 (calreticulin) 절편); ZD6126; ZD6474; 파네실 (farnesyl) 트랜스페라제 억제제 (FTI); 및 비스포스포네이트 (예를 들어, 알렌드로네이트, 에티드로네이트 (etidronate), 파미드로네이트, 리세드로네이트, 이반드로네이트, 졸레드로네이트 (zoledronate), 올파드로네이트 (olpadronate), 이칸드로네이트 또는 네리드로네이트 (neridronate)) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 마메신 및 혈관신생 관련 질환의 예방에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는 조성물은 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 개선에 효과적인 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 마메신은 세포 독성실험에서 그의 안정성, 독성 및 부작용에 문제가 없는 것으로 확인되었으므로 (도 1c), 질환의 예방 및 개선목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 물질이다.
본 발명의 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는 조성물은 혈관신생 관련 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 g을 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제, 예컨대 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예에는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예컨대, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 분리된 마메신을 유효성분으로 함유하는 맥관형성 억제용 조성물을 제공한다.
상기 마메신, 혈관신생 및 맥관형성에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같으며 상기 분리된 마메신을 포함하는 조성물은 다양한 형태로 제조되어 혈관신생 및 맥관형성 억제를 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에서는 마메신이 VEGF-A로 유도된 혈관내피세포의 증식, 이동, 침투, 혈관형성 및 혈관형성 발아를 억제하는 약리활성을 가지는 것을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 마메신을 유효성분으로 포함하는 조성물은 혈관형성 억제용도로 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.
도 1a는 마메신의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 1b는 마메신 처리에 따른 세포 증식을 확인한 것이다. 통계적 유의성은 VEGF-A 처리 세포를 기준으로 하였다. *p < 0.05, **p < 0.01.
도 1c는 마메신 처리에 따른 세포 생존율을 전체 세포 수에서 살아있는 세포 수의 비율로 나타낸 것이다.
도 2a는 마메신 처리에 따른 세포 주기 변화를 나타낸 것이다.
도 2b는 마메신 처리에 따른 세포 주기 관련 단백질의 수준을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 3a는 마메신 처리에 따른 세포 이동을 나타낸 것이다. 통계적 유의성은 VEGF-A 처리 세포를 기준으로 하였다. *p < 0.05, **p < 0.01.
도 3b는 마메신 처리에 따른 세포 침투를 나타낸 것이다. 통계적 유의성은 VEGF-A 처리 세포를 기준으로 하였다. *p < 0.05, **p < 0.01.
도 3c는 마메신 처리에 따른 MMP-2의 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 것이다.
도 3d는 마메신 처리에 따른 MMP-2의 발현 수준을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 3e는 마메신 처리에 따른 세포 배양액 내 MMP-2 수준을 젤라틴 자이모그람 분석으로 확인한 것이다.
도 4a는 마메신 처리에 따른 혈관 형성 (tube formation)을 확인한 것이다. 통계적 유의성은 VEGF-A 처리 세포를 기준으로 하였다. *p < 0.05, **p < 0.01.
도 4b는 마메신 처리에 따른 혈관형성 발아 (angiogenic sprouting)를 확인한 것이다. 통계적 유의성은 VEGF-A 처리 세포를 기준으로 하였다. *p < 0.05, **p < 0.01.
도 5a, 5b 및 5d는 마메신 처리에 따른 VEGF-A 신호전달경로 및 세포 표면 신호전달 분자의 발현 수준을 웨스턴블랏으로 확인한 것이다.
도 5c는 마메신 처리에 따른 VEGFR-2의 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 세포 배양 조건
HUVEC (human umbilical vein endothelial cell)은 Lonza (Walkersville, MD, USA)에서 구입하였고 4 내지 6 계대에서 실험에 사용하였다. 세포는 제조사의 지침에 따라 EGM-2® BulletKit 배지에서 배양하였다.
