KR101257706B1

KR101257706B1 - 오베큐논을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물

Info

Publication number: KR101257706B1
Application number: KR1020110003320A
Authority: KR
Inventors: 유승우; 이정형; 나민균; 이승호; 신우성; 박민진; 민병선
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2011-01-13
Filing date: 2011-01-13
Publication date: 2013-04-24
Also published as: KR20120082047A

Abstract

본 발명은 오베큐논을 함유하는 혈관질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 오베큐논의 처리로 인해, 아르기나아제의 활성이 억제되고, 대동맥에서의 NO의 생성이 증가하였으며, 상기 조성물은 고혈압, 동맥경화, 관상동맥질환, 뇌혈관질환, 말초혈관질환 또는 대동맥질환 등의 혈관질환을 치료할 수 있는 효능이 있다.

Description

오베큐논을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물 {A composition comprising obacunone for treating or preventing vascular disease}

본 발명은 오베큐논(obacunone)을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 본 발명은 아르기나아제의 활성을 억제하고, 혈관 내피세포가 NO(nitric oxide)의 생성을 촉진하도록 하여 혈관 내피세포를 이완시킴으로 동맥경화, 고혈압, 관상동맥질환, 뇌혈관질환, 말초혈관질환 또는 대동맥질환 등을 치료할 수 있는 오베큐논을 함유한 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

혈관의 내피(endothelium)는 혈관재활동성(vasoreactivity), 혈소판 활성, 백혈구 부착, 평활근 세포의 증식과 이동 등에 대한 혈관의 항상성을 유지시키는 데 중요한 역할을 한다.

혈관 내피에서 생성되는 NO(nitric oxide)는 혈관을 보호하는 가장 강력한 물질로, 혈관 평활근 세포를 이완시켜 혈관을 확장하는 역할을 하며, 손상된 NO 신호전달체계는 동맥경화(atherosclerosis) 및 고혈압(hypertension) 등의 혈관 질환을 초래한다. NOS(nitric oxide synthase)는, O₂ 및 보조인자 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(nicotinamide adenine dinucleotide phospate, NADPH), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD), 플라빈 모노뉴클레오티드(flavin mononucleotide, FMN), 헴(heme), 테트라하이드로바이오프테린(tetrahydrobiopterin, BH4)의 존재 하에 L-아르기닌의 말단 질소 원자로부터 NO를 합성시키는 한 그룹의 효소이며, 지금까지 알려진 NOS 중에는, n-NOS(neuronal nitric oxide synthase), e-NOS(endothelial NOS), i-NOS(inducible NOS)의 3종류가 있는데, 이 중 e-NOS가 혈관 내에서 NO를 생성하고 혈관 기능 조절에 관여한다.

한편, 아르기나아제는 기질인 L-아르기닌(L-arginine)을 분해하는 효소로 e-NOS와 기질에 대한 경쟁 관계를 갖고 있어서, NO의 생성을 조절할 수 있는 효소로 알려져 있다(Morris et al., 1998; Berkowitz et al., 2003; Simon et al., 2003; Holowatz et al., 2006; Steppan et al., 2006; Peyton et al., 2009). 또한, 아르기나아제가 L-아르기닌(L-arginine)의 생물학적 이용 가능성(bioavailability)을 제한하여 NOS의 활성을 조절한다는 것과(Ryoo et al., 2006), 아르기나아제의 저해가 NO의 생성을 활발하게 증가시키고 정상 심장의 기능에도 효과적일 뿐만 아니라, 혈관의 비정상상태인 동맥경화, 노화, 발기부전, 겸상(鎌狀) 적혈구 빈혈증(sickle cell disease) 등에 효과적이라는 것이 보고된 바 있다(Bivalacqua et al., 2001; Berkowitz et al., 2003; Morris et al., 2004; Steppan et al., 2006; White et al., 2006; Bivalacqua et al., 2007; Hsu et al., 2007; Xu et al., 2007).

아르기나아제의 저해는 렛드의 대동맥 내피(Berkowitz et al., 2003), 소의 폐 내피 세포(Chicoine et al., 2004), 돼지의 관상동맥(Zhang et al., 2001) 등에서 NO의 생성이 두드러졌으며, HUVEC(human umbilical vein endothelial cells)의 증식을 억제하기도 하여 신생혈관생성(angiogenesis)의 억제와도 관련이 있음을 확인하였다(Faffe et al., 2005).

