KR101503586B1

KR101503586B1 - 선복화 추출물 또는 이로부터 분리된 브리타닌을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101503586B1
Application number: KR1020130026226A
Authority: KR
Inventors: 김재룡; 손종근; 양효현; 박동근
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2015-03-20
Also published as: KR20140112636A

Abstract

본 발명은 선복화 추출물, 이로부터 분리된 브리타닌(britanin) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 섬유아세포 노화 억제용 약학 조성물에 관한 것으로, 아드리아마이신에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 섬유아세포의 노화 억제용 약학 조성물을 제공한다. 이렇게 사람 섬유아세포의 세포노화 과정을 억제함으로써 노화관련 질환, 예를들어 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화, 전립샘 증식증 및 간암 등과 같은 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 세포노화를 저해할 수 있는 항노화 기능성 식품, 항혈관노화 약물 개발, 화장품 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

선복화 추출물 또는 이로부터 분리된 브리타닌을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물{Composition for inhibiting cellular senescence comprising extracts of Inula japonica Thunberg or britanin isolated from the same}

본 발명은 선복화 추출물, 이로부터 분리된 브리타닌(britanin) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 섬유아세포 노화 억제용 조성물에 관한 것이다.

정상 체세포는 일정 횟수 분열하면 더 이상 분열할 수 없게 되면서 세포노화 상태가 된다. 이는 염색체 말단의 텔로미어가 세포분열 과정에서 점점 짧아지면서 DNA 손상이 생기기 때문에 일어나는데, 이를 복제노화라고 한다. 텔로미어의 단축뿐만 아니라, 암유전자 및 암 억제 유전자의 기능 이상, 염증반응, 산화스트레스, 항암제, 자외선 및 방사선 등에 의해서도 세포노화가 유도된다. 노화 세포는 크기가 크고 모양이 더 편평해지며, 세포성장이 멈추고, 핵에 DNA 손상 흔적이 많으며, 다양한 염증성 단백질을 분비한다. 그리고 생화학적으로 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 다양한 인자들에 의해 노화가 유도되지만 p53과 Rb/p16 암억제 유전자 신호전달 경로를 통하여 노화가 조절되는 것으로 밝혀져 있다.

세포노화 현상은 암을 억제하거나 촉진하기도 하며, 조직 재생과 복구, 조직/개체 노화와 노화관련 질환의 중요한 기전으로 제시되고 있다. 아울러 세포노화는 암, 동맥경화, 피부노화, 퇴행성 신경질환, 근감소증, 골다골증, 전립성비대증 등과 같은 다양한 노화관련 질환의 병인에 기여한다. 최근의 연구결과들은 세포노화를 선택적으로 조절하면 조직, 장기의 노화, 건강 수명, 노화관련 질환의 발생을 조절할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 텔로머라제 결핍 생쥐는 노화가 빨리 오는 것으로 알려져 있는데, 늙은 텔로미어 결핍 생쥐에서 텔로머라제 발현을 증가시키면 노화에 따른 조직 또는 장기의 퇴행성 변화를 역전시킴을 확인되었다. 노화가 빨리 오는 생쥐 모델에서 노화세포에서 발현이 증가하는 것으로 알려진 p16을 발현하는 세포를 선택적으로 제거한 결과 노화로 인한 조직 병변이 억제되며, 노화관련 질환의 발생이 감소하는 것을 확인하였다. 생쥐에서 간 섬유화가 일어나는 과정에서 간 성상세포의 노화가 나타나는데, 간성상세포의 노화가 과다한 간 섬유화를 억제하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. p53 활성이 적절하게 조절되지 않은 상태에서 지나치게 높아지면 노화가 빨리 나타나지만, 적절한 p53의 활성은 오히려 노화를 억제하는 것으로 알려져 있다.

그리고 세포노화를 억제하는 효능이 있는 물질들에 대한 연구 결과도 보고되고 있다. 비타민 C, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), NS398 및 에피프리에데라놀(epifriedelanol)과 같은 약물 또는 단일 성분들이 이 세포노화를 억제한다. 그리고 라파마이신(rapamycin)이 생쥐모델에서, 4,4'-디아미노디페닐설폰(4,4'-diaminodiphenylsulfone)이 꼬마선충에서 노화관련 질환의 발생을 억제하며, 건강수명을 늘리는 것으로 보고되었다.