실시예 2: 시약
마메신은 닥나무 에탄올 추출물의 에틸 아세테이트 분획물에서 분리하였다. 마메신의 구조는 도 1a에서 보이는 바와 같다. 시약 및 항체의 구입처는 다음과 같다: VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A, Merck Millipore, Billerica, MA, USA); 항-p-Src (Y416), 항-Src, 항-p-MEK (S217/S221), 항-MEK, 항-p-ERK (T202/Y204), 항-p-Akt (S473), 항-p-p70S6K (T421/S424), 항-p-pRb (S780), 항-p-pRb (S807/S811), 항-pRb, 항-MMP-2, 및 항-HER2/ErbB2 (Cell Signaling, Beverly, MA, USA); 항-p-FAK (Y397) 및 항-FAK (BD Biosciences, Bedford, MA, USA); 항-인테그린 β1, 항-ILK, 항-VEGFR-2, 항-ERK, 항-Akt, 항-p70S6K, 항-Cdk4, 항-Cdk2, 항-사이클린 D, 항-사이클린 E, 항-액틴 항체, 및 마우스 및 토끼 IgG-HRP 결합체 (horseradish peroxidase conjugates)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).
실시예 3: RNA 분리 및 RT- PCR (reverse transcriptase -polymerase chain reaction)
PureHelixTM RNA 추출 용액 (Nanohelix Co., Daejeon, Korea)으로 전체 RNA를 분리하였다. 아가로스 겔 전기영동 및 EtBr (ethidium bromide) 염색을 통해 RNA의 상태를 확인하였다. 1 ㎍의 RNA를 주형으로 하여 HelixCriptTM 1st Strand cDNA 합성 키트 (Nanohelix Co.)로 RT-PCR을 수행하였다. 프라이머는 바이오니어 (Daejeon, Korea)를 통해 합성하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다: MMP-2, 정방향 5′-GCTCAGATCCGTGGTGAGAT-3′ (서열번호 1) 및 역방향 5′-GGTGCTGGCTGAGTAGATCC-3′ (서열번호 2); VEGFR-2, 정방향 5′-TGCCTACCTCACCTGTTTCCT-3′ (서열번호 3) 및 역방향 5′-TACACGGTGGTGTCTGTGTCA-3′ (서열번호 4); GAPDH (glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase), 정방향 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′ (서열번호 5) 및 역방향 5′- GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′ (서열번호 6). NIH (National Institutes of Health) ImageJ version 1.34s 소프트웨어를 이용하여 밴드를 정량적으로 분석하였다.
실시예 4: 세포 생존성 및 증식 분석
HUVEC를 1 x 105 개 세포/웰 농도로 6-웰 플레이트 (BD Biosciences, Bedford, MA, USA)에 접종하고, EBM-2 (endothelial cell basal medium-2, Lonza)에 혈청이 없는 조건으로 14 시간 배양하여 세포 주기를 G1/G0기로 맞추었다. 그 다음 마메신 (0.1 내지 10 μM)을 30 분 동안 처리한 뒤 VEGF-A 10 ng/ml를 24 시간 동안 처리하였다. 세포 수 및 생존성 분석 키트 (Merck Millipore)를 이용하여 MuseTM 세포 분석기로 세포 생존성을 확인하였고, 세포 증식을 정량화하였다. 세 번의 확인 결과 (평균 ± 표준편차)를 총 세포 수에서 살아있는 세포의 백분율 또는 미처리 대조군 대비 증가비로 나타내었다.
실시예 5: 세포 주기 분석
HUVEC을 100 mm 배양 접시에 접종하고, 혈청이 없는 배지에서 14 시간 배양하여 세포 주기를 G1/G0기로 맞추었다. 그 다음 마메신 10 μM로 30 분간 처리한 뒤 VEGF-A 10 ng/ml로 24 시간 처리하였다. 그 다음 세포를 트립신-EDTA로 회수하고, PBS (phosphate-buffered saline, pH 7.4)로 세척한 다음, 차가운 70 % 에탄올로 최소 3 시간 동안 세포를 고정시켰다. 그 다음 세포를 PBS로 세척한 뒤, MuseTM 세포 주기 시약으로 세포를 염색하였다. 그 다음 MuseTM 세포 분석기로 G1/G0, S 및 G2/M기의 세포 주기를 분석하였다.