아르기나아제는 현재 2개의 이성체가 존재한다. 대식세포(macrophages), 간세포(hepatocytes), 혈관 평활근세포에서의 아르기나아제 I의 발현과 기능은 LPS, IL-13(interleukin-13), 변화된 산소 압력(altered oxygen tension), 관상동맥의 팽창(balloon dilatation of coronary arteries) 등으로 인해 자극되는 것으로 알려져 있다(Modolell et al., 1995; Louis et al., 1998; Que et al 1998; Klasen et al., 2001; Chicoine et al., 2004; Morris et al., 2004; Ryoo et al., 2006; Nelin et al., 2007). 혈관 내피에서의 아르기나아제 II의 활성 및 발현은 OxLDL(oxidized low-density lipoprotein), LPS(lipopolysaccharide), TNF-α(tumor necrosis factor-α), IFN-β(interferon-β), 8-Bromo-cGMP(8-Bromoguanosine 3',5'-cyclic monophosphate), 저산소증(hypoxia)에 의한 다양한 혈관 손상으로 인해 유도된다고 알려져 있다(Morris et al., 1998; Que et al., 1998; Chicoine et al., 2004; Ryoo et al., 2006; Nelin et al., 2007).

또한, 동맥경화 유도형 마우스(atherosclerosis-prone mice)에서 아르기나아제 II의 활성이 높은 것과 이와 같은 현상이 혈관 내피의 NO 생성의 손상(impaired endothelial NO production), 혈관 내피의 기능 장애(endothelial dysfunction), 혈관의 뻣뻣해짐(vascular stiffness)과, 특히, 대동맥 내의 플라그 형성(aortic plaque development)과 관련이 있는 것으로 확인되었다. 이와 반대로, 내피의 아르기나아제의 저해 또는 아르기나아제 II 유전자의 삭제(deletion)는 NO의 생성을 증가시켰으며, 혈관 내피 및 대동맥 기능이 회복되었고, 플라그 생성이 줄어들었다. 따라서, 아르기아나제 II는 동맥경화 등을 비롯한 혈관질환의 예방 또는 치료에의 주요 타겟이라고 할 수 있으며(Ryoo et al ., 2008), 아르기나아제 활성이 높아지는 것은 내피의 기능 장애, 고혈압과 폐고혈압(systematic and pulmonary hypertension) 등에 영향을 주는 것으로도 확인되었다.

본 발명의 화합물인 오베큐논은 중추신경 및 식욕에 대해 활성 효과가 있다고 알려져 있으며(유럽특허 제498890호), 오베큐논을 포함하는 리모노이드(limonoid) 화합물이 신경변성의 질환(neurodegenerative disease)을 치료할 수 있다고도 알려져 있다(J Mol Neurosci. 2010, 42[1], 9-16). 또한, 오베큐논을 포함하는 리모노이드(limonoid) 화합물은 신경암세포와 대장암세포의 항증식효과가 있으며(Nutr Cancer. 2006, 56[1], 103-12), 약물민감세포(drug-sensitive cells) 및 약물내성세포(multidrug-resistant cells)에 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine) 및 탁솔(taxol)과 유사한 세포독성 효과가 있음이 알려져 항암제로의 사용도 기대되고 있다(J Agric Food Chem. 2004, 52[15], 4908-12). 이 외에도, 오베큐논이 함유된 붉은 멕시코 포도(red mexican grapefruit) 씨앗의 추출물이 항산화 효과가 있다고도 알려져 오베큐논은 다양한 생리활성이 있음을 확인할 수 있다(Z Naturforsch C. 2007, 62[3-4], 179-188).

그러나, 아직까지 오베큐논이 동맥경화나 고혈압 등의 혈관질환에 치료효과가 있다는 것은 밝혀져 있지 않았다. 한편, 본 발명자들은 오베큐논이 아르기나아제 활성을 억제하고 NO 생성을 높인다는 것을 확인하여, 본 발명의 화합물인 오베큐논이 동맥경화, 고혈압 등의 혈관질환의 치료제로 사용될 수 있다는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 오베큐논을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명에서는 하기 화학식 1로 표시되는 오베큐논(obacunone)이 아르기나아제의 활성을 억제하고 혈관 내피에서의 NO(nitric oxide)의 생성을 활성화하는 것을 확인하여, 상기 오베큐논이 혈관질환의 치료제로 이용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

[화학식 1]

본 발명의 화합물인 오베큐논은 황백(黃栢, 운향과(rutaceae)에 속하는 황벽나무의 껍질을 말린 것)으로부터 추출할 수 있으며, 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올, 아세톤, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 또는 이들의 혼합 용매에 의한 추출, 유기용매와 물의 분배, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 , 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법 등을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수가 있다. 조추출물은 필요에 따라서 상법에 따라서 더욱 정제할 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물 오베큐논은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수 있다.