선복화는 국화과에 속하는 다년생인 금불초(Inula japonica Thunberg)의 꽃으로 세스키테르페노이드(sesquiterpenoids), 디테르페노이드(diterpenoids), 모노테르펜(monoterpenes), 플라보노이드(flavonoides) 등 성분이 함유된 것으로 알려져 있다. 선복화 추출물 및 분리된 물질은 당뇨, 천식 및 알레르기 등에 효능이 있는 것으로 보고되었으나, 섬유아세포 노화를 저해하는 효능에 대해서는 아직까지 보고되지 않았다.

본 발명의 목적은 선복화 추출물, 이로부터 분리된 브리타닌(britanin) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 섬유아세포 노화 억제용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람 섬유아세포에서 선복화 추출물 및 선복화로부터 분리 정제한 4종의 단일 성분을 대상으로 세포노화 억제 효능을 조사하였다. 이 중에서 선복화 물 추출물 및 부탄올 추출물, 단일성분으로 브리타닌(britanin)이 섬유아세포 노화 저해 효능이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 선복화 추출물, 이로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 브리타닌(britanin) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 섬유아세포 노화 억제용 약학 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 선복화 추출물은 선복화 에탄올 추출액에 증류수 및 헥산(n-hexane)을 첨가하여 분획화한 증류수 층에 에틸아세테이트(EtOAc)를 첨가하고, 이를 분획한 증류수 층에 부탄올을 첨가하고 분획화하여 추출된 증류수 분획 추출물 또는 부탄올 분획 추출물인 것을 특징으로 한다.

< 화학식 1 >

상세하게는, 상기 섬유아세포의 노화는 아드리아마이신에 의해 유도되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 섬유아세포의 노화 억제는 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 억제를 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 약학적 조성물인 경우, 상기 약학적 조성물은 상기 선복화 추출물, 이로부터 분리된 브리타닌(britanin) 또는 이들의 혼합물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 세포 노화의 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엘렉시르제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 경고제, 로션제, 연고제 등의 형태일 수 있다.