실시예 6: 웨스턴블랏 분석
HUVEC를 1 x 106 개 세포/접시 밀도로 100 mm 배양 접시 (BD biosciences)에 접종하고, 14 시간 동안 혈청 없이 배양한 뒤, 각기 처리 시간을 달리하여 시료를 처리하였다. 그 다음 세포를 차가운 PBS로 2 회 세척하고, 4 ℃에서 30 분 동안 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 1 % 트리톤 X-100, 1 mM EDTA, 100 ㎍/ml 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플로라이드 (4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride), 10 ㎍/ml 아프로티닌 (aprotinin), 1 ㎍/ml 펩스타틴 A (pepstatin A), 0.5 ㎍/ml 류펩틴 (leupeptin), 80 mM β-글리세로포스페이트 (β-glycerophosphate), 25 mM 소듐 플로라이드 (sodium fluoride) 및 1mM 소듐 오쏘바나데이트 (sodium orthovanadate)를 함유하는 용해 완충액에서 인큐베이션하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 4 ℃, 12,500 × g에서 20 분 동안 원심분리하고 상등액을 수거하여 웨스턴블랏 분석을 수행하였다. 모든 실험은 최소 세 번의 독립적인 실험을 통해 확인하였다. NIH (National Institutes of Health) ImageJ version 1.34 소프트웨어를 이용하여 밴드를 정량적으로 분석하였다.
실시예 7: 상처 치유 분석
세포 이동은 시험관 내 (in vitro) 상처치유 분석으로 정량화하였다. 세포를 48-웰 플레이트에 4 x 104 개 세포/웰 농도로 접종하고 가득 찰 때까지 배양한 뒤, 멸균 플라스틱 파이펫 팁으로 플레이트 가운데 부착된 세포를 제거하여 상처를 만들었다. 세포를 EBM-2에서 혈청 없이 2 시간 동안 배양한 다음, 마메신 (0.1 내지 10 μM)으로 30 분간 처리한 후, VEGF-A 10 ng/ml를 16 시간 동안 처리하였다. 세포를 메탄올로 고정하고 0.04 % 김자 용액 (Giemsa solution, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)으로 염색하였다. 각 시점에 상처로 이동하는 세포를 사진으로 찍어 관찰하였다.
실시예 8: 세포 침투 (invasion) 분석
트랜스웰 인서트 (transwell insert, Costar, 6.5 mm 직경 인서트, 8 ㎛ 구멍 크기)의 상층부를 EBM-2에 희석한 1 mg/ml Matrigel® 기저막 매트릭스 (basement membrane matrix, 10.4 mg/ml, BD Biosciences) 50 ㎕로 코팅하였다. EBM-2에 5 x 104 개 세포/ml 농도로 현탁시킨 HUVEC 분주액 100 ㎕를 마트리겔 (matrigel)로 코팅한 트랜스웰 상층부에 첨가하고, 하층부에 600 ㎕의 EBM-2를 첨가하였다. 세포를 혈청 없이 EBM-2에서 2 시간 동안 배양한 뒤, 마메신 (1 내지 10 μM)으로 30 분간 처리한 후, VEGF-A 10 ng/ml를 18 시간 동안 처리하였다. 상기 인서트를 메탄올로 고정하고 면봉을 이용하여 막 위의 비침투성 세포를 제거하였다. 침투성 세포를 0.04 % 김자 용액으로 염색하고 현미경으로 200 배율로 관찰하여 6 군데에서 세포 수를 확인하였다.
실시예 9: 자이모그램 ( Zymogram ) 분석
MMP 활성을 자이모그래피 (zymography)로 측정하였다. 마메신 10 μM 및 VEGF-A 10 ng/ml를 16 시간 동안 처리한 HUVEC로부터 세포 배양액을 얻어 표본 완충액으로 희석시키고, 기질로서 1 mg/ml 젤라틴 (gelatin, Sigma-Aldrich)을 함유하는 8 % 폴리아크릴아마이드 겔 (polyacrylamide gel)을 이용하여 전기영동하였다. 그 다음 상기 겔에서 SDS를 제거하기 위해 2.5 % 트리톤 X-100으로 1 시간 인큐베이션한 뒤 MMP를 재-중화 (re-naturalization)시키고, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM CaCl2, 및 150 mM NaCl을 함유하는 현상 완충액으로 37 ℃에서 16 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 그 다음 상기 겔을 0.5 % 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue) R-250을 함유하는 30 % 메탄올-10 % 아세트산으로 3 시간 동안 염색한 뒤, 30 % 메탄올-10 % 아세트산 용액으로 탈염색하였다. 젤라틴 분해 활성을 쿠마시 블루로 염색된 젤라틴 배경에 비해 비염색된 밴드를 통해 확인하였다. NIH (National Institutes of Health) ImageJ version 1.34s 소프트웨어를 이용하여 밴드를 정량화하였다.