또한 본 발명은 오베큐논 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 동맥경화, 고혈압, 관상동맥질환, 뇌혈관질환, 말초혈관질환 및 대동맥질환 등의 혈관 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 오베큐논 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 혈관 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 오베큐논 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 오베큐논 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 오베큐논 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 오베큐논 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 화합물인 오베큐논은 황백에서 추출한 천연물 유래의 화합물로써, 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명은 상기 화합물 오베큐논 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 심장 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 상기 건강기능식품으로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림을 포함한 낙농제품, 스프, 이온음료를 포함한 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제를 포함한 영양 공급용 제품이 포함될 수 있다.

본 발명은 오베큐논을 함유하는 혈관질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 오베큐논의 처리로 인해, 아르기나아제의 활성이 억제되고, 대동맥에서의 NO의 생성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 아르기나아제의 활성 억제 및 혈관세포의 NO의 생성 증가되면 고혈압이나 동맥경화에 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 따라서, 본 발명의 화합물인 오베큐논이 고혈압, 동맥경화, 관상동맥질환, 뇌혈관질환, 말초혈관질환 또는 대동맥질환 등의 혈관질환을 치료할 수 있을 것으로 확인되었다.

도 1은 오베큐논의 처리로 인해 마우스의 신장에서 아르기나아제 II의 활성이 농도 의존적으로 억제되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 2는 오베큐논의 처리로 인해 마우스의 간에서 아르기나아제 I의 활성이 농도 의존적으로 억제되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 3은 오베큐논의 처리로 인해 마우스 대동맥에서 NO의 생성이 증가되는 것을 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1. 오베큐논의 분리/정제/ 및 물리 화학적 특성 및 화학구조 분석>

황백 6kg을 메탄올과 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)을 1:1의 비율로 혼합한 용액 10ℓ에 넣고 상온에서 5일씩 3회 반복 추출하여, 추출액을 모아 감압 농축하여 추출물(898g)을 얻었다. 상기 추출물을 증류수 5ℓ에 현탁시키고 동량의 메틸렌 클로라이드를 가하여, 분획깔때기로 메틸렌 클로라이드 분획과 물 분획을 분획하는 조작을 수 회 반복 실시한 후 메틸렌 클로라이드 분획만을 수거한 후 감압 농축하여 519g의 메틸렌 클로라이드 분획을 얻었으며, 동일한 방법으로 n-부탄올을 가하여 169g의 n-부탄올 분획을 얻었다.

메틸렌 클로라이드 분획 중 136g을 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)로 다음과 같이 분획하였다. 지름 9cm인 컬럼에 실리카겔(silica gel)을 80cm 채우고, n-헥산을 유출시켜 고정상을 균일한 상태로 만들어 시료를 충진 후 에 n-헥산에 대한 에틸아세테이트의 비율을 0%에서 시작하여 2% 단위로 증가시키는 기울기 용리로 이동상을 유출시키다가 20%부터는 5%씩 이동상을 유출시키고 50%부터는 10%씩 유출시켜서, 분획 1에서 분획 16을 얻었다.

상기 분획 13(11.9g)을 지름이 5cm인 컬럼에 실리카겔을 50cm 채우고 메틸렌클로라이드를 유출시켜 고정상을 균일한 상태로 만든 후 시료를 충진하였다. 메틸렌클로라이드로 컬럼을 포화시킨 후 메틸렌클로라이드에 대한 아세톤의 비율을 3% 단위로 높여가는 기울기 용리로 이동상을 유출시켜서 소분획 13.1에서 소분획 13.6을 얻었다. 그 중 소분획 13.1(4.1g)을 메탄올로 재결정하여 오베큐논(obacunone, 2,100mg)을 얻었다. 화합물의 화학적 구조는 핵자기 공명분석의 ¹H 및 ¹³C-NMR분석결과를 토대로 화합물의 구조를 분석하였으며, 문헌치와 비교하여 구조를 결정하였다(Chem. Pharm. Bull, 36[11], 4453-4461; Arch Pharm Res, 30[1], 58-63; Arch Pharm Res, 30[1], 58-63; Bio Factors, 13, 213-218)

오베큐논 ( Obacunone ): colorless crystal ; mp 228 - 235 ℃ .