한편, 상기 약학적 조성물은 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화, 전립샘 증식증 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환을 치료할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 선복화 추출물, 이로부터 분리된 브리타닌(britanin) 화합물 또는 이들의 혼합물이 아드리아마이신에 의한 섬유아세포 노화를 억제하고, 아울러 세포 분열로 인한 복제노화를 저해함을 확인하였다. 이렇게 사람 섬유아세포의 세포노화 과정을 억제함으로써 노화관련 질환, 예를 들어 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화, 전립샘 증식증 및 간암 등과 같은 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 섬유아세포 노화를 저해할 수 있는 항노화 기능성 식품, 항혈관노화 약물 개발, 화장품 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 선복화 추출물의 분리 모식도를 나타낸다.
도 2는 선복화로부터 분리된 단일성분의 화학구조를 나타낸다.
도 3은 선복화 추출물의 세포독성 및 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 선복화 추출물의 세포독성 효과. 각 추출물을 100과 10 ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B, SA-β-gal활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, 각 추출물을 100 또는 10 ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻은 전형적인 사진들이며, 평균과 표준편차로 나타냈다. C, 대조군; D, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); N, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); R, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 4는 선복화 물 추출물과 부탄올 추출물의 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 선복화 물 추출물의 SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. B, 선복화 부탄올 추출물의 SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, 선복화 물 추출물을 10-100 ug/ml, 부탄올 추출물을 1-10 ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻은 전형적인 사진들이며, 평균과 표준편차로 나타냈다. C, 대조군; D, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); N, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); R, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 5는 선복화 물 추출물과 부탄올 추출물의 p53, p21, 인산화 S6K의 발현 조절을 나타낸다. 아드리아마이신 처리 후, 선복화 물 추출물을 10-100 ug/ml, 부탄올 추출물을 1-10 ug/ml로 처리하고, 웨스턴 블랏법으로 각 단백질의 발현 정도를 조사하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행 한 후 얻은 전형적인 사진들이다. NT, 아드리아마이신 제외; ADR, 아드리아마이신(adriamycin); C, 대조군; D, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); N, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); R, 라파마이신(rapamycin).
도 6은 사람 섬유아세포에서 선복화 물 추출물과 부탄올 추출물의 복제세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 선복화 물 추출물의 SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. B, 선복화 부탄올 추출물의 SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 복제노화 세포에 선복화 물 추출물을 10-100 ug/ml, 부탄올 추출물을 1-10 ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻은 전형적인 사진들이며, 평균과 표준편차로 나타냈다. O, 늙은 세포(Old cells); D, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); N, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); R, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 7은 사람 섬유아세포에서 선복화 단일성분의 세포독성 및 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 선복화 단일성분의 세포독성 효과. 각 추출물을 10ug/ml 또는 1 ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B, SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, 브리티닌(britanin) 단일성분을 0.1 ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻은 전형적인 사진들이며, 평균과 표준편차로 나타냈다. C, 대조군; D, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); N, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); R, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO. IJ-1, 토멘토신(tomentosin); IJ-2, 브리타닌(britanin); IJ-3, 1,5-디-O-카페오일퀴닉산(1,5-di-O-caffeoylquinic acid), IJ-4, 퀘르세타제틴 3,4'-디메틸 에테르(quercetagetin 3,4'-dimethyl ether).
도 8은 브리타닌(britanin; IJ-2)의 p53, p21, 인산화 S6K 단백질 발현 및 활성산소 조절을 나타낸다. A, p53, p21, 인산화 S6K(pS6K) 단백질 발현을 나타낸다. 아드리아마이신 처리 후, 브리타닌(britanin; IJ-2)을 0.1 ug/ml 처리하고, 세포 내 활성산소 정도를 유세포분석기로 조사하였다. NT, 아드리아마이신 제외; ADR, 아드리아마이신(adriamycin); C, 대조군; D, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); N, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); R, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 9는 복제노화가 유도된 세포에서 브리타닌(britanin; IJ-2)의 세포노화 저해 효과를 나타낸다. 브리타닌(britanin; IJ-2)을 0.1 ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하여, SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율을 나타낸다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻은 전형적인 사진들이며, 평균과 표준편차로 나타냈다. O, 늙은 세포(Old cells); D, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); N, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); R, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > 선복화 추출물 분리 및 단일성분의 화학구조

1. 선복화 추출물 및 단일성분 분리

건조한 선복화 꽃 (www.omniherb.com 구입) 10 kg을 70% 에탄올(ethanol)로 약 60℃에서 24 시간 냉각 환류하여 추출하였다. 추출물을 여과한 후 감압농축하고, 건조하여 에탄올 추출물(ethanol extract; 1.55kg)을 얻었다. 상기 에탄올 추출물에 증류수로 현탁 시킨 후, n-헥산(n-hexane)을 3번 가하여 용매 분획을 수행하여 n-헥산(n-hexane) 분획(159g)을 얻었다. 위 실험에서 남은 수용액을 상기와 같은 실험방법으로 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 와 n-부탄올(n-buthanol)을 각각 가하여 용매 분획하여 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 분획 (309 g)과 n-부탄올(n-buthanol) 분획 (361 g), 그리고 남은 증류수 분획 (510g) 을 얻었다. 수득한 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 분획을 정상 컬럼 크로마토그래피(normal phase column chromatography)법으로 분리를 수행하였다. 고정상 실리카겔(silica gel; No. 9385, 230-400 mesh, Merck)에 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 분획을 로딩(loading)한 후, 이동상을 n-헥산-에틸 아세테이트(n-hexane - ethyl acetate) (100% : 0 → 0 : 100 %), 에틸 아세테이트 - 메탄올(ethyl acetate - methanol) (100% : 0 → 0 : 100 %)로 용출시켜 27개의 분획 (In-1~27)을 얻었다. 상기 분획 중 In-10을 정상 컬럼(normal phase column)에서 이동상 n-헥산-에틸 아세테이트(n-hexane - ethyl acetate) (100% : 0 → 0 : 100 %)으로 용출시켜 IJ-1 (tomentosin)을 얻었다. In-13 분획을 100% 클로로포름(chloroform)으로 재결정하여 IJ-2 (britanin)을 얻었다. In-24 분획을 역상 컬럼(reversed phase column)에서 이동상 메탄올-물(methanol - water) (30% : 70% → 100% : 0)으로 용출시켜 얻은 분획을 HPLC로 역상 컬럼(reversed phase column; waters SunFire^TM C₁₈, 5 um, 4.6 × 250 mm)으로 IJ-3 (1,5-di-O-caffeoylquinic acid) 와 IJ-4 (quercetagetin 3,4'-dimethy ether)를 얻었다(도 1).