실시예 10: 혈관 형성 분석
EBM-2로 혈청 없이 2 시간 배양한 세포를 4 x 104 개 세포/ml 농도로 Matrigel®을 코팅한 플레이트에 접종하고 마메신 (0.1 내지 10 μM)으로 30 분 처리한 다음, VEGF-A 10 ng/ml로 6 시간 동안 처리하였다. 그 다음 Olympus CKX41 도립현미경 (CAchN 10/0.25php objective)으로 ToupTek Toupview 소프트웨어 (version x86, 3.5.563, Hangzhou ToupTek Photonics Co., Zhejiang, P. R. China)를 이용하여 혈관 형성을 관찰하였다.
실시예 11: 래트 대동맥 고리 (aortic ring) 분석
8 내지 9 주령된 수컷 Sprague-Dawley 래트에서 흉대동맥 (thoracic aorta)을 절개하였다. 지방, 조직 및 분지 혈관 (branching vessel)을 제거하고, 대동맥을 1 mm 길이로 잘라 마트리겔로 코팅한 플레이트에 둔 다음, 추가 마트리겔 층으로 대동맥 절편을 덮었다. 그 다음 상기 대동맥 고리에 마메신 10 μM을 30 분간 처리한 뒤 VEGF-A 500 ng/ml를 3 일 동안 처리한 다음, 마메신 및 VEGF-A를 이틀 간격으로 새롭게 처리하며 계속 배양하였다. 배양 7 일째에 40 배율로 사진을 찍었다. 혈관형성 발아 (angiogenic sprouting)가 일어나는 부위를 Adobe PhotoShop 소프트웨어를 이용하여 정량화하였다.
실험예 1: 마메신의 혈관내피세포 증식 억제 효과 확인
본 발명자들은 마메신이 혈관신생 억제 효과를 가지는지 확인하기 위해 먼저, 마메신이 HUVEC의 세포 증식을 조절하는지 확인하고자 하였다. 그 결과, 마메신은 VEGF-A로 촉진되는 세포 증식을 농도 의존적으로 억제하였고 (도 1b), 세포 생존율에는 영향을 미치지 않았다 (도 1c). 이는, 마메신이 세포 증식을 억제하는 것이 세포사멸이나 세포독성에 의한 것은 아님을 의미한다.
다음으로, DNA 함량 분석을 통해 세포 주기에 대한 마메신의 효과를 확인하였다 (도 2a). 24 시간 동안 VEGF-A를 처리하였을 때, 미처리 대조군과 비교하여 S 기의 세포 (7.1 % vs. 10.1 %)와 G2/M 기의 세포 (12.8 % vs. 22.4 %) 비율은 증가하였고, 이와 함께 G1 기의 세포 (80.1 % vs. 67.5 %) 비율은 감소하였다. 반면에, 마메신 처리는 VEGF-A 처리에 따른 S 기 (10.1 % vs. 7.5 %) 및 G2/M 기 (22.4 % vs. 16.7 %)의 증가와 G1 기 (67.5 % vs. 75.8 %)의 감소를 막아, 각 세포 주기가 대조군과 유사한 수준으로 나타났다. 상기 결과는 마메신이 G1/S 기 전환을 억제하여 G1 정지 (arrest)를 야기한다는 것으로, 이는 마메신이 VEGF-A 처리에 따른 세포 증식을 억제하는 것과 상당한 상관관계가 있다 (도 1b).
상기 결과를 기반으로, 다음으로 마메신을 처리한 HUVEC에서 세포 주기 관련 단백질의 변화를 분석하였다. 도 2b에서 보이는 바와 같이, VEGF-A를 처리한 HUVEC에서 마메신 처리로 인해 Cdk 및 사이클린 D 발현이 현저히 감소하였으며, 그 결과 pRb가 저인산화 (hypophosphorylation)되었다. 상기 결과는 마메신이 세포 주기 관련 단백질을 하향조절하여 혈관내피세포 주기 진행 및 증식을 억제한다는 것을 의미한다.