-46.4° (c = 0.24, CHCl₃) ; IR (neat) V _max :2988, 1745, 1703, 1630, 1572, 1503, 1451, 1393, 1282 cm^-1.EI-MS m/z (rel. int.) : 454[M]⁺(0.4), 439 (4), 397 (3), 363 (15), 347 (2), 331 (100), 313 (7). ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 7.43 (1H, s, H-21), 7.40 (1H, s, H-23), 6.53 (1H, d, J = 11.7 Hz, H-1), 6.37 (1H, s, H-22), 5.97 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-2), 5.46 (1H, s, H-17), 3.66 (1H, s, H-15), 2.99 (1H, t, J = 11.0 Hz, H-6b), 2.61 (1H, dd, J = 11.0 Hz, J = 4.0 Hz, H-5), 2.30 (1H, dd, J = 11.0 Hz, J = 4.0 Hz, H-6a), 2.15 (1H, dd, J = 8.5 Hz, J = 3.5 Hz, H-9), 1.50 (6H, s, H-29, H-30), 1.46 (3H, s, H-28), 1.24 (3H, s, H-19), 1.12 (3H, s, H-18) ; ¹³C-NMR (63 MHz, CDCl₃) : δ 207.4 (C-7), 166.9 (C-3), 166.7 (C-16), 156.8 (C-1), 143.3 (C-23), 140.9 (C-21), 122.8 (C-2), 120.0 (C-20), 109.7 (C-22), 84.0 (C-4), 78.0 (C-17), 65.0 (C-14), 57.2 (C-5), 53.4 (C-15), 53.1 (C-8), 49.1 (C-9), 43.0 (C-10), 39.8(C-6), 37.3 (C-13), 32.6 (C-12), 31.9 (C-30), 26.7 (C-19), 21.0 (C-29), 19.4(C-28), 16.9 (C-11), 16.4 (C-18).

< 실시예 2. 오베큐논의 아르기나아제 활성 억제 효과 확인>

아르기나아제 활성 어세이는 Ryoo et al. (CircRes 2006, 99, 951-960)에 개시된 방법으로 수행하였다.

이를 위해 C57BL/6 마우스의 간과 신장에 세포용해버퍼(50mM Tris-HCl, pH7.5, 0.1mM EDTA and protease inhibitors)를 처리하고 4℃에서 균질화하였으며, 이를 14,000×g로 원심분리하고 상등액만을 취하여 아르기나아제 용해물(arginase lysate)을 획득하였다. 상기 아르기나아제 용해물을 50mM tris-HCl을 이용해 10배 희석하였고, 50mM Tris-HC 33.5㎕, 오베큐논(1mg/㎕) 1.5㎕, 10배 희석한 아르기나아제 용해물 25㎕, L-아르기닌(L-arginine, 0.1M) 25㎕를 넣었다. 이 후, 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후, 산성용액(H₂SO₄:H₃PO₄:DW=1:3:7)으로 반응을 정지시켰다. 다음으로는 INSP(9% α-isonitrosopropiophenone in absolute ethanol)를 25㎕를 넣고 97℃에서 45분간 발색(요소[urea]와의 발색반응)시킨 후, 10분간의 암반응 후 550nm파장에서 흡광도를 측정하였다. 또한 흡광도 값은 오베큐논을 처리하지 않은 대조군과 비교하였다. 효소 활성도(pmol Urea/min/mg protein)는 요소 표준곡선으로부터 계산하였고, 효소 활성 억제는 오베큐논 화합물을 넣은 상태에서 아르기나아제 활성을 측정하여 오베큐논 화합물이 없는 조건에서의 효소 활성에 대한 백분율로 표시하였다.

아르기나아제는 아르기나아제 I 및 II의 이성체 형태로 되어 있으며, 간에서는 아르기나아제 I이 주로 발현하며, 신장에서는 아르기나아제 II가 주로 발현하는 것을 웨스턴 블롯 분석으로 이미 확인된 바 있으며(Experimental and molecular medicine, 42[7], 524-532, 2010), 본 발명에서는 이를 참고로 하여, 간에서는 아르기나아제 I의 활성을, 신장에서는 아르기나아제 II의 활성을 확인하였다. 본 실험의 대조군으로는 오베큐논 화합물의 용매인 DMSO(dimethylsulfoxide)를 오베큐논 사용량과 동일한 부피로 처리한 간과 신장의 용해물을 이용하였다.

도 1 및 도 2를 참고하면, 오베큐논이 각각 농도별로 신장에서는 아르기나아제 II의 활성을 억제하였으며 간에서 아르기나아제 I의 활성을 억제하는 것이 확인되었으며, 이와 같은 결과로 인해, 본 발명의 오베큐논 화합물이 아르기나아제 I 및 II를 모두 저해하는 효과가 있는 것을 입증할 수 있었다.