2. 분리된 물질의 물리화학적 특성

상기에 분리된 물질들의 구조(도 2)는 이미 보고된 문헌들에 기재된 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR data 와 비교하여 토멘토신(tomentosin), 브리타닌(britanin), 1,5-디-O-카페오일퀴닉산(1,5-di-O-caffeoylquinic acid) 과 퀘르세타제틴 3,4'-디메틸 에테르(quercetagetin 3,4'-dimethyl ether)로 결정하였다. 분광분석 자료는 다음과 같다.

토멘토신(Tomentosin; IJ-1) Colorless oil; C₁₅H₂₀O₃; ¹H-NMR (CDCl₃, 250 MHz) δ: 6.21 (1H, d, J = 3.1 Hz, H-13´), 5.49 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-13), 5.40 (1H, dd, J = 5.15, 8.90, H-5), 4.60 (1H, ddd, J = 3.07, 8.57, 11.65 Hz, H-8), 3.44 (1H, m, H-7), 2.12 (3H, s, H-15), 0.99 (3H, d, J = 8.67 Hz, H-14); ¹³C-NMR (CDCl₃, 62.9 MHz) δ: 208.2 (C-4), 170.2 (C-12), 144.37 (C-1), 138.8 (C-11), 122.1 (C-13), 120.0 (C-5), 79.2 (C-8), 42.5 (C-3), 42.0 (C-7), 36.5 (C-9), 35.3 (C-10), 30.3 (C-2), 29.6 (C-15), 26.4 (C-6), 20.9 (C-14).

브리타닌(Britanin; IJ-2) Colorless crystal; C₂₀H₃₀O₇; ¹H-NMR (CDCl₃, 250 MHz) δ: 6.14 (1H, d, J = 3.5 Hz, H-13a), 5.33 (1H, d, J = 3.15 Hz, H-13b), 5.01 (1H, d, J = 8.27 Hz, H-6), 4.86 (1H, dd, J = 4.35, 9.10 Hz, H-4), 4.51 (1H, m, H-8), 4.09 (1H, m, H-2), 3.00 (1H, m, H-7), 2.40 (1H, m, H-9a), 2.22 (3H, s, H-17), 2.05 (1H, m, H-3b), 2.01 (3H, s, H-16), 1.97 (2H, br, H-1, 10), 1.84 (1H, m, H-3a), 1.39 (1H, m, H-9b), 0.99 (3H, s, H-15), 0.95 (3H, d, J = 5.82 Hz, H-14); ¹³C-NMR (CDCl₃, 62.9 MHz) δ: 172.6 (6-C=O), 170.2 (2-C=O), 168.8 (C-12), 138.5 (C-11), 120.0 (C-13), 77.2 (C-6),76.0 (C-8), 75.2 (C-2), 72.9 (C-4), 52.3 (C-7), 51.0 (C-5), 51.0 (C-1), 43.9 (C-9), 36.2 (C-3), 30.1 (C-10), 21.2 (C-16), 21.2 (C-17), 20.4 (C-14), 15.8 (C-15).