실험예 2: 마메신의 시험관 내 (in vitro) VEGF -A에 의한 혈관내피세포 이동, 침투 및 혈관 형성, 및 생체 외 (ex vivo ) 혈관형성 발아 ( angiogenic sprouting) 억제 효과 확인
다음으로 혈관신생 반응에서 중요한 역할을 하는 혈관내피세포의 이동, 침투 및 혈관 형성에 대한 마메신의 효과를 확인하고자 하였다. 도 3a 및 b에서 보이는 바와 같이, 마메신 처리는 농도 의존적으로 VEGF-A에 의한 세포 이동 및 침투를 억제하였다.
한편, MMP의 발현 및 활성은 선택적으로 ECM (extracellular matrix) 및 세포 표면을 분해하므로 이를 확인하여 세포 이동 및 침투가 유발되었는지 확인할 수 있다. 따라서, 상기 세포 이동 및 침투에 대한 마메신의 조절 효과를 기반으로, VEGF-A를 처리한 HUVEC에서 MMP-2 발현 및 활성의 변화를 분석하였다. MMP-9은 HUVEC 배양 배지에서 검출되지 않았다.
분석 결과, 마메신 처리는 VEGF-A에 의한 MMP-2의 발현 및 활성을 현저하게 억제하였다 (도 3c, d 및 e). 대조적으로, 내인성 MMP 억제자인 TIMP-2 수준은 VEGF-A 또는 마메신 처리에 의해 변하지 않았다. 상기 결과는 마메신 처리에 의한 MMP-2 발현 및 단백질 분해 활성의 하향조절이 VEGF-A에 의한 HUVEC의 이동 및 침투 능력을 감소시킨다는 것을 시사한다. 나아가, 마메신은 VEGF-A에 의한 모세혈관 유사 구조 형성 및 미세혈관 발달을 미처리 대조군과 유사한 수준으로 억제하였다 (도 4a 및 b).
종합하면, 상기 결과로부터 VEGF-A로 유도된 혈관내피세포 증식, 이동, 침투, 혈관형성 및 혈관형성 발아를 억제하는 마메신의 약리활성을 확인하였으며, 이를 통해 마메신이 혈관형성 억제용 조성물로 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 3: 마메신에 의한 혈관신생 억제 작용 기전 확인
혈관신생 반응을 조절하는 마메신의 작용 기전을 조사하기 위해, 세포 성장 및 분화에서 핵심적인 역할을 하는 FAK (focal adhesion kinase), Src 키나아제 (kinase), MEK (mitogen-activated protein kinase kinase), ERK (extracellular signal-regulated kinase), Akt 및 p70S6K와 같은 VEGF-A 관련 신호전달경로의 활성 변화를 확인하였다.
기대했던 바와 같이, 미처리 대조군에 비해 VEGF-A를 처리한 경우 FAK, Src, MEK, ERK, Akt 및 p70S6K의 인산화/활성이 현저히 증가하였다. 이와는 대조적으로, VEGF-A를 처리한 HUVEC에서 마메신을 처리한 경우 p70S6K를 제외하고 FAK, Src, MEK, ERK 및 Akt의 인산화가 현저히 억제되었다 (도 5a 및 b). 나아가, 마메신 처리는 VEGF-A에 의해 유도되는 혈관신생 및 암 진행과 밀접하게 관련된, VEGFR-2 및 HER2/ErbB2 (human epidermal growth factor receptor 2)와 같은 RTK (receptor tyrosine kinase), 및 인테그린 β1 및 ILK (integrin-linked kinase)를 포함하는 세포 상호작용 관련 분자의 발현을 현저하게 감소시켰다 (도 5c 및 d). 이에, 본 발명에서 마메신의 혈관신생 억제 효과는 VEGF-A 관련 신호전달경로를 억제하는 것에 의한 것임을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Composition for inhibiting angiogenesis comprising marmesin <130> KPA151233-KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 primer-F <400> 1 gctcagatcc gtggtgagat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-2 primer-R <400> 2 ggtgctggct gagtagatcc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR-2 primer-F <400> 3 tgcctacctc acctgtttcc t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFR-2 primer-R <400> 4 tacacggtgg tgtctgtgtc a 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer-F <400> 5 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer-R <400> 6 gaagatggtg atgggatttc 20

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