< 실시예 3. 오베큐논의 NO 생성 효과 확인>

NO의 측정은 마우스에서 분리된 대동맥(aorta)에서 NO에 민감한 형광염료인 DAF-AM(4-Amino-5-methylamino-2',7'-difluorofluorescein diacetate)를 이용한 일산화질소 생성 확인 실험으로 확인하였다.

마우스에서 대동맥 고리(aortic rings)를 분리한 후, 세포배양배지(Dulbecco's modified Eagle's medium with 2% FBS and antibiotics[1×])에 오베큐논 30㎍/㎖이 있는 상태로 18시간 이상(overningt) 배양하였다.

NO 생성을 확인하기 위해 상기 마우스의 대동맥은 세로로 자르고 HEFES 버퍼(NaCl 120mM, KH₂PO₄ 2.6mM, KCl 4mM, CaCl₂ 2mM, MgCl₂ 0.6mM, HEPES 25mM, glucose 14mM, pH7.4)로 채워진 챔버(silgard-coated chamber)의 바닥에 꽂아두었다. 이후, 챔버를 37℃가 유지되도록 하였으며, 배지 상태도 일정하게 유지시켰다(static bath conditions).

대동맥 조직에서의 NO 생성 정도는 DAF-FM을 이용하여 형광정도를 측정하였다(측정조건 → Olympus 10 × objective with optimized excitation, emission wavelength : [DAF-FM, 470/525 nm; or DHE, 470/580], intensified camera : [Luca 658M-TL], custom image acquisition program : [Cell software, Olympus]). 먼저 첫 번째 평형 상태에서 배경 형광정도(background fluorescence)를 측정하고 이를 기록하였다. 대동맥을 다시 실온에 15분 동안 둔 후, 대동맥에 HEPES가 있는 상태에서 5μM DAF-FM을 10분간 처리하였다. 이후, DAF-FM을 제거하고 형광정도를 측정하고 기록하였으며 다시 대동맥을 37℃에서 20분간 두었다. DAF-FM 제거 이후에는 L-NAME(N^Gnitro-L-arginine methyl ester, NOS inhibitors, 10^-5μM)을 처리하여 이 후, 이에 대한 형광정도의 차이를 Origin(version 7.5, OrignLab Corp, Northampton, MA)으로 분석하였다. 본 실험의 대조군으로는 오베큐논 화합물의 용매인 DMSO(dimethylsulfoxide)를 오베큐논 사용량과 동일한 부피로 처리한 마우스 대동맥을 이용하였다.

상기 분석결과는 도 3에 나타내었는데, 도 3의 결과를 통해 오베큐논이 마우스 대동맥에서 NO의 생성을 현저하게 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4. 독성실험>

4-1. 급성독성

오베큐논(obacunone)을 단기간에 과량을 섭취하였을 시 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 20마리를 대조군은 10마리, 실험군은 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 아무것도 투여하지 않았으며, 실험군은 오베큐논을 2.0g/㎏(일반적인 동물실험에서 사용되는 양의 50배 정도)의 농도로 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 2.0g/㎏ 농도의 오베큐논을 투여한 실험군은 모두 생존하였다.

4-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 오베큐논을 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(Blood Urea Nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

< 사용예 1. 약학적 제제예 >

1-1. 정제의 제조

본 발명의 화합물 오베큐논 20g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

1-2. 주사액제의 제조

본 발명의 화합물 오베큐논 2g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

< 사용예 2. 식품 제조예 >

2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 화합물 오베큐논을 0.2~10 중량%로 하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 화합물 오베큐논을 0.1~5.0 중량%로 하여 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2-3. 스프 및 육즙( gravies )의 제조

본 발명의 화합물 오베큐논을 0.1~1.0 중량%로 하여 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

2-4. 유제품( dairy products )의 제조

본 발명의 화합물 오베큐논을 0.1~1.0 중량%로 하여 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

< 사용예 3. 음료 제조예 >

3-1. 야채쥬스 제조

본 발명의 화합물 오베큐논 0.5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

3-2. 과일쥬스 제조

본 발명의 화합물 오베큐논 0.1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

Claims

하기 화학식 1의 오베큐논(obacunone)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 동맥경화, 고혈압, 뇌혈관질환, 말초혈관질환 및 대동맥질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
삭제
하기 화학식 1의 오베큐논(obacunone)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 동맥경화, 고혈압, 뇌혈관질환, 말초혈관질환 및 대동맥질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]
제 3 항에 있어서,
상기 건강기능식품은 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림을 포함한 낙농제품, 스프, 이온음료를 포함한 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제를 포함한 영양 공급용 제품으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 동맥경화, 고혈압, 뇌혈관질환, 말초혈관질환 및 대동맥질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.