1,5-디-O-카페오일퀴닉산(1,5-di-O-caffeoylquinic acid; IJ-3) Yellow powder; C₂₅H₂₄O₁₂; ¹H-NMR (CD₃OD, 250 MHz) δ: 7.55 (2H, d, J = 15.82 Hz, H-7´, 7´´), 7.05 (2H, s, H-2´, 2´´), 6.94 (2H, d, J = 8.12 Hz, H-6´, 6´´), 6.76 (2H, d, J = 8.07 Hz, H-5´, 5´´), 6.27 (2H, bb, J = 8.0, 15.75 Hz, H-8´, 8´´), 5.38 (1H, br, H-5), 4.28 (1H, br, H-3), 3.76 (1H, d, J = 7.47 Hz, H-4), 2.53 (1H, br, H-6e), 2.43 (2H, br, H-2ax, 2eq), 2.07 (1H, br, H-6ax); ¹³C-NMR (CD₃OD, 62.9 MHz) δ: 175.3 (C-7), 168.6 (C-9´), 168.0 (C-9´´), 149.6 (C-4´), 149.5 (C-4´´), 147.5 (C-7´), 147.3 (C-7´´), 146.7 (C-3´, 3´´), 127.7 (C-1´, 1´´), 123.1 (C-6´), 123.3 (C-6´´), 116.4 (C-5´, 5´´), 115.2 (C-2´, 2´´), 115.1 (C-8´, 8´´), 80.9 (C-1), 72.7 (C-4), 71.5 (C-5), 69.3 (C-3), 36.8 (C-6), 35.6 (C-2).

퀘르세타제틴 3,4'-디메틸 에테르(quercetagetin 3,4'-dimethyl ether; IJ-4) Brown powder; C₁₇H₁₄O₈; ¹H-NMR (CD₃OD, 250 MHz) δ: 7.63 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2´), 7.52 (1H, dd, J = 8.4, 2.1 Hz, H-6´), 6.88 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5´), 6.73 (1H, s, H-8), 3.95 (3H, s, H-4´-OMe), 3.78 (3H, s, H-3-OMe); ¹³C-NMR (CD₃OD, 62.9 MHz) δ: 180.2 (C-4), 158.3 (C-5), 155.8 (C-4´), 151.0 (C-9), 149.9 (C-2), 146.7 (C-7), 146.5 (C-3´), 139.4 (C-3), 131.0 (C-6), 122.9 (C-1´), 122.2 (C-6´), 116.5 (C-2´), 116.3 (C-5´), 107.1 (C-10), 91.5 (C-8), 60.5 (4´-OMe), 56.9 (3-OMe).

< 실시예 2 > 선복화 추출물 및 단일 성분의 세포 독성 및 세포 노화 저해 효능 조사

1. 실험 재료

사람 섬유아세포는 Lonza (Walkersville, MD, 미국)에서 구입하였다. 둘베코스-변형 이글스 배지(Dubeccos-Modified Eagle's medium; DMEM), 우태아혈청, 항생제 용액 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)은 WelGene (Daegu, Korea)에서 구입하였다. p53에 대한 항체는 SantaCruz Biotech, Inc. (SantaCruz, CA, 미국)에서 구입하였으며, p21과 pS6에 대한 항체는 Cell Signaling Technology Inc.(Beverly, MA, 미국)에서 구입하였다. GAPDH 항체는 한국생명공학연구원 권기선 박사로부터 분양받았다. 아드리아마이신은 일동제약주식회사 제품을 사용하였다.

2. 세포 배양

사람 섬유아세포는 10% 우태아혈청과 1% 항생제 (페니실린 10,000 unit/ml, 스트렙토마이신 10,000 mg/ml)가 포함된 DMEM 배양액을 이용하여 직경 100 mm 배양접시에 세포를 1×10⁵개로 분주한 후, 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양접시의 바닥에 80-90% 정도 세포가 자라면, 트립신-EDTA 용액 (2.5%) 을 처리하여 세포를 분리한 후, 계대 배양하였다. 세포를 계대할 때마다 세포수를 측정하여 세포가 몇 회 분열하였는지 조사하였다. 세포의 분열 횟수 (population doubling, PD)는 다음 식으로 조사하였다. PD= log₂F/log₂I (F=마지막 세포수, I=처음 세포수). 실험에 사용한 세포들은 분열횟수가 PD<30 또는 PD>70회의 것을 사용하였다.

3. 아드리아마이신 처리에 의한 세포노화 유도

직경 100mm 배양접시에 사람 섬유아세포를 1.5x10⁵개 분주하였다. 3일간 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포 배양액을 제거하였다. 세포를 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척한 후, 500 nM 아드리아마이신을 4시간 처리하였다. 세포를 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척한 후, 사람 섬유아세포는 10% 우태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 배양하였다. 4일 후, 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 염색으로 세포노화가 유도됨을 확인하였다.

4. 세포독성 조사

섬유아세포를 96 웰 배양기에 웰 당 500개씩 분주하였다. 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 각 웰에 DMEM배양액을 100ul씩 더 넣어 준 후, 선복화 추출물을 100 ug/ml, 단일성분을 10 ug/ml로 처리하였다. 음성 대조군으로 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를, 양성 대조군으로 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 5mM과 라파마이신(rapamycin) 500nM을 첨가하였다. 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포 독성이 있는지 MTT 법으로 조사하였다.

5. 3-(4, 5-디메틸티아졸-2일)-2, 5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(3-(4, 5-dimethylthiazol-2yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide; MTT) 측정 방법

96 웰(well) 배양용기의 각 웰(well)에 0.1% MTT 용액을 50 ul씩 넣고 3시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 반응시켰다. 배양액과 MTT 용액을 제거 한 후, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 100 ul를 첨가하여 형성된 결정을 녹였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

6. 아드리아마이신에 의한 세포노화에서 선복화 추출물 및 단일성분의 세포노화 저해 효능 조사

아드리아마이신에 의해 유도된 세포노화에 선복화 추출물과 단일성분들이 노화 저해 효능이 있는지 조사하였다. 아드리아마이신을 4시간 처리한 세포들을 트립신-EDTA로 배양접시에서 분리한 후, 10% 우태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM배양액에는 섬유아세포가 5,000개/ml이 되도록 한 후, 96 웰 배양용기의 각 웰에 100ul씩 분주하였다. 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 각 well에 DMEM 배양액을 100 ul씩 더 넣어 준 후, 선복화 추출물을 1-100 ug/ml, 단일성분을 0.1-10 ug/ml로 처리하였다. 음성 대조군으로 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를, 양성 대조군으로 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 5mM과 라파마이신(rapamycin) 500nM을 첨가하였다. 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포 노화 정도는 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 염색법으로 조사하였다.

7. 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 염색

세포노화에 대한 선복화 추출물과 단일성분의 효과는 SA-β-gal 활성 염색으로 조사하였다. 세포를 인산완충액으로 세척하고, 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 세포를 고정한 후, SA-β-gal 염색 용액 [40 mM 시트릭산(citric acid)/포스페이트(phosphate); pH 5.8, 5 mM 포타슘 페로시아나이드(potassium ferrocyanide), 5 mM 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, X-gal 1 mg/ml]을 넣어 주었다. 은박지로 싸서 37℃에서 16시간에서 18시간 동안 반응시켰다. 인산완충용액(PBS)으로 2번 세척한 후, 1% 에오진 용액으로 1분간 염색하였다. 인산완충용액으로 2회 세척 한 후, 광학현미경으로 파란색으로 염색된 세포를 관찰하였다. SA-β-gal 활성 정도는 총 50~100개의 세포 중에서 세포질에 파란색으로 염색된 세포 수를 측정하여 백분율 (%)로 표시하였다.

7. 세포 단백질 추출

각 세포를 60 mm 배양접시에 1x10⁵개로 분주한 후 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포를 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척한 후, 선복화 추출물과 단일성분을 농도 별로 1시간 전 처리하고, 아드리아마이신 500 nM을 4시간 동안 처리하였다. 배양액을 제거한 후, 인산완충액으로 1회 세척하였다. 세포 용해 용액 [25mM Tris-HCl(pH 7.6), 150mM Nacl, 1% 트리톤(Tryton) X-100, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 0.1% SDS, 1mM 소듐 바나데이트(Sodium vanadate), 5mM NaF, 프로테아제 억제제(protease inhibitor) 또는 1mM PMSF]을 50 ul를 넣었다. 세포 긁개를 이용하여 용액과 세포를 모은 후 미세원침관으로 옮겼다. 얼음에서 30분간 반응시키면서 매 10분마다 용액을 진탕하였다. 13,000 rpm에서 15분간 원침하여 상청액을 새 튜브로 옮겼다. 용액 속의 단백질 양은 우혈청알부민을 표준단백질로 사용하여 바이신코니닉산(bicinchoninic acid; BCA) 법 (Pierce Biotechnology Inc., Rockford IL, 미국)으로 정량하였다.

8. 웨스턴 블랏(Western blot) 분석

단백질 (20μg)을 10% SDS-폴리아크릴아미드(SDS-polyacrylamide) 겔에서 전기영동하여 분리하였다. 니트로셀룰로스 막으로 단백질을 이동시킨 후, 5% 전지분유가 포함된 트윈-20-트리스 완충된 식염수(Tween-20-Tris buffered saline; TTBS)에서 30분 동안 반응시켰다. 니트로셀룰로스 막을 p53, pS6 또는 p21에 대한 일차항체가 포함된 5% 전지분유-TTBS 용액에서 밤새도록 반응시켰다. TTBS 용액으로 3회 세척 한 후, 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 1시간 30분 동안 반응시켰다. TTBS로 막을 5분씩 5회 세척 한 후, 향상된 화학발광(enhanced chemiluminescence) 용액을 이용하여 p53, p21와 pS6의 양을 측정하였다. 각 항체와 반응한 특정 단백질의 양은 LAS-3000 영상장치 (Fujifilm Corp., Stanford, CT, 미국)을 사용하여 측정하였다. 각 실험에 동일한 양의 단백질이 사용되었음은 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease; GAPDH) 항체를 사용하여 확인하였다.

9. 세포 내 활성산소(ROS) 농도 측정

각 세포를 100mm 배양접시에 1.5x10⁵개로 분주한 후 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 3일 배양하였다. 세포를 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척한 후, 아드리아마이신 500 nM을 4시간 동안 처리하고 트립신-EDTA 용액 (2.5%) 을 처리하여 세포를 분리한 후, 60mm 배양접시에 1 X 10⁵개로 다시 분주하였다. 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 배양액을 갈아주고 브리타닌(britanin; IJ-2) 0.1 ug/ml로 처리하였다. 음성 대조군으로 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 양성 대조군으로 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 5mM과 라파마이신(rapamycin) 500nM을 첨가하였다. 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척하고 H₂DCFDA 250uM을 20분 동안 처리하였다. 인산완충용액으로 1회 세척하고 트립신-EDTA 용액 (2.5%)을 처리하여 세포를 분리하여 미세원침관으로 옮겼다. 3,000rpm 에서 2분간 원침하여 상청액을 버리고 2% 우태아혈청을 포함한 인산완충용액을 1ml 넣어 세포를 세척하고 다시 3,000에서 2분간 원침하였다. 세척과정을 2회 반복한 후, 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 1ml 넣어 주었다. BD FACS CantoⅡ 유세포 분류기 (BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 ROS를 측정하였다.

10. 통계처리

각 실험은 한번에 3개씩 각각 3회 이상 반복 실험하여 평균과 표준편차를 구하였다. 통계적 유의성은 Student t-test로 분석하였으며, p값이 0.05이하 (p<0.05)일 때 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

11. 결과

(1) 선복화 추출물의 세포독성 조사

사람 섬유아세포에서 선복화 추출물 5가지에 대한 세포독성을 먼저 조사하였다. 물 추출물, 부탄올 추출물은 100 ug/ml에서 세포독성이 나타나지 않았으나, 에틸아세테이트 추출물, 헥산 추출물, 메탄올 추출물은 100 ug/ml에서 세포독성이 나타났다(도 3a). 그러나 이들 3 추출물을 10 ug/ml로 처리하였을 때는 세포독성이 나타나지 않았다(도 3a).

(2) 선복화 추출물에서 세포 노화 저해 효능 조사

먼저 선복화 추출물이 아드리아마이신에 의해 유도되는 세포노화를 억제하는지 조사하였다. 선복화 추출물은 세포독성이 나타나지 않은 농도로 처리하였으며, 물 추출물과 부탄올 추출물은 100과 10 ug/ml, 에틸아세테이트 추출물, 헥산 추출물, 메탄올 추출물은 10 ug/ml로 각각 처리하였다. 물 추출물과 부탄올 추출물을 처리하였을 때 아드리아마이신 처리에 의해 증가되는 SA-β-gal 활성이 감소되었다 (도 3b). 그러나 에틸아세테이트 추출물, 헥산 추출물, 메탄올 추출물은 SA-β-gal 활성을 저해하지 않았다. 따라서 물 추출물과 부탄올 추출물이 아드리아마이신에 의한 세포노화를 억제하는 효능이 있음을 확인하였다. 물과 부탄올 추출물의 세포노화 저해 효능을 더 확인하기 위하여 농도에 따른 효능을 조사하였다. 그 결과 농도의존적으로 아드리아마이신에 의해 증가되는 SA-β-gal 활성을 저해함을 관찰하였다(도 4).

물 추출물과 부탄올 추출물이 아드리아마이신에 의한 세포노화 과정에서 증가되는 p53, p21, 인산화S6K와 같은 단백질의 발현에 어떤 영향이 있는지 조사하였다. 두 추출물 모두 아드리아마이신에 의해 증가되는 p53과 p21의 발현은 억제하였다. 인산화S6K의 발현을 물 추출물은 감소시켰지만, 부탄올 추출물은 감소시키지 않았다(도 5).

물 추출물과 부탄올 추출물이 복제노화가 유도된 세포에서도 세포노화를 억제하는지 더 조사하였다. 그 결과 두 추출물 모두 농도의존적으로 복제노화에 의해 증가된 SA-β-gal 활성을 감소시켰다 (도 6).

이상의 결과로부터 선복화 물 추출물과 부탄올 추출물이 아드리아마이신에 의한 세포노화와 세포 분열로 인한 복제노화를 저해하는 효능이 있음을 확인하였다.

(3) 선복화 단일성분의 세포독성 효과 조사

사람 섬유아세포에서 선복화 단일성분에 대한 세포독성을 조사하였다. IJ-1, IJ-2(브리타닌, britanin), IJ-3와 IJ-4를 각각 10 ug/ml 처리하였을 때, IJ-2 만 세포독성이 관찰되었다(그림 7a). IJ-2를 농도를 낮추어 1 ug/ml 처리하였을 때, 세포독성이 나타나지 않았다(그림 7b).

(4) 선복화 단일성분의 세포노화 저해 효능 조사

4가지 선복화 단일성분이 아드리아마이신에 의해 유도되는 세포노화를 억제하는지 조사하였다. IJ-1, IJ-3, IJ-4는 10 ug/ml, IJ-2 (브리타닌, britanin)는 1 ug/ml 각각 처리하였다. 이 IJ-2 (브리타닌, britanin)를 처리하였을 때, 아드리아마이신에 의해 증가되는 SA-β-gal 활성이 감소되었다(그림 7c).

IJ-2 (브리타닌, britanin) 처리에 의해 아드리아마이신에 의한 세포노화 과정에서 증가되는 p21 발현이 감소됨을 확인하였다(그림 8a). 그러나, 아드리아마이신 의한 세포노화 과정에서 증가되는 활성산소에는 변화가 없었다(도 8b와 8c).

IJ-2 (브리타닌, britanin)처리에 의해 복제노화가 유도된 세포에서도 세포노화를 억제하는지 조사한 결과, 복제노화에 의해 증가된 SA-β-gal 활성이 감소됨을 관찰하였다(도 9).

이상의 결과로부터 IJ-2 (브리타닌, britanin)가 아드리아마이신에 의한 세포노화와 세포 분열로 인한 복제노화를 저해하는 효능이 있음을 확인하였다.

Claims

선복화 에탄올 추출액에 증류수 및 헥산(n-hexane)을 첨가하여 분획화한 증류수 층에 에틸아세테이트(EtOAc)를 첨가하고, 이를 분획한 증류수 층에 부탄올을 첨가하고 분획화하여 추출된 증류수 분획 추출물 또는 부탄올 분획 추출물인 선복화 추출물, 선복화 에틸아세테이트 분획 추출물로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 브리타닌(britanin) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하고, 아드리아마이신에 의해 유도되는 섬유아세포 노화를 억제하는 것을 특징으로 하는 피부노화 예방 또는 치료용 약학 조성물.
< 화학식 1 >
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제 1 항에 있어서, 상기 섬유아세포 노화 억제는 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 억제를 측정하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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